Исследование поведения мембранных белков в липидных

Московский Физико-Технический институт
(Государственный университет)
Факультет общей и прикладной физики
Кафедра физики и технологии наноструктур
НОЦ Бионанофизика
Фролов Фѐдор Владимирович
Бакалаврская работа на тему:
«Исследование поведения мембранных белков в липидных кубических фазах с
помощью методов флуоресцентной микроскопии»
Руководитель: проф. Георг Бюлдт
Долгопрудный – 2014
1
Оглавление
Оглавление .......................................................................................................................... 2
Словарь сокращений ..................................................................................................... 5
1. Литературный обзор ...................................................................................................... 6
1.1.
Введение................................................................................................................... 6
1.2.
Метод кристаллизации in meso .............................................................................. 9
1.2.1. Общие принципы кристаллизации мембранных белков ................................ 9
1.2.2. In meso кристаллизация белка ........................................................................... 9
1.3.
Метод малоуглового рентгеновского рассеяния (SAXS) ................................. 12
1.3.1. Основные принципы SAXS ............................................................................. 12
1.3.2. Определение типа липидной фазы с помощью метода SAXS ..................... 12
1.4.
Методы микроскопии ........................................................................................... 13
1.4.1. Введение в теорию флуоресценции ................................................................ 13
1.4.2. Принципы wide-field микроскопии ................................................................. 16
1.4.3. Принципы конфокальной микроскопии ......................................................... 17
1.4.4. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия .................................... 19
1.4.5. Принципы Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRF) .......... 20
1.4.6. Принципы метода восстановления флуоресценции после обесцвечивания
(Fluorescence Recovery After Photobleaching - FRAP) ................................... 21
1.5.
Диффузия частиц .................................................................................................. 22
1.5.1. Теория диффузии .............................................................................................. 22
1.5.2. Работы по трекингу частиц .............................................................................. 25
1.5.3. Принципы работы программ по трекингу частиц ......................................... 26
1.5.4. Работы по диффузии бактериородопсина методом FRAP ........................... 26
2. Материалы и методы .................................................................................................. 29
2.1.
Материалы для изготовления образцов .............................................................. 29
2
2.1.1. Белки .................................................................................................................. 29
2.1.2. Детергенты......................................................................................................... 30
2.1.3. Липиды ............................................................................................................... 31
2.1.4. Флуоресцентные красители ............................................................................. 31
2.2.
Оборудование ........................................................................................................ 33
2.3.
Методы изготовления и хранения образцов ...................................................... 33
2.3.1. Солюбилизация бактериородопсина .............................................................. 33
2.3.2. Определение концентрации белка .................................................................. 34
2.3.3. Окрашивание бактериородопсина .................................................................. 35
2.3.4. Определение доли окрашенных молекул ....................................................... 35
2.3.5. Замешивание липидной фазы .......................................................................... 37
2.3.6. Раскапывание липидной фазы и изготовление окончательных образцов для
измерений .......................................................................................................... 39
2.3.7. Хранение образцов ........................................................................................... 43
2.4.
Методы измерения ................................................................................................ 43
2.4.1. Получение дифракционных картин для липидных фаз ................................ 43
2.4.2. Получение спектров флуоресценции компонентов фазы............................. 44
2.4.3. Определение толщины образца ....................................................................... 45
2.4.4. Получение видеозаписей движения одиночных молекул белка.................. 46
2.5.
Методы обработки ................................................................................................ 47
2.5.1. Определение типа липидной фазы .................................................................. 47
2.5.2. Трекинг молекул ............................................................................................... 49
2.5.3. Получение кривых диффузии, коэффициентов диффузии и гистограмм
распределения частиц по коэффициентам диффузии ................................... 51
3. Результаты и обсуждения ............................................................................................ 54
3.1.
Спектры флуоресценции составляющих липидной фазы ................................ 54
3.2.
Определение типа липидной фазы и еѐ толщины ............................................. 56
3.3.
Визуализация одиночных молекул ..................................................................... 58
3.4.
Результаты компьютерной обработки ................................................................ 68
3
4. Выводы .......................................................................................................................... 73
5. Заключение ................................................................................................................... 74
Список литературы............................................................................................................ 75
4
Словарь сокращений
LCP – липидная кубическая фаза
OG – октилглюкозид
MO – моноолеин
bR – бактериородопсин
ETB – эндотелиновый рецептор типа Б
WFM – wide-field microscopy*
TIRFM – total internal reflection fluorescence microscopy
LSCM – laser scanning confocal microscopy (лазерная сканирующая конфокальная
микроскопия)
FCS - fluorescence correlation spectroscopy
2PFM – 2-photon fluorescence microscopy
FLIM - fluorescence-lifetime imaging microscopy
FRAP - fluorescence recovery after photobleaching
SIM - structured illumination microscopy
PALM - photo-activated localization microscopy
STORM - stochastic optical reconstruction microscopy
SAXS - small angle X-ray scattering (малоугловое рентгеновское рассеяние)
*Многие термины не переводятся на русский.
5
1. Литературный обзор
1.1. Введение
В наши дни большой интерес представляет исследование мембранных белков
на молекулярном уровне. Мембранные белки составляют приблизительно одну
треть от общего числа белков, закодированных в человеческом геноме.
Большинство лекарств (около 70%) в настоящее время направлено именно на
мембранные белки. Поскольку мембранные белки играют огромную роль в
жизнедеятельности клетки, нарушение их функционирования может привести к
тяжѐлым заболеваниям. На данный момент получена структура лишь небольшой
части мембранных белков. Это можно объяснить тем, что на сегодняшний день
одним
из
основных
методов
рентгеноструктурный анализ [1].
изучения
структуры
белка
является
Для его проведения необходимы кристаллы
высокого дифракционного качества. Но на этапе кристаллизации белков возникает
проблема: для мембранных белков методы, разработанные для кристаллизации
6
водорастворимых белков, не так хорошо применимы [2]. Поэтому, необходима
разработка и изучение принципиально новых методов кристаллизации. На
сегодняшний день одним из таких методов является кристаллизация из липидной
мезофазы (или как его ещѐ называют in meso). Следовательно, для правильного
оперирования этим методом необходимо его тщательное изучение. Поскольку для
понимания данного метода кристаллизации необходимо рассмотреть различные
процессы, происходящие в липидной мезофазе, необходимы различные методы еѐ
изучения.
Такими
инструментами
для
изучения
могут
являться
методы
флуоресцентной микроскопии. Одни методы направлены на наблюдение за
липидными фазами на макромасштабах. Они позволяют исследовать гетерогенность
фазы на макромасштабах, находить некоторые макропараметры системы, такие как
средние коэффициенты диффузии белка в липидной фазе, его подвижность в фазе и
другие. Другие методы позволяют изучать липидные фазы на микро-масштабе.
Такие
методы
позволяют
наблюдать
локальную
неоднородность
фазы
и
детектировать перемещения отдельных молекул белка в фазе, что позволяет
исследовать локальный характер движения молекул белка. Поэтому данные методы
могут позволить наблюдать за процессом кристаллизации белка на молекулярном
уровне, что поможет детально изучить этот процесс.
Таким образом, цель работы заключалась в исследовании поведения
мембранных
белков
в
липидных
фазах
с
помощью
флуоресцентных
микроскопических методов и накопления экспериментальных навыков для
последующего изучения процесса кристаллизации белков в липидных кубических
фазах на уровне одиночных молекул. В качестве основных задач работы можно
выделить:
 Работа на новом малоизученном оборудовании
 Изготовление необходимых образцов
 Наблюдение за движением отдельных молекул белка в липидных фазах
 Получение некоторых качественных и количественных характеристик
этого движения
7
Поскольку методы детектирования одиночных молекул ещѐ не применялись
для изучения поведения мембранных белков в липидных фазах, необходимы
разработки протоколов приготовления образцов для изучения их на новом в нашей
лаборатории оборудовании (флуоресцентный микроскоп с высоким разрешением).
В
качестве
бактериородопсин
тестовых
(bR)
и
белков
использовались
эндотелиновый
рецептор
мембранные
типа
Б
белки
(ETB),
модифицированный для кристаллизации. На сегодняшний день бактериородопсин –
один из самых изученных мембранных белков. Благодаря простоте выделения и
высокой стабильности, бактериородопсин давно стал системой, на которой
испытываются новые приѐмы работы с мембранными белками. Эндотелиновый
рецептор был выбран, поскольку сейчас происходит изучение данного белка в
нашей лаборатории, и для того, чтобы проверить применимость методов
визуализации одиночных молекул на нѐм.
Актуальность работы. Одной из основных проблем структурной биологии
является кристаллизация мембранных белков. Поэтому необходимо изучение новых
способов кристаллизации белка, одним из которых является метод кристаллизации
из липидной кубической фазы. Для лучшего понимания процесса кристаллизации
белка в липидно кубической фазе интересно пронаблюдать за поведением
отдельных молекул белка. На сегодняшний момент это не было сделано. Поэтому
использование методов флуоресцентной микроскопии позволит изучить поведение
отдельных молекул белка в липидных фазах, что в дальнейшем позволит наблюдать
за поведением отдельных молекул белка в процессе кристаллизации.
Таким образом, данная работа носит экспериментальный характер и
представляет
собой
получение
видеозаписей
с
различимыми
одиночными
молекулами белка в липидных фазах с последующей компьютерной обработкой
этих видеозаписей и получением некоторых количественных характеристик
движения одиночных молекул. Сложность заключалась в том, что необходимо было
разобраться с принципами работы на новом оборудовании без знающего
специалиста.
8
1.2. Метод кристаллизации in meso
1.2.1. Общие принципы кристаллизации мембранных белков
Общий принцип кристаллизации белков как водорастворимых, так и
мембранных
заключается
в
следующем:
необходимо
варьировать
кристаллизационные параметры, такие как концентрация белка, pH раствора,
температура и другие, чтобы получить перенасыщенный раствор белка, но избежать
его агрегации. Но есть и важное отличие кристаллизации мембранных от
водорастворимых белков. Это необходимость использования детергентов для
солюбилизации мембранных белков. Молекулы детергента образуют монослой
вокруг гидрофобной поверхности белка, переводя его в водорастворимую форму.
Поэтому свойства и эффективная форма белка зависят от свойств используемого
детергента.
1.2.2. In meso кристаллизация белка
Природным окружением мембранного белка является липидный бислой,
поэтому мембранные белки часто нестабильны за его пределами [3]. Поэтому
Ландау и Розенбуш в 1996 году создали новый метод кристаллизации мембранных
белков – кристаллизация из липидной фазы [4]. В этом методе солюбилизированный
белок встраивается в липидную систему, и при добавлении солей-осадителей белок
начинает образовывать кристаллы.
Данный метод базируется на том, что некоторые липиды могут образовывать
так называемые мезофазы. Молекулы липида агрегируют и образуют трехмерную
периодическую решетку, причем элементарная ячейка этой решѐтки может быть
образована агрегатами различной формы: сферической, стержнеобразной или
бислойной. Для получения кристаллов особенно интересны липидные фазы,
обладающие кубической симметрией [5]. Для водных растворов липидов можно
выделить три типа кубических решеток: Pn3m, Ia3d, Im3m. Липидные фазы
являются биконтинуальными, поскольку гидрофобная углеводородная область
9
разделяет водное пространство на две сети водных каналов, между которыми нельзя
перейти без пересечения этой гидрофобной области.
Рисунок 1. Схематическое представление элементарных ячеек липидных фаз.
Наиболее часто в кристаллизации применяется липид моноолеин [6]. Его
фазовая диаграмма в разных соотношениях с водой представлена на рисунке 2.
Можно заметить, что моноолеин образует кубическую фазу при комнатной
температуре.
При изменении концентрации воды в смеси моноолеин/вода при
комнатной температуре можно получить фазы различных типов. При низких
концентрация воды липид образует ламеллярную фазу, характеризующуюся
существованием многих слоѐв липида. При увеличении концентрации воды фаза
переходит сначала в систему с кубической симметрией Ia3d, а затем и в Pn3m.
Кроме того, структура и параметры липидной фазы зависят от добавленных
амфифильных молекул. Амфифильные молекулы – это молекулы, имеющие в своѐм
строений гидрофобную и гидрофильную части (например, сами молекулы липида
или молекулы детергента). Такие молекулы, встраиваясь в липидную фазу, влияют
на еѐ параметры, размер элементарных ячеек. Каждую амфифильную молекулу
можно описать некоторой эффективной формой, так как они обладают полярной
головкой и неполярным хвостом различной длины. Обычно для молекул детергента
длина этого хвоста меньше чем у липида в фазе и, встраиваясь в фазу, молекулы
10
детергента увеличивают постоянную решѐтки и в итоге могут привести к
разрушению кубической решѐтки [7, 22].
Рисунок 2. Фазовая диаграмма системы моноолеин/вода и вид основных липидных фаз
этой системы. Здесь FI – изотропная фаза, Lc – ламеллярная кристаллическая, Lα – ламеллярная
жидкокристаллическая, Pn3m и Ia3d – кубические фазы, H – инвертированная гексагональная.
В настоящее время уже есть некоторые предположения, как происходит
процесс кристаллизации в кубической фазе. При смешивании раствора белка и
липида в нужном соотношении спонтанно образуется фаза с кубической решѐткой
Pn3m. Затем белок встраивается в липидный бислой, попадая в более нативное
окружение. Желая занять позицию с минимумом энергии, молекулы белка
располагаются на поверхностях бислоя с минимальной кривизной [8]. При
добавлении солей (приципитант) постоянная решѐтки уменьшается, тем самым
увеличивается кривизна поверхности бислоя. Это заставляет молекулы белка
перемещаться, пытаясь найти новое положение минимума энергии. При этом
перемещении локально возникают области с повышенной концентрацией белка.
Процесс накопления молекул белка в одном месте вызывает локальное уменьшение
радиуса кривизны поверхности (поскольку размеры молекул белка сопоставимы с
размерами ячейки кубической решѐтки), а затем и локальный переход кубической
11
фазы в ламеллярную. Поэтому зарождение кристалла происходит в ламеллярной
фазе, а затем он подпитывается молекулами белка из окружающей кубической фазы.
На рисунке 3 схематически изображѐн этот процесс.
Рисунок 3. Организация липидной мезофазы при кристаллизации in meso.
1.3. Метод малоуглового рентгеновского рассеяния (SAXS)
1.3.1. Основные принципы SAXS
Для определения типа и параметров липидной фазы используется метод
малоуглового рентгеновского рассеяния или SAXS (small angle X-ray scattering).
Малоугловое рассеяние – дифракционный метод, широко используемый для
изучения надатомной структуры вещества [9]. В малоугловом рассеянии обычно
используется излучение с длиной волны порядка нескольких ангстрем.
Вид дифракционной картины и возможности извлечения из неѐ структурной
информации сильно зависят от наличия упорядоченности в структуре исследуемого
объекта. В общем случае, чем выше упорядоченность, тем больше информации мы
можем получить из картины дифракции.
1.3.2. Определение типа липидной фазы с помощью метода SAXS
В нашем случае липидные фазы обладают неким ближним порядком, так как
две точки в фазе, находящиеся на большом удалении ни как не зависят друг от друга
(в них даже может отличаться тип фазы). Поэтому усреднѐнное рассеяние на данной
12
структуре будет выглядеть как концентрические окружности. Только при наличии в
фазе
крупных
областей
упорядоченности
элементарных
ячеек
фазы
на
дифракционной картине могут проявляться пики, соответствующие выделенным
направлениям в макрокристалле липидной фазы. Дифракционные картины
основных типов липидных фаз представлены на рисунке 4 [6, 20].
Рисунок 4. Дифракционные картины для основных типов липидных фаз, полученные
методом малоуглового рентгеновского рассеяния.
По отношениям радиусов колец можно определить тип фазы, а по радиусу
первого (или других) кольца можно посчитать структурный параметр. На рисунке
представлены дифракционные картины, получаемые для основных типов липидной
фазы, а также отношения радиусов колец.
1.4. Методы микроскопии
1.4.1. Введение в теорию флуоресценции [10]
В
последние
годы
произошѐл
огромный
скачок
в
применении
флуоресцентных методов для различных биологических исследований. Особенно
заметен этот скачок в областях клеточной и молекулярной микроскопии. Поскольку
флуоресцентное детектирование достаточно чувствительно, оно позволило заменить
такой неудобный метод, как встраивание радиоактивных меток в образец. Таким
13
образом,
на
сегодняшний
день
методы,
использующие
флуоресценцию,
применяются учѐными в различных областях.
Вообще флуоресценция – это один из типов люминесценции. Люминесценция
– это излучение света веществом, предварительно возбужденным неким другим
источником света. Формально люминесценцию можно разделить на две категории:
флуоресценцию и фосфоресценцию, в зависимости от природы возбуждѐнного
состояния (для флуоресценции это состояние – синглет, для фосфоресценции –
триплет).
Процесс флуоресценции может быть описан тремя стадиями: возбуждение
флуорофоров, нахождение в возбуждѐнном состоянии и флуоресцентное испускание
фотонов. Все эти процессы могут быть проиллюстрированы энергетической
диаграммой
Яблонского
основоположника
(в
честь
флуоресцентной
профессора
спектроскопии).
Александра
Типичная
Яблонского,
диаграмма
Яблонского показана на Рис. 5.
Рисунок 5. Энергетическая диаграмма Яблонского.
14
Фотоны с определѐнными энергиями hνex испускаются лампой накаливания
или лазером и поглощаются флуорофорами (обычно флуорофорами являются
ароматические молекулы), переводя электроны в возбуждѐнное синглетное
состояние (S1, S2):
S0 + hνex → S1 (2)
(1)
В этом состоянии возбуждѐнный электрон спарен с электроном, находящимся
в основном состоянии. Это возбуждѐнное состояние существует некоторое конечное
время (обычно порядка 1 наносекунды). За это время могут происходить релаксации
– переходы электрона на более низкие колебательные подуровни внутри одного
синглетного уровня. Также возможны переходы электрона с одного синглетного
уровня на нижний колебательный подуровень нижнего синглетного уровня. Данный
процесс называется процессом внутренней конверсии.
Затем возбуждѐнный электрон возвращается в основное состояние, испуская
фотон с меньшей по отношению к поглощѐнному фотону энергией hνem:
S1 (2) → S0 + hνem + Q
(2)
где Q – это тепло, рассеиваемое в ходе сопутствующих флуоресценции процессов.
Среди таких процессов выделить безызлучательные релаксации электрона в
основное состояние, а также так называемое “тушение” (quenching) вследствие
ближних связей между флуорофорами и локальным молекулярным окружением.
Обычно время излучения фотона – порядка 10 наносекунд.
Также молекулы в состоянии S1 могут переходить в первое триплетное
состояние T1. Такой переход называется intersystem crossing, а излучение при
переходе из триплетного состояние в основное называется фосфоресценцией.
Фосфоресцентные фотоны обладают меньшей энергией, и время излучения на
порядки больше чем для флуоресценции (порядка миллисекунд). Это происходит
из-за того, что электрон на триплетном уровне имеет тот же спин, что и электрон в
основном состоянии, и его переход в это основное состояние формально запрещѐн.
15
Важной
характеристикой
флуоресценции
является
то,
что
энергия
поглощаемого фотона больше чем излучаемого, и, соответственно, длина волны
поглощения меньше длины волны излучения. Это называется сдвигом Стокса
(Stokes shift).
Другое свойство флуоресценции заключается в том, что обычно спектр
излучения флуорофоров не зависит от длины волны возбуждения. Это объясняется
тем, что возбужденные флуорофоры быстро релаксируют на нижний колебательный
подуровень состояния S1. Это свойство флуоресценции известно как правило Каши
(Kasha's rule).
1.4.2. Принципы Wide-field микроскопии
Базовым
методом
микроскопии
является
так
называемая
wide-field
микроскопия [11]. Данный метод заключается в одновременном облучении всего
образца. В качестве источника света обычно используется лампа. Сначала пучок
света падает на образец, а потом излучение из интересующего региона собирается
на CCD камеру. Принципиальная схема микроскопа, работающего в wide-field
режиме, представлена на рисунке 6.
Рисунок 6. Принципиальная схема wide-field микроскопа.
16
Здесь в качестве источника света используется ртутная лампа. Затем с
помощью специальных светофильтров выделятся свет определѐнной длины волны.
Далее с помощью специально подобранного дихроичного зеркала свет направляется
на образец. Излученный образцом свет затем проходит через то же самое зеркало и
затем направляется на фотоприѐмник (в данном случае CCD камеру).
1.4.3. Принципы конфокальной микроскопии
Принципиальными отличиями от wide-field микроскопии обладает другой
метод – конфокальная микроскопия [12]. В отличии от wide-field микроскопии, в
конфокальных микроскопах в качестве источников света используются один или
несколько
лазеров.
На
рисунке
7
представлена
принципиальная
схема
конфокального микроскопа.
Рисунок 7. Принципиальная схема конфокального микроскопа.
Для
wide-field
микроскопии
излучение
со
всей
толщины
образца
накладывается на интересующий нас регион. Конфокальный метод напротив
позволяет точечно облучать образец и собирать флуоресценцию лишь с нужной
глубины образца. Для этого используются малые апертуры (так называемые
17
пинхолы малых размеров). Они помогают устранить излучение, идущее не из
фокуса, тем самым повышая разрешение и контраст изображения.
Обычно для конфокального метода в качестве размера пинхола перед
детектором выбирают одну единицу Эйри. При падении параллельного светового
пучка на малое круглое отверстие наблюдается дифракция. Мы рассматриваем
случай дальней зоны (дифракция Фраунгофера).
Рисунок 8. Схема дифракции на круглом отверстии.
Если после отверстия поставить собирающую линзу, то в еѐ фокальной
плоскости будет наблюдаться дифракционная картина Фраунгофера (Рис. 8, Рис. 9).
Она представляет собой центральное светлое пятно (диск Эйри) и чередование
тѐмных и светлых концентрических колец. Угловой размер центрального пятна
можно описать приблизительной формулой:
где d – диаметр круглого отверстия. Таким образом, размер пинхола детектора
выбирается так, чтобы в него помещался лишь диск Эйри. Размер этого такого
пинхола и равен одной единице Эйри (1AU – 1 Airy Unit).
18
Рисунок 9. Изображение дифракции на круглом отверстии (диск Эйри).
1.4.4. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия
Конфокальный метод можно усовершенствовать, добавив систему зеркал,
управляющих лазерным пучком [12]. Таким образом, лазерный пучок будет
сканировать выбранную область и давать еѐ изображение. Принципиальная схема
такого микроскопа представлена на рисунке 10.
Рисунок 10. Принципиальная схема лазерного сканирующего микроскопа.
19
Также, дополнительно используя дисперсионные элементы (такие как
дифракционная решѐтка) и мультианодные фотоприѐмники, можно добиться
спектрального изображения наблюдаемой области.
1.4.5. Принципы Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRF)
В отличии от wide-field микроскопии и конфокальной микроскопии, TIRF
использует уникальные свойства затухающей волны (evanescent wave) для
выборочного освещения и возбуждения флуорофоров, находящихся вблизи
поверхности стекла [13]. Возбужденные флуорофоры испускают вторичную
флуоресценцию, которая в итоге детектируется камерами. Теория TIRF базируется
на теории полного внутреннего отражения. При падении луча под углом на границу
стекло-образец при углах больше критического происходит полное внутреннее
отражение и в образце возникает затухающая волна, с частотой, равной частоте
падающей бегущей волны. Интенсивность волны затухает экспоненциально, по
мере проникновения в образец. Таким образом, эта волна возбуждает только те
флуорофоры, которые находятся в тонком слое вблизи стекла (не больше 200-300
нанометров). Критический угол, при значениях больше или равных которому
возникает
затухающая
волна,
определяется
различиями
в
коэффициентах
преломления стекла и образца. Глубина проникновения волны (расстояние, на
котором интенсивность волны затухает в e раз) является функцией угла падения
лазерного пучка, длины волны и коэффициентов преломления стекла и образца и
определяется формулой:
√
где λ – длина волны падающего света, n1 и n2 – показатели преломления стекла и
образца соответственно, θ – угол падения. На рисунке 11 представлена
принципиальная схема метода TIRF.
20
Рисунок 11. Принципиальная схема метода TIRF.
Благодаря такому выборочному возбуждению флуорофоров, данный метод
используется для визуализации одиночных молекул.
1.4.6. Принципы метода восстановления флуоресценции после обесцвечивания
(Fluorescence Recovery After Photobleaching – FRAP)
Данный метод базируется на том, что при облучении флуорофоров светом
высокой интенсивности происходит их обесцвечивание [14,15]. Использование
лазеров с высокими интенсивностями происходит окисление флуорофоров,
вызывающее их необратимые изменения, препятствующие их способности к
флуоресценции. Но повреждѐнные флуорофоры не перестают диффундировать в
среде. Так, обесцветив определѐнный регион, можно впоследствии наблюдать за
восстановлением интенсивности флуоресценции в этой области вследствие
диффузии в данную область новых неповреждѐнных флуорофоров. Схема данного
эксперимента представлена на рисунке 12.
21
Рисунок 12. Схема эксперимента методом FRAP, состоящего из трѐх стадий: начальное
состояние, стадия обесцвечивания, стадия восстановления флуоресценции, а также
схематичный график восстановления флуоресценции.
Если в среде присутствуют неподвижные флуорофоры, то в итоге
флуоресценция
восстановится
не
полностью.
По
полученным
кривым
восстановления флуоресценции затем можно определить характерное время
диффузии, а затем и средний коэффициент диффузии молекул, а также долю
подвижных молекул (долю мобильной фракции).
1.5. Диффузия частиц
1.5.1. Теория диффузии [16]
Под термином диффузия понимается броуновское движение частиц в среде. В
нашем случае наблюдается диффузия молекул белка в липидной фазе – некоторой
трѐхмерной
структуре.
Полное
описание
диффузии
должно
учитывать
и
вращательную диффузию молекул, но мы здесь сконцентрируем своѐ внимание
только на поступательную компоненту диффузии.
Диффузия частицы в среде характеризуется некоторым коэффициентом
диффузии D и описывается законом Фика:
22
⃗
где
⃗
⃗
⃗ описывает вероятность найти частицу, начавшую движение из
точки x0 в момент времени t = 0, в объѐме [ ⃗ ⃗
⃗] в момент времени t. Решение
этого уравнения:
⃗
⃗
(
√
⃗
⃗
) ⃗⃗⃗⃗
где d – размерность пространства (1,2,3). Дальнейшее интегрирование этой функции
с
⃗
⃗
даѐт среднее квадратичное отклонение (MSD – mean squared
displacement):
⟨
⟩
∫ ⃗
⃗
⃗
⃗
Таким образом, среднее квадратичное отклонение увеличивается линейно со
временем наблюдения.
В нашем случае происходит трѐхмерная диффузия молекул белка в липидной
системе. Но используемые методы микроскопии позволяют наблюдать лишь за
движением молекул белка в плоскости некоторой небольшой (200-300 нанометров)
конечной толщины. Поэтому, мы положим диффузию молекул двумерной в течение
времени присутствия наших частиц в области видимости. Для увеличения времени
наблюдения за одной частицей будут использоваться методы уменьшения толщины
образца. Таким образом, в дальнейшем будем рассматривать только двумерную
диффузию.
На движение частиц могут влиять различные силы и ограничители диффузии,
что вызывает отклонения он нормального линейного по времени диффузионного
закона. Ограничителем движения молекул белка в липидной фазе может являться еѐ
доменная структура, затрудняющая движение молекул между доменами. Поэтому в
действительности диффузия частиц может не подчиняться линейному закону, а
выглядит несколько сложнее. Если движение молекул ограничено в некоторой
23
области с характерными поперечными размерами L, то говорят об ограниченной
диффузии, которая описывается формулой:
[
(
)]
В этом случае мы будем наблюдать нормальную диффузию на малых
временных масштабах, когда частицы ещѐ не “чувствуют” барьер. Однако на
больших временных масштабах кривая диффузии асимптотически стремится
некоторому уровню (Рис. 13).
Рисунок 13. Схематические графики нормальной (синий) и ограниченной (красный) диффузии.
Если же барьер может пропускать частицы, лишь задерживая их, может
наблюдаться и диффузия на больших временных масштабах:
[
(
)]
где Dmacro – коэффициент диффузии на макромасштабах.
Если на частицы дополнительно действует некая сила, вынуждающая их
двигаться в определѐнном направлении, то говорят о направленной диффузии. В
24
данном случае (когда присутствует дополнительное направленное движение частиц
со скоростью v) движение частиц можно описать формулой:
Таким образом, чтобы определить коэффициент диффузии на малых масштабах,
необходимо провести
касательную в нуле к кривой диффузии или
же
воспользоваться линейной формулой диффузии для первых 2-5 точек кривой
диффузии [17,18]:
где D2-5 – так называемый начальный коэффициент диффузии, b – некая константа,
показывающая точность определения позиции молекулы (b = 4σx2).
1.5.2. Работы по трекингу частиц
Ученые уже несколько лет используют методы микроскопии и методы
компьютерной обработки для наблюдения за движением частиц и получением их
траекторий. После получений траектории частицы становится необходимым
применение некоторой формулы для пересчета траектории в зависимость среднего
квадрата смещения от времени. Большинство программ на выходе дают зависимость
координат частицы от времени, причем время дискретно. Временной шаг
определяется временем экспозиции камеры в микроскопе и не может быть слишком
малым. Для вычисления среднего квадрата смещения частицы используется
формула [17,18]:
∑ [( (
)
)
( (
)
) ]
где (x(t),y(t)) – координаты частицы, τ – шаг по времени, N – полное число кадров,
на которых присутствует частица, nτ – время, на котором мы рассчитываем средний
квадрат смещения частицы. Видно, что статистическая точность для точек на
кривой MSD убывает, поскольку убывает количество точек, используемых при
25
усреднении для получения значения MSD при определѐнном n (чем больше
статистика, тем больше точность).
После построения кривых диффузии графики фитируются и находятся
нужные параметры. Исходя из точности локализации молекул, выбирается граница
для
коэффициента
диффузии,
которая
отделяет
подвижные
частицы
от
неподвижных.
1.5.3. Принципы работы программ по трекингу частиц
Размер одиночных флуоресцентных эмиттеров ограничен его дифракционной
картиной, называемой point spread function (PSF), шириной 0.61 λ/NA, где NA –
числовая апертура объектива. Для масляных объективов с высокой апертурой (NA =
1.4-1.5) в диапазоне видимого света ширина PSF составляет порядка 200 нм. Два
эмиттера, находящиеся на расстоянии, меньшем, чем эта ширина, разделить
невозможно.
С помощью программ PSF отдельных эмиттеров фитируется
функцией Гаусса. Точность локализации составляет порядка нескольких десятков
нанометров и определяется формулой, учитывающей величину фонового шума и
конечный размер пикселя [16]:
√(
)
где w – ширина Гауссиана, a – размер пикселя, N – число излученных эмиттером
фотонов за данный промежуток времени, b – коэффициент фонового шума. В
программе обычно выставляется порог шума, и обрабатываются только те эмиттеры,
сигнал от которых выше этого порога.
Далее уже локализованные эмиттеры обрабатываются с помощью различных
программ, которые в своей основе используют корреляционные методы, и строятся
траектории движения частиц.
1.5.4. Работы по диффузии бактериородопсина методом FRAP
К настоящему моменту уже были проведены некоторые работы по описанию
поведения молекул белка бактериородопсина в липидных кубических фазах
26
методом FRAP. Эти работы проводились Вадимом Черезовым, и их результаты
были опубликованы в 2008 году [19]. В данной работе наблюдалась зависимость
коэффициента диффузии белка и процентной составляющей мобильной фракции от
молярности
и
pH
добавляемого
приципитанта.
В
качестве
приципитанта
использовался Na/K фосфатный буфер с тремя различными молярностями: 50mM
(маломолярный), 1M (среднемолярный) и 2.5M (высокомолярный). В экспериментах
по определению доли мобильной фракции белка также использовался буфер
молярности 2M. В качестве проверки зависимости от pH бралось три различных pH:
pH 3.5, pH 5.6, pH7.0. Бактериородопсин был окрашен флуорецентным красителем
Cy3 и взят в концентрации ~3мг/мл. Результаты измерений представлены на
графиках (Рис. 14).
а)
б)
в)
Рисунок 14. а) Кривые восстановления флуоресценции для bR в липидной кубической фазе при
различных концентрациях соли с pH 5.6. б) Зависимость доли быстрой фракции молекул bR от
концентрации соли при различных pH. в) Доля мобильной фракции bR при различных
концентрациях соли.
27
При низких молярностях соли (50mM Na/K фосфат pH 5.6) диффузия белка
относительно
медленная
и
описывается
однокомпонентным
уравнением
с
коэффициентом диффузии ~6·10-2 мкм2/с. При увеличении концентрации соли
сначала
появляется
быстрая
компонента,
и
диффузия
уже
описывается
двухкомпонентным уравнением, а затем при высокой молярности буфера (2.5M
Na/K фосфат pH 7) остаѐтся лишь быстрая компонента, и диффузия белка хорошо
описывается однокомпонентным уравнением с коэффициентом диффузии ~0.8
мкм2/с. Две компоненты диффузии были интерпретированы как диффузия
мономеров и тримеров белка. Кроме того, было замечено, что спустя семь дней
кривые восстановления показывали присутствие лишь быстрой компоненты
диффузии. Это объясняется тем, что весь белок перешѐл в вид мономера. Доля же
мобильной фракции белка претерпевала не сильные изменения с течением времени
и не показала особой зависимости от молярности буфера.
28
2. Материалы и методы
2.1. Материалы для изготовления образцов
2.1.1. Белки
Бактериородопсин (bR) – 7-α-спиральный белок, впервые выделенный из
галофильной археи Halobacterium salinarium в виде пурпурной мембранной
фракции, названной пурпурным мембранами [21]. В пурпурных мембранах
упакован в виде тримеров и образует естественные гексагональные кристаллы
симметрии P3.
Рисунок 15. а) Молекула бактериородопсина в липидной мембране. б) Тример молекулы
бактериородопсина
Осуществляет
перенос
протона
через
плазматическую
мембрану.
Молекулярная масса – около 26 кДа. Относительно прост в получении и обладает
высокой стабильностью (до 70oC, диапазон pH 2-12).
29
Эндотелиновый рецептор типа Б (ETB) – относится к классу рецепторов,
сопряжѐнных с G-белком (G-protein-coupled receptor или GPCR), который
активирует фосфатидилинозитол-кальциевую систему вторичных посредников
(second messengers system) [23]. Является медиатором эндотелина-1 (ET-1). Состоит
из 7 спиральных трансмембранных доменов, 3 внеклеточных и 3 внутриклеточных
петель,
внеклеточной
N-концевой
и
цитоплазматической
C-концевой
последовательностью. Для исследований использовался модифицированный для
кристаллизации
белок
(со
вставленным
апцитохромом
BRIL
в
третьей
внутриклеточной петле). Молекулярная масса – около 50кДа. Был выбран для
исследований диффузии, поскольку в настоящее время исследуется в нашей
лаборатории.
2.1.2. Детергенты
Октилглюкозид (n-октил-β-D-глюкопиранозид или OG) – один из наиболее
часто
используемых
детергентов.
Используется
для
солюбилизации
бактериородопсина из пурпурных мембран и для изменения структурного параметра
липидной фазы. Молекулярная масса – 292,4 Да. Образует мицеллы с молекулярной
массой 8-29 кДа и радиусом ~15Å. Критическая концентрация мицелло-образования
~25mM (~0,7%). Нестабилен: разлагается при комнатной температуре под
действием света. Поэтому используются лишь свежеприготовленные растворы OG.
Рисунок 16. Молекула октилглюкозида (OG).
30
2.1.3. Липиды
Моноолеин (МО) – моноглицерид с ненасыщенным углеводородным
хвостом. Его водные растворы проявляют большое разнообразие мезофаз. При
комнатной температуре данный липид способен образовывать биконтинуальные
кубические фазы.
Рисунок 17. Молекула моноолеина (МО).
2.1.4. Флуоресцентные красители
Сy3 NHS ester – органический синтетический флуоресцентный краситель.
Присоединяется
к
амино-группам
биомолекул.
Растворим
в
органических
растворителях, практически нерастворим в воде. При использовании этого
красителя доля окрашенных молекул белка мала (не более 5%). Молекулярная масса
– 765,95 Да. Максимум поглощения на длине волны 548 нм. Максимум излучения на
длине волны 562 нм. Коэффициент экстинкции – 150000 1/ (моль×см).
31
Рисунок 18. а) Молекула Cy3. b) Спектры поглощения и флуоресценции Cy3 (синий - поглощение;
красный – излучение).
Atto590 NHS ester – органический синтетический флуоресцентный краситель,
принадлежащий к классу родаминов. Присоединяется к амино-группам биомолекул.
Хорошо растворим в воде. Максимально возможная доля окрашенных молекул
белка порядка 80%. Молярная масса – 788 Да. Максимум поглощения на длине
волны 594 нм. Максимум излучения на длине волны 624 нм. Коэффициент
экстинкции – 120000 1/ (моль×см).
Рисунок 19. а) Молекула Atto590. b) Спектры поглощения и флуоресценции Atto590 (синий поглощение; красный – излучение).
32
2.2. Оборудование
 Флуоресцентный микроскоп. Для работ по микроскопии липидной фазы
использовался
флуоресцентный
наноскоп,
базирующийся
на
лазерном
сканирующем микроскопе LSM 780 фирмы Carl Zeiss и дополнительно
оснащенный модулем для супер-разрешения ELYRA. Данный наноскоп
позволяет использовать для исследований множество различных методов
флуоресцентной микроскопии, включая LSCM, TIRFM, FCCS, 2PFM, FLIM,
FRAP, SIM, PALM, direct STORM. Спектр возбуждения охватывает весь
видимый диапазон света, а также, при использовании двухфотонного режима, и
область ближнего ультрофиолета.
 Rigaku. Для работ по получению дифракционных картин методом малоуглового
рассеяния использовалось установка Rigaku.
 Автоматизированная
система
Formulatrix.
Использовалась
для
роботизированного раскапывания липидной кубической фазы.
 Спектрофотометр. Использовался для измерения спектров поглощения образцов
солюбилизированного и окрашенного белка.
2.3. Методы изготовления и хранения образцов
2.3.1. Солюбилизация бактериородопсина
Необходимые материалы:
-
Солюбилизационный буфер 20 mM Na2HPO4/KH2PO4. (Na/K−Pi),
pH 7.1, 3.75 % (w/v) OG
Методы:
1) Разбавить
раствор
с
пурпурными
мембранами
буфером
для
солюбилизации до конечной концентрации белка 2.5 мг/мл
2) Оставить перемешиваться на 2 дня в 4°C в темноте
3) Открутить образец на ультрацентрифуге на 90000g
4) Собрать супернатант
33
2.3.2. Определение концентрации белка
Концентрация бактериородопсина определялась по спектру поглощения в
УФ/видимом диапазоне. Спектр bR в диапазоне 250-700 нм имеет две интенсивные
линии поглощения. Первая линия – поглощение ретиналя ~570 нм. Положение
максимума и коэффициент экстинкции для этой линии зависят от присутствия
липидов,
детергента,
от
pH
и
т.д.
Для
солюбилизированного
в
OG
бактериородопсина максимум этой линии достигается при 553 нм и коэффициенте
экстинкции примерно 42000 М-1см-1. Вторая линия на 280 нм представляет собой
поглощение ароматическими аминокислотами.
Рисунок 20. Спектр поглощения солюбилизированного bR и определѐнные по нему максимумы
поглощения.
Концентрация белка рассчитывается по формуле:
34
где CbR – концентрация bR в мг/мл, Amax – максимум поглощения линии ретиналя,
MWbR – молярная масса bR, d – длина оптического пути в см, ε – коэффициент
экстинкции в М-1см-1.
2.3.3. Окрашивание бактериородопсина
Необходимые материалы:
1) Раствор A: PBS буфер (pH 7.4): на 1л воды 8 г NaCl, 0.2 г KCl, 1.44 г
Na2HPO4*2H2O и 0.24 г KH2PO4
2) Раствор B: 0.2M NaHCO3 разбавить до pH 9.0 2M NaOH
3) Раствор C: Смешать раствор A с раствором B в соотношении 20:1 до
конечного pH 8.3
4) Раствор D: Растворить 1.0 мг Atto590 в 50-200 мкл DMSO или DMF
5) Колонка для гель-фильтрации с носителем Sephadex G-75 или
эквивалент
Методы:
1) Растворить 1-5 мг белка в 1мл растворе C
2) Добавить к полученному раствору раствор D, из расчета 2-3 молекулы
красителя на 1 молекулу белка
3) Перемешивать в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте
4) Уравновесить колонку раствором A
5) Загрузить покрашенный белок в колонку
6) Промыть колонку раствором A
7) Собрать фракцию с белком
2.3.4. Определение доли окрашенных молекул
Доля окрашенных молекул бактериородопсина определялась по спектру
поглощения раствора окрашенного белка в УФ/видимом диапазоне. Наблюдалось
две интенсивные полосы поглощения. Первая линия – поглощение присоединѐнной
к белку молекулы красителя (для Atto590 это около 590 нм, для покрашенного bR
при помощи Cy3 доля покрашенного белка не измерялась, она уже была известна).
35
Вторая линия на 280 нм представляет собой поглощение ароматическими
аминокислотами.
Рисунок 21. Спектр поглощения bR окрашенного Atto590 и определѐнные по нему максимумы
поглощения.
Доля окрашенных молекул рассчитывается по формуле:
⁄
⁄
где DOL (degree of labeling) – доля окрашенных молекул белка, Amax – максимум
поглощения линии красителя, εmax – коэффициент экстинкции красителя на длине
волны максимального поглощения, εprot – коэффициент экстинкции белка на длине
волны 280 нм, Aprot – поглощение самого белка, A280 – максимум поглощения линии
ароматических кислот белка,CF280 – фактор коррекции красителя. CF280 = ε280 / εmax,
где ε280 – коэффициент экстинкции красителя на длине волны 280 нм. Для
36
бактериородопсина и красителя Atto590 коэффициенты экстинкции и фактор
коррекции равны соответственно:
εmax = 1.2×105 М-1см-1
εprot = 55000 М-1см-1
CF280 = 0.44
2.3.5. Замешивание липидной фазы
Замешивание липидной фазы проводилось при помощи специальных шприцев
на 100 мкл [24].
Соединитель
шприцев
Поршень
Тефлоновые
прокладки
Водный
раствор белка
Липид
Липидная
фаза
Рисунок 22. Метод замешивания липидной фазы с помощью шприцев.
В один из шприцев набирался раствор белка, в другой – заранее
расплавленный при температуре 42oC моноолеин. Отношение объема моноолеина к
объѐму раствора белка – 60% к 40%, что при комнатной температуре соответствует
кубической фазе Pn3m. Затем шприцы соединялись, и их содержимое аккуратно
перемешивалось при несильном охлаждении (чтобы восстановить комнатную
температуру у моноолеина). О появлении кубической фазы свидетельствовало
37
изменение цвета смеси (становилась прозрачной), а также увеличение силы,
которую нужно было оказывать на поршни для перемешивания. Затем полученная
фаза в одном шприце оставлялась на ночь, для того чтобы установились переходные
процессы.
В работе использовались различные растворы белка. Их можно разделить на
четыре типа:
 Растворы
с
окрашенным
бактериородопсином,
Cy3
с
высокой
концентрацией бактериородопсина (около 4мг/мл – измерена с
помощью спектрофотометра), с низкой долей окрашенных молекул
(0.4%).
 Растворы с окрашенным Atto590 бактериородопсином, с высокой
концентрацией
бактериородопсина
(4мг/мл),
с
низкой
долей
окрашенных молекул (0.5%, 0.05%).
 Растворы с окрашенным Atto590 бактериородопсином, с низкой
концентрацией бактериородопсина (концентрация выбиралась методом
перебора с понижением на порядки – в итоге порядка 10-9мг/мл), с
высокой долей окрашенных молекул (около 60% - измерена с помощью
спектрофотометра).
 Растворы с окрашенным Atto590 эндотелиновым рецептором типа Б, с
низкой
концентрацией
(порядка
10-9мг/мл),
с
высокой
долей
окрашенных молекул (около 60%). Окрашивание ETB и приготовление
липидной фазы с ETB было проведено совместно с А. Мишиным.
Как было сказано ранее, подбор концентрации белка в растворе для раствора
третьего типа происходил из расчета «1 молекула на нм3», а затем происходило
варьирование на порядки в пределах рассчитанной величины. Для первых двух
типов происходил перебор доли окрашенных молекул с понижением порядка. Т.е.
сначала происходил выбор концентрации окрашенных молекул, а затем с помощью
микроскопа определялось,
подойдѐт ли
данный
образец
для
дальнейших
исследований.
38
В итоге были замешаны следующие липидные фазы:
1) Для измерений спектров флуоресценции:
 bR (4мг/мл) окрашенный Cy3 (4%) в LCP
 bR (4мг/мл) окрашенный Atto590 (75%) в LCP
2) Для получения видеозаписей движения одиночных молекул белка:
 bR (4мг/мл) окрашенный Cy3 (0.4%) в LCP
 bR (4мг/мл) окрашенный Atto590 (5%, 0.5%, 0.05%) в LCP
 bR (10-9 мг/мл) окрашенный Atto590 (около 60%) в LCP
 ETB (10-9 мг/мл) окрашенный Atto590 (около 60%) в LCP
Протокол замешивания липидной фазы с ETB приведѐн ниже (фаза
замешивалась не мной):
LCP: 3/2 = моноолеин с 10% холестерина / раствор белка в буфере
Буфер: 50mM Hepes pH7.5, 20mM MgCl2, 500mM NaCl, 2% glycerol, 0,05%
DDM/CHS - смесь детергентов (5\1)
2.3.6. Раскапывание липидной фазы и изготовление окончательных образцов
для измерений
Были изготовлены образцы двух типов: плашки на 96 лунок и “сэндвичи”.
Плашки готовились вручную, а раскапывание фазы на них проводилось с помощью
автоматизированной системы. Для изготовления плашки берѐтся стеклянная или
пластиковая основа (в зависимости от того, какие эксперименты будут с ней
проводиться). На неѐ приклеивается изначально подготовленное поле из клея с 96
лунками, с которого затем снимается верхний защитный слой и, после раскапывания
фазы, сверху приклеивается покровное стекло. В данном случае толщина образца
получается порядка 100 мкм, в зависимости от выбранного поля с лунками.
Раскапывание производится автоматически с помощью робота, причѐм робот
39
сначала раскапывал фазу по 100 нл, а затем приципитант по 800нл. Окончательный
вид образца данного типа приведѐн на рисунке 23.
Рисунок 23. Кристаллизационная плашка с раскапанной липидной фазой.
Образцы типа “сэндвич” были придуманы мной для уменьшения толщины
зажатой между стѐклами липидной фазы (данное уменьшение толщины в
дальнейшем помогает уменьшить фоновый шум при съѐмке на микроскопе, а также
добиться более долгого времени присутствия одиночных молекул в области
видимости). Брались обычные покровные стѐкла 2.5×2.5 см2 и толщиной около 160
мкм. Затем вырезались куски специального пластика аналогичной площади. На
стекло с помощью ручного диспенсера капалось 1-2 мкл липидной фазы. Вокруг
липидной фазы капалось около 20 мкл буфера. Затем сверху всѐ накрывалось
куском пластика, и образец аккуратно сдавливался так, чтобы фаза и буфер
растеклись, но чтобы внутри не оставалось пузырьков воздуха. Итоговый диаметр
раздавленной липидной фазы был порядка 1 см, остальное пространство занимал
буфер. На рисунке 24 показана схема данного образца.
40
LCP
Пластик
Преципитант
Стекло d ≈ 160 µm
Рисунок 24. Схема образца типа “сэндвич”.
Одна из сторон “сэндвича” делалась из пластика, чтобы были возможны
измерения данных образцов с помощью метода малоуглового рентгеновского
рассеяния.
Сравнительный анализ образцов двух данных типов приведѐн ниже:
Плашки
+:
• Удобство в изготовлении
• Незначительное испарение
фазы за заданный
промежуток времени
-:
• Затруднена работа на SAXS
• Большая толщина образца
(порядка сотен микрон)
• Затрачивается больше
времени на изготовление
Сэндвичи
+:
• Маленькая толщина образца
(5-30мкм)
• Быстро изготавливаемы
-:
• Затруднена работа на SAXS
• Особые требования к
хранению из-за заметного
испарения
Рисунок 25. Сравнительный анализ образцов двух типов: плашка и “сэндвич”.
Для снятия спектров флуоресценции образцы готовились на обычных
предметных стѐклах (2.5×8 см2). Как и в случае с плашками на предметное стекло
41
наносилось специальное поле с лунками, а затем образец после ручного
раскапывания накрывался покровным стеклом.
В итоге были изготовлены следующие образцы:
1) Для измерения спектров флуоресценции:
 Раствор bR, солюбилизированного в OG.
 Раствор Cy3
 bR (4мг/мл) окрашенный Cy3 (4%) в LCP
 bR (4мг/мл) окрашенный Atto590 (75%) в LCP
2) Для получения видеозаписей движения одиночных молекул белка:
 bR (4мг/мл) окрашенный Cy3 (0.4%) в LCP без преципитанта.
 bR (4мг/мл) окрашенный Atto590 (5%, 0.5%, 0.05%) в LCP с
преципитантом 1M Na/K фосфат pH 5.6.
 bR (10-9 мг/мл) окрашенный Atto590 (около 60%) в LCP без
преципитанта. (Образец 1)
 bR (10-9
мг/мл) окрашенный
Atto590
(около
60%)
в LCP с
60%)
в LCP с
преципитантом 1M Na/K фосфат pH 5.6. (Образец 2)
 bR (10-9
мг/мл) окрашенный
Atto590
(около
преципитантом 2.3M Na/K фосфат pH 7.0. (Образец 3)
 ETB (10-9 мг/мл) окрашенный Atto590 (около 60%) в LCP без
преципитанта. (Образец 4)
 ETB (10-9 мг/мл) окрашенный Atto590 (около 60%) в LCP
с
преципитантом 500mM NaCl. (Образец 5)
 ETB (10-9 мг/мл) окрашенный Atto590 (около 60%) в LCP с
преципитантом NiCl2 0.4M + 0.1M Tris pH7 + 30% v/v PEG 400.
(Образец 6)
Для липидной фазы с ETB в качестве преципитантов были выбраны буферы
(Образец 5, Образец 6), чтобы проверить гипотезу о том, что первый буфер
отрицательно действует на скорость диффузии, а второй положительно.
42
2.3.7. Хранение образцов
Плашки хорошо герметизируются ещѐ при изготовлении, поэтому не требуют
специального хранения. Сэндвичи же, во-первых, не герметизированы по краѐв, вовторых, через пластик происходит испарение воды. Поэтому для их хранения
использовались
специальные
стеклянные
коробочки,
герметизированные
специальным вакуумным маслом.
Рисунок 26. Стеклянная коробка для хранения образцов типа “сэндвич”.
2.4. Методы измерения
2.4.1. Получение дифракционных картин для липидных фаз
Получение дифракционных картин проводилось на установке Rigaku методом
малоуглового рентгеновского рассеяния (SAXS) под руководством аспиранта
Михаила Синцова. Образцы типа “сэндвич” закреплялись в специальном держателе
и помещались в установку для измерений. Накопление измерений для одного
образца длилось 15-30 минут, так как стекло слабо пропускает рентгеновское
излучение. Также в течение 2-5 минут проводились измерения тестовых образцов в
PCR пробирках (для них накопление данных идѐт быстро). По окончании измерений
полученные дифракционные картины сохранялись для последующей обработки.
Примеры полученных дифрактограмм показаны на рисунке.
43
Рисунок 27. Примеры полученных дифракционных картин. а) Для липидной фазы с bR в PCR
пробирке сразу после изготовления. б) Для липидной фазы с bR с преципитантом 2.3M NaKPi pH
7.0 на второй день после изготовления.
2.4.2. Получение спектров флуоресценции компонентов фазы
Измерение
спектров
флуоресценции
проводилось
на
флуоресцентном
микроскопе с помощью конфокального метода. Все работы проводились в
программе ZEN 2012. Образцы облучались поочерѐдно разными лазерами, и
измерялись спектры их флуоресценции. Пример спектрального изображения и
спектра флуоресценции, получаемые в программе, показаны на рисунке.
Рисунок 28. а) Спектральная картина липидной фазы с окрашенным Cy3 bR при освещении
лазером длиной волны 514 нм . б) Спектр флуоресценции данного образца.
44
Также программа выдаѐт спектр в текстовом формате.
Исследовались спектры флуоресценции как компонентов фазы, так и
замешанных
с
покрашенным
белком
фаз.
Были
получены
спектры
солюбилизированного в OG bR, солюбилизированного в OG bR в липидной фазе,
раствора Cy3, bR окрашенного Cy3 в липидной фазе, bR окрашенного Atto590 в
липидной фазе.
Объектив: масляный 60-кратный.
Лазер: длины волн 405 нм, 458 нм, 488 нм, 514 нм, 561 нм, 633 нм мощность
1-2% от максимальной.
Светофильтр: Для каждого лазера соответствующий светофильтр.
Светодатчики: Для каждого лазера соответствующие светодатчики.
2.4.3. Определение толщины образца
Измерение толщины образца проводилось на флуоресцентном микроскопе с
помощью конфокального метода. Данным методом исследовались образцы типа
“сэндвич” Снималась зависимость интенсивности от положения фокальной
Intensity
плоскости.
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
8 мкм
0
5
10
15
20
25
30
Z-position, µm
Рисунок 29. График зависимости интенсивности флуоресценции от положения фокальной
плоскости для образца липидной фазы с bR с преципитантом 1M NaKPi pH 5.6. Полученная
толщина образца 8±1 мкм.
45
По полученному графику толщина образца определялась как ширина на
полувысоте. Так как высокая точность данного измерения нас не интересовала,
толщина образцов получена с точностью порядка 2 мкм.
Объектив: масляный 100-кратный.
Лазер: длина волны 561 нм, мощность 1-5% от максимальной.
Светофильтр: пропускающий больше 561 нм.
Светодатчики: более 571 нм.
2.4.4. Получение видеозаписей движения одиночных молекул белка
Запись движения одиночных молекул белка проводилась на флуоресцентном
микроскопе с помощью метода TIRF. Сначала проводилась настройка микроскопа
на нужную позицию в эпи-флуоресцентном моде. Затем микроскоп переключался в
режим TIRF. Проводилась ручная настройка угла и коллиматора при мощности
лазера порядка 10% от максимальной. После того, как удалось засечь единичные
молекулы, выбирался нужный масштаб области, минимально доступное время
экспозиции, и выставлялось максимально доступное усиление сигнала. Затем лазер
включался на полную мощность, и включалась запись. Пример полученного
изображения одиночных молекул показан на рисунке.
46
Рисунок 30. Пример визуализации одиночных молекул окрашенного белка ETB в липидной фазе без
преципитанта. Масштаб - 51.2×51.2 мкм. Размер пикселя – 100 нм.
Объектив: масляный 100-кратный.
Лазер: длина волны 561 нм, мощность 100%.
Светофильтр: пропускающий больше 561 нм.
Время экспозиции: 20мс или 33мс.
Коэффициент усиления: 300.
2.5. Методы обработки
2.5.1. Определение типа липидной фазы
Тип липидной фазы определялся после обработки дифракционных картин в
программе SAXSGUI. Программа производила свѐртку дифракционной картины по
углу, учитывая калибровочные параметры, и (уже с учѐтом калибровки) получался
график зависимости средней интенсивности в логарифмических координатах от
47
волнового вектора рассеяния q (в Å-1). На рисунке представлено основное окно
программы SAXSGUI.
Рисунок 31. Пример обработки дифрактограммы липидной фазы в программе SAXSGUI.
Далее представлен пример получаемого графика.
Рисунок 32. Пример графика зависимости средней интенсивности рассеяния от волнового
вектора рассеяния.
По полученным графикам находилось отношение координат положения пиков
и определялся тип фазы. А по значению первого пика находился параметр решѐтки,
как 2π/q с умножением на соответствующий числовой коэффициент (для
ламеллярной фазы – 1, для Pn3m - √ , для Ia3d - √ .
2.5.2. Трекинг молекул
48
Трекинг молекул проводился в программе ImageJ с помощью специального
плагина MOSAIC. Полученная видеозапись открывалась с помощью программы
ImageJ. Если видеозапись требовала обработки, то происходило следующее:
1) Из видеозаписи вырезалась нужная область и нужное количество кадров с
помощью функции Duplicate.
2) Затем по необходимости вычитался фон с помощью функции Subtract
Background .
3) И, наконец, настраивалось настраивалась яркость и контраст изображения с
помощью соответствующих функции Brightness/Contrast.
Затем к обработанной видеозаписи применялся специально установленный в
ImageJ плагин MOSAIC.
Рисунок 33. Окно плагина MOSAIC в программе ImageJ.
Параметр Radius выставлялся равным 3, Cutoff – 0, Percentile – подбирался так,
чтобы программа определила нужные частицы (обычно не больше 1%). Эти три
параметра отвечают за нахождение частиц: Radius – за радиус (в пикселях) маски
фитирования Гауссианом, Cutoff – за отсечение пятен, не похожих на частицы,
Percentile – за то, какой процент от всех локальных максимумов интенсивности
49
принимается за частицу. Далее выбирались ещѐ два параметра, отвечающие за
объединение полученных локализаций частиц в траектории. Первый из этих
параметров - Link Range (выбирался равным 1), который отвечает за число кадров, в
течение которых частица может отсутствовать на видеозаписи (значение 1
соответствует тому, что частица всегда присутствует на протяжении траектории).
Второй параметр, Displacement, определяет максимальное число пикселей между
двумя последовательными положениями частицы. Displacement выбирался равным
от 5 до 10, в зависимости от наблюдаемого движения частиц.
Через некоторое время после запуска программа выдавала результаты:
Рисунок 34. Пример трекинга частиц плагином MOSAIC.
Первое окно включает в себя информацию о параметрах и полученных
траекториях частиц. Во втором окне представлены все полученные траектории с
возможностью выбора минимальной отображаемой длины траекторий.
50
Далее происходила обработка каждой траектории в отдельности (программа
позволяет это делать):
 Отслеживалось, чтобы реальное движение частицы совпадало с
траекторией – иногда в качестве частицы мог определиться шум.
 Сохранялась видеозапись и координаты частицы для каждой траектории
в отдельности.
Пример отдельной траектории представлен далее.
Рисунок 35. Пример полученной траектории молекулы ETB в липидной фазе без преципитанта.
Масштаб – 3.8×4.8 мкм. Время экспозиции камеры – 20 мс.
2.5.3. Получение кривых диффузии, коэффициентов диффузии молекул и
гистограмм распределения частиц по коэффициентам диффузии
Полученные координаты частиц обрабатывались в программе Mathematica 9.0.
Были написаны две программы для обработки полученных координат частиц. За
основу построения графика бралась формула (12), для фитирования использовалась
формула (11) – находился коэффициент диффузии частиц на малых масштабах.
Линейные графики проводились для всех частиц по первым 5 точкам. Текст
программ представлен ниже.
51
Программа 1.
SetDirectory[NotebookDirectory[]]
data = Import["filename.txt", "Data"];
{T,X,Y,n} = data\[Transpose];
coord = Table[{},{i,1,Max[n]+1}]
Do[{
number = IntegerPart[n[[i]]]+1;
AppendTo[coord[[number]],{T[[i]]*33/1000,X[[i]]/10,Y[[i]]/10}]
},{i,1, Length[n]}]
Do[{c=coord[[i]];
Do[{mrsd=0;Do[mrsd+=(c[[j+k]][[2]]-c[[j]][[2]])^2+(c[[j+k]][[3]]c[[j]][[3]])^2,{j,1,Length[c]-k}];
mrsd=mrsd/(Length[c]-k);
ts=c[[1]][[1]];
t=c[[k]][[1]]-ts+0.02;
AppendTo[c[[k]],{t,mrsd}]},{k,1,Length[c]-2}];
AppendTo[c[[Length[c]-1]],{0,0}];
AppendTo[c[[Length[c]]],{0,0}];
a = c\[Transpose][[4]];
five = Take[a,5];
plot1=a;
plot = five;
f=FindFit[plot,h+4*diffusion*x,{h,diffusion},x];
f1=Fit[plot,{1,x},x];
d = f[[2]];
Print[f];
Print["Particle
number="<>ToString[i]<>""<>ToString[d]<>"\!\(\*SuperscriptBox[\(um\),\(2\)]\)/s"];
Print[Show[{Plot[f1,{x,0,Max[plot\[Transpose][[1]]]+0.6}],ListPlot[plot1]},PlotRange>All,ImageSize->700,Frame-> True, FrameLabel-> {Style["Time, s",Large],Style["Mean
square displasement, \[Mu]m^2",Large]}]];},{i,1,Length[coord]}]
52
Программа 2.
SetDirectory[NotebookDirectory[]]
data9= Import["filename.txt", "Data"];
data10 =\Transpose[data9]
Print[Show[{Histogram[data10,20]},PlotRange->All,ImageSize->700,Frame-> True,
FrameLabel-> {Style["Diffusion coefficient, \[Mu]m^2/s",Large],Style["Number of
particles",Large]}]]
На вход первой программы подавался файл в формате .txt с координатами
частицы. Затем с помощью неѐ получались графики диффузии и коэффициенты
диффузии, которые сохранялись для каждой молекулы. Составлялся общий
текстовый файл с коэффициентами диффузии всех частиц, а затем с помощью
второй
программы
строились
гистограммы
распределения
частиц
по
коэффициентам диффузии. Затем они фитировались функциями Гаусса.
Пример построенного графика и определѐнный по нему коэффициент
показаны далее.
Рисунок 36. Пример построенного графика диффузии и касательной к нему.
D = 0.99 ± 0.01 мкм2
53
3. Результаты и обсуждения
3.1. Спектры флуоресценции составляющих липидной фазы.
Были получены спектры флуоресценции составляющих липидных фаз
полностью замешанных липидных фаз.
40
12
10
Intensity
Intensity
30
20
10
8
6
4
2
0
0
400
500
600
700
800
400
500
600
700
800
Wavelenght
Wavelength
561
561
100
30
80
25
Intensity
Intesity
Рисунок 37. Спектры флуоресценции bR: а) солюбилизированного в OG , б) в LCP .
60
40
20
15
10
20
5
0
0
400
500
600
700
800
400
500
Wavelength
488
514
600
700
800
Waxelength
488
514
561
Рисунок 38. Спектры флуоресценции Cy3: а) в растворе, б) bR+Cy3 в LCP.
54
25
Intensity
20
15
10
5
0
450
550
650
750
Wavelength
561
Рисунок 39. Спектр флуоресценции bR+Atto590 в LCP.
Максимум флуоресценции солюбилизированного в OG bR наблюдался на
длине волны 690 нм при облучении его лазером 561 нм. При освещении другими
лазерами также наблюдалась флуоресценция на длине волны 690 нм, но
интенсивность была в разы слабее, что говорит о том, что максимум поглощения
солюбилизированного bR находится в районе 560 нм (что подтверждалось при
измерении спектра поглощения солюбилизированного bR на спектрофотометре).
Аналогичная картина наблюдалась для bR в липидной фазе.
Максимум флуоресценции красителя Cy3 наблюдался на длине волны 566 нм
при облучении лазерами 488 нм, 514 нм и 561 нм. Максимальная интенсивность
наблюдалась при облучении его лазером 561 нм (максимум спектра поглощения 548 нм).
Аналогичная картина наблюдалась для окрашенного Cy3 bR в липидной фазе.
Это говорит о том, что квантовый выход флуоресцентного красителя Cy3 намного
больше квантового выхода флуоресценции bR.
Предполагая, что так
будет и для
красителя
Atto590, его спектр
флуоресценции отдельно от bR не исследовался. Максимум флуоресценции bR
окрашенного Atto590 в липидной фазе наблюдался на длине волны 602 нм при
55
облучении лазером 561 нм. Это значение немного не совпадает с табличным, что
вероятно можно объяснить тем, что Atto590 присоединѐн к белку.
Интересными оказались спектральные картины фаз. Далее представлено
спектральное изображение липидной фазы с bR окрашенным Cy3.
Рисунок 40. Спектральное изображение bR+Cy3 в LCP. Масштаб - 85×85 мкм. Лазер - 514 нм.
На изображении видно, что в фазе присутствует некая неоднородность
флуоресценции, что говорит об неоднородности распределения белка в фазе.
3.2. Определение типа липидной фазы и еѐ толщины.
Стоит напомнить названия основных образцов:
 bR (10-9 мг/мл) окрашенный Atto590 (около 60%) в LCP без
преципитанта. (Образец 1)
 bR (10-9
мг/мл) окрашенный
Atto590
(около
60%)
в LCP с
60%)
в LCP с
преципитантом 1M Na/K фосфат pH 5.6. (Образец 2)
 bR (10-9
мг/мл) окрашенный
Atto590
(около
преципитантом 2.3M Na/K фосфат pH 7.0. (Образец 3)
 ETB (10-9 мг/мл) окрашенный Atto590 (около 60%) в LCP без
преципитанта. (Образец 4)
 ETB (10-9 мг/мл) окрашенный Atto590 (около 60%) в LCP
с
преципитантом 500mM NaCl. (Образец 5)
56
 ETB (10-9 мг/мл) окрашенный Atto590 (около 60%) в LCP с
преципитантом NiCl2 0.4M + 0.1M Tris pH7 + 30% v/v PEG 400.
(Образец 6)
С помощью метода SAXS происходило наблюдение за изменением типа фазы.
Результаты этих измерений приведены в таблице 1.
21.04.14
ПЦР
пробирка
Образец №2
Образец №3
Pn3m
Pn3m
Pn3m
101,5Å
98.2 Å
85.6 Å
Ia3d
Pn3m
131.3 Å
73.2 Å
23.04.14
Таблица 1. Результаты измерений методом SAXS.
Видно, что в изготовленных по типу “сэндвич” образцах сразу после
изготовления тип фазы сохраняется, что опровергает наше предположение о том,
при таком сжатии липидной фазы будет образовываться ламеллярная фаза. Но с
течением времени липидная фаза высыхает, о чѐм свидетельствует уменьшение
структурного параметра в случае Образца 3 и изменение типа фазы в случае
Образца 2. Данные результаты мы можем сопоставить далее с результатами
измерений для одиночных молекул.
Результаты измерений толщин тех же образцов (Образец 2, Образец 3)
представлены ниже.
57
50
35
30
25
Intensity
Intensity
40
30
20
20
15
10
10
5
0
0
0
10
20
30
0
10
20
30
Z-position, µm
Z-position, µm
Рисунок 41. Графики для определения толщины образцов: а) Образец 2, б) Образец 3.
Толщина Образца 2 - 8±1 мкм.
Толщина Образца 3 - 14±1 мкм.
3.3. Визуализация одиночных молекул.
Первые результаты по визуализации одиночных молекул белка bR были
получены для bR окрашенного Cy3 в LCP.
Рисунок 42. Визуализация одиночных молекул белка bR окрашенных Cy3 в LCP. Масштаб –
51.2×51.2 мкм.
Данные видеозаписи показали, что Cy3 плохо применим в качестве
флуоресцентного красителя для наших целей, поскольку он обладает свойством
“мерцания” (blinking) – частым переключением между коротко живущим активным
58
флуоресцентным состоянием и долго живущим неактивным фосфоресцентным
состоянием. Данное свойство не позволяет наблюдать за движением молекул,
поскольку они то появляются, то исчезают. Также Cy3 достаточно быстро
обесцвечивался при облучении мощным лазером, что также может послужить
препятствием для наблюдения за молекулами белка.
Затем были получены первые результаты визуализации молекул bR,
окрашенных
Atto590, в LCP без преципитанта. Постепенным снижением
концентрации окрашенных молекул белка при неизменной полной концентрации
белка добивались улучшения качества изображения. Но подходящих
для
последующей компьютерной обработки результатов получено не было. Ниже
представлены такие обработанные видеозаписи.
Рисунок 43. Визуализация одиночных молекул белка bR, окрашенных Atto590, в LCP с
определѐнными траекториями молекул: а) 5% окрашенных молекул, б) 0.05% окрашенных
молекул. Масштаб – 25.6×25.6 мкм.
Уже по ним видно, что при отсутствии преципитанта молекулы белка bR
малоподвижны в LCP.
59
Теперь перейдѐм к основным результатам. Здесь снова стоит напомнить
основные образцы:
 bR (10-9 мг/мл) окрашенный Atto590 (около 60%) в LCP без
преципитанта. (Образец 1)
 bR (10-9
мг/мл) окрашенный
Atto590
(около
60%)
в LCP с
60%)
в LCP с
преципитантом 1M Na/K фосфат pH 5.6. (Образец 2)
 bR (10-9
мг/мл) окрашенный
Atto590
(около
преципитантом 2.3M Na/K фосфат pH 7.0. (Образец 3)
 ETB (10-9 мг/мл) окрашенный Atto590 (около 60%) в LCP без
преципитанта. (Образец 4)
 ETB (10-9 мг/мл) окрашенный Atto590 (около 60%) в LCP
с
преципитантом 500mM NaCl. (Образец 5)
 ETB (10-9 мг/мл) окрашенный Atto590 (около 60%) в LCP с
преципитантом NiCl2 0.4M + 0.1M Tris pH7 + 30% v/v PEG 400.
(Образец 6)
Ниже представлены результаты измерений для всех этих образцов уже с
построенными траекториями частиц.
1) Образец 1 (bR, без преципитанта): по видеозаписи видно, что большинство
частиц неподвижны либо диффузия медленная. Это говорит о малой
подвижности белка
bR в отсутствии преципитанта и
соответствует
наблюдениям методом FRAP.
60
Рисунок 44. Визуализация одиночных молекул белка bR в Образце 1 с определѐнными
траекториями молекул. Масштаб – 25.6×25.6 мкм.
2) Образец 2 (bR, преципитант 1M NaKPi pH5.6):
1. Первый день наблюдения (после приготовления): в липидной фазе были
найдены области, где характер движения молекул отличался от всей фазы. В
этих областях, подобно случаю в отсутствии преципитанта наблюдалась
медленная диффузия белка. Во всей остальной фазе молекулы двигались
быстрее, но также наблюдалось и множество неподвижных частиц.
61
Рисунок 45. Визуализация одиночных молекул белка bR в Образце 2 в первый день наблюдений с
определѐнными траекториями молекул: а) вся фаза, б) особые области. Масштаб – 25.3×20.7
мкм и 16.3×11.4 мкм соответственно.
Рисунок 46. Особая область в LCP. Масштаб - 51.2×51.2 мкм.
2. Второй день наблюдения: подобные первому дню области обнаружить не
удалось. Визуально наблюдается быстрая диффузия молекул, неподвижные
молекулы практически отсутствуют.
62
Рисунок 47. Визуализация одиночных молекул белка bR в Образце 2 во второй день наблюдений с
определѐнными траекториями молекул. Масштаб – 25.6 ×25.6 мкм.
3) Образец 3 (bR, преципитант 2.3M NaKPi pH7.0):
1. Первый день наблюдения: визуально наблюдается быстрая диффузия молекул,
неподвижные молекулы практически отсутствуют.
63
Рисунок 48. Визуализация одиночных молекул белка bR в Образце 3 в первый день наблюдений с
определѐнными траекториями молекул. Масштаб – 25.6 ×25.6 мкм.
2. Второй день наблюдения: наблюдается изменение характера движения
молекул. Молекулы движутся не по случайным траекториям, видны “линии”
этого движения. Возможные объяснение этому: вблизи поверхности стекла
могла образоваться частично ламеллярная фаза и частицы движутся
параллельно еѐ слоям.
64
Рисунок 49. Визуализация одиночных молекул белка bR в Образце 3 во второй день наблюдений с
определѐнными траекториями молекул. Масштаб – 25.6 ×25.6 мкм.
4) Образец 4 (ETB, без преципитанта): визуально наблюдается случайное
блуждание молекул белка.
65
Рисунок 50. Визуализация одиночных молекул белка ETB в Образце 4 с определѐнными
траекториями молекул. Масштаб – 25.6 ×25.6 мкм.
5) Образец 5 (ETB, преципитант 0.5M NaCl): наблюдается изменение характера
диффузии по отношению к образцу без преципитанта. Далеко от границы
липидной фазы визуально наблюдается такое же случайное блуждание
молекул. Вблизи границы наблюдается движение молекул по параллельным
границе траекториям, что свидетельствует об образовании там ламеллярной
фазы.
66
Рисунок 51. Визуализация одиночных молекул белка ETB в Образце 5 с определѐнными
траекториями молекул: а) вдали от границы фазы, б) вблизи границы фазы. Масштаб – 25.6
×25.6 мкм и 25.6 ×21.6 мкм соответственно.
6) Образец 6 (ETB, преципитант буфер с NiCl2): визуально наблюдается
случайное блуждание молекул
67
Рисунок 52. Визуализация одиночных молекул белка ETB в Образце 6 с определѐнными
траекториями молекул. Масштаб – 25.6 ×25.6 мкм.
3.4. Результаты компьютерной обработки.
Результаты обработки траекторий молекул представлены в виде гистограмм
распределения количества частиц по величине коэффициента диффузии. Всего для
каждого образца было обработано 70 частиц. Всего было обработано 560 частиц.
1) Распределение молекул bR по значениям коэффициента диффузии
68
Рисунок 53. Гистограмма распределения частиц по значениям коэффициента диффузии для
Образца 2 в первый и во второй день соответственно.
Рисунок 54. Гистограмма распределения частиц по значениям коэффициента диффузии для
Образца 3 в первый и во второй день соответственно.
2) Распределение молекул ETB по значениям коэффициента диффузии
Рисунок 55. Гистограмма распределения частиц по значениям коэффициента диффузии для
Образца 4.
69
Рисунок 56. Гистограмма распределения частиц по значениям коэффициента диффузии для
Образца 5: а) вдали от границы фазы, б) вблизи границы фазы.
Рисунок 57. Гистограмма распределения частиц по значениям коэффициента диффузии для
Образца 6.
Ниже представлены сводные таблицы результатов обработки траекторий.
1) Для молекул bR
Образец
1
(bR,
без Образец 2 (bR, 1M)
Образец 3 (bR, 2.3M)
преципитанта)
Первый день
Медленная диффузиия Диффузия
с
двумя Быстрая
диффузия
с
2
(< 0.3 мкм /с), много пиками на (0.24 ± 0.15) пиками на (0.8 ± 0.2)
неподвижных частиц
Второй день
мкм2/с, (1.0 ± 0.4) мкм2/с
Диффузия
с
мкм2/с и (1.5 ± 0.2) мкм2/с
тремя Быстрая
пиками на (0.27 ± 0.15) одним
2
диффузия
с
хорошо
2
мкм /с, (0.9 ± 0.3) мкм /с выделенным пиком (0.9 ±
и (1.6 ± 0.3) мкм2/с
0.2) мкм2/с
Таблица 2. Сводных результатов для LCP с bR.
70
Доля
частиц
с Доля
коэффициентом
диффузии
коэффициентом
с Доля
частиц
1.0 мкм2/с
с
коэффициентом
меньше диффузии от 0.5 до диффузии
0.5 мкм2/с
Без преципитанта
частиц
больше
1.0 мкм2/с
Практически 100%
С 1M преципитантом на 1
день
50%
21.4%
28.6%
39,7%
24,4%
35,9%
15,7%
32,9%
51,4%
11,4%
44,3%
44,3%
С 1M преципитантом на 2
день
С 2.3M преципитантом на 1
день
С 2.3M преципитантом на 2
день
Таблица 3. Распределение частиц по скорости их диффузии для образцов bR в LCP.
Из полученных результатов видна положительная зависимость скорости
диффузии молекул белка bR от молярности добавляемого преципитанта. А также
видно, что со временем увеличивается количество быстрых частиц.
Появление трѐх пиков диффузии в случае 1M преципитанта можно объяснить
образованием липидной фазы с другой кубической решѐткой Ia3d, размер ячейки
которой
больше
чем
для
Pn3m,
соответственно
появляется
пик
быстро
диффундирующих частиц. Наличие же двух других пиков находится в соответствии
с экспериментами методом FRAP.
Во всех образцах присутствует пик 0.8-0.9 мкм2/с, что также соответствует
статье про исследования методом FRAP. Также подтвердилось увеличение
подвижности частиц с течением времени.
Таким образом, подтверждена возможность локальной качественной и
количественной характеристики диффузии молекул bR в липидной фазе.
71
2) Для молекул ETB
Образец
4
(ETB,
без Образец 5 (ETB, NaCl)
Образец 6 (ETB, NiCl2)
преципитанта)
Результат
Пики диффузии на (1.0 ± В
области
рядом Пики диффузии на (1.1 ±
0.4) мкм2/с и (2.1 ± 0.5) границей фазы пики 0.5) мкм2/с и (3.4 ± 0.3)
мкм2/с
диффузии на (0.6 ± 0.3) мкм2/с
мкм2/с и (1.5 ± 0.3)
мкм2/с.
В
области
далеко от границы (0.4 ± 0.2) мкм2/с и (1.0
± 0.2) мкм2/с
Таблица 4. Сводные результаты для LCP с ETB.
Из полученных результатов видно, что наша гипотеза об отрицательном
влиянии преципитанта NaCl и положительном влиянии буфера NiCl2 0.4M + 0.1M
Tris pH7 + 30% v/v PEG 400 на скорость диффузии молекул ETB в липидной
кубической фазе.
Таким образом, подтверждена возможность локальной качественной и
количественной характеристики диффузии молекул bR в липидной фазе.
72
4. Выводы
1) Экспериментально получены спектры флуоресценции составляющих липидной
фазы. На спектральных изображениях видна неоднородность флуоресценции, что
свидетельствует
о
неоднородности
распределения
молекул
белка
бактериородопсина в липидной фазе.
2) Подобран оптимальный флуоресцентный краситель для реализации метода
визуализации одиночных молекул белка, а также экспериментально определена
концентрация
окрашенных
молекул
белка
необходимая
для
визуализации
одиночных молекул белка и последующей компьютерной обработки траекторий.
3) Получены видеозаписи движения одиночных молекул белка бактериородопсина в
липидной фазе при добавлении различных преципитантов, изучена зависимость
подвижности белка от молярности добавляемого буфера, а также изменение
подвижности с течением времени. Подтверждены эксперименты, проведѐнные
методом FRAP, о положительной зависимости скорости диффузии молекул белка
bR от молярности добавляемого преципитанта.
4) Получены видеозаписи движения одиночных молекул белка эндотелиновый
рецептор типа Б в липидной фазе при добавлении различных преципитантов,
подтверждена гипотеза о негативном влиянии преципитанта
0.5M NaCl и
позитивном влиянии буфера NiCl2 0.4M + 0.1M Tris pH7 + 30% v/v PEG 400 на
скорость диффузии белка ETB в липидной кубической фазе.
5)
Полученные
видеозаписи
свидетельствуют
о
возможности
определения
локального характера движения одиночных молекул белка, а также последующей
количественной характеристики этого движения
с помощью флуоресцентного
метода визуализации одиночных молекул - TIRF.
73
5. Заключение
Полученные результаты свидетельствуют о том, что данный метод может
служить мощным инструментом для решения множества практических задач,
связанных с изучением поведения отдельных молекул в клетках, в мембранах, а в
нашем случае, в липидных кубических фазах. Он уже продемонстрировал свою
работоспособность при определении локального характера движения окрашенных
молекул белка в липидных кубических фазах. Данные результаты вплотную
подводят нас к наблюдению процесса образования кристаллов белка в
липидных кубических фазах на молекулярном уровне, понимание которого
чрезвычайно важно для получения кристаллов белка крупных размеров. Он
позволит пронаблюдать характер движения молекул рядом с кристаллом белка, а
также, с помощью этого метода можно увидеть, как молекулы белка подходят к
кристаллу и уходят от него.
74
Список литературы
1. Raman P., Cherezov V., Caffrey M. (2006) The membrane protein data bank. Cell. Mol.
Life Sci. (2006) 63, 36-51
2. Caffrey M. T. (2003) Membrane protein crystallization. J. Struct. Biol. (2003) 142, 108132
3. Bowie U. J. (2001) Stabilazing membrane proteins. Curr. Opin. Struct. Biol. (2001) 11,
397-402
4. Landau E. M., Rosenbusch J. P. (1996) Lipidic cubic phases: a novel concept for the
crystallization of membrane proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., (1996) 93, 1453214535
5. Mariani P., Luzzati V., Delacroix H. (1988) Cubic phases of lipid-containing systems.
Structure analysis and biological implications. J. Mol. Biol. (1988) 204, 165-189
6. Chandrashekhar V. Kulkarni, Wolfgang Wachter, Guillermo Iglesias-Salto, Sandra
Engelskirchen and Silvia Ahualli. (2011). Monoolein: a magic lipid?. Phys. Chem. Chem.
Phys., (2011), 13, 3004–3021
7. Ai X., Caffrey M. (2000) Membrane protein crystallization in lipidic mesophases:
detergent effects. Biophys. J. (2000) 79, 394-405
8. Grabe M., Neu J., Oster G., Nollert P. (2003) Protein interactions and membrane
geometry. Biophys. J. (2003) 84, 854-868
9. Свегун Д.И., Фейгин Л.А. Рентгеновское и нейтронное малоугловое рассеяние.
Москва «Наука». (1986), 7-52
10. Lakowicz J.R. Principles of fluorescence spectroscopy – Sprinter Science, (2006)
11. Peter J. Shaw. Comparison of Widefield/Deconvolution and Confocal Microscopy for
Three-Dimensional Imaging. Handbook of Biological Confocal Microscopy. Springer
Science. (2006) 453-467
75
12. Nathan S. Claxton, Thomas J. Fellers, and Michael W. Davidson. Laser scanning
confocal microscopy. Department of Optical Microscopy and Digital Imaging, National
High Magnetic Field Laboratory, The Florida State University, Tallahassee, Florida
32310
13. Daniel Axelrod. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy in Cell Biology.
Traffic (2001) 2: 764–774
14. Charles A. Day, Lewis J. Kraft, Minchul Kang and Anne K. Kenworthy. Analysis of
Protein and Lipid Dynamics Using Confocal Fluorescence Recovery After Photobleaching
(FRAP). Current Protocols in Cytometry 2.19.1-2.19.29, 2012
15. Axelrod, D.L., Koppel, D.E., Schelessinger, J., Elson, E. and Webb, W.W. Mobility
measuremtns by analysis of photobleaching recovery kinetics. Biophysics journal, (1976)
16: 1055-1069.
16. Anna Pezzarossa, Susanne Fenz, and Thomas Schmidt. Probing Structure and
Dynamics of the Cell Membrane with Single Fluorescent Proteins. Fluorescent Proteins
II, Springer Ser Fluoresc (2012) 12: 185–212
17. Hiroko Bannai, Sabine Levi, Claude Schweizer, Maxime Dahan, & Antoine Triller.
Imaging the lateral diffusion of membrane molecules with quantum dots. Nature
protocols, 2006, VOL.1 NO.6, 2628-2634
18. Marie-Virginie Ehrensperger, Cyril Hanus, Christian Vannier, Antoine Triller, and
Maxime Dahan. Multiple Association States between Glycine Receptors and Gephyrin
Identified by SPT Analysis. Biophysical Journal, 2007, 92: 3706–3718
19. V. Cherezov, J. Liu, M. A. Hanson, M. T. Griffith and R. C. Stevens. (2008) LCPFRAP assay for pre-screening membrane proteins for in meso crystallization. Cryst
Growth Des (2008) 8: 4307-4315
76
20.
J.S.
Joseph,
W.
Liu,
J.
Kunken,
T.M.
Weiss,
H.
Tsuruta,
V.
Cherezov (2011) Characterization of lipid matrices for membrane protein crystallization
by high-throughput small angle X-ray scattering Methods (2011) 55: 342-349
21. Nollert P., Qui H., Caffrey M., Rosenbusch J. P., Landau E. M. (2001) Molecular
mechanism for the crystallization of bacteriorhodopsin in lipidic cubic phases. FEBS
Letters (2001) 504, 179-186
22. V. Cherezov, J. Clogston, M. Z. Papiz and M. Caffrey (2006) Room to move:
crystallizing
membrane
proteins
in
swollen
lipidic
mesophases. J
Mol
Biol,
(2006) 357: 1605-18
23. Marc Q. Mazzuca, Raouf A. Khalil. Vascular endothelin receptor type B: Structure,
function and dysregulation in vascular disease. Biochemical Pharmacology (2012) 84:
147-162
24. M. Caffrey and V. Cherezov (2009) Crystallizing membrane proteins using lipidic
mesophases Nat Protoc (2009) 4: 706-731
77