Иммуноэлектрофорез и родственные методы
advertisement
Иммуноэлектрофорез и родственные методы Белки обладают антигенными свойствами, что широко используется при их изучении. Реакцию между растворимыми белками и специфическими по отношению к ним преципитирующими антителами проводят в гелях или на пленках из ацетата целлюлозы с помощью различных методов простой или двойной иммунодиффузии. Такие иммунодиффузионные тесты можно применять и к белкам, предварительно разделенным путем электрофореза. В определенных условиях антиген и антитело мигрируют при электрофорезе в противоположных направлениях. Если их движение навстречу друг другу обусловлено электромиграцией, а не диффузией, то такой иммунохимический тест называют электросинерезом (синонимы: встречный электрофорез, иммуноэлектроосмофорез). Количественное определение белков можно осуществлять с помощью электрофореза в среде, содержащей антитела (электроиммуноанализ, электроиммуно-диффузия, ракетный иммуноэлектрофорез). Этот метод применяют также для анализа смеси белков, предварительно разделенных в процессе электрофореза (перекрестный иммуноэлектрофорез, перекрестный электрофорез в среде с антителами). Методы иммунопреципитации, обладающие большой чувствительностью, позволяют не только обнаруживать и точно идентифицировать белки, но и проводить их количественное определение. Используя антитела с различной специфичностью, можно проверять белки на наличие или отсутствие у них определенных генетических маркеров или определенных структурных субъединиц. Кроме того, антигенную природу белковых компонентов можно исследовать путем их сравнения с известными антигенами. Таким образом, различные комбинации электрофоретических методик с иммунохимическим анализом служат чрезвычайно эффективным и разносторонним способом изучения свойств белков. Очевидно, что эффективность иммунохимических тестов зависит от специфичности используемых антисывороток, а также от их титра и сродства к антигенам. Для адекватной характеристики антигенов необходимо хорошо знать специфичность применяемой антисыворотки. Иммуноэлектрофорез в агаровых или агарозных гелях В своей классической форме иммуноэлектрофорез представляет сочетание электрофореза в агаровом (или агарозном) геле с последующей двойной иммунодиффузией в той же среде. При двухмерной двойной иммунодиффузии антиген и антитело, помещенные в круглые или прямоугольные углубления в геле, мигрируют навстречу друг другу, в результате чего «в «нейтральной» зоне среды, где они встречаются, образуются линии преципитации (рис. 1). Положение полос преципитации зависит от коэффициента диффузии антигена (скорость диффузии антитела можно рассматривать как постоянную) и концентрации антигена относительно антитела. Существует определенный интервал концентраций антигена и антитела, в котором их соотношение является оптимальным для образования преципитата. При двойной иммунодиффузии в этом интервале относительных Рис. 1 А – Двухмерная двойная иммунодиффузия из прямоугольных канавок. концентраций 1-канавка для антигена; 2- канавка для антител. Б – Иммуноэлектрофорез. (называемом зоной 1, 3-5 – электрофоретически разделенные компоненты смеси антигенов; 2 – прямоугольная канавка для смеси антигенов (стартовая зона электрофореза); 6 - канавка для антител (иммунной сыворотки). эквивалентности) получаются четкие линии преципитации. Сочетание электрофореза с двойной иммунодиффузией впервые описали в 1953 г. Грабар и Уильяме. С тех пор было опубликовано большое число подробных обзоров, посвященных иммуноэлектрофорезу. Исходный метод обычно называют макрометодом (рис. 1), так как в нем применяют относительно большую стеклянную пластинку (13Х Х18 см), покрытую слоем геля толщиной 2—4 мм. В геле вырезают поперечную канавку и заполняют ее образцом, смешанным с расплавленной при 45°С агарозой. После завершения электрофореза в геле вырезают продольные канавки (параллельные направлению миграции) и заполняют их раствором преципитирующих антител, специфических по отношению к анализируемым антигенам. Затем пластинку помещают в горизонтальном положении во влажную камеру и выдерживают при постоянной температуре до тех пор, пока в результате диффузии не образуются линии преципитации. Описан ряд модификаций этого макрометода. В 1955 г. Шейдеггер впервые предложил микровариант иммуноэлектрофореза. Благодаря этому простому, быстрому и сравнительно дешевому методу иммуноэлектрофорез нашел широкое применение в повседневной практике. Для формирования геля используют предметные стекла (25X75 мм). Антигены, подвергаемые электрофорезу, помещают в небольшие лунки, а антитела – в продольные канавки. Следующую за электрофорезом иммунодиффузию проводят таким же способом, как и в макрометоде. Количество вносимой в канавку антисыворотки составляет 50—70 мкл. При обычном иммуноэлектрофорезе иммунодиффузию осуществляют так, как если бы это была двойная иммунодиффузия из расположенных под прямым углом канавок или из круглых лунок и канавок. Однако разделенные при электрофорезе зоны не имеют четко очерченной формы, и вещества в них распределены неравномерно. Поэтому линии преципитации на иммуноэлектрофореграмме представляют собой более или менее удлиненные симметричные или асимметричные дуги. Удлинение дуг наблюдается, в частности, в тех случаях, когда в анализируемом образце содержатся вещества, обладающие одинаковой антигенной активностью, но разной электрофоретической подвижностью (наиболее известным примером подобных антигенов являются нормальные иммуноглобулины). Если антиген удерживается гелем (как, например, в случае микроглобулинов или ЛНП), то образуются линии преципитации неправильной формы. Иммуноэлектрофорез имеет более низкую чувствительность, Рис. 2 А. Приспособление для вырезания канавок при иммуноэлектрофорезе (фирма LKB-Gelman). Слева — вид чем двойная иммунодиффузия, приспособления снизу: 1 — рамка; 2 — штамп; 3 — прорези, в поскольку в процессе которые вставляют штампы для вырезания круглых лунок; 4 — электрофореза происходит лезвия для вырезания продольных канавок; 5 — зажимы для разбавление антигенов фиксации штампа в рамке в нужном положении. Справа — то же вследствие расширения приспособление в собранном виде, установленное над пластинками. Б. Вырезание продольных канавок с помощью разделенных зон. трафарета и режущего колесика (фирма Sevac). 1—пластинка, на которой проводят электрофорез; 2—трафарет из органического стекла; 3 — режущее колесико с ручкой. Результаты иммуноэлектрофореза, очевидно, зависят от факторов, действующих как во время электрофореза, так и на этапе иммунодиффузии. Повышение разрешающей способности электрофореза приводит к улучшению разделения полос преципитации. На иммунодиффузию влияют специфичность, титр и сродство используемой антисыворотки, а также концентрация антигенов и геометрическое расположение в геле лунок для антигенов и канавок для антител. Одинаковые по размеру и форме углубления для антигенов и антител можно вырезать с помощью специальных устройств, таких, как набор штампов системы LKBGelman, предназначенный для микроиммуноэлектрофореза на предметных стеклах (рис. 2,А). Можно использовать трафареты из органического стекла. В этом случае лунки вырезают цилиндрическими штампами, а канавки — режущими колесиками, подобными тем, которые применяются в системе Sevac (Прага) (рис 2,Б). Гель из канавок для антител рекомендуется удалять только после завершения электрофореза, чтобы зоны не получились искривленными. При использовании трафарета и режущего колесика вырезание канавки для антител также можно отложить до окончания электрофореза. Кроме того, эти приспособления позволяют вырезать канавки любой нужной длины. Более короткие канавки удобны с двух точек зрения: они дают возможность экономить иммунную сыворотку и проводить сравнение антигенных свойств электрофоретически разделенных веществ. После завершения иммунодиффузии иммуноэлектрофореграмму можно сразу же сфотографировать без всякой обработки геля, причем лучше в рассеянном свете (при темнопольном освещении). Кроме того, линии преципитации можно окрасить каким-либо белковым красителем. Перед окрашиванием непрореагировавшие белки необходимо отмыть солевым раствором. Для этого пластины геля вымачивают в течение 24—48 ч в солевом растворе, который несколько раз меняют. В последний раз гель промывают дистиллированной водой. Во время промывания слой геля может отделиться от стеклянной пластинки. Чтобы этого не произошло, стеклянную пластинку перед нанесением на нее горячего агарового золя следует покрыть тонкой, пленкой агара (на пластинку наливают разбавленный золь агара и дают ему высохнуть). После промывания гель накрывают полоской влажной фильтровальной бумаги, размеры которой на несколько сантиметров должны превышать размеры геля. Гель вместе с бумагой высушивают под вентилятором, а затем отделяют бумагу от высушенного слоя агара. Линии преципитации можно окрашивать практически любым красителем, применяемым для окрашивания белков после электрофореза в агаровом или агарозном гелях. Рис. 3 Пример иммуноэлектрофоретического титрования: серийные разведения нормальной сыворотки человека и поликлональной сыворотки, взятой у больных гиперглобулинемией. Как уже отмечалось, картина преципитации, получаемая при иммуноэлектрофорезе, сильно зависит от свойств иммунной сыворотки. Для каждого компонента смеси антигенов существует определенный диапазон концентраций, в котором получаются хорошо сформированные четкие линии преципитации (зона эквивалентности). В многокомпонентных смесях концентрация отдельных антигенов может различаться в широких пределах. Концентрация (титр) антител в применяемой иммунной сыворотке также может варьировать в значительной степени. Таким образом, вполне возможна ситуация, при которой зоны эквивалентности для разных компонентов смеси не будут перекрываться. В связи с этим иммуноэлектрофорез многокомпонентных смесей рекомендуется проводить при нескольких относительных концентрациях антиген-антитело, так как при использовании только одной такой концентрации можно не обнаружить какие-то компоненты. Предложен, в частности, метод иммуноэлектрофореза с применением последовательных разведений сыворотки человека. Этот метод «иммуноэлектрофоретического титрования» полезен для полуколичественного определения от дельных белков сыворотки и для обнаружения моноклональных иммуноглобулинов (рис. 3). Кроме метода титрования существуют и другие способы количественного определения антигенов путем иммуноэлектрофореза. Был описан метод, основанный на принципе простой иммунодиффузии, при которой углубления для антигенов и антител примыкают непосредственно друг к другу. Антиген, находящийся в одной части геля, диффундирует в другую, содержащую антитела, и на границе этих двух частей образуется линия преципитации. Первичная зона преципитации растворяется затем в избытке антигена, продолжающего поступать благодаря диффузии в ту часть геля, где находятся антитела. Растворимые комплексы антигенантитело вновь преципитируют при реакции с антителами в прилежащей зоне геля. Описанная последовательность событий — преципитация, Рис. 4 А. Простая линейная иммунодиффузии в одном направлении. 1 — растворение и гель, содержащий антитела; hi—h* — расстояние, пройденное «передним краем преципитата при повышающихся концентрациях антигена. Б. повторная Простая двухмерная иммунодиффузии. J — участок геля, содержащего преципитация — антитела; 2—участки геля, содержащие антиген в повышающихся создает впечатление, концентрациях; h1-h4 — расстояние, между самой дальней точкой дуги что преципитат преципитата и границей между двумя гелями при возрастающих движется. Путь, концентрациях антигена. Б. Количественный иммуноэлектрофорез по Бакхаушу и др. и по Оухтерлони. После электрофореза участок геля (1) пройденный передним заменяют гелем, содержащим антитела. Во время иммунодиффузии краем преципитата за несколько раз измеряют расстояние К исходя из которого рассчитывают тот или иной период концентрацию антигена. Показано, что расстояние λ также может быть времени, может использовано для определения концентрации антигена. 2 — служить мерой для прямоугольная канавка для антигена (стартовая зона электрофореза). определения концентрации антигенов. При этом в качестве стандартов необходимо использовать образцы с известной концентрацией антигена. При количественном иммуноэлектрофорезе для проведения простой иммунодиффузии разделенных компонентов в геле вырезают широкую канавку, непосредственно примыкающую к лунке с антигеном (рис. 4), и заполняют ее агаровым золем, содержащим антитела в относительно низкой концентрации. После того как в геле, содержащем антитела, образуются преципитаты, измеряют расстояние, на которое переместился их передний край. По методу, предложенному Альфонсо, точно измеренный объем раствора антигена подвергают электрофорезу. Затем пластинки оставляют на некоторое время, чтобы дать материалу, разделившемуся при электрофорезе, диффундировать, после чего поверхность геля дважды в течение 1 ч покрывают антисывороткой (4—5 мкл/см2). Образуются зоны преципитации круглой или овальной формы. Количество антигена рассчитывают по величине поперечного диаметра этих зон. Электрофоретич ески разделенные антигены можно сравнивать с известными антигенами по принципу двойной Рис. 5 Сравнение антигенов «методом прерванной канавки». Слияние иммунодиффузии. преципитатов указывает на антигенную идентичность. Экспериментальные подходы для таких исследований предложены несколькими авторами. Методика Хереманса и др, позволяет сравнивать некоторые компоненты двух смесей антигенов, предварительно подвергнутых электрофорезу. С этой целью канавку с антителами укорачивают или прерывают участком геля, не содержащим антител, что позволяет соответствующим зонам преципитации взаимодействовать между собой. В результате на иммуноэлектрофореграмме возникает картина, указывающая на полную или частичную идентичность либо на неидентичность сравниваемых антигенов (рис. 5). Оссерман и Хансон применили другую методику, согласно которой по обеим сторонам электрофоретически разделенных антигенов вырезают продольные канавки. Одну канавку заполняют иммунной сывороткой, а другую — раствором стандартного антигена (рис. 6). Вдоль этих канавок между стандартным антигеном и соответствующими антителами образуется сплошная линия преципитации. Если в анализируемой смеси присутствует антиген, родственный стандартному, то происходит реакция, указывающая на полную или частичную идентичность этих антигенов. Следует отметить, что при сравнительной иммунодиффузии тот или иной характер взаимодействия между двумя антигенами обусловлен не только их свойствами, но и специфичностью используемой иммунной сыворотки. Если наблюдается реакция, свидетельствующая о полной идентичности двух антигенов, то, строго Рис. 6 Сравнение антигенов по методу Оссермана и Хансона. говоря, это означает, что Форма линий преципитации при отсутствии идентичности (1), данная антисыворотка не при частичной идентичности (2); антиген содержит не все обнаруживает между ними антигенные детерминанты, присутствующие в стандартном никаких различий. Однако антигене) и при полной идентичности (3). это вовсе не исключает возможности того, что один из сравниваемых антигенов имеет антигенную детерминанту, которая отсутствует у другого и может быть обнаружена при использовании другой иммунной сыворотки. ИММУНОДИФФУЗИЯ В АГАРОВОМ (АГАРОЗНОМ) ГЕЛЕ ПОСЛЕ ПРОВЕДЕНИЯ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В ДРУГОЙ СРЕДЕ Агаровый или агарозный гель является наиболее подходящей средой для иммунодиффузии. В «классическом» варианте иммуноэлектрофореза и электрофорез, и иммунодиффузию осуществляют в одном и том же геле. Однако во многих случаях иммунодиффузию приходится проводить уже после того, как макромолекулы были разделены в другой среде, менее подходящей для иммунодиффузии. Паулик еще в 1852 г. применил иммунодиффузию для анализа антигенов, разделенных с помощью электрофореза на бумаге. Хотя иммунодиффузию можно осуществлять и на ацетате целлюлозы, Кон предложил переносить антигены с ацетата целлюлозы в агаровый гель вместо того, чтобы проводить весь иммуноэлектрофо-ретический анализ на ацетате целлюлозы. Пленку из ацетата целлюлозы, на которой антигены подвергали электрофорезу, разрезают на две половинки; одну из них окрашивают, а из другой вырезают полоску шириной 1 см (на расстоянии 1 см от центральной линии) и помещают ее на поверхность заранее приготовленного агарового геля, следя за тем, чтобы под ней не образовывались пузырьки воздуха. Можно также быстро окрасить одну половинку полоски, а вторую разрезать на кусочки, так чтобы каждый из них содержал отдельную электрофоретическую фракцию. Эти кусочки пленки помещают на поверхность агарового геля, оставляя между ними промежутки в несколько миллиметров. Пропитанные соответствующей антисывороткой полоски фильтровальной бумаги шириной 2 мм кладут на гель параллельно кусочкам пленки и на оптимальном расстоянии от них. Это расстояние определяется теми же факторами, что и в случае иммуноэлектрофореза в агаровом геле. После завершения иммунодиффузии с поверхности геля удаляют полоски бумаги и кусочки пленки, а затем фотографируют полученную картину преципитации. Для приготовления стабильных препаратов гель высушивают и окрашивают по методике, предназначенной для иммуноэлектрофореграмм в агаре. Удаление лишних белков перед высушиванием геля, как правило, не является обязательным. Иммунохимическая характеристика разделенных компонентов возможна и в том случае, если электрофорез проводят в крахмальном геле. После электрофореза крахмальный гель разрезают обычным способом на тонкие пластинки (желательно толщиной не более 0,3 мм), а пластинки — на полоски, соответствующие электрофоретически разделенным антигенам. Полоски переносят на стеклянные пластинки и заливают их теплым агаровым золем. Затем на определенном расстоянии от полоски крахмального геля и параллельно ей вырезают канавки для антисыворотки. После завершения иммунодиффузии полоски крахмального геля удаляют, образовавшуюся щель заполняют теплым агаровым золем и дают ему застыть. Непреципитировавшие белки можно удалить из геля путем промывания, после чего гель высушивают и окрашивают, как обычно. Если полоски крахмального геля отбирают для иммунодиффузии путем сравнения с параллельной окрашенной полоской, то следует учитывать, что гель сжимается в процессе окрашивания и обесцвечивания. Для предотвращения ошибок на этом этапе Паулик рекомендует перед разрезанием блока геля на пластинки на его смежных сторонах вырезать через равные интервалы отверстия. При сопоставлении окрашенных и неокрашенных пластинок геля эти отверстия служат указателями для последующего вырезания участков геля, содержащих анализируемые антигены. Паулик провел иммунохимический анализ, выявив таким способом локализацию фракций, разделенных двухмерным электрофорезом в крахмальном геле. Для анализа антигенов, разделенных с помощью электрофореза или электрофокусирования в полиакриламидном геле, разработаны многочисленные методы иммунодиффузии. Так, для этой цели можно использовать различные варианты двойной иммунодиффузии. Цилиндрические столбики геля разрезают продольно на две половинки, а из пластин нарезают полоски, содержащие разделенные антигены. Разрезанный гель помещают на стеклянные пластинки, заливают их теплым раствором агара и дают ему застыть. Канавки для антител располагают на соответствующем расстоянии от полиакриламидного геля. Как только полиакриламидный гель покроется слоем агара толщиной 1 мм, в непосредственной близости от него сразу же вырезают канавку для антисыворотки. Если для анализа используют разрезанные вдоль столбики полиакриламидного геля, то их кладут на слой агарового геля и в нем рядом с полоской геля по обеим ее сторонам быстро вырезают канавки для антител. Преципитаты образуются под полоской полиакриламидного геля. Столбик полиакриламидного геля можно также разрезать в поперечном направлении на диски и проанализировать присутствующие в них антигены методом двойной радиальной диффузии. Кроме того, для анализа антигенов применяют принцип простой иммунодиффузии. Лучше всего это сделать, поместив продольно разрезанные цилиндрические столбики геля на поверхность агарового геля, содержащего антитела. Оптимальную концентрацию антител, которую следует внести в гель, определяют в предварительных опытах. Был предложен еще один интересный экспериментальный прием. Полиакриламидный гель формируют в виде полого цилиндра, используя для полимеризации трубочку, в середину которой помещен пластмассовый стержень (из органического стекла или тефлона). Полимеризацию и электрофорез проводят, не вынимая из трубочки пластмассовой вставки. После завершения электрофореза вставку вынимают и образовавшийся канал заполняют теплым агаровым золем, содержащим антитела. Полосы преципитации выявляются в виде дисков. Картину преципитации можно наблюдать, не вынимая геля из стеклянной трубки. Цейне и др. назвали этот метод «иммуноэлектрофорезом с сердцевиной» и применили его для анализа белков мочи. ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗ НА АЦЕТАТЕ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ Электрофорез на ацетате целлюлозы проводят обычным способом. Антиген наносят в виде капли или короткой полоски. Для наблюдения за миграцией образца рекомендуется использовать краситель. После электрофореза полоски пленки помещают во влажную камеру. Для этой цели удобно использовать плоскую пластмассовую коробку с плотно прилегающей крышкой. Пленку кладут на подложку из фильтровальной бумаги с прямоугольной прорезью так, чтобы с подложкой соприкасались только края пленки. Подложки можно изготавливать, например, из нескольких слоев фильтровальной бумаги ватман № 3. Крышку коробки следует выстлать поролоновой губкой, которую увлажняют, чтобы во время иммунодиффузии в камере поддерживалась влажная атмосфера. Подложки также смачивают раствором электролита, используемым для пропитывания пленок. Полоски фильтровальной бумаги (ватман № 1) шириной 1—2 мм пропитывают антисывороткой, проводя по ним пастеровской пипеткой, которую держат в вертикальном положении. Оптимальное количество антисыворотки и расстояние между полоской с антисывороткой и образцом подбирают эмпирическим путем. Если полоска содержит только часть необходимого количества антисыворотки, то остальной объем наносят уже после того, как полоску помещают на пленку. Оптимальное время диффузии следует определять в предварительных опытах; как правило, для этого требуется 18—48 ч. Линии преципитации не видны на пленках и обнаружить их можно только после окрашивания. С этой целью избыток белка удаляют путем промывания пленки солевым раствором в течение нескольких часов, после чего преципитаты можно окрасить так же, как зоны, получаемые при электрофорезе на ацетате целлюлозы. Лучше всего пользоваться водорастворимыми красителями (пунцовый S или нигрозин). Иммунофиксация Альпер и Джонсон предложили метод, позволяющий с минимальной диффузией проводить преципитацию электрофоретически разделенных белков. После завершения электрофореза в агарозном геле на его поверхность равномерно наносят соответствующую иммунную сыворотку, и гель, установленный в строго горизонтальное положение, инкубируют во влажной атмосфере в течение 2 ч. Затем гель покрывают тонким листом влажной фильтровальной бумаги, на который сверху кладут три листа толстой бумаги и стеклянную пластинку с грузом 2— 3 кг. Через 10 мин бумагу снимают с геля, промывают его в течение 6 ч солевым раствором, споласкивают дистиллированной водой, высушивают и окрашивают. Такая методика позволяет улучшить разделение веществ, идентичных (или сходных) в антигенном отношении, но слегка различающихся по подвижности. В основном она применяется для исследования генетического полиморфизма некоторых белков. Этот же принцип Альпер и Джонсон использовали для иммунофиксации белков после электрофореза в крахмальном геле. При этом они увеличивали время инкубации с антителами до 2 ч и затем тщательно отмывали гели в солевом растворе и воде. Гель окрашивали так же, как при обычном электрофорезе в крахмальном геле. Фельгенхауэр проводил иммунофиксацию белков после микроэлектрофореза в полиакриламидном геле. Гель помещали в небольшие сосудики, содержавшие 50—60 мкл антисыворотки. Преципитация происходила при 4°С в процессе встряхивания сосудиков. Преципитаты окрашивали после удаления непрореагировавшего белка путем промывания гелей. Крейг и Вайхер предложили аналогичную методику для столбиков геля обычных размеров. Коттон и Мильштейн разделяли белки методом изоэлектрофокусирования на пластинах полиакриламидного геля. Затем электрофореграммы покрывали полосками фильтровальной бумаги (ватман № 3 ММ), пропитанными антисывороткой в соответствующем разведении. Гель вместе с полосками фильтровальной бумаги инкубировали в течение 24 ч при 37 °С во влажной атмосфере. После интенсивного промывания гель окрашивали. При разделении радиоактивных антигенов высушенные гели подвергали радиоавтографии. Электросинерез (встречный электрофорез, электроиммуноосмофорез) Этот метод, впервые предложенный Бассардом ,широко используется в лабораторной практике. Он позволяет обнаруживать реакцию преципитации между растворимыми антигенами и антителами. Реагенты помещают в отдельные углубления в агаровом или агарозном геле, содержащем соответствующий буфер. Их миграция в геле навстречу друг другу осуществляется не в результате диффузии, а под действием электрического поля. В связи с этим метод электросинереза применяется только в тех случаях, когда при определенных условиях антиген и антитело движутся в противоположных направлениях или когда скорости их миграции в одном направлении сильно различаются. Согласно первоначальному методу, в углубления вносили реагенты, смешанные с подогретым агаровым золем, однако теперь многие авторы не используют агар для этой цели. Большинство преципитирующих антител относится к классу иммуноглобулинов G (IgG), обладающих лишь очень слабым отрицательным зарядом при рН 8—9. Поэтому электроосмотический поток смещает IgG к катоду. Электроэндосмос заметно уменьшается при замене агара агарозой. Путем подбора определенных соотношений агара и агарозы можно регулировать скорость эндосмоса, создавая тем самым оптимальные условия для электросинереза. Очевидно, что антитела следует помещать ближе к аноду, а антиген — ближе к катоду. Если расположить рядом несколько лунок с антигенами, то последние можно сравнивать между собой подобно тому, как это делается в методе двойной иммунодиффузии. Видимые линии преципитации образуются в течение 1—2 ч. Избыток реагентов удаляют, продолжая электрофорез после образования преципитатов. При этом нет надобности отмывать гель перед окрашиванием, что позволяет в течение 3— 4 ч получить полную картину окрашенных полос преципитации. На практике электросинерез наиболее часто используют в клинической диагностике для обнаружения и идентификации некоторых антигенов и антител. Многие авторы сообщали о выявлении с помощью этого метода В-антигена гепатита (австралийский антиген).Электросинерез (называемый также встречным иммуноэлектрофорезом) представляет собой высокоспецифический, быстрый, простой и сравнительно дешевый метод обнаружения вируса В гепатита. По чувствительности этот метод в 2—10 раз превосходит иммунодиффузию, однако существуют и другие, даже более чувствительные (хотя и менее специфические) методы. При определении антител, а не антигенов чувствительность метода снижается. Электросинерез, подобно иммуноэлектрофорезу, можно проводить на пленках из ацетата целлюлозы. Электроиммуноанализ (электроиммунодиффузия, ракетный иммуноэлектрофорез) Суть метода электроиммуноанализа заключается в том, что антигены в процессе электрофореза мигрируют в гель, содержащий антитела, в результате чего происходит реакция преципитации. В обратной постановке опыта антитела перемещаются в гель, содержащий антиген. В строгом смысле слова этот метод не является электрофоретическим. Если рассматривать электросинерез как аналог двойной иммунодиффузии, то электроиммуноанализ можно считать аналогом простой иммунодиффузии. Как правило, антигены мигрируют в гель, содержащий антитела. Раствор антигенов помещают в лунки, вырезанные в геле. Во время электрофореза образуются зоны преципитации, имеющие форму пиков (рис 8). Передний край преципитата перемещается с постепенно уменьшающейся скоростью по направлению к одному из электродов до тех пор, пока мигрирующий антиген не перестает поступать в избытке. Впервые электроиммуноанализ описали Лорелл, а также Мерилл и др.Позже Лорелл и Вееке опубликовали подробное описание этого метода, а Фербрюгген дал исчерпывающий обзор соответствующей литературы (включая метод перекрестного иммуноэлектрофореза). Электроиммуноанализ проводится следующим образом. Готовят 0,8—1,5%-ный золь агарозы в соответствующем буфере. После охлаждения золя до 45—55 °С его смешивают с антисывороткой или с Рис. 7 Электроиммунный анализ восстановленного и алкилированного IgM крысы. Лунки для антигенов содержат выделенными антителами и (слева направо) 1,0; 0,75; 0,5 и 0,25 мкг стандартного белка и формируют слой геля толщиной три параллельные пробы антигена с неизвестной 1—1,5 мм. С этой целью теплый концентрацией. Перед электроиммунным анализом все золь агарозы выливают на образцы были обработаны 1 М KOCN при 45 °С в течение 30 стеклянную пластинку, с. Гель содержал 1% козьей антисыворотки к IgM крысы. установленную строго горизонтально, или заливают агарозу в форму, образованную двумя стеклянными пластинками и U-образной рамкой. Рамку оставляют между стеклами до завершения электрофореза, но ее можно удалить и залить освободившееся пространство агарозой. Как правило, требуется сравнительно небольшое количество антисыворотки, но оно, естественно, зависит от ее титра. Для количественного анализа наиболее удобны пики преципитации высотой 20—30 мм. Работать следует с самым большим разведением антисыворотки, при котором еще возможно образование видимого преципитата. Разведение антигена должно быть подобрано соответствующим образом. Если исследуют антигены с мол. массой более 200 000, то в этом случае особенно важно разбавлять реагенты до такой степени, чтобы происходила лишь слабая преципитация, поскольку крупные комплексы таких антигенов с антителами могут забивать поры в геле, что приведет к образованию полос преципитации неправильной формы. Лунки диаметром 3—4 мм вырезают в геле ближе к его катодному концу. Делают это с помощью пластмассового трафарета и металлической трубки с достаточно острыми краями. Простое приспособление такого типа описал Вееке. Лунки должны быть расположены на расстоянии не менее 6 мм друг от друга и 1—1,5 см от краев геля (во избежание краевых эффектов). Чаще всего используют 20—80 мМ вероналовые буферы с рН 8,6. При таком значении рН средняя подвижность антител в гелях агарозы близка к нулю. Электрофорез можно проводить либо при относительно высоком напряжении (8— 10 В/см) в течение 2—4 ч (быстрый ракетный электрофорез, при котором необходимо эффективное охлаждение), либо при низком напряжении (2 В/см) более длительное время (удобно проводить электрофорез в течение ночи). При электроиммуноанализе и перекрестном иммуноэлектрофорезе используют, как правило, антитела кроликов или коз. С антителами лошади были получены неудовлетворительные результаты, что, вероятно, объясняется более высокой подвижностью антител гипериммунной сыворотки данного вида. Петерфи и др. получили отчетливые, хорошо оформленные преципитаты путем превращения антител лошади во фрагменты F(ab')2. Это, по-видимому, обусловлено тем, что фрагменты F(ab'h обладают такой же подвижностью, как и у-глобулины, тогда как антитела мигрируют вместе с γглобулинами. Фрагменты получают путем обработки цельной сыворотки пепсином при рН 3,6 и последующего дробного осаждения гидролизата (NH4)2S04. После электрофореза непреципитированные белки можно удалять промыванием солевым раствором. Лорелл рекомендует более быстрый способ. Гель покрывают листом фильтровальной бумаги, величина которого слегка превышает размеры геля. Затем на него помещают слой толстой фильтровальной бумаги толщиной 2—3 см, а сверху кладут легкий груз (около 10 г/см2), например толстую стеклянную пластинку. Через 10—15 мин фильтровальную бумагу снимают и гель промывают в течение 15 мин солевым раствором. После многократного промывания солевым раствором гель вымачивают в течение 15 мин в дистиллированной воде, опять кладут на 10—15 мин под пресс и, наконец, сушат горячим воздухом. Сухие пластинки геля можно окрашивать обычными красителями для белков или с помощью более специфических реакций. Строго говоря, площадь под пиком преципитата пропорциональна количеству внесенного антигена и обратно пропорциональна концентрации антител в геле. Если допустить, что высота пика преципитата пропорциональна его площади, то можно с достаточной точностью определить количество антигена путем измерения расстояния от верхнего края лунки до вершины пика. Для получения калибровочной кривой на гель наносят ряд стандартных антигенов с известной концентрацией. Сколари и др. обнаружили, что линейная зависимость между площадью пика и количеством антигена сохраняется в более широком интервале концентраций антигена по сравнению с такой же зависимостью между концентрацией антигена и высотой пика. Точность метода зависит от того, насколько близки между собой размеры молекул и величина зарядов исследуемых и стандартных антигенов. Воспроизводимость количественных определений наиболее высока в том случае, когда образуются симметричные пики преципитации с отчетливыми внутренними и внешними границами. Стандартная ошибка может при этом составлять 2—5%, несколько превышая ошибку, которую дает простая радиальная иммунодиффузия при оптимальных условиях. С помощью электрофореза в геле, содержащем антитела, можно проводить сравнительный анализ антигенов. Данный вопрос обсуждают Грабб и более детально Аксельсен и его соавторы. Здесь мы рассмотрим один из многих возможных вариантов этого метода. Стандартный антиген помещают в прямоугольную канавку, а исследуемый образец — в круглую лунку, расположенную ближе к катоду. При таком расположении можно получить картину, указывающую на полную или частичную антигенную идентичность, либо на отсутствие идентичности (рис. 89). Эта методика представляет собой упрощенный вариант ракетно-линейного иммуноэлектрофореза. В обычных условиях (вероналовый буфер, рН 8,6, ионная сила 0,02—0,08) подвижность преципитирующих антител у большинства видов животных практически равна нулю. В действительности, конечно, это не совсем так, поскольку антитела гетерогенны по своей электрофоретической подвижности. И тем не менее для правильного проведения электроиммуноанализа необходимо, чтобы основная масса антител оставалась неподвижной. Такое ограничение суживает пределы применимости метода, так как те антигены, которые в указанных условиях движутся к аноду не намного быстрее, чем антитела, будут давать несимметричные пики, а следовательно, данный метод непригоден для точного определения их количества. Рис. 8 Сравнение антигенов методом Грабба. А. Неидентичность антигенов 5 и 1. Б. Полная идентичность антигенов 5 и 2. В. Частичная идентичность антигенов 5 и 3 (антиген 5 является неполным по отношению к антигену 3). Г. Частичная идентичность антигенов 5 и 4 (антиген 4 неполон по отношению к антигену 5). Указанное ограничение можно устранить, если повысить анодную подвижность антигенов путем их химической модификации. Сделать это можно с помощью карбамилирования, а также реакции с формальдегидом или с 3-про-пиолактоном. Способ карбамилирования очень прост: к исследуемым и стандартным пробам добавляют 2 М KOCN в соотношении 1 : 1 (объем/объем). Смесь оставляют на 30 мин при 45°С, а затем охлаждают в ледяной бане, чтобы остановить реакцию, Пробы разводят до необходимого объема буфером, после чего они готовы для электроиммуноанализа. Шуллер и Темпе ;описали надежный метод электроиммуноанализа малых количеств медленно мигрирующих антигенов (иммуноглобулинов), основанный на добавлении в гель карбоксиметилцеллюлозы. Если предполагается проводить электроиммуноанализ при более низком значении рН, то химической модификации должны быть подвергнуты антитела. Было проведено детальное изучение реакции карбамилирования антител. Варьируя продолжительность реакции, можно легко контролировать степень карбамилирования и таким образом получать антитела, обладающие при нужном значении рН нулевой электрофоретической подвижностью. Так, например, карбамилированные антитела дают возможность проводить электроиммуноанализ иммуноглобулинов при рН 5,0, когда иммуноглобулины перемещаются к катоду под действием электроосмоса. Преимущество использования модифицированных антител состоит в том, что оно позволяет избежать модификации исследуемых образцов. Перекрестный иммуноэлектрофорез (перекрестный электрофорез в системе антиген-антитело) Настоящий метод можно рассматривать как электроиммуноанализ белков, предварительно разделенных методом электрофореза (рис. 10). Исторически этот метод появился раньше, чем электроиммуноанализ, поскольку Лорелл описал его в 1965 г., тогда как электроиммуноанализ был применен им в 1966 г. в качестве метода, позволяющего использовать возможности перекрестного иммуноэлектрофореза для количественных определений. Существуют два основных варианта перекрестного иммуноэлектрофореза. Первый вариант — это исходный метод, предложенный Лореллом. Подробное его описание (включая ряд модификаций) было сделано Ганротом. Второй вариант представляет собой модификацию первоначального метода. Согласно варианту Лорелла, в канавку вносят смесь антигенов и проводят электрофорез в агарозном геле так, как это описано Иохансоном. Электрофореграмму разрезают по длине и каждую полоску помещают в канавку соответствующего размера, вырезанную в геле, содержащем антитела. В модифицированном методе электрофореграмму, полученную при электрофорезе в первом направлении, целиком переносят на вторую пластинку, а свободную поверхность пластинки заливают гелем, содержащим антитела. Метод Лорелла обладает более высокой разрешающей способностью. С другой стороны, он пригоден лишь для сравнительного исследования компонентов на одной электрофореграмме, тогда как модифицированный метод позволяет осуществлять анализ известных количеств белков и, таким образом, обеспечивает возможность количественного сравнения компонентов на разных пластинках. Если для разделения белков в первом направлении прибегают к изоэлектрофокусированию (перекрестное иммуноэлектрофокусирование), то возникает ряд проблем. Агароза является мало подходящей средой для ИЭФ, поскольку этот метод требует среды, в которой отсутствует электроосмос. Можно, конечно, использовать для ИЭФ полиакриламидный гель, а разделение во втором направлении проводить в агарозном геле, содержащем антитела. Однако, как будет видно из дальнейшего изложения, применение разных сред также имеет ряд недостатков. Один из возможных путей решения этой проблемы заключается в приготовлении агарозы, из которой получается гель почти с нулевым зарядом (см. разд. 1.9.2). В этом случае весь анализ (изоэлектрофокусирование и последующий электрофорез в геле, содержащем антитела) можно проводить в агарозном геле. Таким способом осуществляли перекрестное иммуноэлектрофокусирование Иохансон и Иертен, а также Вейс и др. Первые авторы проводили электрофорез во втором направлении при рН 8,2—8,6, так как в применяемой ими среде подвижность антител при этом рН была близка к нулю. Замечания по технике проведения перекрестного иммуноэлектрофореза. В оригинальной методике Лорелла при электрофорезе в первом направлении рекомендуется вырезать канавку для образца размером 1ХЮ мм. Кроме того, необходимо использовать буфер, обладающий не слишком низкой ионной силой (например 70 мМ вероналовый буфер, рН8,6), и высокое напряжение (до 20 В/см) с эффективным охлаждением системы. Для электрофореза во втором направлении из центральной части электрофореграммы вырезают полоску шириной 2—5 мм и переносят ее на пластинку геля, которую готовят по способу, рекомендуемому для электроиммуноанализа. Разрезать гель следует по линейке острой и тонкой бритвой, чтобы уменьшить выделение жидкости с поверхности среза. В геле, содержащем антитела, делают два параллельных разреза недалеко от его катодного конца. Перенос полоски геля является очень ответственным этапом. Предварительно со стеклянной пластинки удаляют весь окружающий гель, а капли жидкости высушивают фильтровальной бумагой. Полоску геля переносят с помощью тонкого стального лезвия на край тонкого предметного стекла. Затем прилипшую к нему полоску геля переносят в канавку, вырезанную в геле для второго направления (рис. 9,А). Оба этапа электрофореза проводят на пластинках геля размером 10X20 см. Второй гель может вмещать две или больше полосок, перенесенных с первого геля (в зависимости от длины электрофореграммы, полученной в первом направлении). Соответствующую концентрацию антисыворотки подбирают эмпирическим путем; обычно она бывает в 1,5—2 раза выше оптимальной концентрации, используемой для электроиммуноанализа. Антиген, концентрация которого может варьировать в пределах 50—500 мкг/мл, вносят в гель первого направления в объеме 10 мкл -(на второй гель переносят около одной трети указанного количества). Соотношение количеств антигена и антител должно быть подобрано таким образом, чтобы пики преципитации были высотой 10—30 мм. Более высокие пики могут ухудшить разрешение, а слишком малые трудно использовать для количественного определения. В модифицированном методе оба этапа электрофореза проводят на стеклянных пластинках размером 8Х11 см. Для антигенов вырезают четыре круглые лунки. На первом этапе электрофореза, осуществляемом при Рис. 9 Схематическое изображение перекрестного напряжении 10—15 В/см, применяют иммуноэлектрофореза. А. Метод Лорелла. £. Метод охлаждение. После завершения Минчина-Кларка и Фримера. В, Устройство для электрофореза по краям пластинки проведения электрофореза в первом направлении по Бредвеллу и Барнету. удаляют слой геля шириной 10 мм, а остальной гель разрезают на четыре полоски, параллельно направлению электрофореза. Тонким лезвием бритвы каждую полоску переносят на стеклянную пластинку такого же размера, как и первая (рис. 9). Полоску геля помещают на край пластинки, а ее свободную поверхность заливают агарозой, содержащей антитела. После того, как второй гель застынет, проводят электрофорез во втором направлении при низком напряжении (2— 2,5 В/см) в течение 18—22 ч. Описанный метод используют главным образом для одновременного количественного определения всех компонентов какой-либо гетерогенной смеси. Для этой цели нужна антисыворотка, содержащая антитела ко всем анализируемым компонентам, причем титр этих антител должен быть достаточно высоким, чтобы образовались преципитаты, поддающиеся измерению. Подобную «сбалансированную» антисыворотку трудно получить путем иммунизации. Ганрот предлагает готовить антисыворотки высокого титра для нескольких антигенов, а затем смешивать их в таком соотношении, при котором обеспечивается адекватное содержание антител для каждого антигена. Очевидно, более выгодно использовать при перекрестном иммуноэлектрофорезе смесь антигенов в двух разных концентрациях. Само количественное определение заключается в измерении площадей под пиками преципитации. Его можно провести с помощью полуавтоматического электронного планиметра. Другой способ состоит в том, что пластинку проецируют на лист белой бумаги, пики обводят карандашом, вырезают и взвешивают. Если методика электрофореза отличается высокой воспроизводимостью и форма преципитатов близка к симметричной, то площадь пика можно рассчитать, умножая его высоту на ширину, измеренную на половине высоты пика. Количественное определение можно сделать более точным, если использовать «внутренний» стандарт, который в известном количестве добавляется к образцу. Такое вещество при электрофорезе в первом направлении должно мигрировать в зону, не содержащую анализируемых белков. При исследовании белков сыворотки крови в качестве «внутреннего»' стандарта служил ацетилированный альбумин. Вееке рекомендует применять для этой цели карбамилированный трансферрин. Площадь всех остальных пиков сравнивают с площадью пика, образуемого внутренним стандартом, и результаты выражают в относительных единицах. Идентификация отдельных антигенов в сложной смеси представляет собой довольно трудную задачу. Если имеется очищенный антиген, то его можно добавлять к анализируемой смеси, и при этом будет наблюдаться увеличение соответствующего пика преципитации. Можно, наоборот, добавлять к смеси антигенов моноспецифическую антисыворотку,, что приведет к уменьшению пика соответствующего антигена. Другая возможность заключается в том;, что между гелем первого направления и гелем:, содержащим полиспецифические антитела, помещают гель, содержащий один из антигенов в очищенной форме. Движущийся из промежуточной зоны антиген образует продольную линию преципитации, которая сольется с пиком преципитации идентичного антигенного компонента смеси, разделенной в первом направлении (рис 11). Рис. 10 Перекрестный иммуноэлектрофорез сыворотки козы (А, КС) и лошади (Б, ЛС) с использованием кроличьей антисыворотки к белкам сыворотки козы (аити-КС) и лошади (антиЛС) соответственно. Для сравнения приводятся окрашенные электрофореграммы первого направления. Кроме иммунохимических методов для идентификации некоторых компонентов можно ' применять специфические методы окрашивания или связывания со специфическими лигандами (например, таким образом обнаруживают в сыворотке гаптоглобины или тироксинсвязывающие белки). МИКРОМОДИФИКАЦИЯ ПЕРЕКРЕСТНОГО ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗА В АГАРОЗНОМ ГЕЛЕ Микромодификации описанного выше метода были разработаны с целью экономии антисыворотки и времени, а также для того, чтобы сделать его более пригодным для использования в повседневной практике. Эти микромодификации вполне удовлетворяют указанным требованиям и лишь немного уступают в точности исходному макроварианту. Правда, число антигенов, выявляемых и количественно определяемых микрометодом на одной пластинке, вероятно, меньше их истинного числа. Стефан и Фрам описали метод перекрестного иммуноэлектрофореза на пластинках размером 5X5 см. При электрофорезе в первом направлении в круглые лунки, вырезанные в геле, вносят три параллельных образца. После электрофореза гель разрезают и полоску с электрофореграммой одной из крайних проб оставляют на пластинке, а две другие полоски переносят во влажную камеру и сохраняют в качестве резерва. На освободившуюся поверхность пластинки наливают золь агарозы, содержащий антитела, и проводят электрофорез во втором направлении, перпендикулярном первому. Авторы использовали стандартную камеру для иммуноэлектрофореза. Вееке описал аналогичный вариант данного метода. Электрофорез в первом направлении проводят на пластинках размером 10Х Х10 см. На каждой пластинке делают по восемь канавок (IX Х(3 мм) для образцов. После первого разделения полоски (1X5 ем) переносят на пластинки размеров 5X5 см для электрофореза в геле, содержащем антитела. Если при разделении в первом направлении каждый образец наносят в виде двух параллельных проб, то одну из них можно окрасить сразу после электрофореза. Рис. 11 Сочетание линейного иммуноэлектрофореза с перекрестным иммуноэлектрофорезом и методом промежуточного геля. А. Промежуточный гель состоит только из забуференной агарозы. Б. Гель первого направления отсутствует, промежуточный гель содержит очищенный антиген d (линейный иммуноэлектрофорез). В. Гель первого направления содержит антигены а—е, а промежуточный гель — очищенный антиген d (компонент смеси d образует пик, сливающийся с продольным преципитатом). Г. Промежуточный гель содержит моноспецифические антитела к компоненту d. Антисыворотку подвергали истощению растворимым антигеном а, избыток которого образовал линию преципитации. Дэвис и др. разработали полуавтоматическую микротехнику для повседневных анализов. Они предлагают пользоваться пластинками, предварительно покрытыми слоем геля. Гель разрезают на полоски шириной 1 см и каждую из них переносят на новую пластинку, свободную поверхность которой заливают агарозным гелем, содержащим антитела. Электрофорез осуществляют в приборе, позволяющем переключать ток с первого направления на второе путем простого изменения электрических контактов, не прикасаясь к пластинкам (рис. 12). Была предложена техническая модификация микрометода перекрестного иммуноэлектрофореза, которая дает возможность получать прямую базовую линию для всех преципитатов. Перед электрофорезом в первом направлении гель разрезают на полоски, оставляя между ними промежутки в несколько миллиметров. Круглую лунку для образца вырезают с той стороны полоски, которая должна примыкать к гелю, содержащему антитела (рис. 9,В). По данным авторов, такая модификация улучшает разрешение. ПЕРЕКРЕСТНЫЙ ИММУНОЭЛЕКТР0ФОРЕЗ И ПЕРЕКРЕСТНОЕ ИММУНОИЗОЭЛЕКТРОФОКУСИРОВАНИЕ С ПРИМЕНЕНИЕМ РАЗНЫХ СРЕД В ПЕРВОМ И ВТОРОМ НАПРАВЛЕНИЯХ В 1966 г. появились первые сообщения об использовании при электрофорезе крахмального геля в первом направлении и ага-розного —во втором. Фагерхол и Лорелл описали сочетание диск-электрофореза в крахмальном геле с электрофорезом в агарозном геле, содержащем антитела к антитрипсину, причем они обнаружили 12 хорошо разделившихся фенотипических вариантов (см. рис. 106). Крахмальный гель разрезали в горизонтальном направлении и из нижнего слоя (толщиной 2 мм) вырезали полоски шириной 2 мм, которые помещали в канавки, сделанные в геле, содержащем антитела. Пространство между краями крахмального и агарозного гелей заполняли жидкой агарозой, нагретой до 45 °С. Более многочисленны работы, в которых для электрофореза в первом направлении применяли полиакриламидный гель, а во втором — агарозный. Авторы отмечают трудности, связанные с относительно большим Рис. 12 Электрофоретическая камера для полуавтоматического эндосмотическим микрометода перекрестного иммуноэлектрофореза, сконструированная током жидкости, Дэвисом и др. Основной блок, позволяющий проводить электрофорез в наблюдающимся при обоих направлениях на одной пластинке, состоит из четырех использовании даже резервуаров (Л—Г). Подсоединение дополнительных модулей (Д и Е) дает возможность проводить электрофорез на нескольких пластинках хороших препаратов одновременно. Стрелки на электрофоретических пластинках (П) агарозы, имеющихся указывают направление тока при электрофорезе в первом нав продаже. Это может правлении. Стрелки яри цифрах 1 и 2 обозначают контакты привести к соответственно первого и второго направлений. серьезному нарушению миграции белков из полиакриламидного геля в агарозный, поскольку в первом геле электроосмос практически отсутствует. Если на стыке между гелями возникнет избыточный ток буфера, то может произойти даже разделение соприкасающихся поверхностей гелей. Чтобы избежать этих осложнений, весь анализ следует проводить в полиакриламидном геле. Детерман и Уолч пытались приспособить для проведения иммунопреципитации крупнопористый полиакриламидный гель с повышенным содержанием акриламида. Однако преципитаты получались в нем менее четкие, чем в агарозном геле. Большинство авторов применяют во втором направлении агарозный гель, обладающий пониженной способностью к эндосмосу. Иоханссон и Стенфлоу использовали агарозу, очищенную на ДЭАЭ-целлюлозе от компонентов, несущих большие отрицательные заряды. Для дальнейшего уменьшения электроэндосмоса повышали вязкость агарозного геля, добавляя к нему метилцеллюлозу (мол. масса 200 000). Лундалл и Лильяс применили агарозу, очищенную на QAEсефадексе и содержащую 0,04% серы. Они получили удовлетворительные результаты без добавления к гелю агентов, повышающих его вязкость. Чтобы избежать образования градиентов проводимости и рН, авторы вымачивали вырезанный кусок полиакриламидного геля в течение 15 мин в буфере, используемом для электрофореза во втором направлении. Этот гель помещали на стеклянную пластинку и всю ее поверхность между гелем и концом, обращенным к катоду, заливали забуференной агарозой без антител. Чтобы предотвратить преципитацию белков в полиакриламидном геле, с другой его стороны с помощью временной прокладки отделяли узкую часть пластинки и покрывали ее тем же раствором агарозы. На остальной поверхности стеклянной пластинки формировали гель, содержащий антитела. В той же работе описан другой способ устранения трудностей, возникающих при электрофоретическом переносе белков из одной среды в другую. Полоску агарозного геля накладывают на кусок, вырезанный из полиакриламидного геля, и помещают их во влажную камеру, чтобы разделенные белки диффундировали из полиакриламидного в агарозный гель. Как сообщают авторы, при таком способе получаются четкие преципитаты с хорошим разрешением, однако степень диффузии белков варьирует в зависимости от размеров и формы молекулы. Было обнаружено, что при 30 °С за 1 ч в агарозу переходит 20% альбумина. Скуде и Джеппсон в первом направлении проводили ИЭФ в полиакриламидном геле, а антитела включали в комбинированный полиакриламидно-агарозный гель (2% полиакриламида и 0,5% агарозы), вполне пригодный для иммунопреципитации. Во время электрофореза во втором направлении необходимо было накрывать гель тонкой полимерной пленкой, чтобы предотвратить сокращение объема полиакриламидного геля. Джонсон и др. проводили электрофорез в первом направлении в комбинированном геле (5% полиакриламида и 0,8% агарозы), а во втором — в агарозном геле, содержащем антитела. Используют также микровариант дискэлектрофореза в полиакриламидном геле в сочетании с электрофорезом в геле, содержащем антитела. Дэймс и др. применяли стеклянную камеру, которую сконструировали Маурер и Дати для микроэлектрофореза на пластинках полиакриламидного геля (рис. 13). Свободное пространство камеры составляет 75X18X0,75 мм. Дно камеры заплавляют забуференной агарозой. Сверху наслаивают агарозу, содержащую антитела, оставляя верхнюю часть камеры (15 MIM) незаполненной. После застывания агарозного геля на него помещают столбик полиакриламидного геля и заполняют камеру доверху забуференной агарозой. Технические детали этой методики приведены в обзоре Нейхоффа. Электрофорез в геле с антителами проводят в Рис. 13 Диск-микроэлектрофо закрытой камере в вертикальном положении. При рез с последующим этом не было обнаружено накопления жидкости или электрофорезом в агарозном ее обратного тока в результате эндосмоса, несмотря геле, содержащем антитела. на то, что для его предотвращения не применяли Схематическое изображение; каких-либо специальных мер. Между установки. полиакриламидным и агарозным гелями, очевидно, обеспечивается хороший контакт. Авторы подчеркивают, что все эти приемы требуют определенного экспериментального мастерства и навыков. По другой методике после диск-микроэлектрофореза столбик полиакриламидного геля заплавляют в пластину агарозного геля и электрофорез во втором направлении проводят в горизонтальной плоскости. Используя «сбалансированную» антисыворотку (смесь оптимальных количеств разных антисывороток), авторы этой методики смогли разделить и количественно определить 21 белок в сыворотке человека. ЭЛЕКТРОИММУНОАНАЛИЗ И ПЕРЕКРЕСТНЫЙ ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗ НА ПЛЕНКАХ ИЗ АЦЕТАТА ЦЕЛЛЮЛОЗЫ Как уже отмечалось, ацетат целлюлозы является вполне подходящей средой для иммунопреципитации, поэтому его можно использовать также для электроиммуноанализа и в меньшей степени для перекрестного иммуноэлектрофореза. Существенное различие между ацетатом целлюлозы и агарозой состоит в том, что в первом практически отсутствует электроэндосмос. В результате при рН 8,6 большинство антител будет двигаться в электрическом поле к аноду. При анализе антигенов, подвижность которых лишь ненамного превышает подвижность антител, последние будут мигрировать в сторону, противоположную от зоны нанесения антигенов, что приведет к образованию пиков преципитации, лишенных базовой линии. Чтобы свести к минимуму подвижность антител, необходимо снизить рН буферного раствора. Электроиммуноанализ альбумина был осуществлен при рН 6,5, а лактоферрина — при рН 7,4. Белки сыворотки крови, обладающие подвижностью α1- и α2-глобулинов, удалось успешно разделить при рН 8,6, но для разделения трансферрина и иммуноглобулинов пришлось снизить рН до 7,4. Большинство авторов пропитывают пленки антисывороткой, погружая их в раствор антисыворотки соответствующего разведения. В одной из работ подчеркивается, что пленку следует погружать в раствор медленно, чтобы предотвратить захват ею пузырьков воздуха. Затем пленку осушают, помещая ее между листами фильтровальной бумаги, причем этот этап имеет очень важное значение, поскольку количество остающихся на пленке антител зависит от степени осушения При использовании целлогеля (фирменное название желатинизированного ацетата целлюлозы) пленку не погружают в раствор антисыворотки, а, предварительно промыв ее в буфере и осушив между листами фильтровальной бумаги, наносят на нее антитела с помощью специального распределительного устройства, выпускаемого той же фирмой (Chemitron, Италия). Распределительное устройство многократно передвигают по пленке взад и вперед до тех пор, пока в нее не впитается вся жидкость, на что будет указывать исчезновение с поверхности влажного блеска. Пиззолато и др. предпочитают сначала наносить образцы, а затем уже распределять антитела по пленке. Объем образца для электроиммуноанализа на ацетате целлюлозы должен составлять 0,2-0,3 мкл, а на целлогеле – 1мкл. Пиззолато описал перекрестный иммуноэлектрофорез на пленках из целлогеля IM толщиной 0,3 мм в трис-глициновом буфере с рН 8,7. После электрофореза в первом направлении на пленку наносили с помощью специального устройства козью антисыворотку против сыворотки человека. В другой работе для аналогичной процедуры использовали ацетат целлюлозы на подложке из материала, носящего фирменное название mylar. Пленку погружали одним концом в антисыворотку нужного разведения и давали фронту жидкости подняться за счет капиллярных сил на расстояние 2 см от противоположного конца. Затем пленку слегка промокали фильтровальной бумагой и другой ее край погружали в трис-вероналовый буфер с рН 8,9. Из двух описанных методик первая, по-видимому, более удобна, поскольку электрофорез в первом направлении можно проводить в этом случае на пленке, не содержащей антисыворотки. В работе Пиззолато были получены более четкие базовые линии, что, возможно, объясняется особым характером подвижности козьих антител, которые были использованы в этой работе. Способы усиления преципитации при электроиммуноанализе и перекрестном иммуноэлектрофорезе Для выявления малых количеств антигена следует применять сильно разведенные антисыворотки. Однако при слишком сильном разведении образуются очень бледные преципитаты, которые трудно обнаружить. Чувствительность реакции преципитации можно повысить, если применять более чувствительные красители для белка, такие, как кумасси яркий синий. Можно использовать также реакцию с серебром. Описанные в литературе способы выявления антигенов основаны на иммунохимических и физикохимических принципах. Кроме того, применяют антигены и антитела, меченные радиоактивными изотопами. Простейший способ усиления преципитации состоит в том, что после завершения электроиммуноанализа пластинки оставляют на некоторое время во влажной камере. Усиление преципитации в данном случае объясняют существованием в зоне преципитата ненасыщенных антигенных валентностей, которые могут связывать добавочное количество антител. Используя этот принцип, Киндмарк и Торелл наслаивали на раствор антител, меченных 125I, и обнаруживали пики преципитации с помощью радиоавтографии (электроиммуноанализ сначала проводили в геле с немечеными антителами). При таком способе чувствительность обнаружения С-реактивного белка в плазме человека повышалась в 60 раз. Другой иммунохимический прием заключается в том, что на гель наносят антитела, направленные против тех антител, которые используются при первом электроиммуноанализе. Избыток первых антител удаляют промыванием и на гель наслаивают раствор вторых антител. Таким методом Дарси, в частности, анализировал карциноэмбриональный антиген.C целью дальнейшего увеличения чувствительности этого приема вторые антитела можно пометить радиоактивным иодом. Киндмарк и Торелл нашли, что метод с использованием меченых вторых антител является менее чувствительным, чем их собственный метод. Саравис и Бонакер обнаруживали растворимые иммунные комплексы с помощью реакции связывания комплемента. После проведения электроиммуноанализа на пленке из ацетата целлюлозы ее обрабатывали сывороткой морской свинки без предварительного вымачивания в солевом растворе. После реакции связывания комплемента непреципитированные белки удаляли и для дальнейшего усиления иммунной реакции пленку пропитывали антисывороткой к белкам сыворотки морской свинки. Смысл такой обработки заключается в том, что первый компонент системы комплемента вызывает преципитацию тех иммунных комплексов, которые в противном случае остаются растворимыми. Была разработана методика с применением меченого антигена (рис. 14), напоминающая ракетно-линейный иммуноэлектрофорез. При исследовании α-фетопротеина нижний предел чувствительности составлял 20 нг/мл. Меченый антиген наносили на узкую полоску геля на его катодном конце, остальной гель содержал антитела. Лунки для образцов вырезали на границе этих двух участков геля. Рис. 14 Схематическое изображение электроиммунного анализа по методу Нёргарда-Педерсена, в котором для повышения чувствительности используют очищенный меченый антиген. Широко распространенным способом повышения чувствительности иммунопреципитации является добавление к агаровому или агарозному гелю декстрана или полиэтиленгликоля. Хислоп изучал влияние на преципитацию белков декстранов с различными молекулярными массами. Наилучшие результаты были получены с декстранами Т150 и Т500. Костнер и Хадасек исследовали эффективность декстрана Т70 и полиэтиленгликоля (мол. масса 6000) при электроиммуноанализе и перекрестном иммуноэлектрофорезе. Они нашли, что оба полимера обладают одинаковой эффективностью и повышают чувствительность метода в 5 раз при использовании их в оптимальной концентрации (4 г/100 мл).
