Avtoreferat_Lobanov_to site
advertisement
На правах рукописи ЛОБАНОВ КОНСТАНТИН ВЛАДИМИРОВИЧ РОЛЬ СЕНСОРНЫХ РНК В РЕГУЛЯЦИИ ПУРИНОВОГО МЕТАБОЛИЗМА У BACILLUS SUBTILIS 03.02.07 – Генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2011 Работа выполнена в лаборатории биохимической генетики Федерального государственного унитарного предприятия «Государственный научноисследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» (ФГУП «ГосНИИгенетика») Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор ФГУП «ГосНИИгенетика» Миронов Александр Сергеевич Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор ЗАО «АГРИ» Лившиц Виталий Аркадьевич кандидат биологических наук ФГУП «ГосНИИгенетика» Ведущая организация: Манухов Илья Владимирович Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной генетики РАН Защита диссертации состоится « 11 » октября 2011 года в 14-00 на заседании Диссертационного Совета Д.217.013.01 при ФГУП «Государственный научноисследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545, г. Москва, 1-й Дорожный проезд, д.1 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» Автореферат диссертации разослан « 6 » сентября 2011 года Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат химических наук Т.Л. Воюшина ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы Настоящая работа посвящена изучению роли сенсорных РНК в регуляции пуринового метаболизма у Bacillus subtilis. Изучение генетической регуляции пуринового метаболизма направлено на обнаружение молекулярных механизмов, открывающих новые возможности управления генетическими и метаболическими процессами организмов. Конечные продукты (AMP и GMP), а также их предшественники и производные, являются не только компонентами нуклеиновых кислот и энергетическими переносчиками, но и выполняют не менее важные функции глобальных регуляторов общего метаболизма. Традиционные способы производства пуринов основаны на их микробиологическом синтезе, который осуществляется генетически модифицированными штаммами − продуцентами. Создание нового поколения высокопродуктивных штаммов требует углубленного понимания процессов генетической регуляции пуринового метаболизма, что является одной из задач настоящего исследования. Объектом исследования избран Bacillus subtilis, микроорганизм, который традиционно служит не только моделью для выявления новых механизмов регуляции биосинтеза пуринов, но и основой для конструирования промышленных продуцентов. Пуриновый оперон B. subtilis purEKBCSQLFMNHD (далее − pur-оперон) кодирует ферменты синтеза de novo инозинмонофосфата, общего предшественника пуриновых нуклеотидов AMP и GMP. Известно, что гены пуринового метаболизма у B. subtilis подвержены множественной регуляции на уровне инициации и терминации транскрипции. В случае двух оперонов: pur-оперона и xpt-pbuX, кодирующего синтез ксантинфосфорибозилтрансферазы, показано, что их экспрессия регулируется как на уровне инициации транскрипции с участием белка-репрессора PurR, так и на уровне терминации транскрипции. На модели этих оперонов был обнаружен необычный метаболит-зависимый механизм аттенуации транскрипции: при добавлении в ростовую среду оснований гипоксантина и гуанина их транскрипция терминируется перед первыми структурными генами, тогда как в их отсутствии транскрибируется полный оперон. Как выяснилось позднее, влияние пуринов на процесс терминации транскрипции осуществляется посредством нового механизма регуляции активности генов с участием так называемых сенсорных РНК, который был впервые обнаружен в лаборатории биохимической генетики ФГУП ГосНИИгенетика на модели рибофлавинового и тиаминового оперонов у B. subtilis. Такие сенсорные РНК, расположенные в лидерной области мРНК бактериальных оперонов, получили наименование «рибопереключателей» (riboswitch), так как в результате прямого взаимодействия со специфическим метаболитом они способны модулировать экспрессию прилегающих генов, включая или выключая их экспрессию на уровне терминации транскрипции или инициации трансляции. К настоящему моменту выяснилось, что лидерные области ряда генов пуринового метаболизма у B. subtilis, включая pur-оперон, xpt-pbuX-оперон и ген pbuE, кодирующий трансмембранный белок, ответственный за транспорт пуринов из клетки, содержат 1 консервативную последовательность, получившую наименование G-бокс, которая способна выступать в качестве сенсора пуриновых оснований, а также расположенный за ней классический Rho-независимый терминатор транскрипции. В то же время, детального анализа структурно-функциональной организации лидерной области pur-оперона B. subtilis, позволяющего выяснить роль кодируемой этой областью сенсорной РНК в регуляции экспрессии pur-оперона, не проводилось. Кроме того, оставалась неясной роль внутреннего Rho-независимого терминатора транскрипции, расположенного в межгенном участке purFpurM pur-оперона, в координации синтеза предшественников пуриновых нуклеотидов. Изучение механизмов регуляции pur-оперона и других генов, вовлеченных в метаболизм пуринов, имеет и важный практический аспект, поскольку некоторые промежуточные соединения, образующиеся в процессе биосинтеза пуринов, обладают рядом чрезвычайно важных положительных качеств. В частности, 5-аминоимидазол-4карбоксамидрибофуранозид или сокращенно – AICAR (также известный как акадезин), который образуется в процессе биосинтеза пуринов de novo у B. subtilis, является активатором аденозинмонофосфат-активируемой протеинкиназы (AMPK), которая, в свою очередь, является глобальным регулятором метаболических процессов, обеспечивающих энергетический статус эукариотических организмов. В настоящее время проводится ряд клинических исследований препаратов на основе акадезина, результаты которых дают обнадеживающие положительные данные, в области борьбы с хронической лимфоцитарной лейкемией B-клеток, лечения метаболического синдрома и кардиохирургии. В связи с этим, получение высокоактивного штамма-продуцента AICAR на основе генетически модифицированных бактерий с измененной регуляцией генов пуринового метаболизма представляется весьма актуальной практической задачей для разработки процесса дешевого микробиологического синтеза AICAR. Цель и задачи исследования Целью настоящей работы являлось изучение механизма регуляции метаболизма и транспорта пуринов у В. subtilis с участием сенсорных РНК и создание на этой основе штамма-продуцента AICAR – перспективного кандидата в лекарственные препараты широкого терапевтического применения. В процессе работы были решены следующие задачи: 1. Проведение детального анализа структурно-функциональной организации лидерной области pur-оперона B. subtilis и выявление регуляторных элементов, участвующих в контроле экспрессии этого оперона. 2. Изучение структурно-функциональной организации лидерной области гена pbuE B. subtilis, кодирующего синтез трансмембранного белка, ответственного за экспорт пуриновых оснований из клетки. Выявление эффекторов, влияющих на экспрессию гена pbuE. 3. Создание штамма-продуцента, накапливающего AICAR в культуральной жидкости в концентрациях, достаточных для дальнейшего промышленного производства. 2 Научная новизна и практическая ценность работы В результате детального анализа структурно-функциональной организации лидерной области pur-оперона B. subtilis, впервые показано, что регуляция экспрессии этого оперона осуществляется с помощью сенсорной РНК в результате ее связывания со специфическими метаболитами-эффекторами гуанином и гипоксантином. Впервые показано, что уровень экспрессии четырех дистальных генов pur-оперона (purMNHD) подавляется более чем в 2 раза в результате действия Rho-независимого терминатора транскрипции расположенного в межгенном участке purF-purM. На основании мутационного анализа лидерной области гена pbuE B. subtilis, впервые показано, что присутствие в консервативной области лидера (А-бокс) двух нуклеотидных замен 70U→С и A100→G приводит к изменению специфичности сенсорной РНК in vivo: вместо аденина позитивным эффектором транскрипции становится гуанин. Методом сайт-направленного мутагенеза получена коллекция мутантных вариантов лидерной области pur-оперона B. subtilis и лидерной области гена pbuE B. subtilis с нуклеотидными заменами в участках лидерной мРНК, которые влияют на формирование вторичной структуры или на связывание мРНК с эффектором. Коллекция может быть использована для дальнейших исследований в этой области, а также для конструирования высокоактивных штаммов-продуцентов. Сконструирован высокоактивный штамм-продуцент, накапливающий 11-13 г/л AICAR в культуральной жидкости. Полученный штамм может послужить основой для промышленного микробиологического синтеза AICAR – перспективного кандидата в лекарственные препараты широкого терапевтического применения. Апробация работы Материалы диссертации докладывались на международной конференции «Молекулярная генетика, биофизика и медицина сегодня» (Бреслеровские чтения II), (Санкт-Петербург, 7–8 ноября 2006 г.), Международной школе-конференции по генетике микроорганизмов и биотехнологии, посвященной 40-летию создания ГосНИИгенетика (Москва-Пущино, 20 –24 октября 2008 г), Пятом съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 21– 27 июня 2009 г.). Диссертационная работа была апробирована на семинаре секции «Генетика микроорганизмов» Учёного Совета ФГУП «ГосНИИгенетика» 23 мая 2011 года. Публикации По теме диссертации опубликовано пять печатных работ, из них три печатные работы в журналах, входящих в список, рекомендованный ВАК. Структура работы Диссертация изложена на 125 страницах печатного текста, включая 32 рисунка и 5 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения и обсуждения экспериментальных данных, выводов и списка цитируемой литературы ( 246 наименований). 3 СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Изучение регуляторных элементов, контролирующих экспрессию пуринового оперона Bacillus subtilis Схема структурной организации pur-оперона и его регуляции представлена на рис. 1. Данный раздел посвящен мутационному анализу лидерной области pur-оперона B. subtilis и выяснению роли пуриновых оснований в регуляции экспрессии оперона in vivo и in vitro с участием белка-репрессора PurR и терминатора транскрипции, расположенного в лидерной области оперона. А так же изучению влияния внутреннего Rho-независимого терминатора транскрипции, находящегося в межгенном участке purF-purM, на экспрессию дистальных генов pur-оперона. Рисунок 1. Схема структурной организации pur-оперона и его регуляции. В верхней части рисунка показано относительное расположение 12 сцепленных структурных генов, образующих pur-оперон и не сцепленный с ними ген purR, кодирующий белок-репрессор purоперона. В нижней части рисунка представлена лидерная область pur-оперона с указанием сайтов связывания белка-репрессора PurR, сайта связывания РНК-полимеразы ( -35 – - 10), старта транскрипции (+1), терминатора транскрипции (в виде шпилечной структуры) и сайта связывания рибосом (SD). 1.1. Клонирование лидерной области pur-оперона и ее компьютерный анализ С использованием специфических праймеров, фланкирующих лидерную область purоперона, проведена ПЦР амплификация соответствующего фрагмента хромосомы B. subtilis. Полученный фрагмент, содержащий лидерную область pur-оперона, был клонирован с использованием рестриктаз EcoRI и BamHI в полилинкерную последовательность вектора pDG268. Секвенирование клонированного фрагмента pur-оперона подтвердило его интактность. На рис. 2 представлена нуклеотидная последовательность мРНК, кодируемая лидерной областью гена pur-оперона. Рисунок 2. Сравнение нуклеотидной последовательности лидерных областей мРНК генов xpt и purE B. subtilis. Выделены три потенциальные шпилечные структуры (P1/P1’, P2/P2’ и P3/P3’). Гомологичные основания подчеркнуты. Жирным шрифтом выделены основания, в которых были получены 4 мутации, а соответствующие нуклеотидные замены указаны стрелками. Нумерация нуклеотидов приведена начиная со стартов транскрипции генов xpt и purE. Сравнение нуклеотидной последовательности лидерной области pur-оперона c последовательностями лидерных областей xpt-pbuX-оперона B. subtilis (рис. 2) выявляет высокий уровень гомологии, особенно в районе так называемого G-бокса (нуклеотиды от +15 до +90, консервативные нуклеотиды подчеркнуты). Более того, лидерная область содержит три пары антипараллельных последовательностей, которые способны формировать потенциальные шпилечные структуры: P1/P1’, P2/P2’ и P3/P3’. Расположение этих потенциальных шпилек практически полностью совпадает с таковым в лидерных областях xpt-pbuX-оперона B. subtilis. Потенциальные вторичные структуры мРНК, формирующиеся в процессе транскрипции, могут быть смоделированы с помощью алгоритма Цукера-Тернера, который основан на минимизации свободной энергии в процессе фолдинга РНК. Модель двух наиболее вероятных альтернативных вторичных структур лидерной мРНК pur-оперона представлена на рис. 3. Рисунок 3. Модель вторичной структуры лидерной области pur-оперона B. subtilis (G-бокс). Основания, в которых были получены мутации выделены рамками, а соответствующие нуклеотидные замены указаны стрелками. Три потенциальные шпилечные структуры указаны как P1/P1’, P2/P2’ и P3/P3’. Серым цветом выделены области, взаимодействие которых приводит к образованию альтернативной структуры – антитерминатора транскрипции. Штрихпунктирной рамкой выделена область с 44 по 54 нуклеотид. Одна из конфигураций (по аналогии с xpt-pbuX-опероном – в присутствии пуриновых оснований) может формироваться за счет комплементарного взаимодействия последовательностей P1 и P1’ и последовательностей T и T’, образующих терминатор транскрипции (рис. 3). Образование альтернативной конфигурации (в отсутствие пуринов) может происходить за счет формирования шпильки P1’:T (соответствующие комплементарные нуклеотиды выделены серым цветом на рис. 3). В соответствии с моделью, представленной на рис. 3, формирование антитерминатора (шпилька P1’:T) приводит к разрушению терминирующей шпильки T:T’ и обеспечивает сквозную транскрипцию purоперона. Для проверки модели регуляции pur-оперона, приведенной на рис. 3 и основанной на изменении конформации сенсорной РНК, проведен сайт-направленный мутагенез лидерной области pur-оперона. 5 1.2. Сайт-направленный мутагенез лидерной области pur-оперона. Сайт-направленный мутагенез проводили методом ПЦР с использованием специфических праймеров, содержащих нуклеотидные замены в участках лидерной РНК, которые предположительно влияют на формирование ее вторичной структуры или на связывание сенсорной РНК с эффекторами. Расположение всех полученных мутаций в лидерной области pur-оперона показано на рис. 2 и 3. Как показано на этих рисунках, мутанты AM612-M1 (A44→G), AM612-М2 (T47→C), AM612-М3 (T48→C), AM612-M4 (T51→C) и AM612-M5 (C53→T) содержат нуклеотидные замены в области лидера, расположенной между шпильками Р2/P2’ и Р3/P3’, а мутант AM612-M6 (С76→T) – между шпильками Р3/P3’ и Р1/P1’. Кроме того, получен делеционный мутант AM612-M7 ∆(44-54), который содержит делецию всего спейсерного участка между шпильками Р2/P2’ и Р3/P3’, а также мутант AM612-М8, содержащий три нуклеотидные замены (T22→G, A23→T, A24→C), которые увеличивают область спаривания в шпильке Р1/P1’ (рис. 3). Все полученные мутации клонированы в составе экспрессионного вектора pDG268 с целью последующего изучения эффекта этих мутаций на уровень экспрессии purE. 1.3. Изучение экспрессии транскрипционных фьюзов purE-lacZ в клетках B. subtilis. Для изучения механизма регуляции pur-оперона были проведены эксперименты по определению активности β-галактозидазы у штаммов B. subtilis, содержащих интегрированные в хромосому транскрипционные фьюзы purE-lacZ. Прежде всего, мы сравнили экспрессию pur-оперона в штамме пуринового ауксотрофа Mu8u5u6 (purF), содержащего регуляторный локус purR дикого типа, и изогенного штамма АМ521 с нарушенным синтезом репрессора PurR (purF purR::neo) в различных физиологических условиях: в присутствии экзогенных пуриновых оснований гуанина, гипоксантина и аденина и в их отсутствии. Результаты этих опытов представлены на диаграммах рис. 4. Рисунок 4. Сравнение экспрессии транскрипционных фьюзов purE-lacZ в штаммах B. subtilis purF и purF purR::neo. Аббревеатура: Hyp – гипоксантин, G – гуанин, A – аденин. Как следует из данных диаграмм, экспрессия фьюза purE-lacZ в штамме purF характеризуется чувствительностью к добавлению всех трех пуриновых оснований, тогда как в клетках штамма purF purR::neo аденин не оказывает подавляющего действия на экспрессию pur-оперона. Из этого следует, что аденин является эффектором регуляции, 6 которая осуществляется белком-репрессором PurR на уровне инициации транскрипции, тогда как действие гуанина и гипоксантина реализуется скорее всего на уровне терминации транскрипции. Поэтому в дальнейшей работе мы использовали штамм purF purR::neo. На рис. 5 представлены результаты определения активности β-галактозидазы у штамма purF purR::neo, содержащего в составе хромосомы транскрипционные фьюзы лидера purE дикого типа и его мутантные варианты, описанные в предыдущем разделе. Рисунок 5. Влияние пуриновых оснований на экспрессию лидерной области pur-оперона дикого типа и его мутантных вариантов. Условные обозначения: M1 – AM612-М1 (А44→G); M2 – AM612-М2 (T47→C); M3 – AM612M3 (T48→C); M4 – AM612-М4 (T51→C); M5 – AM612-M5 (C53→T); М6 – AM612-M6, (С76→T); М7 – AM612-M7, ∆(44-54); M8 – AM612-M8, (T22→G, A23→T, A24→C). Как следует из рис. 5, по фенотипическому проявлению мутанты, содержащие замены в области лидера, расположенной между шпильками Р2/P2’ и Р3/P3’ могут быть разделены на два класса. У мутантов первого класса AM612-М1 (А44→G), AM612-M3 (T48→C) и AM612-M5 (C53→T), наблюдается некоторое снижение базального уровня экспрессии реперного гена lacZ по сравнению с транскрипционным фьюзом, содержащим лидерную область дикого типа, причем добавление пуриновых оснований приводит к заметному снижению уровня экспрессии β-галактозидазы у мутантов, хотя и в меньшей степени, чем у контрольного варианта дикого типа. Мутанты второго класса AM612-М2 (T47→C) и AM612-М4 (T51→C) также обнаруживают небольшое снижение базального уровня экспрессии β-галактозидазы, однако, в отличие от мутантов первого класса, этот уровень практически не снижается при добавлении пуриновых оснований. Эти данные указывают на важную роль спейсерной области между шпильками Р2/P2’ и Р3/P3’ в узнавании и связывании пуриновых оснований, которые служат негативными эффекторами регуляции pur-оперона. С этим согласуется поведение мутанта AM612-М7, содержащего делецию всей спейсерной области между шпильками Р2/P2’ и Р3/P3’, который обнаруживает полностью дерепрессированный уровень экспрессии pur-оперона (рис. 5). Любопытно, что к такому же эффекту полной нечувствительности к негативному действию пуриновых оснований приводит нуклеотидная замена С76→T в спейсерной области между шпильками Р3/P3’ и Р1/P1’, содержащаяся в мутанте AM612-М6, что свидетельствует о ключевой роли цитозина в положении 76 в узнавании пуриновых 7 эффекторов. В то же время, мутант AM612-М8, содержащий нуклеотидные замены, которые увеличивают область спаривания в шпильке Р1/P1’, напротив, характеризуется резким снижением активности по сравнению с диким типом, причем и в этом случае экзогенные основания практически перестают оказывать репрессирующее действие на экспрессию purоперона. На основании данных рис. 5 можно заключить, что негативное действие эффекторов – гуанина и гипоксантина – реализуется за счет их взаимодействия с участками лидера, расположенными между шпильками Р1/P1’-Р2/P2’, Р2/P2’-Р3/P3’ и Р3/P3’-Р1/P1’. Для проверки этого предположения были поставлены эксперименты in vitro. 1.4. Опыты in vitro по идентификации эффекторов сенсорной РНК pur-оперона. Согласно модели рибопереключателей, низкомолекулярные эффекторы – пуриновые основания должны непосредственно связываться с лидерной РНК в процессе ее транскрипции и обусловливать терминацию путем стабилизации структуры G-бокса в конформации анти-антитерминатора. В отсутствие эффектора-пурина будет формироваться структура антитерминатора и терминация должна супрессироваться. Для проверки этого механизма была реконструирована система аттенюации транскрипции in vitro, в состав которой входит препарат холофермента РНК-полимеразы E. coli и полученные с помощью ПЦР матрицы purE-лидерной области, включающие интактный промотор. После формирования инициирующего комплекса, содержащего [32P] меченую по 3’-концу лидерную РНК, проводилась достройка РНК до конца матрицы в присутствии или отсутствии аденина, гуанина и гипоксантина. Изменения в эффективности терминации в ответ на добавление каждого из пуринов оценивались с помощью гель электрофореза путем расчета соотношения между полноразмерными и укороченными транскриптами Серия матриц, содержащих мутации, охарактеризованные in vivo в предыдущем разделе, также была проверена в аналогичных in vitro экспериментах (рис. 6). Рисунок 6. Эффект пуриновых оснований на транскрипцию лидерной области pur-оперона Условные обозначения матриц: wt – АМ612, дикий тип; М2 – AM612-M2, (T47→C); М4 – AM612M4, (T51→C); М6 – AM612-M6, (С76→T); М7 – AM612-M7, ∆(44-54); M8 – AM612-M8, (T22→G, A23→T, A24→C). Как следует из электрофореграмм, представленных на рис. 6, при использовании в качестве матрицы лидерной ДНК дикого типа примерно 16% purE РНК терминирует на терминаторе в отсутствии эффекторов. Добавление аденина никак не сказывается на 8 распределении транскриптов, тогда как в присутствии высоких концентраций гипоксантина (100 мкМ) терминируется примерно 50% РНК, а гуанина – до 60% даже при низкой концентрации (1 мкМ) этого основания. В соответствии с данными, полученными in vivo, мутантные варианты матриц (М2, М4, М6 и М7) характеризуются сниженным уровнем терминации независимо от присутствия или отсутствия гуанина. Что касается мутантной матрицы М8, то для нее характерно существенное увеличение уровня терминации (до 50%), которое наблюдается в случае матрицы дикого типа при добавлении в транскрипционную смесь гипоксантина или гуанина. Таким образом, результаты экспериментов in vitro свидетельствуют о том, что пуриновые основания гуанин и, в меньшей степени, гипоксантин напрямую связываются с лидерной РНК pur-оперона и способствуют более эффективной терминации транскрипции. 1.5. Синергидный эффект мутации в регуляторном локусе purR и делеции терминатора транскрипции в лидерной области на экспрессию pur-оперона. Для того чтобы оценить относительный вклад негативной регуляции под контролем белка-репрессора PurR, действующей на уровне инициации транскрипции, и регуляции с участием сенсоной РНК на уровне терминации транскрипции, была сконструирована серия изогенных штаммов B. subtilis, содержащих транскрипционные фьюзы в гене purH: в геноме штамма дикого типа (штамм AM733), на фоне инсерции purR::neo (АМ754), делеции терминатора транскрипции purE ∆TL (АМ747) и у штамма АМ769, сочетающего комбинацию этих мутаций. У полученных штаммов определяли активность β-галактозидазы при выращивании бактерий в условиях экспоненциального роста культур (Таблица 1). Таблица 1. Активность β-галактозидазы в экстрактах штаммов B. subtilis Штамм Генотип AM733 АМ747 АМ754 АМ769 purH::(pMutin2purH’-lacZ) purH::(pMutin2purH’-lacZ) ∆TL purH::(pMutin2purH’-lacZ) purR::neo purH::(pMutin2purH’-lacZ) ∆TL purR::neo Активность β-галактозидазы 15±2 135±10 260±18 3200±130 Уровень дерепрессии 1 9 17 210 Как следует из данных табл.1, на фоне делеции терминаторной шпильки лидерной области pur-оперона наблюдается 9-кратное увеличение активности β-галактозидазы у штамма АМ747, содержащего гибридный оперон purH’-lacZ. При внесении инсерции purR::neo, блокирующей синтез белка-репрессора PurR экспрессия реперного гена увеличивается в 17 раз по сравнению со штаммом дикого типа АМ733. Интересно отметить, что на фоне обеих мутаций наблюдается ярко выраженный синергидный эффект: уровень экспрессии гибридного оперона purH’-lacZ увеличивается драматически (в 210 раз), что существенно превышает сумму эффектов этих мутаций в отдельности. Таким образом, максимальный уровень дерепрессии pur-оперона обеспечивается только при одновременном устранении негативной регуляции под действием белка PurR и удалении терминатора транскрипции в лидерной области оперона. 9 1.6. Изучение влияния внутреннего Rho-независимого терминатора транскрипции на экспрессию дистальных генов pur-оперона. Анализ нуклеотидной последовательности генов pur-оперона позволяет выявить наличие потенциального Rho-независимого терминатора транскрипции, локализованного между генами purF и purM (TF-M) (рис. 1), однако какие-либо данные о функциональной значимости этого терминатора транскрипции в литературе отсутствуют. Поэтому мы предприняли получение прецезионной делеции (∆TF-M) полностью удаляющей терминатор транскрипции в межгенном участке purF-purM pur-оперона в составе хромосомы штамма B. subilis Mu8u5u6. Для изучения влияния делеции ∆TF-M на экспрессию дистальных генов purоперона были сконструированы транскрипционные фьюзы последнего гена purD с реперным геном lacZ. Аналогичным образом была сконструирована изогенная пара штаммов, содержащая описанную выше делецию ∆TL в лидерной области pur-оперона. У полученных изогенных штаммов определяли активность β-галактозидазы на различных стадиях роста бактериальных культур (Таблица 2). Таблица 2. Активность β-галактозидазы в бесклеточных экстрактах штаммов, содержащих транскрипционные фьюзы purD-lacZ. Генотип Дикий тип ∆T F-M ∆TL ∆TL ∆T F-M Активность β-галактозидазы* 2.5 ч 6ч 24 ч 160±15 (1) 254±28 (1) 73±10 (1) 220±20 (1.4) 516±60 (2) 224±25 (3) 1596±120 (1) 1890±130 (1) 1202±120 (1) 2289±160 (1.4) 3246±200 (1.7) 2925±200 (2.4) *В скобках приведена кратность увеличения активности фермента у штаммов, содержащих делецию ∆T F-M относительно штаммов дикого типа. Как следует из данных, представленных в таблице 2, удаление терминатора транскрипции TF-M приводит к одинаковому примерно 1,5-кратному усилению экспрессии дистального гена purD у бактерий, находящихся в логарифмической стадии роста как у штамма, содержащего лидерную область pur-оперона дикого типа, так и у штамма с делецией ∆TL. На стационарной стадии роста позитивный эффект удаления терминатора ∆T на экспрессию дистального гена purD проявляется еще сильней, что выражается в 2,5-3-х кратном повышении уровня активности β-галактозидазы у соответствующих штаммов (Табл. 2). F-M 2. Особенности структурно-функциональной организации лидерной области гена pbuE Bacillus subtilis и его регуляции. Ген pbuE B. subtilis кодирует синтез трансмембранного белка, ответственного за транспорт из клетки пуриновых оснований и локализуется на 53.50o хромосомной карты. Первоначально было показано, что экспрессия гена pbuE возрастает при добавлении в среду пуриновых оснований, в частности, гуанина и гипоксантина, однако механизм этой регуляции оставался неясным. 10 Сравнение нуклеотидной последовательности лидерной мРНК генов xpt и pbuE обнаруживает большую гомологию (рис. 7), особенно в участках, расположенных между шпильками и выявляет возможность формирования трех потенциальных шпилечных структур (P1/P1’, P2/P2’ и P3/P3’) – рис. 8. Рисунок 7. Сравнение нуклеотидной последовательности лидерных областей мРНК генов xpt и pbuE B. subtilis. Выделены три потенциальные шпилечные структуры (P1/P1’, P2/P2’ и P3/P3’). Гомологичные основания подчеркнуты. Жирным шрифтом выделены основания, в которых были получены мутации, а соответствующие нуклеотидные замены указаны стрелками. Нумерация нуклеотидов приведена, начиная со стартов транскрипции генов xpt и pbuE. Рисунок 8. Модель вторичной структуры А-бокса гена pbuE B. subtilis. А. Конфигурация А-бокса в присутствии эффектора – аденина. Терминирующая шпилька разрушена, происходит сквозная транскрипция структурного гена pbuE. Б. Формирование терминирующей шпильки в А-боксе в отсутствии аденина. Транскрипция структурного гена pbuE заблокирована. Рамками выделены основания, в которых были получены мутации. Более того, выяснилось, что лидерная мРНК гена pbuE также выполняет сенсорную функцию, но, в отличие от G-бокса гена xpt , эффектором этой мРНК служит не гуанин или 11 гипоксантин, а аденин, поэтому аптамерный участок лидерной мРНК гена pbuE получил наименование А-бокса. Другая интересная особенность А-бокса состоит в том, что в присутствии аденина наблюдается не репрессия, а активация транскрипции гена pbuE. Таким образом, если в случае гена xpt добавление экзогенных гуанина и гипоксантина стабилизирует терминирующую шпильку, то в случае гена pbuE присутствие аденина приводит к такому изменению конформации лидерной области, при которой структура терминатора транскрипции разрушается и обеспечивается сквозная транскрипция структурной части гена. Любопытно, что в областях лидерной мРНК, расположенных между шпильками, нуклеотидные последовательности гуанин-регулируемой xpt мРНК и аденинрегулируемой pbuE мРНК обнаруживаются всего три различия. Примечательно, что одна из замен расположена между шпильками P3/P3’ и P1/P1’: это основание 75С в гуанинрегулируемой xpt мРНК (G-бокс) и основание 70U в аденин-регулируемой мРНК гена pbuE (А-бокс) – рис. 8. Было высказано предположение, что именно это различие определяет специфичность связывания соответствующих аптамеров с метаболитами-эффекторами, так как гуанин и гипоксантин может спариваться с основанием 75С в G-боксе, тогда как аденин – с основанием 70U в А-боксе в результате классического Уотсон-Криковского взаимодействия. Это предположение подтверждается данными in vitro, согласно которым, константа связывания аденина с мутантным А-боксом резко снижается, а гуанина, напротив, повышается, а также результатами опубликованного рентгеноструктурного анализа трехмерной структуры А-бокса гена pbuE B. subtilis. Однако, на фенотипическом уровне изменение специфичности А-бокса не проявлялось: введение нуклеотидной замены 70U→С в А-бокс приводило к конститутивной, не регулируемой пуринами экспрессии гена pbuE. Таким образом, механизм функционирования А-бокса in vivo, в частности, вопрос о корреляции между его сенсорными свойствами и способностью модулировать экспрессию гена pbuE, требует дальнейших исследований. Настоящий раздел посвящен мутационному анализу лидерной области гена pbuE B. subtilis с целью выяснения роли отдельных нуклеотидов в определении специфичности сенсорной мРНК гена pbuE в отношении связывания эффекторов - пуриновых оснований, а также изучения влияния полученных мутаций на экспрессию гена pbuE. 2.1. Определение старта транскрипции гена pbuE Прежде чем приступить к мутационному анализу лидерной области гена pbuE, необходимо было более точно определить старт транскрипции, так как по литературным его локализация установлена лишь приблизительно. Локализацию сайта инициации транскрипции определяли методом «достройки праймера». Как следует из рис. 9, транскрипция гена pbuE инициируется с нуклеотида А в положении +1 , а не с нуклеотида А в положении +8 (рис. 7), как это предполагалось ранее. 12 Рисунок 9. Определение сайта инициации транскрипции методом «достройки праймера» с использованием P32-меченного праймера Y7. Стрелкой указан основной транскрипт, образующийся в реакции удлинения праймера. 3.2.2. Влияние пуриновых производных на экспрессию гена pbuE. Согласно литературным данным, наиболее активным метаболитом-эффектором сенсорной РНК гена pbuE является аналог аденина 2,6-диаминопурин с константой диссоциации 10 нмоль (против 300 нмоль для аденина). Гуанин обнаруживает значительно более низкую константу связывания с А-боксом (порядка 30 мкмоль), а гипоксантин, ксантин и другие аналоги пуриновых оснований вообще не проявляют свойства эффекторов в отношении этой сенсорной РНК. Важно подчеркнуть, что все данные по изучению взаимодействия пуриновых производных с А-боксом были получены в системе in vitro. В связи с этим интересно было изучить влияние потенциальных эффекторов А-бокса на экспрессию гена pbuE в живых клетках. С этой целью были получены транскрипционные фьюзы гена pbuE с реперным геном lacZ с их последующей интеграцией в хромосомный локус amyE штамма B. subtilis Mu8u5u6. У полученных штаммов определяли активность βгалактозидазы в присутствии различных пуриновых производных (рис. 10). Рисунок 10. Эффект пуриновых оснований и их аналогов на экспрессию гена pbuE B. subtilis Условные обозначения: DAP- 2,6-Диаминопурин; Ade – Аденин; Hx – Гипоксантин; AICAR – 5Аминоимидазол-4-карбоксамидрибофуранозид.; AICA –5-Аминоимидазол-4-карбоксамид; GR – Гуанозин; AR – Аденозин; IR – Инозин. 13 Как следует из рис. 10 наиболее выраженный активирующий эффект на экспрессию гена pbuE B. subtilis оказывают 2,6-диаминопурин и аденин (примерно 10-кратное повышение активности по сравнению с базальным уровнем). Добавление аденозина приводит к 5-кратному увеличению экспрессии гена pbuE. Весьма вероятно, что стимулирующее действие аденозина обусловлено его внутриклеточным фосфоролизом до аденина, который является истинным эффектором А-бокса. Еще менее выражен стимулирующий эффект на экспрессию гена гипоксантина, инозина или pbuE гуанозина, тогда как добавление нефосфорилированного предшественника IMP – 5- аминоимидазол-4-карбоксамидрибофуранозида (AICAR) вообще никак не сказывается на экспрессии транскрипционного фьюза pbuE-lacZ. Весьма примечателен тот факт, что в отличие от AICAR, его нерибозилированная форма – основание 5-аминоимидазол-4карбоксамид (AICA) обнаруживает свойства эффектора А-бокса и обусловливает 2,5-кратное увеличение экспрессии гена pbuE. Из этого следует, что, несмотря на то, что AICA представляет собой разомкнутую структуру пуринового кольца, присутствие в его составе дополнительной аминогруппы, видимо, делает его похожим на аденин и обеспечивает возможность связывания с сенсорной РНК. 2.3. Сайт-направленный мутагенез лидерной области гена pbuE Для выяснения функциональной роли отдельных нуклеотидов лидерной области мРНК гена pbuE был проведен сайт-направленный мутагенез лидерной области гена pbuE. Нуклеотидные замены были получены в сайтах, расположенных в основании шпилек P2/P2’ (замены 21С→G, 22С→G) и P3/P3’ (замены 50C→G, 51A→U) – рис. 8. Кроме того, была получена мутация 70U→С, которая, по имеющимся данным, должна влиять на специфичность связывания А-бокса с аденином в качестве положительного эффектора транскрипции. Следует отметить, что эта нуклеотидная замена, по всей видимости, должна одновременно нарушать спаривание нуклеотидов в основании шпильки, формирующей терминатор транскрипции, и, тем самым, влиять на уровень экспрессии гена pbuE (рис. 8). Поэтому была получена компенсирующая нуклеотидная замена 100A→G, которая должна восстанавливать шпилечную структуру терминатора. Полученные мутантные варианты клонировали в составе вектора pDG268 для конструирования транскрипционных фьюзов pbuE-lacZ, а затем интегрировали в хромосомный локус amyE штамма B. subtilis Mu8u5u6, как описано в работе. 2.4. Характеристика мутантов, содержащих замены в лидерной области гена pbuE. У отобранных рекомбинантов, содержащих инсерции транскрипционных фьюзов лидерной области гена pbuE дикого типа и его мутантных вариантов, определяли активность β-галактозидазы в различных физиологических условиях. Результаты этих опытов представлены на рис. 11. 14 Рисунок 11. Влияние пуриновых оснований на экспрессию лидера pbuE дикого типа и его мутантных вариантов. Ночные культуры штамма B. subtilis Mu8u5u6, содержащие в составе хромосомы транскрипционные фьюзы pbuE-lacZ разводились в 50 раз в свежей среде Спицайзена и растили при 37оС до OD600=0.2, затем в соответствующие пробы добавляли пуриновые основания: аденин (А), гуанин (G) и гипоксантин (H) в концентрации 1мМ и растили еще 2 часа перед определением активности βгалактозидазы. Активность β-галактозидазы выражена в единицах Миллера. Приведенные значения активности – средние из 4 независимых определений. Как следует из данных, представленных на рис. 11, базальный уровень экспрессии транскрипционного фьюза лидера гена pbuE дикого типа с реперным геном lacZ очень низок и активируется более чем в 100 раз при добавлении аденина в среду для роста. Добавление гуанина приводит примерно к 10-кратному увеличению экспрессии pbuE-lacZ, тогда как гипоксантин на экспрессию этой конструкции практически не влияет. У мутантов, содержащих нуклеотидные замены 21С→G, 22С→G (мутант pbuE-M1) и 50С→G, 51A→U (мутант pbuE-M2) наблюдается низкий уровень экспрессии pbuE-lacZ, который не увеличивается при добавлении пуриновых оснований. Из этого следует, что частичное разрушение шпилечных структур P2/P2’ и P3/P3’ полностью инактивирует сенсорные свойства лидерной РНК в отношении пуринов. Этот результат подтверждает модель трехмерной структуры А-бокса, согласно которой формированию домена, ответственного за связывание аденина предшествует взаимодействие шпилечных структур P2/P2’ и P3/P3’. Присутствие в лидерной области нуклеотидной замены U70→С (мутант pbuE-M3) приводит к конститутивной экспрессии pbuE, причем добавление пуринов уже практически не сказывается на уровне активности мутантного фьюза (рис. 11), что подтверждает данные работы. Как уже отмечалось выше, конститутивная экспрессия этого мутанта, вероятней всего, обусловлена частичным разрушением терминирующей шпильки. Особый интерес представляет результат внесения на фоне мутации U70→С дополнительной замены A100→G (мутант pbuE-M5) в левом плече терминатора транскрипции (рис. 8). Как следует из рис. 11, именно у двойного мутанта наблюдается изменение специфичности связывания А-бокса с пуриновыми основаниями – вместо аденина 15 (у дикого типа) активатором экспрессии становится гуанин. Таким образом, специфичность связывания сенсорной РНК pbuE с аденином действительно определяется присутствием основания U в положении 70, и, вероятней всего, обусловлена предсказанным УотсонКриковским взаимодействием эффектора аденина с урацилом в А-боксе. Замена U70→С нарушает это взаимодействие и меняет специфичность узнавания сенсорной РНК метаболита-эффектора, но фенотипическое проявление изменения специфичности сенсорной РНК pbuE наблюдается только на фоне дополнительной нуклеотидной замены A100→G, которая восстанавливает шпилечную структуру терминатора транскрипции (рис. 8). 3. Реконструкция пуринового метаболизма у Bacillus subtilis с целью получения штамма-продуцента AICAR (акадезина) – перспективного кандидата в лекарственные препараты широкого терапевтического применения. Как уже отмечалось выше pur-оперон B. subtilis кодирует ферменты синтеза IMP – главного промежуточного соединения при биосинтезе пуриновых нуклеотидов. В результате реакции на восьмом этапе пути биосинтеза пуринов (рис. 12) образуется 5аминоимидазол-4-карбоксамидрибофуранозид или сокращенно – АИКАР (AICAR), который так же известен под названием «акадезин» (acadesine). Впоследствии выяснилось, что это соединение обладает высочайшим потенциалом для терапии различных социально-значимых заболеваний. Соответственно создание штамма-продуцента, обеспечивающего накопление AICAR в культуральной жидкости (КЖ), в концентрации достаточной для дальнейшего производства лекарственной субстанции, является интересной и весьма актуальной задачей. Целью этого раздела является получение штамма-продуцента AICAR путем направленной реконструкции пуринового метаболизма у B. subtilis. На первом этапе работы по получению штамма-продуцента AICAR необходимо было обеспечить максимальную экспрессию генов pur-оперона путем устранения его негативной регуляции под действием белка-репрессора PurR и терминатора транскрипции в лидерной области оперона. После этого в геноме полученного штамма была получена делеция гена purH, кодирующего синтез фермента AICAR трансформилазы/IMP циклогидролазы. Инактивация этого фермента должна обеспечивать внутриклеточное накопление AICAR (рис. 12). Рисунок 12. Схема биосинтеза AICAR. 16 Аббревеатура: R-5-P – рибозо-5’-фосфат, PRPP – 5’-фосфорибозил-1-пирофосфат, PRA – 5'фосфорибозиламин, GAR – 5’-фосфорибозилглицинамид, FGAR – 5’-фосфорибозил-Nформилглицинамид, FGAM – 5'-фосфорибозил-N-формилглицинамид, AIR – 5'-фосфорибозил-5аминоимидазол, CAIR – 5’-фосфорибозил-5-аминоимидазол-4-карбоксилат, SAICAR – 5’фосфорибозил-4(N-сукцинокарбоксамид)-5-аминоимидазол, AICAR-P – 5'-фосфорибозил-4карбоксамид-5-аминоимидазол, FAICAR – 5’-фосфорибозил-4-карбоксамид-5-формамидоимидазол, IMP – инозин-5’-монофосфат, AICAR – 5-аминоимидазол-4-карбоксамидрибофуранозид. На следующем этапе работы необходимо было увеличить пул основного предшественника синтеза пуринов de novo – PRPP. Синтез PRPP осуществляется из рибозо5-фосфата под контролем фермента PRPP-синтазы, кодируемой геном prs. Активность этого фермента подвержена аллостерической регуляции с участием пуриновых нуклеотидов. Структурно-функциональная организация PRPP-синтазы, более детально изучена у бактерий E. coli, у которых получен мутантный вариант этого фермента со снятой аллостерической регуляцией. Учитывая эти данные, был проведен сайт-направленный мутагенез гена prs E. coli для получения мутантного фермента со снятым ретроингибированием пуриновыми нуклеотидами с целью его последующего переноса в клетки B. subtilis. Еще одним препятствием для усиления продукции AICAR является наличие аллостерической регуляции у первого фермента собственно пуринового биосинтеза – глютамин-PRPP-аминотрансферазы, кодируемой геном purF. Известно, что глютамин-PRPPаминотрансфераза из E. coli, в отличие от соответствующего фермента B. subtilis, не подвержена инактивации в стационарной стадии роста бактерий. Кроме того, у E. coli описан мутантный вариант этого фермента, устойчивый к ингибированию пуриновыми нуклеотидами. Поэтому и в этом случае было решено использовать модифицированный с помощью сайт-направленного мутагенеза фермент глютамин-PRPP-аминотрансферазы из E. coli с целью его последующего переноса в клетки B. subtilis. Для обеспечения оптимальной экспрессии клонированных из E. coli модифицированных генов prs и purF в клетках B. subtilis на основе плазмиды pDG268 был сконструирован экспрессионный интегративный вектор, содержащий сильный промотор гена rpsF, кодирующего синтез рибосомного белка S6. Наконец, на последнем этапе работы после клонирования генов prs и purF под контролем промотора гена rpsF в составе полученного вектора, была проведена его интеграция в хромосому штамма-продуцента AICAR B. subtilis. В итоге работы получен штаммпродуцент, накапливающий 11-13 г/л AICAR в КЖ. 3.1. Определение продуктивности штаммов в отношении накопления AICAR Для оценки продуктивности полученных в ходе работы штаммов в отношении накопления AICAR проводились опыты по ферментации. Результаты этих опытов суммированы на рис. 13. Как следует из данных, представленных на рис. 13, исходный штамм АМ732 практически совсем не накапливает AICAR. Только после внесения в геном этого штамма делеции гена purH (штамм АМ793) наблюдается незначительное (<1 г/л) накопление AICAR 17 в КЖ. Внесение мутаций purR::neo и ∆TL (штамм АМ778), обеспечивающих полную дерепрессию ферментов биосинтеза пуринов, приводит к существенному увеличению накопления AICAR до 4-5 г/л. Рисунок 13. Схема конструирования штаммов-продуцентов c указанием их продуктивности в отношении накопления AICAR Дальнейшее почти двухкратное увеличение продуктивности наблюдается у штаммов АМ811 и АМ813, в клетках десенсибилизированных белков которых экспрессируется один из мутантных E. coli – PRPP-синтаза (ген prs) или глютамин-PRPP- аминотрансфераза (ген purF), соответственно. Максимальное накопление AICAR до 11-13 г/л обнаруживается у штамма АМ815, характеризующегося полной дерепрессией ферментов биосинтеза пуринов и одновременно содержащего модифицированные гены prsE и purFE под контролем промотора PrpsF. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Главным итогом настоящей работы является установление важной роли сенсорных РНК в регуляции пуринового метаболизма. Результаты мутационного анализа структурно-функциональной организации лидерной области pur-оперона и данные in vitro позволяют сделать заключение о том, что регуляция экспрессии этого оперона осуществляется с помощью сенсорной РНК в результате ее связывания со специфическими метаболитами-эффектороми гуанином и гипоксантином, как это было показано ранее на модели xpt-pbuX-оперона B. subtilis. Полученные экспериментальные данные подтверждают модель регуляции pur-оперона, приведенную на рис. 3, согласно которой, связывание пуриновых оснований стабилизирует шпилечную структуру P:P’ и, тем самым, способствует образованию шпильки T:T', формирующей типичный Rho-независимый терминатор транскрипции. Интересно отметить, что, несмотря 18 на некоторые различия в нуклеотидном составе G-бокса пуриновых сенсорных РНК pur- и xpt-pbuX-оперонов B. subtilis, в качестве наиболее эффективного метаболита-эффектора в обоих случаях выступает гуанин, а не гипоксантин. Общий план расположения нуклеотидных мотивов, формирующих альтернативные шпилечные структуры в процессе фолдинга сенсорных РНК этих оперонов, также обнаруживает большое сходство. Кроме того, полученные нами данные хорошо согласуются с результатами рентгеноструктурного анализа G-бокса xpt-pbuX-оперона B. subtilis, в соответствии с которыми метаболитсвязывающий «карман» G-бокса формируется за счет водородных связей гуанина с нуклеотидами U22, U47, U51 и C74 (рис. 14). Рисунок 14. Взаимодействие гуанина с метаболит-связывающим «карманом» G-бокса xpt-pbuX-оперона B. subtilis Взаимодействие гуанина (обозн. голубым) с «карманом» из консервативных пиримидиновых остатков (обозн. зеленым). Лиганд взаимодействует с РНК в основном через водородные связи (обозн. черным пунктиром) между пиримидинами 51 и 74. Полученные нами нуклеотидные замены именно в этих положениях лидерной РНК purоперона U47→C (мутант AM612-М2) и U51→C (мутант AM612-М4) сопровождались практически полной потерей чувствительности к гуанину как в опытах in vivo (рис. 5), так и in vitro (рис. 6). В то же время расположенные рядом нуклеотидные замены А44→G, T48→C и C53→T не приводили к существенному изменению регуляции pur-оперона. Еще более выраженный гуанин-независимый фенотип обнаруживал мутант AM612M6, содержащий замену C76→U. По своей функциональной значимости этот цитозин в положении 76 pur-оперона, по-видимому, идентичен цитозину в положении 74 xpt-pbuXоперона (рис. 14), которому приписывают ключевую роль в распознавании и связывании соответствующей сенсорной РНК с метаболитами-эффекторами гуанином и гипоксантином. Таким образом, полученные данные позволяют заключить, что изученная нами лидерная область pur-оперона, несмотря на некоторые различия в первичной структуре, по своей структурно-функциональной организации и специфичности связывания с метаболитамиэффекторами мало отличается от детально исследованной сенсорной РНК, кодируемой xptpbuX-опероном. При выяснении вопроса об относительной роли регуляции pur-оперона, действующей на уровне инициации транскрипции с участием белка-репрессора PurR, и контроля его экспрессии на уровне терминации транскрипции посредством сенсорной РНК, мы показали, 19 что их взаимодействие носит сложный характер и, по всей вероятности, определяется соотношением внутриклеточных пулов адениновых и гуаниновых нуклеотидов. В наших опытах при устранении PurR-регуляции мы наблюдали примерно 17-кратное усиление экспрессии pur-оперона. В то же время, удаление терминатора транскрипции в лидерной области pur-оперона приводило к 9-кратному увеличению уровня его экспрессии, что свидетельствует о важной роли пула гуаниновых производных в регуляции. Однако удаление обоих регуляторных элементов вызывало ярко выраженный синергидный эффект: экспрессия оперона возрастала более чем в 200 раз. Эти данные свидетельствуют, с одной стороны, о мощном биосинтетическом потенциале pur-оперона, а с другой – о наличии в клетках дикого типа строгого баланса между пулами нуклеотидов, обеспечивающего гибкую регуляции экспрессии pur-оперона. Наконец, сама по себе структурная организация pur-оперона также требует специального обсуждения. Даже при беглом анализе структуры этого оперона обращает на себя внимание то обстоятельство, что структурный ген purF, ответственный за первую стадию биосинтеза пуринов расположен примерно в середине оперона, тогда как ген purD, контролирующий следующую стадию биосинтеза занимает самое дистальное положение. Более того, между этими генами располагается внутренний Rho-независимый терминатор транскрипции (T F-M), присутствие которого должно еще больше усиливать дисбаланс в уровне синтеза первого и второго ферментов биосинтеза пуринов. Действительно, мы получили экспериментальное подтверждение, что удаление этого терминатора приводит к существенному усилению экспрессии дистального гена purD. Что касается изучения роли сенсорной РНК в регуляции гена pbuE B. subtilis, то проведенный нами мутационный анализ лидерной области этого гена подтверждает описанную в литературе трехмерную модель структурно-функциональной организации Абокса. Не вызывает сомнения, что связывание пуриновых оснований с сенсорной РНК приводит к ее конформационному переходу из одного альтернативного состояния (терминатор) в другое (антитерминатор). Вместе с тем, динамика этого перехода и реализация изменения конформации сенсорной РНК на уровне экспрессии гена pbuE остается не до конца понятной. В работе, посвященной изучению кинетических характеристик комплекса РНК А-бокса с аденином, показано, что на процесс разрушения терминатора и формирования антитерминирующей структуры под действием аденина влияют такие параметры, как концентрация нуклеозидтрифосфатов, скорость элонгации РНК-полимеразы, наличие транскрипционных пауз в структуре А-бокса, а также, возможно, присутствие белков, модулирующих процесс элонгации транскрипции. Вероятно, с этой множественностью регуляции экспрессии гена pbuE связаны некоторые различия 20 полученных нами результатов с опубликованными данными. Так, например, по литературным данным, константа связывания гуанина с РНК А-бокса почти на три порядка ниже, чем у аденина и, в соответствии с этим, не наблюдается усиление экспрессии гена pbuE in vivo в присутствии гуанина. В то же время, в наших опытах экзогенный гуанин вызывал достаточно выраженное (10-кратное) усиление экспрессии конструкции pbuE-lacZ, содержащей А-бокс дикого типа (рис. 11), что, впрочем, согласуется с данными других работ. Наконец, на последнем этапе работы в результате проведенных исследований на основе бактерий B. subtilis получен штамм-продуцент AICAR – перспективного кандидата в лекарственные препараты широкого терапевтического применения. Стратегия получения штамма-продуцента AICAR основана на направленной реконструкции пуринового метаболизма B. subtilis. Следует отметить, что примерно такая же стратегия уже применялась для создания штаммов-продуцентов инозина на модели B. subtilis. На первом этапе работы в геном бактерий была внесена инсерция в гене purR, кодирующем синтез белка-репрессора pur-оперона и получена делеция терминатора транскрипции в лидерной области pur-оперона, что обеспечило максимальную дерепрессию ферментов биосинтеза пуринов de novo. По имеющися данным в литературе, присутствие такого рода мутаций в геноме B. subtilis обеспечивало накопление инозина в культуральной жидкости до 6 г/л. Затем в геноме бактерий была получена делеция гена purH, кодирующего синтез фермента AICAR трансформилазы/IMP циклогидролазы. Инактивация этого фермента нарушает реакцию превращения AICAR в IMP и приводила к его накоплению в клетке до 4-5 г/л, что примерно соответствует уровню накопления инозина, описываемому в литературе. На следующем этапе работы мы применили полностью оригинальный подход, основанный на введении в клетки бацилл модифицированных гетерологичных генов пуринового биосинтеза из E. coli. При этом предварительно был проведен сайтнаправленный мутагенез генов prs и purF E. coli, кодирующих ключевые ферменты синтеза предшественников пуринов с целью получения их мутантных вариантов со снятым ретроингибированием пуриновыми нуклеотидами. Наконец, на последнем этапе работы была осуществлена интеграция модифицированных генов prs и purF E. coli в хромосому B. subtilis под контролем сильного промотора, обеспечивающего высокий уровень их экспрессии в клетках B. subtilis. В итоге работы получен штамм-продуцент, накапливающий 11-13 г/л AICAR в КЖ. В заключение, следует отметить, что совсем недавно появилось сообщение о том, что AICAR успешно прошел вторую стадию 21 клинических испытаний в качестве противоракового препарата. Показан положительный эффект AICAR при лечении пациентов, страдающих хронической лимфоцитарной лейкемией, множественной миеломой и лимфомой из клеток мантийной зоны. Сконструированный в настоящей работе штаммпродуцент AICAR может послужить основой микробиологического производства этого соединения. 22 для разработки промышленного Выводы: 1. Выявлена роль двух Rho-независимых терминаторов транскрипции, один из которых расположен в лидерной области, а второй − в межгенном участке purF-purM, в регуляции экспрессии pur-оперона. Установлено, что максимальная экспрессия purоперона достигается при делетировании обоих терминаторов транскрипции и регуляторного гена purR. 2. Методом сайт-направленного мутагенеза изучена структурно-функциональная организация лидерной области pur-оперона B. subtilis. Установлено, что помимо негативного контроля с участием белка-репрессора PurR, регуляция экспрессии этого оперона осуществляется на уровне терминации транскрипции с помощью сенсорной РНК в результате ее связывания со специфическими метаболитами-эффектороми гуанином и гипоксантином. 3. Проведен мутационный анализ лидерной области гена pbuE B. subtilis, кодирующего синтез трансмембранного белка, ответственного за экспорт пуриновых оснований из клетки. Установлено, что лидерная область гена pbuE кодирует специфическую сенсорную РНК. Показано, что главными низкомолекулярными эффекторами этой сенсорной РНК являются пуриновые основания аденин и диаминопурин, добавление которых в среду приводит к усилению экспрессии гена pbuE. 4. Показано, что присутствие в консервативной области лидерной РНК гена pbuE (Абокс) двух нуклеотидных замен 70U→С и A100→G приводит к изменению специфичности сенсорной РНК in vivo: вместо аденина позитивным эффектором транскрипции становится гуанин. Подтверждена трехмерная модель структурнофункциональной организации А-бокса гена pbuE B. subtilis. 5. Проведена реконструкция пуринового метаболизма у штамма B. subtilis, направленная на сверхпродукцию AICAR клетками бактерий. Полученный в результате проведенных генетических манипуляций штамм B. subtilis накапливает 11-13 г/л AICAR в культуральной жидкости. 23 Список печатных работ, опубликованных по теме диссертации: 1. Лобанов К.В., Королькова Н.В., Еремина С.Ю. и др. Мутации, приводящие к изменению специфичности сенсорной РНК, кодируемой геном pbuE Bacillus subtilis. // Генетика. 2007. Т. 43. №6. C. 859-864. 2. Миронов А.С. и Лобанов К.В. (2007) Сенсорные РНК и их роль в регуляции экспрессии генов. В кн. Молекулярная генетика, биофизика и медицина сегодня (Бреслеровские чтения II), ред. В.А. Ланцов, изд. ПИЯФ РАН (Гатчина.СанктПетербург), стр.278-298. 3. Миронов А.С., прокариот». Прошкин С.А., Лобанов К. В., Лосева С.А. «Регуляторные Материалы пятого съезда Вавиловского общества РНК генетиков и селекционеров Москва, 21 – 27 июня 2009 г., С.34. 4. Лобанов К.В., Королькова Н.В., Еремина С.Ю. и др. Мутационный анализ лидерной области пуринового оперона Bacillus subtilis // Генетика. 2011. Т.47. №7. С. 890-899. 5. Лобанов К.В., Эрраис Лопес Л., Королькова Н.В. и др. Реконструкция пуринового метаболизма у Bacillus subtilis с целью получения штамма-продуцента AICAR – нового препарата широкого терапевтического применения // Acta Naturae. 2011. Т.3. № 2(9). С. 83-93. 24
