золотухина ирина алексеевна функциональная морфология
advertisement
На правах рукописи ЗОЛОТУХИНА ИРИНА АЛЕКСЕЕВНА ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ МОРФОЛОГИЯ ЭПИТЕЛИЯ ВОРСИН ПЛАЦЕНТЫ ЧЕЛОВЕКА В РАЗНЫЕ СРОКИ НЕОСЛОЖНЕННОЙ БЕРЕМЕННОСТИ 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва - 2014 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И.Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Ерофеева Людмила Михайловна Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Торбек Виктория Эдуардовна ГБОУ ВПО "Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова" Министерства здравоохранения Российской Федерации, профессор кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии доктор биологических наук ,профессор Курило Любовь Федоровна ФГБУ «Медико-генетический научный центр» РАМН, зав. лабораторией генетики нарушений репродукции Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Первый СанктПетербургский государственный медицинский университет имени И.П. Павлова» Министерства Здравоохранения Российской Федерации. Защита состоится « 20» января 2015 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.04 на базе ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д.1. С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке и на сайте http: ⁄⁄ rsmu.ru ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д.1. Автореферат разослан «____»________________2014 года Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Л.В. Леонова 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования Плацента является провизорным органом, обеспечивающим развитие эмбриона, плода и рождение жизнеспособного ребенка. Ее весьма разнообразные физиологические функции направлены на поддержание полноценного материнского-плодного обмена, включающего не только доставку плоду энергетических веществ и выведения продуктов обмена, но и защиту его от вредных влияний матери и внешней среды. Во время физиологической беременности в системе мать-плацента-плод складывается многокомпонентная сбалансированная система гемостаза [Милованов А.П. и соавт., 1999; 2001]. Важная роль в регуляции местного гемостаза принадлежит, синцитиотрофобласта материнской кровью так ворсин, называемой, которая щеточной непосредственно кайме омывается [Benirschke K., Kaufmann P., 1990, 1995]. В зоне микроворсинок находятся множество рецепторов к IgG, трансферрину, плазмину, тромбину, гепарину, аннексин плацентарный протеин-1), тромбомодулин, V (антикоагулянтный и другие белки, которые обладают тромболитическим свойством, предупреждая свертываемость материнской крови. Состояние физиологичной гиперкоагуляции материнской крови нейтрализуется многими плацентарными факторами. Одни из них предупреждают адгезию и агрегацию тромбоцитов матери (оксид азота, простациклин, простагландины), инактивируют тромбин и тем самым препятствуют тромбообразованию, другие - нейтрализуют действие коагулирующих факторов (простациклин), образуют иммуноинертный слой между кровью матери и гликокаликсом эпителия ворсин, блокируют способность к реакциям коагуляции (аннексин V). Существование устойчивой системы гемостаза в системе мать – плацента плод, в которой коагулянтное и антикоагулянтное звено уравновешивают друг друга, зависит от структурной целостности слоя гликокаликса, 3 щеточной каймы и составляющих ее микроворсинок синцитиотрофобласта. В зоне щеточной каймы располагаются разнообразные биологически активные вещества, в том числе тромбомодулин, простациклин, простагландины PG12 и PGE, а так же специфическая термостабильная плацентарная щелочная фосфатаза (ПЩФ), которая способствует процессам транспорта веществ через плацентарный барьер [Matsubara S. et al., 1987], активирует ферменты для многих метаболических процессов [Iqbal S.I. et al., 2000; Sembaj A. еt al., 2000], участвует в клеточной пролиферации и дифференцировке тканей [Dabare A.A. et al., 1999], регулирует систему гемостаза [Сухарев А.Е. и соавт., 2006], участвует в активации факторов роста и, возможно, сама обладает такими свойствами [She Q.B. et al., 2000], принимает участие в клеточной пролиферации [Dabare A.A. et al., 1999], осуществляет транспорт IgG к плоду [Stefaner I. et al., 1997; Makiya R. et al., 1999]. В физиологических условиях ПЩФ, наряду с β-ХГЧ, плацентарным лактогеном, специфическим трофобластическим β-гликопротеином беременных, относят к маркѐрам дифференцировки трофобластического эпителия [Loch A. et al., 1996; Morrish D.W. et al., 1998; Salehnia M. et al., 2000], а главное она является достоверным иммуногистохимическим маркером щеточной каймы и характеризует ее функциональную активность в целом. В большинстве исследований работ, с помощью иммуногистохимических иммунопозитивное окрашивание антител к ПЩФ было выявлено в плазмолемме апикальной части синцитиотрофобласта, в единичных работах - в плазмолемме базальной части цитотрофобласта ворсин плаценты [Leitner K. et al., 2001]. Вместе с тем в литературе имеются отдельные обнаруживается в публикации, плацентарной показывающие, ткани на 7 неделе что ПЩФ нормальной беременности, к 12-13 неделям ПЩФ увеличивает концентрацию, что 4 связывают с ее ролью в плодно-материнском метаболизме [Okamoto T. et al., 1990]. Таким образом, анализ литературы показал, что до настоящего времени остается неясным главный вопрос, на каком сроке возникают микроворсинки (щеточная кайма) синцитиотрофобласта и когда они начинают синтезировать ПЩФ, что напрямую является маркером начала интенсивного гемохориального кровотока. В многочисленных работах, посвященных изучению плаценты, эти важные моменты описываются фрагментарно по отдельным срокам беременности, часто без указания срока гестации, либо используются разные методы исследования, что не позволяет сравнить представленные данные и не дает целостного представления о динамике становления эпителия ворсин. Однако, такие данные чрезвычайно важны для понимания жизнеобеспечения эмбриона в период формирования плаценты, а также для выяснения механизмов ранних потерь беременности. В этой связи актуальной задачей является определение сроков перестройки трофобластического эпителия ворсин плаценты в течение физиологической беременности. Цель исследования Представить комплексную картину развития всех компонентов эпителия ворсин плаценты на разных сроках гестации в течение физиологической беременности. Задачи исследования 1. Изучить динамику ветвления ворсин и структуру трофобластического эпителия ворсин от стадии ветвистого хориона до завершения беременности. 2. Определить площадь трофобластического эпителия ворсин и изучить иммуногистохимические особенности основных его компонентов с помощью антител против ПЩФ, β- ХГЧ и Ki 67. 5 3. Изучить динамику структурных преобразований и секреторную активность цито- и синцитиотрофобласта на разных сроках гестации. 4. Показать количественные и морфофункциональные особенности производных трофобластического эпителия – свободных симпластов и синтициальных почек на разных сроках гестации. Научная новизна Впервые изучена динамика морфологической перестройки эпителия ворсин плаценты (цитотрофобласта и синцитиотрофобласта), а также его производных: свободных симпластов и синтициальных почек. Выделены 5 этапов в течение всего периода морфогенеза плаценты. Впервые показана динамика структурного становления щеточной каймы и составляющих ее микроворсинок на протяжении всей беременности. С помощью иммуногистохического исследования уточнены сроки появления ПЩФ, ее распределение в трофобластическом эпителии и периоды максимальной экспрессии в течение всей физиологической беременности. Впервые с помощью электронной микроскопии изучена динамика адаптационных преобразований базальной части трофобласта ворсин плаценты на разных сроках гестации, в особенности в первом триместре. Показано образование и усложнение инвагинаций плазмолеммы цитотрофобласта по типу базального лабиринта, а также образование отростков базальной части трофобластического эпителия, покрытых базальной мембраной и внедряющихся в строму ворсин плаценты. Теоретическая и практическая значимость работы Полученные данные о сроках появления микроворсинок щеточной каймы, инвагинаций плазмолеммы базальной части трофобластического эпителия и динамике их развития существенно дополняют имеющиеся сведения о морфогенезе плаценты и процессах ее адаптации к меняющимся потребностям эмбриона и плода на разных этапах 6 гестационного периода и могут быть использованы при анализе результатов научных исследований по проблемам морфофункционального состояния плаценты, а так же для понимания причин и механизмов возникновения патологий, таких как самопроизвольное прерывание беременности, «замершая» беременность, связанных с нарушением трофики плода. Результаты исследований могут послужить основой для разработки новых методов диагностики и лечения осложнений беременности. На основании иммуногистохимических и ультрамикроскопических особенностей гестационной перестройки хориальных ворсин в морфогенезе плаценты выделены 5 периодов с уточнением сроков, что может быть использовано при оценке состояния плаценты в клинической практике. Новые сведения о производных трофобластического эпителия синцитиальных почках и свободных симпластах расширяют представления о их структуре и значении. Материалы исследования могут быть использованы в научных целях, при составлении руководств, а также в учебном процессе при чтении лекций и проведении занятий по гистологии и эмбриологии, патологической физиологии и анатомии, биохимии, акушерству и гинекологии в высших учебных заведениях биологического и медицинского профиля. Положения, выносимые на защиту 1. Динамика морфологической перестройки эпителия ворсин плаценты соответствует его функциональной специализации и включает преобразования цито- и синцитиотрофобласта, заключающиеся в формировании щеточной каймы и инвагинаций плазмолеммы в базальной части, а также образование синцитиальных почек и свободных симпластов. 7 2. Особенности ультраструктурной иммуногистохимические организации показатели эпителия (интенсивность ворсин, экспрессии щелочной фосфатазы, β-фракций хорионического гонадотропина), а также пролиферативная активность эпителия являются важными характеристиками фетоплацентарного комплекса. Внедрение результатов исследования в практику Результаты исследования внедрены в учебный процесс на кафедрах анатомии человека, в практическую работу на кафедре патологической анатомии и в научную работу кафедры гистологии, эмбриологии, цитологии ГБОУ ВПО «Московский государственный медико- стоматологический университет имени А.И.Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Апробация работы Результаты и положения диссертации доложены и обсуждены на научно-методическом заседании кафедры гистологии, эмбриологии, цитологии МГМСУ им. А.И. Евдокимова (Москва, 2009); научнопрактической конференции «Научная организация деятельности анатомических кафедр в современных условиях» (Витебск, 2009); Х Конгрессе Международной Ассоциации морфологов (Ярославль, 2010); IX Всероссийской университетской научно-практической конференции молодых ученых по медицине (Тула, 2010); III Эмбриологическом симпозиуме Всероссийского научного медицинского общества анатомов, гистологов, эмбриологов «Югра-Эмбрио-2011. Закономерности эмбриофетальных морфогенезов у человека и позвоночных животных» (ХантыМансийская государственная медицинская академия, 2011); научно- методической конференции кафедры гистологии, эмбриологии, цитологии, кафедры нормальной анатомии, кафедры патологической анатомии ГБО ВПО МГМСУ имени А.И.Евдокимова (май, 2014). 8 Публикации По теме диссертации опубликовано 7 работ, из них 2 работы в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для публикации материалов докторских и кандидатских диссертаций. Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы материала и методов исследований, главы собственных исследований, главы обсуждения полученных данных, выводов, библиографии, включающей 17 отечественных и 155 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 43 рисунками и 4 таблицами. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования Для решения поставленных задач были собраны материалы медицинских абортов у здоровых женщин, пожелавших прервать беременность на разных сроках, которые распределяли по группам (табл. 1). Особое внимание обращали на уточнение гестационного срока (недели после оплодотворения -п.о.; после менструации - п.м.). Подбор здоровых женщин осуществляли в соответствии с клиническими показаниями и противопоказаниями. Для уточнения гестационного срока перед медицинским абортом у женщин с помощью УЗИ определяли темякопчиковые размеры эмбриона (КТР) и рассчитывали менструальный срок минус 2 недели. Каждая из 8 представленных групп характеризовалась некоторыми особенностями взятия материала. В частности, в 1-ой и 2-ой группах целые хориальные мешки помещали в физиологический раствор в чашках Петри, где визуально выявляли гладкий хорион с небольшим количеством генераций отходящих ворсин и ветвистый хорион – противоположный сегмент мешка с более разветвленной сетью ворсин. 9 Таблица 1 Исследуемый материал № гр. Кол-во наблюде ний 1 10 2 3 10 9 4 5 6 8 9 10 7 11 8 9 Особенности взятия материала I триместр лекарственный аборт с помощью введения препарата «Мифегин» - //медицинский абортов путем вакуум экстракции и соскоба из полости матки у здоровых женщин - //- //- //II триместр поздний медицинский абортов с помощью введения препарата «Энзапрост» в околоплодные воды III триместр самостоятельные роды, протекавшие без осложнений Гестационный срок 4 п.о. 5 п.о. 6 п.о. 7 п.о. 8 п.о. 9-10 п.о. 18-24 п.м. 39-40 п.м. Из двух указанных сегментов вырезали небольшие кусочки ворсин с соответствующей маркировкой. С 3 по 7-ую группы материал соскоба предварительно отмывали от крови и выборочно забирали фрагменты, напоминающие «икру», т.е. ворсины плаценты. В 7- 8-ой группе выделяли целые плаценты, из которых забирали ткань из разных участков не менее 7-8 кусочков. Забор кусочков ткани размером 1,0х 0,5х 0,5 см осуществлялся из центральной, парацентральной и краевой частей плаценты, кроме того, один кусочек забирали с хориальной пластинкой, другой – с материнской поверхности. 10 Гистологический и электронно-микроскопический методы Взятые образцы фиксировали 10% нейтральным формалином, проводили по спиртам восходящих концентраций и ксилолу, заливали в парафин. Из парафиновых блоков готовили срезы толщиной 5-6 мкм и окрашивали их гематоксилином и эозином. Для электронно-микроскопического исследования отбирали по 5 случаев из каждой группы плацент. Вырезали кусочки 1мм³, префиксировали их в 2,5% растворе глутарового альдегида на фосфатном буфере, промывали и дофиксировали в 1% растворе четырехокиси осмия, контрастировали в кусочках уранилацетатом и после обезвоживания заливали в смесь эпона с аралдитом. Ультратонкие срезы контрастировали цитратом свинца по методу Рейнольдса и просматривали в электронном микроскопе «Jem – 100B» при различных увеличениях. Иммуногистохимический метод Иммуногистохимическое исследование выполняли на депарафинизированных срезах непрямым иммунопероксидазным методом, использовали следующие антитела и технологические детали: 1. Антитело против плацентарной щелочной фосфатазы (ПЩФ) для выявления щеточной каймы (Novocastra, клон RTU - PLAP-8А9); 2. Антитело против β субъединиц хорионического гонадотропина человека (β-ХГЧ) в синцитиотрофобласте ворсин (Novocastra NCLHCGp) (после воздействия трипсина); 3. Маркер (Ki67) для выявления пролиферации цитотрофобласта (Novocastra, клон ММ1). Для демаскирования антигена стекла со срезами нагревали в микроволновой печи с 0,01М (pH 6,0) цитратным буферным раствором в течение 10 минут при мощности 450Вт (ПЩФ), затем после доливки буфера еще 10 мин при мощности 300Вт (Ki – 67, β-ХГЧ). Для подавления 11 активности эндогенной пероксидазы срезы инкубировали 10 мин. с 0,5% раствором перекиси водорода, а для предотвращения неспецифической адсорбции первичных антител, срезы инкубировали с 5% лошадиной сывороткой в течение 10 мин. Инкубацию с первичными моноклональными антителами проводили при комнатной температуре в течение 10 мин. (ПЩФ, Ki – 67) и 30 мин. (βХГЧ). После каждой процедуры обработки срезы промывали в TBS (Трисбуфере) pH 7,6 в течение 2-5 мин. Инкубацию с вторичными биотинилированными антителами проводили при комнатной температуре в течение 10 мин. Для визуализации иммунной реакции использовали 3,3 – диаминобензидиновую систему детекции (Субстратная система DAB Плюс / DAB Plus Substrate System). Затем докрашивали срезы гематоксилином Майера. Степень окрашивания оценивали в баллах, как отрицательную (негативную) (-), слабую (+), умеренную (++) и выраженную (+++), пользуясь шкалой цветов (рис. 1). «-» «+» «++» «+++» Рис.1. Шкала для оценки иммуноэкспрессии в баллах. Морфометрический метод С помощью микроскопа Leica DM 2500 с цифровой фотокамерой изображение ворсин при увеличении 100 передавалось на экран компьютера. По программе Adobe Photoshop Cs3 Extended проводили морфометрическую оценку генераций ворсин в поперечном сечении, а именно ворсин небольшого диаметра (рис. 2). 12 3 1 1 - площадь ворсины; 2 2 - площадь стромы; 3 - площадь эпителия. Рис. 2. Схема морфометрического исследования ворсины плаценты в поперечном срезе. Определяли: 1) по внешнему контуру эпителиального покрова – площадь ворсин (мкм²); 2) по внутреннему его контуру – площадь стромы (мкм²); 3) по их разнице – площадь трофобластического эпителия (мкм²). Статистическая обработка Полученные данные были проверены на нормальность распределения при помощи критерия Колмогорова-Смирнова в программе Statistica 6,0 из расчета около 100 ворсин на каждый гестационный срок. Количественные показатели площади ворсин, площади стромы и площади трофобластического эпителия, были обработаны параметрическими методами вариационной статистики, сравнение групп проводили с помощью t-критерия Стьюдента. В сравниваемых группах определяли среднюю арифметическую величину (М) и стандартную ошибку (m), при нормальном распределении статистический анализ проводили с помощью t-критерия Стьюдента, а при распределении, отличающимся от нормального, применяли критерий Манна-Уитни. Различия считали достоверными при пороговом уровне значимости р ≤ 0,05. Расчет количества свободных симпластов, производили путем подсчета их количества на 100 ворсин в поле зрения. Учитывали только симпласты, находившиеся в межворсинковом пространстве, с четкой щеточной каймой и конгломератом ядер, без каких-либо признаков стромы 13 и капилляров, чтобы избежать включения тангенциальных срезов концевых отделов мелких ворсин. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Плацента является уникальным объектом для изучения морфогенеза экстраэмбриональных структур, поскольку в ее развитии тесно сопряжены процессы дифференцировки цитотрофобласт), покровного васкуляризации стромы эпителия (синцитио- и ворсин, влияющих на формирование эмбриона и плода. Изучены морфологические и функциональные особенности эпителия ворсин плаценты человека на протяжении всего гестационного периода. На основании морфометрических показателей трофобластического эпителия ворсин выделены в морфогенезе плаценты 5 этапов. Три из них приходятся на первый триместр беременности и описаны впервые: Первый этап (4 - 5-ая нед. после оплодотворения - п.о.). На этом этапе мезенхимальные ворсины покрыты трофобластическим эпителием, который состоит из слоя цитотрофобласта и синцитиотрофобласта, его площадь составила 4863,2±248 мкм² (табл.2). В межворсинковом пространстве выявляется большое количество многоядерных симпластов. Количественное их содержание по отношению к общему числу ворсин достигало 57,14% (табл. 3). При иммуногистохимическом исследовании в эпителии ворсин реакция с антителом против ПЩФ негативна, однако, на электронномикроскопических снимках уже регистрируется формирующаяся щеточная кайма. Известно, что ПЩФ является маркером щеточной каймы. Возможно, отрицательная реакция в этом сроке гестации свидетельствует о том, что микроворсинки уже начали свое структурное формирование, но активных метаболических и транспортных процессов еще не происходит. 14 Таблица 2 Морфометрия трофобластического эпителия ворсин в течение I триместра беременности M±m (мкм²) Показатель 4 неделя n=98 Средняя площадь ворсин 15504,6 ±909,0 5 неделя 6 неделя 7 неделя n=90 n=100 n=73 n=65 n=96 17411,6 ±1305,5 19 05,5 ±1844,9 1 28,3 ±2464 8 32729,8 ±3458,4 30273,2 ±2705,0 N=96 р >0,05 р > 0,05 р>0,05 р >0,05 Средняя площадь стромы 10641,6 ±688,7 12667,3 ±1074,3 14918,7 ±1551 р <0,05 13368,2 ±1964,1 25756,7 ±2926,0 Р <0,05 4863,2 ±248,9 4744,3 282,8 4786,7 ±324,6 р >0,05 23902,49 2325,7 Р > 0,05 р > 0,05 Средняя площадь эпителия 8 неделя 9-10 неделя р <0,05 4460 0 ±528,3 6973,1 607,0 р >0,05 р>0,05 6370,7 ±433,0 р < 0,05 р <0,05 Таблица 3 Количество свободных симпластов в течение физиологической беременности Недели гестации 4 неделя (п.о.) 5 неделя (п.о.) 6 неделя (п.о.) 7 неделя (п.о.) 8 неделя (п.о.) 9-10 недели (п.о.) 18-24 недели (п.м.) 39-40 недели (п.м.) Количество исследованных ворсин (n) 98 90 100 73 95 96 85 100 Количество выявленных симпластов (n) 56 67 104 174 115 68 16 5 15 Отношение свободных симпластов к количеству ворсин (в %) 57,14 74,44 104,0 238,35 121,05 70,83 18,82 5 Антитело против β фракций ХГЧ выявляет слабую (+) степень иммуноокрашивания в инвазирующем ЦТ и трофобластическом эпителии и отрицательное окрашивание в свободных симпластах и в стенке хориального мешка. Высокая степень пролиферации ЦТ, особенно в дистальных отделах ворсин обуславливает рост ворсинчатого дерева в длину, это подтверждается выявлением иммунопозитивных клеток с помощью маркера Ki-67. В стенке хориального мешка и в зоне ворсинчатого хориона количество иммунопозитивных ядер составило 34%. В ЦТ ворсин выявлено в среднем 29% Ki-67 позитивных клеток, а в инвазирующем ЦТ их число составило около 96%. В свободных симпластах и синтициальных почках эта реакция была негативна (-). По данным ультразвукового исследования этому периоду гестации соответствует копчико-теменной (КТР) размер эмбриона, равный 5-9 мм. Второй этап (6 и 7-ая нед.) – происходит рост плаценты за счет увеличения числа боковых генераций. При этом площадь стромы и трофобластического эпителия отличается слабой тенденцией к (табл. 2). Об активности роста можно судить по росту выявлению иммунопозитивных клеток цитотрофобласта с помощью маркера Ki-67. С ним иммуногистохимическая реакция имела не одинаковый характер: в эпителии опорных ворсин она составила 25%, в промежуточных ворсинах – 34%, а в более мелких генерациях зафиксировано 21% Ki-67 позитивных клеток. Реакция с этим антителом в синтициальных почках и свободных симпластах была негативна. Иммуноэкспрессия ПЩФ имела негативную (-) реакцию в трофобласте ворсин, синтициальных почках и свободных симпластах, что не совпадает с данными других авторов [Okamoto T. et al., 1990] о ее наличии на 7 неделе гестации. Иммуноокрашивание с антителом против β-ХГЧ выявлялось в выраженной степени (+++) как в эпителии ворсин, так и в свободных симпластах и синтициальных почках. В этот период эпителий ворсин имеет высокую секреторную активность, что 16 подтверждают, электронно-микроскопические снимки, на которых видны крупные секреторные гранулы в цитоплазме синцитиотрофобласта. Отмечается дальнейшая морфологическая и функциональная специализация апикальной и базальной частей трофобластического эпителия, которая заключается в росте и усложнении формы микроворсинок, которые приобретают колбовидную форму, и в появлении инвагинаций плазмолеммы базальной части цитотрофобласта, что является подготовительным этапом к активным процессам транспорта веществ. Наряду с этим формируются пальцевидные отростки базальной части трофобласта, сопровождаемые базальной мембраной, и внедряющиеся в подлежащую строму ворсины. Такие преобразования обеспечивают увеличение контактной поверхности между эпителием и стромой ворсины, что также способствует адаптации плаценты к активным транспортным процессам. В этот период КТР эмбриона составляет 14-20 мм, а масса эмбриона – 2 г.. Третий этап (8, 9 и 10-ая нед. п.о.) – в этом гестационном периоде у плода происходит возможным активный только при органогенез, полноценном который представляется гемохориальном обмене, начинающемся в конце 8-ой недели [Jauniaux E. et al., 2000; Jauniaux E. et al., 2003; James J.L. et al., 2006]. В связи с этим происходит существенная морфологическая перестройка ворсинчатого дерева (табл. 2). Начиная с 8ой нед. увеличилась общая площадь ворсин в 1,8 раза за счет их фестончатых очертаний и образования синцитиальных почек. В 1,6 раза стал толще трофобластический эпителий вследствие увеличения площади синцитиотрофобласта - основного продуцента плацентарных гормонов и белков, по-видимому, за счет увеличения объѐма цитоплазмы и ядер, также его поверхностного слоя микроворсинок – щеточной каймы и образования отростков цитотрфобласта в сторону стромы ворсин. Вследствие этого происходит приближение капилляров к эпителиальному покрову, что способствует увеличению транспортных процессов. 17 Начиная с 9 недели впервые регистрируется умеренная, а затем выраженная иммуноэкспрессия ПЩФ в цитоплазме синцитиотрофобласта, в зоне щеточной каймы, свободных симпластах и синцитиальных почках, что противоречит данным о ее появлении в сроке 7 недель [Okamoto T. et al., 1990], с 8 недели [Povinelli C.M. et al., 1991], возможно такое разногласие с литературными источниками обусловлено тем, что в литературе не указано, как рассчитывался срок беременности. Согласно полученным нами данным, развитие нормально протекающей беременности сопровождается увеличением иммуноэкспрессии ПЩФ в эпителии ворсин плаценты. Возможно, что синтез ПЩФ по времени приурочен к началу маточно-плацентарного кровотока, который до срока 9-и нед. гестации был заблокирован цитотрофобластическими пробками, которые препятствовали попаданию материнских эритроцитов в межворсинковое пространство [James J.L. et al., 2006]. Необходимость появления ПЩФ имеет отношение к складывающимся реологическим условиям. Вероятнее всего ПЩФ действует в тесном контакте с аннексином V и оксидом азота, предотвращая мембранозависимую активацию коагуляции материнской крови [Милованов А.П. и соавт., 2001]. Также в этот период становится необходимым увеличение интенсивности белкового и углеводного синтеза и активации остеогенеза плода, в чем и принимает участие ПЩФ [Iqbal S.I. et al., 2000; Sembaj A. et al., 2000]. О высокой гормонопродуцирующей функции эпителия ворсин в данном гестационном сроке свидетельствует выраженная степенью (+++) иммуноэкспрессии β-ХГЧ в синцитиотрофобласте, синцитиальных почках и свободных симпластах. О значении свободных симпластов, уходящих в материнский кровоток, в литературе нет единого мнения. По-видимому, это связано с отсутствием данных о их количестве на разных сроках беременности. Традиционно их считают признаком патологии плаценты, в частности у женщин с преэклампсией [Burton G.J. et al., 2009; Rajakumar A. et al., 18 2012]. Возможно, они отражают постоянство количественных соотношений между цито- и синцитиотрофобластом [Ng Y.H. et al., 2011]; либо являются регуляторами гемостаза, а также, будучи мигрантами в легочную ткань матери, индуцируют иммунную толерантность к плоду [Chamley L.W. et al., 2011]. По нашим данным количество свободных симпластов в течение I триместра кардинально изменяется, с 4 по 7 недели п.о. постепенно нарастает, а затем, достигнув пика в сроке 7 недель гестации, начинает постепенно снижаться, что является новым фактом в плацентологии, однако, смысл подобных количественных эволюций пока не ясен. Вероятнее всего этот период является «критическим» для развития плода, свободные симпласты «атакуют» организм матери, принося с собой молекулу ДНК плода, это способствует возникновению устойчивости материнского организма к плоду. Таким образом, морфогенез плаценты в 1-ом триместре физиологической беременности определяется меняющимися условиями микроокружения эмбриона: от низкокислородной среды и анаэробного типа питания к высокоэффективному гемохориальному обмену [Tuuli M.G. et al., 2011]. Морфологическая перестройка характеризовалась рядом особенностей: высокой секреторной активностью синцитиотрофобласта, сформировавшимися микроворсинками, выраженной иммуноэкспрессией ПЩФ. Благодаря тому, что иммуноэкспрессия ПЩФ имеет выраженный характер, мы можем судить об активности транспортных процессов. Этот критерий может служить маркером при таких патологиях как «замершая» беременность, самопроизвольная остановка беременности и свидетельствовать о нарушении процессов метаболизма. В свою очередь известным фактом является то, что синтез ПЩФ стимулируется эстрогенами [Беда Н.А., 2002], применение которых поможет избежать патологий такого рода. Редуцируются ядра цитотрофобласта ворсин, а также происходит усложнение в строении базальной части цитотрофобласта, это выражается в увеличении числа и глубины 19 инвагинаций плазмолеммы по типу базального лабиринта, в удлинении и разветвлении отростков базальной части трофобласта, в результате чего капилляры приближаются к эпителию. Все изменения направлены на укорочение дистанции между лакунами с кровью матери и сосудами плода. В результате морфологической перестройки ворсин происходит подготовка к гемохориальному обмену. Таким образом, происходит адаптация плаценты к изменяющимся условиям жизнеобеспечения эмбриона. Середина II триместра характеризуется быстрым ростом плода, в результате изменяются и его потребности в питании, газообмене и обеспечении других жизненно важных функций. Чтобы соответствовать требованиям плода, плацента морфологически перестраивается, что соответствует четвертому этапу в развитии ворсинчатого дерева. В этот период ворсинчатое дерево плаценты характеризуется интенсивным ростом ветвей в длину и дифференцировкой ворсин на три типа: 1) опорные, 2) промежуточные дифференцированные преобладают ворсины. промежуточные незрелые, В и 3) строении промежуточные ворсинчатого терминальные ворсины, дерева индекс пролиферации, выявленный с помощью маркера Ki-67 в эпителии этих ворсин составляет всего 0,5 %. В отличие от опорных терминальные ворсины более мелкие в диаметре, что отражается в морфометрической характеристике, диаметр ворсин в сравнении с 9 – 10 неделями уменьшился в 1,8 раза (табл. 4). В промежуточных дифференцированных ворсинах наблюдается укорочение наличием эпителиально-капиллярной участков цититрофобласта. дистанции, синцитиотрофобласта, Об истончении где эпителия это проявляется отсутствует слой свидетельствуют морфометрические параметры: в сравнении с 9 – 10 неделями п.о. площадь эпителия уменьшилась в 1,9 раза. 20 Таблица 4 Морфометрия эпителия ворсин в течение II и III триместров беременности M±m (мкм²) Показатель Средняя площадь ворсин Средняя площадь стромы Средняя площадь эпителия 18 - 24 неделя n=85 17017,7 ±2030,8 13731,8 ±1753,1 P <0,001 P <0,001 3285,9 ±291,5 P <0,001 38 - 40недели n=100 3476,4 ±220,7 2690,2 ±189,3 786,2 ±35,3 Активные метаболические процессы отражаются и на строении базальной части трофобласта, которая имеет множественные инвагинации плазмолеммы, формирующие сложный лабиринт. Кроме транспорта веществ, важнейшей функцией плаценты является синтез и секреция широкого спектра биологически активных веществ белковой природы. Многочисленные плацентарные белки (более 60) выполняют роль гормонов, рецепторов, факторов роста, ингибиторов, иммунорегуляторных агентов, транспортных и связывающих белков. В нашей работе о возросших темпах синтеза ПЩФ свидетельствует ее выраженная иммуноэкспрессия в плазмолемме базальной части, где области щеточной каймы и в ПЩФ выявляется в виде неровной линии. Иммуноэкспрессия ПЩФ в свободных симпластах имеет также выраженную степень. Иммуноэкспрессия антитела против β-ХГЧ становится менее интенсивна во всех типах ворсин. Динамику β-ХГЧ в плацентарной ткани можно сравнить с количеством β-ХГЧ в сыворотке беременных женщин. Так, по данным Laurence A.C. (2010), в сроке 9 – 10 недель гестации уровень β-ХГЧ в сыворотке крови беременных женщин 21 составляет 10,35 нг/мл, а в сроке 18 - 26 недель гестации – 1,93 нг/мл. Количество свободных симпластов в межворсинковом пространстве в этот период резко уменьшилось и составляло 16 образований на 100 ворсин. Полученные данные свидетельствуют о том, что морфогенез плаценты во II триместре всецело направлен на обеспечение возрастающих потребностей плода. Происходит активный рост и ветвление ворсинчатого дерева, в котором преобладают терминальные ворсины. Также для обеспечения транспортных процессов морфологически перестраивается эпителий ворсин, появляются протяженные участки, где отсутствует цитотрофобласт. Там же, где цитотрофобласт сохранился, происходит и его морфологическая перестройка, а именно, усложняются инвагинации плазмолеммы в его базальной части. Такая перестройка эпителия в результате приводит к истончению эпителиально-капиллярной дистанции, что способствует быстрому темпу роста плода, который в этот период имеет КТР 34-38 см. и массу 1012-1100г. [Милованов А.П., 1999]. В конце беременности преимущественно специализированными ворсинчатое терминальными ворсинами дерево и с представлено терминальными большим количеством синцитиокапиллярных мембран, что подтверждается морфометрическими данными. Площадь ворсин в этот период минимальна по сравнению с другими гестационными периодами (табл. 4). Об отсутствии роста ворсинчатого дерева свидетельствует также иммунонегативная реакция с маркером Ki-67 в эпителии всех типов ворсин. В этом сроке наблюдается завершение дифференцировки трофобластического эпителия в сторону образования синцитиокапиллярных мембран, что обеспечивает реализацию возрастающих потребностей плода, эти данные находят свое подтверждение в работах других ученых [Павлов К.А. и соавт., 2011]. Синцитиокапиллярная цитоплазмы мембрана безъядерного представляет участка собой тонкий синцитиотрофобласта, слой общую базальную мембрану трофобластического эпителия и эндотелий плодного 22 капилляра. По стереогистохимическим данным T.M. Mayhew (2003), в сроке 37 - 40 нед. средняя площадь барьера складывается из толщины эпителия (1,9-2,1 мкм²) и капилляра (1,14-1,25 мкм²). В результате морфологическая перестройка ворсин направлена на облегчение транспортных и метаболических процессов, что и подтверждается выраженной имуноэкспрессией ПЩФ в виде толстой сплошной зоны в щеточной кайме и более тонкой линии в плазмолемме базальной части трофобластического эпителия. В результате исследования была прослежена динамика морфологической и функциональной специализации трофобластического эпителия ворсин плаценты, которая коррелировала с динамикой роста массы плода. 1. На основании ВЫВОДЫ морфологической перестройки эпителия ворсин плаценты, включающей в себя динамику изменения цитотрофобласта, синцитиотрофобласта, свободных симпластов и синтициальных почек, выделены 5 этапов в течение всего периода морфогенеза плаценты. 2. Первый этап (4 – 5 недель п.о.) заключается в дифференцировке ворсин, окружающих хориальный мешок, с выделением зоны ветвистого хориона. В увеличивающихся генерациях ворсин эпителий представлен цитотрофобластом активностью 78% (маркер с Ki-67) высокой и пролиферативной синцитиотрофобластом с поверхностными микроворсинками. Слабая степень иммуноэкспрессии β-ХГЧ в инвазирующем цитотрофобласте и цитотрофобластическом эпителии. Площадь эпителия составляет 4863,2 ±248,9 мкм² (р>0,05). Двухслойный трофобластический эпителий расположен на тонкой, рыхлой базальной мембране. 3. Второй этап (6 – 7 неделя п.о.) развития плаценты характеризуется дальнейшим ростом боковых генераций ворсин, среднее значение 23 площади которых составляет 19705,5 ±1844,9 мкм² (р>0,05), что обеспечивается высокой пролиферативной активностью клеток цитотрофобласта ворсин. В эпителии стволовых ворсин – 65% Ki-67 позитивных ядер, в отходящих боковых генерациях – 78%, в эпителии мелких ворсин - 36%. Иммуноэкспрессия плацентарной щелочной фосфатазы не выявлена. Обнаружены инвагинации плазмолеммы цитотрофобласта в его базальной части. 4. Третий этап (8 – 10 недели п.о.) характеризуется максимальной площадью эпителия (6370,7 ±433,0 мкм², р<0,05), началом иммуноэкспрессии плацентарной щелочной фосфатазы в зоне щеточной каймы, протяженными участками ворсин без цитотрофобласта и понижением его пролиферативной активности: в эпителии опорных ворсин индекс пролиферации - 12%, в эпителии промежуточных ворсин - 8% и 5% - в трофобластическом эпителии терминальных ворсин. Происходит дальнейшее увеличение протяженности и ветвления инвагинаций плазмолеммы цитотрофобласта в базальной части. 5. Четвертый этап (18 – 24 недели п.м.) отличается дифференцировкой ворсин на опорные, активной промежуточные и терминальные ветви с уменьшением наружной (17017,7 ±2030,8 мкм²; р<0,001) и внутренней границ трофобластического эпителия (13731,8 ±1753,1 мкм²; р<0,001) и значительной редукцией его площади (3285,9 ±291,5; р<0,001). Маркер пролиферации дает негативную реакцию в эпителии всех типов ворсин, кроме терминальных, где индекс пролиферации составляет 0,5 %. Инвагинации плазмолеммы цитотрофобласта имеют более сложное строение. Плацентарная щелочная фосфатаза локализуется в области микроворсинок и в плазмолемме базальной части цитотрофобласта, то есть имеет двухслойное распределение. 6. Пятый этап (39 – 40 недели п.м.) завершается дальнейшим усложнением ворсинчатого дерева за счет доминирования терминальных ворсин с 24 минимальными значениями площади трофобластического эпителия, которая равна 786,2±35,3 мкм² (р<0,001). Появляются синцитиокапиллярные мембраны (истончение плацентарного барьера). Сохраняется выраженная двухслойность иммуноэкспрессии плацентарной щелочной фосфатазы в эпителии всех типов ворсин. 7. Среди производных трофобластического эпителия ворсин наиболее значимые изменения выявлены в количестве свободных симпластов, отшнуровавшихся от синцитиотрофобласта и представляющих собой многоядерные структуры, окруженные микроворсинками с иммуноэкспрессией ПЩФ, β-ХГЧ. Количество свободных симпластов достигает максимума на 7 неделе п.о. и составляет 174 образования на 100 ворсин, затем происходит их количественная редукция на 8 нед. п.о. до 115; на 9 -10 нед.п.о. – до 68; на 18 – 24 нед.п.м. их количество составило 16; а на 39 – 40 нед.п.м. - 5. 8. Морфология микроворсинок прослежена на протяжении всего периода гестации. Первые формирующиеся микроворсинки выявлены на 5 нед.п.о., на 7 нед.п.о. они были выше и имели колбообразную форму, на 8 нед.п.о. имели ветвящуюся структуру, на 9 нед.п.о. были крупные, цилиндрической формы, к концу беременности (39-40 нед. п.м.) - редкие, а в области синцитио-капиллярных мембран микроворсинки отсутствовали. 9. Инвагинации плазмолеммы базальной части цитотрофобласта и синцитиотрофобласта были прослежены в течение всего периода морфогенеза плаценты. На 6 нед.п.о. отмечены первые редко расположенные инвагинации претерпевающие в дальнейшем плазмолеммы усложнение, цитотрофобласта, образуя длинные переплетающиеся пальцевидные впячивания к 8 – 9 нед.п.о. с формированием широкого слоя инвагинаций по типу базального лабиринта в цито и синцитиотрофобласте к 18-24 нед.п.м.. Наряду с 25 этим наблюдается образование отростков базальной части трофобласта, внедряющихся в строму ворсин. Практические рекомендации 1. Сведения о морфологической структуре и активности функциональной эпителия ворсин на разных этапах гестационного периода рекомендуется использовать в акушерской практике, в работе патолого-анатомических служб для понимания причин и механизмов возникновения осложнений беременности. 2. При морфофункциональной оценке фето-плацентарного комплекса необходимо учитывать особенности строения ворсинчатого дерева, уровень иммуноэкспрессии ПЩФ, β-ХГЧ и количество Ki-67 позитивных клеток в эпителии ворсин. Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Золотухина, И.А. Морфогенез плаценты человека в 1 триместре беременности / А.П. Милованов, Л.М. Ерофеева, И.А. Золотухина, и др. // Морфология. - 2011. - № 2 (139) - С. 72-76. 2. Золотухина, И.А. Особенности ранних этапов формирования ворсин плаценты / Золотухина И.А., Ерофеева Л.М.. // Морфология. - 2011. - № 5 (140) - С. 33. 3. И.А.Золотухина. Морфология плаценты человека во II и III триместрах беременности / А.П.Милованов, Л.М.Ерофеева, И.А.Золотухина и др. // Морфология. - 2012. - № 5 (142) – С. 64-67. 4. Золотухина, И.А. Морфофункциональная характеристика ворсин плаценты в разные сроки неосложненной беременности / Александрович Н.В., Золотухина И.А. // Материалы научной конференции «Научная организация деятельности анатомических кафедр в современных условиях». Витебск. - 2009. – С. 146-147. 5. Золотухина, И.А. Ранние сроки развития плаценты человека / Александрович Н.В., Золотухина И.А. // Материалы Х Конгресса Международной Ассоциации морфологов. Ярославль. – 2010. - № 4 (137) С. 14-15. 6. Золотухина, И.А. Особенности формирования ворсин ранней плаценты человека / Золотухина И.А., Милованов А.П. // Материалы научной конференции «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии. Москва. - 2010. – С. 224. 7. Золотухина, И.А. Морфогенез ворсин плаценты в течение физиологической беременности / Александрович Н.В., Золотухина И.А. // Вестник новых медицинских технологий. Материалы IX Всероссийской 26 университетской научно-практической конференции молодых ученых по медицине. Тула. - 2010. - № 2 (XVII) - С. 7-8. Список сокращений СТ - синцитиотрофобласт ЦТ - цитотрофобласт ПЩФ - плацентарная щелочная фосфатаза β-ХГЧ - хорионический гонадотропин человека 27
