Add to collection(s) Add to saved
  1. Естественные науки
  2. Медицинские науки

1 003362 2 Область изобретения

advertisement 
1
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к способам для увеличения прочности и/или упругости костей и/или сокращения вероятности и/или
тяжести переломов костей путем введения паратиреоидного гормона (гормона паращитовидной
железы). Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу увеличения прочности
или упругости костной ткани в месте возможной или реальной травмы, например, такой как
травма таза или позвоночника, у пациента с
риском остеопороза или страдающего остеопорозом. Более конкретно, настоящее изобретение
относится к способу уменьшения распространенности перелома позвоночника, уменьшения
распространенности множественных переломов
позвоночника, уменьшения тяжести перелома
позвоночника и/или уменьшения распространенности не связанных с позвоночников переломов.
Предпосылки изобретения
Существующие агенты, такие как эстроген, бисфосфонаты, фторид или кальцитонин
могут предотвратить потери костной ткани и
вызвать 3-5% увеличение массы костной ткани с
помощью повторного заполнения восстанавливаемого пространства, но общее образование
костной ткани значительно не стимулируется.
Удерживание костной ткани путем ингибирования метаболизма костной ткани не может быть
достаточной защитой от риска перелома для
пациентов, которые уже имеют значительные
потери костной ткани. Анаболические агенты,
которые увеличивают прочность кости путем
стимулирования формирования костной ткани,
предпочтительно могут обеспечить лучшую
защиту от переломов у пациентов с выраженным остеопорозом.
Паратиреоидный гормон (РТН) представляет собой продукт из 84 аминокислот, выделяемый паращитовидной железой млекопитающих, который контролирует уровни сывороточного кальция путем его воздействия на различные ткани, включая костную ткань. N-концевые
34 аминокислоты бычьего и человеческого РТН
(РТН(1-34)) согласно оценкам являются биологически эквивалентами (полноразмерного) гормона. Другие аминоконцевые фрагменты РТН
(включая, например, 1-31 и 1-38), или РТНrР
(РТН-зависимый пептид/белок) или аналоги
одного из них или обоих, которые активируют
рецептор РТН/РТНrР (рецептор РТН1), как показано, проявляют подобные же биологические
воздействия на массу костной ткани, хотя величина таких воздействий может быть различной.
Исследования на людях с различными
формами РТН продемонстрировали анаболическое воздействие на костную ткань и вызвали
значительный интерес к их использованию при
лечении остеопороза и связанных с ним заболеваний костной ткани. Значительные анаболические воздействия РТН на костную ткань,
003362
2
включая стимуляцию формирования костной
ткани, которая приводит к общему увеличению
массы или/и прочности костной ткани, продемонстрированы на многих опытных животных и
на людях.
Обычно предполагается, что введение РТН
людям и соответствующим опытным животным
обладает отрицательным воздействием на кортикальный слой костной ткани. На самом деле,
происходящее естественным образом увеличение уровня эндогенного РТН, которое происходит при расстройственном гиперпаратироидизме, приводит к утончению кортикального слоя
костной ткани, сопровождающемуся увеличением связности и массы губчатой костной ткани.
Последние исследования показывают, что при
восстановлении гаверсова кортикального слоя
кости (обнаруженного у людей и высших млекопитающих) под действием РТН происходит
перераспределение костной ткани, так что
прочность и масса кортикального слоя уменьшается, в то время как масса и прочность губчатой костной ткани увеличивается. Например, в
опубликованных клинических исследованиях
введения РТН масса кортикального слоя костной ткани уменьшается после лечения экзогенным РТН, и эти факты вызывают озабоченность
по поводу того, что лечение с помощью РТН
будет приводить к уменьшению массы и прочности кортикального слоя костной ткани. Одной
из проблем, возникающих при этих исследованиях, является то, что при этом может происходить общая потеря массы костной ткани скелета, связанная с потерями кортикального слоя
костной ткани. Высокую клиническую важность
представляет то, что, при остеопорозе более
высокие потери губчатой костной ткани по
сравнению с потерями кортикального слоя костной ткани означают, что механическая нагрузка ложится в основном на оставшийся кортикальный слой костной ткани. Продолжающиеся потери кортикального слоя костной ткани могут увеличивать риск перелома. По этой
причине является важным, чтобы терапевтический агент для остеопороза поддерживал или
увеличивал оставшийся у пациента кортикальный слой костной ткани.
Воздействие РТН на кортикальный слой
костной ткани исследовалось на животных, но
не на человеке, с гаверсовым восстановлением,
таких как собаки, хорьки, овцы и обезьяны, но
размеры выборок, как правило, являются слишком малыми для надежного статистического
анализа. Воздействие изменений, вызванных
лечением РТН, на механические свойства кортикального слоя костной ткани у таких животных остается неизвестным. Опубликованные
исследования на грызунах демонстрируют увеличение массы кортикального слоя костной
ткани при введении РТН, но потерю этого выигрыша после отмены лечения РТН. Однако
кортикальный слой костной ткани у грызунов
3
имеет структуру, совершенно отличную от гаверсова кортикального слоя костной ткани, и
восстанавливается скорее путем поверхностного
аппозиционного формирования и резорбции,
чем путем интракортикального восстановления
остеонов. Далее технологические ограничения
на биомеханические исследования на относительно коротких костях грызунов приводят к
артефактам при измерениях, когда агент, например РТН, изменяет геометрию кости, делая
кость более толстой. Такие артефакты делают
экстраполяцию реакций кортикального слоя
костной ткани крысы на такие же слои костной
ткани у людей или других животных с остеональным восстановлением ненадежными. Следовательно, существующие данные для животных, подобно людям, подвергающихся гаверсову восстановлению, указывает, что РТН может
обладать побочным эффектом на кортикальный
слой костной ткани, вызывая общие потери массы костной ткани из-за истощения кортикального слоя костной ткани.
Как следствие, популярным мнением относительно воздействия РТН является то, что пациенты требуют одновременного или последующего лечения от резорбции, чтобы свести к
минимуму потери костной ткани, вызванные
РТН. На практике эта модель была основой для
нескольких клинических исследований на женщинах. Например, три клинических исследования использовали РТН для женщин в постменопаузальном периоде при одновременной
терапии кальцитомином или эстрогеном, или
для женщин в предменапаузальном периоде с
использованием агониста GnRH, Synarel, для
эндометриоза. Противоположные воздействия
эстрогена и РТН на метаболизм кортикального
слоя костной ткани делает особенно сложным
наблюдение воздействия именно РТН при объединенной терапии этими двумя агентами.
Остается необходимость в использовании
РТН для увеличения крепости и упругости костей у людей и других животных, проявляющих
гаверсово восстановление, и для понижения
распространенности переломов костей у этих
животных. Далее остается необходимость в способе для увеличения качества и количества кортикального слоя костной ткани.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение включает способ
увеличения прочности или/и упругости костной
ткани, предпочтительно кортикального слоя
костной ткани, или/и сокращения распространенности или/и тяжести переломов путем введения паратиреоидного гормона. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу увеличения прочности или упругости костной ткани в месте возможной или реальной
травмы. Увеличение прочности или/и упругости
костной ткани может проявляться различными
путями, известными специалистам в данной
области, например, такими как увеличение
003362
4
плотности минеральных веществ костной ткани,
увеличение содержания минеральных веществ в
костной ткани, увеличение работы до разрушения, и тому подобное. В одном из воплощений
способ по настоящему изобретению сокращает
распространенность или тяжесть переломов позвоночника или/и переломов, не связанных с
позвоночником. Способ по настоящему изобретению может быть использован для уменьшения
риска таких переломов или для лечения таких
переломов. В частности, способ по настоящему
изобретению может сократить распространенность перелома позвоночника или/и перелома,
не связанного с позвоночником, уменьшить тяжесть перелома позвоночника, уменьшить распространенность множественных переломов
позвоночника, улучшить качество костной ткани и тому подобное.
Настоящий способ может увеличить прочность или упругость на месте возможной травмы, например верхней части бедренной кости
или позвоночника пациента с остеопорозом, или
в другом месте, имеющем аномально низкую
массу костной ткани или плохую структуру костной ткани. Настоящий способ может также
увеличить прочность или упругость костной
ткани в месте возможной травмы, например,
такой как перелом таза или позвоночника.
Предпочтительным субъектом для способа по
настоящему изобретению является женщина
или мужчина с риском, связанным с остеопорозом, предпочтительно женщина в постменопаузальном периоде, и являющийся независимым
от одновременно проводимой гормон-заместительной терапии (HRT), эстрогенной или эквивалентной терапии, или противорезорбционной
терапии. В одном из воплощений пациент получает также дополнительное лечение в виде
кальция или/и витамина D.
Паратиреоидный гормон, такой как рекомбинантный паратиреоидный гормон человека с
N-концевыми аминокислотами 1-34, может вводиться либо циклически, либо с перерывами.
Предпочтительно циклическое введение включает введение РТН в течение 2 или более циклов
восстановления и отмену лечения РТН в течение одного или более циклов восстановления.
Далее согласно способу настоящего изобретения увеличение прочности или/и упругости костной ткани может продолжаться в течение нескольких циклов восстановления или вплоть до
нескольких лет после последнего введения паратиреоидного гормона.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1А и 1В демонстрируют, что BMD
(плотность минеральных веществ в костной
ткани) и ВМС (содержание минеральных веществ в костной ткани) в срединной стержневой
структуре бедренной кости (кортикальная костная ткань) (А) и в проксимальной части бедренной кости (губчатая костная ткань + кортикальная костная ткань) (В) являются значительно
5
большими у животных, пролеченных РТН, чем
у контрольных животных, при обеих дозах.
Фиг. от 2А до 2D демонстрируют воздействия РТН на механическую прочность и поперечный момент инерции (CSMI) в кортикальном
слое костной ткани срединной стержневой
структуры бедренной кости.
Фиг. 3 иллюстрирует процент изменения
измеренных с помощью DXA показателей содержания минеральных веществ в костной ткани в целом для контрольной и пролеченной
групп.
Фиг. 4А-4С иллюстрируют процент изменения измеренных с помощью DXA показателей
позвоночника для контрольной и пролеченной
групп в поясничных позвонках 2-4 для площади
кости (А), содержания минеральных веществ в
костной ткани (В), и плотности минеральных
веществ в костной ткани (С).
Фиг. 5А и 5В иллюстрируют увеличение
массы костной ткани (А) и прочности костной
ткани (В) поясничных позвонков приматов,
пролеченных паратиреоидным гормоном.
Фиг. 6А и 6В иллюстрируют увеличение
прочности шейки бедра (А) и постоянной прочности средней части диафиза плечевой кости
(В) у приматов, пролеченных паратиреоидным
гормоном.
Фиг. 7 иллюстрирует активацию скоростей
формирования костной ткани на эндостальной и
периостальной поверхностях срединной стержневидной структуры плечевой кости.
Фиг. 8 иллюстрирует гистограммный анализ изменения плотности вокселов костной ткани в поясничном позвонке, являющегося результатом лечения РТН, по сравнению с контролем. Происходит увеличение плотности кортикального отдела кости после прекращения
лечения РТН.
Фиг. 9 иллюстрирует увеличение BMD поясничного отдела позвоночника в течение 23
месяцев лечения пациентов, либо 20 мкг/день
РТН, либо 40 мкг/день РТН, по сравнению с
контролями, пролеченными плацебо.
Фиг. 10 иллюстрирует увеличение BMD
бедренной кости и шейки бедра в течение 24
месяцев лечения пациентов либо 20 мкг/день
РТН, либо 40 мкг/день РТН, по сравнению с
контролями, пролеченными плацебо.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к способу увеличения прочности или/и упругости
костной ткани или/и уменьшения распространенности переломов у пациента путем введения
паратиреоидного гормона. Настоящий способ
может быть использован для увеличения упругости или/и прочности в месте возможной травмы или в месте реальной травмы. Травма, как
правило, включает перелом, хирургическую
травму, замену сустава, ортопедические процедуры и тому подобное. Увеличение прочности
или/и упругости костной ткани, как правило,
003362
6
включает увеличение плотности минеральных
веществ в кортикальном слое костной ткани,
увеличение прочности кости, увеличение сопротивления нагрузке и тому подобное. Уменьшение распространенности переломов, как правило, включает уменьшение возможной или реальной распространенности перелома у пациента по сравнению с не пролеченной контрольной
группой.
Как используется здесь, термин предельная сила относится к максимальной силе, которую может выдержать образец костной ткани;
упругость относится к крутизне линейной части
кривой нагрузка-деформация; а работа до разрушения относится к площади под кривой нагрузка-деформация до разрушения. Каждый из
этих параметров может быть измерен и вычислен с помощью методов, которые являются
стандартными в области исследования костной
ткани. Эти параметры представляют собой
структурные свойства, которые зависят от внутренних свойств материала и геометрии и могут
быть определены таким образом, как описано в
Turner СН. Burr DB 1993 "Basic biomechanical
measurements bones: a tutorial". Bone 14:595-608,
которая включена сюда в качестве ссылки. Предельная сила, упругость и работа до разрушения
могут быть нормализованы для получения внутренних свойств материала, таких как предельное напряжение, модуль упругости и прочность,
которые не зависят от размера и формы. Как он
используется здесь, термин предельное напряжение относится к максимальному напряжению,
которое образец может выдержать, модуль упругости относится к внутренней упругости материала; прочность относится к сопротивлению
на излом на единицу объема. Каждый из этих
параметров может быть определен с помощью
методов известных в данной области.
Определение. Прочность бедренной кости,
как она упоминается здесь, может быть измерена на шейке бедренной кости или в ее срединной стержневой структуре, как правило, используя трехточечный или четырехточечный изгиб в
последнем месте.
Травма кости
Способ по настоящему изобретению представляет преимущество пациенту, который может страдать или страдает от травмы одной или
нескольких костей. Способ может представлять
преимущества для пациентов млекопитающих,
таких как люди, лошади, собаки и кошки, в особенности люди. Травма кости может представлять проблему для беговых лошадей и собак, а
также для домашних животных. Люди могут
страдать от множества травм костей, вызванных, например, несчастным случаем, медицинским вмешательством, заболеванием или расстройством. У молодых людей травма костей
наиболее вероятно будет вызываться переломом, медицинским вмешательством для лечения
перелома, или лечением суставов или соедини-
7
тельной ткани, поврежденных, например, во
время физических упражнений. Другие типы
травмы кости, такие как остеопороз, дегенеративное заболевание костной ткани (такое как
артрит или остеоартрит), замена бедренного
сустава или вторичные состояния, связанные с
терапевтическим лечением других системных
заболеваний (например, глюкокортикоидный
остеопороз, ожоги или трансплантация органов), наиболее часто встречаются у пожилых
людей.
Предпочтительные пациенты включают
людей, предпочтительно женщин, с риском заболевания или с выраженным остеопорозом.
Факторы риска для остеопороза известны в данной области и включают гипогонадальные состояния у мужчин и женщин, независимо от
возраста, состояния, заболевания, или лекарственные средства, которые вызывают гипогонадизм, факторы питания, связанные с остеопорозом (низкий кальций или витамин D является
наиболее распространенным), курение, алкоголь, лекарства, связываемые с потерями костной ткани (такие как глюкокортикоиды, тироксин, гепарин, литий, противосудорожные препараты, и тому подобное), потеря зрения, которая предрасполагает к падениям, космические
полеты, иммобилизация, постоянная госпитализация или постельный режим, и другие системные заболевания, которые связываются с увеличенным риском остеопороза. Признаки, указывающие на присутствие остеопороза, известны в
данной области и включают радиологическое
доказательство, по меньшей мере, одного компрессионного перелома позвоночника, низкую
массу костной ткани (как правило, по меньшей
мере, 1 стандартное отклонение вниз от нормальных значений для молодых людей), или/и
атравматические переломы.
Остеопороз может приводить, например, к
переломам позвоночника или/и к переломам, не
связанным с позвоночником. Примеры не связанных с позвоночником переломов включают
перелом кисти, перелом предплечья, перелом
проксимальной части плечевой кости, перелом
лучевой кости, перелом лодыжки, перелом плечевой кости, перелом ребра, перелом стопы,
перелом таза или их сочетание. Способ по настоящему изобретению может быть использован
для уменьшения риска таких переломов или для
лечения таких переломов. Риск перелома
уменьшается, и заживление перелома облегчается путем увеличения прочности или/и упругости костной ткани, например, в тазу и/или в позвоночнике. Типичной женщиной с риском развития остеопороза является женщина в постменопаузальном периоде или женщина в предменапаузальном периоде, женщина, страдающая
гипогонадизмом. Предпочтительным пациентом
является женщина в постменопаузальном периоде, являющаяся независимой от сопутствующей гормон-заместительной терапии (HRT),
003362
8
эстрогенной или эквивалентной терапии или
противорезорбционной терапии. Способ по настоящему изобретению может предоставлять
преимущество пациенту на любой стадии остеопороза, но особенно на ранней и поздней
стадии.
Настоящее изобретение включает способ,
эффективный, в особенности, для предотвращения или уменьшения распространенности переломов у пациента с риском остеопороза или его
развития. Например, настоящее изобретение
может уменьшить распространенность перелома
позвоночника или/и перелома, не связанного с
позвоночником, уменьшить тяжесть перелома
позвоночника, уменьшить распространенность
множественного перелома позвоночника, улучшить качество костной ткани и тому подобное.
В другом воплощении, способ по настоящему
изобретению может приносить преимущества
пациентам с низкой массой костной ткани или с
переломами в прошлом, в дальнейшем с риском
множественных переломов скелетных костей,
таким как пациенты, у которых спинальный
остеопороз может быстро прогрессировать.
Способ по данному изобретению может
быть с успехом применен для других пациентов
с риском травмы костей или с травмами костей.
Например, у множества пациентов с риском
одного или нескольких переломов, указанных
выше, проведение хирургических операций может привести к травме костей, или они могут
подвергаться ортопедической процедуре, которая манипулирует костью в скелете с аномально
низкой массой костной ткани или с плохой
структурой костной ткани, или с дефицитом
минеральных веществ. Например, восстановление функций после хирургической операции,
такой как замена сустава (например, коленного
или тазобедренного) или фиксация позвоночника, или других процедур, которые иммобилизуют кость или скелет, может быть улучшено благодаря способу по настоящему изобретению.
Способ по настоящему изобретению может
также облегчить восстановление после ортопедических процедур, которые манипулируют
костью в области с аномально малой массой
костной ткани или плохой структурой костной
ткани, эти процедуры включают хирургическое
разделение костей, включая остеотомии, замену
сустава, где потеря структуры костной ткани
требует, например, реструктуризации с образованием ацетабулярной полочки и предотвращения смещения протеза. Другие соответствующие субъекты для применения настоящего изобретения включают тех, кто страдает гиперпаратироидизмом или искривлением позвоночника, и кто может получать травму, связанную с
гиперпаратироидизмом или развитием искривления позвоночника или вызванной ими.
Прочность и упругость костей
Способ по настоящему изобретению
уменьшает риск травмы или помогает восста-
9
новлению после травмы путем увеличения
прочности и/или упругости костной ткани. Как
правило, прочность или упругость костей определяется массой и прочностью кортикального
слоя и различных губчатых слоев костной ткани. Способ по настоящему изобретению может
обеспечить уровни прочности, упругости, массы
или/и крепости кости в пределах, характерных
для нормальной популяции, или выше их.
Предпочтительно настоящее изобретение обеспечивает повышенные уровни по сравнению с
уровнями, существующими после травмы или
связанными с риском получения травмы. Увеличение прочности и/или упругости сокращает
риск или вероятность перелома по сравнению с
не пролеченной контрольной популяцией.
Некоторые характеристики костной ткани
при увеличении обеспечивают повышение
прочности или/и упругости костей. Такие характеристики включают плотность минерального вещества в костной ткани (BMD), содержание минерального вещества в костной ткани
(ВМС), частоту активации или скорость формирования кости, трабекулярное число, толщину
губчатого слоя, связность губчатого и других
слоев, периостальное и эндокортикальное формирование костной ткани, пористость кортикального слоя, площадь поперечного сечения
кости и массу кости, сопротивление нагрузке
или/и работу до разрушения. Увеличение одной
или нескольких из этих характеристик является
предпочтительным результатом осуществления
способа по настоящему изобретению.
Некоторые характеристики костей, такие
как пространство для костного мозга и модуль
упругости, когда они уменьшаются, обеспечивают повышенную прочность или/и упругость
кости. Более молодая (более прочная и жесткая)
костная ткань имеет кристаллиты, которые, как
правило, меньше, чем кристаллиты в более старой костной ткани. Таким образом, общее
уменьшение размера кристаллитов костной ткани увеличивает прочность и упругость костной
ткани и может понизить распространенность
переломов. Кроме того, созревание кристаллитов костной ткани может обеспечить дополнительные желательные характеристики костной
ткани, включая увеличение прочности и упругости костной ткани, или/и могут понизить распространенность переломов. Уменьшение одной
или нескольких из этих характеристик может
быть предпочтительным результатом способа
по настоящему изобретению.
Способ по настоящему изобретению является эффективным при увеличении прочности
или/и упругости любой из нескольких костей.
Например, настоящий способ может увеличить
прочность или/и упругость костей, включая
кость таза, например, подвздошную кость, кость
ноги, такую как бедренная кость, кость позвоночника, такую как позвонок или кость руки,
такую как дистальная часть кости предплечья
003362
10
или проксимальная часть плечевой кости. Это
увеличение прочности или/и упругости может
осуществляться по всей кости или локализоваться в определенных частях кости. Например,
прочность или/и упругость бедренной кости
может быть увеличена путем увеличения прочности или/и упругости шейки бедра или большого вертела бедренной кости. Прочность или/и
упругость таза может быть повышена путем
увеличения прочности или/и упругости подвздошного гребня или подвздошного остистого
отростка. Прочность или/и упругость позвонка
может быть увеличена путем увеличения прочности или/и упругости его ножек дуги, пластинки дуги или тела. Преимущественно влияние
оказывается на позвонки определенных частей
позвоночника, таких как шейные, грудные, поясничные, крестцовые или/и копчиковые позвонки. Предпочтительно воздействие происходит на один или несколько средних грудных
или/и верхних поясничных поясков.
Увеличение прочности или/и упругости
может быть обнаружено в каждом из типов костной ткани или преимущественно в одном из
типов костной ткани. Типы костной ткани
включают губчатую (различные типы губчатых
тканей или пластинчатую) костную ткань и
компактную (кортикальную или плотную) костную ткань и костную мозоль. Способ по настоящему изобретению предпочтительно увеличивает прочность или/и упругость при своем
воздействии на губчатую и кортикальную костную ткань, или на одну только кортикальную
костную ткань. Губчатая костная ткань, к которой прикреплена соединительная ткань, может
также быть сделана более прочной или/и жесткой с помощью настоящего способа. Например,
является преимуществом обеспечение дополнительной прочности на месте прикрепления связки, сухожилия или/и мышцы.
В другом аспекте настоящего изобретения
увеличение прочности или упругости может
уменьшить распространенность переломов. В
этом аспекте, увеличение прочности или упругости может включать уменьшение распространенности переломов позвоночника, уменьшение
распространенности
тяжелых
переломов,
уменьшение распространенности переломов
средней тяжести, уменьшение распространенности переломов, не связанных с позвоночником,
уменьшение распространенности множественных переломов или их сочетания.
Паратиреоидный гормон
В качестве активного ингредиента, композиция или раствор могут включать полноразмерный паратиреоидный гормон, включающий
84 аминокислоты, в частности, гормона человека, hPTH (1-84), полученный либо рекомбинантным путем, либо путем пептидного синтеза
или путем экстракции из телесной жидкости
человека. См., например, патент США №
5208041, включенный сюда в качестве ссылки.
11
Последовательность аминокислот hPTH (1-84)
опубликована Kimura et al. in Biochem. Biophys.
Res. Comm., 114(2):493.
Композиция или раствор могут также
включать в качестве активного ингредиента
фрагменты или варианты фрагментов РТН человека или РТН крысы свиньи или быка, которые имеют активность РТН человека, как определяется на модели остеопороза подвергнутых
овариэктомии крыс, опубликованной Kimmel et
al. Endocrinology, 1993, 32(4):1577.
Фрагменты паратиреоидного гормона желательно включают, по меньшей мере, первые
28 N-концевых остатков, такие как РТН(1-28),
РТН(1-31), РТН(1-34), РТН(1-37), РТН(1-38) и
РТН(1-41). Альтернативы в форме вариантов
РТН включают от 1 до 5 аминокислотных замещений, которые увеличивают стабильность и
время полужизни РТН, например, замещение
метиониновых остатков в положениях 8 или/и
18 лейцином или другой гидрофобной аминокислотой, которая улучшает стабильность РТН
в отношении окисления, и замещение аминокислот на участке 25-27 нечувствительными к
трипсину аминокислотами, такими как гистидин
или другая аминокислота, которая повышает
стабильность РТН в отношении протеазы. Другие подходящие формы РТН включают РТНrР,
РТНrР(1-34), РТНrР(1-36) и аналоги РТН или
РТНrР, которые активируют рецептор РТН1.
Эти формы РТН охватываются термином "паратиреоидный гормон", который используется
здесь в общем смысле. Гормоны могут быть
получены путем известных рекомбинантных
или синтетических методов, таких как те, которые описаны в патентах США № 4086196 и
5556940, включенных сюда в качестве ссылки.
Предпочтительным гормоном является
РТН(1-34) человека, также известный как терипаратид. Стабилизированные растворы РТН(134) человека, такие как рекомбинантный РТН(134) человека (rhPTH(1-34)), которые могут быть
использованы в настоящем способе, описаны в
заявке на патент США серийный № 60/069075,
включенной сюда в качестве ссылки. Кристаллические формы РТН(1-34) человека, которые
могут быть использованы в настоящем способе,
описаны в заявке на патент США серийный №
60/069875, включенной сюда в качестве ссылки.
Введение паратиреоидного гормона
Паратиреоидный гормон может, как правило, вводиться парентерально, предпочтительно путем подкожной инъекции, с помощью способов и композиций, хорошо известных в данной области. Стабилизированные препараты
РТН(1-34) человека, которые могут с преимуществами использоваться в настоящем способе,
описаны в заявке на патент США серийный №
60/069075, включенной сюда в качестве ссылки.
Эта заявка на патент также описывает многочисленные другие композиции для хранения и
введения паратиреоидного гормона. Стабилизи-
003362
12
рованный раствор паратиреоидного гормона
может включать стабилизирующий агент, буфер, консервант и тому подобное.
Стабилизирующий агент, включенный в
раствор или композицию, включает полиол,
который включает сахарид, предпочтительно
моносахарид или дисахарид, например, глюкозу, трегалозу, раффинозу, или сахарозу, сахарный спирт, такой, например, как маннитол, сорбитол или инозитол, и многоатомный спирт,
такой как глицерин или пропиленгликоль или
их смеси. Предпочтительным полиолом является маннитол или пропиленгликоль. Концентрация полиола может находиться в пределах от
около 1 до около 20 мас.%, предпочтительно от
около 3 до 10 мас.% от всего раствора.
Буфер, используемый в растворе или композиции настоящего изобретения, может представлять собой любую комбинацию кислот или
солей, которая является фармацевтически приемлемой и способна поддерживать водный раствор в диапазоне значений рН от 3 до 7, предпочтительно от 3 до 6. Пригодные для использования системы буферов представляют собой,
например, источники ацетатов, тартратов или
цитратов. Предпочтительными системами буферов являются источники ацетатов или тартратов, наиболее предпочтительным является источник ацетатов. Концентрация буфера может
находиться в пределах от около 2 до около 500
мМ, предпочтительно от около 2 до 100 мМ.
Стабилизированный раствор или композиция по настоящему изобретению может также
включать парентерально приемлемый консервант. Такие консерванты включают, например,
крезолы, бензиловый спирт, фенол, бензалконийхлорид, бензэтонийхлорид, хлорбутанол,
фенилэтиловый спирт, метилпарабен, пропилпарабен, тимеросал, нитрат и ацетат фенил ртути. Предпочтительный консервант представляет
собой м-крезол или бензиловый спирт; наиболее
предпочтительным является м-крезол. Количество используемого консерванта может находиться в пределах от около 0,1 до около 2
мас.%, предпочтительно от около 0,3 до около
1,0 мас.% от всего раствора.
Таким образом, стабилизированный раствор терипаратида может содержать маннитол,
ацетат и м-крезол с предсказанным временем
хранения в упаковке в течение более 15 месяцев
при 5°С.
Композиции паратиреоидного гормона могут, если это желательно, быть представлены в
форме порошка, содержащего не более чем 2
мас.% воды, который получают в результате
сушки вымораживанием стерильного водного
раствора гормона, приготовленного путем смешивания выбранного паратиреоидного гормона,
буфера и стабилизирующего агента таким образом, как описано выше. Особенно полезным в
качестве буфера при приготовлении лиофилизированных порошков является источник тар-
13
тратов. Особенно полезные стабилизирующие
агенты включают глицин, сахарозу, трегалозу и
раффинозу.
Кроме того, паратиреоидный гормон может быть приготовлен с типичными буферами и
наполнителями, используемыми в данной области для стабилизации и солюбилизации белков для парентерального введения. Используемые в данной области фармацевтические носители и их препараты описаны в Martin,
"Remington's Pharmaceutical Sciences," 15th Ed.;
Mack Publishing Co., Easton (1975). Паратиреоидный гормон может также быть доставлен через легкие, рот, нос с помощью суппозитория
или с помощью пероральных препаратов.
Паратиреоидный гормон приготавливают
для введения дозы, эффективной для увеличения прочности и/или упругости одной или нескольких из костей пациента и/или для уменьшения вероятности и/или тяжести переломов
костей. Предпочтительно эффективная доза
обеспечивает улучшение структуры, массы
и/или прочности кортикального слоя костной
ткани. Предпочтительно эффективная доза
уменьшает распространенность переломов позвоночника, понижает распространенность
множественных
переломов
позвоночника,
уменьшает тяжесть перелома позвоночника
и/или уменьшает распространенность переломов, не связанных с позвоночником. Предпочтительно пациент, принимающий паратиреоидный гормон, также принимает эффективные
дозы кальция и витамина D, что может усилить
воздействие гормона. Эффективная доза паратиреоидного гормона, как правило, является
выше чем около 5 мкг/кг/день, в частности, у
людей, она может повышаться в пределах от
около 10 до около 40 мкг/кг/день или до больших значений, когда это является эффективным
для достижения повышенной прочности или
упругости, в частности, кортикального слоя костной ткани или для уменьшения распространенности перелома. Пациент, страдающий гипопаратироидизмом, может нуждаться в дополнительных или более высоких дозах паратиреоидного гормона; такой пациент также нуждается
в заместительной терапии с помощью этого
гормона. Дозы, необходимые для заместительной терапии при гипопаратироидизме, известны
в данной области. В некоторых случаях воздействия, обусловленные РТН, могут наблюдаться
при дозах, меньших, чем около 5 мкг/кг/день,
или даже меньших, чем около 1 мкг/кг/день.
Гормон может вводиться регулярно (например, один раз или несколько раз каждый
день или каждую неделю), с промежутками (например, нерегулярно в течение дня или недели)
или циклично (например, регулярно в течение
определенного периода дней или недель, за которым следует период без введения). Предпочтительно РТН вводится по одному разу в день в
течение 1-7 дней в течение периода, находяще-
003362
14
гося в пределах от 3 месяцев вплоть до 3 лет,
для пациентов, страдающих остеопорозом.
Предпочтительно, циклическое введение включает введение паратиреоидного гормона в течение, по меньшей мере, 2 циклов восстановления
и отмену введения паратиреоидного гормона в
течение, по меньшей мере, 1 цикла восстановления. Другой предпочтительный режим циклического введения включает введение паратиреоидного гормона в течение, по меньшей мере,
от около 12 до около 24 месяцев и отмену введения паратиреоидного гормона в течение, по
меньшей мере, 6 месяцев. Как правило, преимущества введения паратиреоидного гормона
продолжаются после периода введения. Преимущества от нескольких месяцев введения могут продолжаться в течение года или двух или
более без дополнительного введения.
Использования композиций паратиреоидного
гормона
Настоящее изобретение также предлагает
набор, включающий представленные фармацевтические композиции и композиции, предназначенные для использования по способам настоящего изобретения. Набор может содержать флакон, который содержит композицию по настоящему изобретению и соответствующие носители, либо в сухой, либо в жидкой форме. Набор
дополнительно включает инструкции в форме
этикетки на флаконе или/и в форме вкладки,
помещенной в коробку, в которой упакован
флакон, для использования и назначения введения соединений. Инструкции могут быть также
напечатаны на коробке, в которую упакован
флакон. Инструкции содержат информацию,
такую как подходящая дозировка, и информацию о введении, чтобы дать возможность работающему в данной области специалисту назначить лекарство. Ожидается, что специалист,
работающий в данной области, представляет
собой любого врача, медицинскую сестру или
технического работника, который может назначить лекарство.
Настоящее изобретение также относится к
фармацевтической композиции, включающей
композицию из одного или нескольких паратиреоидных гормонов, таких как РТН(1-84) человека или РТН(1-34) человека, и который является пригодным для парентерального введения.
Согласно настоящему изобретению препарат из
одного или нескольких паратиреоидных гормонов, таких как РТН(1-84) человека или РТН(134) человека, могут быть использованы для
производства композиции или лекарственного
средства, пригодного для парентерального введения. Настоящее изобретение также относится
к способам для производства композиций,
включающих препарат из одного или нескольких паратиреоидных гормонов, таких как
РТН(1-84) человека или РТН(1-34) человека, в
форме, которая является подходящей для парентерального введения. Например, жидкая или
15
твердая композиция может быть изготовлена
несколькими путями с использованием обычных технологий. Жидкая композиция может
быть изготовлена путем растворения одного или
нескольких паратиреоидных гормонов, таких
как РТН(1-84) человека или РТН(1-34) человека,
в соответствующем растворителе, таком как
вода, при соответствующем значении рН, включающем буферы или другие наполнители, например, с образованием одного из стабилизированных растворов, описанных здесь выше.
Примеры, которые следуют далее, являются иллюстрацией настоящего изобретения и не
предполагается, что они будут его ограничивать.
Примеры
Пример 1. Увеличение прочности и плотности костной ткани при введении rhPTH(1-34)
кроликам.
Экспериментальные процедуры.
Самки интактных новозеландских белых
кроликов (HRP Inc. Denver, Pa.), одних из самых
маленьких животных, которые формируют остеоны путем интракортикального восстановления, в возрасте примерно 9 месяцев и весящие
3,25-3,75 кг, сортируют по средней массе тела в
3 группы по 6 животных в каждой. Две экспериментальные группы получают биосинтетический РТН(1-34) в дозах 10 или 40 мкг/мл/кг/
день. Контрольная группа получает 1,0
мл/кг/день подкисленного 0,9М солевого раствора, содержащего 2% активированной нагревом сыворотки крови кролика. РТН(1-34) или
носитель вводят с помощью одноразовых ежедневных подкожных инъекций по 5 дней в неделю в течение 140 дней. Кроликов кормят лабораторным кормом для кроликов, содержащим
0,5% Са и 0,41% Р, и дают воду ad libitum.
Выбор доз основывается на серии предварительных исследований, показывающих, что
(1) после однократного введения РТН(1-34) при
100 мкг/кг уровень сывороточного кальция увеличивается и не возвращается к базовому уровню через 24 ч, при этом после единичной дозы в
50 мкг/кг уровень сывороточного кальция возвращается к базовому уровню в пределах 24 ч,
(2) повторяющиеся инъекции по 20 мкг/кг
РТН(1-34) приводят к временному росту уровня
сывороточного кальция с возращением к базовому уровню через 6-24 ч и (3) РТН(1-34) при
≤5 мкг/кг не изменяет гистоморфометрические
показатели поверхностей костей.
Набор двойных ализариновых меток
(Sigma, St. Louis) вводят внутримышечно при 20
мг/кг в дни 55 и 63, и набор двойных кальцеиновых меток (Sigma, St. Louis) вводят подкожно при 5 мг/кг в дни 15 и 7 перед забоем.
Кроликов подвергают анестезии с помощью
СO2 в случайной последовательности примерно
через 3-6 ч после последней инъекции, чтобы
получить кровь с помощью пункции сердца, а
затем забивают с помощью пентобарбитала на-
003362
16
трия (100 мг/кг) в виде внутрибрюшинной инъекции. Удаляют правую плечевую кость, обе
бедренные кости, поясничные позвонки (L3-L5)
и правую большеберцовую кость.
Химия крови.
Сывороточные уровни кальция, фосфата,
щелочной фосфатазы, креатинина и азота в мочевине измеряют с помощью компьютеризированного многоканального анализа сыворотки
крови.
Гистоморфометрия.
Гистоморфометрические измерения проводят на кортикальном слое костной ткани из
срединной стержневой структуры большеберцовой кости и на губчатой костной ткани из L3.
После забоя эти кости удаляют из каждого животного и фиксируют в 10% растворе формалина при нейтральном рН, полученном с помощью
добавления буфера, в течение 24 ч. Ткани обезвоживают в ряде спиртовых растворов с различными концентрациями (70-100%, 2 изменения на каждую ступень, каждая в течение 4 ч в
вакууме). Затем образцы помещают в ксилол и
инфильтрируют метилметакрилатом в вакууме
при 20 фунтах на квадратный дюйм (1240 г/см2)
по 2 ч/стадия и согласно 24-часовому графику
инфильтрации в автоматическом устройстве для
обработки Shandon Hypercenter (Shandon Lipshaw, Pittsburgh, PA). Образцы погружают в 2%
DDK-пласт с 0,2% инициатора (Delaware Diamond Knives, Wilmington. DE). Поперечные срезы больше берцовой кости нарезают с толщиной
80 мкм с использованием алмазной проволочной пилы (Delaware Diamond Knives, Inc., DE) и
окрашивают с помощью трихрома Гольднера.
Неокрашенные срезы толщиной 80 мкм обрабатывают для динамической гистоморфометрии
флюорохромных меток. Сагиттальные срезы L3
нарезают на микротоме Reichert-Jung 2050
(Magee Scientific Inc., Dexter, MI) с толщиной 5
мкм и окрашивают с помощью тетрахрома Макнила или оставляют неокрашенными для динамической гистоморфометрии.
Гистоморфометрию производят при увеличении 150х с использованием флуоресцентного микроскопа Nikon (Optiphot, Nikon, Tokyo,
Japan) и полуавтоматической системы аналогоцифрового преобразования (Bioquant IV, R&M
Biometrics, Nashville, TN). Формирование костной ткани и ее резорбция в периостальных, эндокортикальных и интракортикальных оболочках измеряется по всей площади среза среднедиафизарных срезов большеберцовой кости.
Измерения на губчатом веществе костной ткани
проводят в пределах участка площадью 6 мм2 в
центре поясничного позвонка, на расстоянии 0,5
мм от края окружающей кортикальной оболочки. Номенклатура приведена в соответствие с
гистоморфометрической
номенклатурой
ASBMR Committee (Parfitt AM, _Drezner MK,
Florieux FH, Kanis JA, Malluche H, Meunier PJ,
Ott SM, Recker RR 1987 "Bone histomor-
17
phometry: standardization of nomenclature, symbols, and units. Report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee". J.Bone
Miner. Res. 2:595-610). Динамические параметры измеряют по отношению к уровню кальцеина.
Измерения массы костной ткани.
Среднюю часть бедренной кости и четвертого поясничного позвонка в 50% этаноле/солевом растворе сканируют по поперечному
сечению с использованием количественной
компьютерной томографии (QCT или pQCT),
используя 960А pQCT и используя для анализа
программное обеспечение Dichte, версию 5.1
(Norland/Stratec, Ft. Atkinson, WI). Измеряются
параметры всей ткани, включая объемную
плотность минеральных веществ в костной ткани (vBMD, мг/см3), площадь поперечного сечения (Х-Аrеа, мм2), и содержание минеральных
веществ в костной ткани (ВМС, мг), используя
вокселы с размерами 148 × 148 × 1200 мкм.
Объем может быть вычислен путем умножения
значения Х-Аrеа на толщину среза в 1,2 мм. Целую шейку бедра из вырезанной бедренной кости в ванне из 50% этанола/солевого раствора
сканируют с использованием периферийного
поглощения рентгеновских лучей с двумя энергиями (pDEXA, Norland/Stratec). В частности,
измеряют видимую плотность минеральных
веществ в костной ткани (aBMD, г/см2), площадь проектированной поверхности (см2) и содержание минеральных веществ в костной ткани (ВМС, г) с использованием шагов сканирования 0,5 × 1,0 мм и порог 0,04.
Биомеханические исследования.
Механические свойства костей измеряются
на срединной стержневой структуре правой
бедренной кости и на теле L5. Кости иссекают,
очищают от соединительной ткани, заворачивают в марлю, смоченную изотоническим солевым раствором, и замораживают при -20°С до
начала исследований. Перед исследованиями
образцы оттаивают в течение 1-2 ч при комнатной температуре. Все образцы исследуют до
разрушения в водяной ванне с циркуляцией воды при 37°С с использованием сервогидравлического испытательного устройства MTS 810
(MTS Corp., Minneapolis, MN). Кривые
нагрузка-деформация записываются с использованием системы построения графиков измерений HP 7090A (Hewlett Packard, Camas, WA).
Предельная сила (максимальное усилие, которое
выдерживают образцы), упругость (крутизна
линейной части кривой нагрузка-деформация) и
работа до разрушения (площадь под кривой нагрузка-деформация до разрушения) измеряются
с использованием системы аналого-цифрового
преобразования (Jandel Scientific, Corte Madera,
CA). Эти параметры представляют собой структурные свойства, которые зависят от внутренних свойств материала и геометрии. Turner СН,
003362
18
Burr DB 1993 "Basic biomechanical measurements
bone: a tutorial. "Bone M:595-608. Данные нормализуют для получения внутренних свойств
материала, таких как предельное напряжение
(максимальное напряжение, которое могут выдержать образцы), модуль упругости (внутренняя упругость материала) и прочность (сопротивление на излом единичного объема), которые
не зависят от размера и формы.
Определение. Прочность бедренной кости
измеряют в средней части с использованием
трехточечного изгиба. Бедренную кость закрепляют, при этом передняя часть находится напротив приспособления для приложения нагрузки. Нагрузка прикладывается к средней
точке между двух опор, которые расположены
на расстоянии 54 мм друг от друга. Ячейка с
нагрузкой перемещается со скоростью 1 мм/с до
тех пор, пока не происходит разрушение. Для
нормализации полученных данных из кривой
нагрузка-деформация, предельное напряжение
изгиба вычисляется из предельной силы по
формуле
(1)
σf=FuLr/8I
где σf обозначает напряжение перелома при изгибе;
Fu представляет собой предельную силу;
L представляет собой длину между опорами;
r представляет собой радиус в направлении
спереди назад; и
I представляет собой момент инерции.
Определение. Значение для момента инерции вычисляется в предположении, что поперечные сечения бедренной кости являются эллиптическими.
Средняя толщина кортикального слоя костной ткани вычисляется из измерений толщины, проводимых в каждом из четырех квадрантов среза бедренной кости с помощью пары
численных калибров, с точностью до 0,01 мм и с
ошибкой ±0,005 мм (Mitutoyo, Japan).
Модуль упругости бедренной кости (Ef)
вычисляют с использованием следующего уравнения:
(2)
Ef=(упругость)⋅(L3/48I)
Прочность бедренной кости (Прочностьf)
также вычисляют с использованием следующего уравнения:
Прочностьf = 3⋅(работа до разрушения)⋅r2/LI
(3)
Для механических исследований пятого
поясничного позвонка (L5) обе концевые пластины тела позвонка отрезаются параллельно с
использованием низкооборотной пилы Buehler
Isomet (Buehler LTD, Evanston, IL). После исключения последующих процессов механическая прочность L5 измеряется при сжатии.
Сжимающая нагрузка прикладывается при
«ударном» контроле, при скорости ползунка 1
мм/с через качающуюся пластинку для корректировки непараллельного расположения лице-
19
003362
вых сторон тела позвонка. Для нормировки данных, полученных из кривой нагрузкадеформация, и для оценки внутренних свойств
материала, которые не зависят от геометрии
кости, предельное напряжение вычисляется как
предельная сила, деленная на полную площадь
поперечного сечения.
Площадь поперечного сечения (CSA) вычисляется как
CSA=πab/4
(4)
где а и b представляют собой ширину в направлениях вперед - назад и от центра - наружу соответственно.
Модуль упругости позвонка (Еv) вычисляется как
(5)
Еv=(упругость)/(CSA/h)
где h представляет собой высоту тела позвонка
в направлении от головы до хвоста.
Прочность позвонка (Прочностьv,) вычисляется как
Прочностьv=(работа до разрушения)/(CSA⋅h)
(6)
Акустическая микроскопия.
Поперечные срезы толщиной 500-мкм вырезают из средней части диафиза правой плечевой кости с использованием алмазной проволочной пилы. Точная толщина каждого образца
измеряется с использованием микрометра (Mitutoyo, Japan) с разрешением 1 мкм. Измерения
скорости звука проводятся с использованием
сканирующего акустического микроскопа (UH3,
Olympus, Japan) с помощью способа, описанного ранее Hasegawa К, Turner CH, Recker RR, Wu
E, Burr DB 1995 "Elastic properties of osteoporotic
bone measured by scanning acoustic microscopy",
Bone 16:85-90. Используя эту методику, могут
быть проведены детальные измерения внутренних механических свойств в заданной фокальной точке. 50 МГц преобразователь (V-390,
Panametrics, Waltham, MA) используют для генерации акустических волн в импульсно-эховом
режиме. 50 МГц линза дает акустический луч
диаметром примерно 60 мкм. Образцы закрепляют на дне камеры, заполненной водой при
постоянной температуре (22°С). Время задержки между акустическими волнами, отраженными от верхней части образцов, и волнами, отраженными от нижней части образцов, измеряют с
использованием цифрового осциллографа (TDS
620, Tektronix, Beaverton, OR). Времена задержки измеряются в пяти различных позициях, так
что каждая позиция находится на расстоянии,
большем, чем 300 мкм от других позиций направленного наружу кортикального слоя плечевой кости. Скорость звука вычисляется как удвоенная толщина образцов, деленная на среднее
время задержки. Влажную массу (Ww) и массу в
погруженном состоянии (Ws) в 100% этиловом
спирте измеряют с использованием весов
(AJ100, Mettler Instrument Corp., Heightstown,
NJ). Влажную плотность (ρ) вычисляют с использованием закона Архимеда:
20
(7)
ρ={(Ww/(Ww-Ws)}⋅ρЕТОН
где ρЕТОН представляет собой плотность спирта (0,789 г/см3).
Предполагая, что путь акустической волны
в костной ткани является однородным, вычисляется коэффициент упругости (С), представляющий собой внутреннюю упругость образцов:
(8)
C=ρ⋅v2
где ρ представляет собой влажную плотность; и
v представляет собой скорость звука.
Статистический анализ.
Анализ по Бартлету используют для исследования гомогенности разброса. Если разброс является гомогенным, применяют односторонние тесты ANOVA с PLSD по Фишеру
для апостериорного сравнения. Когда разброс
не является гомогенным, используют непараметрический анализ разброса Крускала-Уоллиса
с апостериорным анализом, использующим Uтесты Манна-Уитни. Статическую значимость
приписывают при р<0,05. Результаты представляют как среднее ±SEM.
Результаты
Масса тела и биохимия.
Кролики, пролеченные носителем РТН(134) при 10 мг/кг/день, демонстрируют незначительные увеличения массы тела в течение 140
дней. Кролики, получавшие РТН(1-34) при 40
мкг/кг/день, проявляют небольшое увеличение
массы тела в 51 г, представляющие собой 1,4 ±
1,6% потери массы тела во время эксперимента
(табл. 1). Измеренные значения сывороточных
показателей находятся в пределах нормальной
физиологической реакции для кроликов, хотя и
замечены небольшие увеличения уровня кальция и азота мочевины в сыворотке. Уровень
сывороточной щелочной фосфатазы увеличивается в два раза при более высокой дозе РТН(134) (табл. 2).
Таблица 1
Воздействия РТН(1-34) на массу тела
Контроль
PTH(1-34) 10 PTH(1-34) 40
мкг/кг/день мкг/кг/день
Начальная масса
3,42±0,08
3,43±0,08
3,42±0,08
тела, кг
Конечная масса
3,70±0,05
3,51±0,05
3,37±0,10
тела, кг
Увеличение массы
0,26±0,09
0,09±0,05
-0,05±0,05*
тела, кг
Данные представлены как среднее ±SEM для 6 кроликов на группу.
*Р<0,05 по сравнению с контролем
Таблица 2
Воздействия РТН(1-34) на химию сыворотки крови
Контроль
РТН(1-34) 10 PTH(1-34) 40
мкг/кг/день мкг/кг/день
12,6±0,2
13,5±0,3*
4,7±0,2
5,5±0,3
Кальций, мг/дл
12,1±0,3
Фосфат, мг/дл
4,70±0,2
Щелочная фосфа24,7±4,1
41,0±8,1
таза, и.е./л
Креатинин, мг/дл
1,6±0,1
1,9±0,1
Азот мочевины,
18,3±0,3
18,1±0,8
мг/дл
Данные представлены как среднее ±SEM
ликов на группу.
*Р<0,05 по сравнению с контролем.
49,8±7,1*
1,8±0,1
23,9±1,9
для 6 кро-
21
Гистоморфометрия.
Формирование костной ткани на периостальной (Ps.MS/BS) и эндокортикальной
(Ec.MS/BS) поверхностях срединной стержневой структуры большеберцовой кости у пролеченных РТН(1-34) групп возрастает (табл. 3).
Ps.MS/BS у группы с более высокой дозой значительно больше, чем у других 2 групп
(р<0,001), и Ec.MS/BS у группы с более высокой
дозой значительно больше, чем у контрольной
группы (р<0,05). В соответствии с увеличением
уровня сывороточной щелочной фосфатазы,
скорости формирования костной ткани на каждой поверхности (Ps.BFR/BS и Ec.BFR/BS) гораздо выше у группы с более высокой дозой,
чем у других 2 групп (р<0,05). Скорость аппозиции минеральных веществ (MAR) не изменяется ни на периостальной, ни на эндокортикальной оболочке.
Интракортикально, количество областей
резорбции (Rs.N/Ct.Ar) у кроликов, которым
давали РТН(1-34) при 40 мкг/кг/день, значительно, в 7 раз, больше, чем у других 2 групп
(р<0,05) (табл. 4). Количество меченых остеонов
(L.On.N/Ct.Ar) у кроликов, которым давали
РТН(1-34) при 40 мкг/кг/день, также значительно возрастает по сравнению с другими 2 группами (р<0,01 по сравнению с контрольной группой, р<0,05 по сравнению с группой, получающей 10 мкг/кг/день). MAR является значительно
большим у обеих пролеченных групп, чем у
контрольной группы (р<0,01), но не существует
значительной разницы между группами, пролеченными РТН. Скорость формирования костной
003362
22
ткани (BFR/BV) и частота активаций (Ac.F) возрастает (р<0,05 и р<0,01 соответственно) при
обеих дозах.
Хотя площадь поверхности костной ткани
(В.Аг) увеличивается при обеих дозах, значительная разница обнаружена только между
группой с более высокой дозой и контрольной
группой (р<0,01). Площадь поверхности костного мозга (Ма.Аr) уменьшается после лечения, но
не различается значительно для всех трех групп.
Однако площадь поверхности кортикального
слоя (Ct.Ar) у группы с более высокой дозой
является значительно большей, чем у других 2
групп (р<0,0001 по сравнению с контрольной
группой, р<0,05 по сравнению с группой с
меньшей дозой). Ct.Ar у группы с более низкой
дозой также является значительно более высокой, чем у контроля (р<0,05). Подобные результаты обнаружены и для % Ct.Ar.
Пористость кортикального слоя (Ct.Po) у
кроликов, которым давали РТН(1-34) при 10
мкг/кг/день, вдвое больше, чем у контрольной
группы (р<0,05), в то время как Ct.Po у кроликов, которым давали РТН(1-34) при 40
мкг/кг/день, в 6 раз больше, чем у контрольной
группы (р<0,01). Однако пористый слой находится в эндокортикальном отделе и, при таком
расположении является маловероятным, что он
вносит какой-либо вклад в биомеханическую
прочность, поскольку РТН также увеличивает
площадь поверхности кортикального слоя костной ткани, что согласуется с увеличением поперечного момента инерции.
Таблица 3
Воздействия РТН(1-34) на периостальное и эндокортикальное восстановление костной ткани в срединной стержневой структуре большеберцовой кости
Параметры
РТН(1-34)
РТН(1-34)
Аббревиатура
Контроль
10 мкг/кг/день
40 мкг/кг/день
Поверхность эндокортикальEc.OS/BS(%)
8,8±6,0
13,7±10,5
20,2±5,8
ного остеоида
Толщина эндокортикального
Ec.O.Th (мкм)
7,4±2,4
3,7±2,3
8,1±0,9
остеоида
Скорость периостальной аппоPs.MAR (мкм/день)
0,33±0,17
0,38±0,08
0,66±0,14
зиции минеральных веществ
Скорость эндокортикальной
аппозиции минеральных веЕc.MAR (мкм/день)
1,33±0,22
0,79±0,16
1,32±0,15
ществ
Периостальная поверхность
Ps.MS/BS (%)
3,8±1,9
8,2±2,1
22,3±2,7*I
минерализации
Эндокортикальная поверхность
Ec.MS/BS(%)
26,4±6,6
32,6±8,2
57,7±10,4*I
минерализации
Скорость периостального форPs.BFR/BS
0,02±0,02
0,03±0,01
0,16±0,05*I
мирования костной ткани
мкм3/мкм2 /год
Скорость эндокортикального
Ec.BFR/BS
0,40±0,10
0,31±0,10
0,72±0,12*I
формирования костной ткани
мкм3/мкм2/год
Данные представлены как среднее ±SEM для 6 кроликов на группу.
*Р<0,05 по сравнению с контролем.
I
Р<0,05 по сравнению с РТН(1-34) при 10 мкг/кг/день.
23
003362
24
Таблица 4
Воздействия РТН(1-34) на интракортикальное восстановление костной ткани в срединной стержневой
структуре большеберцовой кости
PTH(1-34)
PTH(1-34)
Параметры
Аббревиатура
Контроль
10 мкг/кг/день
40 мкг/кг/день
Количество областей резорбции Rs.N/Ct.Ar (#/mm2) 0,014±0,013
0,013±0,004
0,097±0,036*I
Количество меченых остеонов
L.On.N/Ct.Ar
0,011±0,006
0,027±0,006
0,215±0,094*I
(#/mm2)
Толщина остеоида
O.Th (мкм)
4,92±0,59
5,42±0,30
5,16±0,27
Скорость аппозиции минеральMAR (мкм/день)
1,19±0,20
1,56±0,13*
1,60±0,12*
ных веществ
Скорость формирования костBFR/BV (%/год)
0,5±0,3
8,5±2,9*
21,4±3,8*
ной ткани
Частота активаций
Ac.F (#/mm2/год)
1,8±1,0
15,1±5,0*
43,8±10,5*I
Площадь поверхности костной
29,1±1,3
33,3±1,9
37,8±2,7*
B.Ar(mm2)
ткани
Площадь поверхности костного
Ma.Ar(mm2)
12,7±0,7
11,9±1,0
10,7±1,0
мозга
Площадь поверхности корти16,4±0,9
21,3±1,2*
27,1±2,0*I
Ct.Ar(mm2)
кального слоя
Процент площади поверхности
%Ct.Ar(%)
56,4±1,5
64,2±1,6*
71,6±1,5*I
кортикального слоя
Данные представлены как среднее ±SEM для 6 кроликов на группу.
*Р<0,05 по сравнению с контролем.
I
P<0,05 по сравнению с РТН(1-34) при 10 мкг/кг/день.
Таблица 5
Воздействия РТН(1-34) на восстановление губчатой костной ткани третьего поясничного позвонка
PTH(1-34)
PTH(1-34)
Параметры
Аббревиатура
Контроль
10 мкг/кг/день
40 мкг/кг/день
Объем костной ткани
BV/TV (%)
27,5±1,4
30,5±3,4
27,9±3,2
Толщина губчатого слоя
Tb.Th (мкм)
124,8±7,3
147,4±3,4
27,9±3,2
Разрушенная поверхность
ES/BS (%)
0,5±0,3
1,4±0,3
2,6±0,7*
Поверхность остеокластов
Oc.S/BS (%)
0,4±0,2
0,9±0,3
1,3±0,3
Поверхность остеоидной ткани
OS/BS (%)
5,2±1,3
7,2±1,2
27,7±3,8*I
Поверхность остеобластов
Ob.S/BS (%)
1,4±0,6
1,3±0,6
15,3±5,6*I
Толщина слоя остеоидов
O.Th (мкм)
5,2±0,5
5,3±0,5
4,4±0,2
Объем остеоидов
OV/TV (%)
0,10±0,02
0,13±0,03
0,46±0,07*I
Скорость аппозиции минеральMAR (мкм/день)
1,3±0,2
1,5±0,1
1,7±0,1
ных веществ
Поверхность минерализации
MS/BS (%)
4,4±1,4
4,7±1,9
24,2±1,5*I
Скорость формирования костBFR/BS
19,7±5,3
38,5±8,9
153±15,6*I
ной ткани
(мкм3/мкм2/год)
Данные представлены как среднее ± SEM для 6 кроликов на группу.
*Р<0,05 по сравнению с контролем.
I
Р<0,05 по сравнению с РТН(1-34) при 10 мкг/кг/день.
В губчатой костной ткани большинство
параметров, характеризующих формирование
(OS/BS, Ob.S/BS, OV/TV, и MS/BS), возрастают
при лечении РТН(1-34) (табл. 5). Те из кроликов, которым давали РТН(1-34) при 40
мкг/кг/день, имели все параметры, значительно
превышающие параметры других 2 групп
(р<0,01 по сравнению как с контрольной группой, так и с группой, получающей 10
мкг/кг/день, по всем параметрам). Скорость
формирования костной ткани (BFR/BS) также
значительно возрастает у кроликов, которым
давали РТН(1-34) при 40 мкг/кг/день, по сравнению с другими 2 группами (р<0,0001 по срав-
нению как с контрольной группой, так и с группой, получающей 10 мкг/кг/день). Хотя резорбция (ES/BS и Oc.S/BS) возрастает у обеих пролеченных РТН(1-34) групп, только (ES/BS) у
группы с более высокой дозой разрушенная поверхность становится значительно большей, чем
у контрольной группы (р<0,001). Не существует
разницы в толщине остеоидного слоя (O.Th)
среди всех трех групп. Несмотря на доказательство ускоренного метаболизма костной ткани,
доля объема костной ткани (BV/TV) не изменяется после лечения РТН(1-34). Туннелизованная
резорбция и перитрабекулярный фиброз не наблюдаются ни в одной из групп.
25
Измерения массы костной ткани.
vBMD и ВМС в средней части бедренной
кости, оцениваемые с помощью pQCT в группе,
получающей 40 мкг /кг/день, являются значительно более высокими, чем у других 2 групп
(р<0,001 по vBMD и р<0,0001 по ВМС по сравнению с контрольной группой, р<0,05 по vBMD
и р<0,01 по ВМС по сравнению с группой с более низкой дозой) (фиг. 1А). vBMD и ВМС в
группе, получающей 10 мкг/кг/день, также являются значительно более высокими, чем в контрольной группе (р<0,05 как по vBMD, так и по
ВМС). Хотя площадь поверхности костной ткани в средней части бедренной кости также увеличивается в зависимости от дозы, значительно
она увеличивается только в группе, получающей 40 мкг/кг/день (р<0,05).
aBMD и ВМС в проксимальной части бедренной кости, измеренные с помощью измерения поглощения рентгеновских лучей на двух
длинах волн (DXA или pDXA), увеличиваются в
зависимости от дозы. Значительные отличия
присутствуют как в aBMD, так и в ВМС между
контрольной группой и группой, получающей
10 мкг/кг/день (р<0,05), а также между контрольной группой и группой, получающей 40
мкг/кг/день (р<0,001) (фиг. 1В). Не обнаружено
каких-либо значительных различий в площади
кости среди всех трех групп.
В среднем, фиг. 1 показывает, что BMD
(плотность минеральных веществ в костной
ткани) и ВМС (содержание минеральных веществ в костной ткани) в срединной стержневой
структуре бедренной кости (кортикальная костная ткань) (А) и в проксимальной части бедренной кости (губчатая костная ткань + кортикальная костная ткань) (В) являются значительно
более высокими у животных, пролеченных РТН
при обеих дозах, чем у контроля. Площадь поверхности кортикального слоя костной ткани в
срединной стержневой структуре бедренной
кости кроликов, пролеченных при более высокой дозе, является значительно более высокой,
чем у контроля. Не было замечено никаких значительных различий между группами по площади поверхности костной ткани проксимальной части бедренной кости. Данные представлены как среднее ±SEM. *Р<0,05 по сравнению
с контролем.IР<0,05 по сравнению с РТН при 10
мкг/кг/день.
Нет никаких значительных различий между группами по vBMD, BMC или площади поверхности костной ткани у поясничного позвонка (L4) при оценке с помощью pQCT, среди всех
трех групп.
Биомеханическое исследование.
Структурные свойства срединной стержневой структуры бедренной кости, такие как
предельная сила, упругость и работа до разрушения, увеличиваются в зависимости от дозы
(фиг. 2). Фиг. 2 показывает воздействия РТН на
механическую прочность и поперечный момент
003362
26
инерции (CSMI) кортикальной костной ткани в
срединной стержневой структуре бедренной
кости. Структурные механические свойства
(заштрихованные столбики) и CSMI значительно возрастают у группы, получавшей более высокую дозу, в то время как упругость значительно возрастает также у группы, получавшей
более низкую дозу. Из внутренних свойств материала (темные столбики), только модуль упругости значительно увеличивается в группе,
получавшей более низкую дозу, по сравнению с
контролем. Модуль упругости в группе, получавшей более высокую дозу, значительно увеличивается по сравнению с группой, получавшей более низкую дозу. На фиг. 2 данные представлены как среднее ± SEM. * указывает
Р<0,05 по сравнению с контролем; и I указывает
Р<0,05 по сравнению с 10 мкг/кг/день.
В этом исследовании и у результатов,
представленных на фиг. 2, все параметры являются значительно более высокими у кроликов,
которым давали РТН(1-34) при 40 мкг/кг/день,
чем у контрольной группы (р<0,01 для предельной силы и работы до разрушения, р<0,05 для
упругости). Упругость в группе, получавшей
более низкую дозу, также является значительно
более высокой, чем у контрольной группы
(р<0,05). Из внутренних свойств материала, модуль упругости является значительно меньшим
у кроликов, которым давали 40 мкг/кг/день, чем
у тех, которым давали 10 мкг/кг/день (р<0,01).
В теле поясничного позвонка не обнаружено каких-либо значительных различий по
механическим свойствам среди всех трех групп.
Акустическая микроскопия.
Не существует каких-либо различий в скорости звука или по коэффициенту упругости для
всех трех групп.
Обсуждение.
Реакция кортикальной костной ткани скелета на биосинтетический hPTH(1-34) включает
как прямую регуляцию свойств материала, так и
компенсаторную регуляцию биомеханических
свойств длинных костей у интактных взрослых
самок кроликов. РТН(1-34) увеличивает метаболизм костной ткани и пористость кортикального
слоя и при дозе 40 мкг/кг уменьшает модуль
упругости материала кортикальной костной
ткани. Однако уменьшение модуля упругости
более чем компенсируется путем увеличения
отложения костной ткани на периостальной и
эндокортикальной поверхностях, что приводит
к значительному улучшению структурной прочности, упругости и работы до разрушения кортикальной костной ткани у кроликов.
В этих исследованиях с использованием
интактных кроликов, объем губчатой ткани поясничного позвонка не изменяется после лечения РТН(1-34), несмотря на доказательства увеличения метаболизма костной ткани. Использование в прошлом в качестве модели нарушения
остеогенеза, присутствия интракортикального
27
восстановления и короткого периода восстановления, вместе с быстрым ростом кроликов и
ранним созреванием скелета (к 6-9 месяцам),
составляют основу для выбора кролика в качестве модели, на которой могут исследоваться
воздействия РТН(1-34), вводимого с перерывами.
Кролики могут проявлять широкий разброс сывороточных уровней кальция (10-16
мг/дл), но эти уровни не зависят непосредственно от количества кальция в корме, что является
другим преимуществом модели. Хотя временные значительные повышения, примерно 1
мг/мл, зарегистрированы у кроликов, пролеченных РТН(1-34) при 40 мкг/кг, реальные значения всегда находились в известном физиологическом диапазоне.
В настоящем исследовании биосинтетический hPTH(1-34) в течение 140 дней увеличивает скорость формирования костной ткани интракортикально, а также на периостальной и
эндокортикальной поверхностях. Интракортикальные значения Ac.F увеличиваются в группе,
получавшей более низкую дозу, в 8 раз, и в
группе, получавшей более высокую дозу, в 20
раз. Это ведет к 2-кратному увеличению пористости кортикальной костной ткани в большеберцовой кости в группе, получавшей более
низкую дозу, и к 6-кратному увеличению в
группе, получавшей более высокую дозу. Данные акустической микроскопии показывают,
что упругие свойства самого материала костной
ткани в плечевой кости остаются без изменений,
указывая на то, что внутреннее качество кортикальной костной ткани является нормальным.
Следовательно, увеличение пористости должно
учитываться при небольшом уменьшении модуля упругости при измерениях свойств материала, который включает участки в кортикальном
слое костной ткани.
Однако увеличение пористости кортикальной костной ткани более чем компенсируется
из-за значительного увеличения MS/BS и
BFR/BS, как на периостальной, так и эндокортикальных поверхностях в срединной стержневой структуре большеберцовой кости в группе,
получавшей более высокую дозу, что приводит
к значительному увеличению площади поверхности костной ткани. Это будет увеличивать
поперечный момент инерции, который пропорционален изгибной жесткости кости, как происходит в срединной стержневой структуре бедренной кости (фиг. 2). Следствием этих изменений в форме и свойствах материала является
улучшение механической прочности и упругости диафиза бедренной кости по сравнению с
контролем, тем самым, компенсируются потенциально вредные механические эффекты увеличения пористости кортикальной костной ткани.
Вывод.
В качестве вывода, увеличение метаболизма костной ткани и пористости кортикальной
003362
28
костной ткани после лечения РТН(1-34) сопровождается сопутствующим увеличением кости
на периостальной и эндокортикальной поверхностях. Сочетание этих явлений приводит к
увеличению прочности, предельного напряжения, упругости и работы до разрушения бедренной кости.
Пример 2. Увеличение прочности и плотности костей при введении rhPTH(1-34) обезьянам.
Экспериментальные процедуры
Общая часть.
Фаза исследований на живых объектах использует диких, взрослых (закрытые ростовые
пластинки) приматов циномолгус (Масаса fascicularis), весящих 2,77±0,03 кг (среднее ± стандартное отклонение от среднего [SEM]). Обезьян выдерживают на карантине в течение 3 месяцев, затем содержат на диете, включающей 0,3%
кальция, 0,3% фосфата и 250 ME, витамина
D3/100 г диеты и дают фторированную воду (1
миллионная доля фторида) ad libitum. Содержание кальция соответствует 1734 мг кальция/2000
калорий. Через 1 месяц диеты животных сортируют по группам из 21 или 22, подвергают ложной операции или овариэктомии. Ежедневные
однократные подкожные инъекции носителя
(контроль после ложной операции и овариэктомии) или rhPTH(1-34), при 1 мкг/кг (РТН1) или
5 мкг/кг (РТН5), начинаются через 24 ч после
овариэктомии. Животных лечат либо в течение
18 месяцев (РТН1 и РТН5), либо в течение 12
месяцев с последующей отменой лечения
(PTH1-W и РТН5-W).
Исследуемые группы разделяются так, как
показано в табл. 6.
Таблица 6
Исследуемые группы для исследования на приматах
Группа
Ложная овариэктомия, 18 месяцев,
носитель
Овариэктомия 18
месяцев, носитель
Овариэктомия 18
месяцев, 1 мкг
rhPTH(1-34)/
кг/день
Овариэктомия 12
месяцев, 1 мкг
rhPTH(1-34)/
кг/день, 6 месяцев,
носитель
Овариэктомия 18
месяцев, 5 мкг
rhPTH(1-34)/
кг/день
Овариэктомия 12
месяцев, 5 мкг
rhPTH(1-34)/кг/
день, 6 месяцев,
носитель
Аббревиатура
Обезьяны
Обезьяны
при конечв начале
ном анали(n=128)
зе (n=121)
Ложный
21
21
OVX
22
20
РТН1
21
19
PTH1-W
21
20
РТН5
22
21
PTH5-W
21
20
29
Образцы крови и мочи отбирают в течение
24 ч после инъекции носителя или rhPTH(1-34) с
3-месячными интервалами. Случайную выборку
из 5 обезьян в каждой пролеченной rhPTH(1-34)
группе используют для изучения фармакокинетики с выборочными исследованиями (занимающими от 0 до 240 мин каждый раз) на базовом уровне, на 1, 11 и 17 месяце. В момент времени 0 и через 6-месячные интервалы исследуют массу костной ткани скелета в целом и позвоночника (от L-2 до L-4) с помощью измерения поглощения рентгеновских лучей с двумя
различными энергиями (DXA); периферийная
количественная компьютерная рентгеновская
томография (pQCT) используется для оценок
массы костной ткани в средней части и в дистальной части лучевой кости, и в проксимальной части большеберцовой кости. Биопсии подвздошной кости берут на 6 и 15 месяце для гистоморфометрии. Всех животных подвергают
эвтаназии через 18 месяцев.
Биомеханические тесты проводятся на поясничных позвонках от L-3 до L-4, на шейке
бедра, на средней части плечевой кости и на
образце кортикальной костной ткани, выточенной из диафиза бедренной кости (измеренные
значения определены в табл. 7). Обычные статические и динамические гистоморфометрические исследования осуществляют (измеренные
значения описаны в табл. 11) на средней части
плечевой кости, на поясничном позвонке L-2, на
шейке бедра, на средней части бедренной кости,
на средней части лучевой кости и на дистальной
части лучевой кости. Начальные статистические
анализы сравнивают все группы с контрольными группами, пролеченными носителем, подвергнутыми овариэктомии. Данные являются
пригодными для дополнительного диагностического анализа с целью исследования зависимости от дозы, эффектов отмены лечения, взаимодействий между различными эффектами и изменений со временем с помощью методов, известных специалистам в данной области. Все
исследования проводятся и определяются с помощью методов, известных специалистам в
данной области.
Для определенных объектов эксперимента,
кортикальная костная ткань из плечевой кости
исследуется с помощью гистоморфометрии и с
помощью поляризационной инфракрасной Фурье-микроскопии.
Инфракрасная Фурье-микроскопия проводится с помощью адаптации известных методов
для такой микроскопии.
Модельные исследования с помощью
трехмерного метода конечных элементов.
Эти исследования определяют данные моделирования с помощью трехмерного метода
конечных элементов по позвонкам обезьян из
исследования с введением РТН в течение 18
месяцев. Иссеченные позвонки L-5 в растворе
50% этанола/солевого раствора из подвергнутых
003362
30
овариэктомии (n=7) и пролеченных РТН (n=7)
групп последовательно сканируются с шагом по
500 мкм с помощью количественной компьютерной томографии (QCT, Norland, Ft. Atkinson,
WI), с использованием пикселов 70×70 мкм.
Каждый из 500 мкм поперечных срезов анализируют на объемную плотность минеральных
веществ в костной ткани (BMD, мг/см3), содержание минеральных веществ в костной ткани
(ВМС, мг), площадь поперечного сечения (ХАrеа), объем губчатой костной ткани (BV/TV),
толщину губчатого слоя (Tb.Th) и связность
(плотность узелков, анализ связей). Пикселы в
каждом последовательном сканировании усредняются с образованием вокселов - объемных
элементов 90×490×500 мкм. Результаты последовательных сканирований затем собирают и
генерируют треугольную поверхностную сетку
для каждой кости с использованием алгоритма
"marching cubes" (см., например, Lorensen и
Cline 1987 "Marching cubes, a high resolution 3D
surface construction algorithm." Computer Graphics 21, 163-169). Сглаженная версия каждой поверхностной сетки затем используется для генерирования тетраэдральной сетки для моделирования с помощью трехмерного метода конечных
элементов.
Модуль Юнга для каждого тетраэдрального элемента получают из исходной плотности
вокселов и свойств материала из цилиндра из
кортикальной костной ткани, полученного вытачиванием из диафиза бедренной кости обезьян. Каждая тетраэдральная сетка поворачивается таким образом, чтобы нижняя поверхность
каждого позвонка выровнялась с плоскостью.
Затем производят анализ линейных упругих
напряжений для модели каждого L-5, в котором
распределенная нагрузка 100 Н прикладывается
к центру верхней поверхности, перпендикулярно к нижней плоскости, в то время как нижняя
поверхность фиксируется в направлении нагрузки. Получающиеся аксиальные распределения деформаций оцениваются как представляющие собой распределения BMD, и производится сравнение между группами, пролеченными РТН и подвергнутыми овариэктомии. При
этом разрешении плотность каждого воксела
зависит от степени, до которой каждый воксел
заполнен костной тканью в противоположность
мягкой ткани.
Результаты.
Данные о различиях в тексте являются статистически значимыми р<0,05. Все животные
набирают от 4 до 9% от начальной массы тела
во время исследований, независимо от лечения.
Измерения в крови и в моче.
Сывороточные уровни эстрадиола на 3 и
18 месяце составляют меньше 5 пг/мл у всех
подвергнутых овариэктомии обезьян. Когда измеренные значения гомеостаза кальция сравнивают с подвергнутыми ложным операциям кон-
31
трольными животными, подвергнутые овариэктомии контрольные животные имеют более низкие сывороточные уровни кальция и фосфата и
1,25-дигидроксивитамина D, но не отличаются
по уровням эндогенного РТН, циклического
аденозинмоно-фосфата (цАМФ) в моче, кальция
в моче, креатинина в моче или сывороточного
азота мочевины, измеренным через 24 ч после
последнего введения. Животные, пролеченные
rhPTH(l-34), имеют более низкий уровень сывороточного фосфата, более низкий уровень эндогенного РТН и более высокие уровни 1,25дигидроксивитамина D и цАМФ в моче по
сравнению с животными, подвергнутыми овариэктомии. Исследования сывороточных уровней маркера формирования костной ткани показывают, что подвергнутые овариэктомии обезьяны имеют низкий общий сывороточный уровень щелочной фосфатазы (ALP) и остеокальцина по сравнению с животными, подвергнутыми ложной операции, и rhPTH(l-34) возвращает
уровни назад к значениям для животных, подвергнутых ложный операции. Экскреция Стелопептида в моче (CrossLaps), которую используют как биохимический маркер резорбции
костной ткани, не изменяется под действием
rhPTH(l-34) по сравнению с контрольными животными, подвергнутыми овариэктомии.
Масса костной ткани.
Общая масса костной ткани скелета, представленная как общее ВМС тела, существенно
увеличивается под действием РТН(1-34) (фиг.
3). Плотность минерального вещества в костях
позвоночника (BMD) остается стабильной у
подвергнутых овариэктомии контрольных животных в течение 18 месяцев, в то время как
подвергнутые ложной операции контрольные
животные прибавляют примерно 5% по сравнению с базовым уровнем (фиг. 4А-4С и 5А).
rhPTH(1-34) увеличивает BMD позвоночника на
7-14%, а содержание минеральных веществ во
всем теле (ВМС, фиг. 3) вплоть до 6% по сравнению с базовым уровнем (фиг. 4А-4С и 5А).
003362
32
Содержание минеральных веществ в костях позвоночника также увеличивается (фиг. 5А). У
приматов, пролеченных rhPTH(1-34), величина
этого увеличения является значительно большей, чем у подвергнутых овариэктомии контрольных животных, и сравнима с (РТН1) или
превосходит (РТН5) эти уровни для животных,
подвергнутых ложной операции. rhPTH(1-34) не
изменяет BMD срединной стержневой или дистальной структуры лучевой кости. Площадь
поперечного сечения срединной стержневой
структуры увеличивается на 7% в группе, пролеченной РТН5. В проксимальной части большеберцовой кости нет увеличения площади поперечного сечения, но rhPTH(1-34) увеличивает
ВМС и BMD по сравнению с подвергнутыми
овариэктомии контрольными животными. Через
шесть месяцев после отмены лечения, BMD и
ВМС в позвоночнике и в шейке бедра остаются
более высокими, чем у подвергнутых овариэктомии контрольных животных, при этом без
изменений в кортикальном слое срединной
стержневой структуры плечевой кости.
Прочность костей.
rhPTH(1-34) увеличивает прочность (Fy) у
позвонков вплоть до 43% (табл. 7 и 8, фиг. 5В).
rhPTH(1-34) улучшает прочность шейки бедра
(fu) вплоть до 12% (табл. 7 и 9, фиг. 6А).
rhPTH(1-34) не изменяет измеренных значений
в кортикальном слое диафиза срединной стержневой структуры плечевой кости (табл. 7 и 10)
или свойства материалов цилиндрических образцов, изготовленных из диафиза бедренной
кости (табл. 7 и 9, фиг. 6В), по сравнению с
подвергнутыми овариэктомии контрольными
животными.
У
животных,
пролеченных
rhPTH(1-34) в течение 12 месяцев, с последующей отменой лечения в течение 6 месяцев, измеренные значения прочности костей остаются
значительно более высокими, чем у подвергнутых овариэктомии контрольных животных
(табл. 7-10, фиг. 5В и 6А).
Таблица 7
Переменные, регистрируемые для третьего и четвертого поясничных позвонков (L-3 и L-4), срединной
стержневой структуры плечевой кости, проксимальной части шейки бедра и цилиндрических образцов
бедренной кости
Переменная
Единицы
Описание
Поясничные позвонки, L-3 и L-4
А
мм2
Площадь поперечного сечения
Выходная сила представляет собой силу за вычетом
Fy
Н
0,2%
Крутизна линейной части на кривой сила-смещение
S
Н/мм
(упругость)
Выходное напряжение
МПа
σν
Е
МПа
Модуль Юнга
Срединная стержневая структура
плечевой кости
t
мм
Средняя толщина кортикального слоя
33
003362
Fu
Н
S
Н/мм
мдж/Е
Н-мм
34
Предельная сила представляет собой максимальную
силу, которую образец может выдержать
Крутизна линейной части на кривой сила-смещение
(упругость), здесь - упругость
Площадь под кривой нагрузка - смещение (Е = работа до разрушения)
Проксимальная часть шейки бедра
Fu
Цилиндр. образцы из диафиза бедренной кости бедренной кости
σu
Е
u
εu
Н
МПа
ГПа
Дж/м3
Предельная сила представляет собой максимальную
силу, которую образец может выдержать
Предельное напряжение
Модуль Юнга
Прочность
Предельная деформация
Таблица 8
Биомеханические измерения прочности позвоночника (поясничные позвонки, объединенные L-3 и L-4)
подвергнутых овариэктомии приматов на 18 месяце
Переменная
Ложный
Контроль OVX
РТН1
PTH1-W
РТН5
PTH5-W
(единицы)a
А (мм2)
90,5±2,1b
86,7±2,3
88,3±2,0
90,9±2,3
87,3±2,7
82,8±2,1
Fy(H)
1738±52
1499±94s
1915±105°
1899±73°
2113±77 s°
1792±59°
7401±452°
8012±367°
7074±314°
S (Н/мм)
7312±319
5805±476s
7701±474°
19,4±0,6
17,3±1,0
21,9±1,3°
21,1±0,8°
24,6±1,1 s°
21,9±0,9°
σy (МПа)
Е (МПа)
650±32
546±49
717±48°
659±42
698±41°
759±36°
Аббревиатуры: ОVХ=подвергнутые овариэктомии; PTH1=rhPTH(1-34) 1 мкг/кг в течение 18 месяцев;
PTH1-W=отмена в течение 6 месяцев после лечения rhPTH(1-34) 1 мкг/кг в течение 12 месяцев;
PTH5=rhPTH(1-34) 5 мкг/кг в течение 18 месяцев; РТН5-W=отмена в течение 6 месяцев после лечения
rhPTH(1-34) 5 мкг/кг в течение 12 месяцев
а
См. табл. 4,1 для описания переменных
b
Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение от среднего (SEM) на группу
° Статистически значимые по сравнению с контролями OVX (р<0,05)
s
° Статистически значимые по сравнению с ложными контролями (р<0,05)
Таблица 9
Биомеханические измерения свойств материалов цилиндрических образцов эквивалентного размера из
диафиза бедренной кости и биомеханическое измерение прочности шейки бедра подвергнутых овариэктомии приматов на 18 месяце
Контрольный
Переменная
РТН1
PTH1-W
РТН5
PTH5-W
Ложный
OVX
(единицы)а
222±5°
216±5
222±4
214±6
2063±6
208±6
σu (МПа)
Е (ГПа)
17,2±0,6
16,4±0,4
17,1±0,4
16,6±0,6
15,4±0,6s
15,3±0,6s
u (мдж/м3)
5,9±0,3
5,8±0,4
6,1±0,4
5,5±0,4
5,4±0,4
6,1±0,4
0,035±0,001
0,035±0,002
0,036±0,002 0,034±0,002 0,034±0,002 0,038±0,002
εu
Верхняя шейка
бедра
Fu
1288±41
1105±53s
1235±45°
1258±52°
1362±30°
1213±42
Аббревиатуры: ОVХ=подвергнутые овариэктомии; PTHl=rhPTH(1-34) 1 мкг/кг в течение 18 месяцев
PTH1-W=отмена в течение 6 месяцев после лечения rhPTH(1-34) 1 мкг/кг в течение 12 месяцев;
PTH5=rhPTH(1-34) 5 мкг/кг в течение 18 месяцев; РТН5-W=отмена в течение 6 месяцев после лечения
rhPTH(1-34) 5 мкг/кг в течение 12 месяцев
а
См. табл. 4,1 для описания переменных.
b
Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение от среднего (SEM) на группу
° Статистически значимые по сравнению с контролями OVX (р<0,05)
s
° Статистически значимые по сравнению с ложными контролями (р<0,05)
35
003362
36
Таблица 10
Биомеханические измерения кортикального слоя костной ткани из срединной стержневой структуры
плечевой кости подвергнутых овариэктомии приматов на 18 месяце
Ложный
Контрольный
РТН1
PTH1-W
РТН5
PTH5-W
Переменная
OVX
(единицы)а
t (мм)
1,74±0,04b
1,63±0,03s
1,68±0,03
1,66±0,04
1,80±0,04°
1,72±0,05
Fu (H)
725±26
636±26
654±23
689±23
680±15s
707±24
S (Н/мм)
601±23
520±26
544±23
573±20
548±18
573±24
U (мдж)
1797±85
1542±92
1641±137
1751± 84
1804±99
1775±113
Аббревиатуры: OVХ=подвергнутые овариэктомии; PTHl=rhPTH (1-34) 1 мкг/кг в течение 18 месяцев;
PTH1-W=отмена в течение 6 месяцев после лечения rhPTH(1-34) 1 мкг/кг в течение 12 месяцев;
PTH5=rhPTH(1-34) 5 мкг/кг в течение 18 месяцев; РТН5-W=отмена в течение 6 месяцев после лечения
rhPTH(1-34) 5 мкг/кг в течение 12 месяцев
а
См. табл. 4,1 для описания переменных
b
Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение от среднего (SEM) на группу
° Статистически значимые по сравнению с контролям OVX (р<0,05)
s
° Статистически значимые по сравнению с ложными контролями (р<0,05)
Гистоморфометрия костной ткани.
Хотя скорости метаболизма у подвергнутых овариэктомии животных больше, чем у
контрольных животных, подвергнутых ложной
операции, значительных потерь объема костной
ткани подвздошного гребня нет. Поскольку тетрациклиновая метка, которую дают на 6 месяце,
не детектируется у многих животных, для этого
момента времени измеряются только статические параметры. Данные статической и динамической гистоморфометрии на 15 месяце, показывают, что лечение rhPTH(1-34) увеличивает
площадь губчатой костной ткани по сравнению
с подвергнутыми овариэктомии животными и
повышает формирование костной ткани без измеренных значений резорбции, повышенных по
сравнению с измеренными значениями у контрольных животных, подвергнутых овариэктомии. Скорость формирования костной ткани
последовательно возрастает с увеличением доз
rhPTH(1-34). Хотя слой губчатой костной ткани
остается увеличенным по сравнению с контрольными животными, подвергнутыми овариэктомии, после отмены введения rhPTH(1-34)
после 12 месяцев лечения, формирование и резорбция костной ткани являются обратными
тому, что наблюдается у контрольных животных, подвергнутых овариэктомии, и метаболизм
костной ткани остается более высоким, чем у
контрольных животных, подвергнутых ложной
операции. rhPTH(1-34) не влияет на минерализацию, частоту активации или периоды восстановления. Не существует изменений на уровне
многоклеточной единицы костной ткани (BMU)
между резорбцией и формированием. В итоге,
rhPTH(1-34) увеличивает губчатую костную
ткань путем селективной стимуляции формирования костной ткани.
В кортикальной костной ткани плечевой
кости, где rhPTH(1-34) не изменяет значительно
измеренные значения BMD или прочности кости, rhPTH(1-34) стимулирует изменения в пе-
риостальном, эндостальном и интракортикальном отделах (табл. 11 и 12). Хотя не существует
различий по общей площади поверхности или
медуллярной площади поверхности между
группами, rhPTH(1-34) увеличивает площадь
поверхности кортикального слоя, и группы,
пролеченные РТН5 и PTH5-W, имеют значительно больше кортикальной костной ткани,
предполагая увеличение поперечного момента
инерции, параметров прочности. Увеличение
площади поверхности может быть объяснено
увеличением формирования, как на периостальной, так и на эндостальной поверхностях (фиг.
7).
Группы контрольных животных, подвергнутых ложной операции, и животных, пролеченных PTH5-W, имеют пониженную минерализацию периостальных поверхностей по сравнению с контрольными животными, подвергнутыми овариэктомии, и другими группами, пролеченными rhPTH(1-34). Минерализация эндокортикальных поверхностей является значительно больше у контрольных животных, подвергнутых овариэктомии, по сравнению с животными, подвергнутыми ложной операции, и
уровни rhPTH(1-34) не увеличиваются выше
значений у контрольных животных, подвергнутых овариэктомии. При интракортикальном
восстановлении у подвергнутых овариэктомии
животных имеется больше областей резорбции,
и частота активации является большей у подвергнутых овариэктомии и пролеченных РТН1 и
РТН5 групп, чем у контрольных животных,
подвергнутых ложной операции или у групп с
отменой лечения. Имеется значительно больше
меченых остеонов на единицу площади поверхности у контрольных животных, подвергнутых
овариэктомии, по сравнению с контрольными
животными, подвергнутыми ложной операции,
и rhPTH(1-34) не увеличивает их количество
значительно выше значений для контрольных
животных, подвергнутых овариэктомии.
37
Пористость интракортикального слоя является большей у подвергнутых овариэктомии
животных, чем у животных, подвергнутых ложной операции, но не существует различий между контрольными животными, подвергнутыми
овариэктомии, и животными, пролеченными
РТН1. РТН5 и PTH5-W увеличивают пористость
выше той, которую наблюдают у контрольных
животных, подвергнутых овариэктомии. Данные исследований на кроликах выдвигают гипотезу о том, что увеличение пористости, сопровождающееся увеличением кортикального слоя
костной ткани, может быть структурной реакцией для поддержания биомеханических
свойств костной ткани, пролеченной rhPTH
(1-34). He существует различий между животными, подвергнутыми овариэктомии, и другими
группами по периоду формирования, ширине
остеоида, ширине стенки или по созреванию
остеоидов на 18 месяце.
В итоге, не существует различий в скоростях метаболизма между контрольными живот-
003362
38
ными, подвергнутыми овариэктомии, и животными, пролеченными любой дозой rhPTH(1-34).
Контрольные животные, подвергнутые ложной
операции, имеют более низкую скорость метаболизма, чем либо контрольные животные, подвергнутые овариэктомии, либо животные, пролеченные rhPTH(1-34). Когда введение rhPTH(134) отменяют на 6 месяцев, скорости метаболизма значительно уменьшаются, но BMD и
измеренные значения биомеханической прочности остаются более высокими, чем у контрольных животных, подвергнутых овариэктомии.
Нормальные значения для ширины остеоидов и
времени их созревания в кортикальном слое
костной ткани для всех групп указывают, что
лечение не вызывает никакого воздействия на
нормальный ход процесса минерализации. Нормальные значения для ширины стенки показывают, что лечение не изменяет нормального баланса между резорбцией и формированием на
уровне индивидуального BMU.
Таблица 11
Гистоморфометрические переменные для измерений кортикального слоя плечевой кости
Единицы
Описание
Переменнаяa
Ac.F
циклы/год Частота активаций
BFR/BS.Ec
мкм/день Скорость формирования костной ткани по отношению к эндокортикальной поверхности
BFR/BS.Ps
мкм/день Скорость формирования костной ткани по отношению к периостальной
поверхности
BFR/BV
% год
Скорость формирования костной ткани по отношению к объему костной
ткани
FP
дни
Период формирования
L On.N/Ct.A
№/мм2
Число меченных флюорохромом остеонов на единицу площади поверхности кортикального слоя
MAR
мкм/день Скорость аппозиции минеральных веществ в кортикальном слое
MAR.Ec
мкм/день Скорость аппозиции минеральных веществ на эндокортикальной поверхности
MAR.Ps
мкм/день Скорость аппозиции минеральных веществ на периостальной поверхности
MS/BS.Ec
%
Минерализация эндокортикальной поверхности, нормированная на общую поверхность эндокортикальной поверхности
MS/BS.Ps
%
Минерализация периостальной поверхности, нормализованная на общую
площадь периостальной поверхности
O.Wi
MKM
Ширина остеона
Rs.N/Ct.A
№/мм2
Число областей резорбции на единицу площади поверхности кортикального слоя
W/Wi
мкм
Ширина остеональной стенки
omt
дни
Время созревания остеоидов
Po
%
Пористость, процент площади костной ткани, занятая отверстиями
B.Ar
мм2
Площадь поверхности костной ткани, общая площадь внутри периостальной поверхности
Ct.Ar
мм2
Площадь кортикального слоя, площадь костной ткани внутри периостальной поверхности (включая пористость)
Mc.Ar
мм2
Площадь поверхности медуллярного отверстия
а
Номенклатура является такой, которая рекомендована Journal of bone and Mineral Research, 1987
39
003362
40
Таблица 12
Гистоморфометрия кортикальной костной ткани из срединной стержневой структуры плечевой кости
подвергнутых овариэктомии приматов на 18 месяце (n=121)
Переменная
Ложный
OVX
РТН1
PTN1-W
РТН5
PTH5-W
Ac.F
1,85±1,87a,c
6,06±3,31
7,69±4,96
3,05±2,15a
8,70±3,97
2,05±1,46a
BFR/BS.Ec
7,08±3,80
20,93±19,23
18,14±13,95 14,89±10,32 34,04±19,01 12,73±16,33a
BFR/BS.Ps
3,79±3,07
9,12±7,58
8,53+10,54
3,60±3,84a
8,99±5,81
5,79±4,05
a
BFR/BV
2,13+2,06
9,16±5,37
9,23±5,93
4,39±3,48a
12,93±5,94a
2,21±1,73a
FP
82,73±41,06
65,94±19,79
63,44±10,02 64,94±11,99 81,97±95,63 88,63±52,90
L.On.N/Ct.A
0,28±0,27a
1,03±0,52
1,26±0,71
0,50±0,36a
1,45±0,47a
0,38±0,26a
a
a
MAR
0,91±0,33
1,07±0,19
0,98±0,12
1,06±0,27
1,03±0,23
0,85±0,28a
a
MAR.Ec
0,48±0,19
0,75+0,25
0,66±0,15
0,66±0,16
0,75±0,14
0,63±0,17
MAR.Ps
0,62±0,24
0,69±0,23
0,89±0,95
0,54±0,15a
0,66±0,17
0,82±0,15
MS/BS.Ec
3,09±6,49a
20,99±18,04
25,19±17,14 11,74±14,41a 40,47±24,68a 8,93±15,39a
a
MS/BS.Ps
1,81±3,59
10,03±10,49
8,59±5,73
3,86±4,83a
11,00±9,63
2,30±3,76a
O.Wi
3,77±0,92
4,04±0,91
3,66±0,67
3,96+0,83
3,94±1,13
3,76±0,83
Rs.N/Ct.A
0,12±0,17a
0,21±0,13
0,28±0,18
0,12±0,07a
0,43±0,26a
0,19±0,18
W.Wi
63,23±13,61
68,63±15,09
61,36±7,79
63,12±17,35
65,28±9,43
63,82±8,31
omt
4,58±1,26a
3,87±1,04
3,76±0,70
3,86±0,74
6,45±13,85
5,07±2,65
Po
1,32±0,60a
2,61±1,40
4,65±4,78
2,23±1,60
6,78±4,23a
6,40±4,22a
B.Ar
53,12±5,50
52,82±7,09
54,22±5,97
54,94±6,55
55,81±6,24
58,16±8,79a
a
Ct.Ar
37,40±3,75
35,35±5,04
37,61±3,86
38,10±4,83
40,96±4,30
40,83±5,80a
a
Me.Ar
15,72±4,07
17,47±4,22
16,61±3,77
16,84±3,74
14,85±4,72
17,34±6,05
Аббревиатуры: ОVХ=подвергнутые овариэктомии
PTHl=rhPTH(1-34) 1 мкг/кг в течение 18 месяцев
PTH1-W=отмена после лечения rhPTH(1-34) 1 мкг/кг в течение 12 месяцев
PTH5=rhPTH(1-34) 5 мкг/кг в течение 18 месяцев
PTH5-W=отмена после лечения rhPTH(1-34) 5 мкг/кг в течение 12 месяцев
а
Статистические значимые значения по сравнению с OVX контролями (р<0,05)
b
См. табл. 4,2 для описания переменных
с
Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение от среднего (SEM) на группу
Анализ с помощью гистоморфометрии и
поляризационной
инфракрасной
Фурьемикроскопии показывает, что введение РТН
улучшает качество костной ткани путем замены
старой костной ткани (большие кристаллиты) на
молодую костную ткань (кристаллиты разных
размеров, имеющих тенденцию к уменьшению
размера). Далее при отмене введения РТН
обезьянам, получавшим низкие дозы, существует дополнительное преимущество, поскольку
матрикс становится оптимально минерализованным, и кристаллиты созревают. Данные, полученные с помощью гистоморфометрии и инфракрасной Фурье-микроскопии, показывают
неожиданное преимущество в качестве костной
ткани для кортикальной костной ткани, поскольку происходит оптимальная минерализация и минеральная фаза созревает.
Модельные исследования с помощью
трехмерного метода конечных элементов.
Исследование 500 мкм среза из средней
части L-5 демонстрирует 21% увеличение BMD
для групп, пролеченных РТН, по сравнению с
группами, подвергнутыми овариэктомии, что
связано с 27% увеличением ВМС без изменений
в площади поперечного сечения. Анализ центральной части из группы, пролеченной РТН,
демонстрирует 73% увеличение BV/TV, что вызвано 30% увеличением Tb.Th и Tb.N, большим
на 37% по сравнению с группами, подвергнутыми овариэктомии. Анализ связности для этой
области демонстрирует плотность пересечений
на 140% большую (пересечение/объем ткани) и
связность между узелками, большую на 286%,
для позвонков, пролеченных РТН.
Анализ гистограммы распределения вокселов костной ткани для групп, пролеченных
РТН, демонстрирует увеличение доли низких
плотностей (0-355 мг/с3), увеличение доли средних плотностей (356-880 мг/с3) и очень небольшое воздействие на вокселы с высокой плотностью (887-1200 мг/с3), по сравнению с группами, подвергнутыми овариэктомии (фиг. 8). Наиболее неожиданным является сдвиг в сторону
вокселов с большей плотностью костной ткани
в отделе кортикальной костной ткани, который
следует после отмены лечения в течение 6 месяцев (фиг. 8).
Вычисляют долю элементов костной ткани
позвонка (вокселов), которые попадают в определенный диапазон значений BMD. Выбранные
диапазоны значений BMD представляют собой
следующие: низкие BMD, 0-300 мг/с3; средние
BMD, 300-700 мг/с3; высокие BMD, 700-1000
мг/с3 и кортикальные BMD, >1000 мг/с3 (табл.
13). По сравнению с контрольными животными,
подвергнутыми овариэктомии, лечение РТН
значительно понижает объем костной ткани с
41
низкими BMD и увеличивает объем костной
ткани со средними BMD. После отмены лечения
РТН, происходит уменьшение объема костной
ткани со средними BMD и увеличение объема
003362
42
костной ткани с высокими BMD, указывая на
то, что костная ткань со средними значениями
BMD становится более плотной.
Таблица 13
Проценты объема позвонка L5, сгруппированные по значениям BMD (среднее±SЕМ)
Лечение
Низкие BMD, % Средние BMD, % Высокие BMD, % BMD кортикального слоя, %
Овариэктомия
30,4±2,2
48,7±1,6
19,9±1,2
0,9±0,3
РТН
17,7±1,6*
58,9±1,9*
22,8±27
0,6±0,3
PTH-W
22,4±1,3*
49,7±1,2
27,0±1,6*
0,8±0,2
Таблица 14
ВМС для среднего уровня позвонка L5 и эффективная деформация позвонка
Лечение
ВМС, мг
Эффективная деформация (u-деформация)
Овариэктомия
37,2±1,6
701±64
РТН
47,4±1,5*
447±36*
PTH-W
44,2±1,2*
539±34*
* статически отличные (р<0,05 согласно тесту PLSD по Фишеру)
Данные, собранные на фиг. 8, показывают,
что позвонок L-5 от обезьян циномолгус, пролеченных в течение 18 месяцев РТН, соответствуют значительным увеличениям массы костной
ткани, толщины слоя губчатой ткани и связности губчатой ткани с небольшими воздействиями на внешние параметры (Х-Аrеа) позвонка.
Анализ распределения элементов костной ткани
в L-5 демонстрирует, что сильно минерализованные области костной ткани изменяются
меньше всего без каких-либо доказательств
склерозирования костной ткани. Скорее, наибольшую реакцию на РТН проявляет пористая
губчатая костная ткань. Сдвиг в распределении
BMD ведет к значительному сокращению аксиальной деформации, указывая на улучшение
механических свойств. Как ясно показано на
гистограммах значений BMD для групп, пролеченных РТН и подвергнутых овариэктомии,
РТН преобразует вокселы костной ткани с низкой плотностью в вокселы со средней плотностью без какого-либо значительного влияния на
вокселы с высокой плотностью.
Данные, представленные в табл. 2, показывают, что значения ВМС в средней части позвонков значительно увеличиваются благодаря
лечению РТН, и полезный эффект от РТН остается через 6 месяцев после отмены лечения.
Средняя механическая деформация позвонка
уменьшается на 36% благодаря лечению РТН и
остается на 23% ниже, чем для групп OVX после отмены лечения РТН. Это исследование показывает, что отмена лечения РТН в течение 6
месяцев не приводит к резорбции вновь сформировавшейся костной ткани, но вместо этого
происходит выгодное перераспределение костной ткани со средней плотностью в костную
ткань с более низкой и более высокой плотностью. Это перераспределение приводит к продолжению понижения деформации в позвонках
и, таким образом, улучшает механическую
функцию.
Обсуждение.
Это исследование на приматах демонстрирует, что РТН, который дают в отсутствие других лекарственных средств, которые могут повлиять на костную ткань, полезен как для кортикальной, так и для губчатой костной ткани, с
целью увеличения общей массы костной ткани
скелета. Более того, отмена лечения РТН не
приводит к значительным потерям преимуществ, связанных с лечением РТН, в течение
периода, по меньшей мере, из 2 циклов восстановления.
Суррогатные маркеры использовались в
других исследованиях, чтобы показать активность в костной ткани, и они предполагали, что
изменения значений отражают изменения в массе костной ткани. Хотя существуют опубликованные данные на людях и приматах, которые
показывают, что как формирование, так и резорбция маркеров увеличивается в соответствии
с активированием метаболизма костной ткани,
например, во время раннего менопаузального
периода или в состояниях активного заболевания, высокий метаболизм рассматривается как
показатель потерь костной ткани. В юности высокий метаболизм во время созревания скелета
человека менее хорошо изучен, но он сопровождается анаболическим увеличением массы
костной ткани. Согласно литературным данным,
такое явление было бы совершенно неожиданным при лекарственной терапии остеопороза.
Таким образом, как показывают данные настоящих исследований, повышение уровня маркеров метаболизма костной ткани не согласуется с известным анаболическим воздействием
РТН на увеличение массы и прочности костной
ткани.
43
Данные этих 18-месячных исследований на
обезьянах циномолгус подтверждают следующие неожиданные открытия:
- Общее значительное увеличение общей
массы скелета.
- Значительное увеличение массы и прочности костной ткани в шейке бедра.
- Отсутствие доказательств "похищения"
кортикальной костной ткани для увеличения
губчатой костной ткани.
Увеличения массы и прочности костной
ткани являются статистически значимыми в
областях, обогащенными либо кортикальной
костной тканью (шейка бедра), либо губчатой
костной тканью (поясничные позвонки). В областях с чисто кортикальной костной тканью
(средняя часть диафиза бедренной кости) существует тенденция к стабилизации или небольшому увеличению массы и прочности костной
ткани под действием РТН по сравнению с контрольными животными, подвергнутыми овариэктомии.
- Изменения уровней маркеров костной
ткани у обезьян (и людей), подвергнутых овариэктомии, не отражают полезных анаболических
воздействий РТН на скелет. Использование телесных жидкостей от приматов в настоящих
исследованиях делает возможной разработку
новых и более надежных суррогатных маркеров.
- Удержание прибавки в массе и прочности
костной ткани в течение, по меньшей мере, 2
циклов восстановления после отмены лечения.
Эти исследования приматов, пролеченных
РТН, отличаются от опубликованных исследований на резус-макаках и обезьянах циномолгус, в них используются большие размеры
выборок, чтобы обеспечить соответствующую
статистическую мощность с целью выявления
различий, которые могут не быть очевидными в
предыдущих, более ограниченных исследованиях; контроли включают как приматов, подвергнутых овариэктомии (используемых в опубликованных исследованиях), так и подвергнутых
ложной операции, но интактных приматов. О
последней контрольной группе не сообщалось
ранее при исследованиях этого типа, так что
некоторые преимущества РТН и сопоставление
определенных измеренных значений с уровнями
у контрольных животных, подвергнутых ложной операции, в сравнении со значениями для
животных, подвергнутых овариэктомии, оцениваются впервые.
Выводы.
Эти 18-месячные исследования на взрослых, диких, подвергнутых овариэктомии (OVX)
обезьянах циномолгус, Масаса fascicularis, доказали эффективность и безопасность для костей
последствий лечения rhPTH(1-34), либо в течение 12 месяцев с последующей отменой лечения
на 6 месяцев, либо лечения в течение 18 месяцев. rhPTH(1-34) существенно повышает массу
и прочность костной ткани позвоночника и
003362
44
шейки бедра по сравнению с контрольными животными, подвергнутыми овариэктомии, до
уровней, эквивалентных или превышающих эти
уровни у контрольных животных, подвергнутых
ложной операции. У обезьян, подвергнутых
овариэктомии и пролеченных rhPTH(1-34), измерения гомеостаза кальция (сывороточный
кальций, фосфат и 1,25-дигидроксивитамин D)
сопоставляются с такими измерениями для контрольных животных, подвергнутых ложной
операции. Измерения крови, мочи и гистоморфометрии, используемые для оценки метаболизма костной ткани, показывают, что rhPTH
(1-34) поддерживает скорости формирования,
эквивалентные или более высокие, чем такие
уровни контрольных животных, подвергнутых
овариэктомии, в то время как уровень биохимических маркеров резорбции костной ткани остаются эквивалентными таким уровням у контрольных животных, подвергнутых ложной
операции. У всех животных, пролеченных
rhPTH(1-34) в течение вплоть до 18 месяцев,
фармакокинетические измеренные значения не
изменяются со временем, и накопления
rhPTH(1-34) не происходит. Не существует доказательств постоянной гиперкальцемии или
патологии почек после 18 месяцев лечения. Не
существует изменений в минерализации или
периодах восстановления. Общая прибавка в
содержании минеральных веществ в костях скелета, наблюдаемая при введении rhPTH(1-34),
может быть объяснена повышенной скоростью
формирования костной ткани и поверхности
формирования костной ткани при небольшом
влиянии на резорбцию костной ткани или при
его отсутствии. Существует значительное увеличение содержания минеральных веществ в
костной ткани, плотности минеральных веществ
в костной ткани и биомеханически измеренных
значений прочности, включая прочность и упругость, в клинически значимых областях, таких
как позвоночник, шейка бедра и проксимальная
часть большеберцовой кости.
rhPTH(1-34) увеличивает скорость метаболизма кортикальной костной ткани срединной
стержневой структуры плечевой кости и лучевой кости, но не изменяет значительно массу
костной ткани или биомеханические измеренные значения прочности по сравнению с контрольными животными, подвергнутыми либо
овариэктомии, либо ложной операции. Однако
увеличение ширины кортикального слоя или/и
площади поверхности кортикального слоя костной ткани согласуется с поперечным моментом
инерции, измерением прочности и упругости.
rhPTH(1-34) не оказывает значительного воздействия на внутренние свойства материала
кортикальной костной ткани. Стимулируется
эндокортикальное формирование костной ткани, при этом увеличивается ширина кортикального слоя и пористость кортикального слоя. Видимо, эти изменения пористости являются от-
45
ветственными за поддержание эластичности
костной ткани.
У обезьян 12 месяцев лечения rhPTH(1-34)
с последующей отменой на 6 месяцев ассоциируются с меньшими, но все еще значительными
прибавками в массе и прочности костной ткани
в позвоночнике и шейке бедра. После отмены
лечения не отмечается какого-либо значительного влияния на кортикальную костную ткань
срединной стержневой структуры плечевой кости и лучевой кости. Маркеры костной ткани и
гистоморфометрия демонстрируют тенденцию к
возвращению к низким значениям метаболизма,
измеренным у контрольных животных, подвергнутых ложной операции.
Механистические исследования in vivo на
грызунах показывают, что гены, ассоциированные с анаболическим действием rhPTH(1-34),
являются активированными в пределах от 1 до 6
ч, и увеличение поверхностей формирования
костной ткани может быть замечено в пределах
24 ч после первой дозы и при отсутствии заметных воздействий на резорбцию. rhPTH(1-34),
видимо, пополняет число остеопрогениторов в
S-фазе и стимулирует их дифференциацию в
остеобласты, тем самым быстро увеличивая
процент поверхностей формирования костной
ткани. Однократные и многократные введения
rhPTH(1-34) могут производиться в пределах 1часового периода для индуцирования анаболического эффекта в костной ткани. Однако когда
эквивалентная доза вводится молодым крысам в
виде многократных инъекций в течение 6 или 8
ч, анаболический эффект исчезает, что говорит
о том, что краткое, ограниченное по времени
взаимодействие с rhPTH(1-34) требуется для
индуцирования анаболического эффекта.
В итоге, rhPTH(1-34) является анаболиком
по отношению к костной ткани обезьян и кроликов, увеличивая измеренные значения массы
и биомеханической прочности костной ткани в
клинически значимых областях, таких как поясничный отдел позвоночника и шейка бедра, путем селективной стимуляции формирования
костной ткани. Увеличение метаболизма костной ткани, формирования эндокортикальной
поверхности и пористости, обнаруживаемые с
помощью гистоморфометрии в кортикальных
областях, не изменяют массу костной ткани или
биомеханические измеренные значения прочности костной ткани, но увеличивают поперечный
момент инерции путем увеличения площади
поверхности или/и ширины кортикального слоя
костной ткани.
Эти исследования демонстрируют, что
введение активаторов рецепторов паратиреоидных гормонов, таких как рекомбинантный
РТН(1-34) человека, улучшает качество костной
ткани, как во время, так и после лечения. В самом деле, введение РТН по одному разу в день в
течение 18 месяцев или при таких же дозах в
течение 12 месяцев с последующей 6 месячной
003362
46
фазой отмены лечения демонстрирует четкое
улучшение качества кортикальной костной ткани плечевой кости, как показывает анализ с помощью гистоморфометрии и поляризационной
инфракрасной Фурье-спектроскопии (FTIR).
Этот анализ доказывает, что введение РТН
улучшает качество костной ткани путем замены
старой костной ткани (большие кристаллиты)
молодой костной тканью (набор кристаллитов с
разбросам по размерам и с тенденцией к малым
размерам). Таким образом, введение РТН может
увеличить качество кортикальной костной ткани, улучшить минерализацию и ускорить минерализацию и замену старой костной ткани новой
костной тканью.
Далее при отмене лечения РТН у обезьян,
которым давали низкие дозы, существует дополнительное преимущество, поскольку матрикс становится минерализованным более оптимально, и кристаллиты созревают. То есть
при низких дозах РТН может иметь дополнительные преимущества во время фазы отмены
лечения путем усиления минерализации. Эти
данные указывают на преимущества ограниченного во времени режима лечения с помощью
РТН, за которым следует период отмены лечения с целью получения увеличенного преимущества. Существующие в настоящее время определения качества костной ткани не включают
эти аспекты улучшенной минерализации.
В более ранних исследованиях фазы лечения с помощью РТН, за которой следует фаза
без лечения, фаза лечения составляла менее чем
1 месяц. Более продолжительная, но ограниченная по времени фаза лечения из 18-24 месяцев,
за которой следует период, по меньшей мере, из
2 циклов восстановления, ранее не исследовалась. Продолжающееся преимущество у приматов после отмены лечения явно контрастирует с
результатами, достигнутыми на грызунах при
введении РТН. Исследования на крысах однородно показали, что костная ткань быстро теряется вслед за отменой лечения. Gunness-Неу, М.
and Hock, J. M. (1989) Bone 46 10: 447-452; Shen,
V. et al. (1993) J. Clin Invest 91: 2479-2487; Shen,
V. et al. (1992) Calcif. Tissue Int. 50: 214-220; and
Mosekilde, L. et al. (1997) Bone 20: 429-437.
Такой способ усиления минерализации костной ткани ранее не наблюдался и является
неожиданным, представляя собой новый способ,
с помощью которого РТН укрепляет и упрочняет костную ткань и может предотвратить переломы. Этот новый способ включает усиление и
регуляцию минерализации с целью создания
более прочной, более упругой, более устойчивой к переломам кости. Такие преимущественные воздействия требуют большего, чем формирование нового матрикса. Эти открытия указывают, что РТН имеет преимущества у пациентов с иммобилизованными костями или скелетами или со скелетами с дефицитом минеральных веществ, при условии, что существует так-
47
003362
же адекватное дополнительное лечение кальцием и витамином D.
Пример 3. Увеличение прочности и плотности костной ткани и уменьшение переломов
при введении rhPTH(1-34) людям.
Количество пациентов: rhPTH(1-34): 1093
включено в список, 848 прошли лечение. Плацебо: 544 включено, 447 прошли лечение.
Диагноз и критерии включения: Женщины
в возрасте от 30 до 85 лет в постменопаузальном
периоде в течение минимум 5 лет, с минимум
одним умеренным или двумя средними атравматическими переломами позвоночника.
Дозировка и введение: Исследуемый продукт (вслепую) rhPTH(l-34); 20 мкг/день, вводят
подкожно rhPTH(1-34): 40 мкг/день, вводят под-
Кавказской группы
Возраст
Годы после менопаузы
Гистерэктомия
Матка + 0 или 1 яичник
Матка + 2 яичника
Неизвестно
Предыдущее использование лекарств от остеопороза
Исходная BMD позвоночника, позвонков
Исходное # фиксир.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Не указано
48
кожно. Сравнительная терапия (вслепую): Материал плацебо исследований для инъекций.
Длительность лечения: rhPTH(1-34): 17-23
месяцев (исключая 6-месячную начальную фазу). Плацебо: 17-23 месяцев (исключая 6месячную начальную фазу).
Критерии оценки: Рентген позвоночника;
сывороточные биологические маркеры (кальций, специфичная к костной ткани щелочная
фосфатаза, проколлаген 1 пропептид с карбоксиокончанием); маркеры для мочи (кальций, Nтелопептид, свободный деоксипиридинолин);
1,25-дигидрокси-витамин D; плотность минерального вещества в костной ткани: позвоночник, бедро, запястье и общая для тела высота;
фармакокинетика в популяции; биопсия костной
ткани (выбранные области для исследования).
Характеристика пациента
Плацебо (N=544) РТН-20 (N=541) РТН-40 (N=552)
98,9%
98,9%
98,4%
69,0±7,0
69,5±7,1
69,9±6,8
20,9±8,5
21,5±8,7
21,8±8,2
23,8%
23,1%
21,6%
57
51
58
61
57
51
11
17
10
значение P
0,672
0,099
0,273
0,682
14,9%
15,5%
13,0%
0,479
0,82±0,17
0,82±0,17
0,82±0,17
>0,990
54 (10,4%)
144
128
75 (14,5%)
59 (11,4%)
28 (5,4%)
13 (2,5%)
6 (1,2%)
9 (1,7%)
1 (0,2%)
1 (0,2%)
26
45 (8,8%)
159 (31,1%)
128 (25,0%)
67 (13,1%)
49 (9,6%)
31 (6,1%)
20 (3,9%)
7 (1,4%)
5 (1,0%)
0
1 (0,2%)
29
54 (10,1%)
169 (31,6%)
125 (23,4%)
81 (15,1%)
45 (8,4%)
21 (3,9%)
25 (4,7%)
10 (1,9%)
3 (0,6%)
2 (0,4%)
0
17
>0,990
Результаты.
Данные этого клинического исследования
включают в целом 1637 женщин, пролеченных
рекомбинантным паратиреоидным гормоном
человека (1-34), rhPTH(1-34) при 0, 20, или 40
мкг/день с дополнительным введением и витамина D и кальция в течение 18-24 месяцев,
представленные результаты изложены в табл.
15-19.
Табл. 15 иллюстрирует данные, представляющие уменьшение при лечении РТН числа и
тяжести переломов позвоночника. При сравнении всех пациентов, пролеченных РТН, с плацебо общее уменьшении по числу пациентов составляет 67% (р<0,001), при этом уменьшение
составляет 65% (р<0,001) при введении 20
мкг/день РТН по сравнению с плацебо, и
уменьшение составляет 69% при 40 мкг/день
РТН по сравнению с плацебо (табл. 15). Сравнивая всех пролеченных РТН пациентов с плацебо, общее уменьшение по числу пациентов с
множественными переломами позвоночника
составляет 81% (р<0,001), при этом уменьшение
по сравнению с плацебо составляет 77%
(р<0,001) при введении 20 мкг/день РТН, и
уменьшение по сравнению с плацебо составляет
86% при введении 40 мкг/день РТН. Сравнивая
всех пролеченных РТН пациентов с плацебо,
общее уменьшение по числу пациентов с переломами позвоночника от средней тяжести до
тяжелых составляет 84% (р<0,001), при этом
уменьшение по сравнению с плацебо составляет
49
90% (р<0,001) при введении 20 мкг/день РТН, и
уменьшение по сравнению с плацебо составляет
003362
50
78% при введении 40 мкг/день РТН (табл. 15).
Таблица 15
Влияние лечения РТН на количество и тяжесть переломов позвоночника
Плацебо (n*=448) РТН, 20 мкг/день (n=444) РТН, 40 мкг/день (n=434)
Число и процент пациентов с новыми переломами
64 (14,3%)
22 (5,0%)
19 (4,4%)
позвоночника
Число и процент пациентов с 2 или более новыми
22 (4,9%)
5 (1,1%)
3 (0,7%)
переломами позвоночника
Число и процент пациентов с новыми переломами,
42 (9,4%)
4 (0,9%)
9 (2,1%)
от средней тяжести до тяжелых **
*n = число пациентов с рентгенографией позвоночника как в начале, так и в конце
** Перелом средней тяжести приводит к потерям более чем 25% высоты позвоночника (или эквивалентной меры). Тяжелый перелом приводит к потерям более чем 40% высоты позвоночника (или эквивалентной меры). Переломы определяются согласно Genant et al. (1993) Vertebral fracture assessment using a semiquantitative technique; J.
Bone & Min Res 81137-1148
Табл. 16 иллюстрирует влияние лечения
РТН на количество переломов различных костей, не связанных с позвоночником, в теле. Количество переломов заметно уменьшается в
верхней части бедренной кости, лучевой кости,
лодыжке, плечевой кости, ребрах, ступне, тазу и
других местах (табл. 16). Уменьшение является
статистически значимым, если рассматривать
его как уменьшение общего количества перело-
мов у пролеченных РТН пациентов по сравнению с пациентами, пролеченными плацебо.
Уменьшение является еще более значимым, если его рассматривать как уменьшение общего
числа переломов верхней части бедра, лучевой
кости, лодыжки, плечевой кости, ребер, ступни
и таза у пролеченных РТН пациентов по сравнению с пациентами, пролеченными плацебо
(табл. 16).
Таблица 16
Влияние лечения РТН на количество переломов, не связанных с позвоночником
Значения Р
Плацебо
РТН-20
РТН-40
Общее PTH-pbo* 20-pbo
(N-544)
(N=541)
(N=552)
Бедро
4
2
3
0,718
0,474
0,417
Лучевая кость
13
7
10
0,404
0,236
0,180
Лодыжка
4
2
2
0,601
0,313
0,417
Плечевая кость
5
4
3
0,767
0,534
0,744
Ребра
10
5
5
0,277
0,109
0,197
Ступня
4
1
4
0,374
0,474
0,181
Таз
3
1
0
0,171
0,076
0,319
Другие
16
14
9
0,338
0,296
0,723
Общее
53
34
32
0,024
0,007
0,036
Общее без "другие"
41
21
24
0,013
0,003
0,010
*Плацебо (pbo)
Влияние РТН на содержание минеральных
веществ в костной ткани (ВМС), плотность минеральных веществ в костной ткани (BMD), и
площадь кости определяют с помощью измерения поглощения рентгеновских лучей с двумя
различными энергиями (DEXA), и результаты
изложены в табл. 17-19. Введение РТН вызывает очевидное увеличение ВМС в поясничном
отделе позвоночника, в бедре и тазу, в запястье
пациента и во всем теле пациента (табл. 17).
Лечение РТН вызывает значительное увеличение BMD в поясничном отделе позвоночника,
40-pbo
0,690
0,504
0,403
0,465
0,184
0,983
0,081
0,146
0,015
0,025
бедре и в тазу пациента (табл. 18). Увеличения в
поясничном отделе позвоночника, бедре и тазу
являются статистически значимыми с р<0,001
(табл. 18). Площадь кости, заметно увеличивается при лечении РТН для поясничного отдела
позвоночника, бедра и таза пациента (табл. 19).
Увеличения являются статистически значимыми
для спинного отдела позвоночника и шейки
бедра (табл. 19).
Влияние РТН на меру качества и количества костной ткани в теле в целом, ВМС, является особенно значительным. Это влияние на
51
тело в целом указывает на то, что количество
костной ткани в теле пациента увеличивается.
РТН не приводит только к перемещению массы
костной ткани от одной части тела пациента к
другой. Вместо этого, лечение РТН увеличивает
количество и качество костной ткани в теле пациента.
Фиг. 9 и 10 иллюстрируют увеличение от
времени BMD в поясничном отделе позвоночника и BMD в бедре/шейке бедра, соответственно, для пролеченных РТН и принимавших
003362
52
плацебо контрольных пациентов. BMD поясничного отдела позвоночника пациента временно увеличивается в течение, по меньшей мере,
около 18 месяцев, при этом наблюдается менее
существенное увеличение, или вообще никакого, в течение последующих месяцев. BMD бедра/таза пациента заметно возрастает в течение,
по меньшей мере, 18 месяцев, и может возрастать при дальнейшем продолжении лечения
РТН.
Таблица 17
Влияние РТН на содержание минеральных веществ в костной ткани, представленное как конечный процент изменения (произвольное время) от исходного уровня
Плацебо
РТН-20
РТН-40
Значение р
Поясничный отдел позвоночника
1,60 (6,92)
11,85 (8,83)
16,62(11,1)
0,001
Бедро/тазобедренный сустав
Общее
-0,38 (5,18)
3,50 (6,26)
4,78 (6,70)
<0,001
Шейка
-0,51 (7,06)
2,99 (7,26)
5,80 (8,71)
<0,001
Вертел
0,98 (14,97)
5,68 (15,58)
6,53 (15,33)
<0,001
Межвертельная линия
-0,23 (6,28)
3,59 (7,32)
4,99 (7,79)
<0,001
Треугольник Варда
0,01 (14,75)
5,36 (14,78)
8,86 (17,02)
<0,001
Запястье
Ультрадистальн. часть (пястье)
-1,67 (7,44)
-0,25 (6,53)
-1,88 (7,97)
0,184
1/3 лучевой кости
-1,19 (6,12)
-1,37 (4,51)
-3,04 (6,09)
0,025
Тело в целом
-0,74 (4,76)
1,30 (4,48)
2,28 (5,44)
<0,001
Таблица 18
Влияние РТН на плотность минеральных веществ в костной ткани, представленное как конечный процент изменения (произвольное время) от исходного уровня
Плацебо
РТН-20
РТН-40
Значение р
Поясничный отдел позвоночника
1,13 (5,47)
9,70 (7,41)
13,7 (9,69)
<0,001
Бедро/тазобедренный сустав
Общее
-1,01 (4,25)
2,58 (4,88)
3,60 (5,42)
<0,001
Шейка
-0,69 (5,39)
2,79 (5,72)
5,06 (6,73)
<0,001
Вертел
-0,21 (6,30)
3,50 (6,81)
4,40 (7,45)
<0,001
Межвертельная линия
-1,29 (4,53)
2,62 (5,52)
3,98 (5,96)
<0,001
Треугольник Варда
-,80 (11,73)
4,19 (11,93)
7,85 (13,24)
<0,001
Запястье
Ультрадистальн. часть (пястье)
-1,89 (7,98)
-0,05 (7,14)
-1,76 (7,20)
0,108
1/3 лучевой кости
-1,22 (3,37)
-1,94 (4,07)
-3,17 (4,62)
0,001
Таблица 19
Влияние РТН на площадь поверхности кости, представленное как конечный процент изменения (произвольное время) от исходного уровня
Плацебо
РТН-20
РТН-40
Значение р
Поясничный отдел позвоночника
0,46 (2,97)
2,52 (3,52)
3,34 (3,72)
<0,001
Бедро/тазобедренный сустав
Общее
0,54 (3,02)
0,84 (3,16)
1,05 (2,98)
0,144
Шейка
0,04 (4,60)
0,27 (4,91)
0,81 (5,56)
0,035
Вертел
0,95 (12,75)
1,99 (12,16)
1,92 (11,30)
0,197
Межвертельная линия
1,01 (5,17)
1,01 (4,99)
1,01 (4,89)
0,964
Треугольник Варда
0,44 (7,60)
1,13 (7,34)
0,99 (8,06)
0,309
Запястье
Ультрадистальн.часть(пястье)
0,25 (6,40)
-0,25 (6,00)
-0,39 (4,80)
0,653
1/3 лучевой кости
-0,02 (5,73)
0,52 (3,40)
0,01 (4,42)
0,586
В итоге данные, представленные выше,
показывают, что пациенты, пролеченные РТН,
имеют меньше переломов. В частности лечение
РТН уменьшает более чем на 66% количество
53
пациентов, у которых раньше были переломы
позвоночников, и которые страдают от новых
переломов позвоночника. Лечение РТН также
уменьшает более чем на 78% количество пациентов, у которых раньше были переломы позвоночников и которые страдают от новых множественных переломов позвоночника. Кроме того,
РТН уменьшает тяжесть переломов позвоночника, со значительным уменьшением на 78%
числа пациентов с тяжелыми переломами или
переломами средней тяжести. Пациенты, принимающие РТН, выигрывают от значительного
уменьшения всех переломов, не связанных с
позвоночником (включая переломы верхней
части бедра, лучевой кости, запястья, таза, стопы, плечевой кости, ребер или лодыжки) со значимостью на уровне р<0,007. Качество костной
ткани также увеличивается. Пациенты, имевшие
ранее переломы, выигрывают от значительного
увеличения содержания минеральных веществ в
бедренной кости, позвоночнике и в теле в целом. Это увеличение указывает, что уменьшение переломов в этих местах может произойти
уже через 12 месяцев терапии.
Обсуждение.
Настоящие данные по переломам являются
первыми данными по уменьшению переломов у
людей с помощью РТН. Настоящие открытия
демонстрируют улучшение в качестве костной
ткани и в прочности костей, подобно преклиническим данным, изложенным выше. Эти результаты также показывают выигрыши в качестве и
прочности костной ткани в областях, не связанных с позвоночником. Обнаружение уменьшения количества переломов, имевших место во
время 18-23-месячного периода лечения, ранее
не было обнаружено в клинических или преклинических исследованиях.
Вопрос о том, один ли РТН увеличивает
прочность и крепость костей для повышения
сопротивления переломам, не был ранее исследован на людях. Все опубликованные литературные данные вместе убеждают, что РТН должен даваться в сочетании с противорезорбционным агентом или с эстрогеном. Предыдущие
опубликованные клинические исследования
включают популяции пациентов, слишком малые для определения значимого восстановления
после переломов. В одном исследовании преимущества РТН самого по себе не могли бы
быть оценены, поскольку не существовало контрольной группы с плацебо. Во втором исследовании, использовавшем повсеместно принятое
определение перелома, не было обнаружено
уменьшения переломов.
Открытие сокращения переломов в различных местах, не связанных с позвоночником,
является особенно неожиданным в свете распространенного предположения о том, что РТН
имеет отрицательное влияние в таких областях.
Распространенная догма утверждает, что РТН
будет увеличивать пористость кортикальной
003362
54
костной ткани и поэтому ослаблять кость, особенно на ранних стадиях терапии. Далее эта
догма утверждает, что области кортикальной
костной ткани имеют высокий риск перелома, и
что РТН не будет давать выигрыша в уменьшении переломов в местах, не связанных с позвоночником. Эта догма также утверждает, что
РТН сам по себе вряд ли будет эффективным и
будет требовать совместной противорезорбционной терапии, чтобы блокировать отрицательные воздействия на кортикальную костную
ткань. Представленные данные демонстрируют
незамеченные ранее преимущества введения
РТН пациентам, принимающим дополнительное
лечение в виде витамина D и кальция. Неожиданно, РТН упрочняет костную ткань с уменьшением количества новых переломов у пациента с риском множественных переломов позвоночника, с риском дополнительных переломов,
не связанных с позвоночником, с риском дополнительных переломов позвоночника от средней
тяжести до тяжелых и тому подобное.
Клинические исследования на женщинах в
постменопаузальном периоде показывают особенные преимущества от лечения пациентов
низкими дозами (20 мкг/день), поскольку доза
РТН (который при высоких дозах мог бы демонстрировать побочные эффекты у некоторых
пациентов) уменьшается, но предотвращение
перелома и уменьшение перелом остается и является подобным тем, которые отмечаются при
высокой дозе (40 мкг/день). Данные по FT-IR
исследований на обезьянах указывают возможное, но не ограничивающее механистическое
объяснение. Исследования на обезьянах показывают, что РТН при низких дозах увеличивает
образование кристаллитов и ускоряет минерализацию кортикальной костной ткани. Кроме того,
обезьяны при низких дозах демонстрируют дополнительные преимущества после отмены лечения, поскольку РТН увеличивает содержание
минеральных веществ в костной ткани. Настоящие данные демонстрируют новое открытие,
что РТН, вводимый при низких дозах, пациентам, принимающим дополнительное лечение в
виде витамина D и кальция, является эффективным для предотвращения переломов, как позвоночника, так и не связанных с позвоночником. В
противоположность популярному утверждению,
РТН упрочняет костную ткань в местах, не связанных с позвоночником, с целью предотвращения новых переломов или уменьшения тяжести
переломов, видимо путем улучшения минерализации и повышения содержания минеральных
веществ в костной ткани.
Настоящее изобретение описывается с
упоминанием различных конкретных и предпочтительных воплощений и способов. Однако
должно быть понятно, что множество вариаций
и модификаций может быть сделано, оставаясь
при этом в духе и рамках настоящего изобретения. Все публикации и заявки на патенты в этой
55
в настоящем описании являются показательными для уровня среднего специалиста в области,
к которой относится настоящее изобретение
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ для одновременного уменьшения риска перелома костей как позвоночника,
так и не связанных с позвоночником, у человека
с риском развития остеопороза или имеющего
остеопороз, включающий введение указанному
человеку паратиреоидного гормона без одновременного введения противорезорбционного
агента иного, чем витамин D или кальций при
ежедневной дозе от 20 до 40 мкг.
2. Применение паратиреоидного гормона,
состоящего из последовательности аминокислот
1-34 паратиреоидного гормона человека для
производства лекарственного средства для одновременного уменьшения риска перелома костей как позвоночника, так и не связанных с позвоночником, у женщины в постменопаузальном периоде с риском развития остеопороза или
имеющую остеопороз, где указанное лекарственное средство вводят указанной женщине без
одновременного введения противорезорбционного агента иного, чем витамин D или кальций
при ежедневной дозе от 20 до 40 мкг в течение,
по меньшей мере, от около 12 месяцев и до 3
лет.
3. Применение по п.2, отличающееся тем,
что указанная ежедневная доза составляет 20
мкг.
4. Применение по п.2, отличающееся тем,
что указанная ежедневная доза вводится, по
меньшей мере, в течение около 24 месяцев.
5. Применение по п.2, отличающееся тем,
что указанное лекарственное средство содержится внутри упаковочного материала и указанный упаковочный материал содержит печатный материал, который указывает, что указанное лекарственное средство эффективно для
одновременного уменьшения риска перелома
костей как позвоночника, так и не связанных с
позвоночником, у женщины в постменопаузальном периоде с риском развития остеопороза или
имеющую остеопороз, когда его вводят указанной женщине таким образом, что указанный
паратиреоидный гормон вводится без одновременного введения противорезорбционного агента иного, чем витамин D или кальций при ежедневной дозе от 20 до 40 мкг, по меньшей мере,
в течение от около 12 месяцев и до 3 лет.
6. Применение паратиреоидного гормона
для производства лекарственного средства для
уменьшения риска перелома костей как позвоночника, так и не связанных с позвоночником, у
пациента - человека с риском развития остеопороза или имеющего остеопороз, где указанный
паратиреоидный гормон вводят указанному пациенту без одновременного введения противорезорбционного агента иного, чем витамин D
003362
56
или кальций при ежедневной дозе от 20 до 40
мкг.
7. Применение паратиреоидного гормона
для производства лекарственного средства для
усиления кортикального слоя кости у пациента человека с риском развития остеопороза или
имеющего остеопороз, где указанный паратиреоидный гормон вводят указанному пациенту
без одновременного введения противорезорбционного агента иного, чем витамин D или кальций при ежедневной дозе от 20 до 40 мкг.
8. Применение по п.6 или 7, отличающееся
тем, что указанный пациент - человек имеет
риск развития остеопороза или остеопороз, происходящий от обусловленного возрастом гипогонадального состояния.
9. Применение по п.8, отличающееся тем,
что указанный пациент-человек является женщиной в постменопаузальном периоде.
10. Применение по любому из пп.2-9, отличающееся тем, что указанный пациентчеловек имеет остеопороз.
11. Применение по любому из пп.2-10, отличающееся тем, что указанное лекарственное
средство вводят, по меньшей мере, в течение от
около 12 месяцев и до 3 лет.
12. Применение по п.6, отличающееся тем,
что указанная ежедневная доза составляет 20
мкг.
13. Применение по п.6, отличающееся тем,
что указанная ежедневная доза вводится, по
меньшей мере, в течение около 24 месяцев.
14. Применение по п.6, отличающееся тем,
что указанное лекарственное средство содержится внутри упаковочного материала и указанный упаковочный материал содержит печатный материал, который указывает, что указанное лекарственное средство эффективно для
уменьшения риска перелома костей как позвоночника, так и не связанных с позвоночником, у
пациента-человека с риском развития остеопороза или имеющего остеопороз, когда его вводят указанному пациенту таким образом, что
указанный паратиреоидный гормон вводится
без одновременного введения противорезорбционного агента иного, чем витамин D или кальций при ежедневной дозе от 20 до 40 мкг.
15. Применение по любому из пп.6-14, отличающееся тем, что указанный паратиреоидный гормон выбран из РТН(1-31), РТН(1-34),
РТН(1-37), РТН(1-38), РТН(1-41) и РTH (1-84).
16. Применение по п.15, отличающееся
тем, что указанный паратиреоидный гормон
представляет собой РТН(1-34) человека.
17. Применение по п.15, отличающееся
тем, что указанный паратиреоидный гормон
представляет собой РТН(1-84) человека.
57
003362
58
Фиг. 1А
Фиг. 4В
Фиг. 1В
Фиг. 4С
Фиг. 2А, 2B
Фиг. 5А
Фиг.5B
Фиг. 2С, 2D
Фиг. 6А
Фиг. 3
Фиг. 4А
Фиг. 6В
59
003362
60
Фиг. 9
Фиг. 7
Фиг. 10
Фиг. 8
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6
Related documents
Создание нормативной базы данных - congress
Создание нормативной базы данных - congress
Выполнение следующих рекомендаций сделает ваши кости
Выполнение следующих рекомендаций сделает ваши кости
Отзыв Арамисовой Р.М. на автореферат диссертации Слоховой
Отзыв Арамисовой Р.М. на автореферат диссертации Слоховой
Связаны ли инфекции тканей пародонта с повышенным риском
Связаны ли инфекции тканей пародонта с повышенным риском
СТруКТурНыЕ ИЗМЕНЕНИЯ КоСТНой ТКаНИ прИ провЕДЕНИИ
СТруКТурНыЕ ИЗМЕНЕНИЯ КоСТНой ТКаНИ прИ провЕДЕНИИ
рушенный минеральный обмен. Нами установлено, что при
рушенный минеральный обмен. Нами установлено, что при
Аппарат Piezosurgery II компании «Mectron
Аппарат Piezosurgery II компании «Mectron
СОСТОЯНИЕ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТОЙ СИСТЕМЫ У
СОСТОЯНИЕ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТОЙ СИСТЕМЫ У
Download
advertisement