На правах рукописи Титушин Максим Сергеевич БЕЛОК
advertisement
На правах рукописи Титушин Максим Сергеевич БЕЛОК-БЕЛКОВЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫХ СИСТЕМАХ КИШЕЧНОПОЛОСТНЫХ RENILLA MUELLERI И CLYTIA GREGARIA 03.00.02 – биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Красноярск – 2009 Работа выполнена в лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН, г. Красноярск Научный руководитель: Кандидат биологических наук Высоцкий Евгений Степанович Официальные оппоненты: Доктор физико-математических наук Овчинников Сергей Геннадьевич Кандидат биологических наук Межевикин Владислав Валентинович Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт Биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Защита состоится «___»_______________ 2009 г. в _____ час. на заседании диссертационного совета Д 003.007.01 в Институте биофизики СО РАН по адресу: 660036, г. Красноярск, Академгородок, д. 50, стр. 50. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики СО РАН Автореферат разослан «___»_______________ 2009 г. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук 2 Франк Л.А. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Классическими представителями целентеразинзависимых биолюминесцентных систем являются системы мягкого коралла Renilla и медузы Aequorea. Главный компонент биолюминесцентной системы Aequorea, Ca2+-регулируемый фотопротеин акворин, представляет собой комплекс из белка и нековалентно связанного 2-гидропероксицелентераизна. Биолюминесценция возникает при добавлением ионов кальция, инициирующих реакцию декарбоксилирования 2-гидропероксицелентеразина. В результате образуется молекула целентерамида в возбужденном состоянии и CO2. Переход целентерамида в основное состояние сопровождается излучением кванта света. В биолюминесцентной системе Renilla функции фотопротеина как бы поделены между двумя белками: Ca2+-зависимый целентеразинсвязывающий белок (CBP) хранит субстрат и реагирует на ионы кальция, а люцифераза катализирует окисление целентеразина при участии кислорода. Окисление целентеразина в активном центре люциферазы или фотопротеина сопровождается излучением в голубой области спектра, тогда как свечение медузы Aequorea и коралла Renilla является зеленым. Это обусловлено наличием зеленого флуоресцентного белка (GFP), который выступает в роли акцептора энергии возбужденного состояния продукта, целентерамида, и который, затем, излучает в зеленой области спектра. Поскольку такой безызлучательный перенос энергии наблюдается в сильно разбавленных растворах донорного и акцепторного белков, было сделано заключение, что перенос происходит с образованием белок-белкового комплекса. Однако достоверно образование комплекса было показано только для люциферазы и GFP из Renilla, но не для фотопротеина и GFP из Aequorea. Впервые формирование комплекса в биолюминесцентной системе фотопротеинового типа было косвенно показано для клитина и GFP из медузы Clytia в лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН. Однако в силу слабой природы взаимодействия клитина и GFP не удалось получить кристаллы комплекса, а следовательно, и определить его структуру. Пространственная структура комплекса представляет фундаментальный интерес, поскольку в рамках этого комплекса происходит безызлучательный перенос энергии, понимание механизма которого важно не только для биолюминесценции, но и для процессов фотосинтеза и дыхания. Другое направление исследований было связано с изучением биолюминесцентной системы морского коралла Renilla, в которой белок-белковое взаимодействие между люци3 феразой и GFP было продемонстрировано в работах американских ученых более 30 лет назад. Тогда же было высказано предположение, что все 3 белка системы Renilla: люцифераза, CBP и GFP – функционируют в комплексе, однако дальнейших исследований в этом направлении проведено не было. Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось определение пространственных структур белок-белковых комплексов между Са2+регулируемым фотопротеином клитином и зелёным флуоресцентным белком (GFP), а также Са2+-регулируемым целентеразин-связывающим белком (CBP) и люциферазой, входящими в состав биолюминесцентных систем медузы Clytia gregaria и мягкого коралла Renilla muelleri, соответственно. Выполнение исследования требовало решения следующих задач: 1. Изучить биохимические и спектральные свойства CBP и кинетику биолюминесцентной реакции люциферазы Renilla с СВР в качестве «субстрата», а также, предполагая вид поверхности взаимодействия белков, рассчитать пространственную структуру комплекса при помощи программы стыковки («докинга») HADDOCK2.0. 2. Получить 13С,15N-меченые клитин и GFP для исследования методом ЯМР, провести отнесение резонансов в 1Н-15N HSQC спектрах клитина и GFP и на основе данных ЯМР-титрования определить аминокислотные остатки обоих белков, формирующие поверхность взаимодействия. 3. Учитывая данные об аминокислотных остатках поверхности взаимодействия, рассчитать пространственную структуру комплекса клитин-GFP в программе HADDOCK2.0, а также с помощью мутантов клитина, полученных олигонуклеотид-направленным мутагенезом, экспериментально подтвердить правильность рассчитанной структуры комплекса. При решении поставленных задач получены результаты, которые выносятся на защиту: 1. Исходя из кинетических характеристик реакции люциферазы с СВР, спектральных свойств CBP, а также кристаллических структур люциферазы и CBP из Renilla muelleri рассчитана пространственная структуры комплекса люцифераза-CBP-Ca2+. 2. Методом ЯМР-титрования с использованием изотопно-меченых белков определены аминокислотные остатки поверхности взаимодействия клитина и GFP. 3. На основе данных о кристаллических структурах клитина и GFP и данных об аминокислотных остатках зоны контакта рассчитана пространственная 4 структура комплекса клитин-GFP, правильность которой подтверждена экспериментально. Научная новизна и практическая ценность работы. Все результаты, представленные в данной работе, получены впервые и имеют фундаментальный характер, так как добавляют новую информацию для понимания устройства и функционирования биолюминесцентных систем кишечнополостных, а также роли белок-белковых взаимодействий в этих процессах. Кроме того, комплекс клитин-GFP является хорошей модельной системой для исследования деталей молекулярного механизма индуктивно-резонансного переноса энергии в белковых структурах. Полученные результаты могут найти применение и в прикладных исследованиях. Так, использование CBP в качестве субстрата для люциферазы Renilla может повысить чувствительность биолюминесцентного анализа. В свою очередь, система клитин-GFP является новым перспективным кандидатом для использования в BRET системах, широко используемых для прижизненной визуализации белок-белковых взаимодействий в клетках и целых организмах. Данные о пространственной структуре комплекса клитин-GFP являются основой для возможной модификации белков в комплексе с целью повышения эффективности переноса энергии и, следовательно, чувствительности BRET анализа. Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались на Международной Конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2004); Конференции молодых ученых КНЦ СО РАН (Красноярск, 2007); на Международном симпозиуме по Биолюминесценции и Хемилюминесценции (Шанхай, 2008); на семинарах лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН и Национальной лаборатории биологических макромолекул Института биофизики Пекина (КНР). Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 печатные работы. Результаты структурных исследований включены в международные базы данных PDB и BMRB. Структура и объем работы. Работа изложена на страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, описание методов исследования, изложение результатов исследования, заключение, выводы и список цитируемой литературы ( источников). Диссертационная работа проиллюстрирована рисунками, содержит таблицы. 5 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Клонирование и получение экспрессионных плазмид для клитина и GFP из Clytia gregaria и для люциферазы и CBP из Renilla muelleri было выполнено старшим научным сотрудником лаборатории фотобиологии ИБФ СО РАН Марковой С.В. Олигонуклеотид-направленный мутагенез клитина проводили методом ПЦР с использованием Quick-Change site-directed mutagenesis kit. Трансформированные клетки E. coli (штаммы BL21-RIL и XL1-Blue) культивировали в LB-среде, содержащей ампициллин. Индукцию проводили добавлением ИПТГ. Для получения изотопно-меченых клитина и GFP трансформированные клетки выращивали в минимальной M9 среде, содержащей 15 NH4Cl и 13C-глюкозу. Для получения дейтерированного GFP минимальная среда готовилась на тяжёлой воде D2O. Выделение и очистку рекомбинантных белков, их мутантных или изотопно-меченых форм проводили по схемам, разработанным в лаборатории фотобиологии ИБФ СО РАН. Апо-клитин и апо-CBP выделяли из телец включений, проводили рефолдинг с субстратом целентеразином и очищали с помощью ионообменной хроматографией. Люциферазу и GFP выделяли из клеточного лизата металл-аффинной хроматографией за генетически пришитый полигистидиновый фрагмент, который затем удаляли инкубацией с TEV протеазой или энтерокиназой. Все белки дополнительно очищались при помощи гель-фильтрации. Спектры поглощения белковых растворов регистрировали при помощи спектрофотометра UVIKON 943. Кинетику биолюминесцентной реакции люциферазы измеряли с использованием люминометра БЛМ 8802. Спектры биолюминесценции люциферазы и флуоресценции CBP измеряли на спектрофлуориметре AMINCO. Спектры биолюминесценции клитина и его мутантных форм в комплексе с GFP, а также кинетику люминесцентного сигнала измеряли с помощью планшетного спектрофлуориметра Varioskan. Все спектры корректировались на чувствительность ФЭУ к различным длинам волн, а также с учетом кинетики спада биолюминесцентного сигнала. Поиск условий кристаллизации клитина выполняли с использованием 384 коммерческих растворов при помощи робота Mosquito и 96-луночного планшета методом сидячей капли. Дифракционные данные получали при облучении кристаллов длинной волны 1,54 Ǻ рентгеновского излучения от трубки с вращающимся анодом Rigaku. Фазы рассчитывали в программе 6 PHASER по методу «молекулярных замен» с использованием структуры обелина из Obelia geniculata (код в PDB банке 1JFO) в качестве модельной. Модель белка автоматически строили с помощью программы PHENIX. Расчет параметров модели и ее усовершенствование выполняли в программах MOLPROBITY и COOT. Гетероядерные ЯМР спектры регистрировали на ЯМР спектрометрах Bruker DMX 600 и Bruker Advance 800 с рабочей частотой на протонах 600 МГц и 800 МГц, соответственно. Отнесение резонансов 15N и 1Н клитина проводили на основании гетероядерных спектров 15N-HSQC, 3D 1H-15N-13C HNCA, HNCACB, CBCA(CO)NH, HNCO, HN(CA)CO, HBHA(CBCA)NH и HBHA(CBCA)(CO)NH при температуре 293 K с использованием 13C,15Nмеченого клитина. Отнесение резонансов 15N и 1Н GFP проводили на основании гетероядерных спектров 3D HNCACB, CBCA(CO)NH, HNCO и HN(CA)CO с использованием 2H,13C,15N-меченого GFP и спектра модифицированного 4D 13C,15N-NOESY, используя 13C,15N-меченый GFP, при температуре 310 K. Аминокислотные остатки клитина и GFP, «затронутые» взаимодействием в рамках комплекса клитин-GFP, определяли в серии титрований 15Nмеченого клитина немеченым GFP или 2H,15N-меченого GFP немеченым клитином (или его мутантными формами). Полученные 15N-HSQC спектры сравнивали с исходными спектрами и рассчитывали величину возмущения химического сдвига для каждого резонанса. Структуру комплекса клитин-GFP и люцифераза-CBP-Ca2+ рассчитывали с помощью программы «многозначной управляемой стыковки белков» HADDOCK2.0 на ядре CNS при использовании пространственных структур клитина (код в PDB банке 3KPX) и GFP (код в PDB банке 2HPW), люциферазы и CBP-Ca2+ (код в PDB банке 2HQ8) и ограничений по взаимодействующим аминокислотным остаткам. Метод последовательных приближений включал стадии жёсткой и гибкой стыковок и стадию уточнения структур в водном окружении. Результаты расчётов ранжировались в соответствии со значением свободной энергии связывания пространственных структур, которая включает термы Ван-дер-Ваальсовых и электростатических взаимодействий, десольватации, соответствия ограничениям по взаимодействующим аминокислотам и площади поверхности контакта. 7 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Доказательство существования комплекса Renilla люцифераза-CBP Целентеразин-связывающий белок (CBP) содержит в своём составе молекулу целентеразина, который становится доступным для окисления люциферазой после связывания Ca2+ с образованием продукта реакции – целентерамида. В спектре поглощения CBP имеется характерный белковый пик на 280 нм и пик, соответствующий поглощению молекулы целентеразина (444 нм). Связывание Ca2+ смещает максимум поглощения CBP в видимой области на 12 нм (432 нм). Однако этот спектр отличается от спектра поглощения свободного целентеразина в водном растворе (рис. 1А). Это позволяет сделать заключение, что целентеразин остаётся связанным с молекулой CBP после присоединения Ca2+, а изменения в спектре поглощения комплекса CBPСа2+ отражают конформационные перестройки в белковой молекуле. Такие перестройки, очевидно, делают целентеразин более доступным для окисления люциферазой, а следовательно, и для некаталитического окисления растворённым в воде кислородом. Некаталитическое окисление целентеразина идёт медленно, а образующийся целентерамид остаётся связанным с CBP, о чём свидетельствует слабая флуоресценция CBP (532 нм), возрастающая при добавлении Ca2+ (рис. 1Б). Известно, что флуоресцентными свойствами обладает молекула целентерамида в белковом, но не водном окружении. Для примера показана флуоресценция целентерамида в обелине после добавления ионов кальция (рис. 1Б). Рис. 1. (А) Спектры поглощения CBP, CBP со связанным кальцием и свободного целентеразина (CE). (Б) Спектры флуоресценции обелина и CBP после добавления ионов кальция. 8 Биолюминесцентная реакция люциферазы in vitro может быть инициирована как добавлением целентеразина, так и раствора Са2+ в смесь люциферазы и CBP (схема рис. 2). Рис. 2. Кинетические исследования биолюминесцентной реакции люциферазы при запуске реакции целентеразином или ионами Ca2+ в присутствии CBP. (А) Зависимость люминесцентного сигнала от концентрации целентеразина и CBP. (Б) Кинетика люминесцентного сигнала в реакции с целентеразином и CBP. (В) Определение Km и Vmax из графика Лайнувера-Берга. (Г) Спектры биолюминесценции с целентеразином и СВР. 9 Кинетические исследования показали, что интенсивность свечения люциферазы в реакции с CBP в несколько раз выше, чем с целентеразином во всём диапазоне концентраций субстрата (рис. 2А). Из графика ЛайнувераБерга (рис. 2В) определены кинетические параметры реакции (Km, Vmax) и показано, что люцифераза совершает в 6 раз большее число оборотов с CBP, чем со свободным целентеразином (Vmax(CE) = 1080 отн.ед., Vmax(CBP) = 6700 отн.ед. при одинаковых концентрациях люциферазы). Общая эффективность работы люциферазы, оценённая из kcat/Km, в реакции с CBP в 2,5 раза выше, чем с целентеразином (kcat(CBP)/Km(CBP) = 136 мкМ-1с-1, kcat(CE)/Km(CE) = 57 мкМ1 -1 c ). Квантовый выход реакции при использовании CBP в качестве «субстрата» также в 2 раза выше, чем со свободным целентеразином (рис. 2Б). Спектры биолюминесценции с СВР и свободным целентеразином практически идентичны, что свидетельствует об общем молекулярном механизме окисления целентеразина в активном центре люциферазы (рис. 2Г). Полученные данные позволили сделать заключение, что протекание биолюминесцентной реакции требует образования короткоживущего белокбелкового комплекса между люциферазой и CBP, в рамках которого происходит доставка целентеразина в активный центр люциферазы. Увеличение квантового выхода реакции с CBP, вероятно, может быть объяснено ослаблением колебательной релаксации возбужденного состояния целентерамида в более жёстком белковом окружении. Пространственная структура комплекса Renilla люцифераза-CBP Пространственные кристаллические структуры CBP из Renilla muelleri 2+ в Ca -свободном и Ca2+-связанном состояниях были определены научным сотрудником лаборатории фотобиологии ИБФ СО РАН Степанюк Г.А. Пространственная структура CBP имеет вид глобулы, подобной глобуле фотопротеинов (рис. 3А). Примечательно, что конформационные перестройки в молекуле CBP в ответ на связывание Ca2+ приводят к образованию отверстия на поверхности белковой глобулы, которое открывается непосредственно в целентеразин-связывающую полость белка (рис. 3Б). Поскольку, как было показано, целентеразин остаётся в CBP при связывании Ca2+, представляется наиболее вероятным, что его доставка в активный центр люциферазы осуществляется непосредственно через образующееся отверстие. Пространственная структура люциферазы из Renilla muelleri была получена в результате компьютерного моделирования в программе 10 SWISSMODEL с использованием кристаллической структуры люциферазы из Renilla reniformis в качестве первичной модели. В силу высокой гомологии аминокислотных последовательностей данных люцифераз Renilla (98 %) пространственные структуры люциферазы из Renilla muelleri (модель) и люциферазы из Renilla reniformis практически идентичны (среднеквадратичное отклонение RMSD 1,0 Ǻ). Моделирование пространственной структуры комплекса люциферазаCBP-Ca2+ проводили с помощью программы стыковки («докинга») HADDOCK2.0 и первичных структур люциферазы и CBP-Ca2+. Аминокислотные остатки, окружающие активный центр люциферазы и отверстие на поверхности CBP, составили условия ограничения стыковки (остатки D158, E161, K173, E183, S188 люциферазы и Q67, V74, E80, S88, E96, Q103 CBP). Рассчитанные структуры ранжировали в соответствии со свободной энергией связывания. Для более чем 60% структур среднеквадратичное отклонение координат (RMSD) от структуры с наименьшей свободной энергией связывания составило 7.5 Ǻ. Пространственная структура комплекса с наименьшей свободной энергией связывания представлена на рис. 3В. Зона контакта люциферазы и CBP сформирована в равной степени остатками заряженных и нейтральных аминокислот, которые образуют относительно небольшое число водородных связей и гидрофобных контактов. Площадь поверхности контакта составляет порядка 1800 Ǻ2, что является средним значением для известных белокбелковых комплексов. Поверхность CBP имеет участки с преобладающим положительным зарядом (R9, K91, K93, K97, K209) и преобладающим отрицательным зарядом (D66, E95, E96), которые комплементарны соответствующим участкам поверхности люциферазы, сформированным остатками D158, E160, E161, D162 и K4, K189, K193, K282 (рис. 3В). Перечисленные особенности являются характерными для слабых белок-белковых взаимодействий. Отверстие, открывающееся в субстрат-связывающую полость CBP, располагается напротив активного центра люциферазы. Образующийся белковый «карман» вполне вероятно может экранировать возбуждённое состояние целентерамида и тем самым обеспечивать наблюдаемое повышение квантового выхода реакции. 11 Рис. 3. Изображение поверхности белковой глобулы CBP в целентеразин- (А) и Са2+-связанной (Б) формах. Стрелка показывает «отверстие» на поверхности CBP, образующееся в результате связывания Ca2+. (В) Пространственная структура комплекса люцифераза-CBP-Ca2+, рассчитанная в программе стыковки HADDOCK2.0. Электростатический потенциал поверхности показан для CBP с кальцием (верхняя молекула) и люциферазы (нижняя молекула). Стрелками отмечены участки комплементарности электростатических потенциалов поверхностей (синий цвет соответствует положительному заряду, красный – отрицательному). 12 Поверхность взаимодействия клитина и GFP из Clytia gregaria, определённая методом ЯМР-титрования В присутствии мкМ концентраций GFP спектр биолюминесценции клитина (λmax = 470 нм) становится практически идентичен спектру флуоресценции GFP (λmax = 500 нм) (рис. 4). Очевидность безызлучательного переноса энергии в данной системе следует из сохранения квантового выхода реакции. Сближение хромофоров на расстояние не менее 100 Ǻ (необходимое условие для индуктивно-резонансного переноса энергии) при мкМ концентрациях белков представляется возможным лишь в рамках белок-белкового комплекса. Несмотря на то, что исходя из биолюминесцентного анализа KD комплекса клитин-GFP лежит в мкМ диапазоне (10-6 М), из существующих на сегодняшний день методов (гель-фильтрация, аналитическое ультрацентрифугирование, плазмонный резонанс, ЯМР) образование комплекса удалось показать только методом ЯМР (чувствительность 10-2 М). В ходе работы также не удалось получить кристаллы комплекса клитин-GFP, хотя по отдельности клитин и GFP образовывали кристаллы, которые были использованы для определения их пространственных кристаллических структур с высоким разрешением (1,9 Ǻ для клитина и 1,55 Ǻ для GFP). Рис. 4. Спектры биолюминесценции клитина (0,057 мкМ) при разных концентрациях GFP (0 – 4,24 мкМ). Чёрным цветом показан спектр флуоресценции GFP. Клитин представляет собой компактную белковую глобулу (Mr 22,4 кДа), сформированную 8-ю α-спиралями (А – H), и имеет 3 Са2+связывающих петли (I, III, IV) (рис. 5А). Структура клитина высоко гомологична структуре фотопротеина обелина (RMSD 0.66 Ǻ); целентеразинсвязывающие полости обоих белков сформированы идентичными аминокислотными остатками. N-конец клитина (T2 – A9) не структурирован, поэтому для него отсутствуют данные электронной плотности. 13 Кристаллическая структура GFP была определена научным сотрудником Института биофизики СО РАН Степанюк Г.А. Пространственная структура GFP (Mr мономера 26,6 кДа) имеет вид «бочонка», сформированного 11ю β-слоями (S1 – S11) (рис. 5Г). В центре «бочонка» расположен хромофор – результат автокаталитической циклизации аминокислот S68, Y69 и G70. Уникальная структура «бочонка» эффективно изолирует хромофор от внешней среды, обеспечивая высокий квантовый выход флуоресценции GFP. В растворе GFP образует гомодимер (Mr 53,2 кДа), что подтверждено данными гель-фильтрации и аналитического ультрацентрифугирования. Для проведения ЯМР экспериментов были получены образцы клитина и GFP, меченые изотопами 13C и 15N. Для образца 2Н,15N- и 2H,13C,15Nмеченого GFP были подобраны условия обратимой денатурации белка с целью замены способных к обмену атомов 2Н N-H групп на атомы 1Н. Основой для определения аминокислотных остатков клитина и GFP, формирующих зону контакта, послужили двумерные спектры HSQC (гетероядерный одноквантовый перенос когерентности), полученные на ядрах 1H и 15N. Каждый кросс-пик (резонанс) такого спектра соответствует N-Н группе основной цепи белка и боковых радикалов аминокислот Asn, Gln, Trp, His и Arg. Образование белкового комплекса меняет локальное электронное окружение аминокислот поверхности взаимодействия, что отражается в изменении химического сдвига соответствующих кросс-пиков в HSQC спектре. Последовательное отнесение 1Н и 15N химических сдвигов основной цепи клитина и GFP проводили, как описано в материалах и методах. Отнесение осложнялось относительно большими размерами белковых молекул (клитин 22,4 кДа и димер GFP 53,2 кДа). Проблему уширения линий ЯМР сигналов GFP по причине быстрой релаксации решали с использованием образца ренатурированного 2Н,13С,15N-меченого GFP. На основе значений химических сдвигов атомов 1HN, 1Hα, 1Hβ, 15N, 13CO, 13Cα, 13Cβ было проведено отнесение 95% резонансов клитина и GFP. Сравнение 1Н-15N HSQC спектров изолированного 15N-клитина и 15Nклитина в смеси с немеченым GFP позволило определить кросс-пики, которые испытывают возмущение химического сдвига в результате комплексообразования, и соотнести их с конкретными аминокислотными остатками белка (рис. 5Б). Аналогично определяли «возмущенные» аминокислотные остатки GFP (рис. 5Д). Величину возмущения химического сдвига (ВХС) рассчитывали поформуле: 14 Рис. 5. Определение методом ЯМР-титрования аминокислотных остатков поверхности взаимодействия клитина и GFP. На пространственных структурах клитина (А) и GFP (Г) «возмущенные» остатки показаны в виде цветных линий и обозначены цветом на поверхности белка. (Б, Д) участки 1H-15N HSQC спектров, полученные наложением спектров 15N-меченого клитина (Б, чёрный цвет) и 2H,15N-меченого GFP (Д, чёрный цвет) при добавлении немеченых GFP (Б, синий) и клитина (Д, пурпурный). (В, Д) Возмущение химического сдвига (ВХС) аминокислотных остатков клитина (В) и GFP (Е) при титровании немеченым GFP и клитином, соответственно. Порог в 1 и 2 среднеквадратичных отклонения показан серым и синим (пурпурным) цветами. 15 ВХС = sqrt(∆δH2 + 0.2∆δN2) (1), где ∆δN и ∆δH – изменение величины химического сдвига 15N и 1Н, выраженной в миллионных долях (м.д.). Параметр «возмущённые» присваивался аминокислотным остаткам, для которых значение ВХС превышало среднее возмущение всех остатков на величину среднеквадратичного отклонения (рис. 5В,Д), а также остаткам со значительным уменьшением интенсивности кросс-пиков. Возмущение химических сдвигов (и интенсивности сигналов) затрагивает 23 остатка клитина, большинство которых формирует равномерную поверхность на пространственной структуре клитина (рис. 5А). Определенная таким образом поверхность взаимодействия клитина с GFP включает аминокислотные остатки участков N-конца (А9 – E17), α-спирали D (K100 – N109) и C-концевого сегмента (G180 – Y193), которые в молекуле клитина пространственно сближены. Возмущение некоторых остатков (L103, L105, G180, T184, L192, Y193), не доступных растворителю, можно объяснить близостью их пространственного расположения к остаткам поверхности взаимодействия. Возмущение химических сдвигов затрагивает 25 остатков GFP, которые входят с состав петли S3-S4 и следующей за ней короткой α-спирали (D55 – S65), протяженной петли S6-S7 (K132 – H149) и петли S10-S11 (G209 – D218). Поверхность взаимодействия GFP с клитином выглядит боле дискретной (рис. 5Г), поскольку для ряда остатков, находящихся в «зоне возмущения» не удалось провести отнесение, либо разделить сигналы в силу высокой степени перекрытия (P57, S133, N134, I137, R141, Y144, P147, P148, A150, K168, D171, V172, G174, P212, D215). Интересно возмущение остатков GFP, не доступных растворителю (V58, T60, A61, T62, I63, S65, F85б S146, H149), которые как бы соединяют поверхность контакта с хромофором GFP, либо образуют водородные связи с хромофором (S146, H149). Вероятно, связывание клитина может приводить к минорным конформационным перестройкам центральной оси GFP, несущей хромофор. Пространственная структура комплекса Clytia клитин-GFP Поверхности взаимодействия с клитином мономеров GFP в димере расположены таким образом, что молекула клитина не может занять оба сайта связывания одновременно. Поэтому 1 мономер GFP способен связать 1 мономер клитина, а в растворе вполне вероятен тетрамерный симметричный комплекс (2 молекулы клитина : 1 молекула димера GFP). Для упрощения 16 расчетов модели пространственной структуры комплекса в программе HADDOCK2.0 в качестве исходной бралась структура мономера GFP. Более 40 % рассчитанных структур составляют кластер с наименьшим значением свободной энергии связывания; среднеквадратичное отклонение (RMSD) координат структур в «лучшем» кластере не превышает 4 Ǻ. Пространственная структура комплекса с наименьшей свободной энергией связывания представлена на рис. 6. Выражена комплементарность формы поверхностей белков: α-спираль D клитина занимает «желоб» на вершине «бочонка» GFP, сформированного петлями S6-S7 и S10-S11. Хромофоры белков в комплексе сближены на расстояние (45 Ǻ), которое является более чем достаточным для обеспечения эффективного индуктивно-резонансного переноса энергии. Рис. 6. Стереоизображение пространственной структуры комплекса клитин-GFP. Указано расстояние между хромофорами (45 Ǻ). Отмечены элементы вторичной структуры, формирующие зону контакта (N-конец и αспираль D клитина; петли S6-S7 и S10-S11 GFP). Зона контакта белков (площадь 1900 Ǻ2) характеризуется выраженной комплементарностью электростатических потенциалов поверхностей клитина и GFP (рис. 7): положительный заряд сосредоточен на участке поверхности клитина (K11, K13, K100, K104), а отрицательный – на поверхности GFP (D211, D213, D214, D215, E216). Другой участок взаимодействия сформирован аминокислотными остатками подвижного N-конца клитина (T2, D3, T4, A5, S6, K7, Y8, A9, V10) и участка петли S6-S7 GFP (S133, N134, L138, G139, M140, R141). Более высокая вариабельность контактов в этом участке отражает конформационную подвижность N-конца клитина. В целом, природа контактов поверхности взаимодействия клитина и GFP характерна для слабо взаимодействующих белков, что хорошо соотносится с данными ЯМРтитрования (KD комплекса 10-2 – 10-3 М). Однако в биолюминесцентных экс17 периментах высокоэффективный перенос энергии происходит при мкМ концентрациях белков. Этот факт позволяет сделать предположение, что существует два типа комплексов клитин-GFP: «возбужденный» комплекс, в рамках которого аффинность белков увеличивается на несколько порядков, и «невозбужденный» комплекс с низкой аффинностью, который, фактически, определяется с помощью ЯМР-титрования. Рис. 7. Зона контакта клитина и GFP. Электростатический потенциал поверхности показан для GFP (А) и клитина (Б). Поверхность окрашена в соответствии с зарядом аминокислотного остатка (отрицательный – красным, положительный – синим и нейтральный – белым цветами). Аминокислотные остатки зоны контакта показаны в виде цветных линий (синих – для клитина и пурпурных – для GFP). 18 Экспериментальное подтверждение структуры комплекса клитин-GFP Некоторые из аминокислотных остатков клитина, формирующих поверхность контакта с GFP, были заменены на аланин методом олигонуклеотид-направленного мутагенеза (K11A, K13A, N15A, N109A, N188A). Также были получены мутанты клитина с укороченным N-концом (5А, 10V). Влияние мутаций на эффективность переноса энергии оценивали с помощью константы Ket, рассчитанной из биолюминесцентных спектров клитина и его мутантных форм в комплексе с GFP. Дополнительно мутанты клитина K11A, K13A, N188A и 5A использовали для ЯМР-титрования 2Н,15N-меченого GFP с целью оценить эффект мутации на аффинность белков в комплексе, которая оценивалась по степени возмущения кросс-пиков GFP. Все исследованные аминокислотные замены клитина снижали эффективность переноса энергии и аффинность белков друг к другу. Минимальный и максимальный эффекты показаны на примере мутантов N188A и K11A, соответственно (рис. 8). Интересно, что эффект от аминокислотных замен положительно заряженных K11 и K13 сопоставим с эффектом от делеции 8 остатков N-конца клитина. Это может подтверждать значительный вклад электростатического взаимодействия в образование комплекса клитин-GFP. Рис. 8. (А) Спектры биолюминесценции клитина (WT) и его мутантных форм (N188A, K11A) при титровании GFP. (Б) Возмущение химического сдвига аминокислотных остатков 2H,15N-меченого GFP при добавлении 2кратного молярного избытка клитина и его мутантных форм. 19 ВЫВОДЫ 1. Определены кинетические характеристики ферментативной реакции, катализируемой люциферазой из коралла Renilla muelleri, с целентеразином и целентеразин-связывающим белком (CBP). Показано, что использование CBP в качестве «субстрата» в два раза повышает эффективность работы люциферазы. 2. На основе кристаллических структур люциферазы Renilla и CBP, связанного с кальцием, рассчитана пространственная структура комплекса люцифераза-CBP-Ca2+, объясняющая высокую эффективность биолюминесцентной реакции с СВР в качестве «субстрата» люциферазы. 3. Впервые получены кристаллы и определена кристаллическая структура 2+ Са -регулируемого фотопротеина клитина из медузы Clytia gregaria с разрешением 1,9 Ǻ. Показано, что пространственная структура клитина высоко гомологична структуре фотопротеина обелина. 4. Впервые получены 13С,15N-меченый клитин и 2Н,13С,15N-меченый зеленый флуоресцентный белок (GFP) и проведено полное отнесение резонансов основных цепей в 1Н-15N HSQC ЯМР спектрах этих белков. С помощью ЯМР-титрования определены аминокислоты клитина и GFP, формирующие поверхность взаимодействия белков. Установлено, что основными аминокислотными остатками зоны контакта клитина являются остатки N-конца, α-спирали D и С-конца белковой молекулы. Показано, что поверхность контакта GFP более дискретна и образована аминокислотами петель S3-S4, S6-S7 и S10-S11 верхушки «бочонка». 5. Используя кристаллические структуры клитина и GFP с учетом аминокислотных остатков поверхности взаимодействия, рассчитана пространственная структура комплекса клитин-GFP, отражающая взаимную ориентацию белков. Так как, KD комплекса клитин-GFP, оцененная из биолюминесцентных измерений, лежит в µМ диапазоне, а из данных ЯМР – в мМ диапазоне, сделан вывод, что структура комплекса клитин-GFP соответствует комплексу, предшествующему «возбужденному состоянию». 6. Получены мутанты клитина с заменами некоторых аминокислот, формирующих зону контакта. С помощью ЯМР и биолюминесцентных измерений показано, что замены уменьшают эффективность образования комплекса. Это является дополнительным подтверждением правильности рассчитанной структуры комплекса клитин-GFP. 20 СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ 1. Titushin, M.S. Coelenterazine-binding protein of Renilla muelleri: cDNA cloning, overexpression, and characterization as a substrate of luciferase / M.S. Titushin, S.V. Markova, L.A. Frank, N.P. Malikova, G.A. Stepanyuk, J. Lee, E.S. Vysotski // Photochem. Photobiol. Sci. – 2008. – V. 7 (2). – P. 189–196. 2. Titushin, M.S. Ca2+-dependent coelenterazine-binding protein of Renilla provides higher bioluminescence efficiency that free coelenterazine / M.S. Titushin, S.V. Markova, L.A. Frank, N.P. Malikova, G.A. Stepanyuk, J. Lee, E.S. Vysotski // Luminescence. – 2008. – V. 23 (2). – P. 95. 3. Титушин, М.С. Получение и некоторые биохимические свойства рекомбинантных белков биолюминесцентной системы коралла Renilla muelleri / М.С. Титушин // Материалы конференции молодых ученых КНЦ СО РАН. – Красноярск: ИВМ СО РАН, 2007. – С. 41 – 44. 4. Титушин, М.С. Получение и некоторые биохимические свойства рекомбинантных белков биолюминесцентной системы коралла Renilla muelleri / М.С. Титушин // Материалы XLIII международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс». – Новосибирск: Новосибирский Государственный Университет, 2005. – С. 91–92. 21
