На правах рукописи ТЕРТЕРЯН Маргарита Анатольевна
advertisement
На правах рукописи ТЕРТЕРЯН Маргарита Анатольевна ПОСТТРАВМАТИЧЕСКАЯ РЕГЕНЕРАЦИЯ СУСТАВНОГО ГИАЛИНОВОГО ХРЯЩА ПРИ ПРИМЕНЕНИИ КЛЕТОЧНОТКАНЕВЫХ БИОТЕХНОЛОГИЙ (Экспериментальное исследование) 14.03.02 – патологическая анатомия 14.01.15 – травматология и ортопедия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Самара - 2011 Работа выполнена учреждении в высшего Государственном профессионального бюджетном образовательном образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации. Научные руководители: Волова Лариса Теодоровна; доктор медицинских наук, профессор академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Котельников Геннадий Петрович. Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук Туманов Владимир Павлович; Решетников Андрей Николаевич. Ведущая организация: Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Первый Московский государственный медицинский университет им. Сеченова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Защита состоится « ____ » ___________ 2011 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 208.094.01 при ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздравсоцразвития России» по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Б. Казачья, д. 112. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздравсоцразвития России». Автореферат разослан «___» ______________2011 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор Г.Н.Маслякова. 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследования Известно, что миллионы людей по всему миру страдают от посттравматических и деструктивных поражений суставного гиалинового хряща. Обычно заболевают люди среднего, наиболее трудоспособного возраста. Особую группу риска занимают лица, испытывающие повышенные физические нагрузки, особенно спортсмены. (Тихилов Р.М., 2006; Blanc K.L., 2004; Roos E.M., 2007). Гиалиновый хрящ является одной из основных структур, реализующих функцию сустава как органа движения и опоры (Миронов С.П., 2008; Котельников Г.П., 2010; Uchio Y., Vad V.B., Gregard A., 2008). Особенности его гистоархитектоники на данный момент не позволяют известным консервативным и хирургическим способам лечения деструктивнодистрофических заболеваний достичь полной регенерации суставного хряща с образованием органотипичной ткани и восстановлением функции сустава. Как правило, повреждения гиалинового хряща заполняются фиброзной или волокнистой хрящевой тканью (Писарев В.Б., Маланин Д.А., 2004; Санкин А.П., 2006; Татаренко-Козмина Т.Ю., 2007; Brittberg M., 2006; Pietsch M., 2007). Именно поэтому, первостепенной, но в то же время трудновыполнимой задачей в лечении этой группы больных становится полноценная регенерация суставного хряща, определяющая в дальнейшем восстановление функций коленного сустава и нижней конечности в целом (Леднев В.Ю., 2000; ДенисовНикольский Ю.И., 2005; Ahn J.I., 2004; Arinzeh T.L., 2005; Horwitz E.M.,2007). В последние годы широкую значимость приобрела регенеративная медицина. В связи с этим клеточные и тканевые биотехнологии занимают лидирующие позиции и являются перспективными в клинической травматологии и ортопедии (Vacantis J. et al., 2000, Kotobuki N. et al., 2004, Oreffo R. O. et al., 1999, Otto W. R., 2004, Verfaillie C. M., 2002). 3 Цель исследования Оценить эффективность проведения пластики интраоперационных костно-хрящевых дефектов аллогенными клеточно-тканевыми трансплантатами при травматическом повреждении суставного хряща с позиции регенеративной медицины. Задачи исследования: 1. Провести иммунофенотипирование и дать морфо-функциональную характеристику культур клеток полученных из гиалиновой ткани реберного хрящева. 2. Исследовать возможность хондродифференцировки в культуре клеток из гиалиновой хрящевой ткани. 3. Установить оптимальный бионоситель для этой популяции клеток и создать аллогенный клеточно-тканевой трансплантат для хондропластики. С помощью методов электронной микроскопии изучить его структуру и наличие в нем клеточного компонента и его жизнеспособность. 4. В эксперименте на животных провести сравнительную оценку характера регенераторных процессов и состояние прилежащей к области повреждений гиалиновой комбинированными хрящевой ткани клеточно-тканевыми при пластике аллогенными трансплантатами, только бионосителем и без замещения дефектов биопластическим материалом. 5. сериях Оценить функциональное состояние конечности кролика во всех эксперимента с использованием комплекса количественных морфологических методов, методов лучевой диагностики, компьютерной томографии и доказательной медицины. Научная новизна Впервые дана структурно-функциональная характеристика и проведено иммунофенотипирование культур клеток из реберной гиалиновой хрящевой ткани кролика с использованием проточной цитометрии и комплекса иммуногистохимических методов исследования с применением моноклональных антител, морфологических и морфометрическх методов. 4 Впервые проведено тестирование на биосовместимость и адгезивную способность клеток из реберной гиалиновой хрящевой ткани к различным аллогенным костным пористым материалам, изготовленным по технологии «Лиопласт»®, позволившее выбрать оптимальный бионоситель для создания клеточно тканевого трансплантата (Патент РФ № 2402339). Впервые создан аллогенный клеточно-тканевой трансплантат (Патент РФ № 2402340) на основе биодеградируемой деминерализованной губчатой кости и культур клеток из реберного хряща. Применение конфокальной и растровой электронной микроскопии позволило выявить интеграцию в бионосителе жизнеспособных фибробластоподобных клеток из реберной гиалиновой хрящевой ткани. Гистологическими исследованиями in vivo установлено наличие жизнеспособных трансплантируемых на носителе клеток. Впервые с помощью морфометрических, макро- и микроскопических методов исследования интраоперационных in vivo показано, костно-хрящевых что дефектов после пластики комбинорованными трансплантатами на основе деминерализованной губчатой спонгиозы и культур аллогенных клеток из реберного хряща, происходит полное восстановление функций конечности животного с замещением дефектов регенератом, визуально не отличимым гистологически от представленным окружающей суставной органотипичной поверхности гиалиновой и хрящевой тканью. Практическая значимость Разработана и изучена на доклиническом этапе в эксперименте на животных новая медицинская биотехнология восстановления посттравматических дефектов суставного хряща, представляющая собой создание клеточно-тканевого трансплантата на основе деминерализованной спонгиозы и культур клеток из гиалиновой хрящевой ткани реберного хряща и применение его во время операции для замещения сформированных костнохрящевых дефектов. 5 Использование аллогенного клеточно-тканевого трансплантата при хондропластике обеспечивает замещение дефекта новообразованной гиалиновой хрящевой тканью, имеющей типичное для суставного хряща строение, и восстановление структуры субхондральной кости с образованием компактного вещества костной пластины и губчатого компонента, отсутствием дистрофических процессов в окружающей хрящевой ткани и полным восстановлением функций оперированной конечности. Внедрение результатов исследования Результаты проведенных исследований используют учебных процессах ГБОУ ВПО «Самарский Минздравсоцразвития государственный России кафедры: медицинский университет» травматологии, ортопедии и экстремальной хирургии, оперативной хирургии и клинической анатомии с курсом инновационных технологий, гистологии и эмбриологии, общей и клинической патологии: физиологии, радиотехнических государственного патологической анатомии устройств аэрокосмического ФГБОУ университета и патологической ВПО им. «Самарского Академика С.П. Королева (национальный исследовательский университет)» и металловедения, порошковой металлургии и наноматериалов ФГБОУ ВПО «Самарского государственного технического унивеситета», а также в Институте экспериментальной медицины и биотехнологий. Апробация работы Основные положения диссертационного исследования доложены и обсуждены на IV Всероссийском симпозиуме с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (г.СанктПетербург, 2010), IV Всероссийской (78-я Итоговой) студенческой научной конференция «Студенческая наука и медицина XXI века: традиции, инновации и приоритеты» (г.Самара, 2010) и Всероссийской конференции «Регенеративная биология и медицина» (г.Москва, 2011). Работа поддержана грантом программы У.М.Н.И.К. (г.Самара, 2010). Публикации 6 По теме диссертации опубликовано 12 работ, из них 3 – в журналах, рекомендованных ВАК РФ. Получено 2 Патента РФ на изобретение. Объем и структура работы Диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных наблюдений, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Библиографический список содержит 50 отечественных и 137 зарубежных источников. Содержит 7 таблиц и 69 рисунков. Положения, выносимые на защиту. 1. Создан аллогенный клеточно-тканевой трансплантат, для восстановления костно-хрящевых повреждений, клеточным компонентом которого являются фибробластоподобные клетки из реберного хряща, идентифицированные как клетки хрящевого дифферона. 2. В качестве матрицы-носителя, путем тестирования на клетках различных пористых костных материалов, выбрана резорбируемая аллогенная деминерализованная спонгиоза, изготовленная по технологии «Лиопласт»®, которая обеспечивает жизнеспособность и пролиферативную активность трансплантированных на ней культур хрящевых клеток с последующей хондродифференцировкой в присутствии данного материала. 3. Результаты выполненного исследования с помощью комплекса морфологических, функциональных и методов лучевой диагностики в динамике подтверждают полное восстановление структуры и функции задней конечности кролика с формированием органотипичной гиалиновой хрящевой суставной ткани и образованием субхондральной костной ткани. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования Доклинические «Самарский исследования государственный проводились на медицинский базе ГБОУ ВПО университет» 7 Минздравсоцразвития РФ в Институте экспериментальной медицины и биотехнологий (ИЭМБ) (директор д.м.н. профессор Л.Т. Волова). Научное исследование разделено на два блока: in vitro – исследования на культурах клеток и in vivo – на животных. Объектом исследования были кролики породы «Шиншилла» обоих полов. Возраст кроликов составил 9-12 месяцев, масса – 2,5-3 кг. Выбор животных обусловлен достаточно полными данными об их анатомии и физиологии, частым использованием их для изучения регенерации тканей. Технический процесс был разделен на следующие этапы: забор реберного хряща, культивирование клеток, создание клеточно-тканевого трансплантата, применение клеточно-тканевого трансплантата в эксперименте у кроликов. Все исследования рекомендаций по осуществлялись проведению в рамках медико-биологических международных исследований с использованием животных. Кроликов содержали в условиях стационарного вивария на растительном витаминизированном рационе при свободном доступе к воде. Перед проведением эксперимента были определены границы биологической нормы для всех тестируемых показателей у интактных животных (5 кроликов). Оперативные вмешательства проводили в стерильных условиях с соблюдением правил асептики и антисептики под наркозом (ксилазин и золетил). Оперированных животных содержали поодиночке. Для выведения кроликов из эксперимента применяли наркоз (одномоментное внутривенное введение летальной дозы тиопентала натрия). Забор аллогенной реберной гиалиновой хрящевой ткани осуществляли заранее у 15 кроликов, не вошедших в экспериментальное исследование. В стерильных условиях, под наркозом после обработки операционного поля растворами антисептиков, линейным разрезом вдоль нижнего края грудино-реберного сочленения острым скальпелем рассекали кожу, подкожножировую клетчатку и мышцы, до сочленяющихся с грудиной ребер. Осторожно при помощи скальпеля в продольном направлении иссекали фрагмент реберного хряща размером 0,2х0,1 см. Послеоперационную рану послойно ушивали наглухо. 8 Клетки для последующей трансплантации получали в лаборатории культуры клеток ИЭМБ «Сам ГМУ» (зав. лабораторией к.м.н. доцент Россинская В.В.). Культуру клеток из реберного гиалинового хряща выращивали по методу Brittberg et al. (1994, 1996) в модификации лаборатории, в стандартных условиях в термостате Sanyo-Incubator MIR-162 (Sanyo, Япония) при температуре 37°С в пластиковых культуральных флаконах площадью 25 см2 (Orange Scientific, Бельгия). После зарастания дна флакона на 80% клетки пересевали стандартным способом. После 4-кратного пассирования получали чистую культуру фибробластоподобных клеток. Все манипуляции с клетками производили в ламинарном боксе второго класса защиты с соблюдением правил асептики и антисептики. Нативную культуру изучали, морфометрировали и фотографировали с помощью инвертированного микроскопа "Биолам П – 2-1" (ЛОМО, Россия) при увеличении 100 и 150 (окуляры – 10 и 15, объектив – 10). Идентификацию клеток проводили с использованием морфологических, гистохимических, морфометрических и иммуногистохимических методов, проточной цитометрии. Для определения функциональных и биологических свойств клеток из гиалиновой хрящевой ткани их окрашивали суданом IV и жировым красным О для выявления включений липидов, орсеином по Унна Тенцеру. Щелочную сукцинатдегидрогеназу фосфатазу определяли по (СДГ) по Нахласа, – методу методу с Берстона, помощью моноклональных антител к коллагену II типа (Chondrex, inc.) двухэтапным методом. Проточной цитометрией выявляли экспрессию следующих маркеров стромальных и гемопоэтических клеток: CD34, CD44, CD45, CD90, CD105 (AbD Serotec). Проводили оценку биосовместимости и адгезивной способности клеток к различным аллогенным биопластическим материалам, изготовленным по технологии «Лиопласт»®: спонгиозе деминерализованной и недеминерализованной и брефоостеоматриксу. Оценку тропности клеточных культур к бионосителям проводили следующим образом: на дно культуральной чашки Петри помещали образец, 9 затем высевали клетки, предварительно снятые стандартным способом со дна культурального флакона, в дозе 20х10³ клеток на 1 см². Совместное культивирование осуществляли в течение 3 суток. Оценивали скорость пролиферации клеток в культуре, их структурнофункциональные особенности и способность к миграции в присутствии биоимплантатов. Контролем служили чашки Петри с клетками без имплантата. Процесс получения аллогенной деминерализованной спонгиозы включал специальную ультразвуковую обработку костных тканей кролика для удаления элементов костного мозга и жира, проведение первичной стерилизации, вирусной инактивации и дезинфекции материала. После такой обработки фрагменты губчатой костной ткани лиофилизировали, затем герметично упаковывали и электронами на стерилизовали радиационным сертифицированной установке способом – (ускоритель быстрыми У003 с поверхностной дозой 15 кГр). С целью получения аллогенного комбинированного клеточно-тканевого трансплантата деминерализованную спонгиозу кролика помещали на трое суток в культуральные флаконы с клетками, выращенными из реберной гиалиновой хрящевой ткани того же вида животных. Для подтверждения наличия и жизнеспособности клеток на бионосителе использовали конфокальную (Olimpus IX 71, Япония) и растровую электронную микроскопию (JEOL JSM –6390A Analysis Station, Япония). Для оценки эффективности аллогенного клеточно-тканевого трансплантата проведены экспериментальные исследования in vivo на кроликах породы «Шиншилла». Всего в эксперимент вошли 33 кролика. Они были разделены на три экспериментальные группы. Первую (контрольную) группу составили 10 животных, пластику дефектов суставной поверхности которым не выполняли. Вторую группу сформировали 10 животных, у которых костнохрящевые дефекты деминерализованной заполняли только лиофилизированной бионосителем спонгиозой, – аллогенной изготовленной по технологии «Лиопласт»®. В третью группу вошли 13 кроликов, которым проводили пластику дефектов комбинированными клеточно-тканевыми 10 трансплантатами с аллогенными клетками из реберной гиалиновой хрящевой ткани. Животных выводили из эксперимента через 2 недели, 1 месяц, 3 месяца и 6 месяцев после проведения оперативного вмешательства. Операцию осуществляли следующим образом. Всем животным интраоперационно с помощью зубоврачебного бора при малых оборотах формировали 2 цилиндрических костно-хрящевых дефекта в области мыщелков бедренной кости обеих задних конечностей. Диаметр дефектов был 2,5 мм, глубина – 5 мм. Животным второй группы в сформированные дефекты помещали бионоситель, а животным третьей группы – комбинированные клеточно-тканевые трансплантаты. Пластический материал по форме и размерам соответствовал сформированному дефекту, дополнительно его не фиксировали. После ушивания послеоперационной раны иммобилизацию конечности кроликам не проводили. В процессе эксперимента с целью визуализации области пластики дефектов и забора биопсийного материала осуществляли артротомию оперированных коленных суставов. Макроскопическую оценку коленных суставов животных в динамике производили с помощью специальной шкалы, разработанной S. О' Driscoll et al. Для гистологического анализа осуществляли забор дистального отдела бедренной кости. Материал фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, затем проводили в спиртах восходящей крепости и заливали в парафин. Изготавливали серийные срезы толщиной 5-6 мкм на всю глубину блока на роторном микротоме Sakura Accu-Cut SRM200 (Sakura Finetek, Япония). Гистологические препараты окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван-Гизон, крезиловым фиолетовым. Препараты изучали светооптически при помощи биологического микроскопа Nikon Alphaphot-2 YS2-H (Nikon, Япония), телеметрически при помощи видеокамеры KCC31OPD. Проводили морфометрию, измеряя длину, ширину, диаметр клеток, а также подсчитывали среднее количество клеток в поле зрения при помощи системы анализа изображений «Видео-Тест Морфо» (Автандилов Г.Г 11 Компьютерная микротелефотометрия в диагностической гистоцитопатологии., М., Медицина, 1996, 256 с.). Для определения характера репаративного процесса в динамике использовали морфологическую шкалу оценки заживления поврежденного суставного гиалинового хряща, предложенную Д.А. Маланиным с соавторами (2004). Компьютерную томографию проводили на мультиспиральном компьютерном томографе TOSHIBA Aquilion 32 (TOSHIBA, Япония) во фронтальной и сагиттальной плоскостях, с толщиной среза 3 мм. Рентгенографию коленных суставов выполняли животным в рентгенологическом кабинете с помощью аппарата PHILIPS med 10 50 cp (PHILIPS, Германия). Снимки делали в прямой и боковой проекции. Эффективность различных методов лечения была проанализирована с позиции доказательной медицины (Котельников Г.П., Шпигель А.С., 2000). Была вычислена частота неблагоприятных исходов в группе лечения (ЧНИЛ) и контрольных клинических группах (ЧНИК). Далее были рассчитаны следующие показатели: 1. Снижение абсолютного риска (САР) – абсолютная арифметическая разница в частоте неблагоприятных исходов между группами лечения и контроля: САР = ЧНИЛ – ЧНИК 2. Снижение относительного риска (СОР) – относительное снижение частоты неблагоприятных исходов в группе лечения по сравнению с контрольной группой: СОР = (ЧНИЛ – ЧНИК) / ЧНИК 3. Число больных, которых необходимо лечить каждым исследуемым способом для предотвращения неблагоприятного исхода у одного больного (ЧБНЛн): ЧБНЛн =1 / ЧНИЛ – ЧНИК = 1 / САР 12 Затем была вычислена частота благоприятных исходов в группе лечения (ЧБИЛ) и контрольных клинических группах (ЧБИК) и рассчитаны следующие показатели: 4. Повышение абсолютной пользы (ПАП) – абсолютная арифметическая разница в частоте благоприятных исходов между группами лечения и контроля: ПАП = ЧБИЛ – ЧБИК 5. Повышение относительной пользы (ПОП) – относительное увеличение частоты благоприятных исходов в группе лечения по сравнению с контрольной группой: ПОП = (ЧБИЛ – ЧБИК) / ЧБИК Показатели снижения относительного и абсолютного риска и повышения относительной и абсолютной пользы рассчитывали вместе с 95% доверительным интервалом. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Исследования in vitro Начиная с третьих суток после эксплантации фрагментов реберного гиалинового хряща в культуральный флакон наблюдали рост клеток. Они проявляли выраженную адгезивную способность ко дну культурального пластика, имели удлиненную форму, 3-5 отростков, анастомозирующих с отростками соседних клеток. Контуры клеток четко были очерчены, цитоплазма более светлая по периферии и более темная гомогенная в центральных зонах, ядра круглые или слегка овальной формы расположены центрально. В окрашенных препаратах ядерная оболочка гладкая, ядра содержат одно-два ядрышка, хроматин в них расположен диффузно. Для растущей культуры было характерно большое количество двуядерных клеток. При окраске жировым красным О и суданом IV в цитоплазме клеток визуализировали мелкие вакуоли нейтрального жира, а при реакции Нахласа – мелкие равномерные зерна формазана. Реакция на щелочную фосфотазу в них отрицательная. Эти клетки способны синтезировать коллаген II типа. Фенотипирование культивированных клеток с помощью проточной цитометрии 13 и иммуногистохимии показало принадлежность этих клеток к стромальным, об этом свидетельствовала экспрессия маркеров CD44, CD90, CD105 и отсутствие экспрессии на их поверхности маркеров гемопоэтических клеток CD34, CD45. Все это свидетельствует, что фибробластоподобные клетки выращенные из реберного хряща, являются прогенеторными мезенхимальными стромальными клетками хрящевого дифферона. Исследование таких клеток на биосовместимость и адгезивную способность к различным костным пористым трехмерным биоматериалам, изготовленным по технологии «Лиопласт»®, показало что лучшим по итогам тестирования оказался брефоматрикс, к нему хорошо пристают клетки. Однако в связи с существующими юридическим нормами имеются препятствия для применения этого материала в клинике. Так же хорошие результаты получили при совместном культивировании с деминерализованной спонгиозой. Тестируемый материал не нарушал адгезивную функцию клеток. Уже через 2 часа после посева клетки начинали приставать ко дну культуральной чашки, а через сутки клетки прикреплялись к испытуемому образцу и количество их прогрессивно увеличивалось. Совместное культивирование с недеминерализованной спонгиозой показало, что фибробластоподобные клетки не приставали к этому материалу и проявляли практические нулевую тропность к нему, что делало невозможным применение его в качестве бионосителя. По итогам тестирования для создания клеточно-тканевого трансплантата в качестве 3D бионосителя была выбрана деминерализованная спонгиоза. Клеточно-тканевой трансплантат создавали следующим образом: на данный бионоситель высевали клетки, выращенные из реберного хряща, в дозе 5 тыс. клеток на 1 мм3 и культивировали в стандартных условиях в течение 3 дней. Исследование клеточно-тканевого трансплантата с помощью растровой электронной микроскопии показало наличие на поверхности и в порах биоматериала распластанных отростчатых клеток. При изучении трансплантата с помощью конфокальной флюоресцентной микроскопии в глубинных слоях бионосителя обнаруживали светящиеся клетки. 14 Для оценки эффективности аллогенного клеточно-тканевого трансплантата проведены экспериментальные исследования in vivo на кроликах породы «Шиншилла». Макроскопические исследования коленных суставов животных без хондропластики в течение всего динамического наблюдения показали деформацию суставной поверхности мыщелков бедра. Сформированный регенерат был серым и тусклым. При микроскопическом исследование через 2 недели в группе животных пластику дефектов которым не проводили, обнаружили, что вся область операции заполнена новообразованной рыхлой соединительной тканью реципиента, в которой имеется воронкообразная деформация суставной поверхности. К 6 месяцам эта область была представлена волокнистой хрящевой тканью, не доходящей до уровня интактной хрящевой поверхности. Сформирована субхондральная кость губчатой формации, которая в пограничных участках резко утолщена. Гиалиновый хрящ, прилежащий к месту дефекта суставной поверхности истончен, содержит небольшое количество хондроцитов. Нечётко выражено разделение на кальцинирующий и некальцинирующий слои хрящевой ткани. В отдалении от дефекта зональность строения хрящевой ткани восстанавливается. Отмечается большое количество дистрофически измененных хондроцитов разной формы, многочисленные пустые лакуны, широкие лакуны с единичными хондроцитами. Большинство клеток содержат пикнотические ядра. В группе животных, дефекты которым восполняли только бионосителем, макроскопически область пластики почти полностью замещалась новообразованной тканью, резко отличающейся ярко бордовым цветом и неровной поверхностью от окружающего хряща. Вокруг этой области виден ореол инъецированных сосудов. На гистологических препаратах у животных этой группы регенерат в глубинных участках представлен ретикулофиброзной костной тканью с большим количеством остеобластов и единичными остеокластами, участвующими в перестройке костной ткани, а в поверхностных слоях имело место формирование волокнистой соединительной ткани. К концу 15 эксперимента дефект был восполнен новообразованной пластинчатой костной тканью губчатой формации с явлениями остеопороза и с прослойкой тонкой соединительной ткани в поверхностной зоне. В поверхностной зоне прилежащего к области регенерата гиалинового хряща наблюдается развитие дистрофическое повреждение ткани. В опытной группе после пластики дефектов клеточно-тканевым трансплантатом при визуальном осмотре зона операции не отличалась от окружающей суставной поверхности уже к 3 месяцам эксперимента. Ткань регенерата блестящая, бело-голубого цвета, без видимых признаков дегенерации. Через 2 недели на микропрепаратах у животных данной группы определяли пористый трансплантируемый материал, тесно спаянный с окружающими тканями. Визуализировали рассасывающиеся трабекулы пересаженной деминерализованной спонгиозы, все пространство которых было заполнено большим количеством фибробластоподобных клеток. Через месяц после проведенной хондропластики пересаженный материал не определялся, на его месте образовалась новая ткань, отличающаяся полиморфно-клеточной картиной. Клетки были разного размера и формы: большие, малые и средние. К этому времени сформировалась субхондральная кость, в трабекулах которой отмечали большое количество остеоцитов. Процесс перестройки костной ткани имел незавершенный характер. По краям костных балок наряду с остеобластами обнаруживали многоядерные остеокласты. К 3 месяцам при применении клеточно-тканевого трансплантата для замещения костно- хрящевых дефектов регенерат был восполнен незрелой хрящевой тканью, поверхностный слой которого представлен островками мелких клеток тесно прилегающих друг к другу. Окружающие их клетки более крупные интенсивно, окрашенные. Имелось много делящихся клеток, которые образовывали, так называемые, монетные столбики. Субхондральная кость была представлена пластинчатой костной тканью губчатой формации. Прилежащая к зоне регенерата соседняя интактная область представлена типичным гиалиновым хрящом, имеющим зональное строение. К 6 месяцам поверхность новообразованного суставного хряща была гладкая и ровная. Регенерация 16 имела завершенный характер – отмечали практически полное восстановление структуры суставного хряща с формированием типичного трехслойного строения гиалиновой хрящевой ткани этой локализации. Хрящевые клетки были крупные, округлой формы, с крупным базофильно окрашенным ядром и светлой цитоплазмой. Имело место большое количество двуядерных клеток. На препаратах хорошо контурировалась зона кальцификации. Непосредственно под хрящевой тканью была сформирована субхондральная костная пластина, имеющая остеонное строение. Нижележащие слои представлены губчатой костью. Полученные на макро- и микроскопическом уровне результаты согласуются с данными рентгенограмм и компьютерной томографии. У кроликов, замещения суставных дефектов которых не проводилось, начиная со 2 месяца на рентгенограммах хорошо визуализировались и прогрессировали деструктивные изменения в суставе, характерные для остеоартроза сужение суставной щели, склероз замыкательных пластинок, образование остеофитов. На серии компьютерных томограмм на протяжении всего периода наблюдения обнаруживались дефекты суставной поверхности, хорошо отличимые от окружающего хряща, не восстановленные до его уровня. Расположенные погранично с дефектом участки гиалинового хряща дистрофически изменены. Многие хондроциты погибли, отмечаются пустые лакуны, отсутствуют изогенные группы хрящевых клеток. Размеры хрящевых клеток резко варьируют. В группе животных, пластику костно-хрящевых дефектов которых проводили только бионосителем, в динамике на серии компьютерных томограмм наблюдали полное заполнение зоны дефектов тканью, визуально не отличимой от окружающего гиалинового хряща. Аналогичную картину отмечали и при пластике дефектов комбинированными клеточно-тканевыми трансплантатами. Однако, начиная с 4 месяца, на рентгенограммах коленных суставов животных с выполненной пластикой дефектов бионосителем начинали появляться и в дальнейшем прогрессировали признаки остеоартроза. 17 В группе животных, у которых суставные дефекты были замещены комбинированными трансплантатами, деструктивных процессов в суставах не наблюдали на протяжении всего экспериментального исследования. Для обоснованного определения эффективности различных методов лечения проанализированы полученные результаты с позиции доказательной медицины. Выполнение пластики суставных костно-хрящевых дефектов только бионосителем – деминерализованной сонгиозой (II группа) позволило снизить абсолютный риск развития неблагоприятных исходов на 8,5% по сравнению с отсутствием замещения Применение пластики дефектов суставной костно-хрящевых поверхности дефектов (I группа). комбинированными клеточно-тканевыми трансплантатами по разработанному нами способу (III экспериментальная группа) позволило снизить абсолютный риск на 16,3% по сравнению с группой I. Относительный риск развития неблагоприятных исходов во II группе снижен на 55.3%, а в III группе на 71,4% по сравнению с I группой. Число животных, которых необходимо лечить (выполнять пластику суставных дефектов) для предотвращения неблагоприятного исхода у одного животного в первой группе составило 16,38 животных, во второй – 11,74, в третьей – 6,14. Повышение абсолютной пользы при выполнении пластики дефектов суставной поверхности только бионосителем составило 8,5% (группа II по сравнению с группой I). А при замещении костно-хрящевых дефектов комбинированными клеточно-тканевыми трансплантатами (группа III по сравнению с I группой) соответствующий показатель составил 16,3%. Относительная вероятность получения благоприятного исхода во II группе животных по сравнению с I составила 11,2%. В III экспериментальной группе кроликов повышение относительной пользы было равно 21,3%. ВЫВОДЫ 1. При травматических повреждениях суставного хряща заполнение интраоперационного костно-хрящевого дефекта клеточно-тканевым 18 трансплантатом является эффективным средством регенераторной медицины, обеспечивающей репаративный характер хондрогенеза с формированием de novo органотипичной суставной гиалиновой хрящевой ткани, субхондральной кости с образованием компактной костной пластины и сохранением структуры окружающего хряща. 2. Клеточный компонент для создания клеточно-тканевого трансплантата получают из гиалиновой хрящевой ткани реберного хряща. Такие клетки в культуре имеют фибробластоподобную форму, по 2-3 отростка, жировые включения в цитоплазме, продуцируют коллаген II типа, позитивны по маркерам стромальных клеток CD44, CD90, CD105 и негативны по маркерам гемопоэтических клеток CD34, CD45, что позволяет идентифицировать их как прогениторные клетки хрящевого дифферона. 3. Клетки в культуре, полученной из реберного хряща, in vitro способны к спонтанной хондродифференцировке. При культивировании на пластике процесс трасформации малодифференцированных отростчатых клеток в зрелые клетки округлой формы происходит через 10 дней, а в присутствии биоимплантата – через 3 дня, что косвенно свидетельствует о наличии в нем индуктора хондрогенеза. 4. По биодоступности и результатам тестирования in vitrо различных пористых аллогенных материалов деминерализванная спонгиоза, изготовленная по технологии «Лиопласт» ®, является оптимальным 3D-носителем для создания аллогенного клеточно-тканевого трансплантата. Наличие и жизнеспособность клеток на трехмерном пористом бионосителе подтверждено растровой и конфокальной электронной микроскопией. 5. Сравнительный морфологический анализ результатов экспериментальных исследований показал, что при незаполнении дефекта пластическим материалом имеет место воронкообрзная деформация суставной поверхности и образование в зоне повреждения волокнистой соединительной ткани. При проведении пластики поверхность сустава восстанавливалась. При этом при применении только бионосителя происходило замещение дефекта преимущественно губчатой костной тканью с явлениями остеопороза, а при 19 применении клеточно-тканевым трансплантатом наблюдался репаративный хондрогенез и восстановление типичной структуры субхондральной кости. 6. Комплексная оценка функционального состояния оперированной конечности кролика с помощью количественных морфологических методов, методов лучевой диагностики и доказательной медицины свидетельствует о прогрессивном развитии остеоартроза и высоком риске осложнений у животных без пластики и с пластикой только бионосителем. При применении клеточно-тканевого трансплантата позволило достичь более раннего и полного восстановления функций оперированной конечности, предотвратить развитие деструктивно-дистрофических процессов в суставах животных, снизить риск возможных осложнений с 4,5 до 79%. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Использование аллогенных носителей для культуры клеток хрящевой ткани при хондропластике / Г.П. Котельников, Л.Т. Волова, Ю.В. Ларцев, М.А. Тертерян // «Инновационные технологии в трансплантации органов, тканей и клеток»: Материалы Всероссийской конференции с международным участием. – Самара, 2008. – С. 191-193. 2. Применение комбинированного клеточно-тканевого трансплантата для лечения деструктивно-дистрофических заболеваний коленного сустава / Г.П. Котельников, Л.Т. Волова, В.В. Россинская, М.А. Тертерян // Материалы 18 международного конгресса европейской ассоциации клеточных банков. – Польша, Краков, 2009. – С.249. 3. Тертерян, М.А. Новый способ пластики дефектов суставного гиалинового хряща комбинированным клеточно-тканевым трансплантатом / Д.А. Долгушкин, М.А. Тертерян // Аспирантские чтения – 2009 (приложение к межвузовскому журналу «Аспирантский вестник Поволжья»). – Самара, 2009. – С. 20-25. 4. Применение нового комбинированного клеточно-тканевого трансплантата при пластике дефектов суставного гиалинового хряща у кроликов / Г.П. Котельников, Л.Т. Волова, Д.А. Долгушкин, М.А. Тертерян // 20 «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии»: Материалы IV Всероссийского симпозиума с международным участием. – С.-Петербург, 2010. – С. 81. 5. Новый способ пластики дефектов суставного гиалинового хряща комбинированным клеточно-тканевым трансплантатом / Г.П. Котельников, Л.Т. Волова, Д.А. Долгушкин, М.А. Тертерян // Травматология и ортопедия России. – С.-Петербург, 2010. – №1. – С. 150-155 6. Экспериментальное обоснование применения бионосителя клеток гиалиновой хрящевой ткани деминерализованной спонгиозы «Лиопласт»® для пластики дефектов суставного хряща у кроликов» / Г.П. Котельников, Л. Т. Волова, Ю.Д. Ларцев, М.А. Тертерян // Материалы IХ съезда травматологовортопедов. – Саратов, 2010. – том III. – С. 114. 7. Применение аллогенного трехмерного наноструктурированного бионосителя в составе комбинированного клеточно-тканевого трансплантата для хондропластики у кроликов / Г.П. Котельников, Л.Т. Волова, Д.А. Долгушкин, М.А. Тертерян // Материалы 19 международного конгресса европейской ассоциации клеточных банков. – Германия, Берлин, 2010. – С. 46. 8. помощью Тертерян, М.А. Восстановление суставного гиалинового хряща с нового клеточно-тканевого трансплантата (экспериментальная работа) / М.А. Тертерян //Материалы докладов конкурса программы У.М.Н.И.К., IV Всероссийская (78-я Итоговая) студенческая научная конференция «Студенческая наука и медицина XXI века: традиции, инновации и приоритеты», – Самара, 2010. – С. 44-45. 9. при Тертерян, М.А. Регенерация суставной гиалиновой хрящевой ткани хондропластике аллогенным клеточно-тканевым трансплантатом (экспериментальное исследование) / Л.Т. Волова, М.А. Тертерян, Е.А. Белозерцева // Регенеративная биология и медицина: Материалы Всероссийской научной конференции. – Москва, 2011. – С. 40-41. 10. Природный наноструктурированный биоматрикс для адресной доставки клеточных культур в регенеративной медецине / Г.П. Котельников, 21 Л.Т. Волова, Россинская В.В., Тертерян М.А. и др. // Семинар «Передовые российские технологии», – Испания, Мадрид, 2011. – С. 11-12. 11. Природный аллогенный наноструктурированный 3D бионоситель «Лиопласт»® для клеточных технологий / Л.Т. Волова, М.А. Тертерян, Тимченко, В.В. Болтовская // Сербия, Белград, 2011. 12. Оценка жизнеспособности клеток на бионосителе при помощи конфокальной микроскопии / Л.Т. Волова, П.Е. Тимченко, В.П. Захаров, В.В. Болтовская, М.А. Тертерян и др.// Морфологические ведомости. – 2011. – № 3. С. 22-27. ПАТЕНТЫ 1. Патент на изобретение РФ № 2402339 от 27.10.2010 «Клеточный трансплантат для лечения деструктивно-дистрофических заболеваний и травматических повреждений суставного хряща» / Котельников Г.П., Волова Л.Т., Россинская В.В., Теретерян М.А. Заявка № 2008138030 от 23.09.2008; приоритет от 23.09.2008. Опубликовано 27.10.2010. Бюллетень № 30. 2. Патент на изобретение РФ № 2402340 от 27.10.2010 «Клеточный трансплантат для лечения заболеваний и травматических повреждений суставного хряща» / Котельников Г.П., Волова Л.Т., Тертерян М.А., Болтовская В.В. Заявка № 2008139126 от 01.10.2008; приоритет от 01.10.2008. Опубликовано 27.10.2010. Бюллетень № 30. 22 Подписано в печать _____________. Формат 60×80/16. Объем 1 . печ. л. Тираж 100 экз. Бумага офсетная. Печать оперативная. Отпечатано в типографии ООО «ЦПР». 443013, г. Самара, Московское шоссе, 3. Тел. (846) 276-85-92, 276-85-72. 23
