Сохранение структуры и функции белков слезы человека с
advertisement
Контактная коррекция зрения УДК 617.7 Сохранение структуры и функции белков слезы человека с помощью нового универсального раствора для контактных линз Аннотация Цели. Белки, входящие в состав слезной пленки, выполняют антимикробную и другие функции, которые могут быть утрачены в результате денатурации при ношении контактных линз. Недавно появился новый универсальный раствор (Biotrue, Bausch & Lomb Inc., Рочестер, Нью- Йорк), в состав которого входят вещества, стабилизирующие структуру белка, в том числе гиалуроновая кислота, полоксамин и сульфобетаин 10, последний ранее использовался в лабораторных условиях для восстановления естественных свойств белков. Мы изучаем, возможно ли предотвращение денатурации лактоферрина и лизоцима человека, содержащихся в слезе в естественных количествах, под сильным воздействием факторов, вызывающих денатурацию, с использованием нового универсального раствора. Методы. Лактоферрин и лизоцим человека обрабатывали додецилсульфатом натрия (ДСН) как в присутствии опытного образца нового универсального раствора, так и без него [исследуемый многофункциональный раствор (иМФР)]. Структура оценивалась с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ), дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) и флюорометрии; кроме того, определялась противомикробная активность в отношении Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus. Результаты. иМФР предотвращал индуцированный ДСН сдвиг положения полос лактоферрина в ПААГ- электрофорезе. При обработке ДСН происходили значительные изменения в ДСК и спектре флюоресценции лактоферрина, что свидетельствует о денатурации белка. В присутствии иМФР такие изменения не наблюдались. Была продемонстрирована антибактериальная активность и бактериолитическая активность лактоферрина и лизоцима, которые исчезали после обработки ДСН, но сохранялись при обработке белков иМФР. Выводы. Полученные данные свидетельствуют о том, что иМФР предотвращает денатурацию имеющихся в естественных количествах, лактоферрина и лизоцима, которая спровоцирована активным поверхностно- активным веществом, вызывающим денатурацию, – ДСН; кроме того, стабилизированные белки сохраняют свою функцию. Мы пришли к выводу, что данный раствор способен стабилизировать структуру и функцию белков слезы. К л ю ч е в ы е с л о в а: белок слезы, денатурация, инфекционное поражение роговицы, контактная линза Э. А. Райт, кафедра манифестных инфекций, микробиологии и иммунологии Ливерпульского университета (Ливерпуль, Великобритания) К. A. П. Пэйн, факультет медико- биологических наук Манчестерского университета (Манчестер, Великобритания) T. A. Джовитт, врач- оптометрист, факультет медико- биологических наук Манчестерского университета (Манчестер, Великобритания) M. Ховард, врач- оптометрист, факультет медико- биологических наук Манчестерского университета (Манчестер, Великобритания) Ф. Б. Морган, врач- оптометрист, член Американской академии оптометрии, директор подразделения Eurolens Research Манчестерского университета (Манчестер, Великобритания) К. Мальдонадо- Кодина, врач- оптометрист, факультет медико- биологических наук Манчестерского университета (Манчестер, Великобритания) К. Б. Добсон, старший лектор, факультет медико- биологических наук Манчестерского университета (Манчестер, Великобритания) Перевод: Е. А. Плыкина, специалист по профессиональной поддержке компании Bausch + Lomb Статья опубликована в журнале Eye & Contact Lens (01.2012). Перевод печатается с разрешения редакции 4 ÑÎÂ ÐÅ ÌÅ ÍÍÀ ß ÎÏ ÒÎÌÅÒÐÈß Raj_Sohranenie_so05-12_s3.indd 4 С лезная пленка — это сложный слой внеклеточной жидкости, в состав которого входят секретируемые белки, гликопротеины, липиды и пептиды, защищающие и обеспечивающие питательными веществами передний отрезок глаза. Многие из этих компонентов выполняют противомикробную функцию, в том числе белки слезы четырех преобладающих видов (секреторный IgA, липокалин, лизоцим и лактоферрин), которые отвечают как за приобретенный иммунитет (секреторный IgA), так и за врожденные механизмы иммунной защиты [1]. Лактоферрин подавляет рост бактерий, конкурируя за железо и вызывая повреждение мембран бактерий [2], а также может препятствовать образованию биопленки [3]. Лизоцим гидролизует гликозидные связи бактериальных пептидогликанов, что приводит к лизису клетки [4]. Наблюдается синергизм этих двух белков, по крайней мере в отношении грамотрицательных бактерий [2]. Противомикробная функция слезной пленки была подтверждена в опы- ¹ 5 (и юнь) 2 012 04.06.2012 12:50:18 тах ex vivo [6, 7] и in vivo на мышах, инфицированных Pseudomonas aeruginosa [8], это явилось убедительным подтверждением того, что белки слезы играют важную роль в предотвращении колонизации поверхности глаза микроорганизмами. Белки слезы быстро накапливаются на поверхности и в материале контактной линзы in vit­ ro [9–11] и на контактных линзах во время ношения [12, 13]. Известно, что скопление белка на одной линзе варьировало от нескольких микрограммов до 1,4 мг в зависимости от продолжительности ношения [11, 14], раствора для ухода за линзами [12, 15, 16] и материала, из которого изготовлена линза [10, 17]. Абсорбция белков традиционными гидрогелевыми линзами значительно выше, чем у силикон- гидрогелевых линз [18], а виды иммобилизированных белков сильно варьировали в зависимости от материалов [19]. Абсорбированные белки часто подвергаются денатурации; степень денатурации лизоцима колеблется в широких пределах с учетом разных материалов [20]: от 23 до 90 % для некоторых типов силикон- гидрогелевых линз [18]. Денатурация лизоцима также увеличивается спустя некоторое время после абсорбции [21]. Бреннан (Brennan) и Коулс (Coles) [22] выдвинули предположение, что любое увеличение воспалительного ответа на ношение контактных линз в отношении силикон- гидрогелевых контактных линз может быть связано с более низким содержанием белков в слезе (а значит, с более низкой естественной противомикробной защитой). Данная информация касалась многих силикон- гидрогелевых материалов. Если продолжить эту линию рассуждений, можно предположить, что белковые отложения на поверхностях линзы могут обеспечивать определенную защиту от инфекционного поражения роговицы [инфекционного кератита (ИК)]. Вероятно, предотвращение денатурации белков будет способствовать сохранению их антимикробного действия. Результаты исследований действия отложений белков слезной пленки, не сообщали о значимой корреляции между количеством белковых отложений и нежелательными реакциями [23] или достоверным влиянием на адгезию бактерий [24–26]; тем не менее возможная корреляция между наличием натурального белка и положительными клиническими эффектами или между количеством денатурированных белков и возникновением нежелательных явлений не становилась еще предметом изучения. Растворы для ухода за контактными линзами либо устраняют белковые отложения (средства для очистки на основе поверхностно- активных веществ), либо непосредственно подавляют бактериальную колонизацию (пероксидные растворы или хлор содержащие растворы), либо выполняют обе эти функции [27, 28]. Сообщалось о закономерном изменении относительного содержания белков в слезной пленке после применения различных универсальных растворов [29]. Кроме того, наличие веществ, вызывающих денатурацию, в некоторых средствах для ухода за линзами (например, пероксида водорода, который вызывает денатурацию лизоцима [30]) может способствовать увеличению количества денатурированных белков слезы, закрепившихся на поверхностях линзы. Недавно был создан новый универсальный раствор (Biotrue, Bausch & Lomb Inc., Рочестер, Нью- Йорк), содержащий вещества, действие которых ранее связывали со стабилизацией белка. Сообщалось, что один из компонентов – гиа­ луроновая кислота, (несульфатированный гликозаминогликан, природный лубрикан) – в сочетании с другими веществами сохраняет белки (панкреатическую кининогеназу) в нативном состоянии [31], и его действием объяснялось уменьшение денатурации белка на границе твердой и жидкой фаз [32]. Другой компонент — поверхностно- активный полоксамин относится к классу веществ, которые уменьшают агрегацию белков, подвергнутых термической денатурации, в том числе белого лизоцима, содержащегося в куриных яйцах [33]. Новый универсальный раствор также содержит сульфобетаин 10 (N- децил- N,N- диметил- 3- аммонио- 1- пропансульфонат) – вещество, вызывающее восстановление естественных свойств белков, которое ранее в офтальмологии не применялось. Сульфобетаины — это лабораторные поверхностно- активные вещества, которые ранее использовались для изу­чения структуры и функции белков. В отличие от сильных детергентов, они содержат короткую гид­рофобную группу и гидрофильную головку, которая является цвиттер- ионом при наличии широкого диапазона уровня рН [34]. Компоненты сульфобетаина обеспечивают восстановление естественных свойств денатурированных белков, в том числе белого лизоцима, содержащегося в курином яйце, β-D- галактозидазы, триптофан- синтетазы и бычьего сывороточного альбумина [35–37], а также могут предотвращать агрегацию белка, взаимодействуя с промежуточными продуктами на ранних этапах свертывания [37]. Более того, сульфобетаины связывают и стабилизируют структуру белка, не оказывая воздействия на его функцию [38]. Новый универсальный раствор может предотвращать денатурацию и восстанавливать естественные свойства белков слезы. В данной статье представлены первые исследования способности исследуемого многофункционального раст­вора (иМФР), идентичного раствору Bio­true, но отличающегося от него отсутствием двух дезинфицирующих веществ, стабилизировать лактоферрин и лизоцим человека, также изучено противомикробное действие раствора при проведении исследований в условиях, соответствующих физио­ логическим, после сильного воздействия фактора, вызывающего денатурацию. ¹ 5 ( и юнь) 2 012 Raj_Sohranenie_so05-12_s3.indd 5 Ñ ÎÂÐ Å ÌÅ ÍÍÀß Î Ï Ò Î Ì ÅÒ ÐÈ ß 5 04.06.2012 12:50:18 Сохранение структуры и функции белков слезы человека с помощью нового универсального раствора... Материалы и методы Белки слезы и состав исследуемого многофункционального раствора Лактоферрин, выделенный из человеческого молока, или рекомбинантный лизоцим человека (Sigma-Aldrich, Джиллингем, Великобритания) растворяли в количестве 4,25 и 3,75 мг/мл соответственно в фосфатно- солевом буферном раст­ воре (ФСБР) (рН = 7,4) или в растворе искусственной слезы (РИС), в составе которого имелось в 2,5 раза больше солевых компонентов, чем в используемом обычно РИС [39] (283,7 ммоль/л NaCl; 57,7 ммоль/л KCl; 50 ммоль/л NaHCO3; 2,9 ммоль/л CaCl2 2H2O). Изученный иМФР был идентичен универсальному раст­вору Bio­ true, за исключением отсутствия в первом двух дезинфицирующих веществ, полигексам бигуанида и поликватрниума- 1, так как эти вещества могли препятствовать оценке антибактериальных свойств белков слезы. Раствор состоял из гиалуроновой кислоты, сульфобетаина 10, полоксамина, борной кислоты, натрия бората, натрия эдетата и натрия хлорида, и его концентрация в 2,5 раза превышала обычно используемую в клинической практике. Перед денатурацией растворы белков смешивали в соотношении 1 : 1 с иМФР или с дистиллированной водой, в результате получали раствор, содержащий РИС, иМФР и/или ФСБР. Протокол денатурации Додецилсульфат натрия (ДСН) – вещество, которое вызывает денатурацию большинства белков, – широко применяется для «разворачивания» белковых молекул перед электрофорезом в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия. Лактоферрин или лизоцим, содержащиеся в РИС или ФСБР, с иМФР или без него (способ приготовления последнего указан выше) смешивали с ДСН в различных концентрациях (0,1–0,8 %) (Sigma-Aldrich) так, чтобы РИС, ФСБР и иМФР в окончательной смеси были представлены в однократном разведении. Окончательная концентрация лактоферрина составляла 1,7 мг/мл, что соответствует обычной концентрации этого белка в слезе [1]; лизоцим использовался в концентрации 1,5 мг/мл, что несколько ниже его обычной концентрации (2,1 мг/мл [1]) в слезной пленке, с целью сохранить белок в растворе для последующей функциональной оценки. Также использовались контрольные образцы, не содержащие белка. Инкубирование осуществлялось при температуре 33 °С, нормальной температуре поверхности роговицы [40], в течение 1 ч. РИС использовался во время всех исследований, когда проводился ПААГ-электрофорез; тем не менее в связи с проблемами растворимости, имеющими место при использовании аналитических методик в структурном анализе других видов и в опытах по изучению функции, потребовалось применение ФСБР. 6 ÑÎÂ ÐÅ ÌÅ ÍÍÀ ß ÎÏ ÒÎÌÅÒÐÈß Raj_Sohranenie_so05-12_s3.indd 6 Структурный анализ лактоферрина Был проведен ПААГ- электрофорез с использованием 5 или 7 %- х полиакриламидных готовых гелей (и 4 %- го концентрирующего геля) (Bio- Rad Laboratories, Хемел Хемпстед, Великобритания). Образцы лактоферрина после инкубирования смешивали в соотношении 1 : 1 с образцом буферного раствора и добавляли по 8,5 мкг белка в каждую лунку. Бычий сывороточный альбумин использовался в качестве маркера (Sigma-Aldrich). Образцы подвергали электрофорезу с использованием глицинового буфера в течение 3 ч при 100 В. Гели фиксировали в растворе, состоящем из 40 % метанола и 10 % уксусной кислоты в течение 1 ч при комнатной температуре, а затем окрашивали кумасси бриллиантовым голубым R- 250 (Bio- Rad Laboratories) в течение 3 ч при комнатной температуре перед обесцвечиванием и визуа­ лизацией. Изучение денатурации молекулы лактоферрина осуществлялось с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии. Эта методика позволяет определить переход теплоемкости белкового раствора для установления абсолютной температуры плавления Tп и энтальпии, связанных с денатурацией; полученный в результате диапазон теплоемкости указывает, сколько необходимо тепла для увеличения температуры образца буферного раствора, соответствующего контрольному образцу, и, таким образом, свидетельствует о степени денатурации образца, содержащего белок. Теплоемкость образцов лактоферрина изучалась при температуре от 20 до 90 °С по сравнению с контрольным образцом, имеющим точно такой же состав, как и образец, содержащий белок; эксперименты проводились на приборе VP- DSC (MicroCal, GE Healthcare, Великобритания). Флюоресцентные изображения образцов лактоферрина получали с помощью спектрометра Jasco FP750 с длиной волны возбуждения 280 нм при сканировании от 290 до 450 нм. Ароматические аминокислоты, входящие в состав белков, имеют характерный спектр флюоресценции, который может становиться другим при денатурации в результате изменения расположения ароматических групп в белке [41]. Бактериальные культуры Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus – это организмы, которые чаще всего определяются при ИК [42, 43]. Хотя функция лизоцима обычно изучается при количественном измерении подавления Micrococcus luteus, этот микроорганизм более чувствителен к лизоцим- индуцированному лизису, чем P. aeruginosa и S. aureus [44]; мы целенаправленно изучали эти менее чувствительные, но более клинически значимые виды микроорганизмов. Штаммы бактерий выращивали после высевания на бульон Лурия– ¹ 5 (и юнь) 2 012 04.06.2012 12:50:18 Бертани (Luria–Bertani) с P. aeruginosa (штамм АТСС 9027) или S. aureus (штамм АТСС 6538) из упаковок Cultiloop (Oxoid, Бейзингсток, Великобритания). Растущие штаммы были получены при посеве штрихом на чашки с триптон- соевым агаром (ТСА) и при инкубировании в течение ночи при температуре 37 °С. Бактериальные взвеси были стандартизированы до концентрации 106 колоние­образующих единиц (КОЕ) на миллилитр в бульоне Мюллера–Хинтона (Mueller–Hinton) или в триптон- соевом агаре для P. aeru­ginosa и S. aureus соответственно для количественного определения подавления роста лактоферрином или 109 КОЕ/мл в ФСБР для определения литической активности лизоцима. соответственно перед нанесением 3 107 КОЕ бактерий на лунку. Окончательная полученная концентрация белка варьировала от 4 мкг/мл до 1,1 мг/мл. Мутность оценивалась путем определения поглощения при 620 нм с использованием считывающего устройства для микропланшетов FLUOstar Optima (BMG Labtech, Эйлсбери, Великобритания) после инкубирования микропланшетов при комнатной температуре в течение 15 мин. Средняя степень мутности бактерий, подвергнутых обработке белком, была выражена относительно мутности контрольного образца, обработанного идентичными буферными растворами, не содержащими лизоцим. Методы количественного определения подавления роста ДСК и результаты флюоресценции были проанализированы с помощью однофакторного дисперсионного анализа, после чего использовался критерий множественного сравнения Данна. Сравнение количества жизнеспособных клеток (лактоферрин) и мутности, обусловленной бактериями (лизоцим), на образцах, подвергнутых инкубированию с нативным, денатурированным и обработанным иМФР белком, производилось с помощью однофакторного дисперсионного анализа, после чего использовался критерий Тьюки для множественного сравнения. При проведении стандартного количественного определения минимальной подавляющей концентрации изучалась стагнация роста бактерий, вызванного ДСН [45]. Была произведена количественная оценка процесса при использовании лактоферрина и образцов белка при окончательной концентрации 1,02 мг/мл (для S. aureus) или 0,68 мг/мл (для P. aeruginosa) при всех разведениях с использованием стерильного ФСБР, содержащего иМФР и 0,04 или 0,02 %- й ДСН в соответствующих концентрациях. Для предотвращения значительного подавления роста бактерий ДСН последний использовался в более низкой концентрации, чем при структурном анализе; тем не менее белки подвергали воздействию на протяжении гораздо большего времени. Перед инкубированием в течение ночи при температуре 37 °С на исследуемые образцы, размещенные на планшетах с 96 лунками, наносили от 3 104 до 6 104 микроорганизмов на лунку. Кроме того, лактоферрин во время этих опытов растворяли в ФСБР, а не в РИС, так как было установлено, что при использовании РИС в условиях этого эксперимента выпадал осадок. После инкубирования бактериальные взвеси разводили в стерильном ФСБР и наносили на планшеты с ТСА [автоматизированным аппаратом для спирального посева бактерий на чашки Whitley (Whitley Automated Spiral Plater, DW Scientific, Шипли, Великобритания)]. Перед подсчетом и оценкой количества жизнеспособных клеток после обработки различными веществами и перед сравнением с контрольным образцом, образцом, обработанным ДСН и иМФР/ДСН, чашки инкубировали в течение ночи при температуре 37 °С. Количественное определение бактериолитической активности Исследуемые образцы лизоцима последовательно разводили в планшетах с 96 лунками стерильным иМФР, содержащим ФСБР, и 0,16 % ДСН Анализ данных Результаты Влияние инкубирования с додецилсульфатом натрия на нативное состояние белка слезы Для установления денатурации белков слезы под воздействием ДСН и для подтверждения его необходимой концентрации мы подвергали лактоферрин человека, содержащийся в РИС, воздействию ДСН различных концентраций перед структурным анализом с помощью ПААГ- электрофореза. Окончательные концентрации ДСН во время инкубирования составляли 0,02; 0,04; 0,08 и 0,16 %, а лактоферрин использовался в обычной концентрации in vivo (1,7 мг/мл) [1, 39]. После инкубирования и ПААГ- электрофореза нами было установлено, что положение полос белка лактоферрина значительно изменялось при воздействии на белок ДСН в концентрации от 0,16 до 0,08 %, но оставалось прежним при более низких концентрациях ДСН (рис. 1, а); при более низких уровнях ДСН, а также на контрольных образцах получали одну полосу, образованную белком; после обработки ДСН с более высокой концентрацией наблюдалось формирование двух полос, идущих выше и ниже нормального положения полосы (рис. 1, а). Следовательно, нами были установлены факт нарушения ДСН естественной конформации лактоферрина и необходимая для этого концентрация ДСН. ¹ 5 ( и юнь) 2 012 Raj_Sohranenie_so05-12_s3.indd 7 Ñ ÎÂÐ Å ÌÅ ÍÍÀß Î Ï Ò Î Ì ÅÒ ÐÈ ß 7 04.06.2012 12:50:18 а б 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 Ср • 104, ккал/моль/°С Сохранение структуры и функции белков слезы человека с помощью нового универсального раствора... 6 5 1 2 4 3 2 3 1 20 40 60 80 100 Температура, °С Рис. 1. Анализ состояния денатурации лактоферрина при электрофорезе в полиакриламидном геле (ПААГ) после воздействия додецилсульфата натрия (ДСН) и обработки исследуемым многофункциональным раствором (иМФР): Рис. 2. Анализ состояния денатурации лактоферрина с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) после воздействия ДСН и обработки иМФР: а — концентрация ДСН, необходимая для денатурации лактоферрина, определение которой производилось с помощью 7,5 %- х нативных полиакриламидных гелей с окраской кумасси голубым. Полосы содержали: 1 — маркер бычьего сывороточного альбумина (БСА); 2 — нативный лактоферрин и лактоферрин, обработанный ДСН, в следующих концентрациях 0,16 (3); 0,08 (4), 0,04 (5) и 0,02 % (6). Полосы лактоферрина после воздействия ДСН в концентрациях: 0,16 и 0,08 % (полосы 3 и 4) существенно отличаются от положения полос нативного лактоферрина; 1 — лактоферрин, обработанный 0,16 %- м ДСН и иМФР; 2 — нативный лактоферрин; 3 — лактоферрин, обработанный 0,16 %- м ДСН. б — влияние ДСН на денатурацию лактоферрина человека при инкубировании с иМФР. Образцы были подвергнуты электрофорезу с нативным 5 %- м ПААГ, окрашенным кумасси голубым. Полосы содержали: 1 — маркер БСА; 2 — нативный лактоферрин; 3 — лактоферрин, подвергнутый денатурации 0,16 %- м ДСН; 4 — лактоферрин, обработанный иМФР перед воздействием ДСН. Лактоферрин, подвергнутый воздействию иМФР перед обработкой ДСН (4), занимал то же положение, что и нативный лактоферрин (полоса 2). Представлены типичные данные. Изоэлектрические точки БСА и лактоферрина — 4,7 и 8,7 соответственно Действие иМФР на структурную целостность латоферрина, подвергнутого воздействию ДСН Первоначально мы оценивали влияние иМФР на лактоферрин, обработанный 0,16 %- м ДСН, с использованием ПААГ- электрофореза. Образцы белка, входящие в состав РИС или РИС/иМФР, были подвергнуты воздействию 0,16 %- го ДСН и инкубировались в течение 1 ч, так что в присутствии ДСН концентрация РИС и иМФР соответствовала их начальной концентрации, а концентрация лактоферрина составляла 1,7 мг/мл. После инкубирования образцы были подвергнуты ПААГ- электрофорезу и визуализации после окрашивания кумасси голубым. Создавалось впечатление, что лактоферрин, заранее обработанный иМФР, оставался неизменным и занимал то же положение, что и в контрольном образце, не подвергнутом воздействию ДСН (рис. 1, б), что позволяет предположить, что иМФР стабилизировал конформацию этого белка. Небольшое различие распределения полос наблюдалось у образцов, обработанных 0,16 % ДСН, на рис. 1, а, б, его можно объяснить различным процентным содержанием полиакриламида, который использовался при проведении этих опытов. Нами были проведены дальнейшие исследования с использованием ДСН для изучения того, защищает ли иМФР белки от денатурации. Мы быстро получили переход теплоемкости контрольных растворов лактоферрина, который отражает 8 0 ÑÎÂ ÐÅ ÌÅ ÍÍÀ ß ÎÏ ÒÎÌÅÒÐÈß Raj_Sohranenie_so05-12_s3.indd 8 Диапазоны теплоемкости были получены для нативного белка, лактоферрина после обработки 0,16 %- м ДСН, а также после обработки ДСН и иМФР. Образцы нативного белка приводили к снижению пика теплоемкости, который отсутствовал после обработки ДСН, это подтверждает, что ДСН вызывал денатурацию белка (для наглядности диапазон теплоемкости образца, подвергнутого воздействию ДСН, был нанесен на график несколько выше его реального положения под осью х). Тем не менее у образцов, обработанных иМФР, имелся переходный пик, который напоминал пик теплоемкости и существенно не отличался от такового для нативного белка [р > 0,05, однофакторный дисперсионный анализ, с последующим использованием критерия Данна (Dunn) для множественного сравнения] количество тепловой энергии, поглощенной белком и продуктами его денатурации (рис. 2). Тем не менее после предварительной обработки ДСН раствора лактоферрина этот пик не был получен, а значит, после обработки ДСН белок был денатурирован. И наконец, после предварительной обработки лактоферрина иМФР и воздействия ДСН был получен калориметрический профиль, напоминающий профиль белка контрольного образца (р > 0,05, однофакторный дисперсионный анализ); таким образом, применение второго метода также показало, что иМФР позволяет сохранить стабильность лактоферрина. Для дополнительного подтверждения стабилизации белка мы определили флюоресценцию триптофана в образцах лактоферрина. Спектр флюоресценции лактоферрина, подвергнутого денатурации под действием ДСН, существенно отличался от спектра нативного лактоферрина (р > 0,001, однофакторный дисперсионный анализ) (рис. 3). Пик спектра денатурированного лактоферрина был смещен в красную область по сравнению с нативным белком, что указывает на воздействие растворителя на группы триптофана [41]. Более того, обработка лактоферрина иМФР перед воздействием ДСН приводила к тому, что спектр флюоресценции существенно не отличался от такового у образцов нативного лактоферрина (р > 0,05, однофакторный дисперсионный анализ). Все эти данные, полученные с помощью трех независимых методов, свидетельствуют о том, что обработка лактоферрина, ¹ 5 (и юнь) 2 012 04.06.2012 12:50:18 Мутность P. aeruginosa A620, % необработанного контроля 1 150 3 100 2 0 250 300 350 400 450 500 Длина волны, нм Рис. 3. Анализ состояния денатурации лактоферрина при флюорометрии после воздействия ДСН и обработки иМФР. Собственная флюоресценция образцов лактоферрина человека: 1 — лактоферрин, обработанный 0,16 %- м ДСН; 2 — нативный лактоферрин; 3 — лактоферрин, обработанный 0,16 % ДСН и иМФР Образцы нативного белка давали обычный спектр флюоресценции при воздействии ультрафиолетового излучения, которое приводило к значительному переходу после обработки ДСН, при этом триптофановые группы подвергались воздействию растворителя, что подтверждает способность ДСН вызывать денатурацию белка. Тем не менее для образцов, обработанных иМФР, получены спектры флюоресценции, которые существенно не отличались от спектра нативного белка (р > 0,05, однофакторный дисперсионный анализ, с последующим использованием критерия Данна для множественного сравнения) Стабилизация структуры белков слезы не обязательно означает сохранение их функции. Конформация белка может казаться соответствующей нативной, но при этом белок может демонстрировать ограниченную способность к изменению конформации, которое необходимо для его функционирования. После исследований структуры мы изу­ чили собственно воздействие предварительной обработки иМФР на противомикробную активность лактоферрина и литический эффект лизоцима. Сначала мы установили, что в условиях наших экспериментов ДСН обладал определяемым противомикробным действием (рис. 4), и поэтому в дальнейшем во всех случаях количество жизнеспособных микроорганизмов после воздействия на бактерии протеинов слезы выражалось относительно количества жизнеспособных микроорганизмов после воздействия соответствующего индифферентного вещества в контрольном растворе, не содержащем белка (ФСБР или ДСН в ФСБР, или ДСН в иМФР). Количество жизнеспособных микроорганизмов во взвесях P. aerugi­ nosa и S. aureus было значительно ниже, чем в контрольном образце с индифферентным веществом после обработки нативным лактоферрином, и этого не было установлено в образцах, обработанных измененным под действием ДСН лактоферрином (р < 0,05, однофакторный дисперсионный анализ, 80 60 40 20 0,2 0,4 Применяемый для денатурации лактоферрина ДСН также обладает противомикробной активностью в концентрациях, которые использовались в наших экспериментах, и поэтому оказывает влияние на функциональную оценку активности белка слезы. Антимикробная активность оценивалась при воздействии ДСН с последовательным разведением в ФСБР с 106 КОЕ P. aeruginosa, перед инкубированием в течение ночи и оценкой мутности. ДСН в разных концентрациях обладал очевидной противомикробной активностью и поэтому в последующем был включен в соответствующей концентрации в контрольные образцы при проведении остальных микробиологических опытов. Типичные данные продемонстрированы: столбцы отражают стандартную ошибку а б 2 1 0 –1 –2 Нативный Лактоферрин, лактоферрин обработанный 0,04 %- м ДСН Лактоферрин, обработанный 0,04 %- м ДСН и иМФР 6 5 4 3 2 1 0 Нативный Лактоферрин, лактоферрин обработанный 0,02 %- м ДСН Лактоферрин, обработанный 0,02 %- м ДСН и иМФР Рис. 5. Оценка противомикробной активности лактоферрина после воздействия ДСН и обработки иМФР (по оси ординат показан рост P. aeruginosa (а) и S. aureus (б) соответственно после обработки лактоферрином по сравнению с обработкой раствором, содержащим только индифферентное вещество Противомикробная активность лактоферрина человека оценивалась для нативного белка, лактоферрина после обработки ДСН, а также для лактоферрина, обработанного иМФР перед воздействием ДСН. На белки были высеяны P. aeruginosa (а) и S. aureus (б), после чего проводилось инкубирование в течение ночи перед оценкой жизнеспособных бактерий, когда осуществлялся посев последовательных разведений бактериальных взвесей. Любое воздействие буферных растворов, в которых были растворены белки, контролировалось посредством одновременного инкубирования контрольных образцов с бактериями в соответствующем буфере (то есть ФСБР или ДСН в ФСБР, или ДСН в иМФР) по отдельности, количество бактерий после обработки белком оценивалось в виде процентного соотношения количества после воздействия только буферного раствора. Лактоферрин, обработанный ДСН (денатурированный), обладал значительно сниженной противомикробной активностью по сравнению с нативным лактоферрином в отношении обоих видов микроорганизмов [p < 0,001 для S. aureus, p < 0,05 для P. aeruginosa, однофакторный дисперсионный анализ с последующим использованием критерия Тьюки (Tukey) для множественного сравнения]. Тем не менее антимикробная активность существенно не отличалась от таковой у нативного лактоферрина после инкубирования с лактоферрином, обработанным ДСН в иМФР (p > 0,05, однофакторный дисперсионный анализ с последующим использованием критерия Тьюки для множественного сравнения). Типичные данные продемонстрированы: столбцы отражают стандартную ошибку ¹ 5 ( и юнь) 2 012 Raj_Sohranenie_so05-12_s3.indd 9 0,6 0,8 1,0 Концентрация ДСН, % Рис. 4. Оценка противомикробной активности ДСН. имеющего естественную концентрацию, ДСН приводила к денатурации белка и во всех трех случаях иМФР предотвращал денатурацию. Влияние иМФР на сохранность функций белков слезы, подвергнутых воздействию ДСН 100 0 Рост P. aeruginosa, log10 % 50 Рост S. aureus, log10 % Интенсивность флюоресценции 200 Ñ ÎÂÐ Å ÌÅ ÍÍÀß Î Ï Ò Î Ì ÅÒ ÐÈ ß 9 04.06.2012 12:50:19 Сохранение структуры и функции белков слезы человека с помощью нового универсального раствора... Мутность P. aeruginosa, % а 140 120 2 80 60 Мутность S. aureus (А620) , % 40 0 б 1 100 3 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 Концентрация лизоцима, мг/мл 140 120 1 100 80 2 60 40 0 3 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 Концентрация лизоцима, мг/мл Рис. 6. Оценка литической активности лизоцима после воздействия ДСН и обработки иМФР (по оси ординат показана соответственно мутность P. aeru­ ginosa (а) и S. aureus (б) после обработки лизоцимом по отношению к мутности при обработке только раствором, содержащим индифферентное вещество: 1 — лизоцим, обработанный 0,16 %- м ДСН; 2 — лизоцим, обработанный 0,16 %- м ДСН и иМЦФР; 3 — нативный лизоцим. Литическая активность лизоцима человека в последовательных разведениях оценивалась для нативного белка, лизоцима после обработки ДСН и для лизоцима, обработанного иМФР перед воздействием ДСН. На белки производился посев P. aeruginosa (а) и S. au­ reus (б), которые затем инкубировали в течение 15 мин перед оценкой роста бактерий посредством определения мутности по сравнению с контрольным образцом. Рост бактерий выражался по отношению к росту после воздействия соответствующего контрольного раствора, содержащего индифферентное вещество (например, ФСБР или ДСН в ФСБР, или ДСН в иМФР), что позволяет нам сравнить действие лизоцима в таких разных условиях исследования. Нативный лизоцим вызывал уменьшение роста бактерий, а при предварительном инкубировании белка с ДСН такое действие лизоцима исчезало (р < 0,05, однофакторный дисперсионный анализ, после которого использовался критерий Тьюки для множественных сравнений). Продемонстрированы типичные данные: столбцы отражают стандартную ошибку рис. 5, а, б), а значит, воздействие ДСН вызывало утрату антибактериального эффекта в дополнение к денатурации (подтверждено, что использованная в данном случае концентрация ДСН, более низкая по сравнению с применявшейся при исследовании структуры ранее, была эффективна предположительно в связи с более продолжительным инкубированием, чем в опытах по изучению структуры). Предварительная обработка лактоферрина иМФР перед воздействием ДСН позволяла сохранить антибактериальное действие, так как количество жизнеспособных микроорганизмов было таким же низким или еще ниже, чем при использовании нативного белка (р > 0,05, однофакторный дисперсионный анализ, рис. 5, а, б). Мы пришли к заключению, что иМФР предотвращает вызванную ДСН денатурацию лактоферрина и препятствует сопутствующей ей утрате антибактериальной активности. Для того чтобы понять, может ли иМЦФР стабилизировать другие белки слезы, мы изучили способность ДСН инактивировать антимикробное действие лизоцима (другого белка слезы, об10 ÑÎÂ ÐÅ ÌÅ ÍÍÀ ß ÎÏ ÒÎÌÅÒÐÈß Raj_Sohranenie_so05-12_s3.indd 10 ладающего соответствующими свойствами, который присутствует в высокой концентрации in vi­ vo). Если такая способность имеется, возможно ли предотвратить ее проявление с помощью иМФР? В отличие от лактоферрина, лизоцим вызывает быстрое разрушение бактериальных клеток, и поэтому его функциональная целостность оценивалась с помощью метода количественного определения литической активности. Инкубирование P. aeru­ ginosa и S. aureus с лизоцимом в нарастающих концентрациях приводило к уменьшению мутности бактериальной взвеси, что свидетельствует о литической активности этого белка слезы в отношении обоих микроорганизмов (также во всех случаях количество выражалось по отношению к количеству после обработки контрольным раствором, содержащим индифферентное вещество без белков слезы). Эта активность была сниженной у образцов лизоцима, обработанных ДСН (p < 0,05, однофакторный дисперсионный анализ); тем не менее индуцированное ДСН снижение функции после воздействия лактоферрина предотвращалось с помощью обработки иМФР (p > 0,05, однофакторный дисперсионный анализ) (рис. 6, а, б). Обсуждение Нами предложена модель системы для изучения возможного защитного действия иМФР на денатурацию белков слезы, вызванную ДСН – широко распространенным денатурирующим реактивом, который используется в лабораторных условиях. Мы попытались обеспечить и условия воздействия, сравнимые с существующими на поверхности глаза в естественных условиях, несмотря на то что имели место факторы, не отвечающие последнему требованию. Лактоферрин и лизоцим человека использовались в концентрациях, сравнимых с существующими в естественных условиях в слезе человека. Опыты с ПААГ-электрофорезом проводились с применением рецептуры РИС, которая напоминает естественную концентрацию солей в слезе, при этом во всех случаях инкубирование осуществлялось при температуре 33 °С, что соответствует нормальной температуре роговицы [40]. Другие опыты проводились в ФСБР, который отличается от РИС тем, что в нем отсутствует хлорид кальция; тем не менее результат этих опытов оказался таким же, поскольку данные неизменно подтверждали, что иМФР защищал белки слезы от структурных и функциональных изменений после обработки ДСН. Представляет интерес целенаправленное изучение того, будет ли иметь место стабилизация, которую мы наблюдали после обработки иМФР, также при действии физиологических факторов, вызывающих денатурацию, в том числе возникающих при абсорбции и сохранении белков слезы на поверхности контактной линзы. Осуществление этого возможно в дальнейших исследованиях с экстрактами настоящей слезы, а не коммерчески ¹ 5 (и юнь) 2 012 04.06.2012 12:50:19 доступных in vitro белков, и это позволит изучить факторы, которые вызывают денатурацию и встречаются в клинической практике, а не ограничиваться использованием лабораторных реактивов. На действие гиалуроновой кислоты, полоксамина и сульфобетаина 10, входящих в состав раствора Biotrue и иМФР, могут оказывать влияние другие компоненты раствора, которые способны действовать синергично и увеличивать стабилизирующий эффект. Кроме того, сообщалось о том, что значение рН раствора играло важную роль в сохранении структуры и функции белков слезы [46, 47]. Ключевой особенностью нашего исследования являлось изучение иМФР в целом, а не действия компонентов раствора по отдельности. В дальнейших исследованиях было бы интересно провести анализ влияния всех компонентов иМФР по отдельности и величины рН на общее стабилизирующее действие и дополнительно изучить вопрос, изменяют или усиливают дезинфектанты, входящие в состав раствора Bio­true, такую стабилизацию. Сохранение структуры и функции белка слезы иМФР является доказательством возможной клинической пользы при применении растворов, стабилизирующих белок, в составе дезинфицирующего раствора с помощью трех возможных механизмов. Во- первых, воздействие дезинфицирующих растворов с соответствующим составом на поверхность роговицы у пользователей контактных линз может позволить стабилизировать белки, находящиеся в слезной пленке, тем самым усиливая их антибактериальную и другие функции. У лиц, которые не носят линзы, имеется высокая устойчивость к инфекционному поражению роговицы [48, 49], и наоборот, у тех, кто пользуется линзами, данный параметр понижен, но увеличение антибактериальной функции их слезной пленки может позволить частично восстановить такую устойчивость. Во- вторых, по- видимому, при повторной обработке линз, которые носили ранее, фиксированные белки слезы будут сохраняться в нативном состоянии, что будет препятствовать утрате их благоприятной антибактериальной функции. Во время ношения на линзах будет сохраняться «запас» стабилизированных белков, не утративших естественную функцию, что, вероятно, будет наблюдаться после воздействия веществ, стабилизирующих белок, в противном случае будет происходить денатурация белка и утрата такого благоприятного действия [18]. В- третьих, если при стабилизирующем действии предотвращается денатурация абсорбированных белков слезы, возможно, удастся избежать некоторых отрицательных последствий формирования белковых отложений, особенно нежелательных воспалительных реакций в ответ на посторонние белковые структуры, присутствующие на линзах, которые имеют место при различных заболеваниях [28], в том числе при гигантском папиллярном конъюнктивите [50]. Нежелательные реакции на ношение контактных линз могут быть спровоцированы микроорганизмами [51]. Два вида изученных здесь микроорганизмов, P. aeruginosa и S. aureus, являются распространенными патогенами, которые определяются в естественных условиях на поверхности глаза (возможно, в связи с экспрессией множества факторов вирулентности [52, 53]). Продемонстрированное нами очевидное сохранение противомикробной функции лизоцима и лактоферрина в отношении этих патогенных организмов, несмотря на сильное воздействие факторов, вызывающих денатурацию, позволяет допустить, что при клиническом применении дезинфицирующих растворов, в состав которых входят некоторые вещества, стабилизирующие белок, у пользователей контактных линз может измениться частота возникновения ИК; представленные здесь данные подчеркивают необходимость дальнейших исследований для изучения этого предположения. Таким образом, мы пришли к заключению, что иМФР предотвращает денатурацию лактоферрина и лизоцима после обработки интенсивными факторами, вызывающими денатурацию. Белки слезы, подвергнутые обработке, сохраняют свое противомикробное и бактериолитическое действие. Наши данные позволяют предположить, что данный раствор может стабилизировать структуру и функцию белков слезы. Список литературы 1. Tiffany JM. The normal tear film. Dev Ophthalmol 2008; 41: 1–20. 2. Flanagan JL, Willcox MD. Role of lactoferrin in the tear film. Biochimie 2009; 91: 35–43. 3. Singh PK, Parsek MR, Greenberg EP, et al. A component of innate immunity prevents bacterial biofilm development. Nature 2002; 417: 552–555. 4. Callewaert L, Michiels CW. Lysozymes in the animal kingdom. J Biosci 2010; 35: 127–160. 5. Ellison RT III, Giehl TJ. Killing of gram- negative bacteria by lactoferrin and lysozyme. J Clin Invest 1991; 88: 1080–1091. 6. Fleiszig SM, Kwong MS, Evans DJ. Modification of Pseudomonas aeruginosa interactions with corneal epithelial cells by human tear fluid. Infect Immun 2003; 71: 3866–3874. 7. McNamara NA, Andika R, Kwong M, et al. Interaction of Pseudomonas aeruginosa with human tear fluid components. Curr Eye Res 2005; 30: 517–525. 8. Kwong MS, Evans DJ, Ni M, et al. Human tear fluid protects against Pseudomonas aeruginosa keratitis in a murine experimental model. Infect Immun 2007; 75: 2325–2332. 9. Bohnert JL, Horbett TA, Ratner BD, et al. Adsorption of proteins from artificial tear solutions to contact lens materials. Invest Ophthalmol Vis Sci 1988; 29: 362–373. 10. Michaud L, Giasson C. Comparing the extent of protein build- up on several disposable lenses by two spectrophotometric methods. Cont Lens Anterior Eye 1998; 21: 104–108. 11. Keith DJ, Christensen MT, Barry JR, et al. Determination of the lysozyme deposit curve in soft contact lenses. Eye Contact Lens 2003; 29: 79–82. ¹ 5 ( и юнь) 2 012 Raj_Sohranenie_so05-12_s3.indd 11 Ñ ÎÂÐ Å ÌÅ ÍÍÀß Î Ï Ò Î Ì ÅÒ ÐÈ ß 11 04.06.2012 12:50:19 Сохранение структуры и функции белков слезы человека с помощью нового универсального раствора... 12. Zhao Z, Wei X, Aliwarga Y, et al. Proteomic analysis of protein deposits on worn daily wear silicone hydrogel contact lenses. Mol Vis 2008; 14: 2016–2024. 33. Mustafi D, Smith CM, Makinen MW, et al. Multi- block poloxamer surfactants suppress aggregation of denatured proteins. Biochim Biophys Acta 2008; 1780: 7–15. 13. Fowler SA, Korb DR, Allansmith MR. Deposits on soft contact lenses of various water contents. CLAO J 1985; 11: 124–127. 34. Hamada H, Arakawa T, Shiraki K. Effect of additives on protein aggregation. Curr Pharm Biotechnol 2009; 10: 400–407. 14. Jones L, Mann A, Evans K, et al. An in vivo comparison of the kinetics of protein and lipid deposition on group II and group IV frequent- replacement contact lenses. Optom Vis Sci 2000; 77: 503–510. 35. Goldberg ME, Expert- Bezancon N, Vuillard L, et al. Non- detergent sulphobetaines: A new class of molecules that facilitate in vitro protein renaturation. Fold Des 1996; 1: 21–27. 15. Zhao Z, Carnt NA, Aliwarga Y, et al. Care regimen and lens material influence on silicone hydrogel contact lens deposition. Optom Vis Sci 2009; 86: 251–259. 16. Senchyna M, Jones L, Louie D, et al. Quantitative and conformational characterization of lysozyme deposited on balafilcon and etafilcon contact lens materials. Curr Eye Res 2004; 28: 25–36. 17. Jones L, Evans K, Sariri R, et al. Lipid and protein deposition of N- vinyl pyrrolidone- containing group II and group IV frequent replacement contact lenses. CLAO J 1997; 23: 122–126. 38. Spreti N, Reale S, Amicosante G, et al. Influence of sulfobetaines on the stability of the Citrobacterdiversus ULA- 27 beta- lactamase. Biotechnol Prog 2001; 17: 1008–1013. 39. Subbaraman LN, Glasier MA, Sheardown H, et al. Efficacy of an extraction solvent used to quantify albumin deposition on hydrogel contact lens materials. Eye Contact Lens 2009; 35: 76–80. 19. Carney FP, Morris CA, Milthorpe B, et al. In vitro adsorption of tear proteins to hydroxyethyl methacrylate- based contact lens materials. Eye Contact Lens 2009; 35: 320–328. 40. Horven I. Corneal temperature in normal subjects and arterial occlusive disease. Acta Ophthalmol (Copenh) 1975; 53: 863–874. 21. Mannucci LL, Moro F, Cosani A, et al. Conformational state of lacrimal proteins adsorbed on contact lenses. Curr Eye Res 1985; 4: 734–736. 22. Brennan NA, Coles ML. To the editor: Risk of corneal inflammatory events with silicone hydrogel and low dk hydrogel extended contact lens wear: A meta- analysis. Optom Vis Sci 2008; 85: 364; author reply 364–365. 23. Zhao Z, Naduvilath T, Flanagan JL, et al. Contact lens deposits, adverse responses, and clinical ocular surface parameters. Optom Vis Sci 2010; 87: 669–674. 24. Butrus SI, Klotz SA. Contact lens surface deposits increase the adhesion of Pseudomonas aeruginosa. Curr Eye Res 1990; 9: 717–724. 25. Miller MJ, Wilson LA, Ahearn DG. Effects of protein, mucin, and human tears on adherence of Pseudomonas aeruginosa to hydrophilic contact lenses. J Clin Microbiol 1988; 26: 513–517. 26 Vermeltfoort PB, Rustema- Abbing M, de Vries J, et al. Influence of day and night wear on surface properties of silicone hydrogel contact lenses and bacterial adhesion. Cornea 2006; 25: 516–523. 27. Emch AJ, Nichols JJ. Proteins identified from care solution extractions of silicone hydrogels. Optom Vis Sci 2009; 86: E123–E131. 28. Luensmann D, Heynen M, Liu L, et al. The efficiency of contact lens care regimens on protein removal from hydrogel and silicone hydrogel lenses. Mol Vis 2010; 16: 79–92. 29. Grus FH, Kramann C, Bozkurt N, et al. Effects of multipurpose contact lens solutions on the protein composition of the tear film. Cont Lens Anterior Eye 2005; 28: 103–112. 30. Drozdz R, Naskalski JW. Inactivation and denaturation of some proteins by enzyme system: myeloperoxidase, chloride and hydrogen peroxide. Folia Histochem Cytobiol 1993; 31: 71–75. 41. Eftink MR. The use of fluorescence methods to monitor unfolding transitions in proteins. Biophys J 1994; 66: 482–501. 42. Tuft SJ, Matheson M. In vitro antibiotic resistance in bacterial keratitis in London. Br J Ophthalmol 2000; 84: 687– 691. 43. Melia B, Islam T, Madgula I, et al. Contact lens referrals to Hull Royal Infirmary Ophthalmic A&E Unit. Cont Lens Anterior Eye 2008; 31: 195–199. 44. Zhang S, Borazjani RN, Salamone JC, et al. In vitro deposition of lysozyme on etafilcon A and balafilcon A hydrogel contact lenses: effects on adhesion and survival of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Cont Lens Anterior Eye 2005; 28: 113–119. 45. Dobson CB, Sales SD, Hoggard P, et al. The receptor-bin­ ding region of human apolipoprotein E has direct anti- infective activity. J Infect Dis 2006; 193: 442–450. 46. Gasymov OK, Abduragimov AR, Yusifov TN, et al. Interstrand loops CD and EF act as pH- dependent gates to regulate fatty acid ligand binding in tear lipocalin. Biochemistry 2004; 43: 12894–12904. 47. Sreedhara A, Flengsrud R, Langsrud T, et al. Structu­ ral characteristic, pH and thermal stabilities of apo and holo forms of caprine and bovine lactoferrins. Biometals 2010; 23: 1159–1170. 48. Mun JJ, Tam C, Kowbel D, et al. Clearance of Pseudomonas aeruginosa from a healthy ocular surface involves surfactant protein D and is compromised by bacterial elastase in a murine null- infection model. Infect Immun 2009; 77: 2392–2398. 49. Fleiszig SM, Evans DJ. Pathogenesis of contact lens-asso­ cia­ted microbial keratitis. Optom Vis Sci 2010; 87: 225–232. 50. Lazarou ZK. Contact lens associated giant papillary conjunctivitis. Clin Eye Vis Care 1999; 11: 33–35. 51. Dumbleton K. Adverse events with silicone hydrogel continuous wear. Cont Lens Anterior Eye 2002; 25: 137–146. 31. Zhang Y, Ji B, Ling P, et al. Trehalose and hyaluronic acid coordinately stabilized freeze- dried pancreatic kininogenase. Eur J Pharm Biopharm 2007; 65: 18–25. 52. Fleiszig SM, Wiener- Kronish JP, Miyazaki H, et al. Pseudomonas aeruginosa- mediated cytotoxicity and invasion correlate with distinct genotypes at the loci encoding exoenzyme S. Infect Immun 1997; 65: 579–586. 32. Van Beek M, Jones L, Sheardown H. Hyaluronic acid containing hydrogels for the reduction of protein adsorption. Biomaterials 2008; 29: 780–789. 53. O’Callaghan RJ, Callegan MC, Moreau JM, et al. Specific roles of alphatoxin and beta- toxin during Staphylococcus aureus corneal infection. Infect Immun 1997; 65: 1571–1578. ÑÎÂ ÐÅ ÌÅ ÍÍÀ ß ÎÏ ÒÎÌÅÒÐÈß Raj_Sohranenie_so05-12_s3.indd 12 37. Vuillard L, Rabilloud T, Goldberg ME. Interactions of non- detergent sulfobetaines with early folding intermediates facilitate in vitro protein renaturation. Eur J Biochem 1998; 256: 128–135. 18. Boone A, Heynen M, Joyce E, et al. Ex vivo protein deposition on bi- weekly silicone hydrogel contact lenses. Optom Vis Sci 2009; 86: 1241–1249. 20. Suwala M, Glasier MA, Subbaraman LN, et al. Quantity and conformation of lysozyme deposited on conventional and silicone hydrogel contact lens materials using an in vitro model. Eye Contact Lens 2007; 33: 138–143. 12 36. Expert- Bezancon N, Rabilloud T, Vuillard L, et al. Physical- chemical features of non- detergent sulfobetaines active as protein- folding helpers. Biophys Chem 2003; 100: 469–479. ¹ 5 (и юнь) 2 012 04.06.2012 12:50:19 Preservation of human tear protein structure and function by a novel contact lens multipurpose solution containing protein- stabilizing agents Objectives. Tear film proteins have antimicrobial and other functions that may be lost after denatu­ ration during contact lens wear. A new multipurpose solution has recently become available (Biotrue, Bausch + Lomb Inc., Rochester, NY), which contains protein- stabilizing agents including hyaluronic acid, poloxamine, and sulfobetaine 10, the latter used previously as a laboratory tool to renature proteins. We examine whether this new multipurpose solution formulation can prevent the denaturation of human lactoferrin and lysozyme at physiologic levels in response to a powerful denaturing challenge. Methods. Human lactoferrin and lysozyme were treated with sodium dodecyl sulfate (SDS) either with or without an investigational version of the new multipurpose solution (without its two disinfectant agents) (investigational multipurpose solution [iMPS]). The structure was assessed by native- polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), differential scanning calorimetry (DSC), and fluorometry; additionally, antimicrobial activity against Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus was measured. Results. The iMPS prevented an SDS- induced shift in the native- PAGE banding position of lactoferrin. The SDS treatment substantially altered the lactoferrin DSC and fluorescence spectra, indicating that the protein had denatured. This change did not occur in the presence of iMPS. Lactoferrin and lysozyme showed antibacterial and bacteriolytic activity, which was abolished after SDS treatment; this loss of activity did not occur for proteins treated with iMPS. Conclusions. These data clearly show that the iMPS prevents the denaturation of physiologic levels of human lactoferrin and lysozyme by the strongly denaturing surfactant SDS and that stabilized proteins retain their function. We conclude that this solution has the capacity to stabilize the structure and function of tear proteins. Элли А. Райт (Elli A. Wright), кафедра манифестных инфекций, микробиологии и иммунологии Ливерпульского университета (Ливерпуль, Великобритания) Institute of Infection and Global Health, University of Liverpool 8 West Derby Street, Liverpool L69 7BE, United Kingdom Tel.: +44 (0) 151 706 4381 E- mail: E.Wright@liverpool.ac.uk Карл A. П. Пэйн (Karl A. P. Payne), факультет медико- биологических наук Манчестерского университета (Манчестер, Великобритания) Manchester Interdisciplinary Biocentre, 131 Princess Street, Manchester, M1 7DN E- mail: karl.payne@manchester.ac.uk Tомас A. Джовитт (Thomas A. Jowitt), врач- оптометрист, факультет медико- биологических наук Манчестерского университета (Манчестер, Великобритания) Faculty of Life Sciences, Michael Smith Building, Oxford Road, Manchester, M13 9PT Tel.: +44 (0) 161 306 5176, +44 (0) 161 275 1561 E- mail: thomas.a.jowitt@manchester.ac.uk Mарджери Ховард (Marjorie Howard), врач- оптометрист Faculty of Life Sciences, Michael Smith Building, Oxford Road, Manchester, M13 9PT Tel.: +44 (0) 161 275 6916, +44 (0) 161 275 5452 E- mail: marj.howard@manchester.ac.uk Филипп Б. Морган (Philip B. Morgan), врач- оптометрист, член Американской академии оптометрии, директор подразделения Eurolens Research, Манчестерского университета (Манчестер, Великобритания) Faculty of Life Sciences, Carys Bannister Building, Dover Street, Manchester, M13 9PL Tel.: +44 (0) 161 306 4441, +44 (0) 161 306 3887 E- mail: philip.morgan@manchester.ac.uk Кэрол Мальдонадо- Кодина (Carole Maldonado- Codina), врач- оптометрист, факультет медико- биологических наук Манчестерского университета (Манчестер, Великобритания) Faculty of Life Sciences, Carys Bannister Building, Dover Street, Manchester, M13 9PL Tel.: +44 (0) 161 306 8761, +44 (0) 161 306 4442 E- mail: carole.m- codina@manchester.ac.uk Кертис Б. Добсон (Curtis B. Dobson), старший лектор, факультет медико- биологических наук Манчестерского университета (Манчестер, Великобритания) Faculty of Life Sciences, 3.614 Stopford Building, Oxford Road, Manchester, M13 9PT Tel.: +44 (0) 161 306 8765, +44 (0) 161 306 4433 E- mail: curtis.b.dobson@manchester.ac.uk ¹ 5 ( и юнь) 2 012 Raj_Sohranenie_so05-12_s3.indd 13 Ñ ÎÂÐ Å ÌÅ ÍÍÀß Î Ï Ò Î Ì ÅÒ ÐÈ ß 13 04.06.2012 12:50:19
