1 ОТЗЫВ официального оппонента на диссертацию

ОТЗЫВ
официального оппонента на диссертацию
ШАРОНОВОЙ Ирины Николаевны
«ЭЛЕКТРОФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ ДЕЙСТВИЯ
ЭНДОГЕННЫХ И ЭКЗОГЕННЫХ МОДУЛЯТОРОВ ИОНОТРОПНЫХ
РЕЦЕПТОРОВ В НЕЙРОНАХ ГОЛОВНОГО МОЗГА»,
представленную на соискание ученой степени доктора биологических наук по
специальности 03.03.06 - нейробиология.
Значение
ионотропных
рецепторов
нейромедиаторов
или
лиганд-
управляемых ионных каналов трудно переоценить. Они обеспечивают передачу
сигналов от нейронов к нейронам или к эффекторным клеткам. Исследование
механизмов межклеточной передачи электрических сигналов в нервной системе и
выявление свойств постсинаптических рецепторов, участвующих в этом процессе,
является
центральной
проблемой
современной
нейробиологии.
Наряду
с
нормальной функцией ионотропных рецепторов, гиперактивация или другие
нарушения их функционирования во многих случаях вызывают процессы,
участвующие в патогенезе многих неврологических и психических заболеваний.
Например, рецепторы глутамата NMDA-типа, обладая высокой проводимостью
для кальция, с одной стороны вовлечены в формирование памяти и участвуют в
когнитивных процессах, а с другой - обеспечивают запуск апоптоза и некроза при
инсультах,
черепно-мозговых
травмах
и
многих
нейродегенеративных
заболеваниях. Постсинаптические ионотропные рецепторы являются также
мишенью действия многих физиологически активных веществ и лекарственных
препаратов, используемых в неврологической практике. Эти препараты способны
модифицировать состояние канал-рецепторного комплекса посредством разных
механизмов. Выявление молекулярных механизмов действия лекарственных
препаратов необходимо для более рационального их использования при
коррекции разных форм церебральной патологии и для направленного поиска
новых лекарственных соединений. В этой связи изучение свойств ионотропных
рецепторов нейрональной мембраны и механизмов их модуляции эндогенными и
экзогенными
лигандами
является
актуальной
проблемой
современной
нейробиологии.
В настоящее время фармакологические исследования основных групп
лиганд-управляемых ионных каналов, к которым относятся рецепторы глутамата,
1
обеспечивающие передачу сигнала в возбуждающих синапсах ЦНС, рецепторы
гамма-амино-масляной кислоты (ГАМК, ГАМКА-рецепторы) тормозных связей и
возбуждающие
пуриновые
рецепторы
(P2X),
активируемые
АТФ,
широко
распространены и многообразны, так как обеспечивают основу для создания
новых лекарственных препаратов. Однако, наблюдается дефицит обобщающих
работ, в которых был бы проведен всеобъемлющий анализ единства механизмов
блокирования и модуляции активности лиганд-управляемых ионных каналов
различной природы, а также особенностей их регуляции эндогенными факторами
и фармакологически активными препаратами. Это определяет целесообразность
и необходимость проведения широкого обобщающего нейрофармакологического
исследования лиганд-управляемых ионных каналов различной молекулярной
природы, обеспечивающего сравнительный анализ механизмов их блокады и
регуляции.
На основании вышесказанного можно утверждать, что диссертационная
работа И.Н. Шароновой посвящена решению одной из актуальных проблем
современной нейробиологии. В диссертационной работе обобщены данные,
полученные лично автором и ее коллегами по лаборатории за длительный период
научной
деятельности
и
прошедшие
широкую
международную
научную
экспертизу, о чем свидетельствует большое количество публикаций (18 статей) в
рейтинговых зарубежных научных журналах.
Исходя из темы диссертации, цель и задачи представленной работы
указаны четко. Диссертант, используя метод регистрации токов от изолированных
нейронов, предполагает исследовать биофизические и фармакологические
характеристики ионотропных рецепторов глутамата, ГАМК и АТФ в нейронах ЦНС
и выявить механизмы взаимодействия с ними ряда эндогенных и экзогенных
модуляторов.
Перечень задач, которые надлежало решить диссертанту, достаточно
велик. Это потребовало большой экспериментальной работы, которая была
выполнена успешно. Достоинством диссертационной работы является также и то,
что в ней ставятся вопросы для дальнейших исследований и обнаружены
механизмы, которые, по-видимому, имеют общий характер и свойственны
различным типам лиганд-управляемых ионных каналов.
Диссертация объемом 327 страниц написана традиционно и состоит из
введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования,
результатов и их обсуждения, 4 таблиц, заключения, выводов, списка цитируемой
2
литературы. Диссертация хорошо иллюстрирована и имеет 98 комбинированных
рисунков. Список цитируемой литературы составляет 773 публикаций. Личный
вклад автора является очевидным и определяющим на всех этапах работы и
заключается
в
экспериментов
постановке
и
задач
обработке
исследования,
данных,
анализе,
участии
обобщении
в
и
проведении
изложении
результатов. Этот вывод вытекает из большого числа публикаций автора
диссертации в ведущих рецензируемых отечественных (6 статей) и зарубежных
(18 статей) журналах. Основные результаты диссертации представлены в 64
печатных работах, в числе которых 24 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.
Обзор литературы написан достаточно подробно с использованием
большого числа цитируемых источников, что отражает высокую квалификацию и
обширные знания автора диссертации. Он состоит из подразделов, каждый из
которых можно рассматривать как отдельный обзор литературы, направленный на
описание состояния научных представлений и подводящий к восприятию
определенной главы экспериментальных результатов. Такое построение вводит в
курс
проблемы
и
облегчает
восприятие
и
анализ
полученных
данных.
Рассматривая обзор литературы в целом, очевидно, что он написан в
соответствии с логикой собственных исследований, налицо знание истории и
настоящего изучаемого вопроса.
Успех современных исследований зависит от адекватности, точности и
надежности
применяемых
использованных
И.Н.
методов
Шароновой,
исследований.
отвечает
Комплекс
задачам
методов,
диссертации.
Глава
«Материалы и методы исследования» написана подобно, что обеспечивает
точное
понимание
экспериментальных
подходов.
В
качестве
объектов
исследований служили одиночные нейроны, выделенные из срезов различных
отделов мозга методом вибродиссоциации. Регистрацию интегральных токов
нейронов осуществляли методом пэтч-кламп в конфигурации «с клеткой». Для
быстрой смены растворов использовали метод быстрой аппликации. Следует
отметить, что методы вибродиссоциации нейронов и быстрой аппликации были
разработаны в лаборатории, что говорит о высоком экспериментальном уровне
проводимых в ней исследований. По мере необходимости автор диссертации для
анализа субъединичного состава рецепторов, экспрессированных в изучаемых
нейронах, привлекает современные методы молекулярной биологии, в частности,
анализ мРНК регистрируемой клетки – ПЦР анализ цитоплазмы одной клетки
(single-cell PCR analysis). Использованные в диссертационной работе методы
3
исследования являются самыми современными и полностью соответствуют
решению поставленных задач.
В разделе «Результаты» автор сначала сосредоточивает внимание на
данных, полученных при исследовании рецепторов глутамата NMDA-типа.
Автором впервые обнаружено потенцирующее действие гистамина, являющегося
нейромедиатором, на токи нейронов гиппокампа, генерируемые при активации
NMDA рецепторов. При этом показано, что гистамин взаимодействует с местом
связывания полиаминов (спермина). Эта находка представляет интерес не только
с точки зрения фармакологии рецепторов, но и с точки зрения фундаментальной
науки,
поскольку
вскрывает
новый
механизм
модуляции
возбуждающих
глутаматергических систем гистамином.
Важное открытие удалось сделать автору диссертации при исследовании
действия нейропротекторного вещества такрина на NMDA рецепторы. Впервые
было показано, что блокада возбуждающих токов нейронов такрином при быстрой
отмывке агонистов и такрина сопровождается генерацией так называемых
«хвостовых токов». Эти токи являются следствием механизма блокады, при
котором
вещество,
блокируя
канал,
предотвращает
его
закрывание
и
диссоциацию агонистов с мест связывания на рецепторе. В связи с этим такой
механизм блокады называют последовательным или образно - блокадой по
механизму «foot in the door». В дальнейшем И.Н. Шароновой при исследовании
действия
фуросемида,
антибиотика
пенициллина
и
нестероидного
противовоспалительного препарата нифлумовой кислоты на тормозные токи
ГАМКА-рецепторов удалось обнаружить, что действие этих лекарственных
препаратов
также
сопровождается
генерацией
«хвостовых
токов»,
т.е.
осуществляется по механизму последовательной блокады. С одной стороны, эти
данные вскрывают универсальность механизмов блокады лиганд-управляемых
ионных каналов различной молекулярной организации и ионной селективности, а
с другой - демонстрируют дополнительные эффекты лекарственных препаратов,
которые необходимо учитывать при их использовании в качестве терапевтических
средств.
Обобщая данные, полученные при исследовании лиганд-управляемых
ионных каналов (рецепторы глутамата NMDA- и AMPA-типов, ГАМКА-рецепторы и
P2X2-пуринорецепторы),
функциональных
модуля
автор
диссертации
фармакологических
выявляет
воздействий
три
основных
независимо
от
молекулярной организации и природы ионной проводимости каналов. Сайт
4
аллостерической модуляции NMDA-рецепторов обеспечивает потенцирование
гистамином и полиаминами и, по-видимому, блокируется ифенпродилом. Flop и
flip
сплайс-варианты
аллостерического
выявляются
AMPA-рецепторов
взаимодействия
с
циклоциазидом,
путем
анализа
который
ослабляет
десенситизацию AMPA-рецепторов. Аллостерическое взаимодействие диазепама
и абекарнила с бензодиазепиновым сайтом ГАМКА-рецепторов обеспечивает
потенцирование тормозных ответов нейронов.
Другой очевидной мишенью фармакологического воздействия является
ионные каналы. Было исследовано действие большого числа каналоблокаторов:
такрина
(NMDA-рецепторов),
IEM-1460
фуросемида,
(AMPA-рецепторы),
антибиотика пенициллина и нестероидных противовоспалительных препаратов из
группы фенаматов – (ГАМКА-рецепторов) и др.
Третьим
сайтом
фармакологического
воздействия
являются
высокоаффинные места связывания ионов меди и цинка, вызывающих в
наномолярных
концентрациях
аллостерическое
ингибирование
ГАМКА-
рецепторов. На P2X2-рецепторах цинк вызывал двунаправленную модуляцию,
полярность которой определялась использованной концентрацией.
Таким образом, в ходе выполнения работы получены и обобщены
приоритетные
блокирования
каналов.
результаты,
и
раскрывающие
аллостерической
Показана
специфичность
модуляции
экспрессии
универсальные
механизмы
лиганд-управляемых
рецепторов
ионных
определенного
субъединичного состава нейронами различных морфо-функциональных групп. По
новизне подходов, задач и полученных результатов работа соответствуют новому
направлению в изучении мембранных механизмов клеточной регуляции и
межнейрональной передачи сигнала. В целом, при чтении диссертации не
возникает сомнений, что представленные результаты оригинальны, а выводы
диссертации вполне обоснованы и полностью соответствуют полученным
результатам. Автореферат соответствует содержанию диссертации. Практическая
значимость
работы
определяется
возможностью
применения
полученных
фундаментальных результатов при разработке новых лекарственных препаратов.
Принципиальных замечаний по диссертации нет. В дискуссионном порядке
хотелось бы задать автору диссертации вопросы. В работе убедительно показано
аллостерическое
влияние
ионов
цинка
на
ГАМКА-рецепторы
и
P2X-
пуринорецепторы. Действительно, известно, что цинк накапливается в везикулах,
содержащих нейромедиатор, поэтому модуляция этим ионом постсинаптических
5
рецепторов может иметь физиологическое значение. Имеются данные, что ионы
цинка в очень низких концентрациях (субмикромолярных) также ингибируют
NMDA-рецепторы. Возникает вопрос, с каким из изученных сайтов связывания
фармакологически активных веществ может взаимодействовать цинк в NMDAрецепторах?
Кроме
того
известно,
что
накопление
протонов,
т.е.
закисление
внеклеточной среды происходит в результате метаболизма и многих других
функционально важных процессов в нервной системе. Показано, что протоны
способны ингибировать NMDA-рецепторы. Что можно сказать относительно места
связывания протонов на NMDA-рецепторах? И, наконец, может ли связывание
цинка и протонов каким-либо образом взаимодействовать с эндогенными
аллостерическими модуляторами NMDA-рецепторов, изученными диссертантом?
Возникшие вопросы ни в коей мере не умаляют достоинств диссертации.
Необходимо
подчеркнуть
общебиологическую
значимость
полученных
результатов и сделанных на их основе обобщений и выводов. Диссертация
обобщает результаты многолетних исследований автора, отражает успехи,
достигнутые коллективом лаборатории в изучении этой проблематики, и
расширяет наши представления о механизмах функционирования лигандуправляемых ионных каналов, а также существенно обогащает представления о
механизмах действия используемых в медицинской практике лекарственных
препаратов. Для выполнения поставленных задач и анализа полученных данных
автор успешно использовал современные электрофизиологические методы,
дополненные
молекулярно-биологическими
подходами.
Для
обсуждения
результатов привлечено большое количество современных литературных данных.
Работа написана изящно, логично и доступно, несмотря на сложность материала
и несовершенство существующей терминологии.
Заключение.
Диссертация
Шароновой
Ирины
Николаевны
является
научно-
квалификационной работой, в которой на основании выполненных автором
исследований разработаны теоретические положения, совокупность которых
можно квалифицировать как научное достижение, вносящие существенный вклад
в понимание принципов и закономерностей функционирования ионотропных
рецепторов центральных нейронов.
6