Моноклональные антитела в диагностике и терапии
advertisement
МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА В ДИАГНОСТИКЕ И ТЕРАПИИ Оловникова Н.И. Гематологический научный центр РАМН, ООО «Гематолог» Москва ЦОЛИПК ЦОЛИКЛОНЫ ЦОЛИКЛОНЫ – ОТЕЧЕСТВЕННЫЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА К ЭРИТРОЦИТАРНЫМ АНТИГЕНАМ, ВПЕРВЫЕ ПОЛУЧЕННЫЕ В ЦОЛИПКе ( ныне Гематологический научный центр РАМН) ПРЕИМУЩЕСТВА МОНОКЛОНАЛЬНЫХ РЕАГЕНТОВ: неограниченное количество отказ от иммунизации доноров стандартность специфичность возможность применять в простых тестах стабильность длительный срок хранения Определение фенотипа крови доноров и создание банка фенотипированной крови проводят с целью: 1. подбора совместимой для переливания крови, особенно для реципиентов с иммунными антителами; 2. поиска эритроцитов редких фенотипов и создания панелей для определения специфичности иммунных антител. Определение фенотипа крови реципиентов проводят: 1. больным с иммунными антителами; 2. больным, в анамнезе которых были несовместимые трансфузии; 3. больным, которым необходимы многократные трансфузии; 4. беременным и женщинам детородного возраста. ИММУНОСЕРОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КРОВИ (ФЕНОТИПИРОВАНИЕ) РЕЗУС АНТИ- -D -C - CW -c -E -e АВО АНТИ- -A -B - AB - A1 КЕЛЛ АНТИ- -K -k МАССОВОЕ И МЕТОДИЧЕСКИ ПРОСТОЕ ФЕНОТИПИРОВАНИЕ КРОВИ СТАЛО ВОЗМОЖНЫМ В СВЯЗИ С ПОЯВЛЕНИЕМ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ РЕАГЕНТОВ, т.к. не стало ограничений в количестве реагентов можно проводить определение всех антигенов одновременно одним методом можно выбирать адекватный метод тестирования СОВРЕМЕННЫЕ ТЕНДЕНЦИИ РАЗВИТИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ РЕАГЕНТОВ 1.Создание разнообразных тест-систем о л с У е, и н жне авт о м я и ц за и т а СОВРЕМЕННЫЕ ТЕНДЕНЦИИ РАЗВИТИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ РЕАГЕНТОВ 2. Создание олигоклональных реагентов взамен моноклональных. Эритротест-Цоликлон анти-А: смесь двух МКА, проявляющих разную активность в отношении нормальных и слабых вариантов антигена А. Эритротест-Цоликлоны анти-С, анти-с, анти-е также смеси двух МКА. Эритротест-Цоликлон анти-D (для тестирования крови доноров): смесь четырех МКА класса IgG, направленных к различным эпитопам антигена D. Эритротест-Цоликлон анти-D супер – одно МКА класса IgM. ПРОБЛЕМА ТЕСТИРОВАНИЯ Du D weak (D слабый) – снижена экспрессия, антиген не изменен измененные эпитопы D partial (D частичный) – экспрессия разных вариантов различна, отсутствует ряд эпитопов Тип DVI 1 Доноры DVI - Rh-положительные, положительные т.к. 1) Эритроциты DVI могут стимулировать иммунный ответ (?); 2) При наличии анти-D антител у реципиента посттрансфузионная реакция при переливании ему эритроцитов DVI неизбежна (!) 2 3 4 Реципиенты DVI , беременные женщины DVI – Rh-отрицательные, т.к. могут вырабатывать антитела против отсутствующих детерминант при переливании D-положительных эритроцитов. РАЗНОВИДНОСТИ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В ТЕРАПИИ н L CDR Fab Fc Н – тяжелые цепи; L – легкие цепи; Fab – Fab-фрагменты; Fc – Fc-фрагменты; CDR – комплементарные области (гипервариабельные участки). Строение молекулы IgG Антиген-связывающий участок Вариабельная часть (V) Константная часть (Fc) Антитело-зависимая цитотоксичность – основной иммунный механизм разрушения клеток-мишеней под действием антител FcgammaR МКА Антиген Антитела связываются с антигеном на поверхности клетки-мишени. Лимфоцит NK распознает МКА с помощью рецепторов Fcgamma. Активированный которые NK лимфоцит вы- разрушают брасывает перфо- клетку-мишень. рины и протеазы, Гемолитическая болезнь плода (новорожденного) – I беременность результат иммунологического конфликта плода и матери, несовместимых по резус резус + антигену резус RhD После первых родов D+ эритроциты плода, попавшие в кровь резус-отрицательной матери, вызывают у нее анти-D ответ. Иммунные анти-D антитела принадлежат к иммуноглобулинам класса IgG, которые при следующей беременности проходят через плаценту и вызывают разрушение D+ эритроцитов плода, что приводит к гемолитической болезни. + + + + + + II беременность Введение анти-резус иммуноглобулина после родов предотвращает резусиммунизацию женщины, т.е. вызывает антигенспецифическую иммуносупрессию I беременность II беременность Эффекты, которые вызывает анти-резус иммуноглобулин, введенный после родов: D+ эритроциты плода быстро (в течение суток) исчезают из циркуляции матери, если препарат введен в достаточном количестве(20 мкг/1мл эритроцитов) Разрушение эритроцитов происходит без участия системы комплемента, т.е. не наблюдается внутрисосудистого гемолиза Выведение эритроцитов происходит в селезенке при участии макрофагов, несущих рецепторы к Fc фрагментам антител Анти-резус иммуноглобулин вызывает временную толерантность к D+ эритроцитам и предотвращает появление анти-D антител Анти-резус иммуноглобулин не эффективен, если сенсибилизация уже произошла, даже при низком титре иммунных антител Способность антител прочно связываться с D антигеном и быстро выводить D+ эритроциты из кровотока не обеспечивали профилактики анти-резус иммунизации Свойство анти-D Специфическое связывание с D антигеном на эритроцитах Разрушение D+ эритроцитов in vitro в реакции антитело-зависимой цитотоксичности Ускорение клиренса D+ эритроцитов из кровотока через селезенку Длительная циркуляция в крови, соответствующая сроку жизни IgG Ингибирование иммунного ответа на D антиген МКА анти-D ИГ анти-D + + + + - + + + + + Иммунные реакции на эритроциты, сенсибилизированные анти-D антителами Активация системы комплемента Активация/супрессия иммунокомпетентных клеток, несущих Fcγ - рецепторы Три типа активирующих рецепторов и один тип ингибирующего рецептора экспрессируются на иммунокомпетентных клетках. Разные типы рецепторов опосредуют разные типы ответа при взаимодействии с Fc участком молекулы IgG. Активирующие рецепторы: FcγRI, FcγRIIa, FcγRIII Ингибирующий рецептор: FcγRIIb NK- лимфоцит макрофаг FcγRI IgG В-лимфоцит FcγRIIB FcγRIIa FcγRIII ИГ-рецептор АГ эритроцита (D) активация активация подавление Схема реакции антитело-зависимой цитотоксичности (АЗЦ) моноцит NK б) а) ЭР анти-D в) гемоглобин FcγRI FcγRIIа FcγRIII В реакции АЗЦ разрушение D+ Эр осуществляется двумя типами эффекторных клеток, несущих FcγR – моноцитами с FcγRI и FcγRIIa, NK лимфоцитами с FcγRIII. -D И Г Эффективность гемолиза, опосредованная FcγRI и FcγRIII, у монои поликлональных анти-D антител принципиально различны 140 Fcγ( I + III) 120 FcγIII 100 80 60 отан лизс,% 40 20 0 G-7 G-12 G-17 G-48 анти-D ИГ анти-D МКА, которые взаимодействуют только с FcγRI, но не с FcγRIII, не обладают иммуносупрессорным эффектом. Использование при отборе анти-D МКА реакции АЗЦ позволило найти МКА, опосредующие лизис через FcγRIII. МКА с таким свойством встречаются очень редко: их около 1% от общего числа полученных. G-112 Анти-D, 100 нг/мл G-108 Поликлональная иммунная сыворотка содержит смесь антител с разными свойствами различные клоны плазматических клеток секретируют различные антитела поликлональная сыворотка Схема получения клеточных линий, секретирующих моноклональные антитела человека В клетка В-клеточные линии Структурные и функциональные характеристики анти-D МКА МКА Лег- Под- ЛинияАктивность в Секвенирокая класс продуцент АЗЦ (% от анти- вание Fc цепь резус ИГ) G-108 κ IgG1 G-112 κ IgG1 G-12 κ IgG1 ЛБЛ ГГ ЛБЛ ГГ ЛБЛ ГГ 101 53 78 35 19 26 IGHG1*03 Н/д IGHG1*03 Н/д IGHG1*03 IGHG1*03 ЛБЛ – лимфобластоидная линия человека; ГГ – гетерогибридома человек-мышь IGHG1*03 - аллотип IgG1; Н/д – не делали Таким образом, функционально различные антитела имеют идентичную аминокислотную последовательность. Это означает, что их различия определяют посттрансляционные модификации молекулы иммуноглобулина. гликозилирование Структура олигосахарида, присоединенного к Asn 297 тяжелой цепи IgG человека VH CH1 CH2 CH3 Cиаловая к-та (NeuAc) Asn297 Галактоза Манноза N-ацетилглюкозамин Фукоза Указанные стрелками сахара могут отсутствовать, что дает около 30 вариантов (гликоформ), которые обнаруживаются в нормальном IgG человека Клетки человека, секретирующие МКА, можно сливать с клетками других видов и получать гетерогибридомы, секретирующие МКА человека. Аминокислотная последовательность МКА после слияния не изменяется, однако в гибридных клетках структура сахара будет формироваться с участием ферментов миеломной клетки. Человек/мышь Мышиная миелома Р3-Х63-Ag8.653 В-лимфобластоидные клетки человека Крысиная миелома YB2/0 Человек/крыса В клетках грызунов МКА гликозилируются иначе, чем в клетках человека. Влияние линии-продуцента на эффективность гемолиза, опосредованного FcγRIII: мышиная миелома снижает, а крысиная повышает сродство анти-D IgG1 МКА к FcγRIII МКАG-108 3F8 МКА IgG1 анти-D ИГ человек МКА G-12 анти-D ИГ человек Вывод: успех в создании моноклонального анти-D препарата для профилактики гемолитической болезни новорожденных зависит не только от свойств МКА, но и от клеточной системы для продукции антител ПРЕПАРАТЫ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ, РАЗРЕШЕННЫЕ ДЛЯ ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ НАИМЕНОВАНИЕАНТИТЕЛ по USAN КОММЕРЧЕСКИЕ НАЗВАНИЯ ФИРМА-ПРОИЗВОДИТЕЛЬ Ortho Biotech США, 1994/97 Centocor; Eli Lilly CD3 Химерные F(ab), IgG1 gpIIb-IIIa, интегрин αv/β3 Мышиные, IgG2a Химерные, IgG1 ЕрСАМ CD20 Разрушение ЕрСАМ+ клеток Разрушение В-Лф Zenapax® Гуманизированные IgG1 CD25 Блокировка IL-2R Palivizumab Synagis® Гуманизированные IgG1 F-белок RSV Блокировка белка F вируса Basiliximab Simulect® Химерные, IgG1 CD25 Блокировка IL-2R Trastuzumab Herceptin® Infliximab Remicade® Gemtuzumab ozogamicin Mylotarg® Alemtuzumab MabCampath® Гуманизированные IgG1 HER2/neu, рецептор Разрушение EGF+-клеток rEGF Химерные, IgG1 TNF-α Блокировка активности TNF-α Воспалительные заболевания, США, 1998; EC, 1999 РА, болезнь Крона Гуманизир.–калиСD33 Разрушение миелоидных ОМЛ США 2000 хеамицин, IgG4 предшественников Гуманизированные IgG1 CD52 Разрушение CD52+ клеток ХЛЛ США, 2000; EC, 2001 Ibritumomab tiuxetan Мышиные- 111 In или - 90 Y, IgG1 Человеческие, IgG1 CD20 Разрушение В-Лф В-НХЛ Adalimumab Zevalin® IDEC-Y2B8 Humira® TNF-α Блокировка активности TNF-α Tositumomab Efalizumab Bexxar® Raptiva®; Xanelim Мышиные- 131 I, IgG2a Гуманизированные IgG1 CD20 CD11a химерные -131 I Гистон Н1-ДНК Abciximab ReoPro® Edrecolomab Rituximab 17-1А; Panorex® Rituxan®, MabThera® Daclizumab TNT-131 I Omalizumab Cetuximab Xolair® Erbitux® Гуманизированные IgG1 IgE Химерные, IgG1 HER1, рецептор EGF Bevacizumab Avastin® Гуманизированные IgG1 Natalizumab Tysabri®, Antegren® Монафрам™ Nimotuzumab TheraCIM h-R3, Theraloc Tocilizumab ACTEMRA 200 Panitumomab Vectibix™, ABX-EGF Ranibizumab Lucentis ПРИМЕНЕНИЕ ПРИ ЗАБОЛЕВАНИЯХ РЕГИСТРАЦИЯ АНТИГЕН/ ЭПИТОП Orthoclone-OKT3® МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ CША, 1986 ТИП МКА Мышиные, IgG2a Muromonab-CD3 Профилактика острого отторжения при трансплантации почек Препятствие взаимодействию Профилактика тромбоза артерий тромбоцитов с фибриногеном при коронаропластике Блокировка активности Ткиллеров Рак прямого кишечника В-НХЛ Германия, 1995 J&J, GlaxoSmithKline США, 1997; ЕС, 1998Genentech; Biogen IDEC Профилактика отторжения при США, 1997; EC, 1999 трансплантации почки Профилактика инфекции RSV США, 1998; EC, 1999 Roche (Швейцария) Профилактика отторжения при США, 1998; EC, 1998 трансплантации почки Опухоли молочной железы США 1998; EC, 2000 Novartis MedImmune Genentech Centocor Wyeth-Ayerst Laboratories Genzyme РА, псориазный артрит США, 2002 ; ЕС, 2004 США, 2002; EC, 2003 Abbott Laboratories Разрушение В-Лф Блокировка активации Т-Лф В-НХЛ Псориаз США, 2003 США, 2003 GlaxoSmithKline Genentech; Xoma НД Рак легких КНР, 2003 Препятствие выходу IgE Блокировка EGFR Аллергическая астма Рак прямого кишечника США, 2004 США, 2004 MediPharm Biotech (КНР) Genentech ImClone Systems США, 2004 Genentech США, 2004 Biogen Idec, Elan РФ, 2004 Фрамон ООО (Россия) vEGF Инактивация vEGF при Рак прямого кишечника связывания с vEGF-R Гуманизированные IgG4 α4-субъед. Инегри- Угнетение миграции иммун-ных Множественный склероз клеток в очаг воспаления нов α4β1 и α4β7 Мышиные F(ab)’2 gpIIb-IIIa Препятствие взаимодействию Профилактика тромбоза артерий тромбоцитов с фибриногеном при коронаропластике Biogen Idec Гуманизированные EGF-R Инактивация EGF-R Крупноклеточный рак легких КНР, 2005 YM Bioscience (Канада) Гуманизированные, IgG1 IL-6 Связывание IL-6 Болезнь Castleman Япония, 2005 Chugai Pharma USA Человеческие IgG2 EGF-R Рак прямого кишечника США, 2006 Abgenix, Amgen Гуманизированные, IgG1 Fab vEGF Снижение содержания EGF-R в опухолевой клетке Блокировка ангиогенеза Возрастная дегенерация роговицы глаза США, 2006 Genentech; Novartis Работа по исследованию функциональных свойств моноклональных анти-D препаратов выполнена в лаборатории физиологии кроветворения ГНЦ РАМН с участием сотрудников отдела заготовки крови ГНЦ РАМН, стационара дневного пребывания ГНЦ РАМН, станции переливания крови ДЗ г. Москвы, при финансовой поддержке РФФИ и ООО«Гематолог» Возможные иммунные реакции организма на введение по-разному гликозилированных анти-D МКА человека МКА с «чужим» сахаром Рецепторы системы врожденного иммунитета Взаимодействие с FcγRIIb на В клетках МКА со «своим» сахаром, способное взаимодействовать с FcγRIII Взаимодействие с FcγR на макрофагах селезенки Реакции воспаления, презентация АГ, синтез антител Инактивация антигенспецифических клонов В-клеток, нет синтеза антител Фагоцитоз, невоспалительный путь клиренса АГ, нет синтеза антител
