Тр а в м а т о л о г... и о р т о п е д... ВЛИЯНИЕ РЕЗВЕРАТРОЛА НА МОДЕЛИРОВАНИЕ КОСТНОЙ ТКАНИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
advertisement
Тр а в м а т о л о г и я и ортопедия УДК 616.71.001.6-007.234 ВЛИЯНИЕ РЕЗВЕРАТРОЛА НА МОДЕЛИРОВАНИЕ КОСТНОЙ ТКАНИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ А.В. Файтельсон, Г.М. Дубровин, О.С. Гудырев, Н.Ю. Коклина, М.В. Покровский, А.В. Иванов, ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет» Файтельсон Александр Владимирович – e-mail: vladimirfaitelson@gmail.com В эксперименте на самках белых крыс линии «Вистар» изучалось остеопротективное действие резвератрола на модели экспериментального остеопороза. Было выявлено, что после овариэктомии у крыс развивается эндотелиальная дисфункция сосудов микроциркуляторного русла костной ткани, приводящая к возникновению остеопороза. Резвератрол препятствует снижению уровня микроциркуляции в костной ткани, тем самым предотвращает истончение костных трабекул и предупреждает возникновение в них микропереломов. Ключевые слова: остеопороз, микроциркуляция, эндотелиальная дисфункция, резвератрол, кальций «Д3 Никомед». Pharmacological correction of experimental osteoporosis with resveratrol In experiment on white «Wistar» female rats an osteoprotective action of resveratrol was investigated in experimental osteoporosis. It was revealed, that in rats after ovariectomy the endothelial dysfunction of microcirculation vessels of osteal tissue develops, resulting in occurrence of an osteoporosis. Resveratrol prevented a microcirculation level depression in an osteal tissue that has shown in retardation of an osteal trabecules thinning and preventing warns them of microfractures. Key words: osteoporosis, microcirculation, endothelial dysfunction, resverstrol, calcium «D3 Nycomed». Введение Остеопороз – мультифакториальное системное заболевание, характеризующееся прогрессирующим снижением костной массы и нарушением структуры костной ткани, приводящими к увеличению риска переломов костей скелета. В основе развития остеопоротических нарушений костей скелета лежит дисбаланс между двумя процессами костного ремоделирования: резорбцией и регенерацией [1, 2]. Значительную роль в процессах костного ремоделирования и репаративной регенерации костной ткани играет кро- 160 воснабжение кости [1, 3]. Костные микрососуды имеют только эндотелий и не имеют мышечного и соединительнотканного слоев. Следовательно, именно эндотелий опосредует всю гуморальную регуляцию обмена между остеобластами, остеокластами и кровью [4, 5]. В то же время в доступной литературе мы не нашли сведений о том, чтобы кто-либо использовал эндотелий сосудов костной ткани в качестве мишени для целенаправленного фармакологического воздействия при остеопоротических изменениях. По нашему мнению, одной из причин № 1 (20) март 2012 МЕДИЦИНСКИЙ А ЛЬМАНАХ Тр а в м а т о л о г и я и ортопедия ухудшения регионарного кровоснабжения костной ткани является эндотелиальная дисфункция, которая посредством негативного влияния на микроциркуляцию может приводить к нарушению процессов остеогенеза и остеорепарации, тем самым вызывая остеопороз. В современной патогенетической терапии остеопороза не уделяется должного внимания препаратам, обладающим положительным влиянием на кровоснабжение костной ткани. Это указывает на актуальность исследования остеопротективного действия препаратов с доказанными положительными эндотелиотропными эффектами. Цель исследования – оценка остеопротективных качеств фитоалексина резвератрола на модели экспериментального остеопороза. Материал и методы Опыты проводили на 112 самках белых крыс линии «Вистар» массой 200–300 г. Все манипуляции в эксперименте выполнялись под наркозом (внутрибрюшинным введением раствора хлоралгидрата в дозе 300 мг/кг). Для проведения исследования животные были рандомизированы по массе тела и разделены на 4 группы: I – контрольная (интактные животные) (n=42); II – после овариэктомии (n=30) – модель остеопороза; III – после овариэктомии ежедневно внутрибрюшинно в течение 8 недель вводился резвератрол 2 мг/кг (n=20); IV – крысы после овариэктомии восемь недель внутрижелудочно получали препарат сравнения – кальций Д3 в дозе 85,7 мг/кг (n=20). Системный остеопороз моделировался путем двусторонней овариэктомии [6]. Для подтверждения развития последнего и оценки эффективности исследуемых препаратов через восемь недель (на 57-й день) после овариэктомии проводили гистоморфометрию костной ткани [7]. Перед выведением крыс из эксперимента, через 8 недель после овариэктоми, измерялся уровень микроциркуляции в костной ткани проксимального метафиза бедренной кости [7]. Для получения данных микроциркуляции использовалось оборудование производства компании Biopac systems: полиграф MP100 с модулем лазерной допплеровской флоуметрии LDF100C и инвазивным датчиком TSD144; регистрация и обработка данных производилась с помощью программы AcqKnowledge версии 3.9. После определения внутрикостного уровня микроциркуляции, не изменяя положения датчика, проводили пробы на эндотелийзависимую вазодилатацию (ЭЗВД) в ответ на однократное внутривенное введение раствора ацетилхолина в дозе 40 мкг/кг [8] и эндотелийнезависимую вазодилатацию (ЭНВД) в ответ на однократное внутривенное введение раствора нитропруссида натрия в дозе 30 мкг/кг [9]. Для изучения остеопротективного действия нами были выбран препарат, обладающий выраженным эндотелиопротективным действием, доказанным в ходе ранее проведенных исследований в лаборатории кардиофармакологии НИИ экологической медицины КГМУ: фитоалексин резвератрол (4,5,4І-тригидрокси-транс-стильбен) («Greensyn», Guangzhou Ltd.) [10]. Резвератрол вводился внутрибрюшинно в дозе 2 мг/кг ежедневно однократно в сутки в течение восьми недель, что соответствует данным доступной литературы и выявляет эффективное эндотелиопротективное действие данного вещества в экспериментах, ранее проведенных в нашей лаборатории. Для сравнитель- 161 ного анализа нами было использовано известное лекарственное средство, применяемое в лечении остеопоротических нарушений – кальций Д3 в дозе 85,7 мг/кг (в пересчете на кальций), который вводился ежедневно однократно в сутки внутрижелудочно в 1% крахмальном клейстере. Обработка данных Статистический анализ полученных данных осуществляли в программе Microsoft Excel при помощи средств пакета анализа. «Описательная статистика» применялась для нахождения среднего арифметического (M) и среднеквадратичного отклонения (a). «Двухвыборочный t-тест» использовался для определения достоверности различий между соответствующими показателями в различных груп- РИС. 1. Пример динамики уровня микроциркуляции в костной ткани при проведении функциональных сосудистых проб у интактных крыс. Слева – реакция эндотелийзависимой вазодилатации, справа – реакция эндотелийнезависимой вазодилатации. Треугольниками обозначены площади реакций, используемые для расчета коэффициента эндотелиальной дисфункции. РИС. 2. Микроперелом костной трабекулы (1) в проксимальном метафизе бедра. Окраска гематоксилин-эозином, ув. 400. РИС. 3. Влияние резвератрола и кальция Д3 на среднюю ширину костных трабекул в проксимальном метафизе бедра крыс. Примечание. * – p<0,05 по сравнению с группой интактных животных; ** – p<0,05 по сравнению с группой крыс с экспериментальным остеопорозом. № 1 (20) март 2012 МЕДИЦИНСКИЙ А ЛЬМАНАХ Тр а в м а т о л о г и я и ортопедия пах. Статистически значимыми считали различия при значениях двустороннего p<0,05. Результаты исследования Результаты лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) позволили констатировать достоверно более низкий уровень микроциркуляции в костной ткани у крыс через восемь недель после овариэктомии – 61,5±20,5 перфузионных единиц (ПЕ) по сравнению с интактными животными – 100,5±28,6 ПЕ (р=0,00000002). При анализе активности изучаемых препаратов было выявлено, что в группе крыс, получавших резвератрол, средний уровень микроциркуляции составил 91,0±21,4 ПЕ. Эти данные говорят о том, что исследуемый препарат эффективно предотвращает снижение уровня регионарного кровотока в костной ткани бедра после овариэктомии (р=0,006). Показатель микроциркуляции у животных, получавших кальций Д3, составил 61,5±19,2 ПЕ, что не отличается от группы крыс после овариэктомии, которым не проводилось лечения (р=0,99). Для подтверждения роли дисфункции эндотелия в развитии нарушения регионарной микроциркуляции рассчитывался коэффициент эндотелиальной дисфункции (КЭД) на основании данных ЛДФ. В ответ на системное введение ацетилхолина и нитропруссида наблюдается снижение микроциркуляции с последующей нормализацией показателей кровотока. КЭД определялся как отношение площади треугольника над кривой восстановления микроциркуляции в ответ на введение нитропруссида к площади треугольника над кривой восстановления микроциркуляции в ответ на введение ацетилхолина (рис. 1). В группе интактных животных получили КЭД=1,3±0,2, в группе крыс с остеопорозом КЭД=2,4±0,2 (р=0,002). Данные результаты свидетельствуют о формировании дисфункции эндотелия сосудов микроциркуляторного русла костной ткани после овариэктомии. Коэффициент эндотелиальной дисфункции у крыс, получавших резвератрол, снижался до значения 1,3±0,2 (р=0,02). Данный показатель достоверно не отличались от интактных животных (р=1,0). В группе, где проводилась терапия кальцием Д3, КЭД был равен 2,2±0,2, статистически значимых различий с параметрами КЭД у животных с остеопорозом нет (р=0,74). Остеопоротические изменения в костях скелета были гистологически подтверждены у всех крыс через восемь недель после овариэктомии и выражались в истончении костных трабекул и расширении межтрабекулярных пространств. В отдельных гистологических препаратах отмечались микропереломы костных трабекул, о прижизненном возникновении которых судили по прорастанию соединительной ткани в зоне перелома трабекулы (рис. 2). При гистоморфометрии срезов проксимального отдела бедренной кости у крыс, получавших лечение, обнаружили отсутствие микропереломов трабекул, сохранение структуры костной ткани и большую ширину костных трабекул, чем у крыс с остеопорозом, не получавших лечения. Резвератрол оказывает статистически значимое влияние на среднюю ширину костных трабекул, которая под воздействием препарата увеличивается на 45,9% по сравнению с крысами, страдающими остеопорозом (р= 0,0002). При этом у животных, которым проводилась фармакотерапия остео- 162 поротических нарушений кальцием Д3, увеличение средней ширины трабекул составило только 14,3% (р=0,00003) (рис. 3). Обсуждение Эндотелий сосудов костной ткани, являясь неотъемлемой частью кости, играет центральную регуляторную роль, обеспечивая связь с остальными слоями стенки сосуда и адекватно отвечая на их потребности выделением медиаторов [11], что во многом определяет состояние регионарной микроциркуляции и, тем самым, отвечает за поддержание гомеостаза в костной ткани [12]. В настоящее время ведется активное изучение препаратов, обладающих эндотелиопротективными свойствами, а также формулируются возможные патогенетические механизмы их воздействия на сосудистый эндотелий. Представитель группы фитоалексинов резвератрол вызывает эндотелийзависимое расслабление кровеносных сосудов посредством усиления выработки оксида азота (NO) и последующего увеличения уровня цГМФ [4]. Вместе с тем данные эффекты ослабляются при введении конкурентных ингибиторов синтазы оксида азота NG-монометил-L-аргинина и NG-нитро-L-аргинина. Известно, что краткосрочное воздействие на эндотелиоциты резвератрола в невысоких концентрациях (1–10 µM) увеличивает количество производимого оксида азота, что объясняется краткосрочным повышением активности эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS) и сокращением продукции супероксидов в эндотелии. Резвератрол стимулирует в хронологическом порядке экспрессию eNOS и фактор роста эндотелия сосудов (VEGF). Напротив ингибирование выработки NO ингибиторами eNOS существенным образом снижает митогенные и ангиогенные эффекты, стимулируемые VEGF. Определенный вклад при гипоэстрогениндуцированной эндотелиальной дисфункции вносят эстрогенные свойства резвератрола. Последний связывается с рецепторами эстрогена, активируя тем самым процесс матричного синтеза чувствительных к эстрогену генов-репортеров. У крыс после овариэктомии резвератрол действует как агонист рецептора эстрогена [10]. Кроме того, резвератрол усиливает степень сосудистой релаксации, зависящей от эндотелина (в ответ на ацетилхолин) и подобно эстрадиолу предотвращает возможность снижения прочности костной ткани. Таким образом, резвератрол, оказывая эндотелиопротективное воздействие на эндотелий микроциркуляторного русла костной ткани, эффективно предотвращает снижение регионарного кровоснабжения в костной ткани при экспериментальном остеопорозе и обладает остеопротективным действием, заключающимся в положительном влиянии на процессы костного ремоделирования и остеорепарации. Выводы 1. Через восемь недель после овариэктомии у самок крыс линии «Вистар» развивается эндотелиальная дисфункция сосудов микроциркуляторного русла костной ткани со значительным (до 40%) ухудшением регионарного кровотока, что в свою очередь приводит к истончению костных трабекул в среднем на 39,4% и возникновению в них микропереломов, т. е. к остеопорозу. № 1 (20) март 2012 МЕДИЦИНСКИЙ А ЛЬМАНАХ Тр а в м а т о л о г и я и ортопедия 2. Кальций Д3 в дозе 85,7 мг/кг на модели остеопороза не оказывает влияния на кровоснабжение костной ткани, но обладает незначительным положительным воздействием на ширину костных трабекул в проксимальном метафизе бедренной кости у крыс. 3. Резвератрол в дозе 2 мг/кг эффективно предотвращает снижение уровня регионарной микроциркуляции в костной ткани, что позволяет предупредить ухудшение процессов костного ремоделирования при развивающемся остеопорозе. ЛИТЕРАТУРА 1. Насонов Е.Л. Вторичный остеопороз: патогенез и клиническое значение при воспалительных заболеваниях суставов. Остеопороз и остеопатии. 1998. № 3. С. 18–20. 2. Руководство по остеопорозу. Под ред. Л.И. Беневоленской. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2003. 524 с. 3. Alagiakrishnan K., Juby A., Hanley D. et al. Role of vascular factors in osteoporosis. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 2003. № 58. Р. 362–366. 4. Брошусь В.В. Оксид азота как регулятор защитных и гомеостатических реакций организма. Укр. ревматол. журн. 2003. № 4. С. 3–11. 163 5. Napoli C. Nitric oxide and atherosclerosis. Nitric Oxide. 2001. № 5. Р. 88–97. 6. Stimpel M., Jee W.S., Ma Y. et al. Impact of antihypertensive therapy on postmenopausal osteoporosis: effects of the angiotensin converting enzyme inhibitor moexipril, 17beta-estradiol and their combination on the ovariectomyinduced cancellous bone loss in young rats. J. Hypertens. 1995. № 13. Р. 1852–1856. 7. Файтельсон А.В., Дубровин Г.М., Гудырев О.С. и др. Фармакологическая коррекция экспериментального остеопороза и переломов на его фоне. Вестник травматологии и ортопедии имени Н.Н. Приорова. 2010. № 3. С. 47–51. 8. Laursen J.B., Rajagopalan S., Galis Z. et al. Of superoxide in angiotensin II-induced but catecholamine-induced hypertension. Circulation. 1997. № 95. Р. 588–593. 9. Галаган М.Е., Широколова А.В., Ванин А.Ф. Гипотензивное действие оксида азота, продуцируемого из экзо- и эндогенных источников. Вопр. мед. химии. 1991. № 1. С. 67–70. 10. Кочкаров В.И., Покровский М.В., Корнеев М.М. и др. Эндотелиопротективные эффекты резвератрола и его комбинаций с эналаприлом и лозартаном при экспериментальном моделировании дефицита оксида азота. Кубан. науч. мед. вестн. 2006. № 9 (90). С. 150–152. 11. Марков Х.М. Оксидантный стресс и дисфункция эндотелия. Патол. физиология и эксперим. терапия. 2005. № 4. С. 5–9. 12. Lazzarini L., De Lalla F., Mader J.T. Long Bone Osteomyelitis. Curr. Infect. Dis. Rep. 2002. № 4. Р. 439–445. № 1 (20) март 2012 МЕДИЦИНСКИЙ А ЛЬМАНАХ
