эффекты стероидов проявляются быстрее и могут быть следствием взаимодействия

Казанский медицинский журнал, 2009 г., том 90, № 4
УДК 577.175.535+577.152.27]—02:591.175:599.323.4
ВОЗДЕЙСТВИЕ ГИДРОКОРТИЗОНА, АТФ И АДЕНОЗИНА
НА СКЕЛЕТНУЮ МЫШЦУ КРЫСЫ
Рафис Рустэмович Камалиев1, Сергей Николаевич Гришин2, Жалал Юсеф Фалу1,
Айрат Усманович Зиганшин1
Кафедра фармакологии фармацевтического факультета с курсами фармакогнозии и ботаники
(зав. — проф. А.У. Зиганшин) Казанского государственного медицинского университета,
2
кафедра физиологии человека и животных биолого-почвенного факультета
(зав. — проф. И.Н. Плещинский) Казанского государственного университета
1
Реферат
В экспериментах in vitro установлено, что гидрокортизон, АТФ и аденозин угнетают сокращения камбаловидной мышцы крысы. PPADS, антагонист P2-рецепторов, не изменял эффект АТФ, а 8-SPT, антагонист
P1-рецепторов, угнетал действие аденозина. Совместное
действие гидрокортизона с аденозином приводило к
еще большему угнетению сокращений мышцы, тогда
как сочетание АТФ и гидрокортизона не усугубляло
угнетающего эффекта каждого из них в отдельности. Высказано предположение о возможном сходном
механизме угнетающего действия гидрокортизона и
АТФ на сокращения скелетной мышцы.
Ключевые слова: скелетная мышца, гидрокортизон, АТФ, аденозин, P2-рецепторы, P1-рецепторы.
Р2-рецепторы широко распространены
в тканях животных и человека, где они
влияют на различные биологические функции, активируя лиганд-оперирующие
ионные каналы (P2X-рецепторы), или
посредством G-белков (P2Y-рецепторы) [3].
Агонистами этих рецепторов являются
АТФ, АДФ, некоторые другие пуриновые
и пиримидиновые нуклеотиды и их производные. В скелетных мышцах было установлено наличие нескольких подтипов
P2-рецепторов [2]. В отличие от гладких
мышц, в скелетных мышцах агонисты
и антагонисты P2-рецепторов не вызывают сокращения или расслабления сами
по себе. Однако установлено, что стимуляция P2-рецепторов может изменять эффективность нервно-мышечной передачи,
угнетая [9] или усиливая [13] выброс медиатора в нервно-мышечном синапсе.
Известно, что стероидные гормоны
оказывают свои эффекты не только в результате взаимодействия с цитоплазматическими рецепторами и запуская геномный механизм синтеза белков, но и
посредством некоторых так называемых
негеномных механизмов [16]. Негеномные
556
эффекты стероидов проявляются быстрее
и могут быть следствием взаимодействия
их с липидами, белками и рецепторами,
находящимися на мембране клетки [19].
Ранее было установлено, что в нервномышечном синапсе лягушки быстрый
(негеномный) эффект гидрокортизона
приводил к усилению, а длительное влияние — к угнетению токов концевой пластинки. Кроме того, констатировано, что
гидрокортизон угнетает влияние АТФ на
выброс медиатора [1].
Целью данной работы было изучение
влияния гидрокортизона, АТФ и аденозина на сократительную активность изолированной скелетной мышцы крысы, а
также особенности их взаимоотношений.
Эксперименты проводились на белых
подопытных крысах-самцах массой 140—
180 г. Для наркоза животным вводили
внутрибрюшинно этаминал натрия в дозе
40 мг/кг и выделяли камбаловидную мышцу (m. soleus) на обеих задних конечностях. Мышцы фиксировали вертикально,
присоединяя один конец к датчику механической активности, и погружали в термостатируемые ванночки объемом 10 мл,
заполненные раствором Кребса следующего состава (в мМ): NaCl (118.0), KCl (4.75),
CaCl2(2.5), NaHCO3 (24.8), KH2PO4 (1.18),
MgSO4•7H2O (1.18), глюкоза (11), рН7,4,
t=37±0,5o C.
Сократительные ответы мышц вызывали электрическими прямоугольными импульсами частотой 0,1 Гц, длительностью
0,5 мс и напряжением 10 В в течение 30 с.
Раздражение мышц электрическим полем производили стимулятором Digitimer
MultiStim D330 (Великобритания) при помощи двух платиновых колец диаметром
2,5 мм, расположенных на расстоянии
15 мм друг от друга, через которые была
Казанский медицинский журнал, 2009 г., том 90, № 4
пропущена мышца. Ответы регистрировали изометрически с помощью датчика
механической активности Linton FSG-01
(Великобритания), фиксировались аналогово-цифровым преобразователем Biopack
(Великобритания) MP100WSW и сохранялись на персональном компьютере. Средняя величина амплитуд сокращений, записанных в течение 30 с (4 сокращения),
обрабатывалась как одно измерение. Сократительные ответы рассчитывались в %
относительно контрольной стимуляции в
начале эксперимента.
Через 10 минут после фиксирования
ткани проводили дважды с интервалом в
5 минут контрольную стимуляцию мышц
и, удостоверившись в стабильности сократительных ответов, начинали экспериментальные процедуры. В стаканчик
с раствором Кребса добавляли один из
агентов и оценивали сократительные ответы мышцы через 1 минуту (в случае АТФ,
аденозина и α,β-me-АТФ) или через 10
минут (в случае гидрокортизона). Далее,
в одной серии экспериментов оценивали
влияние антагонистов — пиридоксальфосфат-6-азофенил-2’,4’-дисульфоновой кислоты (PPADS) или 8-(п-сульфо)-фенилтеофиллина (8-SPT) — на эффекты АТФ или
аденозина, а в другой серии оценивали
эффект совместного действия этих агонистов с гидрокортизоном.
Статистическую обработку производили с использованием критерия Краскела—Уоллиса. Уровень значимости < 0,05
принимался за достоверный. Данные
представлены в виде среднего арифметического ± стандартная ошибка среднего
(n), где n — количество тестированных
мышечных препаратов.
АТФ (100 µM) угнетал вызванные
электрической стимуляцией сокращения
мышцы до 66,9±7,6% (n=11, р<0,05) по отношению к контрольной стимуляции
(n=9, рис. 1). Предварительная инкубация
мышцы с антагонистом P2-рецепторов
PPADS (10 µM) достоверно не изменяла
угнетающего эффекта АТФ (64,6±7,4%;
n=7).
Аденозин, как и АТФ, снижал амплитуду вызванных стимуляцией электрическим полем сокращений скелетной
мышцы до 64,9±7,5% (n=4, р<0,05). Антагонист P1-рецепторов, 8-SPT, предупреждал
эффект аденозина, и амплитуда сокраще-
АТФ
PPADS+АТФ
аденозин
8-SPT+аденозин
a,b-me-АТФ
Рис. 1. Влияние АТФ, аденозина и α,β-me-АТФ на
сократительные ответы m. soleus, вызванные стимуляцией электрическим полем до и после инкубации
с PPADS, 8-SPT.
ний при этом составила 83,3±7,4% (n=3),
что достоверно не отличалось от контрольных ответов (рис. 1). Энзиматически
устойчивый аналог АТФ, α,β-me-АТФ
(10 µM) не вызывал достоверного угнетения сократительной активности мышцы.
Инкубация мышечных тканей с гидрокортизоном (10 µM) привела к снижению амплитуды их сокращений до
65,6±4,6% (n=5), что отличалось (р<0,05)
от контрольных цифр (рис. 2). При совместном влиянии АТФ и гидрокортизона происходило угнетение сократимости
до 71,3±5,3% (n=5; р<0,05), которое, однако, достоверно не отличалось от влияния
каждого из этих агентов в отдельности.
Совместное действие гидрокортизона и
аденозина приводило к еще большему
угнетению сокращений (31,7±18,2%; n=4),
что достоверно отличалось как от действия только самого аденозина, так и от самостоятельного влияния гидрокортизона
(рис. 2).
гидрокортизон
гидрокортизон+АТФ
гидрокортизон+аденозин
Рис. 2. Влияние гидрокортизона на сократительные
ответы m. soleus и на угнетающее влияние АТФ и аденозина.
Внеклеточное действие АТФ на скелетные мышцы было обнаружено более
35 лет назад [7]. Известно, что АТФ выделяется из нервных окончаний при сокра557
Казанский медицинский журнал, 2009 г., том 90, № 4
щении мышц лягушки [5] и диафрагмы
крысы [18]. Установлено, что в нервномышечных окончаниях лягушки АТФ
угнетает выброс медиатора, действуя на
P2Y рецепторы [15]. В нервно-мышечных
окончаниях крысы β,γ-imido-ATP, устойчивый аналог АТФ, увеличивает выброс ацетилхолина, предположительно действуя
на пресинаптические P2-рецепторы [13].
Нами установлено, что АТФ угнетает
сократительную активность камбаловидной мышцы крысы, которая относится
к так называемым медленным мышцам.
Количество Ca2+ в саркоплазматическом
ретикулуме медленных мышц больше,
чем в быстрых скелетных мышцах [8].
Механизм угнетающего действия АТФ
может быть связан со снижением выброса Ca2+ из саркоплазматического ретикулума, как было ранее показано для АДФ
в медленных волокнах m. soleus крысы
[12]. Интересно отметить, что PPADS, антагонист P2-рецепторов, не блокирует угнетающий эффект АТФ. Этот антагонист
считается неселективным, поскольку он
способен угнетать как Р2Х- [6], так и Р2Yрецепторы [3]. Однако в тех относительно малых концентрациях, которые мы
использовали в наших экспериментах,
PPADS проявляет определенную селективность, угнетая Р2Х [21] и не влияя на
P2Y-рецепторы [20]. Таким образом, можно предположить, что АТФ оказывает
угнетающий эффект на сокращения скелетной мышцы, влияя на P2Y-рецепторы.
Ранее было показано участие пресинаптических P2Y-рецепторов в ингибирующем влиянии АТФ на нервно-мышечную
передачу в портняжной мышце лягушки
[15]. Еще одним подтверждением высказанного предположения является то, что
α,β-me-АТФ, действующий преимущественно на P2X-рецепторы, в наших экспериментах не оказывал никакого влияния
на сокращения скелетных мышц крысы.
Аденозин, как и АТФ, угнетал сокращения мышцы, но это действие блокировалось 8-SPT, антагонистом P1-рецепторов.
Это подтверждает ранее установленные
факты участия Р1-рецепторов в регуляции
нервно-мышечной проводимости в скелетной мускулатуре [4, 14].
Считается, что глюкокортикоиды
проявляют основные эффекты в результате связывания с цитоплазматическими
558
рецепторами с последующим влиянием
на экспрессию генов и синтез определенных белков. Однако в настоящее время
имеются многочисленные свидетельства
о наличии негеномных эффектов стероидных гормонов, реализуемых через
мембранные рецепторы [11, 17]. В наших
экспериментах инкубация камбаловидной мышцы крысы с гидрокортизоном
проводилась в течение 10 минут, что исключает геномный ответ. Установленный
нами негеномный эффект гидрокортизона на сокращения скелетных мышц
крысы был схожим с таковыми АТФ и
аденозина и угнетал сократительные ответы. К тому же сочетанное влияние АТФ
и гидрокортизона не приводило к суммированию эффекта каждого из них. Последнее позволяет предположить, что АТФ
и гидрокортизон обладают сходным механизмом изменения активности мышц.
Возможно, что обнаруженный нами механизм реализуется блокадой выброса ионов
Ca2+ в нервно-мышечном окончании, как
это было установлено в нервно-мышечном
синапсе лягушки [10].
Таким образом, мы впервые показали, что гидрокортизон угнетает сократительные ответы скелетных мышц крысы.
Механизм реализации угнетающего действия гидрокортизона на сокращения скелетной мускулатуры может быть сходен
с таковым АТФ, однако требует дальнейшего изучения.
ЛИТЕРАТУРА
1. Гиниатуллин А.Р., Гришин С.Н., Гиниатуллин Р.А.
Влияние гидрокортизона на модулирующие эффекты
пуринов в нервно-мышечном соединении // Росс. физиол. ж. — 2000. — Т. 86(10). — С. 1293—1299.
2. Bo X., Liu M., Schoepfer R., Burnstock G.
Characterization and expression of ATP P2X4 receptor
from embryonic chick skeletal muscle // Drug Dev. Res. —
2001. — Vol. 53. — P. 22—28.
3. Boyer J. L., Zohn I. E., Jacobson K. A., Harden T. K.
Differential effects of P2-purinoceptor antagonists on
phospholipase C- and adenylyl cyclase-coupled P2Ypurinoceptors // Br. J. Pharmacol. — 1994. — Vol. 113(2). —
P. 614—620.
4. Correia-de-Sa P., Timoteo M. A., Ribeiro J. A.
Presynaptic A1 inhibitory/A2A facilitatory adenosine receptor activation balance depends on motor nerve stimulation
paradigm at the rat hemidiaphragm // J. Neurophysiol. —
1996. — Vol. 76(6). — P. 3910—3919.
5. Cunha R. A., Sebastiao A. M. Adenosine and adenine
nucleotides are independently released from both the nerve
Казанский медицинский журнал, 2009 г., том 90, № 4
terminals and the muscle fibres upon electrical stimulation
of the innervated skeletal muscle of the frog // Pflugers
Arch. — 1993. — Vol. 424. — P. 503—510.
6. Evans R. J., Lewis C., Buell G. et al. Pharmacological
characterization of heterologously expressed ATP-gated
cation channels (P2x purinoceptors) // Mol. Pharmacol. —
1995. — Vol. 48(2). — P. 178—183.
7. Forrester T. An estimate of ATP release into the
venous effluent from exercising human forearm muscle //
J. Physiol. — 1972. — Vol. 224. — P. 611—628.
8. Fryer M.W., Stephenson D.G. otal and sarcoplasmic
reticulum calcium contents of skinned fibres from
rat skeletal muscle // J. Physiol. — 1996. — Vol. 493. —
P. 357—370.
9. Galkin A.V., Giniatullin R.A., Mukhtarov M.R.,
Svandova I., Grishin S.N., Vyskocil F. TP but not adenosine
inhibits nonquantal acetylcholine release at the mouse
neuromuscular junction // Eur. J. Neuroscience. — 2001. —
Vol. 13. — P. 2047—2053.
10. Grishin S., Shakirzyanova A., Giniatullin A., Afzalov R.,
Giniatullin R. Mechanisms of ATP action on motor nerve
terminals at the frog neuromuscular junction // Eur. J.
Neuroscience. — 2005. — Vol. 21 (5). — P. 1271—1279.
11. Johnson J. D., Campisi J., Sharkey C. M. Catecholamines mediate stress-induced increases in peripheral and
central inflammatory cytokines // Neuroscience. — 2005. —
Vol. 135(4). — P. 1295—1307.
12. Macdonald W.A., Stephenson D.G. Effect of ADP
on slow-twitch muscle fibres of the rat: implications for
muscle fatigue // J. Physiol. — 2006. — Vol. 573(Pt 1). —
P. 187—198.
13. Salgado A.I., Cunha R.A., Ribeiro J.A. Facilitation
by P2 receptor activation of acetylcholine release from
rat motor nerve terminals: interaction with presynaptic
nicotinic receptors // Brain Res. — 2000. — Vol. 877. —
P. 245—250.
14. Silinsky E. M. Adenosine decreases both presynaptic
calcium currents and neurotransmitter release at the mouse
neuromuscular junction // J. Physiol. — 2004. — Vol. 558
(Pt 2). — P. 389—401.
15. Sokolova E., Grishin S., Shakirzyanova A., Talantova M., Giniatullin R. Distinct receptors and different
transduction mechanisms for ATP and adenosine at the frog
motor nerve endings // Eur. J. Neuroscience. — 2003. — Vol. 18. —
P. 1254—1264.
16. Song I.H., Buttgereit F. Non-genomic glucocorticoid
effects to provide the basis for new drug developments // Mol.
Cell. Endocrinol. — 2006. — Vol. 246(1-2). — P. 142—146.
17. Sun H.W., Miao C.Y., Liu L. Rapid inhibitory effect
of glucocorticoids on airway smooth muscle contractions in
guinea pigs // Steroids. — 2006. — Vol. 71(2). — P. 154—159.
18. Vizi E. S., Nitahara K., Sato K., Sperlagh B.
Stimulation-dependent release, breakdown, and action of
endogenous ATP in mouse hemidiaphragm preparation:
possible role of ATP in neuromuscular transmission. //
J. Auton. Nerv. Syst.— 2000. — Vol. 81. — P. 278—284.
19. Watson C.S., Campbell C.H., Gametchu B. Membrane
oestrogen receptors on rat pituitary tumour cells: immunoidentification and responses to oestradiol and xenoestrogens
// Exp. Physiol. — 1999. — Vol. 84(6). — P. 1013—1022.
20. Windscheif U., Pfaff O., Ziganshin A.U. и др. The inhibitoryaction of PPADS on the relaxant responses to
adenine nucleotides orelectrical field stimulation in guineapig taenia coli and rat duodenum // Br. J. Pharmacol. —
1995. — Vol. 115. — P. 1509 — 1517.
21. Ziganshin A.U., Hoyle C.H.V. Selective antagonism by
PPADS at P2X-purinoceptors in rabbit isolated blood vessels
// Br. J. Pharmacol. — 1994. — Vol. 111. — P. 923—929.
Поступила 16.03.09.
THE EFFECT OF HYDROCORTISONE, ATP
AND ADENOSINE ON RAT SKELETAL MUSCLE
CONTRACTION
R.R. Kamaliev, S.N. Grishin, Zh.Yu. Falou, A.U. Ziganshin
Summary
In in vitro experiments it was established that
hydrocortisone, ATP and adenosine inhibit the contractions
of the rat soleus muscle. PPADS, a P2 receptor antagonist,
did not modify the effect of ATP, while 8-SPT, a P1 receptor
antagonist, inhibited the effect of adenosine. The combined
effect of hydrocortisone and adenosine resulted in further
inhibition of muscle contraction, while the combination of
ATP with hydrocortisone did not enhance the inhibitory
effect of each compound separately. Proposed was an
assumption of a possible similar mechanism of inhibitory
action of ATP and hydrocortisone on skeletal muscle
contractions.
Key words: skeletal muscle, hydrocortisone, ATP,
adenosine, P2 receptors, P1 receptors.
559