Дронина Мария Алексеевна Воздействие эндотоксинов Bacillus
advertisement
На правах рукописи Дронина Мария Алексеевна Воздействие эндотоксинов Bacillus thuringiensis ssp. israelensis на кишечный эпителий личинок комаров Anopheles stephensi и Aedes aegypti 03.00.09 – энтомология; 03.00.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2007 Работа выполнена в лаборатории химии белка им. В.М. Степанова в ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» и на кафедре энтомологии Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова. Научные руководители: кандидат химических наук И.А. Залунин доктор биологических наук, профессор С.Ю. Чайка Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор С.А. Рославцева кандидат биологических наук Е.Н. Элпидина Ведущая организация: Институт медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е.И. Марциновского Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова Защита состоится 23 апреля 2007 года в 15 ч. 30 мин. на заседании диссертационного совета Д 501.001.20 в МГУ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. Ломоносова. Автореферат разослан 23 марта 2007 г. Ученый секретарь диссертационного совета Л.И. Барсова кандидат биологических наук 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Одними из самых перспективных биоинсектицидов являются препараты, полученные на основе микроорганизма Bacillus thuringiensis. Для различных подвидов B. thuringiensis характерно образование инсектицидных белков (δ- эндотоксинов), отличающихся высокой специфичностью биологического эффекта. Как правило, эти токсины активны против личинок насекомых из отрядов Lepidoptera, Coleoptera и Diptera, а также нематод. В то же время, они абсолютно безвредны для большинства нецелевых объектов. В частности, токсины, продуцируемые Bacillus thuringiensis ssp. israelensis, убивают личинок многих видов комаров и мошек, но безвредны для всей остальной фауны водоёмов. В основе биологического эффекта δ-эндотоксинов B. thuringiensis лежит их цитопатологическое действие на эпителиальные клетки кишечника насекомых. В свою очередь, специфичность этих белков определяется их взаимодействием с рецепторами, локализованными в апикальной мембране эпителиальных клеток. Изучение воздействия δэндотоксинов на кишечный эпителий, поиск и характеристика соответствующих рецепторов важны для понимания механизма действия и специфичности энтомоцидных белков, а также выяснения путей возникновения у насекомых-мишеней резистентности к препаратам B. thuringiensis. Вследствие этого работы по изучению взаимодействия эндотоксинов B. thuringiensis с кишечным эпителием чувствительных насекомых необыкновенно актуальны. До настоящего времени основная масса исследований, посвящённых решению указанных проблем, была проведена для токсинов, активных против гусениц чешуекрылых (лепидоцидных белков). Москитоцидные токсины, например Cry4B и Cry11A из подвида Bacillus thuringiensis ssp. israelensis изучены значительно меньше. Цели и задачи исследования. Целью данной работы было комплексное изучение энтомоцидного действия эндотоксинов Bacillus thuringiensis ssp. israelensis на кишечный эпителий личинок комаров Anopheles stephensi и Aedes aegypti (Culicidae; Diptera). Для ее достижения были определены следующие задачи: - изучение цитопатологических изменений, происходящих в эпителиальных клетках личинок комаров (на примере личинок Ae. aegypti) под действием москитоцидных токсинов Cry4B и Cry11A, продуцируемых B. thuringiensis ssp. israelensis; - идентификация сайтов связывания токсинов со стенкой кишечника личинок комаров; 3 - выделение специфического рецептора (ов), ответственного за связывание токсинов кишечным эпителием личинок An. stephensi. Научная новизна. В работе впервые: всесторонне изучено воздействие эндотоксинов Cry4B и Cry11A на эпителиальные клетки личинок Ae. aegypti; с помощью гистохимических и иммуногистохимических методов визуализировано место связывания этих белков с кишечным эпителием насекомого; выделены 65 и 57 кДа токсинсвязывающие белки из апикальных мембран эпителиальных клеток личинок An. stephensi; высказано предположение, что наряду с выделенными ранее в лаборатории химии белка ГосНИИгенетика токсинсвязывающими белками из Ae. aegypti, эти два белка образуют не описанный ранее класс рецепторов эндотоксинов Bacillus thuringiensis. Практическая ценность работы. Полученные данные о действии москитоцидных токсинов на кишечный эпителий личинок комаров и о природе рецепторов этих токсинов определяют направления дальнейших исследований механизма москитоцидного эффекта и возможные пути возникновения резистентных линий комаров. В свою очередь, эти исследования позволят в дальнейшем создать биоинсектициды нового поколения с существенно повышенной эффективностью биологического эффекта и уменьшенной вероятностью возникновения устойчивых форм насекомых. Апробация работы, публикации. Основные положения диссертации представлены на конференции «Роль кровососущих насекомых и клещей в лесных экосистемах России» (Великий Новгород, 2000), II Республиканской научной конференции (Великий Новгород: НовГУ, 2002), на ХХVII Межвузовской научно-практической конференции по проблемам биологии и медицинской паразитологии, посвященной памяти акад. Е.Н. Павловского (С.-Пб., 2000). Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 6 научных работах, 3 из которых – в изданиях перечня ВАК. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 198 страницах машинописного текста, содержит 136 рисунков и 5 таблиц, состоит из введения, 5 глав, за- ключения, выводов, списка цитированной литературы и приложения. Список цитированной литературы содержит 179 названий, из которых 7 – на русском языке. Благодарности. За содействие в выполнении данной работы выражаю свою искреннюю благодарность: моим научным руководителям И.А. Залунину и С.Ю. Чайке за чуткое научное руководство, дбн Д.П. Жужикову за рецензирование рукописи, всем сотрудникам Лаборатории химии белка ГосНИИгенетика и сотрудникам кафедры энтомологии МГУ, а также сотрудникам Межкафедральной лаборатории электронной микроскопии биологического факультета за всестороннюю помощь в работе. 4 СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. Cry-белки Bacillus thuringiensis: молекулярная структура и механизм действия (обзор литературы) ∆-эндотоксины B. thuringiensis широко изучаются с 50-х годов 20-го века, и к настоящему времени накоплена большая научная литература, посвящённая особенностям структуры, функции, химических свойств и биологической активности этих белков, клонированы гены большого числа δ-эндотоксинов. В обзоре литературы подробно проанализированы современные данные, касающиеся молекулярной организации Cry-белков, механизма их действия, взаимодействия структуры и функции в молекулах δэндотоксинов. Особое внимание уделено освещению взаимодействия Cry-белков с рецепторными белками из кишечного эпителия гусениц – аминопептидазам и кадгеринноподобным белкам. В обзоре приводятся также сведения о наиболее изученных москитоцидных токсинах B. thuringiensis. Представленные данные проиллюстрированы рисунками и схемами. Глава 2. Материалы и методы 2.1. Получение и модификация δ-эндотоксинов B. thuringiensis. Москитоцидные белки Cry4B, Cry11A и Cyt1A выделяли из энтомоцидных кристаллов штамма 2395 (B.t. ssp. israelensis) сочетанием методов избирательной экстракции и анионообменной хроматографии на колонке MonoQ в системе FPLC. Эндотоксины Cry1A и Cry3A получали растворением кристаллов штамма B-9032 ssp. kurstaki и ssp. tenebrionis, соответственно. Чистоту выделенных белков определяли с помощью электрофореза в денатурирующих условиях и двойной иммунодиффузии с использованием специфических антисывороток на выделяемые Cry-белки. Для получения фрагментов эндотоксина Cry4B с молекулярной массой 64, 50 и 4948 кДа исходный белок обрабатывали, соответственно, химотрипсином, трипсином, или кишечным соком личинок Ae. aegypti. Полученные гидролизаты далее в тексте обозначаются: Cry4B-tox, Cry4B-tr и Cry4B-Аa. Протеолиз эндотоксина Cry11А с образованием фрагментов 33 и 36 кДа (этот гидролизат далее обозначается Cry11A-tr) и эндотоксинов Cry1A с образованием фрагментов Cry1A-tox (65 кДа) проводили трипсином. Биотинилирование белков осуществляли N-сукцинимидным эфиром биотина. 5 2.2. Определение биологической активности. Биологическое тестирование было выполнено на личинках Ae. aegypti второго возраста. Для проведения биотестов с эндотоксинами Cry11A и Сгу4В последние осаждали из растворов с известной концентрацией, добавляя лимонную кислоту до рН 4,5. Насекомых помещали по 10 особей в контейнеры, содержащие суспензию кристаллов B.t. ssp. israelensis (в диапазоне концентраций 0,19 - 12 нг/мл) или эндотоксинов Cry 11А (1 – 250 нг/мл), либо Сгу4В (0,25 - 60 нг/мл) в цитратном буфере. В качестве контроля использовали цитратный буфер. Каждый опыт проводили в 4 вариантах. Погибших насекомых подсчитывали через 24 часа. По данным этих опытов для последующих экспериментов были выбраны концентрации токсинов, вызывавших как низкий, так и высокий уровень смертности личинок. 2.3. Методика электронно-микроскопического исследования. Изучение влияния кристаллов эндотоксина, а также эндотоксина Cry11A и активированного токсина Cry4B на ультраструктуру кишечника проводили на личинках второго возраста комаров Ae. aegypti. После инкубации личинок с отобранными концентрациями токсинов в течение указанных интервалов времени их последовательно фиксировали 2,5%-ным раствором глутарового альдегида и 1%-ным раствором четырехоксида осмия, затем контрастировали уранилацетатом и заливали в смесь смол ЭПОН. Ультратонкие срезы окрашивали по методу Рейнольдса и исследовали в трансмиссионном электронном микроскопе JEM100B. 2.4. Проведение иммуноцитохимических и цитохимических исследований. Для выявления мест связывания москитоцидных токсинов с кишечным эпителием чувствительного насекомого использовали гистологические срезы средней кишки личинок второго возраста комара Ae. aegypti. Для этого отпрепарированные кишечники фиксировали в растворе Буэна, заливали их в парафин и готовили срезы толщиной 6 мкм, которые помещали на предметные стекла. Для проведения реакции срезы депарафинировали в ксилоле и проводили гистохимическое исследование. В случае иммуногистохимической реакции срезы кишечника насекомого последовательно инкубировали с токсинами (30 мкг/мл), раствором антител, специфических к соответствующему токсину, конъюгатом вторичных антител с одним из ферментов – пероксидазой или щелочной фосфатазой и хромогенными субстратами указанных ферментов. При этом окрашенные продукты энзиматической реакции откладывались рядом с местом нахождения комплекса рецептор – токсин – антитела к токсину – конъюгат и позволяли увидеть под микроскопом те участки клетки, в которых локализованы молекулы рецептора. 6 Для гистохимической реакции срезы последовательно инкубировали с биотинилированными токсинами и конъюгатом стрептавидина с пероксидазой или щелочной фосфатазой. Дальнейшую обработку срезов проводили по предыдущей схеме. После завершения процедуры окрашивания препараты обезвоживали и заключали в канадский бальзам. Изучение препаратов проводили в световом микроскопе МБИ-3. Фотографирование осуществляли с помощью цифровой фотокамеры Olimpus 3030, соединенной с компьютером. 2.5. Получение препаратов апикальных мембран (brush border membranes, BBM) кишечного эпителия личинок An. stephensi. BBM получали из гомогената средней кишки личинок третьего возраста An. stephensi комбинацией методов осаждения хлористым магнием и дифференциального центрифугирования. В ходе проведённого выделения апикальные мембраны были очищены в 6 раз, что было показано по возрастанию удельной активности маркерного фермента – лейцинаминопептидазы. Белковый состав полученных экстрактов определяли с помощью электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия. 2.6. Аффинная хроматография экстракта мембранных белков An. stephensi. Аффинные сорбенты Cry11A- и Cry4B-сефароза синтезировали с использованием сефарозы 4В, активированной бромцианом. Мембранные белки экстрагировали, обрабатывая BBM 1%-ным раствором детергента NONIDET P40 в карбонатном буфере, рН 9,5 в присутствии коктейля ингибиторов протеиназ, и наносили на колонку с Cry11A- или Cry4Bсефарозой. Фракции, элюированные с помощью 1,0 М NaCl, хранили при температуре –80 ˚C. 2.7. Лиганд-блоттинг. В экспериментах по лиганд-блоттингу фракции, полученные в ходе аффинной хроматографии, подвергали электрофорезу по методу Лэммли с последующим электропереносом на нитроцеллюлозную мембрану. Для предотвращения неспецифического связывания нитроцеллюлозные реплики инкубировали с PBS буфером, содержащим 1 % яичный альбумин и 0,3 % твин, а затем последовательно обрабатывали одним из биотинилированных белков (8 или 4 мкг/мл) и конъюгатом стрептавидина и пероксидазы («Amersham Biosciences»), взятым в разведении 1:1000. Проявление полос, обладающих способностью связывать биотинилированные токсины, осуществляли с помощью ECL-Western blotting analysis system («Amersham Biosciences). 2.8. Изучение связывания 65 и 57 кДа белков An. stephensi с токсинами В. thuringiensis разной специфичности и продуктами ограниченного протеолиза москитоцидных белков Cry11A и Сry4B. Нитроцеллюлозные реплики обрабатывали вышеописанным методом, используя в качестве предполагаемых лигандов следующие биотинили7 рованные токсины: Cry11A (4 мкг/мл), Cry4B-tox (4 мкг/мл), CytA (8 мкг/мл), Cry1A-tox (8 мкг /мл) и Cry 3A (8 мкг/мл), а также продукты их ограниченного протеолиза: Cry11A-tr (4 мкг суммарного белка на 1 мл), Cry4B-tr (4 мкг/мл), Cry4B-Аa (4 мкг суммарного белка на 1 мл). 2.9. Эксперименты по гомологической и гетерологической конкуренции. Нитроцеллюлозные фильтры с перенесенными на них 65 и 57 кДа белками инкубировали с биотинилированным вариантом одного из изучаемых москитоцидных токсинов (Cry 11A или Cry4B-tox) (4 мкг/мл) непосредственно или в смеси с 10-кратным избытком небиотинилированного варианта того же белка (гомологическая конкуренция) или предполагаемого конкурента (соответственно, Cry4B-tox или Cry 11A) (гетерологическая конкуренция). Дальнейшую обработку фильтров проводили, как описано выше. 2.10. Изучение обратимости связывания москитоцидных белков. Нитроцеллюлозные фильтры с содержавшимися на них 65 и 57 кДа белками инкубировали с биотинилированными Cry4B-tox (4 мкг/мл), как описано ранее, отмывали пятью сменами буфера инкубации, а затем обрабатывали в течение часа 10-кратныи избытком небиотинилированного варианта того же токсина 2.11. Определение N-концевой аминокислотной последовательности. 5 мл фракции, элюированной с помощью 1 M NaCl с сорбента Cry4B-сефароза, сконцентрировали в 200 раз посредством ультрафильтрации и осаждения трихлоруксусной кислотой и подвергли электрофорезу в присутствии додецилсульфата натрия и электропереносу на мембрану Immobilon-PSQ. N-концевую аминокислотную последовательность для полос, соответствующих 65 и 57 кДа белкам, определяли с помощью автоматического газофазного секвенатора «Applied Biosystems», США, модель 470А. Поиск последовательностей, ортологичных установленным экспериментально, осуществляли с помощью программы BLAST Search for short, nearly exact matches, используя базу данных NCBI GenBank 2.12. Определение активности щелочной фосфатазы. По 2 мкл следующих препаратов: (а) экстракт белков ВВМ, полученный, как описано выше и разведённый в 100 раз 0,05 М натрий-карбонатным буфером, рН 9,5; (б) фракция, элюированная 1 M NaCl с сорбента Cry4B-сефароза, сконцентрированная в 10 раз с помощью ультрафильтрации; (в) 0,02 %-ный БСА, были нанесены в виде дотов на нитроцеллюлозный фильтр. Фильтр тщательно отмыли вышеупомянутым буфером и инкубировали с субстратами фосфатазной реакции (NBT/BCIP, «Promega», США). При такой постановке эксперимента о наличии в образце активности щелочной фосфатазы должно свидетельствовать появление сиреневой окраски в соответствующем доте. 8 Глава 3. Влияние энтомоцидных кристаллов B. thuringiensis ssp. israelensis, а также индивидуальных эндотоксинов Cry11A и Cry4B на кишечный эпителий личинок комаров Aedes aegypti Наиболее ранние изменения кишечного эпителия при воздействии кристаллов B.t. ssp. israelensis происходят в апикальной части клеток. Если в контроле (рис. 1, 2) поверхность клеток покрыта микроворсинками, внутри которых обнаруживаются тонкие продольно ориентированные филаменты, а с наружным слоем клеточной мембраны связан гликокаликс, то уже через 20 мин инкубации микроворсинки утолщаются и укорачиваются, а целостность эпителиального слоя нарушается. При последующей инкубации эти процессы усугубляются: во многих местах можно наблюдать разрывы между соседними клетками (рис. 3), а также деградацию микроворсинок и утрату ими гликокаликса (рис. 3, 4). Похожие изменения происходят при воздействии отдельных токсинов. Уже через 15 минут инкубации с Cry11A в концентрации 100 нг/мл, микроворсинки укорачиваются и утолщаются, их мембрана лишается гликокаликса (рис. 5). При действии эндотоксина Cry4B микроворсинки также укорачиваются, и их размещение становится беспорядочным, а через 3 часа большая их часть достаточно сильно редуцирована (рис. 6, 7). В то же время, в отличие от действия кристаллов не наблюдается полной потери микроворсинок, а также разрывов между клетками. В норме у личинок комаров вблизи от апикальной поверхности эпителиальных клеток расположена перитрофическая оболочка. Как видно на рисунке 8, она состоит из нескольких слоёв, различающихся электронной плотностью. При воздействии отдельных токсинов расстояние между перитрофической оболочкой и эпителием увеличивается, но её внутренняя структура практически остаётся без изменений (рис. 5, 6). Однако при воздействии кристаллов электронная плотность перитрофической оболочки уменьшается, и её структура разрушается (рис. 9). Нормальный вид цитоплазмы эпителиальных клеток и их органелл представлен на рисунках 10 и 11. При обработке кристаллами в цитоплазме клеток средней кишки наблюдаются следующие изменения: цитоплазма клеток достаточно быстро подвергается значительной дезинтеграции. В митохондриях происходит расширение крист, образуются пустоты (рис. 12). Меняется структура эндоплазматического ретикулума и лизосом (рис. 13). Сходные изменения происходят после инкубации личинок с отдельными белками. Среди митохондрий много вздутых, с разной степенью редукции крист: от незначительной до почти полной (рис. 14-16). 9 Рис. 1-25. Ультраструктурные изменения, происходящие в кишечном эпителии личинок комара Ae. aegypti под действием энтомоцидных кристаллов B. thuringiensis ssp. israelensis и индивидуальных токсинов Cry4В и Cry11A. В подписи к каждому рисунку указаны действующий препарат, концентрация белка и время инкубации с ним. Рис. 1–7. Апикальный отдел столбчатой клетки эпителия. 1, 2 – норма; 3 – кристаллы, 1 нг/мл, 2,5 ч.; 4 – кристаллы, 0,2 нг/мл, 3 ч.; 5 – Cry11A, 100нг/мл, 15 мин.; 6 – Cry 4В, 10 нг/мл, 3ч.; 7 –Cry 4В, 10 нг/мл, 3 ч. Рис. 8, 9. Перитрофическая оболочка. 8- норма; 9- кристаллы, 3 нг/мл, 20 мин. Рис. 10-17. Цитоплазма околоядерной области клетки и клеточные органеллы. 10,11- норма; 12- кристаллы, 1 нг/мл, 2.5 ч; 13- кристаллы, 0,2 нг/мл, 3 ч.; 10 14- Cry11A, 25нг/мл, 3ч.; 15- Cry11A, 100нг/мл, 3ч.; 16- Cry 4В, 40 нг/мл, 3ч.; 17- Cry 4В, 40нг/мл, 15мин. Рис. 18- 25. Базальная область эпителия. 18,19- норма; 20- Cry11A, 100нг/мл, 3ч.; 21- Cry 4В, 40 нг/мл, 3ч. Рис. 22,23. Мышцы, окружающие среднюю кишку. 22- норма; 23- кристаллы, 0,2 нг/мл, 3 ч. Рис. 24,25. Регенерационные клетки. 24- кристаллы, 1 нг/мл, 2.5 ч.; 25- Cry 4В, 10нг/мл, 1ч. Увеличения: рис. 1, 10, 12, 14, 16 - x20 000; рис. 2- x60 000; рис. 3, 5, 15, 18, 21- x10 000; рис. 4, 13- x30 000; рис. 6, 17, 24, 25x8000; рис. 7, 8- x100 000; рис. 9- x40 000; рис. 11, 19, 20, 23- x15 000; рис. 22- x25 000. Обозначения: МВ – микроворсинки, ПО – перитрофическая оболочка, М – митохондрия, Л – лизосома, В – вакуоль, Я – ядро, БЛ – базальный лабиринт, МЦ – мышцы, Р – регенерационная клетка. 11 В околоядерной зоне обнаруживаются удлиненные крупные вакуоли (рис. 14). Образование достаточно крупных вакуолей можно наблюдать в клетках эпителия уже через 15 минут (рис. 17). В цитоплазме встречаются большие тела, похожие на сильно деградировавшие лизосомы. Для базальной части эпителиальных клеток личинок комаров характерно наличие базального лабиринта, в цитоплазматических тяжах которого содержатся митохондрии (рис. 18, 19). При воздействии как кристаллов B.t. ssp. israelensis, так и индивидуальных токсинов, в этом районе клетки также можно видеть сильную вакуолизацию цитоплазмы и деградацию митохондрий, хотя базальный лабиринт сохраняет свое ячеистое строение (рис. 20, 21). При воздействии кристаллов мышцы, окружающие среднюю кишку (в норме показаны на рис. 22), теряют свою правильную структуру, в мышечных тканях появляются разрывы (рис. 23). Регенерационные клетки, расположенные в основании эпителиального пласта средней кишки, после обработки кристаллами отслаиваются от соседних клеток и сжимаются (рис. 24). После инкубации с отдельными белками, регенерационные клетки сохраняют нормальный вид и строение (рис. 25). Подводя итог, можно сказать, что действие индивидуальных токсинов сходно с действием кристаллов по своим проявлениям, а также тем, что они оказывают значительный эффект уже в первые минуты экспозиции. Но при длительной экспозиции, в отличие от кристаллов, отдельные токсины не вызывают таких глубоких патологических изменений, какие наблюдаются при действии кристаллов за сходный период времени. Возможно, это связано как с синергическим эффектом действия токсинов, так и с тем, что в составе кристаллов присутствует ещё и белок Cyt1A, в данном исследовании не изучавшийся. Следует заметить, что, поскольку используемые концентрации сравниваемых препаратов близки по уровню своей биологической активности, уровень патологических изменений, вызываемых отдельными токсинами, достаточен для гибели насекомых. Глава 4. Гистохимическое изучение связывания эндотоксина Cry11A и активированного токсина Cry4B с эпителиальными клетками средней кишки личинок комара Aedes aegypti Как было показано выше, одной из основных мишеней москитоцидных белков Cry4B и Cry11A являются микроворсинки столбчатого эпителия средней кишки личинок комаров. Мы попытались доказать, что эти токсины связываются с апикальной мембраной кишечного эпителия насекомого. Одним из способов выявления структур пищеварительного тракта насекомого, обладающих аффинностью по отношению к токсинам, является 12 инкубация гистологических срезов кишечника с этими белками и визуализация связавшегося токсина с помощью гистохимических и иммуногистохимических реакций. При этом эндотоксин Сry4B (130 кДа), являющийся протоксином, предварительно подвергали протеолизу с образованием активированного токсина (Cry4B-tox) (65 кДа). В экспериментах, описанных в предыдущей главе, этого делать не требовалось, поскольку аналогичная активация происходит в кишечнике личинки. Эндотоксин Cry11A (70 кДа) в активации не нуждается. В результате проведенных экспериментов мы показали, что эндотоксин Cry11A и активированный токсин Cry4B (Cry4B-tox) связываются с апикальной мембраной столбчатых клеток кишечного эпителия (рис. 26, 28, 29, 30). Причём это связывание визуализировалось в ходе как гистохимической (рис. 26), так и иммуногистохимической (рис. 28, 29, 30) реакций. Под большим увеличением хорошо видно (рис. 29), что токсины откладываются по всей длине микроворсинок. Окраска щеточной каймы клеток при изучении обоих москитоцидных белков была очень интенсивной. Для доказательства специфичности связывания, мы проинкубировали срезы с активированным токсином Cry1Ab, не эффективным против личинок Ae. aegypti. При обоих методах постановки гистохимической реакции окрашивания щёточной каёмки не наблюдалось (рис. 27, 31). Однако при аналогичной постановке опыта происходит связывание активированного токсина Cry1Ab со срезами кишечника Lymantria dispar (Lepidoptera), насекомого, чувствительного к этому белку. Полученные результаты позволяют предположить, что рецепторы москитоцидных белков экспонированы в апикальной мембране столбчатых клеток эпителия, и их расположение по всей прослеженной длине средней кишки довольно равномерное. Второй структурой, хорошо прокрашиваемой в наших экспериментах (при инкубации как с CryllA, так и с Сгу4В-tox), является перитрофическая оболочка(рис. 26, 28). Интенсивность окраски перитрофической оболочки не зависела от того, на каком расстоянии от эпителия она располагалась – тесно примыкала или находилась на некотором от него удалении (рис. 28). Связывание перитрофической оболочки с токсинами CryllA и Cry4B-tox тоже специфическое. Оно отсутствует у токсина CrylAb. Наши данные свидетельствуют о том, что ни внутриклеточные структуры, ни базальные и латеральные мембраны эпителиальных клеток, ни мышечные клетки не связывают токсинов, и, по-видимому, лишены рецепторов связывания. 13 Рис. 26–31. Визуализация места связывания CryllA и Сгу4В токсинов с эпителием средней кишки личинок комара Ae. aegypti гистохимическими и иммуногистохимическими методами. Стрелки указывают место связывания токсина. Увеличение Х400. Рис. 26, 27. Гистохимический метод. Срезы последовательно обработаны биотинилированными токсинами, конъюгатом стрептавидина с пероксидазой или щелочной фосфатазой и хромогенными субстратами соответствующей энзиматической реакции. В подписи к каждому рисунку указаны токсин, с которым инкубировали срез и конъюгат, используемый для визуализации связавшегося токсина. 26 – биотинилированный CryllA, фосфатазный конъюгат. 27 – биотинилированный CrylAb, пероксидазный конъюгат (контроль). Рис. 28-31. Иммуногистохимический метод. Срезы последовательно обработаны токсинами, специфическими антителами к токсинам, конъюгатом вторичных антител с пероксидазой или щелочной фосфатазой и хромогенными субстратами соответствующей энзиматической реакции. 28, 29 – CryllA , фосфатазный конъюгат. 30 – Сгу4В, фосфатазный конъюгат. 31 – Cry 1Аb, фосфатазный конъюгат (контроль). 14 Глава 5. Выделение токсинсвязывающих белков (рецепторов) из мембран кишечного эпителия личинок Anopheles stephensi В настоящее время достаточно хорошо описаны рецепторы эндотоксинов класса Cry1 из кишечного эпителия гусениц. К ним относятся аминопептидазы N и кадгеринподобные белки. Однако очень мало известно о рецепторах москитоцидных белков в мембранах кишечного эпителия двукрылых (Diptera). Недавно в нашей лаборатории были выделены токсинсвязывающие белки из апикальных мембран кишечного эпителия личинок комара Ae. aegypti. Нашей задачей было выделение белков, ответственных за связывание токсинов Cry11A и Cry4B с мембранами кишечного эпителия личинок комаров An. stephensi. Нами был получен препарат апикальных мембран кишечного эпителия (BBM) личинок An. stephensi. Экстракт, полученный при обработке этих мембран детергентом NONIDET Р40, судя по данным электрофореза, содержал более сорока белков с молекулярной массой от 27 до 100 кДа (рис. 32). В то же время, если перенести эти полосы на нитроцеллюлозную плёнку и проинкубировать с биотинилированными токсинами Cry11A и Cry4B-tox (лиганд-блоттинг), то с помощью биотин-стрептавидиновой системы проявляются главным образом полоса с молекулярной массой около 65 кДа и менее выраженная полоса с массой 57 кДа. На треках можно также видеть минорные компоненты с меньшей молекулярной массой (рис. 33). Указанные полосы отсутствуют в контроле, в котором реплики обрабатывали биотинилированным бычьим сывороточным альбумином. Полученные данные позволяют предположить, что полосы 65 кДа и, возможно, 57 кДа соответствуют токсинсвязывающим белкам из апикальных мембран кишечного эпителия личинок комара An. stephensi. Для выделения токсинсвязывающих белков мы синтезировали сорбенты Cry4B- и Cry11А-сефароза. При их использовании для хроматографии белков BBM An. stephensi большая часть последних не связывалась с сорбентами и выходила в проскоке (рис. 34, а). В то же время 1 М NaCl в обоих случаях элюировал два белка с молекулярной массой 65 и 57 кДа, реагирующих с биотинилированным токсином Cry11А в условиях лигандблоттинга (рис. 34, б). Способность связываться с токсинами, «пришитыми» к аффинным сорбентам, подтверждает наше предположение о том, что 65 и 57 кДа белки могут служить рецепторами москитоцидных токсинов у личинок An. stephensi. 15 Рис. 32. Белковый состав экстракта, полученного при обработке BBM An. stephensi додецилсульфатом натрия. На 10% полиакриламидный гель нанесен экстракт (1), в лунку (2) помещены стандарты молекулярной массы. Рис. 33. Идентификация токсинсвязывающего белка из BBM An. stephensi с помощью лиганд-блоттинга. Белки, экстрагированные из BBM An. stephensi, были подвергнуты электрофорезу в денатурирующих условиях и электропереносу. Полученные нитроцеллюлозные реплики инкубировали с биотинилированными белками: (а) Cry4B-tox; (б) Cry11A; (в) бычий сывороточный альбумин. Рецепторы токсинов, выделенные из различных видов насекомых, как правило, не связываются с Cry-белками, к которым данное насекомое устойчиво. Поэтому изучение специфичности связывания является важным этапом в доказательстве участия данного токсинсвязывающего белка в выполнении рецепторной функции in vivo. Рис. 34. Электрофоретический анализ фракций, полученных в ходе аффинной хроматографии белков BBM An. stephensi. Электрофорезу подвергли образцы: экстракт следующие мембранных белков (дорожка 2); белки, не связавшиеся с Cry4B-сефарозой (дорожка 3); фракции, элюированные 1 М NaCl с Cry11A- сефарозы (дорожка 4) или с Cry4В- сефарозы (дорожка 5). Дорожка 1 содержит стандарты молекулярной массы. Гели проявляли с помощью Кумасси R-250 (а), или методом лиганд-блоттинга с использованием в качестве лиганда биотинилированного эндотоксина Cry11A (б). 16 В условиях лиганд-блоттинга белки, элюируемые как с Cry11А-, так и с Cry4Всефарозы, одинаково реагируют и с Cry4B-tox и с эндотоксином Cry11А (рис. 35, 36). В то же время, они практически не взаимодействуют с биотинилированными Cry1A-tox, обладающими лепидоцидной активностью, и Cry3А, действующим на личинок жуков, используемыми в два раза большей концентрации (в случае Cry3А это иллюстрируется рис. 35). Эндотоксин Cyt1A также не обладает способностью связываться с 65 и 57 кДа белками из An. stephensi. Этому токсину свойственна высокая москитоцидная активность, однако известно, что при осуществлении своего токсического эффекта он не нуждается во взаимодействии с рецептором. Все эти результаты доказывают высокую специфичность, проявляемую 65 и 57 кДа белками из An. stephensi при взаимодействии с токсинами В. thuringiensis. С помощью лиганд-блоттинга мы изучили некоторые особенности взаимодействия москитоцидных токсинов: Cry4B-tox и Cry11А с выделенными мембранными белками. В частности, если нитроцеллюлозные реплики, содержащие белки, элюируемые с Cry11Аили с Cry4B-сефарозы, проинкубировать с биотинилированным Cry4B-tox, а затем с избытком небиотинилированного варианта этого же токсина, то используемая система детекции не выявляет полос, соответствующих 65 и 57 кДа белкам. Это говорит об обратимости связывания Cry4B-tox с изучаемыми мембранными белками. Рис. 35. Связывание 65 и 57 кДа белков из BBM An. stephensi с различными эндотоксинами B. thuringiensis и продуктами их ограниченного протеолиза. Нитроцеллюлозные реплики, содержавшие 65 и 57 кДа белки, элюированные с Cry4B-сефарозы, инкубировали со следующими биотинилированными белками: Cry4B-tox (а); Cry3A (б); Cry4B-tr (в); Cry4B-Аa (г); Cry11A (д); Cry11A-tr (е). 17 Рис. 36 - Гомологическая и гетерологическая конкуренция и обратимость, выявляемые при изучении связывания Cry4B-tox с 65 и 57 кДа белками из BBM An. stephensi. Нитроцеллюлозные реплики, содержавшие 65 и 57 кДа белки, элюированные с Cry4B- сефарозы (1) и с Cry11А- сефарозы (2), инкубировали со следующими эндотоксинами или их смесями: (а) биотинилированным Cry4B-tox (4 мкг/мл); (б) смесью биотинилированного Cry4B-tox (4 мкг/мл) и небиотинилированного Cry4B-tox (40 мкг/мл); (в) смесью биотинилированного Cry4B-tox (4 мкг/мл) и небиотинилированного Cry11А (40 мкг/мл). В случае (г) после обработки нитроцеллюлозного фильтра биотинилированным Cry4B-tox (4 мкг/мл) следовала его инкубация с десятикратным избытком небиотинилированного варианта этого же токсина. Полосы 65 и 57 кДа не проявляются в условиях гомологической конкуренции, когда нитроцеллюлозные реплики инкубировали со смесью биотинилированного Cry11A или Cry4B-tox и 10-кратного избытка небиотинилированного варианта соответствующего токсина (для Cry4B-tox это иллюстрируется на рис. 36). Полученные результаты говорят о том, что способность к связыванию с 65 и 57 кДа-белками не является следствием биотинилирования москитоцидных токсинов. В условиях гетерологической конкуренции, когда реплики обрабатывают смесью биотинилированного Cry4B-tox или Cry11A и 10-кратного избытка небиотинилированного гетерологического белка (Cry 11A или Cry4B-tox, соответственно) проявления полос также не наблюдается (для первого варианта показано на рис. 36). Это со всей очевидностью показывает, что Cry11А и Cry4B-tox взаимодействуют с одними и теми же белками в мембранах этого насекомого. Более того, они либо связываются с одними и теми же сайтами на поверхности этих белков, либо сайты связывания расположены близко друг к другу. Ранее было показано, что ход ограниченного протеолиза эндотоксина Cry4B зависит от специфичности используемого протеолитического фермента. Под действием хи18 мотрипсина образуется активированный токсин с молекулярной массой 64 кДа (Cry4Btox), с которым проводились вышеописанные эксперименты по связыванию. Однако при обработке рядом других протеолитических ферментов активированный токсин гидролизуется до фрагмента с молекулярной массой 50 кДа (обработка трипсином) (Cry4B-tr), или до смеси 48 и 49 кДа-фрагментов (обработка кишечным соком Ae. aegypti) (Cry4B-Aa). В первом случае от него отщепляются пять α-спиралей N-концевого домена, тогда как во втором случае дополнительно к этому небольшую деградацию претерпевает С-конец третьего домена. По данным лиганд-блоттинга Cry4B-tr взаимодействует с 65 и 57 кДа белками столь же хорошо, как и Cry4B-tox (рис. 35). В то же время Cry4B-Аa не обладает способностью связываться с 65 и 57 кДа белками (рис. 35). Это коррелирует с литературными данными по биологической активности, согласно которым Cry4B-tr обладает такой же токсичностью для личинок комаров, как и Cry4B-tox, но Cry4B-Aa практически не токсичен. Можно предположить, что резкое уменьшение токсичности в последнем случае связано с потерей способности соответствующих фрагментов связываться с рецепторами. В свою очередь, ограниченный протеолиз эндотоксина Cry11А до двух фрагментов с молекулярной массой 33 и 36 кДа не уменьшает его токсичность по отношению к личинкам Ae. aegypti, An. stephensi и Culex pipiens (литературные данные) и не отражается на способности к связыванию с мембранными белками An. stephensi (рис. 35). Фракция, элюированная с колонки Cry4В-сефароза 1 M NaCl, была сконцентрирована в 200 раз и нанесена на 10%-ный ПААГ. Из нитроцеллюлозной реплики, полученной в ходе последующего электрофореза и электропереноса, были вырезаны полосы, соответствующие белкам с молекулярной массой 65 и 57 кДа и белковый материал, содержащийся в этих полосах, проанализирован автоматическим методом Эдмана. Для компонента с молекулярной массой 65 кДа прочитать N-концевую последовательность не удалось. По всей видимости, концевая аминогруппа этого белка была модифицирована. Но для компонента с молекулярной массой 57 кДа была получена следующая последовательность : Ser-Leu-His-Gln-His-Ile-Phe-Ser-Asp-Leu. Эта последовательность уникальна. Поиск её среди белковых последовательностей, содержащихся в NCBI GenBank, дал отрицательные результаты. В настоящее время установлен и опубликован полный геном Anopheles gambiae – вида, родственного An. stephensi. В составе соответствующего протеома мы также не нашли белковой последовательности, полностью совпадающей с последовательностью, установленной нами, однако там имеется рамка считывания, кодирующая первые шесть остатков прочитанного декапептида (Ser-Leu-His-Gln-His-Ile), но функции этого белка неизвестны. 19 Ранее в литературе было высказано предположение о возможной роли щелочной фосфатазы в связывании токсина Cry1Ac с кишечником гусеницы Heliothis virescens. Мы исследовали возможность наличия фосфатазной активности у выделенных нами 65 и 57 кДа белков. В условиях дот-анализа в экстракте мембранных белков из кишечника личинок An. stephensi выявляется высокая активность щелочной фосфатазы. Концентрат фракции, элюированной 1 M NaCl с колонки содержащей Cry11А-сефарозу, также демонстрирует активность щелочной фосфатазы. Интенсивность выявляемого сигнала не высока, но достоверна. Использованный в качестве отрицательного контроля бычий сывороточный альбумин в концентрации 0,2 мг/мл в условиях дот-анализа никакого образования окраски не демонстрирует. В геноме An. gambiae имеются гены нескольких белков, предположительно обладающих активностью щелочной фосфатазы. Нам не удалось обнаружить какого-либо сходства между N-концевым фрагментом 57 кДа-белка и этими последовательностям. Однако активность щелочной фосфатазы может быть связана с 65 кДа-белком, Nконцевую последовательность которого установить не удалось. Сравнение полученных нами данных о токсинсвязывающих белках An. stephensi со свойствами ранее выделенных в нашей лаборатории токсинсвязывающих белков Ae. aegypti показывает их близость по большинству параметров. Это позволяет предположить, что выявленные нами токсинсвязывающие белки из двух видов комаров, An. stephensi и Ae. aegypti, родственны, хотя, возможно, и не идентичны и представляют собой новый класс (классы) рецепторов энтомоцидных белков. Заключение В данной работе мы провели комплексное изучение воздействия москитоцидных токсинов Cry4B и Cry11A, продуцируемых B. thuringiensis ssp. israelensis, на кишечный эпителий личинок комаров. Гистологические исследования продемонстрировали серьёзные изменения, происходящие под действием москитоцидных белков в эпителиальных клетках и перитрофической оболочке личинок комаров в средней кишке. Эти изменения включают деградацию микроворсинок, вакуолизацию цитоплазмы и разрушение клеточных органелл, и, в общем, близки тем, что показаны для гусениц, обработанных лепидоцидными токсинами В. thuringiensis. Гистохимические эксперименты показали, что, как и в случае лепидоцидных токсинов, эндотоксин Cry11A и Сry4B-tox связываются с микроворсинками кишечного эпителия средней кишки чувствительного насекомого. Используя метод аффинной хроматографии на синтезированных нами сорбентах Cry11A- и Сry4Bсефароза, мы выделили белки с молекулярной массой 65 и 57 кДа, способные обратимо и специфично связывать указанные токсины. По всем изученным характеристикам эти бел20 ки близки 65 и 62 кДа токсинсвязывающим белкам, выделенным ранее в нашей лаборатории из апикальных мембран кишечного эпителия личинок Ae. aegypti. В то же время, по молекулярной массе и энзиматической активности, указанные токсинсвязывающие белки существенно отличаются от белков, выполняющих аналогичную функцию у гусениц (аминопептидазы N и кадгериноподобные белки). Тот факт, что связывание москитоцидных и лепидоцидных токсинов В. thuringiensis с разными рецепторными белками приводит к однотипным гистопатологическим изменениям эпителия у личинок комаров и у гусениц чешуекрылых, обусловлено особенностями Cry-белков. Общая принципиальная схема организации вторичной и третичной структуры белков сочетается у них с существенными различиями первичной структуры в тех районах молекулы, которые ответственны за связывание с рецептором или внутримолекулярные перестройки. Именно такая стратегия позволяет токсинам В. thuringiensis приспособиться к физиологическим и биохимическим особенностям, характерным для различных видов насекомых. ВЫВОДЫ 1. С помощью электронной микроскопии показано, что под действием москитоцидных белков Bacillus thuringiensis ssp. israelensis в средней кишке личинок комара Aedes aegypti происходят ультраструктурные изменения клеток столбчатого эпителия, включающие дезинтеграцию цитоплазмы, образование удлинённых лакун, деградацию клеточных органелл и разрушение микроворсинок. Перитрофическая оболочка смещается в полость средней кишки. В ультраструктуре клеток эпителия передней и задней кишки какихлибо изменений не отмечено. 2. Сравнение влияния энтомоцидных кристаллов Bacillus thuringiensis ssp. israelensis и индивидуальных токсинов Cry4B и Cry11A показывает, что эффект всех трёх препаратов однотипен, хотя наиболее сильные разрушения происходят под действием кристаллов. 3. С помощью цитохимических методов установлено, что специфическое связывание эндотоксина Cry11A и активированного токсина Cry4B (Cry4B-tox) с тканями личинок комара Aedes aegypti происходит только в области микроворсинок эпителия средней кишки и перитрофической оболочки. 4. Из апикальных мембран кишечного эпителия личинок комара Anopheles stephensi методом аффинной хроматографии выделены белки с молекулярной массой 65 и 57 кДа, способные специфически связываться с эндотоксином Сry11A и Cry4B-tox в условиях лиганд-блоттинга, причём оба Cry-белка конкурируют друг с другом за это связывание. 21 5. Способность продуктов ограниченного протеолиза эндотоксинов Сry11A и Cry4B к связыванию с 65 и 57 кДа белками коррелирует с их активностью для личинок комаров. N-концевая аминокислотная последовательность 57 кДа белка уникальна и отсутствует в NCBI GenBank. 6. По большинству изученных свойств 65 и 57 кДа белки сходны с токсинсвязывающими белками Aedes aegypti и, возможно, образуют вместе с ними новый класс (классы) рецепторов дельта-эндотоксинов. Список публикаций по теме диссертации Дронина М.А., Чайка С.Ю., Ревина Л.П., Костина Л.И., Залунин И.А., Честухина Г.Г. Визуализация связывания эндотоксинов Cry4B и Cry11A Bacillus thuringiensis с кишечным эпителием личинок Aedes aegypti // Биотехнология. 2002. № 3. С. 8084. Залунин И.А., Чайка С.Ю., Дронина М.А., Ревина Л.П. Цитопатологическое влияние эндотоксинов Bacillus thuringiensis на кишечник личинок комаров Aedes aegypti // Паразитология. 2002. Т. 36. Вып. 5. С. 337-344. Дронина М.А., Ревина Л.П., Костина Л.И., Ганушкина Л.А., Залунин И.А., Честухина Г.Г. Токсинсвязывающие белки из мембран кишечного эпителия личинок Anopheles stephensi // Биохимия. 2006. Т. 71. Вып. 2. С. 173-181. Чайка С.Ю., Залунин И.А., Дронина М.А. Влияние кристаллов эндотоксина Bacillus thuringiensis var. israelensis на ультраструктуру кишечника личинок комаров Aedes aegypti // ХХVII Межвузовская научно-практическая конференция по проблемам биологии и медицинской паразитологии, посвященная памяти акад. Е.Н. Павловского / Материалы конференции. С.-Пб., 2000. С. 24-25. Чайка С.Ю., Залунин И.А., Дронина М.А. Цитопатологическое влияние кристаллов эндотоксина Bacillus thuringiensis ssp. israelensis на кишечник личинок комаров Aedes aegypti // Роль кровососущих насекомых и клещей в лесных экосистемах России. Великий Новгород, 2000. С. 29-33. Чайка С.Ю., Дронина М.А., Залунин И.А., Ревина Л.П., Костина Л.И. Использование гистохимических методов для визуализации места связывания эндотоксинов Cry4B и Cry11A Bacillus thuringiensis с кишечным эпителием личинок Aedes aegypti // Экология, биоразнообразие и значение кровососущих насекомых и клещей экосистем России: Сборник научных работ по материалам II Республиканской научной конференции 27-29 мая 2002 г. Великий Новгород: НовГУ, 2002. С. 5861. 22
