На правах рукописи ДРАЙ Роман Васильевич СТРОЕНИЕ
advertisement
На правах рукописи ДРАЙ Роман Васильевич СТРОЕНИЕ ЭПИТЕЛИЯ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ КИШЕЧНИКА КРЫСЫ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ВЫСОКОИНТЕНСИВНОГО ИМПУЛЬСНОГО МАГНИТНОГО ПОЛЯ 03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Санкт-Петербург 2009 2 Работа выполнена на кафедре медицинской биологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования СанктПетербургской государственной медицинской академии им. И.И. Мечникова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Сергей Владимирович Костюкевич Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Андрей Анатольевич Пузырев доктор медицинских наук, профессор Ирина Алексеевна Одинцова Ведущая организация: ГОУВПО Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия Росздрава Защита состоится «___»____________2009 г. в ______ на заседании Диссертационного совета Д.001.022.02 по защите кандидатских и докторских диссертаций Учреждения Российской Академии Медицинских Наук Научноисследовательского института экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН (Адрес: 197376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения РАМН Научноисследовательского института экспериментальной медицины СЗО РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12. Автореферат разослан «___»____________2009 года. Ученый секретарь совета по защите кандидатских и докторских диссертаций доктор медицинских наук Павел Андреевич Дыбан 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Магнитное поле (МП), взаимодействуя с биологическими объектами, приводит к изменению их функционального состояния, а иногда и морфологии, что обуславливает как лечебные эффекты, успешно используемые в медицине, так и патологические нарушения в различных органах и тканях [Bowman J.D., Methner M.M., 2000; Мичурина С.В. и др., 2005]. Наряду со значительным прогрессом в изучении влияния магнитного поля на живые организмы, остается нерешенным вопрос о механизме его действия: универсален ли он для всех видов МП и биологических объектов, или же реакция различных тканей на каждый вид МП характеризуется специфическим проявлением. Решение данного вопроса осложняется большим разнообразием МП и их характеристик (вид МП, интенсивность, частота, время экспозиции и др.). В связи́ с этим в последнее время во всем мире уделяется большое внимание изучению влияния МП на биологические объекты на всех уровнях: молекулярном, клеточном, тканевом, органном, организменном и популяционном. Однако в литературе имеются лишь отрывочные сведения о структурных изменениях в различных тканях при влиянии магнитного поля на биологические объекты. При этом литературные данные часто противоречивы и описывают взаимодействие лишь некоторых видов МП на органы и ткани. Одним из новых методов, применяемых как для диагностических, так и терапевтических целей во многих нейрохирургии, фундаментальных областях медицины исследованиях (неврологии, головного мозга, восстановительной медицине, психиатрии и других) является магнитная стимуляция, действующим началом которой служит высокоинтенсивное импульсное магнитное поле (ВИМП) с величиной магнитной индукции до 1,53 и даже более Тл. Принципы магнитной стимуляции были подробно разработаны и исследованы группой ученых Шеффилдского университета в середине 1980х годов [Barker A., 1991; Evans B.A., 1991; Geddes L.A., 1991; Jalinous R., 1991; Maccabee P.J.et all., 1991; Murray N.M.F., 1991] и в настоящее 4 время находят новые способы применения для лечения различных заболеваний, в том числе и гастроэнтерологического профиля. Однако при применении данного метода для неинвазивной стимуляции центральной нервной системы, периферических нервов и нервных сплетений, под влиянием ВИМП неизбежно оказываются ткани органов, соседних с непосредственными объектами процедуры. На данный момент в литературе существуют противоречивые сведения о безопасном использовании магнитного поля как лечебного и диагностического фактора в целом, так и магнитной стимуляции в частности. Так некоторыми авторами МС считается уже доказанным безопасным методом [Sgro J.A. et al., 1991; Gates J.R. et al., 1992; George M.S. et al., 1999]. В то же время в других работах отмечаются четкие патоморфологические нарушения в виде микровакуолярных изменений 2-6 слоев (в особенности 3-4) коры головного мозга крыс при экспозиции ВИМП 2,8 Тл и с суммарным числом импульсов 100 и более [Matsumiya Y. et al., 1992]. В связи́ с этим представляет теоретический и практический интерес выявление изменений, в том числе и морфологических, не только в объектах магнитной стимуляции, но также и в окружающих тканях и органах с целью предотвращения побочных явлений, возникающих при воздействии ВИМП. Органы желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) могут подвергаться воздействию ВИМП как при непосредственной магнитной стимуляции сплетений вегетативной нервной системы, расположенных в стенке кишечника или вне ее, так и при стимуляции сегментов поясничного и крестцового отделов спинного мозга и спинномозговых корешков. При этом возможно развитие структурных нарушений, способных вызывать патологические реакции со стороны органов ЖКТ, о чем свидетельствуют и литературные данные изучения воздействия разных видов МП как на ЖКТ, так и на другие органы [Загорская Е.А. и др., 1990; Laitl-Kobierska A. et al., 2002; Мичурина С.В. и др., 2005; Kaszuba-Zwoinska J. et al., 2005 и др.]. Таким образом, для предотвращения побочных эффектов магнитной стимуляции необходимо разрабатывать процедуры с учетом всестороннего 5 изучения ее воздействия на все ткани, подвергающиеся экспозиции высокоинтенсивному импульсному магнитному полю. Широкое применение в медицинской практике ВИМП, немногочисленность опубликованных в литературе работ, посвященных изучению его влияния лишь на некоторые органы и ткани и отсутствие данных о воздействии на строение тканей органов ЖКТ, требуют детального изучения этих вопросов и определяют актуальность данного исследования. Цель исследования – выявление структурных изменений в эпителии слизистой оболочки кишечника крысы при воздействии высокоинтенсивного импульсного магнитного поля различных параметров (0,5 Тл 50 Гц и 1,5 Тл 2,5 Гц). Исходя из цели, определены следующие задачи: • изучить морфологические изменения, возникающие в эпителии двенадцатиперстной, среднего отдела ободочной и прямой кишки крысы при воздействии высокоинтенсивного импульсного магнитного поля различных параметров (0,5 Тл 50 Гц и 1,5 Тл 2,5 Гц) на 1, 7 и 14 сутки после окончания воздействия; • изучить морфологию эпителия указанных отделов кишечника белых крыс при кратковременной ежедневной иммобилизации (контроль эксперимента); • провести дифференцировку структурных изменений эпителия слизистой оболочки перечисленных отделов кишечника, вызванных воздействием на животных высокоинтенсивного импульсного магнитного поля и ежедневной иммобилизацией; • изучить реакцию эндокринной гастроэнтеропанкреатической системы кишечника на воздействие данного физического фактора. Научная новизна. В настоящей работе впервые обнаружены и изучены структурные изменения в кишечнике крысы, возникающие при воздействии высокоинтенсивного импульсного магнитного поля (0,5 50 Гц и 1,5 Тл 2,5 Гц). Предложен вероятный механизм данных изменений. 6 Изучены различия в реакции разных отделов кишечника крысы при действии на него ВИМП, предположены причины, более выраженной реакции со стороны двенадцатиперстной кишки по сравнению с таковой среднего отдела ободочной и прямой кишки. Впервые исследована реакция эндокринных клеток кишечника крысы на воздействие данного физического фактора. Выявлена реакция гастроэнтеропанкреатической системы разных отделов кишечника крысы на воздействие ВИМП. Также впервые изучена морфология эпителия слизистой оболочки двенадцатиперстной, среднего отдела ободочной и прямой кишки крысы при кратковременной ежедневной иммобилизации и выявлено, что значимых структурных изменений при данном виде воздействия, способных влиять на ход эксперимента, у крыс не возникает. Теоретическая и практическая значимость работы. Представленная работа является комплексным исследованием влияния высокоинтенсивного импульсного магнитного поля, применяемого при магнитной стимуляции, на эпителий разных отделов кишечника крысы. В фундаментальном плане полученный фактический материал о воздействии ВИМП на эпителий желудочно-кишечного тракта дополняет уже имеющиеся данные о влиянии магнитного поля на биологические объекты. Полученные данные могут служить основой для прогнозирования неблагоприятных эффектов ВИМП на другие органы и ткани. В практическом аспекте исследование позволяет оценить влияние высокоинтенсивного импульсного магнитного поля на эпителий ЖКТ, и по результатам работы возможно проведение коррекции рекомендованной разработчиками процедуры для проведения магнитной стимуляции или разработка нового протокола, с учетом возможных побочных явлений при ее использовании. Основные положения, выносимые на защиту: 1. Высокоинтенсивное импульсное магнитное поле 0,5 Тл 50 Гц и 1,5 Тл 2,5 Гц при ежедневной 10 минутной экспозиции в течение 10 дней оказывает 7 влияние на эпителий слизистой оболочки кишечника крысы, вызывая комплекс структурных изменений на микроскопическом и субмикроскопическом уровнях. Нарушения, выявляемые во всех изучаемых отделах, при действии ВИМП разных параметров сходны, но различаются временем возникновения и их выраженностью. Полное восстановление в эпителии и собственной пластинке слизистой оболочки исследованных отделов кишечника при воздействии ВИМП 1,5 Тл 2,5 Гц наблюдается на 14 сутки после окончания эксперимента. 2. Структурные изменения, наблюдающиеся в эпителии слизистой оболочки кишки, имеют зависимость как от параметров воздействия МП (чем больше величина магнитной индукции, тем более выраженные в тканях повреждения), так и от отдела кишечника, в котором они развиваются (наибольшие изменения наблюдаются в слизистой оболочке двенадцатиперстной кишки, по сравнению с таковой среднего отдела ободочной, минимальные – в прямой кишке). 3. Появление в эпителиоцитах (экзокринных и эндокринных) определенных структурных изменений (увеличение суммарной поверхности ядер вследствие многочисленных углублений и выпячиваний ядерной оболочки, расширение перинуклеарного пространства, увеличение полисом, гипертрофия комплекса Гольджи), свидетельствует о развитии внутриклеточной регенерации в эпителии в ответ на повреждение уже начиная с 1 суток после окончания эксперимента при воздействии ВИМП 1,5 Тл, 2,5 Гц. 4. При воздействии ВИМП во всех изученных отделах наблюдается перестройка эндокринного аппарата эпителия, выражающаяся в первоначальном увеличении общего числа эндокриноцитов, преимущественно за счет ЕС-клеток, с вовлечением в дальнейшем и других типов эндокринных элементов. При этом наибольшая реакция наблюдается в двенадцатиперстной кишке. Апробация работы. Основные положения работы были представлены на: научно-практической конференции СПбГМА им. И.И. Мечникова «Состояние окружающей среды и здоровья населения Северо-Западного региона» (Санкт- 8 Петербург, 2006); научно-практической конференции СПбГМА им. И.И. Мечникова «Состояние здоровья населения и факторы риска» (СанктПетербург, 2007); симпозиуме «Магнитные поля и здоровье человека» (г. Курск, 2007); научно-практической конференции СПбГМА им. И.И. Мечникова «Исследования и разработки по приоритетным направлениями в медицине» (Санкт-Петербург, 2008); 15-ой международной конференции медицинских наук «Science up the world» (г. Гронинген, Нидерланды, 2008); научно-практической конференции СПбГМА им. И.И. Мечникова «Исследования по приоритетным направлениям в медицине и биологии» (Санкт-Петербург, 2009); 16-ой международной конференции медицинских наук «The Science Alliance» (г. Гронинген, Нидерланды, 2009); совместной конференции Общества биоэлектромагнетики (The Bioelectromagnetics Society – BEMS) и Европейской ассоциации биоэлектромагнетики (European BioElectromagnetics Association) – «BioEM2009» (г. Давос, Швейцария, 2009). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 2 статьи в ведущих рецензируемых журналах, входящих в перечень ВАК, оформлено одно рационализаторское предложение. Структура и объем диссертации. Материалы изложены на 204 страницах. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, собственных данных, главы обсуждения собственных данных, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 47 рисунками, содержащих 99 микрофотографий и 15 графиков. Список литературы включает 286 источников, из них 87 работ отечественных авторов, 199 иностранных. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования. Исследование проведено на 3-5 месячных белых крысах-самцах, весом 150200 г. Во время эксперимента животные находились в условиях вивария. Их содержание, условия эксперимента и забоя соответствовали приказу Минздрава СССР №755 от 12 августа 1977 г. и приказу Министерства высшего и среднего специального образования СССР от 13 ноября 1984 г. «О правилах проведения работ с использованием экспериментальных животных». 9 Таблица 1. Распределение животных по группам Время забора материала Контрольная Интактная серия серия (иммобилизация) 10 сеансов 1 сутки 7 сутки 1,5 Тл, 2,5 Гц 10 сеансов 10 сеансов 5 5 5 5 5 5 5 5 15 15 15 5 5 0,5 Тл, 50 Гц 5 14 сутки Всего Экспериментальная серия Итого животных Итого исследованных органов Итого исследованных препаратов 50 150 450 * /90 ** Распределение животных по группам приведено в таблице 1. Животные экспериментальной серии подвергались экспозиции высокоинтенсивным импульсным магнитным полем, получаемым от магнито-импульсного стимулятора «МИЦ-304», сконструированного Медико-инженерным центром «Гиперселективное Воздействие». Из нескольких режимов магнитной стимуляции были выбраны два, рекомендованные конструкторами для применения в неврологии, травматологии, ортопедии а также гастроэнтерологии: 1) с величиной магнитной индукции 500 мТл (0,5 Тл), частотой 50 Гц, 2) величиной магнитной индукции 1500 мТл (1,5 Тл), частотой 2,5 Гц. Воздействие ИМП осуществлялось путем помещения животных в плексиглазовые контейнеры-домики и устанавливанием последних на индуктор магнитного стимулятора таким образом, чтобы центр индуктора находился непосредственно под брюшной областью. Процедура осуществлялась ежедневно в течение десяти минут на протяжении двух недель, исключая субботы и воскресения. Крысы контрольной серии подвергались обездвиживанию путем помещения их в плексиглазовые контейнеры-домики, но исключалось влияние ИМП. Крысы интактной группы не подвергались какому-либо воздействию. Материал экспериментальных и контрольных животных забирался на 1, 7 и 14 сутки после окончания эксперимента. Забой производили путем декапитации с предварительным усыплением эфиром. От каждого животного был взят материал из трех отделов кишечника: двенадцатиперстной кишки, среднего отдела ободочной кишки и прямой кишки. Для светооптического изучения материал фиксировали в 10% растворе нейтрального забуференного формалина и после обезвоживания в спиртах возрастающей концентрации с последующим просветлением в ксилоле и заливали в парафин по стандартной методике. Изготавливали парафиновые * изученных с помощью световой микроскопии изученных с помощью электронной микроскопии ** 10 срезы толщиной 5 мкм. Для обзорного исследования срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Общую популяцию эндокриноцитов выявляли с помощью аргирофильной реакции по Гримелиусу [Grimelius L., Wilander E., 1980], позволяющую выявить суммарно все типы эндокринных клеток, исключая D-клетки. Энтерохромаффинные клетки (ЕС-клетки) выявляли с помощью аргентаффинной реакции по Массону-Гамперлю в модификации Сингха [Singh J., 1964], а также методом иммуноцитохимии с использованием поликлональных антител к серотонину (NovoCastra NCL-SEROTp, разведение 1:200). Изучение препаратов проводилось на микроскопе МБИ-3 (ок. х7, об.: х10, х20, х40, х90), подсчет общего количества эндокриноцитов и ЕС-клеток проводился с использованием окулярной морфометрической сетки. Количество эндокринных клеток выражали на 1 мм2 слизистой оболочки среза исследуемого органа. Для этого подсчитывали количество эндокринных клеток в 100 квадратах морфометрической сетки, определяли количество клеток в одном квадрате и соотносили полученную величину с площадью сетки: C= c , 100 S где C – искомое количество клеток на 1 мм2 эпителия слизистой оболочки; с – количество эндокринных клеток в 100 квадратах морфометрической сетки; S – площадь одного квадрата. Для проверки принадлежности выборки нормальному распределению использовали тест Колмогорова-Смирнова. Статистическую значимость различий определяли с помощью непараметрического H-критерия КрускалаУоллиса для групп, состоящих из трех выборок, с последующим применением метода множественного сравнения при обнаружении статистически значимых различий внутри группы (критерия Данна) [Гланц С., 1998; Зайцев В.М. и др., 2006]. Статистически достоверными считали различия при P<0,05. Для электронномикроскопического исследования кусочки изучаемых органов фиксировали в 2,5% растворе глутаральдегида на 0,1М фосфатном буфере (pH 7,4) с последующей обработкой 1% раствором четырехокиси осмия в течение 1 часа. Обезвоживание проводили в спиртах возрастающей концентрации и в ацетоне. Материал заливали в аралдит М. Контрастирование ткани проводили в кусочках и на срезах насыщенным раствором уранилацетата, а также цитратом свинца на срезах. Срезы толщиной 60-70 нм, полученные на ультратоме Reichert Supernova (Австрия), изучали в электронный микроскоп JEM-100S (Япония). Результаты исследования и их обсуждение. На 1 и 7 сутки после воздействия ВИМП 0,5 Тл 50 Гц в двенадцатиперстной кишке наблюдаются минимальные патологические изменения в виде расширения и полнокровия мелких сосудов собственной 11 пластинки слизистой оболочки Электронномикроскопически и выявлялось подслизистого набухание слоя. некоторых ядер и деструктивные изменения в митохондриях в виде их набухания, дезинтеграции крист, просветления матрикса. В отдельных участках эпителия имело место расширение межклеточных промежутков, свидетельствующее о развитии в нем отека. Наибольшие морфологические изменения в эпителии наблюдались в двенадцатиперстной кишке на 14 сутки после воздействия ВИМП 0,5 Тл 50 Гц и на 1 и 7 сутки после ВИМП 1,5 Тл 2,5 Гц. Общими структурными изменениями в слизистой оболочке на всех сроках изучения было нарушение микроциркуляции в собственной пластинке слизистой и подслизистом слое, заключающееся в расширении и полнокровии капилляров и венул с явлениями стаза, сладжа, а в некоторых случаях и тромбоза. Также наблюдалась атрофия слизистой оболочки, разрушение верхушек некоторых ворсинок (десквамация эпителиоцитов, выпадение фибриноподобного вещества в просвет), деструктивные изменения в эпителии крипт, сопровождающиеся набуханием ядер и снижением базофилии цитоплазмы, а в некоторых случаях – гибель клеток. Наиболее характерными ультраструктурными повреждениями эпителиоцитов, выявляющимися при воздействии всех параметров МП, являлись набухание митохондрий с увеличением их размера, дезинтеграцией крист, просветлением матрикса, разрывом наружной мембраны, формированием вакуолей и миелиноподобных структур. Также отмечалось набухание ядер, а в некоторых случаях вакуолярное расширение канальцев эндоплазматической сети. В эпителии слизистой оболочки среднего отдела ободочной кишки характерные деструктивные изменения, выявляемые на световом и электроноскопическом уровнях, при всех параметрах воздействия магнитного поля были менее выражены по сравнению с нарушениями в двенадцатиперстной кишке. Однако динамика изменений повторялась в соответствии с таковой, наблюдаемой в двенадцатиперстной кишке. Так, на 1 и 7 сутки после окончания воздействия ВИМП 0,5 Тл, 50 Гц в собственной 12 пластинке слизистой оболочки большинства животных видны расширенные капилляры и венулы с явлениями застоя эритроцитов, а в некоторых случаях – формирования тромбов, при минимальных изменениях в эпителии. Наиболее выраженное нарушение микроциркуляции в собственной пластинке и дегенеративные процессы в эпителии, сходные с таковыми, наблюдаемыми в двенадцатиперстной кишке, наблюдались на 14 сутки при воздействии ВИМП 0,5 Тл, 50 Гц, а при воздействии ВИМП 1,5 Тл 2,5 Гц – на 1 сутки. В прямой кишке крысы, по сравнению с другими исследованными отделами, незначительные нарушения в микроциркуляторном русле, заключающиеся в расширении мелких сосудов с явлениями стаза, наблюдались только у некоторых животных на 1 и 14 сутки при воздействии ВИМП 0,5 Тл 50 Гц и на 1 сутки при влиянии ВИМП 1,5 Тл 2,5 Гц. Дегенеративных изменений в эпителии на световом уровне при воздействии магнитного поля не выявлено. Наиболее значимые патологические изменения, заключающиеся в набухании и частичной дегенерации митохондрий, наблюдались на 14 сутки при экспозиции ВИМП 0,5 Тл 50 Гц и на 1 и 7 сутки при влиянии ВИМП 1,5 Тл 2,5 Гц с полным ее восстановлением на 14 сутки после окончания эксперимента. Повреждения эпителиальных клеток, основными ультраструктурными признаками которых цитоплазматических было набухание структур, по митохондрий, всей вероятности, ядер не и других являются специфическими для реакции на высокоинтенсивное импульсное магнитное поле, поскольку они отражают наиболее распространенный тип ответа клетки на различные виды повреждения, вызванные недостаточной выработкой энергии, в том числе гипоксией, ишемией или ишемией с последующей реперфузией [Jennings RB, Ganote CE., 1976; Mergner W.J. et. al., 1976, McKechnie N.M. et al., 1982; Michiels C., 2004]. В данном случае подобные изменения, по нашему мнению, могли развиться вследствие нарушения микроциркуляции, наибольшее проявление которой наблюдается на 14 сутки при воздействии ВИМП 0,5 Тл 50 Гц и на 1, 7 сутки при воздействии ВИМП 1,5 Тл 2,5 Гц, что по времени совпадало и с наибольшими ультраструктурными 13 изменениями в клетках эпителия. Данное предположение выдвинуто на основании следующих фактов: 1) наблюдаемого отсроченного развития дегенеративных процессов в эпителии при воздействии ВИМП 0,5 Тл 50 Гц, что позволяет допустить наличие опосредующего фактора, вызывающего изменения в тканях кишечника, 2) наблюдаемых нарушений микроциркуляции в собственной пластинке слизистой оболочки и подслизистом слое в виде гиперемии и тромбоза мелких сосудов, 3) типичных для нарушения микроциркуляции структурных изменений (атрофия слизистой оболочки, разрушение верхушек ворсинок, изменение ультраструктуры эпителиоцитов), 4) наличия в опубликованной литературе данных о возможности нарушения местного кровообращения при воздействии магнитного поля [Демецкий А.М., Алексеев А.Г., 1981; Торопцев И.В., Таранов С.В., 1982; Мичурина С.В. и др., 2005; Brix G. et al., 2008]. При этом, несмотря на то, что описанные патологические изменения в эпителии ЖКТ крысы, видимо, и не были обусловлены прямым повреждающим действием ВИМП, их все-таки следует рассматривать как результат данного воздействия, поскольку, ни в контроле, ни у интактных животных подобных изменений не наблюдалось. Выявленные различия в реакции трех отделов ЖКТ крысы при воздействии ВИМП с наибольшими повреждениями в тонкой кишке по сравнению с толстой согласуются с экспериментальными работами, описывающими подобную закономерность при действии других патологических факторов [Takeyoshi I. et al., 1996; Keefe D.M. et al., 2000], и могут объясняться несколькими причинами. Во-первых, различной их ролью в процессах пищеварения и, видимо, различной степенью их повреждения при патологических воздействиях вследствие наличия более агрессивной среды в двенадцатиперстной кишке по сравнению с нижележащими отделами ЖКТ и воздействия ее на клетки эпителия со стороны просвета кишки. Во-вторых, различным положением стволовых клеток в криптах этих отделов [Potten C.S. et al., 1997; Аруин Л.И. и др., 1998; Keefe D.M. et al., 2000]. Так, стволовые клетки в тонкой кишке находятся в позиции 3-5 от дна крипты, в то время как в толстой кишке – 1-2. 14 При этом место наибольшей выраженности апоптоза в крипте совпадает с позицией 3-5 как в тонкой, так и в толстой кишке. В связи́ с этим вышеприведенные авторы считают, что при действии повреждающих факторов, способных вызывать апоптоз в эпителиоцитах указанных отделов, наибольшие изменения в виде атрофии будут именно в тонкой кишке, поскольку апоптозу будут подвергаться стволовые клетки, являющиеся источником генерации клеток эпителия. В-третьих, различным положением отделов кишечника от центра индуктора, поскольку интенсивность МП убывает по направлению к периферии [Jalinous R., 1991]. В связи́ с этим, возможно, двенадцатиперстная кишка была подвержена влиянию ВИМП в большей степени, чем ободочная и тем более прямая, которые располагаются каудальнее и, соответственно, более удалены от области экспериментального воздействия. Несмотря на тяжесть повреждения, наблюдаемого при действии ВИМП 1,5 Тл 2,5 Гц на 1 и 7 сутки после окончания эксперимента, на 14 сутки выявлены минимальные структурные изменения, что документирует восстановление слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки. При этом ультраструктурные признаки внутриклеточной регенерации в виде увеличения поверхности ядер вследствие многочисленных углублений и выпячиваний ядерной мембраны, расширения в некоторых ядрах перинуклеарного пространства, увеличения в цитоплазме числа свободных рибосом, гипертрофии комплекса Гольджи наблюдаются в некоторых эпителиоцитах уже на 1 сутки после эксперимента. На 7 сутки количество таких клеток возрастает, кроме того, появляются пласты эпителия без электронномикроскопических признаков нарушений. Это свидетельствует о высоком регенераторном потенциале эпителия слизистой оболочки кишечника, способном к восстановлению после окончания действия патологического фактора даже при серьезных структурных повреждениях. 15 * 200 * 180 160 * * 140 120 100 * 80 * * 60 40 20 0 Общая популяция ЕС-клетки 1 сутки Контроль Общая популяция ЕС-клетки Общая популяция 7 сутки ИМП 0,5 Тл, 50 Гц ИМП 1,5 Тл, 2,5 Гц ЕС-клетки 14 сутки Рис. 1. Количественное распределение эндокринных клеток на 1 мм2 эпителия слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки крысы на 1, 7 и 14 сутки после окончания воздействия ИМП 0,5 Тл, 50 Гц, ИМП 1,5 Тл, 2,5 Гц и контроля эксперимента. Вертикальные столбики - медианы, вертикальные отрезки - 25 и 75 процентили, сплошной горизонтальной линией обозначено общее количество эндокринных клеток, пунктирной - количество EC-клеток интактных животных, * P<0,05. Особый интерес представляет реакция гастроэнтеропанкреатической системы кишечника крысы при воздействии ВИМП обоих параметров в связи с наличием в литературе данных о вовлечении эндокриноцитов эпителия ЖКТ в процессы адаптации и регенерации ткани при нарушении местного гомеостаза [Россолько Г.Н. и др., 1990; Rindi G. et al., 2004; Костюкевич С.В. и др., 2004]. При сравнении динамики изменения количества общей популяции эндокриноцитов двенадцатиперстной кишки в эксперименте с различными параметрами ВИМП (0,5 Тл 50 Гц и 1,5 Тл 2,5 Гц), обращает на себя внимание, увеличение их численности во всех сроках опыта (рис. 1). При этом в обоих случаях оно достигает максимума на 14 сутки после окончания воздействия. В этот срок в эксперименте с ВИМП 0,5 Тл 50 Гц наблюдаются наиболее выраженные патологические изменения в слизистой оболочке без четких признаков регенерации со стороны эпителия, в то время как у группы крыс, подвергавшихся воздействию ВИМП 1,5 Тл 2,5 Гц, отмечается восстановление структуры слизистой оболочки. Таким образом, степень увеличения общего количества эндокриноцитов двенадцатиперстной кишки соответствовала 16 степени наблюдаемых структурных и ультраструктурных повреждений эпителия, а их максимум совпадал со сроком, на котором наблюдалась регенерация в случае действия ВИМП 1,5 Тл, 2,5 Гц. Начальные изменения численности общей популяции эндокриноцитов происходят в основном за счет ЕС-клеток, в дальнейшем наблюдается увеличение и других типов клеток. При развитии же регенераторных процессов увеличение общей популяции эндокринных клеток происходит как за счет энтерохромаффинных, так и за счет остальных типов, что свидетельствует о вовлечении их в процессы восстановления эпителия при его повреждении. 100 90 80 70 * 60 50 40 * * 30 20 10 0 ЕС-клетки Общая популяция 1 сутки контроль ЕС-клетки Общая популяция ЕС-клетки Общая популяция 7 сутки 14 сутки ИМП 0,5 Тл, 50 Гц ИМП 1,5 Тл, 2,5 Гц Рис. 2. Количественное распределение эндокринных клеток на 1 мм2 эпителия слизистой оболочки среднего отдела ободочной кишки крысы на 1, 7 и 14 сутки после окончания воздействия ИМП 0,5 Тл, 50 Гц, ИМП 1,5 Тл, 2,5 Гц и контроля эксперимента. Вертикальные столбики - медианы, вертикальные отрезки - 25 и 75 процентили, сплошной горизонтальной линией обозначено общее количество эндокринных клеток, пунктирной - количество EC-клеток интактных животных, * P<0,05. Изменения эндокринного аппарата в эпителии среднего отдела ободочной кишки (рис. 2) были менее выражены по сравнению с таковыми в двенадцатиперстной кишке, что может объясняться менее выраженным характером повреждения слизистой оболочки при действии ВИМП по сравнению с нарушениями, которые имеют место в последней. Все же увеличение численности эндокриноцитов общей популяции с одновременным 17 увеличением энтерохромаффинных клеток на 1 и 7 сутки при воздействии ВИМП 1,5 Тл, 2,5 Гц – в сочетании с наибольшими наблюдаемыми ультраструктурными изменениями в это время в эпителиоцитах среднего отдела ободочной кишки – свидетельствует об их реакции на повреждение эпителия и о возможном вовлечении в механизмы регуляции местного гомеостаза при воздействии ВИМП. 50 * 45 40 35 * 30 * 25 20 15 10 5 0 ЕС-клетки ЕС-клетки Общая популяция Общая популяция 1 сутки 7 сутки контроль ИМП 0,5 Тл ИМП 1,5 Тл, 2,5 Гц ЕС-клетки Общая популяция 14 сутки Рис. 3. Количественное распределение эндокринных клеток на 1 мм2 эпителия слизистой оболочки прямой кишки крысы на 1, 7 и 14 сутки после окончания воздействия ИМП 0,5 Тл, 50 Гц, ИМП 1,5 Тл, 2,5 Гц и контроля эксперимента. Вертикальные столбики - медианы, вертикальные отрезки - 25 и 75 процентили, сплошной горизонтальной линией обозначено общее количество эндокринных клеток, пунктирной - количество EC-клеток интактных животных, * P<0,05. Первоначальная реакция общей популяции эндокриноцитов прямой кишки при воздействии ВИМП 0,5 Тл, 50 Гц в некотором роде повторяла динамику изменений в вышеописанных отделах кишечника, соответствуя степени повреждения эпителия (рис. 3). Увеличение общей популяции эндокринных клеток на 1 сутки, по всей вероятности, также происходило в основном за счет увеличения ЕС-клеток, со снижением их количества на 7 сутки. В дальнейшем, на 14 сутки после окончания эксперимента, наблюдалось увеличение как аргирофильных, так и аргентаффинных клеток, в то время как значимых структурных и ультраструктурных повреждений в прямой кишке не обнаружено. При изучении же реакции эндокринного аппарата прямой кишки 18 на воздействие ВИМП 1,5 Тл, 2,5 Гц, наблюдается резкое увеличение общей популяции, но преимущественно не за счет ЕС-клеток, поскольку их количество хотя и увеличивается на данном сроке, но не соответствует увеличению аргирофильных клеток. Их динамика при этом напоминает таковую в двенадцатиперстной кишке при регенеративных процессах в эпителии, когда увеличение общей популяции эндокринных клеток также происходило за счет ЕС-клеток и за счет других типов эндокриноцитов. Однако существенных морфологических изменений в эпителии данного отдела ЖКТ крысы на всех сроках не обнаружено. Тем не менее, указанная перестройка эндокринного аппарата прямой кишки: увеличение аргирофильных и аргентаффинных клеток на 14 сутки (ВИПМ 0,5 Тл, 50 Гц) и 1 сутки (ВИМП 1,5 Тл, 2,5 Гц) при минимальных изменениях в эпителии может свидетельствовать об общей реакции эндокриноцитов ЖКТ на действие повреждающих факторов и их функциональном взаимоотношении на протяжении кишечника. Так, на этих же сроках наблюдался максимум изменений в морфологии двенадцатиперстной кишки и, возможно, это послужило причиной реорганизации эндокринной гастроэнтеропанкреатической системы и в других отделах ЖКТ, в частности прямой кишки. Такая реакция может быть следствием системного ответа со стороны эндокринного аппарата кишечника на действие неблагоприятных факторов с целью восстановления местного гомеостаза и предупреждения его нарушения на всем протяжении ЖКТ. Кроме того, изменения в эндокринном аппарате прямой кишки в данном случае могут наблюдаться в результате нарушений на функциональном уровне, без морфологических проявлений. Таким образом, проведенное исследование показало, что магнитная стимуляция органов брюшной полости крысы высокоинтенсивным импульсным магнитным полем 0,5 Тл 50 Гц и 1,5 Тл 2,5 Гц вызывает структурные изменения в эпителии слизистой оболочки двенадцатиперстной, среднего отдела ободочной и прямой кишки, выявляющиеся на световом и электронномикроскопическом уровнях. Воздействие высокоинтенсивным 19 импульсным магнитным полем обоих параметров с одной стороны, не приводили к необратимым патологическим изменениям на органном уровне: некрозу, обширным кровоизлияниям, массивным воспалительным процессам и др., в то же время – к 14 суткам после воздействия даже более сильного МП наблюдалась практически полная регенерация эпителия. С другой стороны, сила воздействия была достаточной для расстройства микроциркуляции, приводящей к дистрофическим изменениям – атрофии слизистой оболочки, локальной гибели эпителиоцитов в криптах и на верхушках ворсинок. Наблюдаемые нарушения имеют существенное значение, поскольку при определенных условиях (увеличении времени экспозиции, и интенсивности магнитного поля, снижении сопротивляемости организма) может послужить началом развития необратимых патологических реакций с негативными последствиями как для ткани и органа, так и, возможно, для организма в целом. Полученные данные об изменениях в эндокринном аппарате пищеварительного тракта при действии высокоинтенсивного импульсного магнитного поля показали, что он не остался толерантным к данному виду воздействия. Основываясь на литературных данных о сходстве реакции эндокриноцитов (увеличение их количества в большинстве случаев) при повреждении слизистой оболочки, вызванном различными заболеваниями органов ЖКТ [Miller R.R., Sumner H.W., 1982; Gledhill A. et al., 1986a; Gledhill A. et al., 1986b; Козлова И.В. и др., 2000а; Козлова И.В. и др., 2000б; Осадчук А.М., Осадчук М.А., 2006; Осадчук А.М. и др., 2007; Осадчук А.М.и др., 2008; Lee K.J. et al., 2008] и результатах полученных в собственных исследованиях, выявивших зависимость степени увеличения эндокринных клеток от степени повреждения эпителия слизистой оболочки изучаемых отделов ЖКТ, можно предположить, что перестройка эндокриноцитов происходила не вследствие прямого действия ВИМП на эндокринные клетки, а в результате структурных патологических изменений в эпителии, и направлена была на регуляцию местного гомеостаза с целью регенерации поврежденных воздействием ВИМП структур. 20 В заключении хотелось бы отметить, что широкое применение методов магнитной стимуляции в клинической практике диктует необходимость дальнейшего изучения влияния высокоинтенсивного импульсного магнитного поля на клеточном и тканевом уровнях с целью выявления структурных изменений в различных тканях и органах. При разработке и внедрении в клиническую медицину процедур магнитной стимуляции необходимо основываться на всестороннем изучении данного вопроса, в том числе и на морфологических данных о безопасности ее применения. ВЫВОДЫ 1. Воздействие высокоинтенсивного импульсного магнитного поля (ВИМП) 0,5 Тл 50 Гц и 1,5 Тл 2,5 Гц на органы брюшной полости крысы приводит к атрофии слизистой оболочки кишечника и нарушению микроциркуляторного русла в собственной пластинке (гиперемия, стаз, тромбоз мелких сосудов). Реакция эпителия характеризуется сочетанием дистрофических изменений с явлениями внутриклеточной регенерации. 2. Исследуемые отделы кишечника крысы по-разному реагируют на воздействие ВИМП. В двенадцатиперстной кишке наблюдается более выраженная реакция эпителия по сравнению со средним отделом ободочной кишки. В прямой кишке нарушения были выражены меньше, чем в других изученных отделах. 3. Реакция эпителия на ВИМП зависит от параметров воздействия. ВИМП с большей величиной магнитной индукции (1,5 Тл, 2,5 Гц) вызывает более выраженные структурные изменения, проявляющиеся на более ранних, по сравнению с действием ВИМП 0,5 Тл 50 Гц, сроках (с 1 суток). При воздействии ВИМП 0,5 Тл 50 Гц наблюдается отсроченная реакция эпителия, которая максимально проявляется на 14 сутки после окончания эксперимента. 4. При воздействии ВИМП 1,5 Тл 2,5 Гц полная регенерация эпителия отмечается на 14 сутки. Ультраструктурные признаки регенераторных процессов в эпителии наблюдаются с 1 суток после окончания воздействия. 21 5. Воздействие ВИМП приводит к увеличению в эпителии кишечника общей популяции эндокриноцитов. Первоначальное увеличение осуществляется преимущественно за счет ЕС-клеток с вовлечением в дальнейшем и других типов эндокринных элементов. Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Драй Р.В. Гистотопография эндокринных клеток эпителия слизистой оболочки толстой кишки крысы / Р.В. Драй // Вестник Санкт- Петербургской Государственной Медицинской Академии им. И.И. Мечникова (приложение). – 2003. – №1 (4). – С. 63-64. 2. Драй Р.В. Отдельные аспекты морфологии слизистой толстой кишки крысы / Р.В. Драй, А.С. Онищук // Сборник: Человек и его здоровье – 2005 / Под ред. акад. РАМН А.В. Шаброва, проф. В.Г. Маймулова. – 2005, СПб: СПбГМА им. И.И. Мечникова. – С. 81-82. 3. Онищук А.С. Влияние иммобилизации на слизистую оболочку толстой кишки крысы / А.С. Онищук, Р.В. Драй // Сборник: Человек и его здоровье – 2005 / Под ред. акад. РАМН А.В. Шаброва, проф. В.Г. Маймулова. – 2005, СПб: СПбГМА им. И.И. Мечникова. – С. 195. 4. Костюкевич С.В. Эндокринные клетки эпителия толстой кишки крысы при воздействии сильным импульсным магнитным полем / С.В. Костюкевич, Н.М. Аничков, В.Ф. Иванова, Л.С. Орешко, О.В. Иванова, Р.В. Драй, И.С. Алимова // Медицинский академический журнал. – 2006. – Т.6. – №2. – С. 41-47. 5. Драй Р.В. Слизистая оболочка прямой кишки крысы при кратковременной повторяющейся иммобилизации / Р.В. Драй, Е.А. Казанская // Сборник тезисов к научно-практической конференции молодых ученых: Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины. – 2007, СПб: СПбМАПО. – С. 74-75. 6. Драй Р.В. Влияние импульсного магнитного поля (0,5 аргентаффинные клетки слизистой оболочки прямой кишки крысы / Тл) на Р.В. 22 Драй // Труды симпозиума «Магнитные поля и здоровье человека» / Под ред. А.Н. Лазарева, В.А. Лазаренко, А.И. Конопли, П.В. Калуцкого, В.В. Бельского, Л.М. Закарян, Е.В. Шаталовой. – 2007, Курск: ГОУ ВПО КГМУ Росздрава. – С. 14-17. 7. Коржевский Д.Э. Иммуноцитохимический метод выявления ЕС- (энтерохромаффинных) клеток эпителия слизистой оболочки кишки крысы / Д.Э. Коржевский, Р.В. Драй, С.В. Костюкевич // Морфология. – 2008. – Т. 133. – №1. – С. 78-81. 8. Драй Р.В. Влияние магнитной стимуляции на эпителий слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки крысы / Р.В. Драй // Морфология. – 2008. – Т. 133. – №2. – С. 42. 9. Dry R. V. Alteration of rat’s colon endocrine cells under 0,5 T pulse magnetic field / R. V. Dry // Book of abstracts Congressis «People Meeting Medicine», Iasi, Romania. – 2008. – P. 13-14. 10. Dry R. Pulse magnetic field increase EC-cells level in rat’s cecal epithelia / R. Dry // Book of abstracts 15th International Student Congress of Medical Sciences «Science up the world». – 2008. – P. 295. 11. Драй Р.В. Изменения в эндокринном аппарате ободочной кишки крысы при воздействии высокоинтенсивным импульсным магнитным полем / Р.В. Драй // Морфология. – 2008. – Т. 134. – №5. – С. 66. 12. Dray R. V. Influence of high power pulse magnetic field on the duodenal epithelium / R.V. Dray // Book of abstracts 16th International Student Congress of Medical Sciences «The science alliance». – 2009. – P. 45. 13. Dray R. Changes in Rat’s Duodenum Under the High Power Pulse Magnetic Field Exposure / R. Dray // Abstract collection BIOEM-2009 Joint meeting of the Bioelectromagnetics society and the European BioElectromagnetic association. – 2009. – P.16.
