На правах рукописи Полянский Антон Александрович
advertisement
На правах рукописи Полянский Антон Александрович МОЛЕКУЛЯРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ПЕПТИДОВ В МЕМБРАНАХ: ОТ ИЗУЧЕНИЯ МЕХАНИЗМОВ СВЯЗЫВАНИЯ С БИСЛОЕМ К НАПРАВЛЕННОМУ ИЗМЕНЕНИЮ АКТИВНОСТИ Специальность 03.00.02 – Биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук МОСКВА – 2006 Работа выполнена на кафедре биоинженерии Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова и в Лаборатории структурной биологии Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Научный руководитель: Доктор физико-математических наук, доцент Р.Г. Ефремов Официальные оппоненты: Доктор физико-математических наук, профессор Г.Ю. Ризниченко Доктор химических наук, чл.-корр. РАН Ю.А. Чизмаджев Ведущая организация: Институт биологии гена РАН Защита диссертации состоится 23 ноября 2006 г. в 14:00 на заседании Диссертационного совета Д 501.001.96 Биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет, кафедра Биофизики, «Новая» аудитория С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова Автореферат разослан « » 2006 г. Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор Т.Е. Кренделева Актуальность проблемы Мембрано-активные пептиды (МАП) представляют класс соединений, выделенных из природных источников или синтезированных de novo, которые обладают широким спектром биологической активности, часто связанной с изменением физико-химических параметров клеточной мембраны. Действие таких агентов модулируется набором многих факторов (конформация пептида, мода связывания, pH, фазовое состояние и липидный состав мембраны, и др.). Понимание структурных предпосылок, определяющих различные функциональные особенности МАП – одна из важнейших фундаментальных задач в изучении белок-мембранных взаимодействий. Помимо фундаментального значения, исследования в данной области важны для оптимизации и разработки новых соединений, имеющих практическое применение в современной биотехнологии и фармацевтической промышленности (направленная доставка лекарств, генная терапия, антимикробные и противоопухолевые препараты). Наряду с экспериментальными методиками, в последние годы стало возможным исследовать поведение МАП в мембранных системах с помощью техники компьютерного моделирования. Для решения подобных задач могут эффективно применяться методы молекулярной динамики (МД) явно заданных гидратированных мембран (Forrest & Sansom, 2000), которые позволяют исследовать картину взаимодействий на атомном уровне. Тем не менее, во многих современных работах, посвященных моделированию МАП в мембранном окружении, ряд важных аспектов пептид-мембранных взаимодействий часто остается за рамками проводимых исследований. Например, роль различных а.к. остатков в дестабилизации бислоя, специфическое влияние пептидов на структурнодинамические свойства мембраны («мембранный ответ»), гетерогенность поверхностных свойств границ раздела (интерфейсов) водно-липидных систем и др. Одним из возможных объяснений этому является сложность моделируемых объектов и отсутствие общих системных подходов к проблеме белокмембранных взаимодействий. Цели настоящей работы: - Разработка новых подходов в моделировании МАП, позволяющих детально описывать картину взаимодействия пептидов с водно-липидными системами; - Применение полученных результатов в теоретическом изучении мембранного связывания ряда объектов, обладающих важной биологической активностью (фузионные, антимикробные пептиды и др.), и de novo дизайн МАП с направленно измененным функциональным действием. На защиту выносятся следующие основные положения и результаты: 1. Разработаны и оптимизированы методики исследования поведения пептидов в явно заданных модельных мембранах, основанные на расчетах МД. Реализованные новые подходы в анализе МД-данных с использованием процедур картирования различных структурно-динамических свойств поверхности мембран позволяют получать детальную картину мембранного ответа, вызванного встраиванием пептидов. 1 2. Характер связывания фузионного пептида E5, пептидного переносчика пенетратина и антимикробного пептида Ltc2a является следствием их адаптации к различному мембранному окружению. Основными факторами служат: а) конформационная подвижность пептида; б) заряд, динамическое состояние и кривизна поверхности мембраны; в) гидрофобная организация водно-липидного интерфейса. 3. Дестабилизация мембран в процессе связывания ряда биологически активных пептидов происходит в результате образования специфических контактов аминокислотных остатков с полярными головками липидных молекул. а). Взаимодействие остатков глутаминовой кислоты фузионного пептида E5 c фосфатидилхолиновыми (ФХ) группами приводит к вытеснению липидов из плоскости мембраны. б). Формирование комплексов ароматических и катионных остатков пенетратина с молекулами фосфатидилсерина (ФС) способствует возникновению «гидрофобных дефектов» на поверхности мембраны. 4. Применение разработанных методик молекулярного моделирования позволило предсказать аминокислотные замены (Ile7Gln, Phe10Lys) для антимикробного пептида Ltc2a, направленные на уменьшение его гемолитической активности. Экспериментальные данные биологического тестирования для синтезированных аналогов Ltc2a продемонстрировали высокую эффективность предложенных мутаций. Научное значение и новизна работы. Все представленные выше результаты получены впервые. Показано, что встраивание вглубь интерфейса сопровождается реорганизацией пространственной структуры пептида в соответствии с аминокислотным составом и поверхностным распределением его гидрофобных и гидрофильных свойств. Дополнительное влияние на структуру пептида оказывают невалентные взаимодействия аминокислотных остатков внутри молекулы и с мембранным окружением. Эти данные расширяют традиционные представления о процессе сворачивания полипептидной цепи на границе полярной и неполярной фаз, основанные исключительно на амфифильных свойствах последовательностей. Установлено, что мембранный ответ на действие МАП имеет локальный характер: изменение структурно-динамических параметров наблюдается только в области контакта пептида с бислоем, не влияя на интегральные характеристики мембраны. Для разных МАП действие на мембрану характеризуется наличием как общих черт (уменьшение подвижности липидов в области контактов, нарушение характера их упаковки и др.), так и особенностей, связанных с функциональной активностью пептида. При этом в дестабилизации мембраны ключевую роль часто играют специфические контакты остатков пептидов с липидными молекулами. Указанные эффекты зависят от аминокислотного состава пептидов и химического строения полярных головок липидов. Это позволяет выявлять молекулярные основы селективности МАП к различным типам клеточных мембран. В целом, широкое рассмотрение проблемы мембранного ответа на действие биологически активных пептидов и сравнительное изучение разных мембранных систем, проведенное в рамках настоящей работы, позволило сделать существенный шаг в понимании функционирования липидной составляющей 2 клеточной мембраны, а также расширить представления о механизмах белокмембранных взаимодействий. Практическое значение работы. Полученные результаты могут стать необходимой теоретической базой для направленного дизайна пептидов, обладающих разной биологической активностью (антимикробные, противораковые, переносчики и пр.), которые являются перспективными объектами для разработки новых лекарственных препаратов. В частности, на основании данных молекулярного моделирования были получены первые результаты по направленному изменению активности антимикробного пептида Ltc2a из яда паука Lachesana tarabaevi. В настоящей работе представлен и подробно описан ряд новых методик анализа данных МД, позволяющих рассматривать различные аспекты белокмембранных взаимодействий. Кроме того, на основании систематизации полученных результатов создана технология, оптимизирующая задачу моделирования периферически связывающихся МАП в явно заданных мембраноимитирующих системах. Это позволяет существенно расширить применение in silico подхода в современной биотехнологии и молекулярной медицине. Публикации и апробация. Основные результаты работы изложены в 5 статьях, опубликованных в международных научных журналах. Материалы диссертации докладывались на 4-й и 5-й международных конференциях «Биоинформатика регуляции и структуры генома» (Новосибирск, 2004, 2006), международной конференции «Взаимодействие пептид-мембрана» (Намюр, 2004), 18-м Франко-бельгийском конгрессе по фармацевтической химии (Люксембург, 2004), 5-м международном симпозиуме аспирантов, проводимом Европейской молекулярно-биологической лабораторией (Гейдельберг, 2004), Симпозиуме «Взаимодействие белков и пептидов с поверхностью мембран» в рамках 231-го конгресса Американского химического общества (Атланта, 2006). Структура и объем диссертации. Диссертационная работа имеет следующую структуру: Во Введении (Глава I) сформулированы основные цели и задачи и их взаимосвязь с общими тенденциями в изучении МАП. Глава II представляет собой обзор литературы, посвященный современным методам моделирования мембранных систем и их взаимодействий с МАП. Полученные результаты и их обсуждение приведены в Главе III, состоящей из шести разделов. В разделе III.1 описана разработка и оптимизация процедур и протоколов для расчета и анализа МД явно заданных гидратированных заряженных и нейтральных мембранных систем. В разделах III.2-III.5 приводятся примеры применения полученных наработок в исследовании поведения различных МАП в модельных мембранах. В разделе III.6. содержится краткое описание разработанной технологии моделирования МАП. Содержание Главы IV (Заключение) составляет перечень основных результатов работы, обсуждение их научно-практического значения и дальнейших перспектив исследований в данной области. Описание методов, использованных в работе, дано в 3 Главе V. Завершает диссертацию Список литературы. Диссертация изложена на _____ страницах машинописного текста, проиллюстрирована _____ рисунками и _____ таблицами. Список литературы включает _____ источников. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ I. ВВЕДЕНИЕ В первой главе обосновывается необходимость применения методов молекулярного моделирования для изучения поведения МАП в мембранах, сформулированы направления и цели исследования. II. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ В данной главе описаны современные методы моделирования поведения МАП в явно заданных гидратированных мембранных системах. III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ III.1. Разработка моделей явно заданных гидратированных заряженных и нейтральных мембранных систем. В данном разделе приведено описание процедуры оптимизации методов моделирования явно заданных мембранных систем и создания базы данных (БД) липидных бислоев и мицелл разного липидного состава. Процедура отработки и тестирования методик проиллюстрирована на примере сравнительного моделирования заряженного (диолеилфосфатидилсерин – ДОФС) и цвиттерионного (диолеилфосфатидилхолин – ДОФХ) ненасыщенных бислоев (раздел III.1.1). III.1.1 Роль заряда полярной головки в структурной организации модельной мембраны. Сравнительное моделирование заряженного и цвиттерионного бислоев. В результате проведенных расчетов МД получена модель заряженной мембраны ДОФС, для которой показано хорошее согласие с имеющимися экспериментальными данными (табл.1). При этом установлено, что поведение системы существенно зависит от используемого алгоритма учета электростатических взаимодействий. Применение функций сферических отсечек приводит к ряду артефактов – моделируемый бислой оказывается менее упорядоченным по сравнению с экспериментальными данными, имеет «размытый» водно-липидный интерфейс, наблюдаются серьезные флуктуации толщины бислоя. При использовании модифицированных алгоритмов суммирования по Эвальду (PME1) структурные характеристики полученного бислоя хорошо согласуются с соответствующими экспериментальными значениями. Для бислоя ДОФХ показано отсутствие каких-либо расчетных артефактов при использовании функций отсечек, что позволяет применять данную схему учета электростатических взаимодействий в МД-расчетах цвиттерионных липидных систем. Сравнение результатов МД для модельных бислоев ДОФХ и ДОФС позволяет сделать вывод о том, что, в отличие от заряженной мембраны, цвиттерионная мембрана ДОФХ обладает 1 PME – Particle-Mesh Ewald (англ.) 4 менее структурированным интерфейсом. Это влияет на ряд ее интегральных характеристик (характер упаковки липидов (AL, Dp-p, Scd), глубина проникновения воды и пр.). Таблица 1. Равновесные макроскопические средние для бислоев ДОФС и ДОФХ: расчеты МД и экспериментальные данные. ДОФС ДОФХ Параметр* Отсечки PME Эксперимент** Отсечки PME Эксперимент 63.33±0.07 63.31±0.08 64 70.23±0.18 70.55±0.12 72.5 AL, Å2 37.7±0.6 39.0±0.2 39 36.2±0.2 35.8±0.2 36.9 <Dp-p>, Å 44 39 39 36.8 35.9 36.9 DHH., Å 0.11±0.04 0.10±0.04 0.14в 0.10±0.03 0.14±0.05 0.15# <Scd> * Описание параметров: AL – средняя площадь на липидную молекулу; <Dp-p> – средняя толщина бислоя (расстояние между плоскостями атомов фосфора в разных монослоях); DHH – расстояние между пиками электронной плотности для атомов фосфора; <Scd> – средний параметр порядка ацильных цепей липидов; ** Petrache et al., 2004. # Данные взяты для степени гидратации – 40 молекул воды на молекулу липида. III.1.2. Создание БД модельных водно-липидных систем и изучение их структурно-динамических свойств. В данном разделе описано создание БД равновесных моделей гидратированных бислоев и мицелл различного состава. При этом: 1) разработаны заново и/или оптимизированы топологические справочники для молекул липидов и детергентов в силовых полях Gromos87/96; 2) оптимизированы вычислительные протоколы для моделирования МД явно заданных липидных бислоев на высокопроизводительных платформах с параллельной архитектурой – с использованием программного пакета GROMACS (Lindahl et al., 2001). Характерный размер систем: ~100-200 молекул липидов / ~5-7 х 103 молекул воды / ~100-200 ионов Na+ (в случае анионных липидов). Температуру в ячейке при расчете бислойных систем задавали с учетом данных о температуре фазового перехода гель-жидкий кристалл для моделируемого липида, чтобы мембрана находилась в жидкокристаллическом состоянии. Число молекул детергента в ячейке (для мицелл) задавали, исходя из экспериментальных данных о критической концентрации мицеллообразования. Таблица 2. Структурные параметры бислоев и мицелл. T,°C* AL, (Å2)** Бислой 42 (36) 47.1 Димиристоилфосфатидилсерин (ДМФС)128 52 (24) 59.7 Димиристоилфосфатидилхолин (ДМФХ)128 52 (41.5) 59.0 Дипальмитоилфосфатидилхолин (ДПФХ)128 Пальмитоилолеилфосфатидилглицерол (ПОФГ)288 42 (-4) 56.5 Пальмитоилолеилфосфатидилэтаноламин (ПОФЭ)128 42 (26) 57.0 Пальмитоилолеилфосфатидилхолин (ПОФХ)128 27 (-3) 63.7 27 (14) 57.2 Пальмитоилолеилфосфатидилсерин (ПОФС)128 27 (-22) 70.5 Диолеилфосфатидилхолин (ДОФХ)128 27 (-11) 63.3 Диолеилфосфатидилсерин (ДОФС)128 5 Scd Dp-p, (Å) 41.23 0.326 35.24 0.184 39.01 0.187 39.43 0.185 / 0.176# 39.97 0.197 / 0.185 37.35 0.183 / 0.149 41.07 0.185 / 0.178 35.80 0.104 39.03 0.138 DI, (Å) 12.80 12.45 12.77 13.10 10.93 13.25 11.42 12.00 11.16 α Scd DI, (Å) T,°C AL, (Å2) Rs, (Å) Мицелла 27 91.5 20.90 0.106 0.064 5.30 Додецилфосфохолин (ДФХ)60 50 77.2 19.20 0.146 0.091 5.56 Додецилсульфат натрия (ДСН)60 42 100.6 24.01 0.060 0.101 5.19 Лизомиристоилфосфатидилглицерол (ЛМФГ)72 42 105.3 24.56 0.070 0.070 4.76 Лизопальмитоилфосфатидилглицерол (ЛПФГ)72 86.7 29.37 0.072 0.086 6.21 Лизопальмитоилфосфатидилглицерол (ЛПФГ)125 42 * Температура моделирования, в скобках дана температура фазового перехода гель-жидкий кристалл ** Описание параметров: AL – площадь, приходящаяся на липидную молекулу; Dp-p – толщина бислоя (расстояние между пиками электронной плотности по фосфору); Scd – параметр порядка ацильных цепей липидов; DI – ширина интерфейса; Rs – радиус мицеллы; α – анизотропия мицеллы # Значения Scd даны для насыщенной и ненасыщенной ацильных цепей В результате серии расчетов МД длительностью ~20 нс был получен набор траекторий для бислоев, состоящих из основных природных липидов, и мицелл, наиболее широко используемых в экспериментальных исследованиях белокмембранных взаимодействий (табл. 2). На протяжении МД все исследуемые системы сохраняют бислойную (или мицеллярную) структуру, а полученные на равновесных участках траекторий МД (обычно последние 5 нс) макроскопические средние значения (табл. 2) хорошо согласуются с имеющимися экспериментальными данными. Картирование поверхностных свойств модельных мембран позволяет детально описывать мембранный ответ, вызванный встраиванием пептида, и исследовать механизмы дестабилизации мембран. В основе подхода лежит расчет различных усредненных параметров на равновесных участках МД траекторий для каждой липидной молекулы и картирование полученных значений в плоскости мембраны или на ее поверхности, доступной растворителю (ПДР). Для анализа локального изменения толщины мембраны (отклонения от среднего значения Dp-p) использовали процедуру получения разностных двумерных карт рельефа поверхности. На первом этапе рассчитывали ПДР для обоих монослоев мембраны, далее производили интерполяцию и сглаживание рельефов, а также их последующее вычитание. «Разностную» поверхность затем представляли в виде двумерной (2D) карты (рис. 1А). Оценку динамической структуры интерфейса модельных мембран, а также влияние МАП на подвижность липидных молекул осуществляли с помощью расчета эффективных значений флуктуаций полярных головок относительно их равновесных положений (RMSFmol). Для сравнительного анализа распределения динамических фракций липидов в бислоях разного состава использовали относительную величину ΔRMSFmol, определяемую по формуле: mol mol mol mol ΔRMSF = RMSF − max( RMSFpure ) , где max( RMSFpure ) – максимум распределения значений RMSFmol липидов в модельном бислое (в случае моделирования МАП – в «чистом», то есть без пептида). Для построения 2D-карт использовали координаты атомов фосфора полярных головок. Процедуру проводили независимо для обоих монослоев (рис. 1Б). 6 Рис.1. Структурно-динамические свойства поверхности модельных мембран. А. Схема построения разностных карт рельефа поверхности модельных мембран на примере бислоя ДМФХ. Б. Ориентация полярных головок в бислое ДОФС (двумерная карта угла θ для монослоя). В. Поверхностное распределение динамических фракций липидов в бислое ДОФХ. Распределение эффективных значений флуктуаций полярных головок – данные для бислоя (слева). Двумерная карта относительных подвижностей для монослоя (справа). Г. Гидрофобные и гидрофильные участки на поверхности бислоя ПОФГ. Поверхность раскрашена в соответствии со значениями МГП, рассчитанными в каждой ее точке. Светлым показаны гидрофильные области, темным – гидрофобные. Ориентацию липидных головок оценивали по углу θ между нормалью к плоскости бислоя и вектором, образованным центральным атомом глицерола и Сα атомом в серине (для ФС) или аналогичными атомами в ФЭ, ФХ, ФГ (рис. 1В). При этом для каждой молекулы липида на равновесном участке МД определяли среднее значение угла θ. Для построения 2D-карт использовали координаты атомов фосфора полярных головок. Процедуру проводили независимо для обоих монослоев. 2D-карты для углов θ позволяют выявить локализацию дефектов в упаковке липидных головок, вызванную, в частности, взаимодействиями с МАП. Структура водно-липидного интерфейса в различных мембранных системах характеризуется гетерогенной организацией. В частности, нами было показано, что поверхность бислоев и мицелл не является полностью гидрофильной, а содержит гидрофобные участки (рис. 1Г). Одной из причин этого является достаточно «рыхлая» структура мембранных интерфейсов. Для картирования гидрофобных и гидрофильных свойств ПДР в модельных бислоях и мицеллах использовали метод молекулярного гидрофобного потенциала (МГП). Ранее этот метод успешно применялся для анализа свойств белков и ряда МАП (Efremov & Vergoten, 1995). Картирование осуществляется на основании расчета МГП в каждой точке ПДР. Под «нейтральными» понимаются значения МГП 0.00±0.02, 7 бóльшие и мéньшие значения рассматриваются как «гидрофобные» и «гидрофильные», соответственно. Анализ гидрофобных свойств на равновесных участках МД для модельных бислоев и мицелл показал, что соотношения доли гидрофобной / нейтральной / гидрофильной поверхностей являются характеристическими параметрами модельных мембранных систем. III.1.3. Создание смешанных бислоев, имитирующих клеточные мембраны. Создание смешанных липидных бислоев, имитирующих по составу различные клеточные мембраны, является следующим шагом в повышении реалистичности моделирования МАП. В соответствии с данными о липидном составе и физико-химических свойствах мембран грам отрицательных (Грам-) бактерий и клеток млекопитающих (эритроциты) были созданы следующие бислойные липидные системы: «Эритроциты» – ПОФХ114: ПОФЭ114:ХОЛ260 (80% ПОФХ+ПОФЭ, 20% ХОЛ в соответствии с липидным составом мембран эритроцитов); «Грам-» – ПОФЭ200:ПОФГ88 (70% ПОФЭ, 30% ПОФГ – в соответствии с липидным составом мембраны E. coli); Для получения равновесных структур разработанных модельных систем проведены расчеты МД с длиной траектории ~15 нс. Уточнение параметров смешанных модельных мембран было проведено на основании сравнения характера упаковки липидов в смеси и в однокомпонентных бислоях. III.2. Определение структуры МАП в модельных мицеллах, сравнение с экспериментом. Влияние гидрофобной организации водно-липидного интерфейса на конформацию пептида в связанном состоянии. Сопоставление результатов моделирования и эксперимента необходимо для оценки корректности вычислительного подхода, который в дальнейшем был использован для изучения поведения ряда МАП в сложных модельных мембранных системах. Определение структуры антимикробного пептида (АМП) Ltc2a3 (см. также раздел III.5) в мицелле ДСН было проведено методом H1-ЯМР спектроскопии в Лаборатории структурной биологии ИБХ РАН (Dubovskii et al, 2006). Параллельно были выполнены расчеты МД пептида в мицелле ДСН60 (20 нс), которые позволяют получить дополнительную информацию о структурной организации пептида и характере его взаимодействий с мицеллой. Для сравнительного анализа были использованы траектория МД (равновесный участок) и 20 ЯМР-конформаций пептида (PDB код 2G9P). 2 3 ХОЛ – холестерол Ltc2a: GLFGKLIKKFGRKAISYAVKKARGKH 8 Рис.2. А. Структура пептида Ltc2a в мицелле ДСН – данные МД (вверху) и ЯМР. Спиральные участки представлены цилиндрами. Пептид: белый цвет – гидрофобные остатки, серый– полярные, черный – остатки Arg и Lys. Б. Положение пептида на поверхности модельной мицеллы: темные области – полярные головки детергента, светлые – ацильные цепи. В. Энергии ван-дер-ваальсовых (вверху) и электростатических взаимодействий остатков пептида с молекулами ДСН. На рис. 2А показан общий вид пространственной структуры пептида, полученной по результатам 1Н-ЯМР и МД. В обоих случаях сохраняется характерный тип укладки – два спиральных участка, расположенных под углом друг к другу. При этом в каждом случае гидрофобные остатки спиралей ориентированы навстречу друг другу. Отметим, что метод 1Н-ЯМР спектроскопии, использованный для получения структуры Ltc2a, не позволяет изучать детальную картину взаимодействии с мицеллой, в то время как данная информация может быть получена на основании анализа МД пептида. Из рис. 2Б видно, что, взаимодействуя с пептидом, мицелла сохраняет свою сферическую форму. Для мицелл ДСН характерна высокая доля гидрофобной поверхности (~60%, см. также раздел III.1.2), что определяет моду связывания Ltc2a. Пептид ориентируется таким образом, чтобы наибольшее число гидрофобных остатков находилось в выгодных контактах с гидрофобными участками поверхности мицеллы (области экспонированных ацильных хвостов), а заряженные – с полярными головками молекул детергента. Наблюдаемое взаимное соответствие пространственных распределений гидрофобных / гидофильных свойств для пептида и мицеллы приводит к существенному выигрышу в энергии ван-дер-ваальсовых и электростатических взаимодействий (рис. 2Б). Это стабилизирует данную конформацию Ltc2a на интерфейсе. Интересно, что N-концевая спираль пептида, благодаря своим выраженным амфифильным свойствам (см. раздел III.5.1), обладает более низкой энергией взаимодействия с амфипатической поверхностью мицеллы ДСН, чем остальная часть пептида. Подведем итог. Структура Ltc2a, полученная на основании расчетов МД в мицелле, хорошо согласуется с экспериментальными данными 1Н-ЯМР. Это говорит об адекватности созданных моделей и эффективности используемых вычислительных протоколов. Пептид в области интерфейса стремится принять конформацию, для которой наблюдается наилучшее взаимное соответствие собственных гидрофобных / гидофильных свойств с гидрофобной организацией поверхности мицеллы. 9 III.3. Влияние динамического состояния мембраны на характер встраивания МАП (на примере фузионного пептида E5). Оболочечные вирусы «заякориваются» на поверхности клетки с помощью консервативных фрагментов (~20 а.к.), называемых фузионными пептидами (ФП) и представляющих подсемейство МАП. ФП встраиваются в мембрану клеток хозяина, приводя к образованию контакта между липидными бислоями вируса и клетки. Изучение молекулярных механизмов слияния имеет не только фундаментальное значение, но также важно для разработки биомедицинских препаратов, направленных на предотвращение проникновения вируса в клетки. Данный раздел посвящен сравнительному моделированию пептида E5, синтетического аналога ФП из гемагглютинина вируса гриппа А, в мембранах, состоящих из ДМФХ и ДПФХ. Отличие в длине ацильных цепей (две CH2 группы) данных липидов определяет различные физико-химические параметры бислоев (толщина мембраны, коэффициенты латеральной диффузии липидов и пр.). Использование таких систем позволило оценить влияние динамического состояния мембраны («рыхлая» – ДМФХ, «плотная» – ДПФХ) на характер встраивания пептида E5. Суммарные сведения о проведенных расчетах МД даны в табл.3. Конформация пептида в связанном состоянии Анализ данных МД показывает, что присутствие водно-липидного интерфейса стабилизирует α-спиральную конформацию в N-концевой области пептида (остатки 2-10), что хорошо согласуется с данными, полученными на основании анализа набора ЯМР структур в мицеллах ДФХ (Dubovskii et al., 2000). В соответствии с данными ЯМР и МД, C-концевая область пептида обладает большей конформационной подвижностью. Конформация участка 12-20 зависит от типа мембраны – более структурированная в бислое ДМФХ (остатки 12-17 ~50% времени пребывают в α-спиральной конформации) и отсутствие какой-либо выраженной вторичной структуры в ДПФХ. Таблица. 3. Расчеты МД для E5. Система* T,°C** Размер ячейки (Å3) Время МД (нс) + E5/вода7043/Na 5 32 15 60.0×60.0×60.0 ДМФХ128/вода7219/E5/Na+5 52 (24) 30 61.8×61.8×95.0 ДПФХ128/вода5188/E5/Na+5 52 (41.5) 20 61.3×61.8×83.1 *E5 –GLFEAIAEFIEGGWEGLIEG; для расчетов были взяты равновесные структуры бислоев (см. раздел III.1.2); **Температура в МД расчетах, в скобках даны значения температуры фазового перехода гель-жидкий кристалл. Характер встраивания E5 При взаимодействии пептида с обоими бислоями наблюдается заглубление N-концевой спирали, тогда как C-концевой фрагмент остается связанным на поверхности мембраны (рис. 3А). В течение МД угол между осью N-концевой спирали и плоскостью мембраны ДМФХ изменяется от ~0° (стартовая ориентация) до ~40° (10-14 нс) и впоследствии приобретает значение ~20° (после 17 нс). Таким образом, в процессе связывания пептид «выбирает» оптимальную геометрию встраивания, которая стабилизируется на интерфейсе. В бислое ДПФХ Nконцевая спираль оказывается менее заглубленной и лежит практически парал10 лельно плоскости мембраны. При этом характер связывания определятся гидрофобной организацией пептида и поверхности мембраны в области контакта (см. также разделы III.1.2, III.2). Для расчета пространственных гидрофобных / гидрофильных свойств был использован метод МГП. Поверхность пептида была картирована в соответствии со значениями МГП, созданными атомами E5 (МГПпептид) и соседними атомами липидов (МГПбислой). Для E5 в бислое ДПФХ поверхностное распределение МГПпептид характеризуется наличием двух выраженных гидрофобных паттернов: в N-концевой спирали и на C-концевом участке. В бислое ДМФХ оба гидрофобных участка образуют на поверхности пептида непрерывный паттерн. Кроме того, в мембране ДМФХ наблюдается более высокая корреляция между пространственными распределениями гидрофобных и гидрофильных свойств для МГПпептид и МГПбислой, чем в ДПФХ (рис. 3Б). В результате пептид эффективно взаимодействует с «рыхлой» мембраной и глубоко встраивается в бислой, что приводит к вытеснению некоторых липидных молекул в водную фазу (рис. 3А). Эти липиды находятся в выгодных контактах с карбоксильными группами остатков глутаминовой кислоты 11, 15, 19, 20. В процессе встраивания пептида бислой ДПФХ сохраняет свою целостность. При этом боковые цепи остатков Glu лежат на поверхности мембраны, что делает их менее доступными для липидов. Рис.3. А. Геометрия связывания пептида E5 в бислоях ДМФХ (вверху) и ДПФХ. Пептид показан в виде ленты с выделенными остатками глутаминовой кислоты. Водно-липидный интерфейс схематически представлен плоскостью. Показаны соседние молекулы липидов, их положительно заряженные холиновые группы даны в виде связей и сфер. Б. Гидрофобная организация поверхности пептида и мембран в системах E5/ДМФХ (слева) и E5/ДПФХ. Поверхность пептида раскрашена в соответствии со значениями МГП в каждой точке, полученными либо для атомов пептида (вверху), либо для соседних липидов (внизу). Гидрофобные и гидрофильные области показаны темным и светлым цветами, соответственно. Мембранный ответ, вызванный ФП. Мембранный ответ, вызванный встраиванием E5, как и в случае ряда других МАП (см. разделы III.4, III.5), имеет локальный характер, т.е. существенных изменений интегральных параметров мембраны (AL, Dp-p и пр.) не установлено. В то же время в системе E5/ДМФХ наблюдается «размывание» профиля плотно11 сти (смещение в водную фазу) фосфорных групп липидов контактного монослоя, по сравнению с «чистой» мембраной (рис. 4А). В бислое ДПФХ наблюдается обратная тенденция – смещение профиля плотности для фосфорных групп происходит к центру бислоя, поскольку в данном случае пептид «продавливает» часть липидов внутрь мембраны. В зависимости от состава бислоя, важные отличия наблюдаются в распределении плотности воды вдоль нормали к мембране (ρw(z)). Разностная кривая Δρw(z) = ρw(z)E5/ДПФХ - ρw(z)ДПФХ (рис. 4Б) при z>0 имеет два отрицательных (z=16, 22Å) и один положительный пик (z=11Å). Проникновение координированных пептидом молекул воды в процессе его встраивания в мембраны приводит к появлению отрицательного пика при z=22Å. Пики Δρw(z) в области 11 и 16 Å связаны с заглублением полярных головок липидов вместе с молекулами воды внутрь гидрофобного ядра. Для мембраны ДМФХ функция Δρw(z) в области контактного интерфейса имеет только один отрицательный пик (z=18Å), соответствующий молекулам воды, привнесенным вместе с пептидом. При этом полярные головки липидов ДМФХ не погружаются в область ацильных цепей при встраивании E5 (рис. 4А), а, напротив, формируют «встречный поток». В результате для воды практически не наблюдается изменений характера распределения вдоль нормали к мембране, что приводит к отсутствию дополнительных пиков на графике Δρw(z). Встраивание E5 сопровождается локальным уменьшением толщины мембраны «в тени» пептида (рис. 4Б), составляющим 6 и 4 Å для бислоев ДМФХ и ДПФХ, соответственно. Сходный эффект был ранее обнаружен в МД исследовании взаимодействия ФП гемагглютинина вируса гриппа H3 с бислоем ПОФХ (Vaccaro et al., 2005). Рис.4. А-Б. Изменения организации водно-липидного интерфейса, вызванные встраиванием пептида. А. Распределения плотности фосфорных групп липидов и атомов пептида (штрих линии) вдоль нормали к контактным монослоям ДМФХ (черный), ДПФХ (серый). Пунктиром показаны данные для «чистых» бислоев; сплошной линией – в системах с пептидом. Б. Изменения в характере распределения плотности воды вдоль нормали к мембране (ρw(z)). На графике представлены разностные кривые Δρw(z) = ρw(z)E5/бислой - ρw(z)бислой для систем E5/ДМФХ (черный) и E5/ДПФХ (серый). В. Двумерные карты локальных изменений толщины мембраны ДМФХ (слева) и ДПФХ. Окраска произведена в соответствии со шкалой, приведенной на рисунке. Подробнее см. раздел III.1.2 12 Подведем итог. Результаты моделирования ФП E5 в бислоях ДМФХ и ДПФХ показывают, что в обоих случаях наблюдается ряд сходных черт в поведении пептида: стабилизация α-спиральной конформации N-концевой области пептида в мембране, локальный характер мембранного ответа. Ряд важных аспектов взаимодействия пептида с мембраной, зависит от ее состава. 1). Пептид глубже встраивается в более «рыхлый» бислой ДМФХ, чем в относительно более плотный ДПФХ. При этом мембрана ДПФХ сохраняет свою целостность, тогда как в ДМФХ некоторые липидные молекулы в области связывания пептида оказываются вытесненными из плоскости бислоя в водную фазу вследствие образования выгодных контактов с остатками глутаминовой кислоты. 3). Динамическое состояние мембраны влияет на геометрию встраивания пептида: угол наклона N-концевой α-спиралиr к плоскости бислоя ДМФХ составляет ~ 20° в отличие от параллельной ориентации в мембране ДПФХ. В первом случае результаты МД воспроизводят экспериментально установленную моду связывания ФП (Han et al., 2001), вторая мода связывания характерна для их неактивных аналогов (Vaccaro et al., 2005). III.4. Роль специфических контактов пептид-липиды в дестабилизации заряженных и нейтральных мембран. Неспецифические пептидные переносчики представляют особый класс МАП, которые способны доставлять в клетки различные ковалентно пришитые гидрофильные молекулы (ДНК, пептиды, лекарства) без нарушения целостности плазматической мембраны, что делает их перспективными объектами современной биотехнологии. Механизм интернализации таких пептидов до сих пор не установлен. Пенетратин (pAntp)4, 16-членный фрагмент гомеодоменного белка Антеннопедии из D. melanogaster является типичным представителем пептидных переносчиков. В данном разделе описаны результаты МД (длительностью ~20 нс) pAntp в заряженных и цвиттерионных мембранах (ДОФХ и ДОФС, см. раздел III.1.1), а также в водном окружении. Особое внимание уделено влиянию различных стартовых ориентаций пептида относительно мембраны на характер его встраивания. Особенности структурной организации pAntp Распределение заряженных и гидрофобных остатков в структуре pAntp не позволяет ему формировать выраженно амфифильную спираль на границе раздела гидрофобной / гидрофильной фаз и придает подвижность структуре пептида при взаимодействии с мембранами. Это определяет невысокую долю αспиральной конформации (<50%) для структуры pAntp в цвиттерионном модельном бислое, вне зависимости от стартовой ориентации. При взаимодействии с заряженным бислоем структура пептида определяется его исходной ориентацией (рис. 5А) и характеризуется либо утратой спиральной конформации и появлением элементов β-структуры – в первом случае, либо формированием нестабильной спирали – во втором. Такая конформационная динамика pAntp в заря4 pAntp: RQIKIWFQNRRMKWKK 13 женной мембране хорошо согласуется с экспериментальными данными и определяется характером его взаимодействия липидами. В первом случае (исходная ориентация – запуск 1) ароматические и заряженные остатки в середине молекулы были обращены в противоположную сторону от поверхности бислоя (рис. 5А), поэтому в процессе встраивания важную роль во взаимодействии с липидами играют N-концевой остаток Arg1 и С-концевые Lys. Во втором случае (исходная ориентация – запуск 2) заряженные и ароматические остатки центрального фрагмента pAntp (Тrp6, Arg10, Arg11) вносят основной вклад во взаимодействие с мембраной, а также участвуют в образовании долгоживущих комплексов с ФС липидами (см. далее). При этом наблюдается стабилизация спиральной структуры пептида. Рис.5. А. Стартовые ориентации pAntp, исходная конформация пептида – ЯМР-структура в смеси ТФЭ/вода (Czalik et al, 2002; PDB код: 1KZ0). Структура пептида показана в виде ленты, заряженные и ароматические остатки выделены темным цветом. Б. Положение пептида относительно плоскости (z=0Å), образованной атомами фосфора липидных головок в бислоях ДОФС (слева) и ДОФХ. Результаты МД для стартовых ориентаций запуск 1 (сплошная линия) и запуск 2 (пунктир). Стэкинг-взаимодействия ароматических остатков с аргинином. Результаты МД показывают, что в воде исходная спиральная конформация пептида сохраняется, что в целом согласуется с экспериментальными наблюдениями (Czalic et al., 2002). Отчасти это объясняется наличием долгоживущих стэкинг-взаимодействий между остатками Arg и ароматическими кольцами Trp и Phe. Стэкинг-пары Trp6-Arg10 и Phe7-Arg11 c параллельной ориентацией гуанидиновой группировки относительно плоскости ароматического кольца сформированы остатками i,i+4. При связывании с мембранами стэкинг-взаимодействия позволяют понижать энергию для экспонированных в водную и гидрофобную фазу ароматических и заряженных остатков, соответственно. Это повышает сродство pAntp к водно-липидному интерфейсу, а также позволяет стабилизировать различные моды связывания пептида (рис. 5Б) с заряженной мембраной. 14 Рис.6. Механизм дестабилизации мембраны ДОФС (на примере МД расчетов для стартовой ориентации pAntp – запуск 2). А. Примеры долгоживущих комплексов ФС с остатками пептида. Для каждого комплекса приведены диаграммы со временем жизни. Б. Мембранный ответ (см. подробнее раздел III.1.2). Слева: Поверхностное распределение динамических фракций липидов. Окраска поверхности проведена в соответствии со шкалой для ΔRMSFmol. Темным цветом показаны «замороженные» области (для которых происходит наиболее существенное уменьшение подвижности полярных головок липидов в результате связывания пептида). Справа: Поверхностное распределение для углов θ полярных головок липидов относительно нормали к бислою. Окраска поверхности проведена в соответствии со шкалой для угла θ. Положение атомов основной цепи пенетратина показано крестиками. Положение липидов, участвующих в долгоживущих комплексах с остатками пептида (см. панель А), обозначено цифрами. В. Временная зависимость доли гиброфобной (пунктир) и гидрофильной (сплошная линия) поверхности в области контакта пептида с мембраной. Г. Структура «дефекта» в области контакта пептида с мембраной. Основная цепь пептида показана лентой. Атомы фосфора полярных головок представлены сферами, ацильные цепи липидов показаны связями. Специфические комплексы с липидами и механизм дестабилизации модельной мембраны. Помимо стэкинг-взаимодействий, еще одной важной особенностью Arg и Trp, входящих в состав молекулы pAntp, является их способность к формированию долгоживущих комплексов с липидами ФС (рис. 6А). Интересно, что при одновременной координации полярной головки липида гуанидиновой группой Arg и индольным кольцом Trp время жизни комплексов возрастает. Показанное сродство pAntp к липидам ФС отражается на характере мембранного ответа, вызванного встраиванием пептида в модельные мембраны (рис. 6Б). Изменение динамики липидных головок («замораживание» в области контакта пептида с мембраной) и нарушение их упаковки (изменение ориентации по отношению к нормали бислоя) более выражено для бислоя ДОФС, чем для ДОФХ. Кроме того, отсутствие специфических контактов остатков пептида с ФХ-липидами объясняет одинаковые моды связывания pAntp в цвиттерионной мембране в случае различных стартовых ориентаций (рис. 5Б). Изменение динамики липидных головок определяется числом долгоживущих контактов остатков пептида с молекулами липидов. В то же время нарушение характера упаковки ФС-липидов в об15 ласти интерфейса, в первую очередь, связано с формированием долгоживущих комплексов. Важно, что липиды ФС, участвующие в комплексах с остатками pAntp, одновременно обладают пониженной подвижностью и измененной ориентацией полярной головки относительно нормали к плоскости мембраны, что приводит к образованию дефекта в упаковке липидов на поверхности мембраны (рис. 6Г). При взаимодействии pAntp с мембранами важную роль играют гидрофобные / гидрофильные соответствия для контактных поверхностей пептида и мембраны (см. также раздел III.3). Данный эффект наиболее выражен в бислое ДОФС. В первом случае (исходная ориентация – запуск 1) пептид попадает в область с повышенной долей гидрофобной ПДР (~35%) по отношению к среднему значению, что обусловливает его глубокое встраивание (рис. 5Б). Во втором случае исходная доля гидрофобной ПДР в области контакта соответствует ее среднему значению для бислоя ДОФС, однако в процессе встраивания пептида внутрь интерфейса доля гидрофобной поверхности возрастает (рис. 6В) вследствие изменения структурно-динамических параметров липидов, находящихся в контакте с пептидными остатками (см. выше). Таким образом, для pAntp наблюдается способность адаптироваться к гетерогенным свойствам водно-липидного интерфейса в процессе встраивания в мембрану. Подведем итог. Полученные нами результаты, в совокупности с большим набором экспериментальных данных, позволяют предположить гипотетический механизм прямого переноса pAntp через мембраны, состоящий из нескольких этапов. На первом этапе адсорбировавшиеся на поверхности молекулы пептида нарушают структуру липидного бислоя, что может быть связано с локальным увеличением концентрации заряженных липидов (для мембран эукариотических клеток – в основном ФС) и/или с формированием «гидрофобных дефектов» (рис. 6В-Г). При увеличении концентрации пептидов на поверхности мембраны количество дефектов возрастает, поэтому вновь связавшиеся пептиды способны глубоко встраиваться в мембрану. Это приводит к существенному изменению локальных электрических свойств мембраны, что при наличии трансмембранного потенциала позволяет отдельным молекулам pAntp преодолевать гидрофобную фазу бислоя. При этом липиды, находящиеся в комплексах с остатками пептида, могут экранировать заряженные группы pAntp от невыгодных взаимодействий с гидрофобным ядром. Основным условием возможности трансмембранного переноса по предложенному механизму является концентрационная зависимость, т.е. существование определенного порогового значения, при достижении которого возможно проникновение пептидов в клетку или липидные везикулы. Концентрационная зависимость для интернализации pAntp показана в ряде экспериментальных работ. III.5. Особенности аминокислотной организации МАП, обусловливающие различные механизмы связывания с мембраной (на примере антимикробных пептидов). В данном разделе описаны результаты сравнительного моделирования пептидов Ltc2a и Ltc1, которые относятся к семейству латарцинов – линейных АМП, недавно выделенных в ИБХ РАН из яда паука Lachesana tarabaevi (Kozlov 16 et al., 2006). Экспериментально обнаружено, что антимикробная активность выше для Ltc2a, однако данный пептид также обладает выраженными гемолитическими свойствами (литическое действие на эритроциты млекопитающих). Механизмы действия этих пептидов отличаются. Для Ltc2a показано, что он разрушает мембраны по «ковровому механизму» (Dubovskii et al., 2006). Для Ltc1 вопрос о механизме остается открытым. Предположительно, его мембранная активность связана с образованием потенциал-зависимых проводящих структур (белоклипидных пор). Таким образом, основной задачей являлось определение молекулярных предпосылок функционального отличия этих достаточно близких по аминокислотной последовательности пептидов. Кроме того, важной практической составляющей данного этапа стала направленная оптимизация функции Ltc2a (в первую очередь, уменьшение гемолитической активности), проведенная в результате использования методов моделирования, для предсказания необходимых точечных мутаций. III.5.1 Основные результаты моделировнание Ltc2a и Ltc1 в мембранах «Эритроциты» и «Грам-» Структура пептидов. Оба пептида в процессе МД встраиваются в интерфейсы модельных мембран, сохраняя при этом α-спиральную конформацию на протяжении всей молекулы, за исключением N- и С-концевых областей (в среднем доля спиральной конформации на равновесном участке для данных АМП составляет ~70%, см. табл. 4). В разделе III.2 описана структура Ltc2a в мицеллах ДСН, которая состоит из двух спиральных участков, соединенных гибким линкером и расположенных практически перпендикулярно друг другу. В мембранах пептид находится в вытянутой спиральной конформации без выраженных изломов в центре молекулы. Таким образом, характер кривизны поверхности модельных водно-липидных систем влияет на конформацию связанного пептида: переход от сферической мицеллы к плоской мембране приводит к серьезным структурным перестройкам в молекуле Ltc2a. Табл.4 Траектории МД для Ltc2a и Ltc1* в модельных бислоях. Траектории МД Время МД, нс Доля спиральной конформации пептида % Ltc2a / «Эритроциты»** 20 80 Ltc1 / «Эритроциты» 20 73 Ltc2a / «Грам-» 30 73 Ltc1 / «Грам-» 30 78 *А.к. последовательности пептидов (ароматические остатки выделены жирным шрифтом, гидрофобные подчеркнуты): Ltc1 SMWSGMWRRKLKKLRNALKKKLKGEK Ltc2a GLFGKLIKKFGRKAISYAVKKARGKH ** Подробнее см. раздел III.1.3 Взаимодействие с липидами. В процессе взаимодействия с модельными мембранами оба пептида образуют специфические комплексы с липидами. Для Ltc1 характерно формирование таких комплексов с липидами ПОФЭ и ПОФГ только в мембране «Грам-» (рис. 7A). Ltc2a образует серию комплексов с ПОФХ в мембране «Эритроциты», а также с ПОФЭ и ПОФГ – в «Грам-». На формирование комплексов с липидами существенное влияние оказывает распределение 17 остатков в α-спирали пептида. Из рис. 7A видно, что Ltc1 формирует амфифильную спираль, при этом все комплексы с липидами образованы остатками, находящимися на «гидрофильной стороне». Спираль Ltc2a в целом не обладает амфифильными свойствами. Комплексы с липидами формируют остатки, входящие как в гидрофобные, так и в гидрофильные паттерны. Таким образом, пространственная организация пептидов содержит предпосылки для взаимодействия с липидами разных типов, а также определяет их характер связывания с мембранами. Рис.7. А. Двумерные карты распределения гидрофобных свойств на поверхности пептидов. Остатки, образующие специфические комплексы с липидами в мембранах «Эритроциты» (ЭР) и «Грам-» (Г-), обозначены черными точками. Карты построены с использованием метода МГП для расчета значений потенциала в каждой точке ПДР в проекции на цилиндрическую поверхность спиралей пептидов (α, Z) (α – угол поворота относительно оси спирали, Z – смещение вдоль оси спирали). Контурные линии соединяют точки с одинаковым значением МГП. Б. Положение пептидов относительно плоскости, образованной атомами фосфора липидных головок в мембранах «Эритроциты» и «Грам-»: Ltc1 (черный) и Ltc2a (серый). Толстой линией показана граница мембраны, рассчитанная по среднему положению атомов фосфора липидного монослоя, пунктиром обозначены оси спиралей. Характер связывания. В процессе МД пептиды Ltc1 и Ltc2a по-разному связываются с модельными мембранами – для Ltc2a характерна периферическая ориентация, Ltc1 обладает способностью встраиваться под углом к плоскости мембраны, с сильно заглубленной N-концевой областью (рис. 7Б). Эти отличия обусловлены различием в а.к. составе пептидов и гидрофобными свойствами их спиралей (амфифильная для Ltc1 и без выраженных свойств, за исключением амфифильного N-концевого участка – для Ltc2a, рис. 7А). Способность Ltc1 встраиваться внутрь интерфейса зависит от типа мембраны. В случае цвитерионной мембраны «Эритроциты» с повышенной концентрацией ФХ липидов заглубление пептида затруднено вследствие недостаточно эффективного взаимодействия с полярными головками. Наличие равномерно распределенных ароматических остатков, обладающих повышенным сродством к мембранному интерфейсу (F3, F10, Y17), по-видимому, влияет на параллельную ориентацию Ltc2a. В Ltc1 присутствие остатков Trp (W3,W7) в N-концевой области способствуют его встраиванию пептида под углом к плоскости мембраны. 18 Динамические свойства липидов в области интерфейса. Ltc2a, вследствие эффективного взаимодействия с липидами ПОФХ в мембране «Эритроциты», сильнее влияет на их динамику (образует выраженные фракции липидов с пониженной подвижностью), чем Ltc1. В «Грам-» за счет параллельной ориентации пептида также наблюдается более заметное влияние на поверхностное распределение динамических фракций липидов (см. подробнее разделы III.1.2, III.4) по сравнению с сильно заглубленным Ltc1. Подведем итог. Для Ltc2a характерно существенное воздействие на структурно-динамические свойства мембран вблизи интерфейса, поэтому можно предположить, что механизм действия данного пептида связан с поверхностной дестабилизацией бислоя. Дестабилизация, видимо, «накапливается» при увеличении концентрации пептида, достигая определенного уровня, при котором наблюдается разрушение бислоя. Такое поведение говорит в пользу коврового механизма. Мембранный ответ на действие пептида Ltc1 выражен слабее. Видимо, для реализации его механизма действия необходима трансмембранная (или сильно заглубленная) ориентация пептида, что позволяет предположить для него способность к формированию белок-липидных пор. Результаты моделирования хорошо согласуются с экспериментальными данными (вытекание красителей из ФЭ/ФГ липосом, P31-ЯМР), полученными в Лаборатории структурной биологии ИБХ РАН. III.5.2. Разработка аналогов Ltc2a c измененной активностью. Рис.8. А. Энергии ван-дер-ваальсовых взаимодействий Ltc2a с мембраной «Эритроциты». Б. Направленное изменение гидрофобных паттернов на поверхности пептида Ltc2a. Приведены двумерные карты распределения гидрофобных свойств на поверхности пептида дикого типа и его мутантов. Области мутаций выделены овалами. Остальные детали – как в подписи к рис. 7А По результатам МД цвиттерионная мембрана «Эритроциты» обладает более гидрофобной поверхностью, по сравнению с заряженной «Грам-». Это позволяет предположить, что уменьшение площади гидрофобной поверхности Ltc2a приводит к понижению эффективности взаимодействия с цвиттерионными мембранами и, следовательно, – к уменьшению гемолитической активности пептида. Сравнение двумерной карты распределения гидрофобности на поверхности пептида и профиля энергии ван-дер-ваальсовых взаимодействий остатков Ltc2a с мембраной «Эритроциты» (рис. 8) позволяет выявить наиболее перспективные остатки для последующих мутаций – Ile7, Phe10. Для них одновременно характерны низкая энергия взаимодействия с мембраной и локализация внутри обширных гидрофобных паттернов на карте МГП. Поэтому для уменьшения гемо19 литической активности Ltc2a были предложены мутации Ile7->Gln, Phe10->Lys (рис. 8Б). Данный этап работы проводили в тесном сотрудничестве с Лабораторией пептидного синтеза и группой оптической спектроскопии Лаборатории структурной биологии ИБХ РАН. Предложенные мутанты Ltc2a были синтезированы, и для них проведена серия биологических тестов на гемолитическую и антимикробную активности (табл. 5). Видно, что изменение всего лишь одного а.к. остатка позволяет существенно уменьшить гемолитическую активность пептидов, сохраняя при этом антибактериальную активность на уровне пептида дикого типа. Табл. 5. Активности пептида Ltc2a и его аналогов. Минимальная ингибирующая концентрация, мкМ Пептид Последовательность E. coli C-600 GLFGKLIKKFGRKAISYAVKKARGKH Ltc2a 3.0 GLFGKLQKKFGRKAISYAVKKARGKH Ltc2a_I7Q 5.5 GLFGKLIKKFGRKAISYAVKKARGKH Ltc2a_F10К 5.0 * Эффективная концентрация, вызывающая 50%-ный лизис. ** Активность отсутствует (0% лизис) при концентрациях до 45 мкМ. B. subtilis B-501 ВКМ 0.7 0.7 1.3 ЭК50*, мкМ Эритроциты человека 9.2 -** - III.6. Краткое описание разработанной технологии моделирования МАП. В данном разделе приводится описание технологии, оптимизирующей задачу моделирования МД периферически связывающихся МАП в явно заданных мембрано-имитирующих системах. Технология была разработана на основании систематизации результатов предыдущих этапов работы. Она включает две составные части – технологию создание моделей мембрано-имитирующих сред и технологию моделирования пептидов в присутствии таких систем. IV. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В этой главе суммированы проведенные в работе исследования, полученные новые результаты и выводы. 1. Для учета различных эффектов при моделировании МАП была создана БД однокомпонентных липидных бислоев (~200 липидов) и мицелл (~100 молекул детергента) с разной химической структурой полярной головки и ацильных цепей. Проведена оптимизация процедур МД явно заданных гидратированных заряженных и нейтральных мембранных систем с применением высокопроизводительных многопроцессорных вычислительных платформ. Показано хорошее согласие теоретических моделей мембранных систем с имеющимися экспериментальными данными. Созданы модели смешанных бислоев, близких по составу к реальным биологическим мембранам (эритроцитов человека, грам- бактерий). Разработаны новые методики картирования свойств поверхностей модельных мембран (распределения гидрофобных/гидрофильных свойств, подвижность полярных головок липидов, характер упаковки липидов, рельеф поверхности). 2. Проведено тестирование методов моделирования МАП на основании сравнения структур АМП Ltc2a, независимо полученных по данным МД и 1Н-ЯМР спектроскопии в мицеллах ДСН. Результаты: a) Данные МД о структуре Ltc2a в 20 мицелле хорошо согласуются с экспериментальными данными 1Н-ЯМР, что говорит об адекватности созданных моделей и эффективности используемых вычислительных протоколов. б) Структура пептида состоит из двух спиралей, соединенных линкерным участком и ориентированных практически перпендикулярно друг другу своими гидрофобными остатками. 3. Изучен характер взаимодействия фузионного пептида E5, синтетического гомолога пептида слияния из гемагглютинина вируса гриппа, с бислоями, состоящими из липидов с разной длиной ацильных цепей (ДМФХ и ДПФХ). Результаты: a). В процессе МД пептид глубже встраивается в интерфейс более «рыхлой» мембраны ДМФХ, по сравнению с мембраной ДПФХ. Мембранный ответ также более выражен в случае бислоя ДМФХ. б). Встраивание Е5 в бислой ДМФХ приводит к вытеснению части липидов из плоскости мембраны в водную фазу за счет эффективного взаимодействия с остатками глутаминовой кислоты пептида. 4. Проведено моделирование взаимодействия неспецифического переносчика пенетратина с заряженным (ДОФС) и цвиттерионным (ДОФХ) бислоями. Результаты: а). Конформационная динамика пенетратина отличается от поведения амфифильных МАП. В водном окружении структура пептида частично стабилизирована стэкинг-взаимодействиями остатков Arg и Trp; в незаряженном бислое ДОФХ сохраняется исходная α-спиральная конформация; в ДОФС, в зависимости от стартовой ориентации, наблюдаются как α-спиральная, так и βструктурная конформации. Полученные результаты хорошо согласуются с экспериментальными данными. б). Дестабилизация локальной структуры бислоя и изменение его динамических свойств связаны с образованием специфических долгоживущих комплексов пептид-липиды. Пенетратин проявляет способность к формированию сложных центров захвата молекул ФС, тогда как для ФХ этот эффект практически отсутствует. 5. Изучено поведение АМП Ltc1 и Ltc2a в модельных бислоях, имитирующих мембраны эритроцитов и грам отрицательных бактерий. Результаты: а). Характер взаимодействия с ФХ-липидами отличается в случае двух пептидов, что, возможно, определяет их различные гемолитические свойства. б). Отличия в характере связывания с модельными мембранами и мембранном ответе на действие пептидов позволяют сделать предположение о разных механизмах дестабилизации клеточных мембран («ковровый» – для Ltc2a; с образование белоклипидных пор – для Ltc1). Полученные результаты в целом согласуются с экспериментальными данными. в). Для Ltc2a предложен ряд мутаций, направленных на уменьшение гемолитической активности пептида. С помощью экспериментальных методов была показана эффективность предсказанных аминокислотных замен. 21 V. ВЫВОДЫ 1. Разработаны и оптимизированы методики исследования поведения пептидов в явно заданных модельных мембранах, основанные на расчетах МД. Реализованные новые подходы в анализе МД-данных с использованием процедур картирования различных структурно-динамических свойств поверхности мембран позволяют получать детальную картину мембранного ответа, вызванного встраиванием пептидов. На основании систематизации полученных результатов создана интегрированная технология моделирования МАП. 2. Характер связывания фузионного пептида E5, пептидного переносчика пенетратина и антимикробного пептида Ltc2a является следствием их адаптации к различному мембранному окружению. Основными факторами служат: а) конформационная подвижность пептида; б) заряд, динамическое состояние и кривизна поверхности мембраны; в) гидрофобная организация водно-липидного интерфейса. 3. Дестабилизация мембран в процессе связывания ряда биологически активных пептидов происходит в результате образования специфических контактов аминокислотных остатков с полярными головками липидных молекул. а). Взаимодействие остатков глутаминовой кислоты фузионного пептида E5 c ФХ приводит к вытеснению липидов из плоскости мембраны. б). Формирование комплексов ароматических и катионных остатков пентератина с ФС способствует возникновению «гидрофобных дефектов» на поверхности мембраны. 4. Особенности аминокислотной организации АМП Ltc1 и Ltc2a обусловливают различный характер их связывания с моделями бактериальных и эукариотических мембран. В частности, распределение ароматических остатков в молекулах пептидов и гидрофобная организация их спиралей определяют периферическую моду связывания для Ltc2a и заглубленную – для Ltc1. 5. На основании молекулярного моделирования предсказаны полярные аминокислотные замены в гидрофобных областях антимикробного пептида Ltc2a (Ile7Gln, Phe10Lys), направленные на уменьшение его гемолитической активности. Данные биологического тестирования для полученных аналогов (Ltc2a_I7Q, Ltc2a_F10K) показали эффективность предложенных мутаций. 22 СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Polyansky A.A., Volynsky P.E., Nolde D.E., Arseniev A.S, Efremov R.G. Role of lipid charge in organization of water/lipid bilayer interface: insights via computer simulations. (2005). J. Phys. Chem. B, 109, 15052-15059. 2. Volynsky P.E., Polyansky A.A., Simakov N.A., Arseniev A.S., Efremov R.G. Effect of lipid composition on the "membrane response" induced by a fusion peptide. (2005). Biochemistry, 44, 14626–14637. 3. Dubovskii P.V., Volynsky P.E., Polyansky A.A., Chupin V.V., Efremov R.G., Arseniev A.S. Spatial structure and activity mechanism of a novel spider antimicrobial peptide. (2006). Biochemistry, 45, 10759-10767. 4. Polyansky A.A., Volynsky P.E., Arseniev A.S., Efremov R.G. Computer simulations of anionic unsaturated lipid bilayer – a suitable model to study membrane interactions with a cell-penetrating peptide In: Bioinformatics of Genome Regulation and Structure II. (Eds. N.Kolchanov and R. Hofestaedt) Springer Science+Business Media, Inc. 2005, 235-246. 5. Efremov R.G., Volynsky P.E., Polyansky A. A., Nolde D.E., Arseniev A.S. Protein-membrane interactions: lessons from in silico studies. In: Structure and Biophysics - New Technologies for Current Challenges in Biology and Beyond (J.D. Puiglisi), NATO Science Series: Life and Behavioural Sciences, – in press. 6. Efremov R.G., Nolde D.E., Volynsky P.E., Vereshaga Y.A., Simakov N.A., Polyansky A.A. Molecular modeling of membrane peptides and proteins. Fundamental & Clinical Pharmacology 2004 18, 594 7. Polyansky A.A., Volynsky P.E., Efremov R.G. Computer simulations of anionic unsaturated lipid bilayer: a base system to study peptide-membrane interactions. Proceedings of the Fourth International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure, Novosibirsk, Russia (2004), 1, 333-334. 8. Polyansky A.A., Volynsky P.E., Efremov R.G. Unsaturated phosphatidylserine bilayer: a perspective model system to study peptide-membrane interactions via computer simulations. International symposium “Peptide-Membrane Interactions” Namur, Belgium (2004). 9. Polyansky A.A., Volynsky P.E., Efremov R.G. Computer simulations of interaction of Trojan peptides with lipid bilayers. 5th EMBL PhD Student International Symposium, “Design of Life - Learning from Nature”, Heidelberg, Germany (2004). 10. Efremov R.G., Volynsky P.E., Polyansky A.A., Aliper E.T., Dubovskii P.V., Arseniev A.S. Binding of membrane-active peptides to lipid bilayers: From modeling of structure and dynamics – to understanding of function. Symposium “Interactions of Peptides and Proteins with Membrane Surfaces”, the 231st ACS National Meeting, Atlanta, USA (2006) 11. Polyansky A.A., Aliper E.T., Volynsky P.E., Efremov R.G. Action of membraneactive peptides on explicit lipid bilayers. Role of specific peptide-lipid interactions in membrane destabilization. Proceedings of the Fifth International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure, Novosibirsk, Russia (2006), 1, 302305. 23 СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ Czajlik A., Mesko E., Penke B., Perczel A. J. Pept. Sci. 2002, 8, 151 Dubovskii P.V., Li H., Takahashi S., Arseniev A.S., Akasaka K. Protein Sci. 2000, 9, 786. Efremov R.G., Vergoten G. J. Phys. Chem. 1995, 15, 63. Forrest L.R., Sansom M.S. Curr Opin Struct Biol. 2000, 10, 174. Han X., Bushweller J.H., Cafiso D.S., Tamm L.K. Nat Struct Biol. 2001, 8, 715. Kozlov S.A., Vassilevski A.A., Feofanov A.V., Surovoy A.Y., Karpunin D.V., Grishin E.V. J. Biol. Chem. 2006, 281, 20983. Lindahl E., Hess B., van der Spoel. D. J. Mol. Mod. 2001, 7, 306. Petrache H.I., Tristram-Nagle S., Gawrisch K., Harries D., Parsegian V.A., Nagle J.F. Biophys. J. 2004, 86, 1574. Vaccaro L., Cross K.J., Kleinjung J., Straus S.K., Thomas D.J., Wharton S.A., Skehel J.J., Fraternali F. Biophys. J. 2005, 88, 25. 24
