Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Красноярский государственный медицинский университет
advertisement
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В. Ф. Войно-Ясенецкого» Министерства здравоохранения Российской Федерации На правах рукописи Малиновская Наталия Александровна РОЛЬ НАД+-ЗАВИСИМЫХ МЕХАНИЗМОВ В РЕГУЛЯЦИИ НЕЙРОН-ГЛИАЛЬНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ ПРИ ИШЕМИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА И НЕЙРОДЕГЕНЕРАЦИИ 14.03.03 – патологическая физиология Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научные консультанты: д-р мед. наук, профессор Салмина Алла Борисовна д-р мед. наук, профессор Прокопенко Семен Владимирович Кемерово - 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ Стр. ВВЕДЕНИЕ ……………………………………………………………… 9 ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ……………….…………………… 23 1.1 Современные представления о патогенезе острой и хронической нейродегенерации ....……………………..………...………….…………. 23 1.1.1 Особенности развития головного мозга, влияющие на патогенез нейродегенерации в раннем и зрелом мозге .……………... 1.1.2 Особенности патогенеза острой и 27 хронической нейродегенерации ..…..………………………………………….……….. 31 1.2 Интегративные функции головного мозга и тесты для их оценки 41 1.2.1 Когнитивные функции головного мозга ..……………………… 42 1.2.2 Социальное поведение ..……………………..…………………... 43 1.3 Нейрон-глиальные взаимодействия в норме и при патологии ЦНС ...……...………………………………………..…………………….. 44 1.3.1 Виды нейрон-глиальных взаимодействий ..…..………………... 49 1.3.2 Нейрон-глиальные взаимодействия при нейродегенеративных заболеваниях ..…..………………….……………………………………... 53 1.4 Молекулы, играющие роль в нейрон-глиальных взаимодействиях 55 1.4.1 Нуклеотидные рецепторы ..…..…………………………..……... 55 1.4.2 НАД+-гликогидролазы (СD38, CD157/BST-1) ..…..……....…… 64 1.4.3 Коннексины ………...…..……………………………..…………. 71 1.4.4 Молекулы активированной микроглии и их роль в патогенезе ишемии головного мозга и нейродегенерации ………………………… 75 1.5. Клеточная гибель и ее особенности при патологии ЦНС ………… 83 ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ………….. 86 2.1 Создание экспериментальных моделей острой и хронической нейродегенерации ………...…..……………………………..…………… 87 3 2.2 Тесты для поведенческого фенотипирования животных в моделях острой и хронической нейродегенерации ……...…..…………………. 89 2.2.1 Осмотр животных на наличие признаков паркинсонизма …….. 90 2.2.2 Тест открытое поле …………...…..……………………….……... 91 2.2.3 Осмотр животных на наличие признаков аутизма …..………… 92 2.2.4 Неврологическая шкала NSS (Neurological Score System) …….. 92 2.2.5 Тесты для оценки моторной дисфункции передних и задних конечностей …………...…..……………………….……………………... 93 2.2.6 Ольфакторный тест …………...…..……………………….……... 94 2.2.7 Оценка состояния неврологических рефлексов и физического развития животных при моделировании аутизма ……………………... 95 2.3 Тесты для оценки когнитивной функции крыс …...…..……………. 95 2.3.1 Водный лабиринт Морриса …………...…..……………………... 96 2.3.2 Тест Барнса …………...…..……………………….……………… 97 2.3.3 Т-образный лабиринт …………...…..…………………………… 98 2.3.4 Тест на распознавание нового объекта …………...…..………… 99 2.4 Тесты для оценки социального поведения крыс …………………... 99 2.4.1 3-камерная активность …………………………………………... 100 2.4.2 Тест с трубой на агрессию ………………………………………. 100 2.5 Тест для оценки эмоционального поведения крыс ………………… 101 2.6 Иммуногистоцитохимическая оценка экспрессии антигенов …….. 102 2.7 Идентификация апоптоза клеток головного мозга ………………… 104 2.8 Фотометрические и флуориметрические методы ………………….. 105 2.8.1 Определение содержания белка ………………………………… 105 2.8.2 Анализ АДФ-рибозилциклазной активности …………...……… 106 2.8.3 Оценка функциональной активности клеток головного мозга .. 106 2.8.4 Модуляция АДФР-циклазной и функциональной активности клеток головного мозга ………………………………………………….. 107 2.8.5 Определение содержания НАД+ ………………………………… 107 4 2.8.6 Определение концентрации лактата ……………………………. 107 2.9 Статистическая обработка результатов …………………………….. 108 ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ... 109 3.1 Хроническая нейродегенерация …………………………………….. 109 3.1.1 Результаты осмотра животных на наличие признаков паркинсонизма и в тесте «Открытое поле» в модели болезни Паркинсона ……………………………………………………………….. 109 3.1.2 Осмотр животных на наличие признаков аутизма …………….. 118 3.1.3 Тесты для оценки моторной дисфункции передних и задних конечностей в ротеноновой модели хронической нейродегенерации .. 120 3.1.4 Изменение интегративных функций мозга в патогенезе хронической нейродегенерации ………………………………………… Ольфакторный 3.1.4.1 тест в ротеноновой 122 модели нейродегенерации …………………..…………………….……………… 122 3.1.4.2 Оценка социального поведения крыс в ротеноновой модели хронической нейродегенерации ……………………………….. 124 3.1.4.3 Оценка эмоционального поведения крыс в ротеноновой модели хронической нейродегенерации ………………………………... 126 3.1.4.4 Оценка когнитивной функции крыс в ротеноновой модели хронической нейродегенерации ………………………………... 128 3.1.5 Оценка состояния неврологических рефлексов, физического развития животных, признаков аутизма и паркинсонизма и интегративных функций мозга при экспериментальном моделировании аутизма …………………………………………………. 135 3.1.6 Иммуногистоцитохимическая оценка экспрессии НАД+зависимых взаимодействий механизмов в реализации ротеноновой нейрон-глиальных модели хронической нейродегенерации ………………………………………………………... 141 5 3.1.7 Иммуногистоцитохимическая оценка экспрессии «раннего» маркера нейрогенеза Pax6 в среднем мозге в ротеноновой модели хронической нейродегенерации ………………………………………… 3.1.8 Иммуногистоцитохимическая оценка экспрессии 147 P- гликопротеина в среднем мозге в ротеноновой модели хронической нейродегенерации ………………………………………………………... 3.1.9 Идентификация апоптоза клеток головного мозга 148 в ротеноновой модели хронической нейродегенерации ………………… 148 3.1.10 Анализ АДФ-рибозилциклазной активности клеток среднего мозга в ротеноновой модели хронической нейродегенерации ……….. 149 3.1.11 Модуляция АДФ-рибозилциклазной активности клеток среднего мозга в ротеноновой модели хронической нейродегенерации ………………………………………………………... 149 3.1.12 Оценка функциональной активности клеток среднего мозга в ротеноновой модели хронической нейродегенерации ………………… 150 3.1.13 Модуляция функциональной активности клеток среднего мозга в ротеноновой модели хронической нейродегенерации ……….. 151 3.1.14 Определение концентрации НАД+ в модели хронической нейродегенерации ………………………………………………………... 152 3.1.15 Определение концентрации лактата в модели хронической нейродегенерации ………………………………………………………... 3.1.16 Корреляционный анализ в модели 153 хронической нейродегенерации ………………………………………………………... 153 3.2 Острая нейродегенерация …………………………………………… 154 3.2.1 Результаты осмотра животных на наличие признаков острой нейродегенерации с помощью неврологической шкалы NSS (Neurological Score System) ……………………………………………… 154 3.2.2 Тесты для оценки моторной дисфункции передних и задних конечностей в модели острой нейродегенерации ……………………… 156 6 3.2.3 Изменение интегративных функций мозга (когнитивной функции крыс) в патогенезе острой нейродегенерации ………………. 160 3.2.4 Иммуногистоцитохимическая оценка экспрессии НАД+зависимых механизмов реализации нейрон-глиальных взаимодействий в моделях острой нейродегенерации ……………….. 164 3.2.5 Иммуногистоцитохимическая оценка экспрессии «раннего» маркера нейрогенеза Pax6 в коре и гиппокампе головного мозга при ишемии ……………………………………………………………………. 3.2.6 Иммуногистоцитохимическая оценка экспрессии 171 P- гликопротеина в коре передних полушарий головного мозга в моделях острой нейродегенерации …………………………………….. 172 3.2.7 Идентификация апоптоза клеток головного мозга в модели острой нейродегенерации ……………………………………………….. 173 3.2.8 Анализ АДФ-рибозилциклазной активности клеток головного мозга в моделях острой нейродегенерации …………………………….. 174 3.2.9 Модуляция АДФ-рибозилциклазной активности клеток головного мозга в модели острой нейродегенерации …………………. 175 3.2.10 Оценка функциональной активности клеток головного мозга в моделях острой нейродегенерации …………………………………… 177 3.2.11 Модуляция функциональной активности клеток среднего мозга в моделях острой нейродегенерации …………………………….. 3.2.12 Определение уровня НАД+ в моделях 178 острой нейродегенерации ………………………………………………………... 179 3.2.13 Определение концентрации лактата в модели острой нейродегенерации ………………………………………………………... 3.2.14 Корреляционный анализ в моделях 180 острой нейродегенерации ………………………………………………………... 181 ГЛАВА 4 ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ …… 183 ВЫВОДЫ ………………………………………………………………... 211 7 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ..……………………………. 214 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ……………………………………………. 215 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ …………………………………………….. 219 Приложение А Особенности и общие черты развития острой и хронической нейродегенерации развивающегося и зрелого мозга….. 263 Приложение Б Роли глии в головном мозге животных……………… 266 Приложение В Классификация и модуляторы нуклеотидных Р2 рецепторов, их тканевое распределение, механизмы сигнальной трансдукции и роли в нервной системе ……………….………………. 268 Приложение Г Особенности нейрогенеза и функционирования гематоэнцефалического барьера (ГЭБ)/нейроваскулярной единицы (НВЕ) при острой и хронической нейродегенерации развивающегося и зрелого мозга …..…………………………………………………….… 271 Приложение Д Особенности нейрон-глиальных взаимодействий при острой и хронической нейродегенерации развивающегося и зрелого мозга …………………………………………………….………………… 272 Приложение Е Функции крыс и виды тестов, используемых для тестирования животных .………………………………………………… 274 Приложение Ж Шкала оценки признаков паркинсонизма .…………. 276 Приложение И Параметры, оцениваемые в тесте «Открытое поле»………………….……………………………………………………. 277 Приложение К Стандартный протокол выполнения NSS теста.…….. 278 Приложение Л Особенности выполнения тестов для оценки моторной дисфункции конечностей...…………………………………. 280 Приложение М Типичное и атипичное положение лап крысы при выполнении вермишелевого теста …………………………………….. 283 Приложение Н Тесты для оценки неврологического и физического развития крысят …..……………………………………………………… 285 Приложение П Протокол проведения иммуногистоцитохимии….….. 286 8 Приложение Р Протокол метода детекции апоптоза TUNEL ………… 290 Приложение С Протокол оценки АДФР-циклазной активности CD38 клеток нейроглии крыс …..……………………………………………… 294 Приложение Т Протокол оценки концентрации белка в образце микрометодом Лоури без осаждения белка .…………………………… 295 Приложение У Параметры модуляции экспрессии и АДФРциклазной активности CD38 клеток нейроглии и функциональной активности микроглии крыс…..………………………………………… Приложение Ф Протокол оценки концентрации лактата 297 и НАД+…………………………………………………………………..…… 298 Приложение Х Корреляционный анализ в ротеноновой модели хронической нейродегенерации ………………………………………… 299 Приложение Ц Корреляционный анализ в модели перинатальной гипоксии-ишемии при острой нейродегенерации ….………………… 302 Приложение Ш Корреляционный анализ в модели ишемии головного мозга при острой нейродегенерации …..……………………………… 303 Приложение Щ Фотографии флуоресцентной и/или конфокальной микроскопии (ко)экспрессии антигенов в ткани головного мозга при острой и хронической нейродегенерации ……………………………… 311 9 ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования Одной из важнейших проблем современной медицины является высокая распространенность патологии ЦНС. В развитых странах смертность от нейродегенеративных и цереброваскулярных заболеваний в структуре общей смертности занимает 2-3-е места, в России наблюдается схожая ситуация [9]. Изучение механизмов повреждения нейронов и глиальных клеток при поражении центральной нервной системы представляет собой актуальную проблему патофизиологии, биохимии, молекулярной и трансляционной медицины. Несмотря на значительное количество исследований, посвященных анализу развития клеточных и молекулярных механизмов нарушения жизнеспособности и функциональной активности нейронов и клеток глиальной природы, современная медицина все еще далека от создания высокоэффективных технологий коррекции дисфункции мозга [39, 42]. Острая нейродегенерация. На первом месте среди причин инвалидности, втором месте среди причин смерти человека (в течение года после дебюта заболевания умирают 48% пациентов), и одними из наиболее распространенных заболеваний зрелого‚ пожилого, а в последние десятилетия и молодого возраста, являются острые нарушения мозгового кровообращения (ОНМК) ишемического типа. Причем наибольшую долю от всех ОНМК (80%) составляют ишемические инсульты. По данным НИИ неврологии РАМН, по этиологии ОНМК различают несколько вариантов ишемического инсульта: атеротромботический (34%), с артерио-артериальными эмболиями (13%), с тромбозами мозговых сосудов (21%), с кардиоэмболией (22%), гемодинамический (15%), лакунарный (20%), с гемореологической микроокклюзией (9%) [9, 23, 55]. Гипоксически-ишемическое перинатальное поражение головного мозга (перинатальная гипоксия-ишемия, ПГИ) оказывает существенное влияние на многие индивидуальные особенности физической и интеллектуальной сфер развивающегося организма [298], является одной из основных причин смертности 10 (60% заболевших детей умирает в период новорожденности) и неврологической инвалидности (у 25% выживших детей развивается выраженный неврологический дефицит) [161, 305, 333]. Последствия ПГИ в раннем детском возрасте проявляются в виде синдромов внутричерепной гипертензии, расстройства функции вегетативной нервной системы, гипервозбудимости и гиперактивного поведения, нарушения моторного развития, симптоматических судорог и пароксизмальных расстройств [60]. Ожирение, связанное с метаболическим синдромом, является независимым фактором риска развития инсульта у взрослых. Подобно ожирению у взрослых, новорожденные большого гестационного возраста, имеющие вес тела выше среднего при рождении, имеют более высокий риск развития осложнений (таких, как гиперинсулинемия и гипогликемии), чем дети привычного гестационного возраста [305]. Хроническая нейродегенерация. По разным данным, распространенность болезни Паркинсона (БП) в России колеблется от 117000 до 338000 пациентов. Болезнь Паркинсона развивается в достаточно молодом возрасте: средний возраст дебюта БП – 55 лет, в то же время, у 10% пациентов БП начинается еще раньше – до 40 лет. Болезнь не зависит от расовой, социальной и половой принадлежности, и, как правило, прогрессирует очень медленно, не проявляясь долгие годы. Болезнь Паркинсона (БП) - хроническое дегенеративное прогрессирующее заболевание ЦНС, распространенность которого значительно увеличивается с возрастом. Известно, что первые симптомы БП появляются лишь при гибели более 50% нейронов черной субстанции. БП характеризуется моторными расстройствами, проявляющимися при селективной гибели дофаминергических нейронов черного вещества среднего мозга [40]. Болезнь Паркинсона является результатом сложного взаимодействия между генетическими, экологическими факторами и механизмами, включающими окислительный стресс, митохондриальную дисфункцию, эксайтотоксичность, депозицию железа и воспаление. Предполагается, что БП – приобретенная или генетическая протеинопатия с участием в аномальном процессе нескольких нейронных белков [328]. Патологическим признаком болезни Паркинсона является отложение 11 внутри цитоплазмы нейронов включений, называемых тельцами Леви. Основными компонентами телец Леви являются фибриллы белка α-синуклеина. Получены доказательства того, что структурно менее стабильные промежуточные агрегаты α-синуклеина играют ключевую роль в патогенезе и прогрессировании болезни Паркинсона и других нейродегенеративных расстройств, именуемых синуклеинопатиями [324]. Болезнь Паркинсона также связывают с таупатиями, хотя ранее считалось, что болезнь Паркинсона является классической синуклеинопатией, а болезнь Альцгеймера – таупатией. При болезни Паркинсона и Альцгеймера возможно «перекрытие» клинических признаков - болезнь Паркинсона часто связана с деменцией, а у пациентов с болезнью Альцгеймера часто проявляются признаки паркинсонизма [193]. Таупатией также являются многие варианты паркинсонизма, в том числе паркинсоническая деменция [167, 382, 383]. Однако, в отличие от болезни Альцгеймера, где таупатия наблюдается более глобально в различных областях мозга, в случае болезни Паркинсона и паркинсонической деменции, таупатия ограничивается локально нигростриарным регионом [167]. Болезнь Паркинсона, согласно современным представлениям, относят также к группе шаперонопатий («конформационных» болезней) [37]. В частности, с болезнью Паркинсона и паркинсонизмом связаны малые белки теплового шока (БТШ) – кристаллины [12], белок шаперон-«цитокин» («шаперокин») Hsp 70, защищающий клетки от токсичных белков при болезни Паркинсона (например, от α-синуклеина) [417]. Существует необходимость достижения более глубокого понимания этиопатологии БП для разработки новых методов лечения, направленных на прекращение прогрессии заболевания, но с меньшим количеством побочных эффектов [40]. Нарушения развития мозга. Действие повреждающих факторов в пренатальном или раннем постнатальном периоде может существенным образом повлиять на механизмы развития головного мозга, которое представляет собой сопряженные процессы синаптогенеза, нейрональной пролиферации, дифференцировки и миграции клеток, лежащие в основе сложных форм поведения. Количество детей с аутизмом прогрессивно увеличивается в развитых 12 странах мира и достигает, по разным источникам, 5-20 на 10000 населения (классический аутизм) и 20-60 на 10000 населения (синдром аутизма) [241, 317]. Развитие признаков аутистического поведения характерно при действии ряда факторов в пренатальном периоде (вальпроевая кислота, липополисахарид и пр.), что может быть применено в эксперименте для оценки вклада механизмов нарушения развития головного мозга в патогенез нейродегенерации в зрелом мозге [318]. Степень разработанности темы исследования Известны общие механизмы патогенеза острой и хронической нейродегенерации: развитие воспаления и окислительного стресса [182, 257, 266, 304, 305], развитие реактивного астро- и микроглиоза [266, 358], нарушение проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) [104, 129, 240], митохондриальная дисфункция [266], эксайтотоксичность [232, 252], дисфункция нейрон-глиальных взаимодействий [340, 360], нарушение нейрогенеза [33, 93, 287], ведущие к клеточной гибели [33, 91]. Однако, данные о «молекулярных основах» патогенеза острой и хронической нейродегенерации и о взаимосвязи НАД+-зависимых механизмов с проявлениями нейродегенерации были изучены лишь в отношении экспрессии CD38 при аутизме [364]. Известны механизмы, которые могут быть предложены в качестве «мишеней» или «маркеров» при заболеваниях ЦНС [110, 270] и являются одними из наиболее интересных направлений исследований в этой области: НАД+-зависимые механизмы регуляции функциональной активности клеток головного мозга, играющие критическую роль в активации и функционировании нейроглиальных клеток в ответ на различные стимулы, с участием НАД +зависимых путей метаболизма (пуринергические рецепторы, НАД +- метаболизирующие ферменты, НАД(Ф)Н-оксидаза), контролирующих гомеостаз НАД+ и его биодоступность для других ферментов, участвующих в процессах матричных синтезов, репарации ДНК, эпигенетических модификациях ДНК и посттрансляционной модификации белков [159, 337]. 13 Молекулярные механизмы нейрон-астроглиальных взаимодействий, важные для реализации феномена метаболического сопряжения и глиоваскулярного контроля, что определяет значение локального микроокружения, формируемого астроцитами, для функционирования нейронов в (пато)физиологических условиях [81], поэтому идентификация событий, характеризующих нарушение нейронастроглиальной коммуникации, определит прогресс в разработке новых, эффективных методов нейропротекции [94, 146, 180, 290]. Молекулярные механизмы воспаления в ЦНС, которые играют роль в активации микроглии и астроглии, «запускают» локальную гиперпродукцию цитокинов, формирование инфламмасом, изменение экспрессии ряда молекул, определяющих характер межклеточных взаимодействий. Так, известно, что потенциальными терапевтическими мишенями при нейродегенерации могут являться молекулы, связанные с воспалением: цитокины (интерлейкины-1 α и β, интерлейкины-1 F5-F10, ФНО-α, ИФН-γ), HLA антигены, LDL рецепторы, P2X7 рецепторы, CD23, CD38, CD157, компоненты комплемента (MAC-1), ферменты iNOS, COX2, НАД(Ф)Н-оксидаза и миелопероксидаза [407]. Независимо от причины воспаления при нейродегенерации, терапевтические вмешательства, направленные на предотвращение или подавление этих механизмов, могут быть полезными для остановки прогрессии или развития патологического процесса, однако данные о механизмах развития воспаления при нейродегенерации или нарушениях развития мозга носят противоречивый и неполный характер [33]. До сих пор затруднено развитие современных методов диагностики, профилактики и терапии заболеваний центральной нервной системы вследствие недостаточной изученности клеточно-молекулярных механизмов повреждения головного мозга, молекул-маркеров патологических процессов, характеризующих общие компоненты патогенеза или обладающих специфичностью в отношении того или иного вида патологии [257, 270]. Таким образом, поиск общего и специфического при острой и хронической дегенерации, нарушениях развития головного мозга – был и остается одной из актуальных задач патофизиологии [202, 257, 270, 340]. Кроме того, существует 14 значительная потребность в оценке влияния дизрегуляции межклеточных взаимодействий на реализацию интегративных функций головного мозга, в том числе регуляцию сложных форм поведения при нейродегенерации и нарушениях развития мозга. Цель исследования Выявить вклад НАД+-зависимых механизмов дизрегуляции нейрон- глиальных взаимодействий и нарушения сложных форм поведения в патогенез ишемии головного мозга и хронической нейродегенерации (экспериментальная болезнь Паркинсона) в эксперименте. Задачи исследования 1. Изучить экспрессию молекул, участвующих НАД+-зависимых в механизмах внутриклеточной сигнализации и межклеточных взаимодействий (Р2Х7 рецепторы, CD38/НАД+-гликогидролаза, Cx43, CD157) в клетках нейрональной и глиальной природы при ишемии, хронической нейродегенерации. 2. Выявить изменения метаболического статуса и функциональной активности клеток нейрональной и глиальной природы при ишемии, хронической нейродегенерации. 3. Изучить особенности апоптоза при ишемии головного мозга, хронической нейродегенерации, нарушении развития мозга во взаимосвязи с изменением НАД+зависимых механизмов внутриклеточной сигнализации и межклеточных взаимодействий и механизмами нейровоспаления, контролируемыми НАД+зависимыми процессами в клетках глиальной природы. 4. Исследовать особенности нейрогенеза в различных регионах мозга при острой и хронической нейродегенерации. 5. Выявить специфические изменения, характерные для острой и хронической нейродегенерации на примере экспериментальных моделей ишемии головного мозга и болезни Паркинсона. 6. Оценить вклад изменения нейрон-глиальных взаимодействий в нарушение регуляции сложных форм поведения при ишемии, хронической нейродегенерации 15 (в том числе при действии фактора, индуцирующего нарушение развития мозга в пренатальном периоде). 7. Патогенетически обосновать теорию нейропротективной стратегии и этиопатогенетической терапии острой и хронической нейродегенерации, идентифицировав новые молекулы-маркеры и молекулы-мишени нарушения нейрон-глиальных взаимодействий и дополнить существующую концепцию патогенеза острой и хронической нейродегенерации, нарушения развития мозга новыми данными о механизмах нарушения нейрон-глиальных взаимодействий. Научная новизна исследования Впервые предложены новые молекулы-маркеры и молекулы-мишени для диагностики и фармакологической коррекции активности клеток нейрональной и глиальной природы при ишемии и хронической нейродегенерации. Впервые показаны особенности экспрессии НАД+-конвертирующих ферментов CD38 и CD157 в дофаминергических нейронах и клетках глии в среднем мозге во взаимосвязи с развитием характерной неврологической симптоматики при экспериментальной болезни Паркинсона и дана оценка изменения количества CD38-, P2X7-, Pgp-, Cx43-, CD157-, Mac-1, C3/C3bэкспрессирующих клеток нейрональной и глиальной природы при ишемии и хронической нейродегенерации. Охарактеризованы новые особенности нарушения НАД+-зависимых механизмов нейрон-астроглиального метаболического сопряжения (уровни НАД+, лактата, активность АДФ-рибозилциклазы) при ишемии и нейродегенерации. Впервые показаны особенности экспрессии маркера ранних этапов нейрогенеза и апоптоза клеток головного мозга при нарушении НАД+-зависимых механизмов межклеточных взаимодействий и развитии нейровоспаления при ишемии, хронической нейродегенерации. Выявлены новые особенности экспрессии НАД+-конвертирующих ферментов – CD38 и CD157 – в клетках нейрональной и глиальной природы при развитии нейровоспаления, в том числе во взаимосвязи с НАД+-транспортирующими 16 системами (Cx43) и молекулами, регулирующими провоспалительный потенциал клеток микроглии (Mac-1, C3/C3b). Впервые установлено, что действие фактора, нарушающего развитие головного мозга в пренатальном периоде (вальпроат-индуцированная модель аутизма) существенно меняет профиль неврологической симптоматики и реализации сложных форм поведения при развитии экспериментальной болезни Паркинсона, однако доминирующими остаются проявления нейродегенерации. Теоретическая значимость работы Теоретическая значимость работы состоит в установлении новых молекулярных механизмов патогенеза острой и хронической нейродегенерации: дополнены данные как о неспецифических механизмах патогенеза острой и хронической нейродегенерации (экспрессия сигнализации и взаимодействий межклеточных молекул [CD157, внутриклеточной CD38, Cx43], нейровоспаления [P2X7, Mac1, C3-C3b], схожие особенности клеточной гибели и нейрогенеза, повышение концентрации лактата и снижение НАД+), так и специфических особенностях их патогенеза (разнонаправленная метаболическая активность клеток: при ишемии головного мозга отмечается снижение АДФрибозилциклазной и функциональной активности клеток ЦНС, при болезни Паркинсона – их увеличение) и выявлении взаимосвязи между молекулярными механизмами и развитием неврологического дефицита при острой и хронической нейродегенерации. Практическая значимость и внедрение результатов Разработан новый метод регистрации функциональной активности клеток головного мозга по кинетике их аутофлуоресценции, рекомендуемый для применения при проведении экспериментальных исследований в нейробиологии, нейрофармакологии, нейрохимии. При последующей разработке персонифицированных методов диагностики и терапии ишемического повреждения и хронической нейродегенерации могут быть использованы полученные данные о молекулах-маркерах и молекулах-мишенях, 17 определяющих характер протекания НАД+-зависимых процессов внутриклеточной сигнализации и межклеточных взаимодействий (CD157, CD38, Cx43), нейровоспаления (P2X7, НАДФН-оксидаза, Mac1, C3-C3b). Уточненные механизмы развития ишемического повреждения головного мозга, хронической нейродегенерации (экспериментальная болезнь Паркинсона), ассоциированные с нарушением нейрон-глиальных взаимодействий и сложных форм поведения, существенно дополняют концепцию патогенеза повреждения клеток центральной нервной системы и нарушения интегративных функций головного мозга. Получен патент на изобретение: «Способ коррекции постишемической когнитивной дисфункции» (2008). Результаты проведенного исследования внедрены в научный процесс НОЦ «Трансляционная медицина» и НИИ молекулярной медицины и патобиохимии при ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава России (акт внедрения от 06.09.2013), учебный процесс кафедры биологической химии с курсами медицинской, фармацевтической и токсикологической химии ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава России (курс «Трансляционная медицина» на русском и английском языках для студентов 5 курса лечебного факультета, курс «Нейробиология развития. Новые молекулымаркеры и молекулы-мишени для диагностики и терапии заболеваний головного мозга» на русском и английском языках для аспирантов КрасГМУ, акт внедрения от 06.09.2013). Методология и методы исследования Работа носит экспериментальный характер. Материал исследования – крысы линии Wistar. Для решения поставленных задач выполнено моделирование острой и хронической нейродегенерации, поведенческое фенотипирование животных и оценка у них интегративных функций головного мозга, проведены физикохимические (флуориметрические и фотометрические методы) и клеточнобиологические (иммуногистоцитохимия, TUNEL, флуоресцентная и конфокальная 18 микроскопия) методы исследования на полученных образцах головного мозга; достоверность полученных данных подтверждена методами статистического анализа. Положения, выносимые на защиту 1. В патогенезе ишемического повреждения мозга и хронической нейродегенерации важную роль играют нарушения НАД+-зависимых механизмов внутриклеточной сигнализации и межклеточных взаимодействий, связанные с развитием астро- и микроглиоза, сопровождающиеся изменением экспрессии Р2Х7 CD38/НАД+-гликогидролазы рецепторов, и Cx43, с преимущественной локализацией CD38 в активированных астроцитах и уменьшением активности АДФ-рибозилциклазы при ишемии головного мозга, преимущественной локализацией CD38 в астроцитах и активированной микроглии и увеличением активности АДФ-рибозилциклазы при экспериментальной болезни Паркинсона. Маркерами нарушения нейрон-глиальных взаимодействий при ишемии и хронической нейродегенерации являются уровни лактата и НАД+ во внеклеточном пространстве, экспрессия CD38 и Cx43 в клетках нейрональной и астроглиальной природы, экспрессия CD157, Mac-1 и C3/C3b в клетках микроглиальной природы. Увеличение экспрессии CD38, Cx43 и P2X7 маркирует повреждение клеток «вторичного» характера (вследствие высвобождения активных метаболитов во внеклеточное пространство) при острой ишемии и хронической нейродегенерации. 2. Развитие ишемического повреждения и хронической нейродегенерации сопровождается появлением признаков повреждения ткани: увеличенная экспрессия Р2Х7 рецепторов, CD38, Mac-1 и C3/C3b, и признаков восстановления поврежденных клеток: увеличенная экспрессия Pax6 в гиппокампе или среднем мозге, экспрессия P-гликопротеина, снижение уровня НАД+, динамическое равновесие между которыми определяет развитие апоптоза клеток нейрональной и глиальной природы в поврежденной области мозга, а также неврологической симптоматики, характерной для ишемии или экспериментальной болезни Паркинсона. Увеличение экспрессии Mac-1 в среднем мозге при 19 экспериментальной болезни Паркинсона и в пораженной области коры мозга при ишемии сопровождается увеличением экспрессии C3/C3b, что свидетельствует о вкладе комплемент-опосредованного механизма повреждения клеток в патогенез острой и хронической нейродегенерации. CD11b/CD18 характеризует изменение Коэкспрессия CD157 с комплексом CD157-контролируемых механизмов регуляции уровня НАД+ в активированных клетках микроглии. 3. Экспрессия CD38 на клетках нейрональной и глиальной природы дифференцирует процессы, сопровождающие развитие острой и хронической нейродегенерации: при ишемическом повреждении мозга нейрональная экспрессия CD38 соответствует усилению нейрогенеза в коре и гиппокампе, а астроглиальная экспрессия CD38 характеризует интенсивность локального метаболизма НАД+; при болезни Паркинсона нейрональная и астроглиальная экспрессия CD38 соответствует реакции активированной микроглии, микроглиальная экспрессия CD38 характеризует интенсивность развития апоптоза в среднем мозге. Активность НАД(Ф)Н-оксидазы в клетках микроглии меняется однонаправленно с активностью АДФ-рибозилциклазы/CD38, причем при ишемии головного мозга активность ферментов уменьшается, а при экспериментальной болезни Паркинсона – увеличивается. 4. Нарушение взаимодействий, НАД+-зависимых определяющее механизмов чувствительность нейрон-глиальных клеток к действию апоптогенных стимулов, находит свое отражение в развитии неврологической симптоматики и поведения, специфически характеризующих повреждение клеток при острой ишемии и экспериментальной болезни Паркинсона (в том числе на фоне действия индуктора нарушения развития головного мозга в пренатальном периоде). 5. Направленная регуляция НАД+-зависимых механизмов межклеточных взаимодействий нуклеотидных достигается рецепторов применением Р2Х7 нейрональной и глиальной природы. подтипа, модуляторов активности НАД(Ф)Н-оксидазы в CD38, клетках 20 Степень достоверности полученных результатов Все научные положения и выводы обоснованы применением системного анализа поставленной проблемы, современных методов нейробиологии, достоверной выборкой исследуемых животных, большим объемом фактического материала, который подвергнут адекватному статистическому анализу. Апробация результатов Основные положения работы были доложены и обсуждены на школесеминаре для молодых ученых «Новые терапевтические стратегии: клеточномолекулярные мишени действия» в рамках Сибирского конгресса «Человек и лекарство» (Красноярск, 2009), IV,VI и VII Российско-Японских семинарах по нейронаукам (Красноярск, 2009, 2011, 2012), симпозиуме «Образование и интеграция специалистов в области медицинской генетики и молекулярной медицины» в рамках I Российского конгресса с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины – возможное и реальное» (Москва, 2010), 1 международной 3D онлайн-конференции «Фундаментальная медицина: от скальпеля - к геному, протеому и липидому» (Казань, 2011), международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2011), Школе молодых ученых «Экспериментальные модели заболеваний центральной нервной системы» в рамках выездного Пленума проблемной комиссии «Фундаментальные вопросы нейронаук» Научного Совета РФ по неврологии (Красноярск, 2011), III Съезде физиологов СНГ (Украина, Ялта, 2011), II Всероссийской Интернет-Конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии» (Казань, 2011), международном конгрессе «BITs 2nd Annual World Congress of NeuroTalk» (Dalian, China, 2011), I Международной ИнтернетКонференции «Медицина в XXI веке: тенденции и перспективы» (Казань, 2012), научных семинарах научно-образовательного центра «Трансляционная медицина», НИИ молекулярной медицины и патобиохимии КрасГМУ (Красноярск, 2010-2013). 21 Публикации по теме диссертации Результаты проводимых исследований опубликованы в 46 печатных работах, 16 из которых – в журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки РФ для публикации материалов диссертаций на соискание ученой степени доктора наук, 2 – в зарубежных изданиях, получен патент РФ на изобретение. Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 262 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав (обзор литературы, материал и методы, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов), выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Работа иллюстрирована 10 рисунками, 65 таблицами и 22 приложениями. Библиографический список состоит из 420 источников (68 отечественных и 352 зарубежных). Благодарности Автор благодарит старшего преподавателя кафедры биологической химии с курсом медицинской, фармацевтической и токсикологической химии КрасГМУ, к.м.н. Окуневу О. С. за совместную работу по постановке и оценке модели перинатальной гипоксии-ишемии, врача-хирурга операционного отделения ГБУЗ КККБ Лалетина Д. И. за помощь в создании хирургических моделей ишемии головного мозга, старшего лаборанта кафедры биологической химии с курсом медицинской, фармацевтической и токсикологической химии КрасГМУ Манторову Н. С. и научного сотрудника НИИ молекулярной медицины и патобиохимии КрасГМУ Фролову О. В. за помощь в уходе за животными и в выполнении спектрофлуориметрических исследований, врача-невролога и очного аспиранта кафедры биологической химии с курсом медицинской, фармацевтической и токсикологической химии КрасГМУ Панину Ю. А. за помощь в тестировании животных, лаборанта кафедры патологической анатомии им. проф. П. Г. Подзолкова КрасГМУ Сафину З. Г. за приготовление гистологических срезов головного мозга; заведующего кафедрой медицинской и 22 биологической физики КрасГМУ, д.ф.-м.н. Салмина В. В. за помощь в разработке и постановке флуориметрического метода оценки функциональной активности клеток головного мозга. Личный вклад автора Научные результаты, обобщенные в диссертационной работе Малиновской Н. А., получены самостоятельно. Диссертантом выполнено лично: определение цели, разработка конкретных задач работы и плана их выполнения; планирование экспериментов, составление экспериментального материала протоколов (результаты исследований; с использованием набор модели перинатального гипоксически-ишемического повреждения получены совместно с к.м.н. О. С. Окуневой); моделирование острой и хронической нейродегенерации у животных детского экспериментальных и взрослого животных; возраста; проведение осмотр контрольных и иммуногистоцитохимических исследований (удостоверение о краткосрочном повышении квалификации по программе «Клиническая иммунология с курсом иммуногистоцитохимии» №89, ФГУЗ «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины» МЧС России, Санкт-Петербург, 2006); проведение спектрофлуориметрических и спектрофотометрических исследований (диплом Н № 16659, степень магистра физики по направлению Физика, специализация Физика оптических явлений, ФГАОУ ВПО Сибирский федеральный университет, 2012); статистическая обработка материала исследований и интерпретация результатов; написание автореферата, текста диссертации, научных публикаций по теме работы. 23 ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Современные представления о патогенезе острой и хронической нейродегенерации Острая нейродегенерация встречается во время и после инсульта, преходящей остановки сердца, травмы мозга, инсулин-индуцированной гипогликемии и эпилептического статуса. Все эти тяжелые клинические состояния характеризуются кальциевой перегрузкой нейронов, аберрантной клеточной сигнализацией, образованием свободных радикалов и повышением уровня в клетках свободных жирных кислот, т.е. условиями, которые способствуют образованию пор для митохондриальной проницаемости (mtPTP) [82, 186]. Патологические каскады, ведущие к клиническим проявлениям хронической нейродегенерации (например, при болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, хорее Гентингтона и других), включают прогрессирующую потерю функционирующих синапсов, необратимое повреждение и потерю нейронов, нейротоксичность и избыточную активацию астроцитов (реактивный астроглиоз) и микроглии (нейровоспаление). Нейродегенерация ассоциирована с аксональной и синаптической дегенерацией, вызванных механическими, метаболическими, инфекционными, стимулами. токсическими, Несколько наследственными сигнальных путей и участвуют воспалительными в аксональной и синаптической дегенерации, но так и не идентифицирован интегративный механизм этих саморазрушающих процессов. Кроме того, нейродегенеративные события, как известно, связаны с изменениями межклеточных взаимодействий, экспрессии генов, динамикой нейронных сетей, развитием окислительного стресса, накоплением липидов и белковых продуктов окисления, производством биологически активных метаболитов жирных кислот, митохондриальной дисфункцией, поломкой множества сигнальных путей, активацией гибели клеток и т.д. [82, 351]. В целом, взаимосвязь между характером астроглиальной активации, 24 нейронального повреждения или репарации при нейродегенерации хорошо установлена [82, 397]. Последняя концепция включает в себя повреждение астроглия-связанных процессов: синаптогенеза и ликвидации синапсов, нейрогенеза и нейропластичности, функционирования нейронных сетей и гематоэнцефалического барьера, регуляции глиоваскулярного контроля и мозгового кровотока, изменение метаболизма нейронов, астроцит-зависимое усиление окислительного стресса (вследствие нарушения антиоксидантной активности), стимуляцию нейровоспалительного ответа (реакция микроглии), потенцирование эксайтотоксичности, митохондриальной и гликолитической недостаточности, нарушение глиального кальциевого гомеостаза, патологию нейроваскулярной единицы, реактивный астроглиоз (сопровождается образованием рубцов) и инициацию восстановления мозга [82, 83, 94, 95, 103, 107, 301, 334, 365, 371]. Интересным аспектом патогенеза нейродегенераций являются данные о роли инсулинорезистентности. На протяжении многих лет головной мозг рассматривался как орган, обладающий способностью утилизировать глюкозу без участия инсулина (инсулино-независимый орган). Однако, в течение последних лет, в связи с проведением многочисленных исследований в физиологических и патологических условиях, была пересмотрена роль инсулина в функционировании головного мозга [163]. Была показана экспрессия рецепторов инсулина в клетках головного мозга [233], причем их наибольшая экспрессия была выявлена в коре головного мозга, гиппокампе, миндалине, гипоталамусе, обонятельных луковицах, мозжечке [133]. Механизмы внутриклеточной сигнализации при активации рецепторов инсулина в головном мозге принципиально не отличаются от механизмов сигнальной трансдукции в других тканях [352]. Биологические эффекты инсулина в головном мозге включают регуляцию транспорта и метаболизма глюкозы, нейрито-, синапто- и нейрогенеза, биосинтеза белков, секреции нейротрансмиттеров, реализации процессов памяти, экспрессии рецепторов для нейротрансмиттеров, нейропротекторное воздействие путем ингибировнаия 25 апоптоза [113]. В физиологических условиях на поверхности клеток гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) отмечена экспрессия транспортеров инсулина (главным образом в гипоталамусе, коре головного мозга, обонятельных луковицах) [105], с помощью которых инсулин транспортируется через ГЭБ [312]. В физиологических (в процессе развития головного мозга) и некоторых патологических условиях (отдельные формы сахарного диабета) транспорт инсулина через ГЭБ усиливается, но в большинстве случаев при патологии (голодание, ожирение, старение, нейродегенеративные заболевания) транспорт, напротив, затруднен [105, 292]. Инсулин может оказывать нейропротекторное действие, которое реализуется через сиртуины (SIRT, НАД+-зависимые деацетилазы гистонов и негистоновых субстратов − p53, FOXO, NF-κB, Ku70, α-тубулина, ДНКполимеразы). Сиртуины считают внутриклеточными сенсорами уровня НАД+, регуляторами путей сигнальной трансдукции, связанными с гомеостазом НАД+ в клетках нейрональной и глиальной природы (кроме сиртуинов, гомеостаз уровня НАД+ обеспечивается активностью НАД+-генерирующих и утилизирующих НАД+ ферментов), регуляторами продолжительности жизни и процессов старения, синаптической пластичности и памяти, формирования поведенческих реакций при изменении метаболизма (однако последние роли в настоящее время подвергаются активным дискуссиям), факторами патогенеза хронической нейродегенерации (к примеру, болезни Альцгеймера и хореи Гентингтона) [289, 362, 380]. С другой стороны, в литературе недавно была описана негативная роль сиртуинов в развитии инсулинорезистентности [288], что может отражать участие других механизмов (к примеру, экспрессии CD38 и CD157 на клетках ЦНС) в патогенезе инсулинорезистентности и нейродегенерации, являющихся объектом регуляции различными агентами (цитокины, нейротрансмиттеры, агенты, изменяющие процессы дифференцировки) [32] и отражающими гомеостаз внутриклеточного уровня НАД+ [150]. Инсулинорезистентность - снижение чувствительности к действию инсулина или ухудшение его действия на клетки- 26 мишени соответствующих тканей [147]. Выявлена роль инсулина, нарушения гомеостаза глюкозы и развития инсулинорезистентности не только в патогенезе сахарного диабета 2 типа, метаболического синдрома, но нейродегенерации [416]. У пациентов с инсулинорезистентностью отмечено увеличение потребления глюкозы головным мозгом при высоком уровне инсулина в плазме крови. Интересно, что уменьшение уровня инсулина в плазме крови не снижает потребление глюкозы головным мозгом, что предполагает вовлеченность не только системных, но и локальных механизмов продукции и действия инсулина в регуляции метаболизма клеток ЦНС. Инсулинорезистентность в головном мозге может развиваться на нескольких регуляторных уровнях (на этапе доставки инсулина через ГЭБ, этапах секреции и рецепции инсулина) [165, 404]. В литературе появляются данные о роли в патогенезе инсулинорезистентности хронического воспаления, изменения чувствительности рецепторов врожденного иммунного ответа и формирования инфламмасом [223, 270]. Недавно появилось новое понятие «метаболико-когнитивный синдром», связывающий развитие метаболического синдрома с когнитивной дисфункцией в патогенезе нейродегенерации (понятие изначально появилось для обозначения нарушений при болезни Альцгеймера, но в последующем было интерпретировано и на другие виды нейродегенерации) [234, 261, 342]. Так, нарушение толерантности к глюкозе было зарегистрировано примерно уполовины пациентов с болезнью Паркинсона, однако развитие инсулинорезистентности менее характерно для БП, в отличие от Альцгеймеровской деменции. Снижение дофамина в клетках инсулинорезистентности, среднего что связано мозга с способствует нарушением развитию фосфорилирования некоторых белков [157, 314]. Кроме хронической нейродегенерации у взрослых, заболевания аутистического спектра нарушают механизмы внутриклеточной сигнализации при активации рецепторов инсулина, что может быть обусловлено дизрегуляцией PTEN-, PI3K- и mTOR-контролируемых механизмов [370]. 27 Инсулинорезистентность также является фактором риска развития острой нейродегенерации (является маркером формирования инсульта, маркирует развитие интракраниального атеросклероза у пациентов с ишемическим инсультом без сахарного диабета, является прогностически неблагоприятным фактором рецидива ишемического инсульта или развития ишемической болезни сердца у больных, перенесших инсульт) [226]. Таким образом, в патогенезе острой и хронической нейродегенерации, кроме ранее известных механизмов (реактивный астро- и микроглиоз, воспаление, окислительный стресс, дисфункция митохондрий и др.), немаловажную роль могут играть и недавно выявленные сигнальные механизмы (роль инсулина, метаболизма глюкозы и НАД+) развития инсулинорезистентности. 1.1.1 Особенности развития головного мозга, влияющие на патогенез нейродегенерации в раннем и зрелом мозге В физиологических условиях развитие головного мозга скоординированные процессы пролиферации, дифференцировки включает и миграции клеток, нейро- и синаптогенеза, нейрон-глиальных взаимодействий, дизрегуляция которых лежит в основе патогенеза многих заболеваний. Нарушения развития головного мозга зачастую связаны с нарушением пренатального периода развития или раннего детства, оказывая существенное влияние на здоровье человека в детстве или юности, могут исказить нормальный ход развития мозга и иметь своим результатом спустя время формирование патологии головного мозга [33]. При развитии ЦНС выделяют 3 основных этапа: индукцию нейроэктодермы, нейруляцию и региональную специализацию. Эмбриональный нейрогенез характеризуется высоким уровнем пролиферативной и миграционной активности клеток во всех регионах головного мозга, формированием из стволовых клеток всех видов новых клеток глии и нейронов. В отличие от эмбрионального, нейрогенез во взрослом организме присутствует только в отдельных регионах мозга и характеризуется образованием некоторых видов глии и нейронов. Как эмбриональный, так и взрослый нейрогенез находится под 28 контролем различных эндогенных и экзогенных факторов [33, 144]. Кроме нейрогенеза, в развивающемся и зрелом мозге имеются также отличия в функционировании лимбико-гипоталамо-гипофизарной системы, ответа на стресс, реализации процесса клеточной гибели и нейрон-глиальных взаимодействий [33, 91, 184]. В литературе появились новые данные о влиянии нейропептида окситоцина (ОТ), а не только глюкокортикоидов, на координацию и функционирование основных компонентов лимбической системы (гипоталамус, миндалина, гиппокамп, лимбическая кора). Накоплены доказательства роли окситоцина в регуляции интегративных функций головного мозга (социального распознавания и взаимодействия) у животных и человека: OT играет роль в регуляции поведения, ответа на стресс, запоминания и механизмах памяти, отвечает за формирование родительского поведения, взаимоотношений матери и ребенка и социальных связей. Эффекты окситоцина могут быть связаны с влиянием на нейрогенез и процессы нейропластичности. Нарушение молекулярных механизмов секреции ОТ в эмбриональном или раннем постнатальном периоде способствует формированию аутистического типа поведения, причем самыми уязвимыми являются пренатальный и ранний постнатальный периоды развития [33, 318, 298]. В последние годы появились новые доказательства того, что ряд факторов, влияющих на развивающийся мозг, могут вызывать отдаленные по времени эффекты за счет воздействия на процессы нейрогенеза. Например, неонатальная гипоксия вызывала увеличение пролиферации клеток в отдельных регионах мозга в экспериментах на животных, что связывают в последующем с риском развития шизофрении, депрессии, нейродегенерации [33]. Малоизученным при болезни Паркинсона являются данные по нарушению развития мозга в патогенезе этого заболевания. Известны некоторые черты, делающие патогенез болезни Паркисона (хронической нейродегенерации позднего периода развития головного мозга – «зрелого мозга») очень схожим с патогенезом аутизма, хронической нейродегенерации раннего периода развития 29 головного мозга (раннего мозга). Так, в их симптомах (повторяющееся компульсивно-импульсивное поведение) [284] и патогенезе прослеживаются общие черты: в виде гипофункции дофаминергической системы (снижение THпозитивных нейронов в стриатуме) [219], нейровоспаления, дисфункции нейронглиальных взаимодействий, нейрогенеза и нарушения проницаемости гематоэнцефалического барьера, в патогенезе аутизма и болезни Паркинсона также возможно общее нарушение детоксикации некоторых химических веществ, в частности, рассматривается предполагаемая роль пестицидов в патогенезе аутизма [418]. Сходства и различия заболеваний, связанных с острой и хронической нейродегенерацией, представлены в приложении А. «Стресс раннего периода жизни», связанный с воздействием стрессогенных факторов во всех периодах развития головного мозга, связан с патогенезом аутизма, депрессии и хронической нейродегенерации, а отделение потомства от матери является одной из моделей депрессии. Такой вид стресса оказывает влияние не только на развитие потомства в отдаленном периоде жизни, но и на состояние матери. Негативное влияние стресса раннего периода жизни на развивающийся мозг связывают с изменением механизмов эпигенетической регуляции, регуляции экспрессии белков синаптопластичности, развитием митохондриальной дисфункции и нейродегенерацией отдельных регионов мозга (например, в результате ингибирования протеасом и протеасом-убиквитиновой деградации белков), что, по ряду признаков напоминает патогенез нейродегенеративных заболеваний у взрослых [33, 184]. Известно, что стресс раннего периода жизни нарушает формирование агрессивного поведения у самцов животных, не влияя на социальное распознавание, но изменяет социальное поведение самок. Усиление агрессивности при стрессе может быть связано с адаптацией организма к действию стрессоров, однако избыток агрессии у самцов животных приводит к их ранней гибели, а у самок – к жестокому обращению со своим потомством [33]. Интересны особенности клеточной гибели в развивающемся мозге. Благодаря апоптозу происходит гибель клеток головного мозга в процессе 30 нейрогенеза (к примеру, у человека к 28 неделе эмбрионального развития присутствует большое количество нейронов в коре головного мозга, которое затем снижается на две трети от исходного уровня путем апоптоза) [91]. В то же время, гибель клеток (в частности, апоптоз) является важным компонентом повреждения головного мозга в процессе его эмбрионального развития, что связано с активацией каспазы-3 и ПАРП, высоко экспрессируемых в неонатальном периоде развития. Запуск апоптоза также может быть связан с активацией микроглии и развитием нейровоспаления, что усугубляет повреждение головного мозга путем продукции провоспалительных цитокинов [305], активацией НАД+-конвертирующих ферментов CD38 или CD157 [280] или стресс-реагирующих киназ (к примеру, протеинкиназы JNK, являющейся регулятором резистентности к инсулину при ожирении). Так, активация JNK предшествует апоптотической гибели клеток и воспалению многих типов клеток при нейродегенерации. Однако пока не известно, усугубляет ли избыточный вес апоптоз, активацию микроглии и повреждение ГЭБ, к примеру, путем гиперактивации JNK в неонатальном мозге [305]. Особенностью развития нейродегенерации в зрелом мозге является влияние процесса старения на их патогенез, что может быть связано с увеличением количества GFAP-позитивных клеток (астроглиоз) и их гипертрофией в гиппокампе, потерей их радиальной организации. В процессе старения движению веществ препятствуют более узкие щели, что частично компенсируется за счет снижения диффузии барьеров, которые могут быть образованы макромолекулами внеклеточного матрикса. Параметры диффузии могут повлиять на эффективность синаптической и внесинаптической передачи аккумулированных веществ, они распространяются от источника медленнее и вызывают повреждение нервных клеток, если эти вещества достигают токсических концентраций. Диффузионные параметры также имеют важное значение в «перекрестах» («сшивках») между синапсами, которые развиваются с возрастом. Наблюдаемые изменения в параметрах диффузии в процессе старения функциональному дефициту и потере памяти [379]. могут способствовать 31 Активированная микроглия присутствует в мозге пациентов с болезнью Паркинсона и может быть вовлечена в патогенез этой патологии. Что касается физиологического старения, при нем чаще отмечается астроглиальная активация. Однако при старении активация микроглии может быть связана с изменением электрической активности, включая чувствительность ионных каналов к внеклеточному (например, калию, ФНО), что или вызывает увеличение эпилептиформную продукции активность, цитокинов блокирование проводимости. В белом веществе активация микроглии при старении может быть довольно частой причиной или следствием последующих изменений олигодендроглии, связанных с хронической прогрессирующей демиелинизацией. Еще одним фактором, вызывающим активацию микроглии и развитие нейровоспаления, наблюдаемые при старении мозга, может быть окисление липидов в миелиновой оболочке [381]. Таким образом, нейрогенез и нейрон-глиальные взаимодействия в развивающемся и зрелом мозге – ключевые механизмы нейропластичности, являющиеся объектом регуляторного влияния большого числа гормонов, цитокинов, факторов роста. Дизрегуляция эмбрионального нейрогенеза и нейрогенеза после рождения характерна для нарушений развития головного мозга, что играет важную роль в инициации и прогрессировании острой и хронической нейродегенерации во взрослом состоянии [184]. 1.1.2 Особенности патогенеза острой и хронической нейродегенерации Результатом развития нарушений функций ЦНС является необратимое повреждение клеток или нарушение их функциональной активности, что клинически проявляется формированием в сенсорной, моторной и когнитивной сферах дисфункции, обусловленной, в значительной степени, нарушениями процессов синаптопластичности, индукцией апоптоза нейронов и глиальных клеток, дизрегуляцией механизмов синтеза, секреции и рецепции нейротрансмиттеров, нарушением функционирования гематоэнцефалического барьера и дисфункцией нейрогенеза [39, 251, 298]. 32 В литературе существует 2 понятия, связанных с функционированием клеток нервной системы – «гематоэнцефалический барьер» и «нейроваскулярная единица». Под гематоэнцефалическим барьером (ГЭБ) понимают совокупность клеток, участвующих в формировании мозгового капилляра (эндотелиоциты и перициты) и взаимодействующих с ними клеток ЦНС (астроциты), которые тесно переплетены друг с другом и обеспечивают избирательную проницаемость лишь для некоторых низкомолекулярных веществ. Нейроваскулярная единица (НВЕ) представляет собой функциональную единицу головного мозга, состоящую из клеток капилляров (эндотелиоциты и перициты), астроцитов и нейронов [35, 69, 214, 215]. Наличие барьера между головным мозгом и кровью ограничивает транспорт в мозг потенциально токсичных и опасных веществ, обеспечивает удаление эндогенных метаболитов, транспорт газов и питательных веществ к клеткам головного мозга, контролирует миграцию клеток, обеспечивает гладкую поверхность эндотелия сосудов, изолирует головной мозг от контроля иммунной системы («иммунопривилегированный орган») и позволяет лишь некоторым мононуклеарным клеткам мигрировать в ЦНС [35, 88, 209]. Заболевания ЦНС (ишемия, гипоксия головного мозга, травмы и опухоли, нейродегенеративные заболевания) приводят к изменению проницаемости ГЭБ, которая носит избирательный характер и часто является причиной неэффективной фармакотерапии [33, 45, 108]. При острой нейродегенерации (ишемическое и инфекционное поражение головного мозга, черепно-мозговые травмы, церебральная гипоксия-ишемия) обнаружены следующие изменения функций гематоэнцефалического барьера: нарушение целостности и проницаемости ГЭБ [375], его повреждение вследствие апоптоза нейронов и нейровоспаления [305], повышения проницаемости капилляров и/или нарушения плотных контактов ГЭБ [45, 104, 214]. Хроническая нейродегенерация (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, аутизм, шизофрения) и эпилепсия характеризуются дисфункцией ГЭБ, связанной с нарушением структуры плотных контактов и дизрегуляцией белков- 33 транспортеров. Кроме того, при аутизме изменение проницаемости ГЭБ связывают с активацией процесса трансэндотелиальной миграции лейкоцитов и появлением в крови циркулирующих аутоантител к фетальным белкам головного мозга, последнему также способствует наличие стресса и воспаления. Интересно, что снижение уровня растворимой формы молекулы эндотелиального происхождения – CD31 (sPECAM-1), которая контролирует процессы роллинга и миграции лейкоцитов через клетки эндотелия, коррелирует с выраженностью поведенческих нарушений у детей с аутизмом [45, 129, 240, 318]. Дисфункция ГЭБ в процессе эмбрионального развития головного мозга главным образом связана с нарушением эмбрионального нейрогенеза, не менее интересным является изучение изменения функций и структуры барьера при физиологическом старении и при патологии зрелого и стареющего мозга (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и другие) [45, 354, 385, 399]. Раньше считалось, что при болезни Паркинсона не страдает гематоэнцефалический барьер, однако позже было обнаружено увеличение проницаемости ГЭБ в черном веществе среднего мозга и стриатуме, что связано с микроповреждениями сосудов, скоплением активированной микроглии, изменением экспрессии белков межклеточных контактов и транспортных белков. В процессе активации мироглии высвобождаются провоспалительные цитокины, индуцируя изменение экспрессии белков плотных контактов ZO-1 и окклюдина. Гиперэкспрессия белков клеточной адгезии при воспалении облегчает миграцию иммунных клеток в область повреждения, увеличивая тем самым проницаемость ГЭБ. У пациентов с БП обнаружено снижение активности одного из транспортных белков ГЭБ P-гликопротеина, что привело к повышению проницаемости ГЭБ [45, 114]. P-гликопротеин трансмембранным (Pgp, белок транспортером, лекарственной удаляющим устойчивости) химические является вещества из цитоплазмы клеток. В литературе описано, что гиперэкспрессия Р-гликопротеина приводит к развитию полирезистентности к различным лекарственным препаратам при некоторых заболеваниях (бронхиальная астма, злокачественные 34 опухоли - рабдомиосаркомы, остеосаркомы) [15, 34, 36, 65, 218, 319, 332]. В литературе была описана экспрессия Pgp на эндотелиоцитах сосудов головного мозга, в некоторых работах – на астроцитах и нейронах. Известно, что локализация Pgp на эндотелиоцитах играет роль в биодоступности многих веществ (в том числе и лекарственных) для головного мозга. Было высказано предположение, что при болезни Альцгеймера Р-гликопротеин может играть роль в элиминации Aβ белков [67, 127, 254, 285]. Таким образом, иммунологическая дисфункция и нейровоспаление являются основными факторами нарушения целостности ГЭБ при острой и хронической нейродегенерации. Особенности функционирования гематоэнцефалического барьера/нейроваскулярной единицы при острой и хронической нейродегенерации развивающегося и зрелого мозга представлены в приложении Г. В патогенезе ишемии головного мозга и гипоксически-ишемического перинатального поражения ЦНС в литературе был показан этапный характер развития событий, где каждый этап характеризуется определенными клеточномолекулярными событиями: нарушением электровозбудимости нейронов и расстройствами микроциркуляции, окислительным стрессом и гиперпродукцией цитокинов, изменением секреции и рецепции нейротрансмиттеров, развитием апоптоза и некроза [18, 144, 232]. Травма центрального белого вещества является одной из основных причин функциональной поломки при цереброваскулярных заболеваниях. Повреждение белого вещества как следствие гипоксически-ишемического повреждения происходит при перивентрикулярной лейкомаляции в неонатальном периоде, при инсульте и сердечной недостаточности у взрослых, при сосудистой деменции в процессе старения мозга. Действительно, скорость обмена веществ в белом веществе лишь немного ниже, чем у серого вещества, белое вещество может быть повреждено даже при краткой ишемии. Энергетическая недостаточность при ишемии приводит к пробою ионного градиента, деполяризации мембраны и в конечном итоге приводит к кальциевой перегрузке цитозоля клетки, которая 35 активирует Са2+-зависимые ферменты (кальпаины, фосфолипазы и другие ферменты) в результате необратимых повреждений глии и аксонов белого вещества [232, 252]. Перивентрикулярная лейкомаляция является основным нейропатологическим поражением у недоношенных детей и включает в себя фокальный некроз белого вещества и последующуе гипомиелинизацию. Ее патофизиология является многофакторной и включает в себя гипоксию-ишемию, индуцированную глутаматной эксайтотоксичностью, окислительным стрессом и нейровоспалением. Перинатальная ишемия вызывает, в дополнение к глутаматной эксайтотоксичности, смертельную активацию P2X7 рецепторов у предшественников олигодендроцитов [232, 252]. Во время ишемии головного мозга метаболическая активность мозговых клеток подавляется, а, следовательно, повреждается и структурная целостность клеток вследствие эксайтотоксичности, активации нескольких окислительного стресса, механизмов: стрессовой глутаматной сигнализация, нейровоспаления и клеточной гибели [252]. Известно, что в физиологических условиях модулированная возбуждающая стимуляция является важным трофическим фактором для нейронов, с одной стороны, и может привести к гибели клетки при перинатальной гипоксииишемии, с другой стороны. Эксайтотоксичность обеспечивается избыточным накоплением глутамата, приводя к гиперактивации глутаматных NMDAрецепторов, способствуя увеличению концентрации кальция в цитозоле и запуску кальций-зависимых механизмов клеточной деградации [49, 295]. Ключевым событием в патофизиологии острой и хронической нейродегенерации является окислительный стресс, индуцированный снижением поступления кислорода или, наоборот, его поступлении при реперфузии ишемизированной области [94, 306]. Избыточная продукция свободных радикалов превышает физиологическую способность клеток к детоксикации путем выработки антиоксидантов, что вызывает вторичные необратимые повреждения белков, липидов и нуклеотидов, что и индуцирует гибель клеток путем апоптоза и 36 некроза. Астроциты, антиоксидантной как защиты известно, в являются предотвращении основным гибели источником нейронов после ишемического инсульта [85, 94, 409], вследствие этого реактивный астроглиоз коррелирует с увеличением гибели нейронов [94, 96]. Особенности метаболизма нейронов и астроцитов сказываются на различной чувствительности этих видов клеток к повреждающему действию гипоксии/ишемии [323]. Так, астроциты, в отличие от нейронов, более устойчивы к повреждению [389]. Несмотря на то, что повреждение астроцитов и олигодендроцитов наблюдается уже в начальном периоде ишемического повреждения мозга, особенности функционирования митохондрий нейронов и клеток глии способствуют большей устойчивости глиальных клеток к повреждающему действию гипоксии: подавление активности компонентов дыхательной цепи в митохондриях глиоцитов значительно менее выражено, чем в митохондриях нейронального поисхождения [49, 103]. Еще одним универсальным механизмом острой и хронической нейродегенерации (травма, инсульт и т.д.) является нейровоспаление. Эта универсальность обусловлена тем, что независимо от исходного стимула, активация основных клеток нейровоспаления, микроглии, сопровождается однотипными изменениями экспрессии генов и активности белков и является таким образом «программной» реакцией. Поэтому во всех случаях, независимо от вида заболевания, нейровоспаление характеризуется резко возрастающей продукцией провоспалительных цитокинов, индукцией экспрессии молекул адгезии (интегрины, селектины, кадгерины), активацией протеаз и ферментов (индуцибельная NO-синтаза, НАД(Ф)Н-оксидаза, миелопероксидаза, циклооксигеназы 1 и 2 типов и т.д.), генерирующих низкомолекулярные медиаторы воспаления (оксид азота, активные формы кислорода и азота, эйкозаноиды) [43, 76]. Другим универсальным компонентом патогенеза нейродегенерации является дисфункция нейрогенеза. Догма, что взрослый мозг млекопитающих не способен к клеточному самовосстановлению, наконец, была преодолена, когда 37 генерация новых нейронов в головном мозге взрослых была описана для латеральных стенок боковых желудочков (субвентрикулярная зона, SVZ) и в зернистом слое зубчатой извилины гиппокампа (субгранулярная зона, SGZ). SVZ является важным зародышевым слоем, наиболее заметным в латеральных стенках боковых желудочков. SVZ содержит самый большой бассейн делящихся нейрональных предшественников/стволовых клеток (NSCs) во взрослом мозге всех млекопитающих, в том числе человека [93]. Многие нейробиологи придерживаются мнения, что в ЦНС взрослых млекопитающих новые нейроны образуются не только в SVZ и SGZ. Присутствие включающих метку в ДНК и делящихся прогениторных клеток, фенотипически сходных с дифференцирующимися в нейральном направлении клетками герминативных зон, продемонстрировано в коре мозга, миндалине, стриатуме, черной субстанции. Интенсивность нейрогенеза в этих структурах значительно ниже, чем в SVZ, обонятельной луковице и гиппокампе. Тем не менее, например, в черной субстанции мыши, количество вновь образующихся нейронов достаточно для полного обновления их популяции в течение жизни животного [68]. Важную роль в нейрогенезе играет транскрипционный фактор Pax6, мультифункциональный регулятор, контролирующий дифференцировку нейронов, их пролиферацию и созревание, глиогенез (в частности, он ингибирует пролиферацию и способствует созреванию астроцитов) [138, 190, 269, 316, 350]. Известно, что экспрессия Pax6 отмечается в стволовых клетках- предшественниках (радиальная глия) и является одним из наиболее ранних маркеров нейрогенеза [268]. Во взрослом головном мозге отмечается экспрессия Pax6 в тех регионах мозга, где происходит интенсивный нейрогенез (SVZ, SGZ, кора головного мозга, средний мозг) [205, 303]. Показано, преимущественно что на 11 день экспрессируется эмбрионального в развития пролиферирующем (E11) Рах6 нейроэпителии желудочков переднего и заднего мозга, а также в области основания и ретикулярной формации среднего мозга. В эти же сроки в основании среднего 38 мозга появляются дифференцированные тирозингидроксилаза-позитивные (TH) нейроны, где также отмечена экспрессия Рах6. Однако очевидной колокализации ТН и Рах6 не было обнаружено. Вероятнее всего, Pax6 играет ключевую роль в специализации нейрональных предшественников, созревании и поддержании зрелых нейронов. Большинство Рах6-позитивных групп клеток сохраняется и во взрослом мозге, но интенсивность экспрессии Рах6 становится менее выраженной. В головном мозге взрослых Рах6 локализуется в нейронах некоторых подтипов [367]. Исследования, проведенные на различных моделях болезней животных, убедительно показали, что SVZ и SGZ могут реагировать на повреждения взрослого мозга, производя новые клетки-предшественники, которые могут мигрировать к поврежденным участкам головного мозга участки, которые были повреждены в результате нейродегенерации или травм головного мозга. В ответ на нейродегенерацию при хорее Гентингтона, эпилепсии, рассеянном склерозе и инсультах, повышение регуляции продукции клеток-предшественников, уровня цитокинов и миграционных белков в SVZ, приводит к увеличению числа нейронов «взрослого» происхождения. В противоположность этому, при болезни Альцгеймера и Паркинсона снижается число пролиферирующих клеток SVZ [93]. После разрушения нигро-стриатального пути (поражение черного вещества) некоторые предшественники из SVZ начинают экспрессировать тирозингидроксилазу (TH) и нейрональные маркеры (NeuN). Трансплантация хромаффинных клеток в денервированный стриатум увеличивает количество тирозингидроксилаза-позитивных клеток [287]. До сих пор вызывает активные дискуссии вопрос, происходит ли дофаминергический нейрогенез в черном веществе взрослого мозга в физиологических условиях или при болезни Паркинсона. С одной стороны, было обнаружено, что дофаминергическая дифференцировка происходит в черной субстанции здоровых мышей и этот процесс увеличивается после повреждения MPTP. Базальный уровень нейрогенеза, повышенная пролиферация и дофаминергическая дифференцировка после приложения MPTP также были продемонстрированы в нестин-LacZ 39 трансгенных мышах, хотя уровни дофаминергической дифференцировки были достаточно низкими. С другой стороны, некоторые группы не смогли подтвердить самостоятельно нейрогенез у здоровых мышей или при приложении 6-OHDA у крыс. В нескольких лабораториях были получены результаты, что 6-OHDA или МРТР повреждения у мышей привели к пролиферации клеток в черном веществе без дофаминергической дифференцировки. До сих пор остается спорным вопрос о происхождении пролиферирующих клеток черного вещества. Они могут быть получены из клеток-предшественников паренхимы мозга или из предшественников, выстилающих церебровентрикулярную систему [139, 268]. При фокальной ишемии головного мозга нейрогенез отмечается в субвентрикулярной зоне на стороне повреждения головного мозга спустя 1-2 недели с момента моделирования ишемии головного мозга, но снижается спустя 6 недель с момента повреждения. Однако около 80% вновь образованных нейронов в стриатуме умирают в течение первых 2 недель после их образования. Механизмы, лежащие в основе этой гибели, полностью не изучены. Предполагается, что эта гибель может быть связана с активностью каспаз и запуском апоптоза клеток. Вероятно также цитотоксическое действие повреждающих факторов («хроническая» активация микроглии, окислительный стресс, глутаматная эксайтотоксичность, действие провоспалительных цитокинов и др.). В частности, спустя 2 часа с момента развития ишемии головного мозга в поврежденных регионах отмечено появление активированной микроглии, причем активация микроглии сохраняется вплоть до 16 недель с момента развития ишемии. Таким образом, ишемия головного мозга приводит к долгосрочным перестройкам в нише стволовых клеток в SVZ. Согласно литературным данным, не очень выраженный нейрогенез отмечается также в коре головного мозга при развитии ишемии. Нейрогенез в среднем мозге при болезни Паркинсона может происходить и при участии клеток-предшественников, мигрирующих из специализированных ниш (зубчатая извилина гиппокампа, субвентрикулярная зона) [268]. Нейротрофины могут играть важную роль в нейрогенезе и содействуют 40 выживаемости нейронов и модуляции синаптической пластичности. Например, нейротрофин CNTF стимулирует нейрогенез в гипоталамусе. Хотя эти результаты представляют значительный интерес для регенеративной терапии, все еще до конца не ясны биологические механизмы, лежащие в основе этих воздействий на ниши стволовых клеток взрослого мозга [194]. Клеточная терапия болезни Паркинсона направлена на экзогенную замену дофаминергических клеток путем трансплантации фетальных клеток среднего мозга в стриатум, основную область проекции черного вещества. Тем не менее, такой подход обладал переменным успехом. При трансплантации экзогенных клеток возникали серьезные проблемы: недостаточное количество дофаминергических нейронов в трансплантате, иммунологические реакции отторжения, возможный отказ клеток интегрироваться в головной мозг и низкий процент выживания трансплантированных клеток [384]. Воздействие же на эндогенный нейрогенез может являться терапевтическим методом лечения острой и хронической нейродегенерации. Так, было высказано предположение, что клеточная замена погибших клеток путем стимуляции эндогенных стволовых клеток/клеток-предшественников может быть полезна для терапевтического вмешательства при нейродегенеративных заболеваниях, в том числе болезни Паркинсона. Во взрослом черном веществе активно делящиеся клетки-предшественники приводят к образованию новых зрелых глиальных клеток, но не нейронов. Тем не менее, после их удаления из черного вещества, эти клетки-предшественники обладают потенциалом дифференцировки в нейроны. Трансплантация недавно выделенных клеток-предшественников в гиппокамп взрослого мозга показала, что эти клетки также могут дифференцироваться в нейроны. Эти результаты показывают, что клетки-предшественники имеются во взрослом черном веществе и могут привести к появлению новых нейронов, когда поступает соответствующий сигнал [384]. Особенности нейрогенеза при острой и хронической нейродегенерации представлены в приложении Г. 41 1.2 Интегративные функции головного мозга и тесты для их оценки Поведение человека является продуктом его взаимодействия с другими члненами социума, формирования социальных связей и взаимоотношений, коллективных форм поведения и сотрудничества. Сложные формы поведения (высшая нервная деятельность, интегративная деятельность мозга) животных также включают в себя социальные (социальная память и социальное распознавание, формирование связей, сексуальное и родительское поведение, социальное предпочтение, межсамцовые взаимодействия/агрессия и конкуренция) и несоциальные (обучение и память/пространственная и непространственная, тревога и депрессия) формы поведения [1, 61, 373]. Основные качества социального поведения определяются генотипом, однако эти качества находятся также под контролем внешней среды и социального окружения. С одной стороны, поведенческие реакции, в том числе и социальное поведение, контролируются разнообразными генами. С другой стороны, само социальное поведение может влиять на экспрессию генов, работу нейротрансмиттерных систем и нейропластичность. Обнаружены возможные молекулярные механизмы регуляции социального поведения: повышение уровня белка BDNF в прилежащих ядрах мозга и увеличение уровня мРНК моноаминооксидазы А и серотонинового транспортера в ядрах шва среднего мозга наблюдается у самцов «побежденных» мышей при агрессивном столкновении с более сильным партнером. В то же время, у самцов«победителей» увеличивалась экспрессия генов тирозингидроксилазы и дофаминового транспортера в вентральной тегментальной зоне мозга при снижении экспрессии генов каппа-опиоидных рецепторов [25]. Другим нарушении молекулярным социального механизмом, поведения, играющим являются роль нейропептид в регуляции окситоцин, необходимый для социального распознавания особей, и молекула CD38. Показано, что CD38 может регулировать выброс окситоцина у мышей. У CD38нокаутных мышей наблюдалась социальная амнезия, сходная с расстройствами аутистического спектра [364]. 42 Поведенческое поведенческих фенотипирование качеств животных лабораторных – комплексная животных, оценка разработанная для стандартизации сбора и интерпретации данных о поведенческих особенностях отдельных грызунов для обнаружения нарушений функционирования ЦНС (начиная с элементарных реакций и рефлексов, заканчивая сложными тестами для оценки эмоционально-психической сферы). Для дифференцировки разнообразных тестов нейропсихических функций животных они были условно разделены на тесты для оценки моторной и сенсорной сфер, для выявления эмоциональных, социальных и «интеллектуальные» компонентов [1]. К тестам поведенческого фенотипирования и оценки интегративных функций животных можно отнести моторные (локомоторная активность, мышечная сила, баланс, особенности походки, моторика передних и задних лап), сенсорные тесты (слух, зрение, обоняние, тактильная и болевая чувствительность), тесты для оценки эмоционального поведения (на тревожность и депрессию, эмоциональность) и интеллекта (пространственная и непространственная, рабочая и справочная память, внимание, обучение, элементарная рассудочная деятельность). Кроме поведенческих тестов, при оценке состояния животных с моделями острых и хронических нейродегенераций, необходимы тесты для подтверждения развития этих моделей. Спектр тестов (поведенческих и неврологических), оцениваемых у крыс, представлен в приложении Е. 1.2.1 Когнитивные функции головного мозга Процессы памяти и способности к обучению тесно взаимосвязаны, определяя объем оперировать. информации, Согласно которым классификации, индивид может различают единовременно кратковременную и долговременную память, эксплицитную (декларативная память, на события; делится, в свою очередь, на пространственную и непространственную) и имплицитную (процедурная память, на действия, делится на ассоциативную и неассоциативную), что отражает различные по строению, механизмам кодирования, хранения, обработки и воспроизведения информации, нейрон- 43 глиальные сети [1]. 1.2.2 Социальное поведение Социальное поведение – поведение, связанное с социумом и требующее для своего выражения присутствия хотя бы 2 представителей данного вида животных. Социальное поведение является компонентом интегративных функций головного мозга и включает несколько вариантов взаимодействий: межсамцовые взаимодействия, половое (репродуктивное) поведение, родительское поведение [1, 364]. Межсамцовые взаимодействия можно разделить на следующие группы: –социальный интерес и социальное распознавание (исследование партнера, принюхивание к нему, аногенитальный груминг); –защитное поведение (рефлекс активного избегания партнера или пассивный рефлекс «затаивания», страх перед партнером); –агрессивное поведение (приподнимание на задние лапы, биение хвостом, толчки, нападения, погоня, агрессивный груминг и пр.); –несоциальное поведение, которое может сопровождать социальное взаимодействие (аутогруминг и аутоагрессия, исследование клетки, рытье подстилки) [1]. Обычно первой реакцией животного при встрече с партнером является социальный интерес, затем социальное взаимодействие (агрессивное и/или защитное поведение) и социальное распознавание (животные выясняют свой ранг в данном «социуме»), после чего интенсивность социальных взаимодейтсвий снижается и имеет «ритуализированный характер». Фактором, влияющим на социальное поведение (запуск первой реакции, продолжительность и интенсивность социальных взаимодействий), является уровень тревожности животных: высокая тревожность взаимодействующих крыс снижает выраженность их социальных контактов. Другими факторами, благодаря которым возможно влиять на социальные взаимодействия, являются уровень освещенности тестов, размер и знакомство территории взаимодействия, знакомство с 44 партнерами [1], что необходимо учитывать при проведении тестов для оценки социального поведения крыс. 1.3 Нейрон-глиальные взаимодействия в норме и при патологии ЦНС В структуре нейроваскулярной единицы (функциональной единицы головного мозга) выделяют нейроны, глиальные клетки (главным образом астроциты) и сосудистые клетки (эндотелиоциты и перициты). Глия, в зависимости от выполняемых функций, подразделяется на следующие типы: олигодендроглию, микроглию, эпендимоглию и астроглию. Согласно современным представлениям, в функционировании нейроваскулярной единицы играют роль астроциты, олигодендроглия и микроглия [21, 92]. Глиальные клетки составляют около 80-90% клеток головного мозга человека и являются основными регуляторами развития нервной системы, ее функционирования и здоровья [185]. Давно известно, что глиальные клетки играют роль в развитии, метаболизме и изоляции нейронов, но последние исследования показали, что между астроцитами и нейронами существует не односторонняя, а двусторонняя связь, необходимая для аксональной проводимости, синаптической передачи, обработки информации и, следовательно, для нормального функционирования нервной системы во время развития и во взрослой жизни [360]. Все глиальные клетки должны отвечать трем критериям, не применяемым к клеткам неглиальной природы: глия всегда физически связана с нейронами, глия не является нейронами, поэтому они, как правило, не образуют пресинаптические структуры (хотя был зафиксирован контакт нейронных синапсов с глией), глия и нейроны линейно связаны между собой. Исследования природы стволовых клеток в мозге позвоночных показали, что клетки глии и нейроны часто происходят из общих эктодермальных клеток-предшественников, таких, как клетки радиальной глии. Родство между глией и нейронами является важным аспектом глиальной идентичности [274, 360]. Известны следующие функции глии в головном мозге (приложение Б): роль в процессах эмбрионального и взрослого нейрогенеза, в особенности в 45 синаптогенезе [185], в синаптической пластичности и сигнализации [185, 359, 360], в регуляции функционирования нейронов – их электрических свойств (глия в качестве электрических изоляторов) [360], нервной проводимости [185], выживания (глия взаимодействует с нейронами и обеспечивает для них трофическую и питательную поддержку) [360, 402], они являются ключевыми элементами гомеостаза мозга, «информационными процессорами» в его функционировании [92]. Каково физиологическое значение двунаправленной нейрон-глиальной динамической сигнализации в мозге? Удивительная архитектура мозга состоит из сотен миллиардов нейронов, а также триллиона опорных клеток глии, которые составляют примерно половину объема взрослого мозга млекопитающих. Астроциты являются активными участниками обработки информации мозга и ключевыми элементами синаптический ток физиологии между нервной нейронами, системы, они модуляцию регулируют количества нейротрансмиттеров, в том числе глутамата и аденозинтрифосфата, внеклеточную и внутриклеточную динамику кальция в синаптической щели. Повышение внутриклеточного уровня кальция в астроцитах способствует образованию и высвобождению глутамата из астроцитов, модулируя пресинаптическую и постсинаптическую нейронную активность путем деполяризации нейронального тока [322]. Интересна роль астроцитов в поставке энергии для активных нейронов. У позвоночных животных глюкоза играет ключевую роль в качестве источника энергии для клеточного метаболизма. И глия, и нейроны обладают гликолитическими ферментами для расщепления глюкозы и использовании ее для производства АТФ, однако основным источником энергии для активных нейронов является не глюкоза, а лактат, продуцируемый глией. Отдельные астроциты в ЦНС часто контактируют с кровеносными сосудами и нейронами, идеально располагаясь, чтобы быть энергетическими посредниками. Глутамат высвобождается из нейронов в синаптическую щель во время их активности и удаляется в основном окружающими астроцитами путем транспорта ионов 46 натрия. Увеличение натрия в астроцитах запускает каскад сигнальных событий, которые, как полагают, приводят к поставке энергетических эквивалентов в нейроны. Лактат-челночная гипотеза (astrocyte-neuron lactate shuttle hypothesis, ANLSH) предполагает, что перенос глутамата астроцитами после активации нейронов стимулирует астроцитарный гликолиз и продукцию молочной кислоты. Лактат, в свою очередь, покидает астроциты и действует на соседние нейроны в качестве источника энергии. Таким образом, астроциты играют центральную роль в регуляции так называемой нейрометаболической связи. Однако возможен и вариант, когда глюкоза может непосредственно использоваться нейронами, без астроцитарного посредничества [7, 92]. Поскольку астроцитарные процессы обладают высокой динамикой субклеточных элементов, астроциты способны к передвижению, сжатию и растягиванию и могут динамически формировать межклеточное пространство, что оказывает сильное воздействие на нейронную сеть, влияя на внеклеточную диффузию нейромедиаторов. Астроциты могут контролировать внеклеточную концентрацию ионов калия через экспрессию специфических калиевых каналов или транспортеров глутамата. экспрессия глутаматных транспортеров астроцитами играет решающую роль в клиренсе глутамата из синаптической щели для завершения синаптической передачи. Астроциты могут находиться в контакте с тысячами синапсов, взаимодействуя с ними. Этим, возможно, объясняется их способность одновременно активировать популяцию нейронов. Этот эффект был продемонстрировал в гиппокампе, где повышение уровня кальция в астроцитах и последующее высвобождение глутамата привело к синхронному возбуждению кластеров пирамидальных нейронов, показывая вклад глиотрансмиссии в нейронной синхронизации [92]. Молекулы, участвующие в этих процессах, экспрессируемые на астроцитах, получили название молекул неэлектрической «кальциевой возбудимости» [360]. Несмотря на то, что в основном астроциты обеспечивают контроль за гомеостазом внеклеточной среды нейронов и реагируют на различные стимулы (повреждение, химическое или физическое воздействие), микроглия также 47 участвует в гомеостазе, действуя как «очиститель» от клеток в случае инфекции, воспаления, травмы, ишемии и нейродегенерации в ЦНС. Микроглия также играет активную роль в конце эмбрионального развития и созревания мозга после рождения, выполняя функцию запрограммированного уничтожения нервных клеток [112, 415]. Фенотипически в нервной системе произошла дифференцировка системных макрофагов, которые проникли в центральную нервную систему, на перициты, периваскулярные физиологических макрофаги условиях в и резидентные головном мозге клетки находятся микроглии. В «отдыхающая» микроглия, периваскулярные макрофаги и перициты, а также небольшое количество «патрулирующих» макрофагов. В патологических условиях все эти виды клеток активируются. Микроглия и перициты могут ограниченно пролиферировать, в отличие от макрофагов, которые не могут пролиферировать. Как правило, в патологических условиях, влияющих на головной мозг, отмечаются повреждения гематоэнцефалического барьера, которые позволяют попасть в головной мозг периферическим макрофагам из крови. Происхождение микроглии было одним из самых спорных вопросов в глиальных исследованиях. Подавляющее большинство нейробиологов теперь считают, что они получены из моноцитов, и, в меньшей степени, из мезенхимальных клеток-предшественников. Альтернативная точка зрения - что они происходят из нейроэпителия, как другие глиальные клетки мозга и нейроны. Была показана роль перицитов в патогенезе повреждения тканей при гипоксии, гипертензии, диабетической ретинопатии, травмах мозга, болезни Альцгеймера, рассеянном склерозе, опухолях ЦНС. В первые 2 часа после травмы перициты и периваскулярные макрофаги активируются и местонахождения. начинают мигрировать Одновременно, из активированные своего первоначального моноциты/макрофаги и лимфоциты крови мигрируют через поврежденный гематоэнцефалический барьер, в котором сильно снижается количество плотных контактов, в ответ на выработку хемоаттрактантов, генерируемых астроцитами. В то же время, покоящаяся микроглия активируется и изменяет свой фенотип на амебоидную микроглию, 48 способную к фагоцитозу. Участие активированной микроглии и периваскулярных макрофагов, связанных с повреждением гематоэнцефалического барьера показано в недавней гипотезе одного аспекта патогенеза болезни Альцгеймера [206]. Микроглия, относящаяся к мононуклеарно-фагоцитарной линии клеток, мигрирующих в нервную систему в период эмбрионального развития, обеспечивает фагоцитоз поврежденных клеток, очистку от «мусора», локальный ответ при действии повреждающих факторов, в том числе гипоксии, апоптогенных стимулов и т.п., за счет секреции цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО-α), а также участвует в метаболизме нейротрансмиттеров, поддержании гомеостаза внеклеточных ионов. Вместе с тем, клетки микроглии обладают высокой цитотоксической активностью, в частности, способностью продуцировать активные формы кислорода и азота (т.н. окислительный стресс или дыхательный взрыв, опосредуемый активностью НАДФН-оксидазы), активировать протеазы и осуществлять фагоцитоз. Микроглиальные клетки in vitro продуцируют большое количество глутамата, что позволяет предполагать их вовлеченность в реализацию «глутаматного удара» при нейродегенерации [39, 80, 121] Микроглиальный ответ на повреждение нейронов обычно называют реактивным микроглиозом - процессом усиления пролиферации, рекрутинга и активации микроглии. Реактивный микроглиоз наблюдается при болезни Паркинсона и множестве других нейродегенеративных заболеваний или повреждения ЦНС. Микроглиальная активация функционирует как нейропротективный механизм за счет утилизации избыточных нейротоксинов, удаления гибнущих клеток и продуктов их распада и стимуляции репаративных процессов. Сверхактивация микроглии, однако, оказывает цитотоксические эффекты, ускоряя повреждение нейронов, генерируя и выпуская множество нейротоксических веществ, включая свободные радикалы и провоспалительные цитокины. Таким образом, порочный круг может развиваться между дегенерацией нейронов и реактивным микроглиозом, играя важную роль в прогрессирующем характере нейродегенерации при болезни Паркинсона [247]. Показано, что изменения функциональной активности или 49 жизнеспособности нейронов и клеток глии при гипоксическом или токсическом поражении ЦНС ассоциированы с изменением нейрон-глиальных взаимодействий. 1.3.1 Виды нейрон-глиальных взаимодействий Известно, что клетки общаются друг с другом несколькими сотнями различных сигнальных молекул, в том числе белков, небольших пептидов, аминокислот, нуклеотидов, стероидов, ретиноидов, производных жирных кислот и газов (оксид азота и оксид углерода). Эти молекулы, как правило, секретируются сигнальными клетками либо путем экзоцитоза, либо путем диффузии через клеточную мембрану. Сигнальные молекулы связываются с рецепторами на клетках-мишенях, которые, в свою очередь, активируют внутренние сигнальные каскады, которые изменяют поведение этих клеток. Эти сигналы могут быть растворимыми факторами (выделяются в окружающую среду) или мембраносвязанными молекулами (регулируют свои сигналы при непосредственном контакте). Растворимые факторы могут переноситься на большие расстояния и влиять на клетки-мишени, (эндокринная сигнализация), другие молекулы достигают только коротких расстояний и влияют на соседние клетки (паракринная сигнализация), третий вариант - молекулы влияют на те же самые клетки, которые их выделяют (аутокринная сигнализация). Мембраносвязанные молекулы могут влиять только на клетки, находящиеся в непосредственном контакте друг с другом, такие молекулы имеют важное значение для межклеточной адгезии, миграции клеток, сборки органов и тканей [142]. Нейрон-глиальные взаимодействия подразделяют на контактные (прямые, быстрые) и беcконтактные (дистантные, опосредованные) взаимодействия [336]. Классические формы быстрой связи включают гомоцеллюлярную сигнализацию, такую как химическая синаптическая передача между нервными клетками (нейрон-нейрональная сигнализация) и электротоническая связь через каналы щелевых контактов между глиальными клетками (глия-глиальная сигнализация). 50 Последние наблюдения показывают, однако, что химические синапсы существуют также между пресинаптическими нейронами и постсинаптическими глиальными клетками, непосредственно пару дополнительные формы синаптическая а также щелевые «глиальная клетка-нейрон». нейрон-глиальной нейротрансмиссия, контакты которая могут связывать Также известны сигнализации: может интенсивная привести к активации перисинаптических глиальных клеток (нейротрансмиттеры в синаптической щели выделяются в достаточной концентрации, чтобы связать и стимулировать рецепторы, расположенные на цитоплазматической мембране соседних глиальных клеток); но глиальные клетки также могут активно реагировать на стимуляцию, высвобождая нейроактивные трансмиттеры и тем самым модулировать функции соседних нейронов; глиальные клетки также могут высвобождать трансмиттеры также на другие соседние глиальные клетки, усиливая таким образом сигнал. В целом, весьма вероятно, что активность мозга включает в себя интерактивные сигнальные сети между нейронами и глией [109]. Выброс нейромедиаторов из активных синапсов может стимулировать рецепторы на глиальных клетках, в результате чего повышается уровень внутриклеточного кальция и активируются клетки глии («синаптическая активация глии»). Несколько различных трансмиттеров вызывают запуск нейронглиальной сигнализации на различных синапсах центральной или периферической нервной системы. Уровень кальция повышается в активных глиальных клетках в результате нейромодуляторного ответа на высвобождение нейротрансмиттеров («нейромодуляторная глия»). Такая глия-нейронная сигнализация может действовать локально, вызывая «пищевой» резервный ответ, или дистально, чтобы модулировать различные синаптические домены, если активационный сигнал распространяется в пространстве глиальной сети. Различные медиаторы могут поддерживать глия-нейронную сигнализацию, больше всего собрано доказательств для кальций-зависимого "экзоцитоза" глутамата из астроцитов. Третья форма общения, называемая «глиотрансмиссией», позволяет сигналам распространяться в глиальной сети с 51 пространственной экспансией оригинального сигнала входа. «Глиотрансмиссия» классически контролируется межклеточными волнами повышения кальция и зависит от диффузии внутриклеточного сигнала (например, инозитол-трифосфата [IP3]) через щелевые контакты. Недавние работы показывают, что кальциевые волны сопровождаются волнами внеклеточных посредников, таких как АТФ и АТФ-зависимые сигналы, оксид азота/G киназы или глутамат. Таким образом, «глиотрансмиссия» должна быть связана с аутокринной/паракринной глияглиальной сигнализацией, возможно, с привлечением дополнительных трансмиттеров (таких, как простагландины и оксид азота). Так, PGE2 быстро высвобождается из астроцитов при глутаматной активации рецепторов, улучшая и усиливая кальциевую сигнализацию, запущенную этим нейромедиатором. Подобные PGE2-зависимые события могут стимулировать активацию нуклеотидных рецепторов P2Y подтипа [109]. Кроме нейрон-астроглиальных [94], различают также двунаправленные нейрон-микроглиальные взаимодействия, играющие роль при нейровоспалении [378], астроцит-микроглиальные взаимодействия, вероятнее всего, играющие роль в контроле за воспалением и дальнейшим повреждением соседних нейронов при патологических состояниях [390], а также взаимодействия между глией и эндотелиоцитами [73]. Интересно, что принцип Дейла (один нерв - один медиатор) не всегда действует для формирования нервного импульса. В ответ на нервный импульс часто наблюдается феномен ко-трансмиссии (одновременного выделения двух или более нейромедиаторов и нейромодуляторов). Установлено, что в состав «коктейля» нейромедиаторов и нейромодуляторов в разных нервных окончаниях могут входить норадреналин, ацетилхолин, аденозинтрифосфорная кислота, оксид азота, аденозин, нейропептид Y, вазоинтестинальный пептид, субстанция P, ГАМК, глутамат и другие. Роль большинства этих веществ в функционировании нервной системы описана в многочисленных публикациях, однако о рецепторных и пострецепторных эффектах АТФ в процессах передачи нервного импульса известно гораздо меньше [14, 406]. 52 К примеру, астроциты могут высвобождать глиотрансмиттеры (глутамат, ГАМК, АТФ, D-серин), которые регулируют возбудимость нейронов, синаптическую передачу и пластичность, изменяя функции нейронной сети, влияя на молекулы-мишени (NMDA рецепторы, GABA рецепторы, PAR-1 рецепторы, P2Y1 рецепторы и т.д.). В нейрон-астроглиальных взаимодействиях также может играть роль изменение внутриклеточной концентрации кальция в астроцитах [92]. Микроглия акумулируется вокруг поврежденных нейронов, генерируя различные нейротоксические (глутамат) и нейропротекторные (сигналы "помоги мне") факторы [378, 406]. Интересно, что выброс одного и того же глиотрансмиттера может привести к различным эффектам на нейроны, в зависимости от их разновидности и вида нейронных элементов (пре- и постсинаптических), а также от субтипа активированных рецепторов, что обеспечивает высокую степень сложности эффектов астроцитов на активность нейрон-глиальных сетей. Модификации астроцитарных наружных синапсов, которые образуются при определенных физиологических условиях, сильно зависят от синаптической эффективности, связанной с клиренсом глутамата и внеклеточным уровнем глиотрансмиттера Dсерина, который модулирует NMDA-рецептор-опосредованную синаптическую передачу [92]. В нейрон-глиальных взаимодействиях роль играют также выделение клетками экзосом и микровезикул. Так, нейрональные клетки секретируют различные типы микровезикул с известными функциями. Нейроны образуют экзосомы, которые могут повлиять на синаптическую пластичность. Микроглия модулирует нейротрансмиссию через образование микровезикул. Астроцитвысвобожденные экзосомы оказывают нейропротективный эффект и могут способствовать нейрональной выживаемости. Нейрональные сигналы вызывают высвобождение экзосом из олигодендроцитов для повышения уровня внутриклеточного кальция. После интернализации на нейронах экзосомы могут быть включениями олигодендроглиальных на аксонах. экзосом без Микроглия их вызывает воспалительных деградацию изменений. В 53 специфических патологических условиях эти экзосомы могут вызывать трансфер антигенов микроглиальных клеток и индуцировать воспалительную реакцию [188]. Нейроны, глиальные клетки и клетки тканей опухолей головного мозга высвобождают небольшие везикулы (секреторные экзосомы и микровезикулы), которые могут представлять собой новый механизм, влияние нейрональной активности на ангиогенез в эмбриональном и зрелом мозге. Выделенные ЦНСмикровезикулы могут попадать в кровоток, осуществляя также коммуникации с эндотелиоцитами и клетками периферической крови, а также клетками иммунной системы [363]. Известно, что глия распознает любую нейронную травму (например, повреждение спинного мозга, ишемию, нейродегенеративные заболевания) и реагирует на повреждение реактивным глиозом, при котором клетки глии претерпевают серьезные изменения морфологии и паттернов экспрессии генов, мигрируют к месту повреждения, управляют мозговым ответом на травму. До сих пор не известны или малоизвестны молекулярные пути нейрон-глиальных взаимодействий после повреждения ЦНС [185]. 1.3.2 Нейрон-глиальные взаимодействия при нейродегенеративных заболеваниях Адекватная работа нейроваскулярной единицы приводит к метаболической оптимизации функционирования отдельных групп нейронов, позволяющей максимально эффективно использовать их возможности, что на уровне целого мозга позволяет решать сложные информационные задачи в условиях относительно ограниченного количества энергии и субстратов. Нарушение взаимодействий внутри нейроваскулярной единицы приводит к снижению эффективности функционирования мозга, при этом в наибольшей степени страдают энергетические структуры, в частности кора и подкорковые ганглии, а также связи между ними [21]. Так, например, гистологические изменения перицитов возникают при 54 многих патологических состояниях, в том числе при эпилепсии и рассеянном склерозе. Наиболее изученными состояниями, приводящими к повреждению перицитов и разобщению внутри нейроваскулярной единицы, являются хроническая ишемия мозга (гипертоническая энцефалопатия), диабетическая энцефалопатия и нейродегенеративные заболевания (такие, как, например, болезнь Альцгеймера). В последние годы рядом исследователей выдвигаются предположения о вовлечении нейроваскулярных связей в патологический нейродегенеративный процесс и при демиелинизирующих заболеваниях (в частности, при рассеянном склерозе) [21]. Наиболее изучаемыми в настоящее время являются исследования нейронастроцитарных взаимодействий, многие из которых касаются роли астроцитов в нейродегенерации [82, 94, 95, 107]. Расстройства памяти и когнитивных нарушений при нейродегенерации в настоящее время предполагают дефект синаптической эффективности в виде изменения астроцитарно-нейронной сигнализации [394]. Функциональные взаимодействия между нейронами, глиальными и сосудистыми клетками в нейроваскулярной единице очень важны в контексте патогенеза нейродегенеративных расстройств. Астроциты демонстрируют анатомические взаимосвязи между церебральными артериолами и нейронами. В паренхиме мозга, обширные сети мозговых артериол с астроцитарными «ногами» по размерам намного превышают любые прямые нейральные контакты с перфузия-регулируемыми микрососудами. Эта уникальная конструкция позволяет преобразовывать астроцитами сигналов из активированных нейронов и передавать эту информацию к клеткам церебральной микроциркуляции. Изменение этих процессов может играть особенно важную роль в патогенезе нейродегенеративных заболеваний. Ранние и срединные стадии развития нейродегенеративных процессов связаны с генерализованной атрофией астроглии, тогда как более поздние стадии характеризуются астроглиозом, активацией микроглии и связанных с ними повреждениями, такими как старческие бляшки [82, 344]. нейропатологическими 55 При остром повреждении при нейродегенерации, астроциты и микроглия претерпевают процесс глубокого морфологического и функционального ремоделирования, которое зависит от типа патологии, времени и расстояния с момента повреждения. В течение этого процесса реактивные астроциты могут потерять свои непересекающиеся эпилептических припадков (интердигитируют), что домены. Например, соседние приводит к после астроциты «смешиванию» нескольких переплетаются территорий. Такое ремоделирование на уровне одиночных клеток, вероятно, оказывает влияние на организацию астроглиальной сети [97]. Особенности нейрон-глиальных взаимодействий при острой и хронической нейродегенерации развивающегося и зрелого мозга представлены в приложении Д. 1.4 Молекулы, играющие роль в нейрон-глиальных взаимодействиях 1.4.1 Нуклеотидные рецепторы Координация широкого спектра клеток в нервной системе требует средств межклеточной коммуникации, которые могут интегрировать с сосудистой, глиальной, иммунной и нервной системой в динамическую, но строго регулируемую систему. Больше, чем любая другая молекула, внеклеточный АТФ удовлетворяет этому требованию. Все эти типы клеток могут высвобождать АТФ для межклеточных коммуникаций, и все они отличаются богатым разнообразием мембранных рецепторов для внеклеточного АТФ и его метаболитов, а также внеклеточных ферментов, которые регулируют гидролиз АТФ. Системы вторичных промежуточных посредников активируют рецепторы, опосредующие разнообразные процессы нервной системе, с милисекундной продолжительностью синаптической передачи во время развития и регенерации [181]. Внеклеточный АТФ может действовать как активность-зависимая сигнальная молекула взаимосвязи свидетельствуют о между нейронами функциональных и глией. последствиях Полученные данные нейрон-глиальных 56 коммуникаций в гомеостазе внеклеточной среды, окружающей нейроны, в том числе регулирующей синаптическую силу, экспрессию генов, скорость митоза и дифференцировку глии в соответствии с импульсной активностью в нейронных сетях [180]. АТФ функционирует в качестве котрансмиттера для различных нейротрансмиттеров; АТФ является важным глиотрансмиттером и посредником кальциевых волн между астроцитами и участвует в реципрокной нейрон-глиальной сигнализации; АТФ действует как «сигнал опасности», предупреждая нервную ткань для предотвращения пагубного воздействия, играет важную роль в стимуляции микроглиоза и контроля микроглиальной пролиферации, миграции и секреции медиаторов воспаления в иммуномодуляции и иммуносупрессии. Это индуцирует астроглиоз (превращение астроцитов в клетки звездчатой формы, их миграцию и пролиферацию, высвобождение молекул опорного ремоделирования ткани), АТФ и аденозин также участвуют в нейропротекции [331]. АТФ и его метаболиты играют роль в модуляции нейрогенеза после ишемии. Кальциевая сигнализация через пуринергические P2X и P2Y рецепторы регулирует пролиферацию и дифференцировку нейральных стволовых клеток, которые экспрессируют эктонуклеотидазы. АТФ выделяется при ишемическом инсульте и создает неблагоприятную среду, в которой миграция и пролиферация SVZ-нейробластов к поврежденной области затруднены, блокада P2X1 и P2X7 рецепторов реактивирует миграцию нейробластов к поврежденной коре головного мозга. Кроме того, блокада P2X рецепторов защищает клетки от токсичности АТФ, в то время как эктонуклеотидазы в нейрогенной нише генерируют нейрогенный аденозин, который защищает клетки от гибели через A2A рецепторы аденозинкиназы и способствует поддерживает активации дальнейшее нейрогенеза. Ингибирование нейропротекторное действие аденозина и стимулирует активацию нейробластов. Активация нейробластов также поддерживается активацией P2Y-подобного GPR17 рецептора через CysLT и через УТФ-активацию P2Y1,2 и P2Y13 рецепторов [178, 252]. Внутриклеточный уровень АТФ снижается, тогда как внеклеточный АТФ повышается при ишемии головного мозга как следствие вторичной аноксической 57 деполяризации. Интересно, что ишемия изменяет чувствительность АТФзависимых рецепторов к АТФ: усиливается активность и плотность P2X7 рецепторов в нейронах и других клетках после ишемии. Кроме того, устойчивое приложение АТФ и последующая активация P2X7 рецепторов переключают P2X7 рецепторы с действия "типичного" селективного ионного канала для малых катионов (в том числе для Ca2+) в режим образования больших пор. Эта особенность приводит к увеличению проницаемости мембраны, что способствует дезагрегации актина и быстрой перестройке цитоскелета, процессам мембранного блеббинга, лизиса клеток, высвобождения цитокинов и апоптоза. Белки ионных каналов P2Y1 и P2Y4 усиливают свою активность после ишемии в культуре нейронов и в периинфарктной области после окклюзии средней мозговой артерии. P1 пуринергические рецепторы также участвуют в ишемическом повреждении. Блокада A2A рецекпторов является протективной в модели перманентной фокальной ишемии, вероятно, путем ослабления микроглиоза и продукции провоспалительных цитокинов [252]. Аденозинтрифосфат (АТФ) является 5'-фосфорным эфиром аденозина. АТФ участвует во многих событиях внутриклеточной сигнальной трансдукции, являясь универсальным преобразователем энергии в клетке. Аденозинтрифосфат служит "сигналом тревоги" и запускает иммунный ответ, высвобождаясь при воспалении, повреждении клеток, в том числе и при их метаболической дисфункции. Известно, что фагоциты, кроме пула АТФ, содержат и другие высокоэнергетические фосфаты (например, креатинфосфат), которые во время фагоцитоза быстро рециркулируют и пополняют расход АТФ [175, 243]. АТФ может использоваться как субстрат/источник энергии для работы различных ферментов: трифосфатгидролаз (превращение АТФ в АДФ и АМФ с выделением энергии), 5-нуклеотидаз, экзонуклеотидаз, эктокиназ и эктопротеинкиназ (участвуют в фосфорилировании белков), апираз, гексокиназ и других. Утилизация избытка АТФ в фагоцитах осуществляется с помощью эктоАТФаз [176]. В клетках ЦНС внеклеточный АТФ может регулировать активацию так называемых «пуринергических» («пуриновых», «нуклеотидных», 58 P2) рецепторов. Пуринергические рецепторы группируют согласно их структуре и выполняемым функциям и классифицируют на P2U, P2X и P2Y рецепторы, активируемые нуклеотидными классификаций нуклеотидных три- и рецепторов дифосфатами. (Van Одна Calker, из 1979) первых включала аденозиновые (Р1, в современной классификации - A1, А2А, A2B и А3 рецепторы) и пуриновые (Р2) рецепторы. В дальнейшем Abbracchio и Burnstock (1994) дополнили сведения о пуриновых рецепторах, сгруппировав их в 3 подкласса («классическая» классификация включала 6 подтипов), а другие авторы (R. Coutinho-Silva, 2005; S. Duan, 2003) отнесли Р2Z рецепторы (в современной классификации - Р2Х7 рецепторы, ранее их выделяли как отдельный Р2Z подтип) к Р2Х рецепторам и выявили, что некоторые рецепторы Р2 подтипа активируются не только пуринами (аденозин, АДФ, АТФ), но и пиримидинами (УДФ, УТФ), поэтому в дальнейшем Р рецепторы стали называть не «пуринергическими» (пуриновыми), а «нуклеотидными» [297]. Известно, что аденозин является важным связующим звеном между нейронами и астроцитами и нейромодулятором в физиологических условиях, и может играть роль гомеостатического регулятора при патологии. Все четыре типа аденозиновых рецепторов присутствуют в астроцитах и их активация является результатом различных прямых эффектов, включая гиперполяризацию, высвобождение кальция из внутренних депо, кальциевый вход и модуляцию амплитуды и/или кинетики кальция, инициированной активацией метаботропных глутаматных рецепторов, мускариновых рецепторов и P2Y рецепторов. Так, активация А2B рецепторов приводит к повышению внутриклеточного цАМФ, усилению синтеза и выделения простациклина, оксида азота и эпоксиэйкозатриеновых кислот. Следует также отметить феномен самоактивации астроцита, который связан с расположением А2B рецепторов в области коннексиновых каналов [21]. Аденозин действует как мощный нейрон-глиальный передатчик для ингибирования пролиферации олигодендроцитарных клетокпредшественников, стимулирует дифференцировку и способствует 59 формированию миелина. Аденозин и АТФ, высвобождающийся из аксонов, регулируют аксон-олигодендроцитарную сигнализацию в развивающемся мозге [252]. Нуклеотидные ионотропные Р2 рецепторы (лиганд-оперирующие подразделяются ионные каналы) на P2X 2 подгруппы: рецепторы и метаботропные (G-белок-опосредующие) P2Y рецепторы [222]. P2X рецепторы включают 7 подтипов (P2X1-P2X7), которые можно условно разделить на три группы (первая группа может активироваться АТФ и его аналогами, вторая – только АТФ, а активация рецепторов третьей группы [P2Z/P2X7 рецепторы] сопровождается повреждением и гибелью клеток при длительном приложении агонистов) [246]. Клетки нервной системы экспрессируют разные типы нуклеотидных рецепторов: олигодендроциты и их предшественники экспрессируют все четыре подтипа Р1 рецепторов, P2X и P2Y рецепторы, которые могут выступать в качестве посредников аксоно-олигодендроцитарной взаимосвязи для контроля миелинизации (к примеру, зрелые олигодендроциты зрительного нерва экспрессируют большую часть подтипов P2X рецепторов, но преобладающим является P2X7 подтип), микроглиальные клетки также экспрессируют все типы аденозиновых рецепторов (активация A1 и A2 рецепторов способствует пролиферации микроглии, в то время как A3 рецепторы опосредуют ERK1/2 фосфорилирование) и несколько типов P2X и P2Y рецепторов (P2X4, P2X7, P2Y2, и P2Y12), которые действуют как сенсоры астроцитарной активности и триггеры высвобождения цитокинов, астроциты экспрессируют большую часть P2X и P2Y подтипов рецепторов [252]. Суммируя данные, можно выделить следующие роли нуклеотидных (пуринергических) рецепторов в нервной системе (приложение В). P2X7 рецепторы являются бифункциональными рецепторами, которые, в зависимости от уровня низкопроводимые ионные активации, каналы (в формируют катион-селективные физиологических условиях) или неселективные высокопроводимые поры (в патологических условиях, поры проницаемы для крыпных молекул, таких как этидиум весом 342 Da и YoPro-1 60 весом 629 Da) [294, 297, 400]. Известно, что кратковременная (менее 15 минут) и/или слабовыраженная (при приложении АТФ в нано-микромолярной концентрации) активация P2X7 рецепторов происходит в физиологических условиях, при этом P2X7 рецепторы могут выполнять следующие функции, согласно литературным данным [16, 74, 297, 330, 368, 377]: участвуют в поддержании митохондриального потенциала в состоянии покоя, агрегации тромбоцитов, активации и созревании T-клеток, процессах нейрональной передачи и мышечного сокращения, росте клеток, запуске внутриклеточных сигнальных каскадов и клеточной пролиферации за счет активации и накопления ядерных транскрипционных факторов (NFAT, NFКB), клеточной коммуникации в виде щелевых контактов. Вероятна также паракринная роль АТФ в передаче сигналов через P2X рецепторы в эпителии дыхательных путей, нейрогипофизе, небных миндалинах, костной, почечной, кроветворной ткани. Длительная (свыше 15 минут) и сильная (миллимолярной концентрацией АТФ) активация P2X7 рецепторов приводит к истощению внутриклеточного пула АТФ, запуску клеточной гибели клеток путем апоптоза (за счет непосредственной и косвенной [через фосфолипазу Д] активации каспаз) и/или некроза (в результате сильного набухания клетки и разрыва ее мембраны) за счет образования главным образом гигантских цитолитических пор [74, 100, 119, 134, 222, 347, 372]. Считается, что образование пор связано с особенностями строения P2X7 рецепторов: в отличие от остальных видов P2X рецепторов (состоят из 1 центрального внеклеточного и 2 трансмембранных доменов, 2 коротких внутриклеточных «хвостов» − карбокси-(С-) и амино-(N-)терминального), P2X7 рецепторы имеют длинный эндоплазматический С-терминальный «хвост», содержащий липополисахарид-связывающий домен [296, 330, 372]. Экспрессия Р2Х7 рецепторов была обнаружена на клетках моноцитарномакрофагального происхождения (включая незрелые моноциты, дендритные клетки, микроглию и зрелые макрофаги), лимфоцитах, нейтрофилах [307, 400], клетках надпочечников, сердца, околоушных желез, яичка, фибробластах, 61 нейрональных, нейроглиальных, эпителиальных, эндотелиальных, костных, мышечных и кроветворных тканях [296, 372]. В центральной нервной системе Р2Х7 рецепторы экспрессируются прежде всего на астроцитах и микроглии [252]. Известно, что активация P2X7 рецепторов на астроцитах повышает уровень [Ca2+] и является причиной высвобождения пуринов. В патологических условиях уровень АТФ может вырасти настолько, чтобы вызывать повреждение ткани за счет стимуляции P2X7 рецепторов и инициировать нейронную и глиальную гибель при острых и хронических повреждениях [252]. P2X7 рецепторы в астроцитах обеспечивают «маршрут» для выхода аминокислот при формировании пор, увеличивают базальный уровень митохондриального Ca2+ и внутриклеточный Ca2+ посредством фосфолипаза C-независимого сигнального пути, повышают мембранный потенциал. Кроме того, сами Р2Х7 рецепторы действуют как каналы, проницаемые для моно- и дивалентных неорганических катионов [16, 99, 175, 311, 330, 368]. В зависимости от количества АТФ, высвобождаемого при повреждении головного мозга, микроглия может высвобождать факторы, которые способствуют нейропротекции (например, плазминоген и ИЛ-6) или напротив, повреждает нейроны. В частности, микроглиальные P2X7 способствуют микроглиальной активации и пролиферации и рецепторы функционально связаны с высвобождением некоторых веществ (в том числе провоспалительных цитокинов), которые влияют на патологические процессы и содействуют нейродегенерации. АТФ является мощным иммуномодулятором, контролирующим микроглиальный рекрутинг и активацию, действуя на P2Y12 рецепторы, вызывая хемотаксис микроглии на ранних стадиях ответа на локальное повреждение ЦНС. В то же время, активация А2А рецепторов в клетках микроглии может высвобождать нейротрофические факторы для нейропротекции и регулировать синтез простагландина Е2 [252]. P2X7 рецепторы опосредуют продукцию супероксид-анион-радикалов в первичной микроглии в трансгенной модели болезни Альцгеймера, в частности, вокруг β-амилоидных бляшек. Стимуляция микроглиальных P2X7 рецепторов 62 также приводит к усилению активности интерферон-γ(ИФН-γ)-индуцированной синтазы оксида азота II типа. АТФ селективно подавляет синтез воспалительного белка микроглии в ответ на фактор через приток кальция при активации P2X7 рецепторов в микроглии. АТФ, АДФ и бензоил-бензоил АТФ, действующие через P2X7 рецепторы, вызывают высвобождение ИЛ-1β из микроглии. Активация P2X7 рецепторов усиливает активность ИФН-индуцированной синтазы оксида азота в клетках микроглии и может привести к воспалительному ответу. АТФ через P2X7 рецепторы увеличивает продукцию 2-арахидоноилглицерина, который также участвует в воспалении в клетках микроглии [181]. При воспалении сверхвыраженная активация Р2Х7 рецепторов индуцирует слияние фагоцитов с образованием гигантских многоядерных клеток, образование "ифламмасом" (макромолекулярных комплексов, необходимых для активации каспазы 1), инициирует фосфолипаза Д-зависимое слияние лизосом и эндосом (необходимо для эффективного фагоцитоза) в макрофагах, приводит к генерации активных форм кислорода и азота, процессингу, созреванию (в результате посттрансляционной модификации белков) и секреции провоспалительных цитокинов (ФНО, ИЛ-1, 6 и 18), формированию микровезикул, связанных с их высвобождением из клеток фагоцитов [74, 98, 175, 325, 330, 368]. Активация P2X7 рецепторов стимулирует выброс нескольких видов провоспалительных цитокинов активированными макрофагами, а ИЛ-1b является наиболее изученным среди них. Известны следующие шаги, в настоящее время способствующие созреванию и высвобождению интерлейкина ИЛ-1b и формированию инфламмасом: 1. Toll-подобные рецепторы активируются патоген-ассоциированными молекулярными паттернами или бактериальным эндотоксином липополисахаридом, что приводит к образованию про-ИЛ-1b и к активации Рanx1. 2. При внеклеточной микромолярной концентрации АТФ происходит активация P2X7 рецепторов, открытие селективных катионных каналов и увеличение кальциевого и натриевого притока и оттока калия, что приводит к 63 снижению внутриклеточной концентрации калия. 3. Активация Panx1 вызывает поглощение бактериальных патогенассоциированных молекулярных паттернов, усиление внеклеточного входа АТФ и активацию NLRP3 компонента инфламмасомы (реакции способствует низкий уровень внутриклеточного калия) с помощью апоптоз-ассоциированного белка, содержащего каспаза-рекрутирующий домен [308]. После сборки и активации инфламмасомы продуцируется каспаза 1, которая ферментативно преобразует проИЛ-1b в его зрелую форму, затем зрелый цитокин выходит из цитоплазматической мембраны путем экзоцитоза или с помощью микровезикул. Современная теория предполагает, что P2X7 рецептор может функционировать как «сенсор опасности», а АТФ – как «сигнал опасности», так как достаточно высокая концентрация АТФ необходима для активации P2X7 рецепторов. Это может создать «порочный круг», где P2X7 рецептор принимает решение – продолжить или остановить воспалительный процесс, способствуя чаще всего его дальнейшей прогрессии [308]. Активация Р2Х7 рецепторов происходит под влиянием физиологических лигандов и синтетических агонистов или антагонистов. Для узнавания лигандов и агонистов необходимы конформационные изменения рецепторов. Так, под влиянием фермента ART 2.2 (аденозиндифосфат-рибозилтрансфераза 2.2) происходит АДФ-рибозилирование аргинина в составе P2X7 рецептора, что вероятнее всего, повышает чувствительность самого P2X7 рецептора к действию АТФ [74, 78, 164, 173]. Возможна регуляция взаимодействия Р2Х7 рецепторов с лигандами путем изменения плотности их субъединиц на клеточной поверхности: так, Р2Х7 субъединицы «рассеяны» по поверхности неактивных моноцитов на значительном расстоянии друг от друга, что может предохранить моноциты от случайной активации P2X7 рецепторов, пока они не успели мигрировать в очаг тканевого повреждения и дифференцироваться в макрофаги. дифференцировки моноцитов в макрофаги сопровождается Процесс 10-кратным увеличением плотности рецепторов на единицу площади, что сближает Р2Х7 субъединицы [338]. 64 Физиологическим лигандом является АТФ (для активации Р2Х7 рецепторов во внеклеточной среде требуется наличие двухвалентных катионов, ионов Na+ и Cl-, содержание внеклеточного АТФ не менее 100 микромолярного и присутствие микромолярного НАД+, что может наблюдаться при наличии обширного очага повреждения или гибели клеток, при ишемическом/гипоксическом или воспалительном повреждении тканей) [118]. Для модуляции активности Р2Х7 рецепторов могут использоваться неселективные (сурамин [suramin], пиридоксаль-фосфат-6-азофенил-2',4'-дисульфокислота [PPADS] и другие) и селективные антагонисты (окисленная форма АТФ [oATP], BBG, KN-62 и др.), синтетические агонисты (BzATP), представленные в приложении В [132, 330]. В литературе описаны исследования, посвященные применению агонистов и антагонистов Р2 рецепторов при многих нервных болезнях (инсульт, паркинсоническая и альцгеймеровская нейродегенерация), боли, нарушениях функций органов чувств [14]. Клетки иммунной и нервной систем содержат механизмы, сопряженные с Р2Х7 рецепторами, которые могут изменять свою конфигурацию вследствие Р2Х7 рецепторной активации (пурин-изменяемые эктоферменты). К ним принадлежат НАД+-гликогидролазы (CD38 и CD157), 5′-эктонуклеотидаза (CD73), эктоАТФаза (CD39), АДФ-рибозилтрансферазы (ARTs – моно-АДФ-рибозилтрансфераза [mART], поли-АДФ-рибозилполимераза нуклеотидпирофосфат/фосфодиэстеразы. [PARP, Указанные ПАРП] механизмы и др.), формируют тесно переплетенные пурин-чувствительные сети, в которых нуклеотиды могут активировать пуринорецепторы, а эктоферменты могут катализировать образование метаболитов, стимулирующих другие пуринергические рецепторы [130, 307]. 1.4.2 НАД+-гликогидролазы (СD38, CD157/BST-1) Ионы АТФ, НАД+ и кальция обладают уникальными химическими свойствами: кальций образует обратимые комплексы со специфическими белками даже в присутствии конкурирующих катионов, а НАД+ и АТФ обладают 65 функциональным сходством и играют «двойную» роль в энергетической и сигнальной трансдукции [78, 116, 164], в том числе и при реализации нейронглиальных взаимодействий. Как и в случае АТФ, внутриклеточный уровень НАД+ может значительно варьировать в физиологических и патологических условиях. Даже низкая концентрация НАД+ (1 мкM) во внеклеточном пространстве при коротком (секундном) контакте может оказать выраженные эффекты [78, 164, 177, 310]. К факторам, определяющим характер нейрон-глиальных взаимодействий и чувствительность клеток к действию индукторов апоптоза, относится метаболизм НАД+ (никотинамидадениндинуклеотида) и концентрация внутриклеточного кальция [248]. НАД+ функционирует в качестве субстрата, лиганда и кофермента для многих ферментов метаболизма НАД+. Состояние пула внутриклеточного НАД+ влияет на репликацию и репарацию ДНК, метаболическую активность клеток ЦНС и электровозбудимость нейронов, устойчивость к окислительному стрессу [388], поэтому метаболизм НАД+ в клетках нейрональной или глиальной природы может быть направленной «мишенью» для его контроля и регуляции [39, 286]. Биодоступность НАД+ необходима для выживания нейронов при ишемии головного мозга. Однако, показано, что НАД+ также может оказывать протеотоксическое действие путем воздействия как на формирование, так и катаболизм поврежденных белков. Предполагается, что низкий уровень НАД + способствует синтезу метилглиоксаля, который может индуцировать гликозилирование белков, образование активных форм кислорода и дисфункцию митохондрий. Избыточная экспрессия глиоксалазы и карнозин защищают клетки от метилглиоксаля и ишемических повреждений, поддерживая данное предположение [216]. Среди ферментов, утилизирующих НАД+, наиболее изучаемыми являются PARP, mART (участвуют в АДФ-рибозилировании белков), НАД+- гликогидролазы (превращают НАД+ в циклическую или нециклическую АДФрибозу) и пирофосфатазы (участвуют в преобразовании НАД+ в АМФ и АТФ). 66 Снижение НАД+-гликогидролазной активности, вероятнее всего, влияет на биодоступность НАД+ для других ферментов: сдвиг от гидролиза НАД+ до АДФрибозилирования может привести к посттрансляционным модификациям, которые, в свою очередь, приведут к изменению функционирования клеток [160, 279]. Известно, что резкое снижение уровня внутриклеточного НАД+, чаще всего связанное с гиперактивацией другого фермента метаболизма НАД+, PARP, при окислительном стрессе, приводит к запуску дисфункции митохондрий и апоптоза астроцитов [80], а активация НАД+-конвертирующих ферментов астроцитов (к примеру, PARP) может быть важным фактором направленной модуляции выживаемости клеток при острой и хронической нейродегенерации [49]. СD38 (трансмембранный гликопротеид II типа, НАД+-гликогидролаза, EC 3.2.2.6) – бифункциональный фермент (проявляет взаимопротивоположные активности – синтез циклической АДФ-рибозы и ее гидролиз), являющийся также антигеном, ассоциированным с β2-микроглобулином [150]. Известны три основные ферментативные (катализирует синтез активности нециклической CD38: АДФ-рибозы НАД+-гликогидролазная из НАД+), АДФ- рибозилциклазная (ускоряет образование циклической АДФ-рибозы из НАД+), цАДФР-гидролазная (катализирует гидролиз циклической АДФ-рибозы), причем преобладает в основном НАД+-гликогидролазная активность. При кислом pH CD38 может катализировать синтез НААДФ+ (адениндинуклеотидфосфат никотиновой кислоты) через реакцию основного обмена между НАДФ+ и никотиновой кислотой. Циклическая АДФ-рибоза и НААДФ+ являются сильными кальций-мобилизующими посредниками во многих типах клеток [235, 239, 278]. Так, циклическая АДФ-рибоза является модулятором рианодиновых рецепторов II и III типов за счет специфического связывания с белком FKBP12.6 и обеспечивает мобилизацию кальция из эндоплазматического ретикулума в цитоплазму [42]. В клетке CD38 располагается, в основном, трансмембранно, хотя возможно существование внутриклеточных фракций CD38 (ядерная, митохондриальная). 67 Кроме того, возможна лиганд-индуцированная интернализация СД38, благодаря которой каталитически активная СД38 попадает внутрь клетки (эндоцитозные везикулы), продолжая функционировать внутриклеточно [242, 420]. Так, при обработке бактериальной фосфатидил-инозитол-фосфолипазой С CD38 может растворяться. Растворимая форма CD38 образуется в результате ферментативного расщепления димера CD38 на мономеры и показывает все те же ферментативные свойства, что и мембранная форма, а также рибозилирует некоторые белки [126, 179, 203, 279]. При синтезе циклической АДФ-рибозы был обнаружен «топологический парадокс»: цАДФР образуется на внеклеточной поверхности, а действует внутриклеточно. Этот парадокс может быть преодолен следующими механизмами: возможна интернализация CD38 путем эндоцитоза, проникновение цитозольного НАД+ во внеклеточное пространство и синтезированной цАДФР внутрь клетки через коннексиновые полуканалы, также вероятно внутриклеточное перемещение цАДФР путем эндоцитоза и/или через канал, образованный олигомерами CD38 (CD38 может вести себя как каталитически активный транспортер, ответственный за генерацию и вход цАДФР через клеточную мембрану) [256, 282, 293, 387]. Молекула CD38 может участвовать во многих внутриклеточных функциях в физиологических и патологических условиях: выполнять роль антигена (регуляция адгезии, пролиферации, дифференцировки, клеточной смерти), рецептора (для лиганда CD31), маркера многих патологических состояний (мониторинг и оценка прогрессии ВИЧ-1 инфекции, негативный прогностический маркер B-CLL, фенотипирование и классификация лейкемий), фенотипического маркера дифференцировки и/или активации кроветворных клеток (лимфоциты, мононуклеарные фагоциты), редокс-сенсора и сенсора НАД+, эктофермента и сигнальной молекулы [166]. В настоящее время описана патогенетическая роль нарушения экспрессии и/или активности CD38 в развитии ряда заболеваний (в частности, вирусных инфекций, онкогематологических заболеваний, цирроза печени, сахарного диабета) [122, 149, 207]. Противоречивыми остаются данные об 68 изменении активности фермента в электровозбудимых тканях при ишемии и реперфузии. В частности, в некоторых условиях регистрируется снижение продукции цАДФР при ишемии кардиомиоцитов [277], в то время как в других условиях определяется увеличение пула цАДФР при ишемии [46, 221]. CD38 в нейронах и астроцитах локализуется на цитоплазматической мембране и в различных внутриклеточных компартментах (цитозоль, ядро, митохондрии) [170], в этих же отсеках показана рецептор-опосредованная регуляция активности АДФ-рибозилциклазы [149, 275]. Циклическая АДФ-рибоза (цАДФР) является специфическим лигандом рианодиновых рецепторов эндоплазматического ретикулума и митохондрий, действуя через кофеиноподобный механизм, усиливая чувствительность рианодиновых рецепторов к кальцию [346]. Возможно как прямое, так и опосредованное (через FK-506-связывающий белок 12.6, кальмодулин, SERассоциированные Ca2+-АТФ-азы) влияние цАДФР на цитоплазматическую часть рианодиновых рецепторов, индуцируя механизм «порочного круга» CICR (кальций-индуцированное высвобождение кальция) [116]. Известно, что цАДФрибоза является более сильным кальций-мобилизующим посредником, чем ИТФ (инозитол-1,4,5-трифосфат) [263]. Физиологической является 100-200 нМ концентрация циклической АДФР в гепатоцитах, кардиомиоцитах и нейронах [346]. Кроме мобилизации внутриклеточного кальция из депо, цАДФР выполняет и другие физиологические функции: вовлечена в кальций-зависимые процессы нервной системы (высвобождение нейроотрансмиттеров, синаптическая передача, пластичность и возбудимость); является сигнальной молекулой для многих клеток (нейроны, миоциты, клетки надпочечников и поджелудочной железы, макрофаги, Tлимфоциты); участвует в цитокиноподобной пролиферации кроветворных клетокпредшественников у человека [148, 174, 177, 208]. цАДФР вызывает спазм артериальных сосудов (к примеру, коронарных артерий), вовлечена в патогенез бронхиальной гиперчувствительности и сахарного диабета (снижение синтеза цАДФР в клетках Лангерганса приводит к уменьшению секреции инсулина) [125, 69 168, 299]. В фагоцитах цАДФР участвует в ионных потоках, вызванных АТФ- и НАД+, является вторичным посредником для хемокинов и цитокинов, участвует в продукции активных форм кислорода (АФК) и азота (АФА) и индуцирует выделение хемоаттрактантов [162, 168, 345, 377]. Модуляторами экспрессии (активаторы: ретиноиды, гормоны, витамины, цитокины, транскрипционные факторы, компоненты микроорганизмов) и активности (лиганды − НАД+, CD31; ассоциированные молекулы − гиалуроновая кислота, β2 микроглобулин, РС 1, СD16, СD73, СD26) CD38 являются различные факторы. Вероятнее всего, при взаимодействии CD38 с субстратами (НАД+, цАДФР, НГД+, (негидролизуемый НМН+, аналог НАДФ+) НАД+ или конкурентными 3-NH2-PyAD, ингибиторами АДФР) происходят конформационные изменения СD38, что улучшает или ухудшает это связывание. Для взаимодействия же CD38 с неконкурентными ингибиторами (никотинамид и пиримидины), не требуются конформационные изменения СD38. Таким образом, действуя на преобразование НАД+ в цАДФР, можно воздействовать и на внутриклеточный гомеостаз кальция в CD38+ клетках [217, 326, 395]. Выявлено, что CD38 играет важную роль в социальном поведении мышей, регулируя выброс окситоцина, который, в свою очередь, необходим для взаимного распознавания особей. У CD38-нокаутных мышей наблюдалась социальная амнезия, что напоминает дефекты социального взаимодействия и коммуникации при расстройствах аутистического спектра у людей (нарушения социального взаимодействия/коммуникации происходят либо от случая к случаю, либо в виде «семейной картины») [364]. Наряду с CD38, в патогенезе БП может играть роль CD157 (BST-1) – эктофермент из семейства АДФ-рибозилциклаз, который, как и CD38, обладает АДФ-рибозилциклазной активностью. Показано, что BST1 (CD157) тесно связан с CD38, который является одним из генов кальциевого пути. Обе молекулы, являющиеся эктоферментами и поверхностными рецепторами, утилизируют НАД+ и расположены в пределах 50 kb друг от друга на 4p15 локусе. Вполне возможно, что в некоторых популяциях эти гены находятся в группе сцепления. 70 CD157 действует как молекулярный организатор сигналинг-компетентных мембранных микродоменов и является частью более крупной «молекулярной машины», управляемой интегринами. CD157-интегриновое «партнерство» обеспечивает оптимальную адгезию и трансмиграцию моноцитов человека [152, 302, 386]. Известны два вида ферментов млекопитающих, которые способны производить циклическую АДФ-рибозу внеклеточно (CD38 и CD157), однако существуют данные, указывающие на наличие в головном мозге мышей внутриклеточных мембран-связанных АДФ-рибозил циклаз, отличающихся от CD38 и от CD157. Этот новый фермент, который оказывает более активное участие в развивающемся мозге, чем во взрослой ткани, может играть важную роль в цикло-АДФ-рибоза-вызванной кальциевой сигнализации в процессе развития мозга, а также во взрослой ткани [388]. Итогом работы кальций-мобилизующих посредников является повышение содержания кальция в клетках ЦНС, что при патологических состояниях (гипоксия-ишемия, воспаление и т.д.) может усугублять их проявления за счет чрезмерного усиления метаболизма фагоцитов и гиперпродукции ими активных форм кислорода и азота, усиления потребности тканей в кислороде, что приводит к развитию гипоксии, индукции «кальциевой смерти» клеток [20, 158, 173, 211]. Кальциевый гомеостаз поддерживается за счет его трансмембранного транспорта (натрий-кальциевый обменник, медленные кальциевые каналы, СаАТФ-азы), накопления ионов кальция внутриклеточными депо (ядро, эндоплазматический ретикулум, комплекс Гольджи, митохондрии), активности кратковременных внутриклеточных «депо» (буферных белков: кальмодулина, кальсеквестрина, кальбиндина, аннексина, тропонина, протеинкиназ и др.) [10, 19, 116]. Снижение концентрации внутриклеточного кальция происходит за счет связывания кальция (буферными белками) и его запасания во внутриклеточных депо, выхода кальция из цитоплазмы клеток в межклеточное пространство (кальциевые насосы и обменники цитоплазматической мембраны), его хелирования и деградации. Повышение содержания внутриклеточного кальция 71 осуществляется за счет выхода кальция из внутриклеточных депо и его входа из внеклеточного пространства (каналы L-типа, вольтаж- и лиганд-зависимые ионные каналы), в том числе и за счет механизма кальций-индуцированного высвобождения кальция (CICR) [10, 117, 321]. На клеточной мембране эндоплазматического ретикулума (ЭПР) локализуются рианодиновые рецепторы (RyR), которые активируются под действием сигнальных триггеров (гормонов или нейротрансмиттеров), обеспечивая выход кальция из его депо в цитоплазму. Рианодиновые рецепторы состоят из тетрамера субъединиц массой 500-560 kDa, ассоциированных с 4 субъединицами FK506(FKBP)-связывающих белков массой 12-kDa [258]. Известны три изоформы рианодиновых рецепторов, на клетках ЦНС главным образом экспрессируются рианодиновые рецепторы 2 типа [148, 230]. Известно, что рианодиновые рецепторы играют важную роль в реализации процесса миграции астроцитов при повреждении головного мозга [341]. Интересно, воздействием что цАДФР) гиперактивация приводит к рианодиновых инактивации рецепторов СD38 по (под принципу отрицательной обратной связи (другими механизмами его инактивации являются блокирование антителами, денатурация белка, влияние конкурентных и неконкурентных ингибиторов) и требует конформационных изменений СD38 (для этого рядом с каталитическим сайтом СD38 должен располагаться свободный цистеин, являющийся связующим агентом; также необходимо образование АДФР-оксокарбениум-иона). Известно, что CD38 блокируется связыванием со специфическими антителами [273]. Выявлена взаимосвязь и между сигнализацией внутриклеточного кальция и активностью пуринергических рецепторов P2Y и P2X подтипов. 1.4.3 Коннексины В клетках ЦНС нейроны и клетки глии функционируют в виде единой сети, в которой контакты между астроцитами и олигодендроцитами (астроцитастроцитарные, олигодендроцит-олигодендроцитарные и астроцит- 72 олигодендроцитарные контакты), между химическими синапсами, клубочками и перехватами Ранвье, обеспечиваются белками щелевых контактов (gap junctions), включающими несколько семейств: паннексины (Panx), коннексины (Cx) и иннексины (Inx). Щелевые контакты представляют собой межклеточные каналы, позволяющие осуществлять межклеточные взаимодействия за счет небольших молекул и обмениваться ионами между соседними клетками. Коннексины являются интегральными гексамерные трансмембранными каналы-коннексоны, которые белками, обеспечивают формирующими межклеточный транспорт «малых» молекул размером до 1–1,2 кДа (АТФ, малых РНК), ионов кальция и калия, молекул воды, глутамата, вторичных кальций-мобилизующих посредников и проапоптотических молекул с различным молекулярным весом. В соответсвии с различным молекулярным весом коннексинов, их подразделяют на 20 подвидов [97, 141, 142, 195, 196, 374, 408]. Иммуноэлектронная микроскопия с использованием антител против коннексинов, основных компонентов щелевых контактов, показала иммунореактивность глиальных и нейрональных коннексинов в местах нейронглиальных мембранных соприкосновений [360]. Интересным аспектом щелевых контактов является их возможная роль в регуляции роста и пролиферации. Так, коннексин 43 (Cx43), основной компонент астроцитарных щелевых контактов, был использован в качестве маркера нейрон-глиальных взаимодействий. Астроциты экспрессируют Cx43, который отсутствует в олигодендроцитах. Вполне вероятно, что гетеротипические переходы между этими двумя типами глиальных клеток сделаны из каналов, состоящих из Cx43 и Cx32. Нейронглиальные взаимодействия могут нарушать процесс распознавания коннексина 43 антителами, причем повреждение Cx43 коррелирует с нейрональной потерей, в модели «виртуального отсутствия астроцитарных щелевых контактов» с добавлением каиновой кислоты показана гибель нейронов [408], что может свидетельствовать о роли как нейрон-глиальных взаимодействий, так и коннексина 43 в поддержании жизнеспособности взимодействующих клеток [197]. 73 Известно, что коннексины, не имеющие контактов с коннексинами соседних клеток, формируют «открытые» во внеклеточное пространство каналы, которые также могут использоваться для транспорта некоторых молекул (например, Cx43 образует каналы, опосредующие транспорт АТФ, кальция и НАД+ из цитозоля к активному сайту НАД+-гликогидролаз, играя роль в межклеточной коммуникации; Cx43 также может функционально взаимодействовать с эктоферментом CD38, действуя через активацию каналов, сопряженных с рианодиновыми рецепторами), функционально взаимодействуя в мембранах ряда клеток с механизмами утилизации НАД+, обеспечивая биодоступность НАД+ в качестве субстрата для каталитической реакции [42, 71, 140, 149, 150, 260, 280, 392]. В эксперименте показано, что функциональное разобщение между CD38 и коннексином 43 в CD38-позитивных клетках сопровождается снижением уровня внутриклеточного кальция вследствие редукции межклеточной передачи НАД+. Известна модель, согласно которой НАД+ высвобождается из клеток через коннексиновые каналы и выполняет гормоноподобную функцию, стимулируя активность CD38. Интересно, что коннексин 43 в фосфорилированной форме не обладает способность транспортировать НАД+. Указанные взаимодействия между CD38 и коннексином 43 обеспечивают дополнительный механизм ауторегуляции уровня НАД+ в клетках: повышение концентрации внутриклеточного кальция приводит к активации кальций-зависимой протеинкиназы и фосфорилированию коннексина 43, что превращает его в молекулу, не способную транспортировать НАД+. Механизм ауторегуляции позволяет избежать потерь НАД+ из клеток, предотвращает истощение внутриклеточной концентрации НАД+ вследствие гиперактивности ферментов его метаболизма, предохраняя клетку в целом от усиленной генерации цАДФР и «кальциевой перегрузки» [71, 357]. Изменения экспрессии коннексинов в различных патологических ситуациях могут повлиять на функционирование астроглиального сетей. При ишемии головного мозга и нейродегенерации реактивный астроглиоз вызывает повышение уровня экспрессии Cx43, хотя эта экспрессия также может возникнуть 74 в результате интернализации щелевых контактов, и, следовательно, не обязательно отражает увеличение числа внутриклеточных каналов щелевых контактов или астроглиальных сетей [97]. Учитывая роль щелевых контактов в буферизации ионов, дистантной сигнализации и обмена малыми молекулами в астроглиальных сетях, была предложена нейропротекторная роль астроглиальных каналов щелевых контактов. Тем не менее, остается спорным, является ли усиление связи между каналами полезным или вредным при патологических состояниях. Некоторые исследователи предположили, что Cx43-содержащие каналы или полуканалы могут играть определенную роль в выживании нейронов при ишемии. Во-первых, у Cx43-нокаутных мышей проявляется больший объем инфаркта, чем у мышей дикого типа после индукции ишемии. Недавно было показано, что при гипоксическом прекондиционировании коннексиновые полуканалы играют ключевую роль: эти полуканалы являются транспортерами АТФ, который, в свою очередь, быстро превращается в мощный нейропротектор аденозин [97]. Напротив, коммуникации за счет щелевых контактов в астроцитах могут усиливать и распространять повреждение клеток, позволяя провести внутриклеточную диффузию «сигналов смерти», которые убивают соседние клетки. Такой «эффект безучастия» может представлять вторичное повреждение в дистальных участках органотипических при ишемии гиппокампальных головного мозга. слайс-культурах Действительно, при в гипоксическом, гипогликемическом или травматическом повреждении, приложение блокаторов Cx каналов или Cx43-миметиков вызывает снижение клеточной смерти [97]. В глиальных клетках головного мозга экспрессия коннексинов обнаружена в эмбриональном периоде и сохраняется на протяжении всей взрослой жизни с качественными и количественными различиями между различными типами клеток глии. В астроцитах в основном экспрессируются Cx43 (с раннего эмбрионального этапа развития) и Cx30 (в зрелых серых астроцитах), а также обнаруживается незначительная экспрессия Cx26, Cx40 и Cx45 [200]. Во время развития происходит постепенное снижение экспрессии 75 коннексинов и каналов щелевых контактов в нейронах. Корреляция между изменением экспрессии коннексинов и дифференцировкой нейронов показывают, что ранняя Cx-опосредованная межклеточная коммуникация позволяет сигнальным молекулам диффундировать между нейронами и способствует запуску их дифференцировки. Было обнаружено восемь типов коннексинов (Cx26, Cx32, Cx36, Cx37, Cx40, Cx43, Cx45 и Cx47) в определенных нейронных популяциях: главным образом в гипоталамусе, стриатуме, нижней оливе, гиппокампе, обонятельных луковицах, сетчатке, коре головного мозга и мозжечке. Экспрессия мРНК, кодирующих Cx26, Cx32, Cx36 и Cx43 была обнаружена в дофаминергических нейронах черного вещества среднего мозга [200]. В астроцит-астроцитарной сигнализации играют роль такие композиции каналов щелевых контактов, как Cx30/Cx30, Cx43/Cx30 и Cx43/Сх43, в астроцитолигодендроцитарной сигнализации - композиции Cx47/Cx43, Cx47/Cx30, Cx32/Cx30, Cx32/Cx26, в олигодендроцит- олигодендроцитарной сигнализации – коннексины Cx32 и Cx47. В нейрон-глиальной взаимосвязи ЦНС взрослых лишь в небольшом количестве областей обнаружены щелевые контакты [200]. 1.4.4 Молекулы активированной микроглии и их роль в патогенезе ишемии головного мозга и нейродегенерации Микроглия, резидентные иммунные клетки в центральной нервной системе, как правило, неактивны, но активируются после инфекции или повреждения. Покоящаяся микроглия очень чувствительна к разнопричинному нарушению микроокружения головного мозга и может быстро активироваться при патологических событиях (например, при инфекции и воспалении), что приводит к воспалительному ответу. В покоящемся состоянии клетки микроглии неповрежденного мозга имеют разветвленную морфологию с низкой экспрессией мембранных рецепторов (CD45, CD14 и Mac-1), которые необходимы для реализации нормальных функций фагоцитов. Было показано, что ранняя активация микроглии при 24 часовой экспозиции стимула приводит к повышению 76 реактивности микроглиального иммуноглобулина G, повышению экспрессии CD1 и молекул клеточной адгезии (например, лимфоцит-ассоциированного антигена LFA-1, Mac-1, молекулы межклеточной адгезии ICAM -1 и сосудистой адгезии клеток VCAM-1) [415]. В результате активации микроглии происходит реорганизация внутреннего цитоскелета, клеточное тело увеличивается, микроглия становится похожа на макрофаги. В конечном счете, при дальнейшем присутствии индуцирующего стимула, микроглия становится активированной и длительно поддерживается в таком состоянии с усилением активности главного комплекса гистосовместимости (МНС) 2 класса и воспалительных гликопротеинов (CD40, CD80 и CD86), которые обеспечивают мощный стимул для последующей активации иммунокомпетентных клеток. В дальнейшем количество микроглии может уменьшаться, клетки могут терять маркеры активации и возвращаться в состояние покоя, если активирующий стимул исчезает. Однако, если патологический стимул сохраняется, происходит существенное увеличение маркеров активации микроглии и молекул клеточной адгезии, что образует кластер активированной фагоцитирующей микроглии вокруг нейронов (в частности, дофаминергических), вызывая их повреждение и прогрессирующую необратимую гибель. При этом гибнущие нейроны выпускают хемоаттрактанты, вызывающие еще больший приток в очаг повреждения активированной микроглии по механизму «порочного круга» [415]. Активация микроглии при активация-индуцированной гибели клеток связана с активностью CD38, через свой кальций-мобилизующий метаболит циклическую АДФ-рибозу. CD38 может существенно влиять на регуляцию количества и функций активированной микроглии, с важными последствиями для повреждения и репарации головного мозга в норме и при патологии ЦНС [151]. НАД(Ф)Н-оксидаза (NOX2, EC 1.6.3.1) фагоцитов является ключевым ферментом генерации активных форм кислорода, подвергающимся процессу самосборки на цитоплазматической мембране [172]. NOX2 – комплекс, состоящий из трансмембранного цитохрома b558 (а в его состав, в свою очередь, входят 77 субъединицы p22phox и gp91phox) и цитозольных компонентов (p47phox и p67phox). В дополнение к указанным, для полной активности НАД(Ф)Н-оксидазы в фагоцитах требуется не менее пяти других компонентов: Rac1(ГТФ-аза), Rac2, p40phox, протонный канал и Rap1A. Компоненты НАД(Ф)Н-оксидазы в неактивной клетке разрозненны, что гарантирует отсутствие активации NOX2 в покоящейся клетке [191, 192, 245]. При активации NOX2 фагоциты контролируемо и локально начинают вырабатывать супероксид-анион-радикалы. В присутствии ионов кальция НАД(Ф)Н- оксидаза генерирует перекись водорода, передавая электроны из внутриклеточного НАД(Ф)Н на внеклеточный молекулярный кислород. Синтезированные супероксид-анион-радикалы далее способны превращаться (через образование перекиси водорода и воды) в другие активные формы кислорода (синглетный кислород, гидроксильный радикал и др.). При взаимодействии супероксид-анион-радикала с оксидом азота образуется пероксинитрит, активная форма кислорода и азота с очень сильными окислительными свойствами [79, 272]. В физиологических условиях, при достаточной работе антиоксидантных систем в организме, выработка АФК и АФА происходит локально в фагосомах фагоцитирующей клетки, что приводит к токсичности и гибели инфекционного агента, активирующего этот фагоцит. Также известно, что в норме активные формы кислорода могут функционировать и как вторичные посредники внутриклеточной сигнализации [272, 335, 353]. Однако чрезмерная активация НАД(Ф)Н-оксидазы и гиперпродукция свободных радикалов в условиях патологии, особенно в сочетании с дисфункцией системы антиоксидантой защиты, могут привести к «окислительному стрессу». Так, некоторые интерлейкины и интерфероны резко потенциируют генерацию АФК, что может вызывать redox-активацию различных участников сигнальных путей (протеинкиназы, белковые фосфатазы, транскрипционные факторы и др.) и, вместе с внутриклеточным кальцием, активировать клеточную гибель. Кроме того, сам процесс «рекрутинга» моноцитов в макрофаги инициирует выработку множества свободных радикалов, что может способствовать усилению 78 воспалительного ответа [89, 272, 353]. Одним из следствий длительной и сверхсильной метаболической активности фагоцита может быть истощение его антиоксидантных систем и саморазрушение. адаптационный Вероятно, механизм этот в процесс может противоинфекционной рассматриваться защите как организма, предохранящий его от персистенции инфекционных агентов [183]. НАД(Ф)Н-оксидазной активностью в фагоцитах опосредовано раннее событие апоптоза - экстернализация фосфатидилсерина. НАДФH-оксидаза участвует в регуляции мембранного потенциала, запуске кальциевого потока в активированных фагоцитах и по принципу положительной обратной связи стимулирует активацию P2X7 рецепторов клеток нейрональной природы [75]. Генерация активных форм кислорода фагоцитами зависит от распределения кислорода вокруг и внутри клеток даже при адекватном содержании его в среде и блокируется приложением специфических модуляторов [31]. Модуляторами НАД(Ф)Н-оксидазы в (пато)физиологических условиях являются дифениленйодониум (DPI, ингибитор клеточных флавопротеидов) и апоцинин (критический модулятор НАД(Ф)Н-оксидазы и нейропротектор при экспериментальной ишемии головного мозга). Интересно, что DPI может сенсибилизировать клетки к Fas-индуцированному апоптозу [231, 329]. Фагоцитарная НАД(Ф)Н-оксидаза остается значимым объектом исследований ученых. Интерес к ней возрос в связи с накоплением сведений о том, что оксидазы, схожие с лейкоцитарной, обнаружились в ряде других клеток, в том числе и клеток ЦНС, где этот фермент выполняет ряд функций. НАД(Ф)Ноксидаза играет роль в патогенезе нейродегенерации за счет генерации АФК и может являться новой терапевтической мишенью. Так, при болезни Паркинсона отмечена критическая роль микроглиальной НАД(Ф)Н-оксидазы в гибели нейронов за счет продукции супероксид-анион-радикалов. НАД(Ф)Н-оксидаза 1 типа может играть роль в модуляции экспрессии и аггрегации α-синуклеина и экспрессии убиквитина в дофаминергических нейронах при БП, а НАД(Ф)Ноксидаза 2 типа негативно регулирует уровень протеолиза при созревании 79 фагосом в макрофагах и является микробицидным эффектором, глобальным модулятором фагосомной физиологии, участвующим в антигенном процессинге. Эффектор HMGB1 высвобождается из воспалительной микроглии и/или поврежденных стимулируя нейронов, активирует NF-kB пути продукцию нескольких и воспалительных НАД(Ф)Н-оксидазу, и нейротоксических факторов. Интересно, что сигналинг HMGB1-Mac1-НАД(Ф)Н-оксидаза является основой для хронической прогрессии БП [139, 185, 335, 415]. Mac-1 (макрофагальный антигенный комплекс, рецептор комплемента 3 типа, CR3, интегрин αMβ2, CD11b/CD18) - мембранный белок, гетеродимерный интегрин семейства β2-интегринов, состоящий из альфа-(CD11b) и бета-цепи (CD18), является членом семейства лейкоцит-специфических интегринов, относящихся и к молекулам клеточной адгезии, и к образ-распознающим рецепторам. CD11b участвует в функционировании миелоидных клеток (в адгезии, миграции, хемотаксисе, фагоцитозе и индукции окислительного стресса) [224]. Mac-1 является рецетором адгезии лейкоцитов, связывает молекулу межклеточной адгезии 1 (ICAM-1), эндотелиальный лейкоцитарный рецептор адгезии, C3bi фрагмент C3 компонента комплемента, молекулу гепарина и фибриногена, коагуляционного взаимодействует с стимулирующий фактора Fc-рецепторами, функции X; образуя полиморфноядерных Mac-1 функционально иммунный нейтрофилов комплекс, [70]. Mac-1 опосредует фагоцитоз опсонизированных частиц и функционирует как лектин, способный связывать некоторые углеводы. Mac-1 экспрессируют фагоциты (нейтрофилы, естественные киллеры, мононуклеарные фагоциты, микроглия), его экспрессия повышается под действием цитокинов. Гетеродимеры CD11/CD18 участвуют в межклеточной адгезии: они вовлечены в инициацию В- и Тклеточной пролиферации, в Т-клетки-опосредованный цитолиз и взаимодействие лейкоцитов с другими тканями, включая эндотелий. Сродство CD11/CD18 к ICAM-1 увеличивается при активации Т-клеток. Mac-1 способен модулировать процесс клеточного выбора: в присутствии ИЛ-2 он может приводить к увеличению продолжительности жизни иммунной клетки, а в присутствии ФНО-α 80 индуцирует апоптоз и селективное удаление клеток. В экспериментах in vitro показано, что клетки микроглии, экспрессирующие Mac-1, опосредуют нейротоксичность [70, 262]. Последние данные показали, что CD11b/CD18 может быть вовлечен в процесс активации микроглии при воспалительных и демиелинизирующих заболеваниях. Mac1 также играет важную роль в активации НАДФН-оксидазы в ответ на окислительный стресс. Другие данные свидетельствуют о том, что экспрессия Mac1 способна вызывать активацию сигнального пути, связанного с транскрипционным фактором NF-kB. Повышенная экспрессия Mac-1 на микроглии при многих нейродегенеративных заболеваниях, в том числе и при болезни Паркинсона, соответствует активации микроглии. Возможной биологической ролью этой повышенной экспрессии при нейродегенерации может быть роль Mac1 как посредника между микроглиозом, микроглия- индуцированным окислительным стрессом и воспалительной реакцией, приводя к дофаминергической нейродегенерации и замыкая «порочный круг» между этими двумя событиями [224]. При церебральной ишемии происходит индукция воспалительной реакции, усиливающаяся при реперфузии, что подтверждается инфильтрацией ткани мозга лейкоцитами. Mac-1 в неактивной форме экспрессируется на поверхности лейкоцитов, но изменяет конформацию на активную, усиливает свою экспрессию на клеточной поверхности под действием провоспалительных медиаторов [262]. Система комплемента участвует в фагоцитирующей функции микроглии. С3 компонент комплемента является его центральным компонентом, обеспечивая врожденную иммунную защиту от патогенов через классический, альтернативный и лектиновый пути активации комплемента. Эти три различные пути активации комплемента сходятся на образовании С3-расщепляющих ферментов (например, С3 конвертаз), которые расщепляют С3 приводит к образованию фрагментов С3а, C3b и iC3b. В конечном счете, активация системы комплемента может привести к образованию мембраноатакующего комплекса, что приводит к лизису необходимых патогенов. C3b, iC3b и C4b фрагменты способствуют фагоцитозу 81 патогенов путем связывания с другими рецепторами (такими, как CR1 (CD35), CR3 (Mac-1, CD11b/CD18) и CR4 (CD11c/CD18)). Продукция С3 компонента комплемента и ассоциированных с ними рецепторов комплемента активируются в головном мозге пациентов с болезнью Альцгеймера и болезнью Паркинсона [136]. β-амилоидный пептид, связанный с болезнью Альцгеймера и болезнью Паркинсона, активирует MAC1 рецептор, повышая активность PI3K, которая, в свою очередь, фосфорилирует p47phox, вызывает перемещение цитозольных субъединиц НАД(Ф)Н-оксидазы в микроглии, активируя ее, что приводит к интенсивной продукции супероксид-анион-радикалов и к окислительному стрессу [156]. С другой стороны, при болезни Альцгеймера показана позитивная роль связывания С3 компонента комплемента и/или продукта его расщепления iC3b с Mac-1. Это взаимодействие вызывает фагоцитоз и уничтожение βамилоидных бляшек клетками микроглии. При болезни Паркинсона в дофаминергических нейронах на ранних стадиях наблюдается активация 3 компонента комплемента (iC3b), а на поздних – 9 компонента (С9). Активация комплемента в дофаминергических нейронах, сниженная при нормальном старении, также может свидетельствовать о возможной нейропротекторной роли этого процесса в нормальной черной субстанции [136]. При нейродегенеративных расстройствах микроглиальная токсичность не ограничивается нейронами, она также вызывает гибель опухолевых клеток. Микроглиальная цитотоксичность осуществляется при посредничестве молекул, связанных с активацией и функциональной дифференцировкой макрофагов (свободные радикалы, хинолиновая кислота, цитокины). Интрагиппокампальные инъекции каиновой кислоты значительно увеличивают экспрессию моноцитами хемоаттрактантного белка-1 (MCP-1) и макрофагального воспалительного белка-2 (MIP-2), что свидетельствует о возможном участии этих хемокинов в нейродегенеративных и регенеративных процессах, возможна их аутокринная и паракринная роль в регуляции «жизни и смерти» нейронов гиппокампа после травмы ЦНС [213]. При БП наблюдается усиленная регуляция молекул главного комплекса 82 гистосовместимости: в черной субстанции пациентов увеличивается количество HLA-DR-позитивной микроглии (антигены II класса) [199, 276], в то время как легкая цепь HLA антигенов I класса (β2-микроглобулина) повышается в стриатуме [415]. Обнаружено участие цитокинов в активации выработки оксида азота в глиальных клетках. ФНО-α, ИЛ-1β и ИФН-γ являются мощными стимуляторами индуцибельной синтазы оксида азота (iNOS) или циклооксигеназы 2 (COX2) в клетках глии, индуцируя экспрессию молекулы CD23. Активация CD23 также индуцирует экспрессию концентраций iNOS и приводит к высвобождению высоких оксида азота (NO). NO может стимулировать продукцию провоспалительных цитокинов (ФНО-α и ИЛ-6) в глиальных клетках по механизму «порочного круга» и высвобождение железа от транспортного белка ферритина, оказывающего токсическое действие, так как свободное железо является чрезвычайно токсичным и может усилить образование гидроксильных радикалов. АФК также может генерироваться работой ферментов, участвующих в развитии воспаления (циклооксигеназы-2/COX-2/ЦОГ-2) [200, 276]. Ингибиторы iNOS (например, белок калирин) могут обладать терапевтически важным потенциалом [415]. Интерлейкин 1 (IL-1) является важным цитокином, участвующим в различных биологических процессах, в том числе иммунных реакциях, воспалении, тканевой деградации. IL-1 состоит из двух белков, обозначенных как IL-1α и IL-1β. Повышенный уровень IL-1α связан с рядом хронических заболеваний, включая ревматоидный артрит, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона. IL-1β продуцируется активированными макрофагами в виде пробелка, который подвергается протеолитическому процессингу, превращаясь в его активную форму с помощью каспазы 1. IL-1β является важным медиатором воспалительной реакции, участвует в реализации различных клеточных функций, включая клеточную пролиферацию, дифференцировку и апоптоз [415]. LDL рецептор (LDLR, рецептор липопротеинов низкой плотности) является прототипом семейства скавенджер-рецепторов, которые участвуют в рецептор- 83 опосредованном эндоцитозе специфических лигандов апоВ-100 и апоЕ [415]. Конечным итогом активации микроглии и ее цитотоксичности является гибель нейронов и глии путем апоптоза или некроза. При активации микроглии и макрофагов возможна также индукция собственной гибели несколькими путями, каждый из которых возможен при нейровоспалении: «активационный апоптоз», индуцированный за счет гиперпродукции фагоцитами цитокинов, активных форм кислорода и азота; стресс-индуцированный апоптоз; апоптоз вследствие пролонгированной стимуляции Р2Х7 рецепторов; кальций-индуцированный апоптоз; апоптоз, индуцированный патогенными микроорганизмами и Fas- лиганд-индуцированный апоптоз [106]. 1.5 Клеточная гибель и ее особенности при патологии ЦНС Клеточная гибель в клетках нейрональной и глиальной природы характеризуется некоторыми особенностями: апоптоз, чаще всего, начинается с разрушения синапсов, сопровождается нарушением ионного гомеостаза нейронов, дизрегуляцией нейрон-глиальных взаимодействий и процесса рецепции нейротрансмиттеров. В то же время, не ясна роль апоптоза в повреждении клеток ЦНС в (пато)физиологических условиях. К примеру, активность каспаз необходима для выполнения многих (пато)физиологических событий, связанных с запрограммированной гибелью клеток (гибель клеток в эмбриогенезе, терминальная дифференцировка клеток, реализация феномена прекондиционирования при ишемии клеток), при нейродегенерации изменение интенсивности апоптоза может играть важную роль в работе клеток нейрональной и глиальной природы [46, 238, 251]. Реализация клеточной гибели в клетках ЦНС может происходить как в нейронах, так и в клетках глии, и ее молекулярные механизмы не отличаются принципиально от аналогичных механизмов в клетках других типов: происходит активация специфического процесса внутриклеточного протеолиза, в результате чего разрушаются ключевые ядерные и цитоплазматические белки [187, 244, 315]. Однако, функционирование этих механизмов (к примеру, каспаз) в клетках 84 нервной системы может отличаться от других клеток. К настоящему времени до конца не выяснены особенности работы различных каспаз в динамике нейронального апоптоза. Известно, что каспазы участвуют как в патологических (повреждение нейронов), так и физиологических процессах (феномены прекондиционирования и нейропротекции) функционирования ЦНС [39, 80, 187]. При ишемии головного мозга запуск апоптоза наблюдается не только в период ишемии, но и в процессе реперфузии, что связано с развитием окислительного стресса. Особенностью апоптоза при окислительном стрессе является повреждением ядра и митохондрий с повышением проницаемости мембран митохондрий и высвобождением в цитозоль смеси из проапоптотических белков [39, 393]. Острая нейродегенерация в развивающемся мозге также имеет свои особенности, т. к. протекает на фоне интенсивной физиологической запрограммированной клеточной смерти. Это обусловлено главным образом присутствием большого количества индукторов и медиаторов апоптоза, как это было обнаружено в головном мозге новорожденных. Однако механизмы иницииации и прогресии клеточной гибели могут отличаться от аналогичных механизмов в зрелом мозге и в развивающемся мозге в условиях патологии. Так, отмечена гетерогенность уровня апоптоза в различных регионах головного мозга (через 12 часов с момента развития нейродегенерации уровень апоптоза в коре и базальном ганглии максимален и сохраняется на таком уровне в течение 7 суток, а в таламусе, зубчатой извилине гиппокампа и эпиталамусе апоптоз максимален через 24-72 часа развития ишемии, а затем снижается) при развитии гипоксииишемии у крысят, что вероятнее всего, связано с асинхронностью вхождения клеток в апоптоз, а также с особенностями функционирования нейрон-глиальных (нейрон-астроцитарных и астроцит-эндотелиальных) взаимодействий в разных регионах мозга. В то же время, тяжелая дисфункция митохондрий с истощением запасов АТФ в клетке приводит к развитию некроза, так как для завершения программы апоптоза требуется сохранность некоторых митохондриальных процессов [49, 90, 91, 112, 251]. 85 В целом, при острой и хронической нейродегенерации ключевыми событиями, определяющими направление гибели клеток ЦНС, являются особенности повреждения синапсов и дисфункция митохондрий (т. к. они являются основным участком аккумуляции митохондрий в нейронах, известен особый вид клеточной гибели – «Валлерова дегенерация», которая характеризуется локальным апоптозом в аксоне при сохранности тела нейрона, программа апоптоза также может запускаться локально в синаптических терминалях и дендритах), активация фагоцитов и их скопление вокруг поврежденных клеток, снижение уровня энергетических субстратов (АТФ, фосфокреатина и др.) и нуклеотидов в ткани мозга при повышенном энергопотреблении, содержания окислительный кальция и стресс, особенности повышение экспрессии внутриклеточного некоторых молекул (нуклеотидные рецепторы Р2Х7 подтипа, НАД(Ф)Н-оксидаза и молекулы активированной микроглии, CD38, CD157, коннексин 43, молекулы клеточной адгезии и др.) в клетках ЦНС [24, 39, 244]. Таким образом, исследования в области роли метаболизма НАД + и нейронглиальных взаимодействий в патогенезе острой и хронической нейродегенерации, несмотря на новые знания, не утратили своей актуальности. Знание ключевых элементов патогенеза острой и хронической нейродегенерации может привести к лучшему пониманию этих болезней и разработке новых терапевтических стратегий [360]. Последние достижения в расшифровке клеточных и молекулярных механизмов острой и хронической нейродегенерации могут предложить новые перспективные биомаркеры и терапевтические мишени для модуляции нейронглиальных взаимодействий. Такими биомаркерами могут быть механизмы метаболизма НАД+ в нейронах и астроцитах в качестве важнейшего фактора в нейродегенерация-ассоциированного повреждения клеток. Оценка активности мозга при интерактивной сигнализации между нейронами и глией открывает новые перспективы для понимания патогенеза заболеваний головного мозга [276]. Так, возможности фармакологической коррекции функциональной гиперемии при 86 нейродегенерации и нейровоспалении находятся в настоящее время в стадии изучения, при этом наибольшее внимание сосредоточено на препаратах, влияющих на пуринергические системы, так как именно аденозин и его производные могут оказывать комплексное действие на все компоненты нейроваскулярной единицы. Однако на настоящий момент в арсенале фармакологических средств отсутствуют зарегистрированные и разрешенные для клинического применения препараты, являющиеся селективными агонистами отдельных подтипов данных рецепторов [21]. ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектом исследования являлись самцы белых нелинейных и линейных (линия Wistar) молодых крыс возрастом 3-4 месяца (ювенильный возраст, масса 180-250 г, модель ишемии головного мозга) и зрелых крыс возрастом 11-12 месяцев (зрелый возраст, масса 300-500 г, модель ротенонового паркинсонизма), нелинейные и линейные крысята обоего пола возрастом 7 дней (период молочного кормления, масса 10-13 г, модель перинатальной гипоксии-ишемии) и 1-60 дней (периоды молочного кормления и полового созревания, модель аутизма). Эксперименты на животных были одобрены представителями биоэтической комиссии по работе с лабораторными животными при локальном этическом комитете и локальным этическим комитетом КрасГМУ и проводились согласно «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. N 755), национальному стандарту Российской Федерации ГОСТ Р 53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики» и приказу Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (Минздравсоцразвития России) от 23 августа 2010 г. N 708н г. Москва "Об утверждении Правил лабораторной практики". Животные содержались в хорошо вентилируемом, освещенном, отапливаемом помещении со своевременной уборкой, при 12-часовом световом цикле, не более пяти в одной клетке и имели свободный доступ к пище и воде. 87 Эвтаназию крыс проводили пуетм передозировки наркоза (фоторотан). Далее животных декапитировали и на льду производили забор исследуемых областей головного мозга (кора передних полушарий головного мозга и средний мозг). Забор материала проводили на 30-е сутки с момента моделирования экспериментальной болезни Паркинсона, через 24 и 48 часов после создания моделей ишемии головного мозга, через 72 часа с момента моделирования перинатальной гипоксии-ишемии и на 60-е сутки постнатального развития животных с моделью аутизма. Осмотр животных, биохимические, морфологические, иммуногистохимические, спектрофлуориметрические исследования проведены в центре коллективного пользования НИИ молекулярной медицины и патобиохимии при ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В. Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава России. Замороженные и парафиновые срезы головного мозга готовили на кафедре патологической анатомии им. проф. П. Г. Подзолкова ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В. Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава России. 2.1 Создание экспериментальных моделей острой и хронической нейродегенерации Моделирование острой глобальной неполной ишемии головного мозга крыс осуществлялось в операционной комнате НИИ молекулярной медицины и патобиохимии анестезированным животным (фторотан ингаляционно) путем экстравазальной окклюзии (перевязки лигатурой) общих сонных артерий (ОСА), использовались два варианта: неполная глобальная ишемия с более легким течением – унилатеральная перевязка правой ОСА (Levine и Payan, 1966) и неполная глобальная ишемия с более тяжелым течением – билатеральная перевязка ОСА (Eklof и Siesjo, 1972). При создании модели экспериментальной ишемии головного мозга исследуемые животные (самцы аутбредных крыс линии Wistar, возраст 3-4 месяца, масса 180-250 г, n=70) были разделены на 7 групп по 10 крыс: 88 контрольная группа 1 (К1) – интактные крысы; контрольная группа 2 (К2) – крысы с проведением «ложной операции» с оценкой параметров и забором материала через 24 часа с момента проведения операции; контрольная группа 3 (К3) – крысы с проведением «ложной операции» с оценкой параметров и забором материала через 48 часов; экспериментальная группа 1 (Э1) – билатеральная окклюзия ОСА с оценкой параметров и забором материала через 24 часа с момента проведения операции; экспериментальная группа 2 (Э2) – билатеральная окклюзия ОСА, оценка параметров и забор материала - через 48 часов; экспериментальная группа 3 (Э3) – унилатеральная окклюзия ОСА, 24 часа с момента проведения операции и экспериментальная группа 4 (Э4) – унилатеральная окклюзия ОСА, 48 часов с момента проведения операции. Для исключения эффекта наркоза и операционного стресса, кроме группы негативного контроля, были введены 2 группы ложно-оперированных животных. Моделирование перинатальной гипоксии-ишемии головного мозга анестезированным животным (кетамин, 5 мг/кг веса) осуществлялось по методу Rice J. et al. (1981) путем экстравазальной окклюзии правой ОСА на 7 сутки постнатального развития крысят с их помещением на 1 час под купол с низким содержанием кислорода (8%, температура 28-30ºС). Экспериментальная группа (Э5) включала 10 животных с моделью гипоксически-ишемического повреждения головного мозга, контрольную группу (К4) составили 5 ложно-оперированных животных. Экспериментальная ротеноновая модель паркинсонизма выполнялась по методикам Ferrante R.J. et al., 1997 и Sherer T.B., 2003 с модификациями. Данная модель представляет модель хронического системного введения ротенона и включала ежедневные подкожные инъекции ротенона (1-3 мг/кг веса/в сутки) c растворителем. При постановке модели ротенонового паркинсонизма на нелинейных животных (самцы нелинейных крыс-альбиносов, возраст 11-12 месяцев, масса 300-500 г, n=15) экспериментальная группа (ЭГ) включала 5 крыс с ежедневным подкожным введением ротенона с растворителем, контрольная группа животных 89 включала 2 подгруппы: интактные животные (НК - негативный контроль, n=5) и животные (ПК - «позитивный» контроль, n=5) с ежедневным подкожным введением растворителя (ДМСО и ПЭГ-300, 1:1). Критерием включения в группы наблюдения при постановке модели ротенонового паркинсонизма являлось нормальное исходное состояние неврологического статуса (0 баллов по неврологической шкале NSS и отсутствие нестабильности, неустойчивость походки, олигокинезии, постуральной тремора в покое, мышечной ригидности и нарушений равновесия, по 0 баллов за каждый из перечисленных признаков) крыс до проведения эксперимента. Далее исследования по моделированию паркинсонизма проводились на линейных крысах (самцы аутбредных крыс линии Wistar, возраст 11-12 месяцев, масса 300-500 г, n=60): контрольная группа животных (К5, n=30) включала ежедневное подкожное введение растворителя (100% ДМСО), экспериментальная группа (Э6, n=30) - ежедневные подкожные инъекции ротенона (1-3 мг/кг веса/в сутки) c растворителем (100% ДМСО, n=30). При отборе исключались животные с грубой неврологической патологией (более 2 баллов по шкале NSS), а также животные, имевшие свыше 2 баллов при осмотре животных на наличие признаков паркинсонизма. Экспериментальная модель нарушения развития головного мозга создавалась путем подкожных инъекций беременным самкам крыс на 12-й день после зачатия либо 0,5 мг/кг веса ротенона в растворителе (100% ДМСО, группа Э7, n=17), либо комбинацию вальпроевой кислоты и ротенона (инъекция 500 мг/кг веса вальпроевой кислоты в физиологическом растворе и инъекция 0,5 мг/кг веса ротенона в растворителе, группа Э8, n=11), либо 500 мг/кг веса вальпроевой кислоты в физиологическом растворе (классическая модель аутизма, группа Э9), либо только растворитель (100% ДМСО, группа К6, n=13) из расчета 1 мл/кг веса. 2.2 Тесты для поведенческого фенотипирования животных в моделях острой и хронической нейродегенерации Тесты для поведенческого фенотипирования животных в моделях острой и 90 хронической нейродегенерации включали их осмотр на наличие специфических признаков паркинсонизма и аутизма, шкалу для оценки неврологического дефицита животных, тесты для оценки сенсомоторной и моторной дисфункции передних и задних конечностей (в том числе и тесты для оценки «мелкой моторики» передних лап крысы, которая имеет некоторое сходство с мелкой моторикой рук человека, страдающей нейродегенерации), тест для оценки исключения или подтверждения при острой и ольфакторной функции роли ольфакторной хронической крыс (для дискриминации в социальном поведении крыс). 2.2.1 Осмотр животных на наличие признаков паркинсонизма При осмотре животных в баллах (приложение Ж) оценивали основные (гипо-, бради- и олигокинезия, постуральная нестабильность, неустойчивость походки) и дополнительные (ригидность мышц, тремор, нарушение равновесия) признаки паркинсонизма, которые не всегда присутствуют при экспериментальном моделировании болезни Паркинсона. Основные и дополнительные параметры оценивали по 3-балльной шкале: гипо-, бради- и олигокинезию (замедление и уменьшение частоты движений), постуральную нестабильность (постуральный баланс - способность поддерживать и управлять общим центром массы тела в пределах базы поддержки его опоры в целях предотвращения падения или потери равновесия при статическом и динамическом положениях) [8], неустойчивость походки, ригидность мышц (скованность, мышечная напряженность, «ступенчатый характер» затруднения сгибания конечностей и гипертония по типу «зубчатого колеса») по симптому «горбатости» спины, выраженность которого зависит от мышечной ригидности и определяется по уменьшению расстояния от шеи до основания хвоста за счет сгорбленности животного [2, 3, 40], тремор (тремор покоя, баллы определяли в зависимости от характера тремора – локального или генерализованного, мелко или среднеамплитудного) [40]. Оценивали также суммарную выраженность признаков паркинсонизма (1-18 баллов). 91 Оценку выраженности признаков паркинсонизма при постановке модели проводили перед моделированием паркинсонизма, на 2-е, 4-е, 7-е, 10-е, 14-е, 21-е и 28-е сутки с момента первой инъекции ротенона с растворителем, в последующем оценку проводили до моделирования ротенонового паркинсонизма и на 28-29 сутки с момента введения ротенона и растворителя. 2.2.2 Тест открытое поле Тест «открытого (свободной) постуральную поля» двигательной позволяет выявить активности нестабильность и нарушения (горизонтальной неустойчивость и спонтанной вертикальной); ходьбы; вегетативную дисфункцию (увеличение или уменьшение количества и изменение консистенции болюсов, увеличение частоты уринации); нарушение эмоциональности (увеличение времени замирания крысы, снижение частоты или отсутствие груминга). Оценку выраженности признаков паркинсонизма и вегетативных нарушений в тесте «открытое поле» при постановке модели проводили перед моделированием паркинсонизма, на 2-е, 4-е, 7-е, 10-е, 14-е, 21-е и 28-е сутки с момента первой инъекции ротенона с растворителем, в последующем оценку проводили до моделирования ротенонового паркинсонизма и на 28-29 сутки с момента введения ротенона и растворителя. Тест «открытого поля» проводили в квадратной площадке площадью 1 м2, ограниченную бортами высотой 45 см. Животное тестировали 8 минут, при посадке крысы в тест фиксировали латентный период, остальные параметры определяли в течение 3 последних минут (согласно литературным данным, в первые 5 минут тестирования поведение крыс связано с чувством страха, а на 6-12 минуте появляется исследовательское поведение). Регистрировали ряд элементарных двигательных актов и поз, совокупность которых характеризует целостное поведение: время замирания, время перебежек, число подъемов на задние лапы (стойки - вертикальные движения), количество пересеченных квадратов (горизонтальные движения), количество болюсов дефекации и частоты 92 уринации, заглядывание в отверстия (поисковая активность), количество грумингов (умывание – комфортное поведение) [53, 58]. Некоторые параметры теста (скорость и траектория движения крыс) записывались и оценивались с помощью программы для видеотрекинга ANY-maze (фирма Stoelting Co., США), остальные параметры оценивались вручную при анализе видеофайлов. Параметры, определяемые в тесте «Открытое поле», представлены в приложении И. 2.2.3 Осмотр животных на наличие признаков аутизма При осмотре животных оценивали наличие и продолжительность (в секундах) таких признаков заболеваний аутистического спектра, как аутоагрессия, наличие стереотипных повторяющихся движений (аутогруминг и рытье подстилки). Для анализа аутогруминга и рытья подстилки проводили соответствующие тесты: аутогруминг в пустой, протертой 70% спиртом прозрачной клетке, а тест на рытье подстилки в клетке, обработанной аналогичным образом, но с чистой подстилкой. После каждого животного клетка мылась и обрабатывалась 70% спиртом (для теста на аутогруминг), мылась, обрабатывалась 70% спиртом и менялась подстилка на чистую (для теста на рытье подстилки). В течение первых 10 минут осуществлялось привыкание животных к тестам, видеозапись и оценка велась в течение последующих 10 минут. В тесте на аутогруминг подсчитывали число актов груминга и их продолжительность в секундах (как общее число и продолжительность, так и отдельно для короткого и длительного груминга), а также число актов аутоагрессии и их продолжительность в секундах. В тесте на рытье подстилки подсчитывали продолжительность рытья подстилки животным в секундах. 2.2.4 Неврологическая шкала NSS (Neurological Score System) О тяжести ишемического повреждения и перинатальной гипоксии-ишемии судили в баллах по степени неврологического дефицита, оцениваемого по шкале NSS – стандартном варианте и варианте с небольшой модификацией (кроме выраженного повреждения, повреждения средней степени тяжести, умеренного 93 повреждения и отсутствия повреждения по стандартной шкале NSS, учитывалось тяжелое повреждение у животных в коматозном состоянии и смерть животных в период до 48 часов с момента моделирования ишемии головного мозга) в динамике: до моделирования ишемии и через 24(48) часов с момента ее проведения (приложение К). Шкала NSS позволяет провести динамическое исследование состояния различных (моторной, сенсорной, координаторной и рефлекторной) функций у исследуемых крыс до и после моделирования ишемии головного мозга. Шкала NSS составляет от 0 (нормальный неврологический статус) до 18 баллов (выраженное повреждение головного мозга) [17]. Степень повреждения головного мозга в модифицированном варианте ранжировалась по шкале ординальных переменных: 0 – нормальный неврологический статус (0-1 балл), 1 – умеренное повреждение (2-6 баллов по шкале NSS), 2 - повреждение средней степени тяжести (7-12 баллов), 3 выраженное повреждение (13-18 баллов), 4 – тяжелое повреждение (присоединение комы), 5 – очень тяжелое повреждение, не совместимое с жизнью (смерть животного в период до 24(48) часов с момента моделирования ишемии). При осмотре животных также учитывалась смертность крыс в группах, вычисляемая в процентах от общего числа крыс в группе. 2.2.5 Тесты для оценки моторной дисфункции передних и задних конечностей Тестом, позволяющим оценить моторную дисфункцию главным образом задних конечностей, является тест «Сужающаяся дорожка» (beam-walking) [137]. Тестом для оценки сенсомоторной дисфункции передних конечностей, является «вибриссовый» тест. Вибриссы ритмично и скоординировано функционируют у крыс, чтобы приобрести тактильную информацию из окружающей среды. Тестами, позволяющими оценить общую моторную дисфункцию передних конечностей, и лишь в небольшой степени позволяющими оценить «мелкую» моторную дисфункцию передних конечностей, являются 94 «цилиндрический» и «адгезивный» тесты. Ловкость рук занимает центральное место в повседневной деятельности грызунов и, обычно, нарушения нервной системы часто приводят к нарушению мелкой моторной функции передних лап, носящему необратимый характер. Грызуны умело манипулируют движениями передних лап, что в некоторой степени гомологично движениям рук человека. Наиболее распространенными тестами для оценки мелкой моторной функции передних лап являются тесты «вермишелевый» (Vermicelli Handling Test), «семечковый» (Sunflower Seed Opening) и «лестничный» (Staircase test) тесты [236]. Особенности выполнения тестов для оценки моторного дефицита передних и задних конечностей представлены в приложениях Л и М. Оценку моторной дисфункции конечностей животных проводили на 28-30-е сутки с момента начала моделирования болезни Паркинсона и через 24 и 48 часов с момента моделирования ишемии головного мозга. 2.2.6 Ольфакторный тест Обонятельная сфера используется для определения обонятельной способности, степени социального интереса, перцепции социальной новизны. Тест основан на поиске и/или обнюхивании пищевой или другой аттрактивной приманки (для социального ольфакторного теста - образцы мочи других особей, для несоциального ольфакторного теста – вещества с сильными запахами – эфирные масла и т.д.), помещаемой в домашнюю клетку. Мы проводили несоциальный вариант ольфакторного теста для определения обонятельной способности крыс. Кусочки ваты, смоченные в растворах веществ помещали в одинаковые пластиковые баночки с отверстиями. В клетку до помещения туда животного располагали 2 баночки – с водой (контроль) и сильным запахом (эфирное масло мяты). Проводили 5 последовательных 3-минутных сессии с перерывом в 15 минут для сенсорной адаптации животного. Во время 6-й сессии банку с эфирным маслом мяты заменяли альтернативным запахом (эфирным маслом пихты). Регистрировали латентный период нахождения приманки и время 95 исследования запаха (в секундах). Оценивали также ольфакторную дискриминацию как отношение между временем обнюхивания знакомого (в 5-й сессии) и незнакомого (в 6-й сессии) запахов. Оценку ольфакторной функции животных проводили на 28-30-е сутки с момента начала моделирования болезни Паркинсона. 2.2.7 Оценка состояния неврологических рефлексов и физического развития животных при моделировании аутизма После рождения исследуемые крысята содержались в отдельной клетке совместно с матерью, на 28-й день постнатального развития мать удаляли из клетки. Потомство перед оценкой на 60-е сутки развития разделяли по полу. Исследование неврологического и физического развития тестируемых крысят проводилось с 1-х по 17-е сутки их развития, при этом оценивали ряд параметров, представленных в приложении Н: количество крысят в помете и число мертвых крысят в помете, средний вес крысят на 7-е и 14-е сутки развития, сутки отлипания ушной раковины, появления первичного волосяного покрова, прорезывания резцов, открытия глаз, сутки появления рефлексов: отрицательного геотаксиса, переворачивания на плоскости, плавательного рефлекса, обонятельной реакции, ползания, поиска гнезда, поднимания головы и передних лап, опоры на задние конечности и подъема всего тела, мышечной силы. Для некоторых неврологических тестов и тестов оценки физического развития крысят, кроме суток их появления у животных, оценивались параметры в бинарной (выполнение/не выполнение теста), ординальной (выраженность в баллах 0-2 открытия глаз с промежуточными значениями в 0,5, 1 и 1,5 балла, мышечная сила 0-1 балл с промежуточным значением 0,5 балла) и интервальной (вес крысят на 7е и 14-е сутки) шкале. 2.3 Тесты для оценки когнитивной функции крыс Поскольку существуют данные о появлении у пациентов с болезнью Паркинсона когнитивной дисфункции (на всех стадиях заболевания характерна замедленность когнитивных процессов - брадифрения, на развернутых стадиях 96 заболевания четко проявляются нарушения регуляторных функций и памяти снижение способности к запоминанию и воспроизведению материала, сложность воспроизведения последовательности действий по образцу, мышления), при моделировании острой и хронической нейродегенерации у животных также возможно исследовать когнитивную дисфункцию [54]. Основой врожденные адаптации стереотипы животных поведения в и незнакомых условиях приобретенный опыт. являются Опыт, как способность к обучению и приобретению индивидуальных навыков, делает их поведение более гибким и адаптивным, а его применение, что необходимо для выживания, напрямую связано с интеллектом и когнитивной деятельностью. Исходя из этого, должны применяться наиболее точные и удобные методы исследования данных функций. Известными тестами для исследования когнитивной функции у животных являются тесты «водный лабиринт Морриса», Т- и Y-образный лабиринт, тест Барнса, тест на распознавание нового объекта и другие. Оценку когнитивного дефицита животных проводили на 28-30-е сутки с момента начала моделирования болезни Паркинсона и через 24 и 48 часов с момента моделирования ишемии головного мозга. 2.3.1 Водный лабиринт Морриса Тест водный лабиринт Морриса позволяет оценить пластичность обучения (пространственную память, соответствующую эпизодической памяти человека), регулируемую с помощью гиппокампа. Крыс помещали в водный лабиринт (глубина 50 см), наполненный водой с добавлением сухого молока для непрозрачности (температура воды 30°С). Платформу диаметром 10 см помещали в одном из фиксированных квадрантов бассейна так, чтобы уровень платформы был на 1 см ниже уровня воды. Два фиксированных источника света прикрепляли к тесту, источники света служат ориентирами для тестируемых крыс. Исследователи во время тестирования находились на фиксированных позициях. Перед тестированием животных тренировали (проводили обучение) в 97 течение трех дней [17, 44]. В день осуществлялось по 4 попытки, между которыми крыса сидела по 20 секунд на платформе для запоминания ее расположения. В течение каждой попытки крыса помещалась в одну из 4 фиксированных стартовых точек бассейна («север», «юг», «восток», «запад»), регистрировали время, которое требуется животному для достижения платформы. Через день расположение платформы менялось и оценивалось время нахождения крысой нового расположения платформы. Основным критерием нормального состояния когнитивных функций у крыс является достижение платформы, скрытой под водой, за 15 и менее секунд, поэтому в тесте оценивалось достижение животным платформы за 15 и менее секунд во время 4-й попытки 4-го дня тренировки. В тесте также оценивали особенности кратковременной и долговременной памяти по изменению времени нахождения платформы в первый день обучения (кратковременная память) и изменению времени нахождения платформы в четвертую попытку всех 4 дней тестирования крыс (долговременная память). 2.3.2 Тест Барнса Аналогом теста «Водный лабиринт Морриса» является тест Барнса, который также позволяет оценить пластичность обучения, регулируемую гиппокампом [366]. Крыс помещали в середину теста, представляющего из себя круг диаметром 120 см, размещенный на подставке высотой 115 см и имеющий по краю 18 отверстий диаметром 9,5 см, одно из которых заканчивается темной коробкой с едой (в ней крыса комфортно себя чувствует и находится в течение 20 секунд в перерывах между попытками). После помещения крысы в центр теста 30 секунд дают крысе на акклиматизацию, видеосъемка проводится в течение последующих 2 минут. По аналогии с водным лабиринтом, в один день осуществлялось по 4 попытки (всего 40 попыток в течение 10 дней), каждый день положение отверстия с коробкой сдвигают на 90°. Вокруг теста, как и в случае водного лабиринта, размещают ориентиры для крыс - крупные предметы или источники света. Основным достигаемым диагностическим нормального состояния когнитивных функций у крыс критерием считали достижение 98 крысой отверстия с коробкой за 15 и менее секунд. До проведения диагностического оценочного теста осуществлялась тренировка (обучение) наблюдаемых животных в течение 9 дней. В тесте также оценивали особенности кратковременной и долговременной памяти крыс по изменению времени нахождения отверстия с коробкой в первый день обучения (кратковременная память) и изменению времени нахождения отверстия с коробкой в четвертую попытку всех 10 дней тестирования крыс (долговременная память). 2.3.3 Т-образный лабиринт Установка "Т-лабиринт" позволяет исследовать рабочую память грызунов, лежащую в основе поведения при «смене» рукавов (спонтанного или подкрепленного вариантов), данный тест также предназначен для оценки когнитивных функций у животных и представляет собой закрытый Т-образный лабиринт, установленный горизонтально. Животное помещают в центральный рукав и, после некоторого времени, необходимого на адаптацию, открывают заслонку, позволяя выбрать один из рукавов, отходящих в стороны от центрального. Если два исследования выполняются в быстрой последовательности, во второй части крыса стремится пойти в ту часть лабиринта, которую не посещала прежде, отражая память на первый выбор (метод «спонтанного чередования»). Но большинство тестов проводятся в «усиленном» варианте (вознагражденное/подкрепленное чередование): в нужный рукав кладут пищу, и голодная крыса отреагирует и пойдет в нужном направлении. Каждое испытание должно быть закончено в течение 2 мин. Закрытый Т-образный лабиринт, по некоторым данным, даже в большей степени может отражать нарушение гиппокампальных когнитивных функций, чем водный лабиринт Морриса. Оценка когнитивной функции крыс в тесте Т-лабиринт проводилась у крыс со сниженным рационом питания (за 2 суток до начала тестирования и в течение всех дней тестирования, рацион крыс снижался до 25% от привычной нормы) 99 согласно протоколу вознагражденного/подкрепленного чередования рукавов. В один день осуществлялось по 10 попыток (всего 40 попыток в течение 4 дней), между которыми крыса сидела по 20 секунд в рукаве с едой, запоминая его расположение и подкрепляясь пищей. Критерием нормальной когнитивной функции и обученности крыс в «усиленном» варианте Т-лабиринта считалось выполнение 80% безошибочных заходов в подкрепляемый отсек в течение эксперимента (или семь "правильных" побежек подряд), согласно литературным данным. У животных с поражением ЦНС наблюдается задержка узнавания и распознавания объектов, что ведет к снижению процента выполненных заданий, в сравнении с интактной группой. Также появляется ошибка бездействия - нехватка мотиваций данных животных, что тоже является показательным критерием повреждения. Еще одним параметром считали среднее время выполнения теста (в секундах) в день оценки теста (4-й день тестирования). 2.3.4 Тест на распознавание нового объекта Тест основан на естественном стремлении грызунов исследовать новый объект вместо уже знакомого. Выбор исследовать новый объект отражает процессы обучения и памяти. Исследование нового объекта определяется как фырканье, обнюхивание, облизывание или касание объекта, стоя перед ним. Для тестирования в домашнюю клетку помещали 2 одинаковых объекта (кубики), первую 10-минутную сессию проводили для запоминания крысой объектов и адаптации к ним. Далее вынимали крысу и меняли один из «знакомых» крысе объектов (кубик) на незнакомый (кольцо от пирамиды). Регистрировали время (в секундах), потраченное на исследование как нового, так и уже знакомого объекта, в течение 10 минут второй сессии. 2.4 Тесты для оценки социального поведения крыс Известными тестами для исследования социальной активности крыс являются тесты «3-камерная активность», быстрый тест на социальное 100 распознавание и тест с трубой на агрессию. 2.4.1 3-камерная активность Социальный интерес в межсамцовых взаимодействиях изучался в тесте «3камерная активность», где незнакомые для исследуемого самцы («самцыстимулы») были «иммобилизованы» в закрытых пластиковых контейнерах с отверстиями, не позволяющими проявлять агрессивные действия по отношению к исследуемому самцу, но стимулирующие социальный интерес исследуемого самца по отношению к незнакомым самцам, помещенным в контейнеры. В комнату тестирования заносили домашнюю клетку с исследуемыми крысами и клетку с другими самцами, одного возраста с тестируемыми особями, но ранее им никогда не встречавшиеся. Тест состоит из трех 10-минутных сессий. Во время первой сессии тестируемое животное помещали в центр 3-камерной (с отверстиями для перехода между камерами) установки для привыкания. После первой сессии тестируемое животное на время уборки установки отсаживали в пустую клетку, тест протирали и в левый отсек помещали контейнер с ранее незнакомым самцом-стимулом, после чего в центральный отсек снова помещали исследуемого самца (вторая 10-минутная сессия проводилась с незнакомым самцом слева, к концу сессии тестируемый самец к нему привыкает и он для него становится «знакомым»). После второй сессии тестируемое животное на время уборки установки снова отсаживали в пустую клетку, тест протирали, в левый отсек помещали контейнер с той же крысой-стимулом, а в правый отсек помещали контейнер с новым самцом-стимулом (таким образом, третья 10минутная сессия проводилась со «знакомым» самцом слева и незнакомым справа). Велась видеосъемка второй и третьей сессии, оценивалось время, затраченное на обнюхивание каждого стакана, время проведенное в каждой камере и число входов в каждую камеру. 2.4.2 Тест с трубой на агрессию Агрессивность исследуемого животного определялась в тесте с трубой на 101 агрессию. В комнату тестирования заносили домашнюю клетку с исследуемыми крысами и клетку с другими самцами, одного возраста с тестируемыми особями (и желательно, сходных размеров), но ранее им никогда не встречавшиеся («самцы-стимулы»). На столе устанавливали пластиковую трубу, диаметр которой не позволял самцам «разойтись» друг с другом внутри трубы. С двух концов трубы подсаживали слева тестируемого самца, справа – самца-стимула. Тест считался выполненным, когда один из самцов вытеснял другого из трубы, всего проводилось по 5 попыток, оценивалось число побед тестируемого самца из 5 попыток. 2.5 Тест для оценки эмоционального поведения крыс Тестом для оценки эмоционального состояния, а также тревожности, боязни высоты, параметров оценки риска, исследовательской и двигательной активности грызунов в условии стрессогенности при свободном выборе крысой условий (комфорта/дискомфорта), является тест приподнятый крестообразный лабиринт (ПКЛ). В установке ПКЛ можно регистрировать ряд параметров: количество посещений и время пребывания в открытых и закрытых рукавах, количество стоек в открытом и закрытом рукавах, количество свешиваний с открытого рукава, число эпизодов и продолжительность груминга, общую неподвижность, количество болюсов. Согласно литературным данным, с одной стороны, интактные животные предпочитают большую часть времени проводить в закрытых (темных) рукавах лабиринта. С другой стороны, увеличение времени пребывания животного в закрытых рукавах может свидетельствовать о его беспокойстве или о страхе открытых пространств/высоты. Другими проявлениями беспокойного поведения животного могут быть эпизоды замирания/неподвижности и увеличение актов дефекации в открытых рукавах по сравнению с закрытыми, уровень тревожности грызуна можно также оценить по предпочтению темноты/света, боязни высоты, выраженности и динамике поведения "выглядывания". Тревожное поведение грызунов можно оценить по отношению времени, проведенного в открытых рукавах, к времени, проведенному 102 в закрытых рукавах, а анти-тревожное поведение можно оценить по увеличению времени, проведенному в открытых рукавах или увеличению числа входов в открытые рукава. Увеличение времени пребывания в открытых рукавах, с одной стороны, может отражать исследовательскую активность мотивацию осваивать новые пространства), а, с (врожденную другой стороны, быть проявлением отсутствия у крыс «способности» различать темный и светлый отсеки лабиринта (например, нарушение светочувствительности сетчатки глаза) или об их высокой локомоторной активности, связанной с особенностями процессов дофаминергической трансмиссии, напоминающей картину синдрома гиперактивности/дефицита внимания у человека [26, 410]. Поведение крыс исследовалось на установке, помещенной в 1 метре от пола и состоящей из двух открытых рукавов 50х10 см и двух закрытых рукавов 50х10 см, расположенных перпендикулярно друг относительно друга. При тестировании животное помещали в центр лабиринта и проводили видеорегистрацию в течение 10 минут. Оценивали время пребывания в закрытых и открытых «рукавах», количество заходов в закрытые и открытые «рукава», длительность нахождения животного в центре. Тревожное поведение грызунов оценивали по отношению времени, проведенного в открытых рукавах, к времени, проведенному в закрытых рукавах, а анти-тревожное поведение - по увеличению времени пребывания/числу входов крысы в открытые рукава. 2.6 Иммуногистоцитохимическая оценка экспрессии антигенов Оценку экспрессии антигенов (CD38, P2X7 рецепторы, тирозин- гидроксилаза, компонент комплемента C3/C3b, транскрипционный фактор Pax6, P-гликопротеин) проводили на замороженных и парафиновых срезах и суспензии клеток головного мозга согласно стандартным протоколам [220] прямого и непрямого методов иммуногистохимии (иммунофлуоресцентный вариант), анализ коэкспресссии антигенов [коэкспрессия CD38 и тирозингидроксилазы, CD38 и маркеров вида клеток – NSE(нейроны), GFAP(астроциты) или MAP2(активированная микроглия), CD38 и Сx43, «тройная» коэкспрессия 103 проводили CD157/CD11b/CD18] (иммунофлуоресцентный вариант) согласно стандартным одновременного или протоколам последовательного комбинированного окрашивания препарата (приложение П). Суспензию клеток получали путем ферментативной обработки (10 мг/мл трипсина) мелко нарезанных и 10-15 кратно тритурированных кусочков головного мозга, затем готовили препараты по типу «толстой капли», высушивали при комнатной температуре и в последующем хранили при температуре -20°C до использования. Препараты подвергали депарафинизации (в случае парафиновых срезов) или фиксировали в парах 10% формальдегида (в случае препаратов суспензии клеток и замороженных срезов), далее для выявления внутриклеточных антигенов препарат подвергали пермеабилизации (постфиксации) смесью этанол-уксусная кислота (для замороженных срезов/суспензии клеток) или протеиназой К (для парафиновых срезов). Неспецифическая активность блокировалась при 30минутной инкубации в условиях термостата во влажной камере клеточной суспензии с 15 мкл 10% раствора WGS (инактивированная козья сыворотка) в PBS (фосфатно-солевой буфер). Далее на препараты наносили по 15 мкл первичных антител в рабочем разведении (1:50-1:100) в растворителе для антител (PBS с 1% WGS) и их инкубировали в течение часа при +37ºС во влажной камере. Затем в темноте на образцы наносили по 15 мкл вторичных антител в рабочем разведении (1:150-1:200) в растворителе для антител, осуществляли получасовую инкубацию при +37ºС во влажной камере. На всех этапах осуществляли 2кратную промывку образцов инкубацией (2-5 минут) с раствором PBS. Завершающим этапом было нанесение 15 мкл монтирующей жидкости (50% глицерин в PBS), препарат накрывали покровным стеклом, плотно его придавливали, микроскопировали. Флуоресцентную микроскопию проводили при увеличении 900/1000 (микроскоп «Люмам Р8», ОМО, Россия/Olympus CX41, Olympus, Япония; видеосистема для анализа изображений Nikon Coolpix 4500, Nicon, США/видеокамера Olympus DP71, Olympus, Япония; программа для обработки изображений и морфометрии Cell-F). Фотографии, полученные при проведении 104 флуоресцентной и/или конфокальной микроскопии иммуногистоцитохимической оценки (ко)экспрессии антигенов в суспензии клеток и ткани головного мозга, представлены в приложении Щ. Подсчет относительного количества клеток, экспрессирующих соотвествующий антиген, производился на 100-300 клеток в образце при анализе не менее 10 полей зрения. В случае оценки коэкспрессии считали количество клеток, экспрессирующих только первый антиген, только второй антиген, коэкспрессирующих оба антигена и не экспрессирующих оба антигена, при «тройной» коэкспрессии подсчитывали количество клеток, коэкспрессирующих все 3 маркера одновременно. Кроме того, при обработке результатов учитывалось относительное количество всех клеток, несущих метки на оба антигена и выраженное от этого количества в % количество клеток, несущих сразу две метки. Конфокальную микроскопию проводили с помощью полностью автоматизированного конфокального лазерного сканирующего микроскопа с водной иммерсией фотоснимков с Olympus FV10i-W (Olympus, конфокального микроскопа Япония). подсчитывали При анализе коэффициент колокализации (Colocalisation Test) антигенов (CD157/CD11b/CD18) и плотность интенсивности флуоресценции антигенов (C3/C3b, Pax6) на единицу площади (IntDen делили на Area) с помощью программы MacBiophotonics ImageJ. 2.7 Идентификация апоптоза клеток головного мозга Оценка апоптоза клеток проводилась на замороженных и парафиновых срезах аффектированных регионов головного мозга (средний мозг и кора больших полушарий головного мозга) с помощью метода TUNEL (TdT-mediated dUPT nick end labeling) с использованием наборов Mebstain Apoptosis Detection kit (Immunotech, Франция) и Apo-BrdU Apoptosis Detection Kit 88-6671 (Millipore, США) согласно стандартным протоколам фирм-производителей (приложение Р). Метод TUNEL позволяет обнаружить разрывы ДНК, 3′-ОН концы помечаются искусственно синтезированными нуклеотидами с помощью фермента TdT. Подготовка препаратов (депарафинизация, фиксация, постфиксация) 105 проводилась подобно иммуногистоцитохимии, далее препараты инкубировались с компонентами реакционной смеси, включающей TdT и нуклеотиды, меченые FITC. Для окраски ядра клеток препараты инкубировали с раствором пропидия йодида. При микроскопии (х900, микроскоп «Люмам Р8», видеосистема для анализа изображений Nikon Coolpix 4500 или х1000, микроскоп Olympus CX41 с видеокамерой Olympus DP71, Olympus, Япония) регистрировались FITCпозитивные клетки с разрывами ДНК. Подсчет количества FITC-позитивных клеток производился на 100-300 клеток при анализе не менее 10 полей зрения. 2.8 Фотометрические и флуориметрические методы Гомогенат ткани для флуориметрических и фотометрических исследований получали путем механической гомогенизации исследуемых участков головного мозга в 2 мл буферного раствора (PBS), затем полученный гомогенат разводили в 10 раз, разделяли на несколько аликвотов, все манипуляции проводили на льду. Затем часть свежевыделенного гомогената использовали немедленно для определения функциональной активности клеток, другую часть гомогенатов замораживали и хранили при -20ºС, размораживали непосредственно перед процедурой исследования. В первом аликвоте определяли содержание белка, второй использовался для определения концентрации лактата и НАД+ и для измерения АДФ-рибозилциклазной активности клеток головного мозга. 2.8.1 Определение содержания белка АДФ-рибозилциклазная активность измерялась согласно R M. Graeff и др. [169], приложение С. Метод основан на измерении превращения НГД+ (никотинамидгуаниндинуклеотид) флуоресцирующий продукт в реакции). цГДФР (циклическую Содержание белка ГДФ-рибозу, определяли по протоколу фирмы-производителя (набор «Total Protein Kit, Micro Lowry, Peterson’s Modification», Sigma-Aldrich, США, микрометод Лоури, вариант без осаждения белка), приложение Т. К 1 мл клеточной суспензии добавляли 1 мл рабочего раствора реактива Лоури (проведение биуретовой реакции: в щелочной среде пептидные белковые связи образуют комплексы с тартратом), затем, через 20 106 минут инкубации при комнатной температуре добавляли 0,5 мл рабочего раствора реактива Фолина-Чиокальто (появление интенсивного сине-фиолетового окрашивания образующихся комплексов), инкубировали реакционную смесь 30 минут при комнатной температуре. Затем измеряли оптическую плотность раствора на спектрофлуориметре СМ 2203 («СОЛАР», Беларусь) между длинами волн 500 и 800 нм против контроля, не содержащего суспензию клеток. Концентрация белка определялась по калибровочной кривой, построенной по стандартным растворам (50, 100, 200, 300 и 400 мкг/мл). 2.8.2 Анализ АДФ-рибозилциклазной активности Активность АДФР-циклазы определяли путем инкубации определенного (с концентрацией белка 1,2-1,35 мкг/мл) объема клеточной суспензии с реакционной смесью, содержащей 100 мМ KCl, 10 мкM CaCl2 и 60 мкM НГД+ в 50 мМ растворе трис-HCl (рН 6,6), причем субстрат НГД+ добавляли к каждому образцу непосредственно перед его измерением в темноте. Измерение флуоресценции (возбуждение λ=300 нм, эмиссия λ=410 нм) на спектрофлуориметре СМ 2203 («СОЛАР», Беларусь) осуществлялось на исходной и 20-й минуте инкубации (при 37°C в условиях постоянного перемешивания) против контроля, не содержащего НГД+. АДФ-рибозилциклазную активность вычисляли по разнице амплитуды флуоресценции между 20-й и исходной минутами инкубации и выражали в ед/мин/мг белка. 2.8.3 Оценка функциональной активности клеток головного мозга Функциональная активность клеток головного мозга оценивалась на свежевыделенном гомогенате ткани головного мозга по интегральным кривым кинетики их аутофлуоресценции при длине волны, соответствующей редокстрансформации внутриклеточных пиридиновых нуклеотидов (в том числе и НАД(Ф)Н) по оригинальной методике (В. В. Салмин, А. Б. Салмина, О. Л. Лопатина и др.) [28]. Для количественной оценки использовали максимальную амплитуду (отн. ед.) и время достижения полувысоты (τ/2, секунды) интегральной кривой кинетики флуоресценции. 107 2.8.4 Модуляция АДФР-циклазной и функциональной активности клеток головного мозга Модуляция АДФ-рибозилциклазной активности (приложение У) осуществлялась непосредственно перед флуориметрическим анализом лигандом Р2Х7 рецепторов аденозинтрифосфатом (1 мМ АТФ, инкубация 15 минут при 37°С), селективным блокатором Р2Х7 рецепторов - окисленной формой АТФ (100 мкМ oАТФ: сначала образец инкубируют с 5 мкМ АТФ 15 минут при 37°С для активации нуклеотидных рецепторов, затем инкубируют с оАТФ 60 мин при 37°С), субстратом и НАД+-метаболизирующих лигандом ферментов никотинамидадениндинуклеотидом (1 мМ НАД+, инкубация 15 минут при 37°С). Модуляция функциональной активности (приложение У) также осуществлялась клеток головного млзга непосредственно перед регистрацией кинетики аутофлуоресценции модуляторами Р2Х7 рецепторов (АТФ и oАТФ) и СD38/CD157 (НАД+) в тех же условиях, что описано для активности АДФРциклазы, и ингибитором внутриклеточных флавопротеинов (10 мкМ DPI, 45 минут, 22°С). 2.8.5 Определение содержания НАД+ Определение уровня НАД+ в гомогенатах ткани головного мозга проводили с помощью спектрофотометрического микрометода (Nisselbaum J.S. et al., 1969), протокол которого представлен в приложении Ф. К реакционной смеси (0,3 мг феназина метасульфата, 0,08 мг тиазолила синего, 0,25 мг алкогольдегидрогеназы, 0,065 М никотинамид, 0,065 М глицилглициновый буфер, 0,33 М этанол, рН 7,4) добавляли 0,1 мл гомогената ткани. Оптическую плотность образованного продукта реакции измеряли на спектрофлуориметре СМ 2203 («СОЛАР», Беларусь) при длине волны 556 нм (измерения проводили в режиме кинетики в течение 30 минут при постоянном перемешивании и температуре инкубации 37ºС). Результат реакции выражали в ммоль НАД+/мг белка ткани. 2.8.6 Определение концентрации лактата Определение лактата в гомогенатах ткани мозга проводилось 108 спектрофотометрическим методом (Hohorst H.J., 1957), протокол метода представлен в приложении Ф. Реакционная смесь содержала 20 мкл гомогената, 500 мкл дистиллированной воды, 400 мкл 1М глицинового буфера (рН 9,5), 50 мкл 0,56 М гидразина сульфата (рН 8,6), 20 мкл 0,1М НАД (рН 6,75). Через 5 минут (после перемешивания) при 37°С добавляли 10 мкл лактатдегидрогеназы (концентрация 2,7 единиц/мкл). Измеряли поглощение при 340 нм в динамике (соответствует степени восстановления НАД+ до НАДН, образовавшееся количество НАДН эквимолярно количеству окисленного лактата). В качестве контроля использовали смесь без добавления гомогената. Результат реакции выражали в мкг/мл. 2.9 Статистическая обработка результатов Статистический анализ включал проверку нормальности распределения, арифметического, среднего методы описательной статистики, определение дисперсии, квадратичного отклонения, ошибки среднего среднего. Сравнение средних проводили с помощью тестов Манна-Уитни (для порядковых и непараметрических количественных шкал) или с помощью Т-теста (гетероскедастического или гомоскедастического), корреляционный анализ (r) включал проведение линейных корреляций Пирсона или ранговых корреляциий Спирмена (для непараметрических шкал) [5, 48, 50, 62]. Для статистического анализа использовали программы Stаtplus Professional 2009 и Statistica 6.0. Все результаты представлены в виде M±m, где М – среднее значение, m – ошибка среднего, p – уровень значимости: * – приемлемая граница значимости (p≤0,05); ** – результат значим (p≤0,01); *** (p≤0,005) и **** (p≤0,001) - результат высоко значим. 109 ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1 Хроническая нейродегенерация Для подтверждения развития моделей хронической нейродегенерации у экспериментальных животных проводился осмотр контрольных групп животных для выявления экспериментальных и характерных симптомов, также осуществляли поведенческое фенотипирование животных. 3.1.1 Результаты осмотра животных на наличие признаков паркинсонизма и в тесте «Открытое поле» в модели болезни Паркинсона Результаты осмотра животных на наличие признаков ротенонового паркинсонизма и в тесте «Открытое поле» при подборе условий и сроков забора материала приведены в таблице 1. Осмотр животных выявил наличие всех основных признаков развития паркинсонизма у экспериментальных крыс по сравнению с контрольными животными: олигокинезия, постуральная нестабильность и неустойчивость походки. Отмечалось значимое нарастание всех признаков к 28 суткам. В контрольных группах либо совсем не наблюдалось исследуемых признаков (негативный контроль), либо они были слабо выражены (небольшая олигокинезия у некоторых животных из группы «позитивного» контроля) и практически не различались с группой негативного контроля. Выраженность клинических признаков паркинсонизма, полученная при суммировании трех основных признаков паркинсонизма, имела те же тенденции, что и признаки по отдельности (рисунок 1): нулевые значения в группе негативного контроля, статистически незначительные и варьирующие от 0,2 до 1,0 баллов в контрольной группе с растворителем («позитивный» контроль), статистически значимые изменения (в сравнении с негативным и позитивным контролями и исходными значениями до моделирования паркинсонизма) в экспериментальной группе (выраженность признаков варьирует от 2,0 до 5,8 баллов), где постепенное стабильное развитие признаков наблюдалось к концу месяца и было максимальным (5,6 баллов) на 28-е сутки. 110 Таблица 1 – Основные признаки паркинсонизма при подборе условий и сроков забора материала в ротеноновой модели хронической нейродегенерации Признаки БП Олигокинезия Группы животных НК, n=5 ПК, n=5 0: 0,0±0,0 0: 0,0±0,0 7: 0,0±0,0 4: 0,4±0,25 14: 0,0±0,0 10: 0,0±0,0 28: 0,0±0,0 21: 0,2±0,20 ЭГ, n=5 2: 0,0±0,0 0: 0,0±0,00 2: 0,8±0,20* 7: 0,0±0,0 4: 2,2±0,49* 7: 1,2±0,37* 14:0,8±0,20 10: 1,2±0,37* 14: 1,4±0,25 28: 0,0±0,0 21: 1,8±0,37* 28: 2,4±0,40** 2: pНК-ЭГ≤0,05 4: pНК-ЭГ≤0,05 7: pНК-ЭГ≤0,05 pПК-ЭГ≤0,05 10: pНК-ЭГ≤0,05 14: pНК-ПК≤0,01 pНК-ЭГ≤0,05 pПК-ЭГ≤0,01 21: pНК-ЭГ≤0,01 28: pНК-ЭГ≤0,01 pПК-ЭГ≤0,01 Постуральная нестабильность 0: 0,0±0,0 0: 0,0±0,0 2: 0,0±0,0 0: 0,0±0,0 2: 0,6±0,25 7: 0,0±0,0 4: 0,0±0,0 7: 0,0±0,0 4: 1,6±0,40** 7: 0,4±0,25 14: 0,0±0,0 10: 0,0±0,0 14: 0,2±0,20 10: 0,8±0,20* 14: 1,0±0,00* 28: 0,0±0,0 21: 0,0±0,0 28: 0,0±0,0 21: 1,2±0,20** 28: 1,6±0,25** 4: pНК-ЭГ≤0,01 10: pНК-ЭГ≤0,05 14: pНК-ЭГ≤0,01 pПК-ЭГ≤0,01 21: pНК-ЭГ≤0,01 28: pНК-ЭГ≤0,01 pПК-ЭГ≤0,01 Неустойчивость походки 0: 0,0±0,0 0: 0,0±0,0 2: 0,0±0,0 0: 0,0±0,0 2: 0,6±0,25 7: 0,0±0,0 4: 0,0±0,0 7: 0,0±0,0 4: 1,6±0,40** 7: 0,4±0,25 14: 0,0±0,0 10: 0,0±0,0 14: 0,0±0,0 10: 0,8±0,20* 14: 1,0±0,0** 28: 0,0±0,0 21: 0,0±0,0 28: 0,0±0,0 21: 1,2±0,2** 28: 1,6±0,25** 4: pНК-ЭГ≤0,01 10: pНК-ЭГ≤0,05 14: pНК-ЭГ≤0,01 pПК-ЭГ≤0,01 21: pНК-ЭГ≤0,01 28: pНК-ЭГ≤0,01 pПК-ЭГ≤0,01 Суммарное значение 0: 0,0±0,0 0: 0,0±0,0 7: 0,0±0,0 4: 0,4±0,25 14: 0,0±0,0 10: 0,0±0,0 28: 0,0±0,0 21: 0,2±0,20 2: 0,0±0,0 7: 0,0±0,0 14: 1,0±0,32 28: 0,0±0,0 0: 0,0±0,0 4: 5,4±1,17** 10: 5,8±0,73* 21: 4,2±0,73** 2: 2,0±0,63* 7: 2,0±0,71* 14: 3,4±0,25** 28: 5,6±0,87** 2: pНК-ЭГ≤0,05 4: pНК-ЭГ≤0,01 7: pНК-ЭГ≤0,05 pПК-ЭГ≤0,05 10: pНК-ЭГ≤0,01 14: pНК-ПК≤0,05 pНК-ЭГ≤0,01 pПК-ЭГ≤0,01 21: pНК-ЭГ≤0,01 28: pНК-ЭГ≤0,01 pПК-ЭГ≤0,01 Примечания: обозначения времени оценки признаков паркинсонизма (0 – до проведения эксперимента, 2 – на 2-е сутки, 4 – на 4-е сутки, 7 – на 7-е сутки, 10 – на 10-е сутки, 14 – на 14-е сутки, 21 - на 21-е сутки, 28 - на 28-е сутки), * – p при сравнении параметров до и после создания модели болезни Паркинсона 111 Рисунок 1 – График изменения суммарного значения основных признаков паркинсонизма паркинсонизма. в течение 1 Примечания: месяца с момента обозначения начала времени моделирования оценки признаков паркинсонизма (0 – до проведения эксперимента, 2-28 – на 2-е-28-е сутки), НК – негативный контроль, ПК – «позитивный» контроль, ЭГ – экспериментальная группа. В экспериментальной группе наблюдалось три пика максимальной выраженности суммарных признаков (на 4-е, 10-е и 28-е сутки с момента начала моделирования ротенонового паркинсонизма. Первые 2 пика можно объяснить возможным развитием острого обратимого повреждения среднего мозга и частичным восстановлением функций дофаминергических нейронов соседними животными. Третий пик, вероятнее всего, связан с необратимым повреждением дофаминергических нейронов среднего мозга, что согласуется с литературными данными [135, 255, 349]. У контрольных животных в группах НК и ПК наблюдалось практически полное отсутствие суммарных признаков паркинсонизма или их умеренная выраженность – на 14-е сутки. Кроме основных при знаков ротенонового паркинсонизма, оценивались также дополнительные признаки (таблица 2), которые не всегда присутствуют в моделях ротенонового паркинсонизма (тремор, ригидность мышц) или не 112 являются специфическими (равновесие) для развития болезни Паркинсона Таблица 2 – Дополнительные признаки при подборе условий и сроков забора материала в ротеноновой модели хронической нейродегенерации Признаки БП Группы животных НК, n=5 ПК, n=5 ЭГ, n=5 Оценка 0: 0,0±0,0 0: 0,0±0,0 2: 0,0±0,0 0: 0,0±0,0 2: 0,0±0,0 равновесия 7: 0,0±0,0 4: 0,4±0,25 7: 0,0±0,0 4: 0,4±0,25 7: 0,0±0,0 14: 0,0±0,0 10: 0,6±0,25 14: 0,8±0,37 10: 1,8±0,58 14: 1,8±0,49 28: 0,0±0,0 21: 0,2±0,20 28: 0,2±0,20 21: 1,8±0,49* 28: 1,8±0,37* 10: pНК-ЭГ≤0,05 14: pНК-ЭГ≤0,01 pПК-ЭГ≤0,01 21: pНК-ЭГ≤0,01 28: pНК-ЭГ≤0,01 pПК-ЭГ≤0,01 Ригидность 0: 0,0±0,0 0: 0,0±0,0 2: 0,0±0,0 0: 0,0±0,0 мышц по типу 7: 0,0±0,0 4: 0,0±0,0 7: 0,0±0,0 4: 0,4±0,25 7: 0,0±0,0 «зубчатого 14: 0,0±0,0 10: 0,0±0,0 14: 0,0±0,0 колеса» 28: 0,0±0,0 21: 0,0±0,0 28: 0,0±0,0 10: 0,4±0,25 2: 0,0±0,0 14: 1,6±0,40** 21: 1,6±0,51* 28: 1,6±0,51* 14: pНК-ЭГ≤0,01 pПК-ЭГ≤0,01 21: pНК-ЭГ≤0,05 28: pНК-ЭГ≤0,05 pПК-ЭГ≤0,05 Тремор покоя 0: 0,0±0,0 0: 0,0±0,0 2: 0,0±0,0 7: 0,0±0,0 4: 0,0±0,0 7: 0,0±0,0 14: 0,0±0,0 10: 0,0±0,0 14: 0,0±0,0 28: 0,0±0,0 21: 0,0±0,0 28: 0,0±0,0 0: 0,0±0,0 2: 0,8±0,20* 4: 0,6±0,25 7: 0,4±0,25 10: 0,6±0,40 14: 0,4±0,25 21: 0,8±0,37 28: 1,4±0,25** 2: pНК-ЭГ≤0,05 28: pНК-ЭГ≤0,01 pПК-ЭГ≤0,01 Примечания: обозначения времени оценки признаков паркинсонизма (0 – до проведения эксперимента, 2 – на 2-е сутки, 4 – на 4-е сутки, 7 – на 7-е сутки, 10 – на 10-е сутки, 14 – на 14-е сутки, 21 - на 21-е сутки, 28 - на 28-е сутки), * – p при сравнении параметров до и после создания модели болезни Паркинсона Выявлено значимое увеличение дисфункции равновесия (на 10-28-е сутки с момента развития экспериментального паркинсонизма), ригидности мышц (14-28е сутки) и тремора покоя (2-е и 28-е сутки моделирования болезни Паркинсона) у 113 экспериментальных животных в среднем на 10-28-е сутки (экспериментальный паркинсонизм). Дополнительные признаки паркинсонизма (оценка равновесия, ригидности мышц конечностей по типу «зубчатого колеса», тремор в покое) существенно помогают в оценке выраженности паркинсонизма, при этом специфическими признаками являются наличие ригидности мышц конечностей по типу «зубчатого колеса» и тремора в покое, которые не встречаются в контрольных группах, однако присутствуют не у всех экспериментальных животных и их выраженность варьирует при моделировании паркинсонизма. Нарушения равновесия менее специфичны, присутствуют у контрольных («позитивный» контроль) и экспериментальных животных, но более выражены у животных опытной группы, что может свидетельствовать о развитии небольшой атаксии, связанной с растворителем в группе ПК или иными причинами (однако, согласно литературным данным [391], диметилсульфоксид не вызывает мозжечковой атаксии) и о более выраженном воздействии на нервную систему ротенона. Также роль может играть нормальная прибавка веса у животных контрольной группы и относительное ухудшение удержания крысы на балансире (по сравнению с исходными значениями до введения растворителя). Кроме непосредственного токсического воздействия ротенона, нарушение равновесия при паркинсонизме может зависеть от множества факторов: вторичных нарушений проводящих путей среднего мозга, выраженности процесса повреждения нейронов и стадии развития паркинсонизма. Таким образом, паркинсонизма, у начиная со 2 экспериментальных суток с животных момента моделирования наблюдалось значимое нарастание всех исследуемых признаков паркинсонизма; пики наибольшей выраженности признаков наблюдались на 28-е сутки, эти же сроки (28-30-е сутки) являются наиболее подходящими для забора материала от животных. У контрольных животных наблюдалось практически полное отсутствие признаков паркинсонизма или их умеренная выраженность, не отличающаяся значимо от начальных значений. 114 Учитывая полученные результаты по выраженности признаков паркинсонизма, дальнейшие исследования по тестированию нейропсихических функций животных и изучению молекулярных механизмов патогенеза болезни Паркинсона проводились на линейных животных с использованием модели ротенонового паркинсонизма путем хронического подкожного введения ротенона с забором материала и оценкой всех параметров до создания модели и на 28-30-е сутки с момента ее начала, контролем являлось хроническое подкожное введение растворителя. Оценка вегетативных нарушений в тесте «открытое поле» выявила значимое снижение количества болюсов дефекации при паркинсонизме через 28 суток с момента начала моделирования паркинсонизма (таблица 3). Таблица 3 – Вегетативные расстройства при хронической нейродегенерации Группы животных Признаки БП Количество болюсов дефекации К5 (растворитель), n=10 Э6 (ротенон), n=12 до создания после до создания после модели создания модели создания 2,0±0,85 1,3±0,65 4,3±0,49 0,6±0,34**** 0,6±0,20 0,4±0,19 до создания модели: pК5-Э6≤0,05 Частота уринаций 1,6±0,46 0,2±0,12** значимых различий между группами К5 и Э6 не выявлено Примечание: * – p при сравнении параметров до и после создания модели БП Полученные нами результаты согласуются с литературными данными об урежении дефекации при развитии паркинсонизма (развитие запоров). Что касается частоты уринации, то данный показатель не показал значимых различий ни с исходными результатами до моделирования паркинсонизма, ни с контрольной группой. В отношении частоты уринации в литературных 115 источниках сообщается об учащении уринации и появлении никтурии и недержания мочи у пациентов с болезнью Паркинсона, что может являться причиной осложнений [51]. С другой стороны, разрушение среднего мозга, от вентральной половины задних отделов, минуя конец акведука, до ядра пятого нерва, сопровождается при двустороннем повреждении постоянной потерей желания к мочеиспусканию и дефекации (исчезновение характерных поведенческих реакций у животных), что может наблюдаться при действии ротенона на средний мозг [63, 267]. Кроме того, токсическое действие ротенона при системном введении может быть связано с нарушением функции почек и развитием урежения мочеиспускания [267, 348]. Значимое исходное отличие количества болюсов дефекаций в контрольной группе в сравнении с экспериментальной (до начала проведения эксперимента) и значимое снижение частоты уринаций на 28-е сутки с момента введения растворителя, вероятнее всего, свидетельствует об исходной неоднородности популяции крыс по вегетативной иннервации, а не с действием растворителя. Осмотр линейных животных на наличие признаков паркинсонизма (таблица 4) и остальные параметры теста «Открытое поле» (таблица 5) также подтвердили развитие признаков паркинсонизма у экспериментальных животных в сравнении с контрольными: у экспериментальных животных наблюдалось значимое нарастание олигокинезии (что также подтверждается уменьшением пройденного пути в тесте «Открытого поля», полученного при видеотрекинге с помощью программы Anymaze), постуральной нестабильности, неустойчивости походки, дисфункция равновесия, появление тремора и ригидности мышц, увеличение латентного периода с момента посадки крысы, уменьшение средней скорости движения крыс в тесте, снижение общей вертикальной и горизонтальной двигательной активности крыс. У крыс наблюдалось снижение числа норковых рефлексов, но общее время нахождения головы крысы в норках значимо не отличалось от нахождения головы крысы в норках у контрольных времени животных, что свидетельствует у экспериментальных животных о более редких, но более 116 продолжительных актах контакта животного с «норками» в тесте «Открытого поля». С литературными данными о нарушении прибавки веса при системном введении ротенона вследствие ухудшения аппетита и нарушений двигательной активности у животных и отсутствии данного признака при локальном (стереотаксическом) введении ротенона [267, 369] согласуются результаты значимого снижения прироста массы тела у экспериментальных животных в сравнении с контрольными. Таблица 4 – Признаки паркинсонизма при хронической нейродегенерации Группы животных К5 (растворитель), n=30 Признаки БП Олигокинезия Э6 (ротенон), n=30 до создания модели после создания до создания модели после создания 0,0±0,0 0,2±0,1 0,0±0,0 1,7±0,3**** 0,0±0,0 1,4±0,2**** 0,0±0,0 1,3±0,2**** 0,1±0,1 2,8±0,4**** после создания модели: pК5-Э6≤0,001 Постуральная нестабильность 0,1±0,1 0,1±0,1 после создания модели: pК5-Э6≤0,001 Неустойчивость походки 0,0±0,0 0,1±0,1 после создания модели: pК5-Э6≤0,001 Оценка равновесия 0,6±0,3 до создания модели: pК5-Э6≤0,05 Тремор покоя 1,8±0,5* после создания модели: pК5-Э6≤0,05 0,0±0,0 0,1±0,1 0,0±0,0 0,9±0,2**** - 1,3±0,1 0,1±0,1# 9,5±0,6**** после создания модели: pК5-Э6≤0,01 Ригидность мышц по типу «зубчатого колеса» - 0,3±0,1 после создания модели: pК5-Э6≤0,001 Суммарное значение баллов 0,7±0,3 2,5±0,5** после создания модели: pК5-Э6≤0,001 Средний вес животных 335,7±12,9 497,0±14,7* 316,2±9,4 350,5±18,9 после создания модели: pК5-Э6≤0,001 Примечание: * – p при сравнении параметров до и после создания модели БП 117 Таблица 5 – Параметры, оцениваемые в тесте «Открытое поле» при моделировании паркинсонизма Группы животных Признаки БП До создания моделей (НК), n=21 К5 (раствль), n=10 Э6 (ротенон), n=11 Латентный период 58,3±24,2 11,7±10,7 95,4±50,3 Пройденный путь (м) 15,5±1,4 14,4±1,9 2,3±0,4 Средняя скорость (м/с) 0,03±0,003 0,03±0,004 0,01±0,001 Число переходов в тесте 21,7±4,4 15,4±5,7 5,6±2,1 Число пересеченных квадратов (ГДА) 62,3±8,9 45,3±9,3 7,8±1,5 Число Rearing 0,7±0,3 0,2±0,1 0,2±0,1 Число Climbing 2,7±0,9 1,0±0,5 1,9±0,7 Общая ВДА 4,6±0,8 1,2±0,6 2,1±0,8 Число коротких грумингов 1,2±0,2 1,0±0,3 1,2±0,3 Число длинных грумингов 1,4±0,3 1,3±0,2 1,5±0,4 Общее число грумингов 2,6±0,4 2,3±0,4 2,7±0,5 Продолжит-ть коротких грумингов (с) 6,9±2,1 10,4±3,9 10,6±5,1 Продолжит-ть длинных грумингов (с) 26,3±9,8 22,5±9,6 36,7±10,0 Общая продолжит-ть грумингов (с) 39,8±7,7 36,7±10,0 33,1±10,3 Число норковых рефлексов 30,6±5,3 10,5±2,4 6,3±1,9 373,0±41,4 276,3±87,4 286,6±55,2 Продолжит-ть обнюхивания «норок» (с) Пройденный путь: pК5-Э6≤0,001 pНК-Э6≤0,001 Средняя скорость: pК5-Э6≤0,001 pНК-Э6≤0,001 Число переходов в тесте: pК5-Э6≤0,05 pНК-Э6≤0,001 ГДА: pК5-Э6≤0,001 pНК-Э6≤0,001 Climbing: pНК-К5≤0,05 ВДА: pНК-К5≤0,05 Число норковых рефлексов: pНК-К5≤0,01 pК5-Э6≤0,05 pНК-Э6≤0,001 Продолжит-ть обнюхивания «норок»: pК5-Э6≤0,05 118 Таким образом, результаты осмотра животных подтверждают развитие ротенонового паркинсонизма и создание модели хронической нейродегенерации. 3.1.2 Осмотр животных на наличие признаков аутизма Учитывая данные о чертах сходства симптомов и поведения пациентов с болезнью Паркинсона и расстройствами аутистического спектра, а также их патогенеза [219, 284, 418], интересно было проверить гипотезу о возможном «пересечении» признаков паркинсонизма и аутизма при осмотре животных с ротеноновой моделью болезни Паркинсона на наличие признаков аутизма (нарушение социальной памяти, наличие повторяющихся стереотипных движения – аутогрумминга, рытья подстилки, аутоагрессии). Данные о результатах осмотра животных на наличие стереотипных движений в тестах на «аутогрумминг» и «рытье подстилки» представлены в таблице 6. Были получены неоднозначные результаты: с одной стороны, некоторые признаки свидетельствуют о наличии у животных признака аутизма (было отмечено статистически значимое увеличение числа и продолжительности аутогруммингов), однако ряд признаков у многих животных отсутствовал (так, рытье подстилки наблюдалось у 3 животных с моделью ротенонового паркинсонизма, наличие признаков аутоагрессии было отмечено у одного животного с экспериментальной моделью болезни Паркинсона из 15 животных), в отношении времени рытья подстилки, напротив, даже наблюдалось статистически значимое уменьшение этого времени вместо прогнозируемого увеличения. Таким образом, у животных с экспериментальной ротеновой моделью болезни Паркинсона не получено достаточных доказательств наличия признаков, характерных для экспериментальных животных с моделями аутизма (появление «стереотипных» движений «рытье подстилки», аутогрумминг, аутоагрессия), хотя у некоторых животных и отмечалось появление этих признаков. 119 Таблица 6 – Осмотр животных на наличие признаков аутизма в тестах аутогрумминг» и «рытье подстилки» в модели хронической нейродегенерации Группы животных Признаки аутизма Время рытья подстилки (с) К5 (растворитель), n=10 Э6 (ротенон), n=15 до создания после до создания модели создания модели 33,4±5,4 26,6±9,7 после создания 38,0±5,8 3,7±1,2*** 2,6±0,6 8,2±1,0** 5,0±0,6 8,4±0,6** 7,6±0,9 16,6±1,3*** 47,2±16,1 89,3±9,4 88,9±16,3 168,7±13,8 после создания модели: pК5-Э6≤0,01 Число коротких грумингов 2,5±0,5 2,6±0,9 после создания модели: pК5-Э6≤0,005 Число длинных грумингов 4,4±0,6 4,6±0,7 после создания модели: pК5-Э6≤0,005 Общее число грумингов 6,9±0,9 7,1±1,3 после создания модели: pК5-Э6≤0,001 Продолжит-ть коротких 37,4±12,3 35,3±11,5 грумингов (с) после создания модели: pК5-Э6≤0,01 Продолжит-ть длинных 98,0±27,3 82,3±12,2 грумингов (с) ** после создания модели: pК5-Э6≤0,001 Общая продолжит-ть грумингов 135,4±28,4 117,6±16,9 136,1±19,2 (с) 258,1±18,6 *** после создания модели: pК5-Э6≤0,001 Число эпизодов аутоагрессии 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,1±0,07 Продолжит-ть аутоагрессии (с) 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,4±0,4 Примечание: * – p при сравнении параметров до и после создания модели БП 120 3.1.3 Тесты для оценки моторной дисфункции передних и задних конечностей в ротеноновой модели хронической нейродегенерации Результаты осмотра животных на наличие признаков моторной дисфункции конечностей представлены в таблицах 7-8. В тесте «Сужающаяся дорожка» (таблица 7) у крыс отмечено появление моторной дисфункции задних лап в экспериментальной группе на 28-е сутки с момента моделирования, в сравнении с исходным значением до моделирования, что выразилось в значимом увеличении общего числа соскальзываний задними лапами крысы справа и слева при укорочении пройденного крысой пути (в %), в сравнении с исходными значениями до моделирования паркинсонизма. У контрольных животных до и после введения растворителя не выявлено значимых различий. Таблица 7 – Осмотр животных на наличие моторной дисфункции задних конечностей в тесте «Сужающаяся дорожка» в модели хронической нейродегенерации Группы животных Признаки моторной дисфункции Число соскальзываний задних К5 (растворитель), n=13 Э6 (ротенон), n=16 до создания после до создания модели создания модели после создания 1,2±0,3 2,0±0,8 0,8±0,3 3,9±0,8* 69,4±11,7 69,3±12,3 64,2±11,7 32,8±9,3 лап Пройденный путь, % Пройденный путь после создания модели: pК5-Э6≤0,05 Примечание: * – p при сравнении параметров до и после создания модели БП В «лестничном» и «семечковом» (таблица 8) тестах отмечено появление у крыс дисфункции «мелкой моторики» передних лап в экспериментальной группе на 28-е сутки с момента моделирования, в сравнении с исходным значением до моделирования и в сравнении с контрольной группой, что выразилось в значимом уменьшении числа съеденных в «лестничном» тесте зерен справа и слева, общего 121 числа съеденных (т. е. поднятых передними лапами крысы, зерен справа и слева) зерен в «лестничном» тесте, увеличении числа частей кожуры при очистке зерен в «семечковом» тесте в экспериментальной группе после моделирования болезни Паркинсона. Таблица 8 – Осмотр животных на наличие дисфункции «мелкой моторики» передних конечностей в тестах «Лестничный» и Семечковый» в ротеноновой модели хронической нейродегенерации Группы животных Признаки моторной дисфункции К5 (растворитель), n=15 Э6 (ротенон), n=11 до создания после до создания модели создания модели после создания Число поднятых зерен слева 2,0±0,9 2,1±0,9 2,0±0,7 0,1±0,1* Число поднятых зерен справа 1,6±0,6 2,0±0,8 2,6±0,9 0,2±0,1* Общее число поднятых зерен 3,6±1,5 4,1±1,6 4,6±1,5 0,3±0,2* Число частей кожуры зерен 1,2±0,3 2,0±0,8 0,8±0,3 3,9±0,8* Число частей кожуры после создания модели: pК5-Э6≤0,05 Примечание: * – p при сравнении параметров до и после создания модели БП Как и в случае моторной дисфункции задних лап, у контрольных животных до и после введения растворителя в отношении дисфункции передних лап не выявлено значимых различий, не обнаружены они и при сравнении исходных значений съеденных зерен крысами в контрольной и экспериментальной группах. Таким образом, при моделировании ротенонового паркинсонизма у экспериментальных крыс отмечено нарушение моторных функций задних и передних конечностей. 122 3.1.4 Изменение интегративных функций мозга в патогенезе хронической нейродегенерации 3.1.4.1 Ольфакторный тест в ротеноновой модели нейродегенерации При проведении социальных тестов оценки интегративных функций мозга, для исключения влияния факторов, которые могут искажать результаты полученных исследований (снижение обонятельной чувствительности), был проведен тест на изучение обонятельной чувствительности. Известно, что обонятельная чувствительность и восприятие запахов у крыс играет очень важную роль в получении информации об окружающей среде, в коммуникациях животных, в ольфакторной дискриминации (распознавании различных запахов). Обонятельная чувствительность с течением жизни млекопитающих способна меняться: к примеру, обнаружены возрастное чувствительности при дегенеративных изменениях снижение обонятельной обонятельного эпителия, модуляция обонятельной чувствительности в течение эстрального цикла самок под действием половых гормонов, продолжительное (двухнедельное) приложение запаха андростенона на крыс повышала их чувствительность животных к этому запаху [30]. Данные осмотра животных на обонятельную чувствительность и наличие/отсутствие повреждения ольфакторной дискриминации представлены в таблице 9. В ольфакторном тесте отмечено значимое уменьшение во всех группах и в среднем времени обнюхивания крысами баночки с запахом, со второй по пятую сессии (по сравнению с первой сессией, когда для крыс тестируемый запах эфирного масла был незнакомым). При замене баночки с другим эфирным маслом (6 сессия) вновь отмечается увеличение времени обнюхивания баночки, значимо не отличающееся от времени обнюхивания баночки с первым запахом в первой сессии тестирования крыс. В отношении ольфакторной дискриминации не отмечено появления значимых различий в экспериментальной группе при создании модели ротенонового паркинсонизма в сравнении с контрольной группой и ольфакторной дискриминацией в этой же группе до моделирования 123 паркинсонизма, что свидетельствует об отсутствии нарушения распознавания запахов у животных с ротеноновой моделью хронической нейродегенерации. Таблица 9 – Осмотр животных на обонятельную чувствительность в «ольфакторном» тесте при ротеноновом паркинсонизме Группы животных Параметры в ольфакторном тесте Время обнюхивания баночки с запахом в 1 сессию (с) Время обнюхивания баночки с запахом во 2 сессию (с) Время обнюхивания баночки с запахом в 3 сессию (с) Время обнюхивания баночки с запахом в 4 сессию (с) Время обнюхивания баночки с запахом в 5 сессию (с) Время обнюхивания баночки с запахом в 6 сессию (с) Ольфакторная дискриминация К5 (раств-ль), n=15 Э6 (ротенон), n=11 Суммарное значение до до до после после создания создания создания создания создания модели модели модели 13,8±4,4 7,9±3,8 11,8±1,7 16,0±4,2 7,4±2,4* 1,7±0,8 10,2±3,4 5,2±1,7 4,0±1,5 5,1±1,5* 2,4±1,0* 4,0±0,7**** 10,5±3,5 4,9±2,3 11,2±3,4 2,9±1,6** 6,8±1,4* 7,0±4,1 2,5±1,7 12,4±3,6 4,4±1,8* 6,6±1,5** 14,7±5,9 2,4±1,5 21,0±7,4 8,9±3,3 11,7±2,6 1,6±0,9 1,5±1,4 1,0±0,3 1,1±0,5 - 4,6±2,9 12,7±1,8 6,1±1,5*** Время обнюхивания баночки во 2 сессию после создания модели: pНК-К5≤0,05 Примечание: * – p при сравнении 2-й и последующих сессий с 1-й Таким образом, при моделировании ротенонового паркинсонизма у экспериментальных крыс не отмечено нарушения обонятельной чувствительности и ольфакторной дискриминации. 124 3.1.4.2 Оценка социального поведения крыс в ротеноновой модели хронической нейродегенерации Социальное поведение крыс является проявлением сложных форм поведения и интегративных функций нервной системы и может страдать при заболеваниях аутистического спектра, являясь одним из проявлений этих заболеваний. Считается, что нарушение социального поведения у пациентов с аутизмом может быть связано с нарушением функции программирования и контроля или вследствие снижения способности к социальному познанию и может объясняться не только ригидностью поведения, но и ослаблением способности участвовать в социальной коммуникации, которая требует оперативной оценки и выбора подходящих реакций в ответ на постоянно меняющуюся информацию [1]. Способность крыс участвовать в социальных коммуникациях с другими животными (незнакомым самцами) была определена в тестах «3-камерная активность» и «с трубой на агрессию» (таблица 10). В тесте «3-камерная активность» при моделировании паркинсонизма отмечено удлинение времени, проведенного в центральном отсеке во время 2-й и 3-й сессий тестирования, значимое удлинение времени, проведенного в отсеке со знакомым самцом, в отличие от незнакомого, при этом не отмечено значимых отличий между временем обнюхивания «знакомого» и «незнакомого» самцов, что вместе взятое отражает нарушение социального распознавания у крыс с моделью БП. Известно, что для аутизма, кроме социальной отгороженности (недостатки социальных и коммуникативных навыков) и наличия стереотипных действий, характерно агрессивное (аутоагрессивное) поведение [47]. У крыс с моделью БП не отмечено появления агрессивности, даже имеется тенденция к ее уменьшению по отношению к другим самцам, однако выявленное изменение может быть связано не столько с уменьшением агрессивности, сколько с большей «пассивностью» крыс вследствие развития паркинсонизма и уменьшением их двигательной активности вследствие моторных нарушений, из-за чего таких крыс с большей «легкостью» выталкивают из теста. 125 Таблица 10 – Оценка социального поведения крыс в модели хронической нейродегенерации в тестах «3-камерная активность» и «с трубой» на агрессию Группы животных К5 (раств-ль), n=11 Э6 (ротенон), n=15 Параметры социального поведения до создания модели после создания до создания модели после создания Время, проведенное в боковом отсеке с 141,2± 198,5± 277,7± 230,9± объектом во 2 сессии (с) 126,7 112,3 86,5 Время, проведенное в пустом боковом отсеке 208,1± 3,2± 72,8± 94,7± во 2 сессии (с) 105,1 0,9 68,5 62,5 Время, проведенное в центральном отсеке во 72,7± 101,4± 79,3± 141,3± 2 сессии (с) 68,8 98,3 76,3 73,2 553,5± 296,8± 70,4± 231,2± 91,2 139,0 69,1*** 86,8 Время, проведенное в боковом отсеке со 139,8± 1,6± 277,2± 231,9± знакомым объектом в 3 сессии (с) 91,7 0,8 112,4 86,5* Время, проведенное в боковом отсеке с 72,6± 100,3± 208,9± 95,0± незнакомым объектом в 3 сессии (с) 68,8 98,3 105,1 62,5 Время, проведенное в центральном отсеке в 141,9± 6,1± 279,4± 142,8± 3 сессии (с) 1,0 112,0 73,3 Время обнюхивания знакомого объекта в 3 207,6± 394,0± 138,4± 275,7± сессии (с) 105,3 139,2 92,2* 90,2 Время обнюхивания незнакомого объекта в 3 482,8± 394,9± 138,7± 276,5± сессии (с) 104,9 139,4 91,7* 90,3 50,0± 60,0± 58,0± 30,7± 8,0 20,0 13,5 6,4 91,6 Время обнюхивания объекта во 2 сессии (с) Наличие 91,4 агрессии выполнении теста), % (число побед при Время обнюхивания объекта во 2 сессии в группе Э6: pдо-после создания модели≤0,05 Примечание: * – p при сравнении экспериментальной группы (Э6) с контролем (К5) 126 Таким образом, в отношении нарушения социальных коммуникаций и агрессивности крыс, как и других нарушений, характерных для аутизма, получены неоднозначные данные, требующие дальнейшего изучения. Тем не менее, у большинства крыс отмечено нарушение социального распознавания других животных, но лишь у некоторых крыс наблюдалось появление агрессивного (аутоагрессивного) поведения. 3.1.4.3 Оценка эмоционального поведения крыс в ротеноновой модели хронической нейродегенерации Известно, что для болезни Паркинсона и аутизма (чаще наблюдается у взрослых людей, чем у детей с аутизмом) характерно увеличение тревожности и появление депрессии. К психологическим симптомам тревожности при этих заболеваниях относятся быстрая потеря терпения, проблемы с концентрацией внимания, постоянные мысли о наихудшем варианте развития событий, проблемы со сном, депрессия, полная увлеченность или навязчивые мысли об одном и том же предмете. Ранее считалось, что синдром дефицита внимания и аутизм являются взаимоисключающими диагнозами. Однако, в литературе появились новые данные [77] о том, что эти диагнозы не просто не являются более взаимоисключающими, а между ними найдена взаимосвязь. К примеру, около 30% детей с аутизмом имеют симптомы дефицита внимания. У животных тревожность в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ) проявляется в виде увеличения времени пребывания животного в закрытых рукавах, эпизодов замирания/неподвижности и увеличения актов дефекации в открытых рукавах по сравнению с закрытыми; нарушение внимания, проявляющееся у людей в виде синдрома гиперактивности/дефицита внимания, у животных может проявляться в виде беспорядочных переходов между открытыми и закрытыми рукавами [26, 410]. Несмотря на общие нарушения двигательной активности, у экспериментальных животных в условиях переменной стрессогенности (таблица 127 11) выявлена тенденция к удлинению пройденного пути, значимое увеличение числа пересеченных линий, увеличение числа входов в открытые, закрытые рукава и центр, что характерно для беспорядочных перемещений крыс при «дефиците внимания». Кроме того, у крыс с ротеноновой моделью болезни Паркинсона отмечено значимое уменьшение времени пребывания в открытых рукавах и описанное выше увеличение числа входов в закрытые/открытые рукава и центр установки, что также может быть связано и с увеличением тревожности крыс. Таблица 11 – Оценка эмоционального поведения крыс в модели хронической нейродегенерации в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» Группы животных Параметры эмоционального поведения До создания К5 (раств- Э6 (ротенон), модели, n=20 ль), n=7 n=13 5,5±1,6 6,2±1,3 8,2±1,6 11,9± 2,3 13,3±3,5 20,5±5,4* Число входов в открытые рукава 3,3±0,5 2,4±0,7 3,8±1,6 Число входов в закрытые рукава 3,8±0,7 4,4±1,0 7,5±1,7* Число входов в центральную часть теста 5,9±1,2 5,1±1,2 8,9±2,4 Пройденный путь, м Число пересеченных линий Время нахождения в открытых рукавах, с Время нахождения в закрытых рукавах, с Время нахождения в центральной части теста, с 209,1±72,2 396,3±138,9* 54,9±53,1 6,7±0,9 9,3±0,1 7,7±0,8 310,6±78,6 492,4±126,9 372,5±99,3 Примечание: * – p при сравнении параметров до и после создания модели БП Таким образом, у крыс с хронической нейродегенерацией в ротеноновой модели болезни Паркинсона отмечено нарушение эмоционального поведения в виде появления тревожности и «дефицита внимания», характерных также, согласно последним данным, и для расстройств аутистического спектра. 128 3.1.4.4 Оценка когнитивной функции крыс в ротеноновой модели хронической нейродегенерации Когнитивная функция крыс определяется в основном гиппокампом и заключается в запоминании объектов и их положении в пространстве, навигационном научении при плавании крыс, социальной/эмоциональной памяти [1]. В тестах на когнитивную функцию можно оценить кратковременную (изменение памяти крыс в процессе тренировок крыс в течение одного дня тестирования) и долговременную (изменение способности к запоминанию и нахождению объектов в течение нескольких дней тренировки) память, а также появление когнитивной дисфункции у крыс при развитии нейродегенерации. Известно, что у пациентов с БП отмечается появление когнитивного дефицита во второй стадии развития болезни, часто когнитивные нарушения появляются еще на домоторной стадии заболевания, определяют качество жизни пациентов, нередко являются причиной инвалидизации пациентов [54]. Оценка кратковременной памяти животных в тестах «водный лабиринт Морриса» (таблица 12), Барнса (таблица 13) и Т-лабиринте с подкрепленным вариантом (таблица 14) выявила сходные изменения: в экспериментальной и контрольной группах крыс отмечалось постепенное снижение времени выполнения тестов от 1-й попытки к 4-й в первый день тренировки, однако наиболее значимые различия наблюдались в тесте «водный лабиринт Морриса». Таблица 12 – Динамика изменения кратковременной памяти у исследуемых крыс до создания модели болезни Паркинсона в тесте «водный лабиринт Морриса» Группы животных Время достижения платформы в 1-й день тренировки (с) 1 попытка 2 попытка 3 попытка 4 попытка К5 (растворитель), n=11 52,7±2,4 43,9±3,3** 43,9±3,6* 40,3±4,2* Э6 (ротенон), n=14 49,8±3,1 41,5±3,6* 37,3±3,7*** 36,3±3,9*** Среднее по группам, n=24 51,2±2,0 42,6±2,5*** 40,4±2,6**** 38,2±2,8**** Примечание: * – p при сравнении 2, 3 и 4 попытки с 1 попыткой тренировки 129 Таблица 13 – Динамика изменения кратковременной памяти у исследуемых крыс до создания модели хронической нейродегенерации в тесте Барнса Время достижения отверстия, ведущего в короб, в 1-й день тренировки (с) Группы животных 1 попытка 2 попытка 3 попытка 4 попытка К5 (растворитель), n=11 59,5±0,5 59,7±0,9 59,5±0,5 58,0±2,0 Э6 (ротенон), n=14 59,0±1,0 58,5±1,1 59,3±0,7 57,2±1,9 Среднее по группам, n=24 59,3±0,5 59,1±0,6 59,4±0,4 57,6±1,4 Таблица 14 – Динамика изменения кратковременной памяти у исследуемых крыс до создания модели хронической нейродегенерации в тесте ««Т-лабиринт» Время нахождения еды в Группы животных нужном рукаве в 1-й день К5 (раств-ль), Э6 (ротенон), Среднее по тестирования (с) n=30 n=30 группам, n=60 1 попытка 15,1±2,8 19,2±4,7 17,3±2,8 2 попытка 10,4±2,5 12,0±3,3 11,3±2,1* 3 попытка 15,4±3,7 15,6±3,3 15,5±2,5 4 попытка 14,5±3,1 18,5±4,4 16,6±2,7 5 попытка 8,9±2,2 12,8±3,3 11,0±2,0 6 попытка 11,0±2,6 12,4±4,4 11,7±2,6* 7 попытка 9,9±2,7 13,3±3,6 11,7±2,3 8 попытка 14,8±3,3 6,4±1,6 10,4±1,8 9 попытка 11,8±2,9 6,0±1,9 8,8±1,7* 10 попытка 12,3±3,4 12,6±3,0 12,4±2,2 Время нахождения еды при 8-й и 9-й попытке: pК5-Э6≤0,05 Примечание: * – p при сравнении 2-й и последующей попыток с 1-й попыткой в 1-й день тренировки 130 Долговременная память крыс также показала постепенное уменьшение времени выполнения тестов «водный лабиринт Морриса» (таблица 15), Барнса (таблица 16) и Т-лабиринта (таблица 17) во всех тестах, однако наиболее быстрое и значимое уменьшение времени выполнения теста до нормальной когнитивной функции наблюдалось в тесте «водный лабиринт Морриса». В тех же случаях, когда по ряду причин (очень тяжелое состояние животных, не позволяющее им плыть, нарушение плавательного рефлекса и др.) выполнение теста «водный лабиринт Морриса» затруднено или невозможно, возможно использовать тесты Барнса и Т-лабиринт с подкреплением. Для оценки когнитивной функции крыс в Т-тесте лучше использовать среднее время нахождения еды за 10 попыток обучения в день (в секундах) и % правильно выполненных попыток из 10. Таблица 15 – Динамика изменения долговременной памяти у исследуемых крыс до создания модели болезни Паркинсона в тесте «водный лабиринт Морриса» Время достижения платформы в 1-4-й дни тестирования, 4-е попытки (с) Группы животных 1 день 2 день 3 день 4 день К5 (растворитель), n=11 40,3±4,2 24,5±3,9** 29,1±3,7* 15,5±2,9**** Э6 (ротенон), n=14 36,3±3,9 23,3±3,3** 25,5±3,2* 16,3±2,7**** Среднее по группам, n=24 38,2±2,8 23,8±2,5**** 27,1±2,4*** 15,9±2,0**** Примечание: * – p при сравнении 2, 3 и 4 дня тренировки с 1 днем (4-я попытка тренировки) Оценка когнитивной функции крыс после создания у них модели хронической нейродегенерации также проводилась в тестах «водный лабиринт Морриса», Барнса и Т-лабиринте и представлена в таблицах 18-19. При моделировании ротенонового паркинсонизма отмечено появление у крыс когнитивной дисфункции в экспериментальной группе на 28-е сутки с момента моделирования, в сравнении с исходным значением до моделирования, что выразилось в значимом увеличении времени нахождения крысой платформы 131 в водном лабиринте, времени нахождения отверстия, заканчивающегося коробом, в тесте Барнса и в значимом уменьшении % правильного выполнения теста Тлабиринт. Как и в случае оценки долговременной памяти, наиболее предпочтительным тестом для оценки когнитивной функции крыс является «водный лабиринт Морриса», однако в случае невозможности его выполнения целесообразно использовать тест Барнса (определение времени нахождения отверстия, заканчивающегося коробом) и/или Т-лабиринт (в данном тесте для оценки когнитивной дисфункции лучше оценивать % правильного выполнения теста). Таблица 16 – Динамика изменения долговременной памяти у исследуемых крыс до создания модели хронической нейродегенерации в тесте Барнса Группы животных Время достижения отверстия, ведущего в короб, в 1-й-10-й дни К5 (раств-ль), Э6 (ротенон), Среднее по тестирования (с) n=11 n=14 группам, n=24 1 день обучения 58,0±2,0 57,2±1,9 57,6±1,4 2 день обучения 55,5±3,1 60,0±0,0 57,8±1,6 3 день обучения 60,0±0,0 58,7±1,3 59,4±0,7 4 день обучения 59,7±0,3 56,0±4,0 57,9±2,0 5 день обучения 56,8±3,2 60,0±0,0 58,4±7,2 6 день обучения 60,0±0,0 60,0±0,0 60,0±0,0 7 день обучения 59,0±3,2 59,1±0,6 59,1±0,6 8 день обучения 36,1±5,6* 32,3±6,4** 34,2±4,2**** 9 день обучения 41,1±3,5** 32,8±2,1*** 37,0±2,2**** 10 день (оценка) 14,1±2,2*** 18,3±2,0*** 16,2±1,5**** Время нахождения отверстия, ведущего в короб, на 9-й день обучения: pК5-Э6≤0,05 Примечание: * – p при сравнении 2-10 дней тренировки с 1 днем (4-я попытка тренировки) 132 Таблица 17 – Динамика изменения долговременной памяти у исследуемых крыс до создания модели хронической нейродегенерации в Т-тесте Группы животных Параметры Т-теста К5 (раств- Э6 (ротенон), Среднее по ль), n=11 n=14 группам, n=24 12,3±3,4 12,6±3,0 12,4±2,2 5,8±4,4* 3,1±1,3** 4,4±2,2*** 13,9±2,6 7,0±2,4 10,3±1,8 6,4±1,7 9,2±2,2 7,8±1,4 Среднее время нахождения в 1-й день (с) 12,4±1,6 12,9±2,0 12,3±1,3 Среднее время нахождения во 2-й день (с) 9,7±1,7 6,2±1,0*** 7,9±1,0**** Среднее время нахождения в 3-й день (с) 15,3±1,5 10,6±1,4 12,7±1,1 Среднее время нахождения в 4-й день (с) 13,0±1,5 11,0±1,5 11,9±1,1 % правильно выполненного теста (1 день) 41,3±6,9 31,5±6,3 36,2±4,7 % правильно выполненного теста (2 день) 16,7±2,7**** 13,9±3,5* 15,2±2,2**** % правильно выполненного теста (3 день) 52,0±6,0 40,0±5,9 45,7±4,3* % правильно выполненного теста (4 день) 47,0±6,4 40,6±5,3 43,7±4,1 Время нахождения еды на 10-ю попытку, 1-й день (с) Время нахождения еды на 10-ю попытку, 2-й день (с) Время нахождения еды на 10-ю попытку, 3-й день (с) Время нахождения еды на 10-ю попытку, 4-й день (с) Время нахождения еды во время выполнения 10-й попытки и среднее время нахождения еды на 3-й день обучения: pК5-Э6≤0,05 Примечание: * – p при сравнении 2, 3 и 4 дня тренировки с 1 днем У контрольных животных до и после введения растворителя не отмечено развития когнитивной дисфункции, на 28-е сутки с момента введения растворителя даже отмечено значимое улучшение времени достижения крысами платформы. Данный факт, вероятнее всего, связан с малыми объемами выборок и 133 поведенческими особенностями некоторых крыс, что подтверждается появлением исходных различий между группами К и Э до создания моделей БП. Таблица 18 – Появление когнитивной дисфункции крыс в модели хронической нейродегенерации в тестах «водный лабиринт Морриса» и Барнса Группы животных Водный лабиринт Морриса, Тест Барнса, время нахождения время нахождения отверстия, заканчивающегося платформы (с) коробом (с) до создания после до создания модели создания модели К5 (раств-ль), n=11 15,5±2,9 11,7±2,3 14,1±2,2 5,3±0,9* Э6 (ротенон), n=14 16,3±2,7 31,9±4,8* 18,3±2,0 19,6±4,1 после создания Время нахождения платформы в тесте «водный лабиринт» после создания модели: pК5-Э6≤0,001 Время нахождения отверстия, заканчивающегося коробом, в тесте Барнса после создания модели: pК5-Э6≤0,005 Примечание: * – p при сравнении параметров до и после создания модели БП Таблица 19 – Оценка когнитивной функции крыс в модели хронической нейродегенерации в тесте Т-образный лабиринт Время нахождения Среднее время еды на 10-ю попытку нахождения еды в тестирования (с) Группы животных тесте (с) до выполнения теста до до создания после модели создания К5 (раств-ль), n=11 6,4±1,7 7,4±1,9 13,0±1,5 11,0±1,2 47,0±6,4 46,2±5,2 Э6 (ротенон), n=14 9,2±2,2 3,4±3,0 11,0±1,5 7,1±1,5* 40,6±5,3 23,3±6,4 создания модели после % правильного создания создания модели после создания Среднее время нахождения еды в тесте после создания модели: pК5-Э6≤0,05 % правильного выполнения теста после создания модели: pК5-Э6≤0,01 Примечание: * – p при сравнении параметров до и после создания модели БП 134 Тест на распознавание нового объекта (таблица отражает 20) непространственную память крыс на характеристики объектов (их форму, запах, цвет, текстуру и т.д.) и процесс пластичности обучения. Тест выявил пластичность обучения и нормальную когнитивную функцию крыс до создания модели болезни Паркинсона, проявляющейся в значимом увеличении времени обнюхивания «нового» объекта в сравнении со «знакомым» объектом и сохраняющейся в контрольной и экспериментальной группах крыс, но немного страдающей (увеличение времени обнюхивания как нового, так и старого объекта по сравнению с контролем и аналогичным параметром до создания модели, однако в экспериментальной группе также отмечаются значимые различия между временем обнюхивания «старого» и «нового» объектов) в экспериментальной группе животных. Таблица 20 – Оценка непространственной памяти крыс в модели хронической нейродегенерации в тесте на распознавание нового объекта Параметры теста Среднее по К5 (раств-ль), Э6 (ротенон), группам, n=24 n=11 n=14 Время обнюхивания кубиков в 1 сессии (с) 45,8±8,2 32,0±4,5 57,1±31,9 Время обнюхивания кубика во 2 сессии (с) 8,8±1,0 14,9±2,5 38,5±22,1 23,1±2,0**** 34,6±4,9* 73,7±7,7*** Время обнюхивания кольца («новый» объект) во 2 сессии (с) Время обнюхивания «нового» объекта во 2 сессии в группе К5: pдо-после создания модели≤0,05; в группе Э6: pдо-после создания модели≤0,05 Время обнюхивания «нового» объекта во 2 сессии после создания модели: pК5-Э6≤0,005 Примечание: * – p при сравнении времени обнюхивания «старого» и «нового» объектов Таким образом, у крыс до создания моделей хронической нейродегенерации, отмечалась нормальная когнитивная функция (как пространственной, так и непространственной, кратковременной и долговременной памяти), связанная с 135 пластичностью обучения. Развитие хронической нейродегенерации сопровождалось появлением когнитивной дисфункции. 3.1.5 Оценка состояния неврологических рефлексов, физического развития животных, признаков аутизма и паркинсонизма и интегративных функций мозга при экспериментальном моделировании аутизма В моделях внутриутробного воздействия ротенона, ротенона/вальпроевой кислоты и общеизвестной модели аутизма (введение вальпроевой кислоты) при оценке состояния их физического и неврологического развития (таблица 21) отмечено значимое отставание в развитии некоторых рефлексов и признаков физического развития животных в сравнении с контрольными животными. Однако, по некоторым рефлексам, напротив, отмечалось значимое ускорение их развития: более раннее появление отрицательного геотаксиса и прорезывания резцов в экспериментальных группах в сравнении с контролем. Некоторые параметры (рефлекс поднятия головы и передних лап) отличались значимо в группе с «классической» моделью аутизма в сравнении с остальными группами, в отношении других (рефлекс опоры на задние конечности и подъема всего тела, открытие глаз, отставание в весе как на 7-е, так и на 14-е сутки наблюдения, более позднее выполнение плавательного теста) – отмечались значимые различия в группах с приложением ротенона или ротенона и вальпроевой кислоты в сравнении с контролем и «классической» моделью аутизма с приложением вальпроата. Остальные параметры (число мертвых крысят в помете при рождении и гибель животных в постнатальном периоде развития, число крысят в помете, время появления рефлекса поиска гнезда, обонятельной дискриминации в тесте «поиск гнезда», ползательного рефлекса и рефлекса поиска гнезда, мышечная сила) не отличались значимо в группах с пренатальным введением ротенона и ротенона/вальпроевой кислоты в сравнении с контрольной группой. 136 Таблица 21 – Осмотр на становление неврологического и физического развития животных с моделью хронической нейродегенерации раннего возраста Оцениваемые признаки Группы животных К6 (раств- Э7 (Рот), Э8 (Рот+ Э9 (Вальп), ль), n=13 n=17 Вальп), n=11 n=7 0,0±0,0 0,0±0,0 1,0±1,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 1,5±1,5 0,0±0,0 6,5±3,5 8,0±1,0 7,0±4,0 3,5±3,5 Число мертвых крысят в помете (Р1) Число мертвых крысят в помете (P7) Число крысят в помете (Р1) Сутки появления рефлекса 8,4±0,3 7,2±0,3 6,3±0,1 6,0±0,0 «Отрицательный геотаксис» Сутки прорезывания резцов 7,2±0,1 7,3±0,1 6,0±0,0 8,7±0,2 Сутки появления рефлекса подъема 9,5±0,2 9,4±0,2 9,1±0,3 8,0±0,0 головы и передних лап Сутки появления рефлекса опоры на 14,8±0,1 15,0±0,7 15,1±0,1 14,7±0,2 задние конечности и подъема тела Сутки появления рефлекса поиск гнезда 9,1±0,1 9,2±0,1 9,1±0,1 9,0±0,0 Сутки появления обонятельн. реакции 9,0±0,0 9,1±0,1 9,0±0,0 9,0±0,0 Сутки открытия глаз 14,2±0,4 16,3±0,2 16,2±0,2 14,7±0,2 Правильность выполнения 5,4±0,2 5,7±0,1 6,0±0,0 5,3±0,2 плавательного теста (баллы) Вес крысят (г, Р7) 12,2±0,3 9,1±0,2 9,0±0,3 16,1±0,6 Вес крысят (г, Р14) 22,6±0,6 18,4±0,7 14,4±0,3 19,7±0,4 Мышечная сила (баллы, Р15) 0,4±0,1 0,6±0,1 0,5±0,1 0,5±0,1 Мышечная сила (баллы, Р16) 0,8±0,1 0,8±0,1 0,7±0,1 0,8±0,1 Мышечная сила (баллы, Р17) 1,0±0,04 0,9±0,05 1,0±0,0 1,0±0,0 Сутки появления рефлекса «Отрицательный геотаксис»: рК6-Э8≤0,001, рК6-Э9≤0,001, рЭ7Э8≤0,05, рЭ7-Э9≤0,01 Сутки прорезывания резцов: рК6-Э9≤0,001, рЭ7-Э8≤0,001, рЭ7Э9≤0,001, рЭ8-Э9≤0,001 Сутки появления рефлекса подъема головы и передних лап: рК6-Э8≤0,001, рК6-Э9≤0,001, рЭ7-Э9≤0,001, рЭ8-Э9≤0,005 Сутки появления рефлекса опоры на задние конечности и подъема тела: рЭ8-Э9≤0,01 Сутки открытия глаз: pК6Правильность выполнения Э7≤0,001, p≤0,001, К6-Э8≤0,005, рЭ7-Э9≤0,001, рЭ8-Э9≤0,001 плавательного теста: рК6-Э8≤0,01, рЭ7-Э8≤0,05, рЭ7-Э9≤0,05, рЭ8-Э9≤0,01 Вес крысят (Р7): pК6-Э7≤0,001, pК6-Э8≤0,001, pК6-Э9≤0,001, рЭ7-Э9≤0,001, рЭ8-Э9≤0,001 Вес крысят (Р14): pК6-Э7≤0,001, pК6-Э8≤0,005, pК6-Э9≤0,01, pЭ7-Э8≤0,001, pЭ7-Э9≤0,001, рЭ8-Э9≤0,001 Примечания: Р1-Р17 сутки постнатального развития (1-е-17-е), Рот – ротенон, Вальп – вальпроат натрия 137 Данные осмотра нейропсихического статуса крысят на 60-е сутки развития представлены в таблицах 22-26. При осмотре неврологического статуса крысят по шкале NSS (таблица 22) выявлены значимые различия в группах с пренатальным введением ротенона и комбинации ротенон-вальпроевая кислота с группой контроля, что свидетельствует о развитии у крысят легкой неврологической дисфункции, связанной главным образом с нарушением равновесия. Таблица 22 – Оценка неврологического статуса 60-дневных крысят в NSS-тесте Параметры теста Сумма баллов Группы животных К6 (раств-ль), n=9 0,3±0,2 Э7 (Рот), n=8 1,5±0,2 Э8 (Рот+ Вальп), n=7 1,6±0,4 рК6-Э7≤0,005, рК6-Э8≤0,05 Примечания: Рот – ротенон, Вальп – вальпроат натрия Осмотр крысят на наличие признаков паркинсонизма (таблица 23) и в тесте «Открытое поле» (таблица 24), учитывая возможную взаимосвязь клеточномолекулярных событий и этиопатогенеза аутизма и болезни Паркинсона, выявили некоторые особенности у крысят с пренатальным введением ротенона и комбинации ротенон-вальпроевая кислота, характерные для паркинсонизма: появление тремора и нарушения равновесия, а также значимое нарастание суммы баллов в экспериментальных группах в сравнении с контрольной, значимые различия в горизонтальной двигательной активности (укорочение длины пройденного пути и количества пересеченных секторов), в средней скорости крыс (ее значимое снижение) в группе с пренатальным введением ротенона (в сравнении с контролем), значимое увеличение латентного периода «замирания» крыс (отмечалось в обеих экспериментальных группах в сравнении с контролем), что свидетельствует о развитии у крыс нарушений двигательной активности. Однако эти различия не так резко выражены, как у взрослых животных и по симптомам больше напоминают симптомы паркинсонизма, нежели болезни Паркинсона (нарушения двигательной активности и ригидность мышц у 138 некоторых крыс отсутствуют или слабо выражены, среди симптомов доминируют тремор и нарушение равновесия), поэтому модели с пренатальным введением ротенона и ротенона/вальпроевой кислоты не могут являться полноценными моделями болезни Паркинсона. Таблица 23 – Осмотр животных на наличие признаков паркинсонизма в моделях хронической нейродегенерации на 60-дневных крысятах Группы животных Параметры теста К6 (раств- Э7 (Рот), Э8 (Рот+ ль), n=9 n=8 Вальп), n=7 Олигокинезия 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 Постуральная нестабильность 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 Неустойчивость походки 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 Равновесие 0,3±0,2 1,5±0,2 1,6±0,4 Тремор покоя 0,0±0,0 1,0±0,0 1,4±0,3 Ригидность мышц по типу «зубчатого колеса» 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 Суммарное значение баллов 0,3±0,2 2,5±0,2 3,0±0,7 Равновесие: рК6-Э7≤0,005, рК6-Э8≤0,05 Тремор покоя: рК6-Э7≤0,001, рК6-Э8≤0,005 Суммарное значение баллов: рК6-Э7≤0,001, рК6-Э8≤0,005 Примечания: Рот – ротенон, Вальп – вальпроат натрия В обеих экспериментальных моделях также наблюдалась часть признаков аутизма (таблица 25): отмечалась тенденция к увеличению агрессивности крысят, значимое увеличение продолжительности аутогрумминга и рытья подстила животными, отмечено также нарушение социального контакта животных (увеличение времени контакта с ранее «знакомой» крысой в сравнении с контролем при сохранении социального интереса к «незнакомой» крысе) при сохранении когнитивной функции, как было ранее показано в тесте «водный лабиринт». 139 Таблица 24 – Оценка признаков паркинсонизма 60-дневных крысят в тесте «Открытое поле» Группы животных Параметры теста К6 (раств-ль), Э7 (Рот), Э8 (Рот+ n=9 n=8 Вальп), n=7 Дефекация 1,4±0,5 0,9±0,6 1,1±0,5 Уринация 1,4±0,5 1,1±0,3 0,4±0,2 Пройденный путь (м) 21,4±1,6 15,0±1,9 20,3±2,5 Число пересеченных квадрантов (ГДА) 166,2±13,8 113,3±15,0 160,1±20,7 Средняя скорость крысы (м/с) 0,05±0,004 0,03±0,003 0,04±0,005 Латентный период (с) 26,6±9,4 61,1±13,5 56,4±12,4 Общее число входов в сектора 27,0±12,5 17,0±3,8 31,7±6,0 Число норковых рефлексов 34,0±10,8 24,9±4,4 29,4±5,1 Время обнюхивания норок (с) 12,0±3,7 13,5±2,4 13,1±2,5 Уринация: рК6-Э8≤0,05 Пройденный путь: рК6-Э7≤0,05 ГДА: рК6-Э7≤0,05 Средняя скорость: рК6-Э7≤0,01, рЭ7-Э8≤0,05 Латентный период: рК6-Э7≤0,05, рК6-Э8≤0,05 Общее число входов в сектора: рЭ7-Э8≤0,05 Примечания: Рот – ротенон, Вальп – вальпроат натрия Во всех тестируемых группах животных не было обнаружено признаков когнитивной дисфункции (среднее время достижения платформы в 4-ю попытку 4-го дня тренировки во всех группах менее 15 секунд, что соответствует нормальной когнитивной функции), одной из интегративных функций мозга, также у крысят в контрольной группе и группе с пренатальным введением ротенона отмечено значимое улучшение показателя (времени достижения платформы) на 4-й день тренировки в сравнении с 4-й попыткой 1-го дня тренировки, что свидетельствует о нормальной долговременной памяти в этих группах крысят (таблица 26). В группе с пренатальным введением ротенона и вальпроевой кислоты различия не были значимы, однако наблюдалась тенденция 140 к уменьшению времени достижения платформы. Таблица 25 – Оценка признаков аутизма 60-дневных крысят в тестах «3камерная активность», «тест с трубой» на агрессию, «рытье подстилки» и «аутогрумминг» Группы животных Параметры теста К6 (раств- Э7 (Рот), Э8 (Рот+ ль), n=9 n=8 Вальп), n=7 2,2±0,6 3,0±0,5 3,0±0,5 Аутогрумминг, время выполнения теста (с) 157,2±34,5 327,8±37,3 340,0±98,0 Рытье подстила, время выполнения теста (с) 45,6±33,9 363,6±55,1 143,1±40,2 102,9±45,3 99,4±65,0 41,4±12,6 49,6±14,1 48,9±13,2 50,5±7,4 23,0±13,6 64,7±33,6 92,5±42,20 Агрессия, число побед в тесте с трубой Время контакта с незнакомой крысой в тесте 3-камерная активность, 1 сессия (с) Время контакта с незнакомой крысой в тесте 3-камерная активность, 2 сессия (с) Время контакта со «знакомой» крысой в тесте 3-камерная активность, 2 сессия (с) Аутогрумминг, время выполнения теста: рК6-Э7≤0,05, рК6-Э8≤0,01 Рытье подстила, время выполнения теста: рК6-Э7≤0,01, рК6-Э8≤0,05, рЭ7-Э8≤0,05 Время контакта со «знакомой» крысой в тесте 3-камерная активность, 2 сессия: рК6-Э8≤0,05 Примечания: Рот – ротенон, Вальп – вальпроат натрия Таким образом, в моделях пренатального воздействия ротенона и комбинации ротенон+вальпроевая кислота отмечены значимые различия в отношении открытия глаз, прорезывания резцов, выполнения плавательного теста, отставания в весе (наблюдается и у взрослых животных с моделью хронического системного введения ротенона), выполнения отрицательного геотаксиса по сравнению с контрольными животными и/или животными с «классической» моделью аутизма, отмечено появление легкого неврологического 141 дефицита без когнитивной дисфункции, части признаков, характерных и для паркинсонизма (появление у большей части животных тремора и нарушения равновесия, а у части животных нетяжелых нарушений двигательной активности), и для аутизма (склонность к агрессии, появление непроивольных повторяющихся движений – аутогрумминга и рытья подстилки, нарушение социального контакта с другими особями), что может быть связано с появлением у животных нарушения развития головного мозга по типу хронической нейродегенерации. Таблица 26 – Оценка на наличие когнитивной дисфункции, оценка кратковременной и долговременной памяти 60-дневных крысят в тесте «водный лабиринт Морриса» (время выполнения теста в секундах) Группы животных Параметры теста К6 (раств-ль), Э7 (Рот), Э8 (Рот+ n=9 n=8 Вальп), n=7 1 попытка в 1 день тестирования 48,1±6,1 48,9±6,7 49,1±6,5 2 попытка в 1 день тестирования 47,1±7,1 48,4±5,7 39,6±8,1 3 попытка в 1 день тестирования 40,8±7,6 48,4±7,4 30,3±3,8 4 попытка в 1 день тестирования 34,6±7,6 41,1±9,3 33,9±7,1 4 попытка во 2 день тестирования 26,6±7,3 14,8±3,7 23,0±9,6 4 попытка в 3 день тестирования 18,3±5,6 11,5±5,1 7,9±2,9 4 попытка в 4 день тестирования 12,3±6,2* 4,1±0,6* 14,3±7,8 3 попытка в 1 день тестирования: рЭ7-Э8≤0,05 Примечания: Рот – ротенон, Вальп – вальпроат натрия, * – p при сравнении 4-й попытки 1-го дня тестирования с 4-м днем тестирования 3.1.6 Иммуногистоцитохимическая оценка экспрессии НАД+-зависимых механизмов реализации нейрон-глиальных взаимодействий в ротеноновой модели хронической нейродегенерации Для подтверждения развития паркинсонизма была произведена 142 иммуногистоцитохимическая оценка экспрессии фермента тирозингидроксилазы, участвующего в биосинтезе дофамина в дофаминергических нейронах (как метка для идентификации этого типа нейронов, селективно гибнущих при болезни Паркинсона) и оценка его коэкспрессии с одним из ферментов, участвующих в метаболизме внутриклеточного НАД+, CD38/АДФР-циклазой/НАД+- гликогидролазой (таблица 27). Таблица 27 – Коэкспрессия CD38/тирозингидроксилазы(ТГ) в среднем мозге Клеточные субпопуляции (количество позитивных клеток в % при подсчете на 100 клеток) Группы животных К5 (раств- Э6 (ротенон), ль), n=9 n=11 Кол-во CD38+ клеток 2,3±0,79 7,6±1,70* Кол-во ТГ+ клеток 21,8±2,84 6,7±0,95**** Кол-во коэкспрессирующих CD38/ТГ клеток 0,44±0,29 4,8±1,39* 2,2±1,5 32,0±8,7* Кол-во коэкспрессирующих CD38/ТГ клеток в % от всех СD38+ 10,0±6,7 30,6±9,0 Кол-во коэкспрессирующих CD38/ТГ клеток в % от всех ТГ+ Суммарное кол-во CD38+ клеток 2,8±0,86 12,5±2,36**** Суммарное кол-во ТГ+ клеток 22,2±2,82 11,5±1,82** Примечание: * – p при сравнении параметров в группе Э6 с группой К5 Выявлено, что при паркинсонизме отмечается значимое снижение суммарного количества тирозингидроксилаза-позитивных (дофаминергических нейронов) клеток, что согласуется с общеизвестными представлениями о патогенезе паркинсонизма в ротеноновой модели и является морфологическим подтверждением развития токсического паркинсонизма у экспериментальных животных. Кроме того, при паркинсонизме отмечается почти 5-кратное увеличение суммарного количества CD38-позитивных клеток и 10-кратное и увеличение доли CD38-экспрессирующих дофаминергических нейронов, что, вероятно, играет роль в индукции клеточного повреждения и гибели 143 дофаминергических нейронов. Те же тенденции по увеличению доли CD38 + клеток наблюдаются не только в дофаминергических нейронах: в 3,3 раза увеличивается количество CD38+ клеток, не относящихся к дофаминергическим (табл. 23). Вероятнее всего, это свидетельствует об увеличении количества CD38позитивных клеток среди нейроглиального окружения, что согласуется с данными зарубежных исследователей об увеличении количества CD38-экспрессирующих астроцитов и микроглии при паркинсонической нейродегенерации [151, 403]. Для подтверждения этого была проведена оценка коэкспрессии CD38 и маркеров вида клеток (нейронов, астроцитов и активированной микроглии) в норме и при развитии ротеноновой нейродегенерации (таблица 28). Таблица 28 – Фенотипирование CD38-позитивных клеток (в % от общего количества клеток) в экспериментальной модели болезни Паркинсона Группы животных Клеточные популяции (в % при подсчете на 100 клеток) астроциты активированная микроглия (GFAP+) (MAP2+) 7,3±0,87 3,0±0,60 4,2±0,75 9,1±0,10 13,3±1,96* 13,1±2,11** нейроны (NSE+) К5 (раств-ль), n=5 Э6 (ротенон), n=5 Примечания: * – p при сравнении параметров в группе Э6 с группой К5 При паркинсонизме отмечено значимое увеличение количества астроцитов (p≤0,05) и клеток активированной микроглии (p≤0,01), экспрессирующих CD38, в сравнении с контролем, и тенденции к увеличению количества нейронов, экспрессирующих CD38, что согласуется с данными о реактивном астроглиозе и нейровоспалении при хронической нейродегенерации, включая болезнь Паркинсона [82, 351]. Иммуногистоцитохимическая оценка коэкспрессии антигена CD38 и возможного белка, играющего роль в нейрон-астроглиальных взаимодействиях и 144 сопряженного с CD38, коннексина 43, экспрессируемого на астроцитах и функционально взаимодействующего, согласно литературным данным [42, 71], в мембранах ряда клеток с CD38, обеспечивая доступность НАД+ в качестве субстрата для каталитической реакции CD38, представлена в таблице 29. Таблица 29 – Коэкспрессия Cx43/CD38 в среднем мозге Группы животных Клеточные субпопуляции (количество позитивных клеток в % при подсчете на 100 клеток) К5 (раств- Э6 (ротенон), ль), n=5 n=5 Кол-во Cx43+ клеток 1,8±0,6 2,9±1,0 Кол-во CD38+ клеток 4,2±2,4 4,5±1,0 Кол-во коэкспрессирующих Cx43/CD38 клеток 5,2±1,7 12,9±1,7** 67,5±15,1 84,3±4,9 49,9±15,1 74,6±4,4 4,2±1,6 15,8±2,2*** Кол-во коэкспрессирующих Cx43/CD38 клеток в % от всех Cx43+ Кол-во коэкспрессирующих Cx43/CD38 клеток в % от всех CD38+ Суммарное кол-во Cx43+ клеток, % Примечание: * – p при сравнении параметров в группе Э6 с группой К5 При оценке коэкспрессии CD38 с белком каналов щелевых контактов коннексином 43 (Cx43), в экспериментальной группе отмечено значимое 3кратное увеличение количества клеток, коэкспрессирующих Cx43/CD38, и значимое 4-кратное увеличение суммарного количества коннексин43- положительных клеток (сумма клеток, как экспрессирующих коннексин 43 в «чистом виде», так и клеток, коэкспрессирующих оба белка). В отношении количества клеток, изолированно экспрессирующих коннексин-43, без коэкспрессии с CD38, в экспериментальной группе были выявлены тенденции к их увеличению, количество клеток, экспрессирующих только CD38, значимо не 145 отличалось от контрольной группы и не было отмечено заметных тенденций изменения их количества. При ротеновой нейродегенерации была выявлена тенденция к увеличению количества клеток, коэкспрессирующих Cx43/CD38, как в % от всех Cx43+ клеток, так и в % от всех CD38+ клеток. Для отдельных выяснения молекул, потенциальной роли экспрессируемых активированной главным образом микроглии на и клетках моноцитарного происхождения, микроглии и макрофагах (пуринергические рецепторы Р2Х7 подтипа; молекула метаболизма НАД+, сходная с CD38 – CD157; β-интегрин Mac-1 (CD11b/CD18); C3 компонент комплемента и один из продуктов его гидролиза C3b), потенциально играющих роль во взаимодействии микроглии с другими клетками ЦНС (нейрон-микроглия, астроцит-микроглия, микроглия-лейкоциты) и клетками эндотелия сосудов, была рассмотрена экспрессия пуринергических рецепторов Р2Х7 подтипа (таблица 30), «тройная» коэкспрессия CD157/CD11b/CD18 (таблица 31) и экспрессия лиганда для Mac-1 – C3/C3b компонента комплемента (таблица 32). Таблица 30 – Экспрессия Р2Х7 рецепторов в среднем мозге Клеточные субпопуляции (количество Группы животных позитивных клеток в %) К5 (раств-ль), n=10 Э6 (ротенон), n=11 Кол-во Р2Х7+ клеток, % 0,6±0,4 26,2±11,6** Примечание: * – p при сравнении параметров в группе Э6 с группой К5 При паркинсонизме отмечается значимое однонаправленное увеличение количества P2X7-экспрессирующих клеток среднего мозга (p≤0,01), увеличение относительного количества клеток, коэкспрессирующих CD157/CD11b/CD18 (p≤0,01) и тенденция к увеличению коэффициента их коэкспрессии (по данным конфокальной микроскопии), зрначимое увеличение количества C3/C3b- экспрессирующих клеток (p≤0,05) среднего мозга и плотности интенсивности флуоресценции C3/C3b на единицу площади (p≤0,05) по данным флуоресцентной 146 и конфокальной микроскопии в сравнении с контрольной группой, что согласуется с ролью микроглии в реализации нейровоспаления при развитии хронической нейродегенерации и потенциальной ролью указанных механизмов в реализации взаимодействий микроглии с другими типами клеток в ЦНС. Таблица 31 – Коэкспрессия маркеров CD157/CD11b/CD18 в модели БП Параметры коэкспрессии количество коэкспрессирующих клеток в % от общего количества клеток коэффициент колокализации антигенов в клетках по данным конфокальной микроскопии Группы животных К5 (раств-ль), n=5 Э6 (ротенон), n=5 4,9±0,71 14,9±1,20** 0,69±0,03 0,73±0,02 Примечание: * – p при сравнении параметров в группе Э6 с группой К5 Таблица 32 – Экспрессия C3/C3b в среднем мозге в модели болезни Паркинсона у взрослых животных Параметры экспрессии количество экспрессирующих C3/C3b клеток в % от общего количества клеток плотность интенсивности флуоресценции C3/C3b на единицу площади Группы животных К5 (раств-ль), n=5 Э6 (ротенон), n=5 8,5±1,32 21,3±4,74* 9,8±1,24 13,8±0,46* Примечание: * – p при сравнении параметров в группе Э6 с группой К5 Таким образом, фенотипирование CD38-позитивных клеток выявило важную роль астроцитов и активированной микроглии, экспрессирующих CD38, коннексин 43, Р2Х7 рецепторы, CD157/CD11b/CD18 и C3/C3b в среднем мозге при развитии ротенонового паркинсонизма. 147 3.1.7 Иммуногистоцитохимическая оценка экспрессии «раннего» маркера нейрогенеза Pax6 в среднем мозге в ротеноновой модели хронической нейродегенерации Данные о характере экспрессии транскрипционного фактора Pax6, играющего ключевую роль в нейрогенезе головного мозга и являющегося «ранним» маркером нейрогенеза в среднем мозге при ротеноновой хронической нейродегенерации, представлены в таблице 33. Таблица 33 – Нейрогенез в среднем мозге в модели болезни Паркинсона у взрослых животных Параметры экспрессии количество экспрессирующих Pax6 клеток в % от общего количества клеток плотность интенсивности флуоресценции Pax6 на единицу площади Группы животных К5 (раств-ль), n=5 Э6 (ротенон), n=5 3,3±1,74 16,5±1,32* 9,4±0,74 17,9±2,76* Примечание: * – p при сравнении параметров в группе Э6 с группой К5 При паркинсонизме отмечается значимое однонаправленное увеличение количества Pax6-экспрессирующих клеток среднего мозга (p≤0,05) и плотности интенсивности флуоресценции Pax6 на единицу площади (p≤0,05) по данным флуоресцентной и конфокальной микроскопии в сравнении с контрольной группой, что согласуется с литературными данными об усилении нейрогенеза в среднем мозге при развитии экспериментальной болезни Паркинсона [283]. 148 3.1.8 Иммуногистоцитохимическая оценка экспрессии P-гликопротеина в среднем мозге в ротеноновой модели хронической нейродегенерации Оценка экспрессии белка-транспортера ГЭБ Р-гликопротеина (Pgp) выявила значимое 3-кратное увеличение количества Pgp-позитивных клеток (таблица 34) при экспериментальной болезни Паркинсона в сравнении с группой контроля. Таблица 34 – Экспрессия P-гликопротеина в среднем мозге Параметры экспрессии Группы животных К5 (раств-ль), n=7 Э6 (ротенон), n=11 количество Pgp+ клеток, % 5,4±1,1 16,6±3,4* Примечание: * – p при сравнении параметров в группе Э6 с группой К5 3.1.9 Идентификация апоптоза клеток головного мозга в ротеноновой модели хронической нейродегенерации Детекция разрывов ДНК методом TUNEL в срезах среднего мозга крыс (таблица 35) выявила значимые различия между уровнем TUNEL+ клеток (клеток в позднем апоптозе) в контрольной и экспериментальной группах: при паркинсонизме отмечено значимое 2-кратное возрастание количества апоптотических клеток. Таблица 35 – Выявление апоптоза клеток среднего мозга методом TUNEL в ротеноновой модели хронической нейродегенерации Параметры теста Группы животных К5 (раств-ль), n=14 Э6 (ротенон), n=14 количество TUNEL+ клеток, % 6,9±1,2 15,2±4,5* Примечание: * – p при сравнении параметров в группе Э6 с группой К5 Таким образом, развитие ротенонового паркинсонизма сопровождается апоптотической гибелью клеток среднего мозга. 149 3.1.10 Анализ АДФ-рибозилциклазной активности клеток среднего мозга в ротеноновой модели хронической нейродегенерации Известно, что CD38 – бифункциональный фермент, способный проявлять как минимум 2 функциональные активности – синтез циклической (АДФрибозилциклазная активность) и нециклической (НАД+-гликогидролазная активность) АДФ-рибозы, используя НАД+ в качестве субстрата и лиганда. В ротеноновой модели хронической нейродегенерации выявлено значимое 2кратное усиление АДФ-рибозилциклазной активности (таблица 36). Выявленное усиление активности, однако, чуть менее выражено, чем увеличение количества CD38+-клеток. Очевидно, что, кроме АДФ-рибозилциклазной активности, в патогенезе болезни Паркинсона могут играть роль и другие активности CD38 (например, НАД+-гликогидролазная активность). Таблица 36 – АДФ-рибозилциклазная активность клеток среднего мозга в модели хронической нейродегенерации Параметры теста АДФ-рибозилциклаза (ед/мин/мг белка) Группы животных К5 (раств-ль), n=5 Э6 (ротенон), n=5 0,02±0,007 0,04±0,006** Примечание: * – p при сравнении параметров в группе Э6 с группой К5 Таким образом, при ротеноновом паркинсонизме выявлено значимое увеличение АДФ-рибозилциклазной активности клеток среднего мозга. 3.1.11 Модуляция АДФ-рибозилциклазной активности клеток среднего мозга в ротеноновой модели хронической нейродегенерации Приложение модуляторов нуклеотидных рецепторов и субстрата и лиганда для CD38/CD157, НАД+, выявило значимое усиление активности АДФР-циклазы при приложении АТФ и НАД+ в экспериментальной группе и тенденции к ее усилению при приложении АТФ и оАТФ в контрольной группе (таблица 37). 150 Приложение НАД+ извне в контрольной группе и воздействие блокатора нуклеотидных рецепторов Р2Х7 подтипа оАТФ в экспериментальной группе не выявило каких-либо тенденций изменения АДФР-циклазной активности. Таблица 37 – АДФР-циклазная активность клеток среднего мозга до и после приложении модуляторов нуклеотидных рецепторов (АТФ и оАТФ) и лиганда и субстрата CD38/CD157 (НАД+) Группы животных Исходная После приложения модуляторов АТФ оАТФ НАД+ К5 (растворитель), n=5 0,02±0,007 0,05±0,007 0,04±0,007 0,01±0,001 Э6 (ротенон, БП), n=5 0,04±0,006 0,17±0,1* 0,05±0,001 0,08±0,003** Исходная активность: рК5-Э6≤0,01 После приложения АТФ: рК5-Э6≤0,05 Примечания: * - уровень значимости при сравнении эффекта после воздействия модулятора с исходным значением в этой же группе Таким образом, в модуляции АДФР-циклазной активности клеток среднего мозга при паркинсонизме значимый эффект оказали приложение активатора нуклеотидных рецепторов аденозинтрифосфата (АТФ) и субстрата/лиганда для CD38/CD157 – никотинамиддинуклеотида (НАД+). 3.1.12 Оценка функциональной активности клеток среднего мозга в ротеноновой модели хронической нейродегенерации Кроме АДФ-рибозилциклазной активности, в экспериментальной группе Э6 отмечается также значимое 2-кратное усиление и функциональной активности клеток среднего мозга (как в отношении собственно функциональной активности клеток среднего мозга в относительных единицах, так и времени достижения полувысоты этой функциональной представлены в таблице 38. активности), полученные результаты 151 Таблица 38 – Функциональная активность клеток среднего мозга в ротеноновой модели хронической нейродегенерации Группы животных Параметры теста К5 (раств-ль), n=5 Э6 (ротенон), n=5 Функциональная активность клеток (отн.ед.) Время достижения полувысоты интегральной кривой (с) 0,09±0,02 0,20±0,04* 207,6±57,3 432,1±99,2* Примечание: * – p при сравнении параметров в группе Э6 с группой К5 Таким образом, при паркинсонизме выявлено значимое увеличение функциональной активности клеток головного мозга при увеличении времени достижения полувысоты этой активности. 3.1.13 Модуляция функциональной активности клеток среднего мозга в ротеноновой модели хронической нейродегенерации В функциональной активности клеток среднего мозга тестировалось приложение модуляторов нуклеотидных рецепторов (АТФ и оАТФ), и субстрата и лиганда для АДФР-циклаз (НАД+) и ингибитора клеточных флавопротеидов (главным образом НАД(Ф)Н-оксидазы) дифениленйодониума (DPI). В контрольной группе выявлено значимое усиление функциональной активности клеток среднего мозга под действием оАТФ и значимое снижение этой активности под действием DPI, при паркинсонизме выявлен эффект значимого снижения функциональной активности клеток под действием дифениленйодониума и ее значимого повышения при воздействии АТФ (таблица 39) Таким образом, в модуляции функциональной активности клеток среднего мозга при паркинсонизме значимый эффект оказало приложение ингибитора флавопротеидов DPI и модулятора нуклеотидных Р2Х7 рецепторов АТФ, в нормальных условиях значимый эффект выявлен под действием блокатора 152 нуклеотидных рецепторов Р2Х7 подтипа оАТФ и ингибитора клеточных флавопротеидов DPI. Таблица 39 – Функциональная активность клеток среднего мозга до и после приложения модуляторов нуклеотидных рецепторов (АТФ и оАТФ), лиганда и субстрата CD38 (НАД+) и ингибитора клеточных флавопротеидов (DPI) Группы животных После приложения модуляторов Исходная АТФ оАТФ НАД+ DPI К5 (растворитель), n=5 0,09±0,02 0,14±0,03 0,55±0,3* 0,18±0,04 0,03±0,01* Э6 (ротенон), n=5 0,32±0,1* 0,25±0,12 0,17±0,03 0,10±0,07* 0,20±0,04 Исходная активность: рК5-Э6≤0,05 Примечания: * - уровень значимости при сравнении эффекта после воздействия модулятора с исходным значением в этой же группе 3.1.14 Определение концентрации НАД+ в модели хронической нейродегенерации Анализ содержания уровня НАД+ спектрофотометрическим ультрамикрометодом выявил снижение содержания субстрата и лиганда для фермента АДФР-циклазы - НАД+ при ротеноновом паркинсонизме (таблица 40), что может быть связано с усиленной активностью CD38 и других ферментов, участвующих в утилизации НАД+ и снижает его дальнейшую биодоступность для нормального функционирования фермента при хронической нейродегенерации. Таблица 40 – Содержание НАД+ в гомогенате ткани среднего мозга при хронической нейродегенерации Группы животных НАД+ (ммоль/мг ткани) К5 (растворитель), n=10 3400,0±862,6 Э6 (ротенон), n=10 1040,0±529,7* Примечание: * – p при сравнении параметров в группе Э6 с группой К5 153 Таким образом, при ротеноновом паркинсонизме выявлено значимое снижение внутриклеточного уровня субстрата/лиганда для АДФР-циклаз НАД+. 3.1.15 Определение концентрации лактата в модели хронической нейродегенерации Анализ содержания лактата спектрофотометрическим методом выявил значимое увеличение лактата, играющего роль в нейрометаболической связи между астроцитами и нейронами [72], в экспериментальной модели болезни Паркинсона (таблица 41). Таблица 41 – Содержание лактата в гомогенате ткани среднего мозга в ротеноновой модели хронической нейродегенерации Группы животных Лактат (мкг/мл) К5 (растворитель), n=10 34,4±3,1 Э6 (ротенон), n=10 60,6±9,7** Примечание: * – p при сравнении параметров в группе Э6 с группой К5 3.1.16 Корреляционный анализ в модели хронической нейродегенерации Корреляционный анализ для выявления взаимосвязи между основными параметрами, выявленными в экспериментальной и контрольной группах животных с ротеновой моделью хронической нейродегенерации представлен в приложении Х (в приложении представлены сильные корреляции, корреляции умеренной силы и слабые не представлены). При проведении корреляционного анализа были выявлены множественные корреляции. Значимыми были корреляции между симптомами паркинсонизма и уровнем экспрессии CD38 на астроцитах, между уровнем коэкспрессии CD157/CD11b/CD18 и активностью АДФР-циклазы, между уровнем экспрессии 154 CD38 на нейронах и коэкспрессией CD157/CD11b/CD18, между уровнем экспрессии CD38 на активированной микроглии и количеством апоптотических клеток, между функциональной активностью клеток среднего мозга и уровнем НАД+ (контрольная группа); между симптомами паркинсонизма и уровнем экспрессии CD38, между концентрацией лактата и активностью АДФР-циклазы, между уровнем экспрессии CD38 на астроцитах и коэкспрессии CD157/CD11b/CD18 на микроглии, между функциональной активностью клеток среднего мозга и количеством CD38-экспрессирующих клеток (экспериментальная группа). 3.2 Острая нейродегенерация Для подтверждения развития моделей острой нейродегенерации проводился осмотр экспериментальных животных для выявления характерных симптомов неврологического дефицита и наличия смертности крыс. 3.2.1 Результаты осмотра животных на наличие признаков острой нейродегенерации с помощью неврологической шкалы NSS (Neurological Score System) Анализ неврологического статуса экспериментальных животных по стандартной (в баллах) и модифицированной (в % животных в зависимости от степени выраженности неврологического дефицита, выражаемых в уровнях 0-5) шкале NSS и анализу смертности крыс (таблица 42) подтвердили эффективность используемых моделей для достижения эффекта острой глобальной ишемии головного мозга и последующего развития мотосенсорной дисфункции у животных в связи со статистически значимым нарастанием неврологического дефицита по шкале NSS в группах Э1-Э5 в сравнении с исходными значениями неврологического статуса этих же групп до проведения оперативных вмешательств и в сравнении с группой интактных животных К1 (для модели ишемии головного мозга у взрослых крыс) и в сравнении с соответствующими группами позитивного контроля (К2, К3 для ишемии головного мозга взрослых 155 животных, группа К4 для модели перинатальной гипоксии-ишемии) в определенные временные сроки с момента проведения операций. Таблица 42 – Результаты оценки неврологического статуса крыс по шкале NSS и смертности крыс в модели ишемии головного мозга Уровни шкалы NSS Смертность (в % частот) животных после после до после моделирован создания модели ия, % Шкала NSS, баллы Группы животных К1 (интактные, n=10) до 1,2±0,51 К2 («ложная операция», 24 ч, n=10) 1,9± 0,74 К3 («ложная операция», 48 ч, n=10) 1,1±0,63 К4 (контроль, 72 ч, =5) Э1 (2-стор. ОСА, 24 ч, n=10) Э2 (2-стор. ОСА, 48 ч, n=10) 1,6± 0,52 1 – 30%, 0 – 70% - 1 – 40%, 0 – 60% 1 – 50%, 0 – 50% 0% 1,9±0,13* 1 – 20%, *** 0 – 80% 1 – 70%, 0 – 30% 0% - - 5,0±0,55 - 5 – 50%, 4 – 10%, 10,0±3,5 0,18±0,12 0 – 100% 3 – 10%, **** 2 – 10%, 1 – 20% 50% 5 – 50%, 3 – 10%, 2 – 40% 50% 13,3±0,6 1,0±0,55 **** 1 – 20%, 0 – 80% Э3 (1-стор. ОСА, 24 ч, n=10) 0,4±0,22 3,1±0,67* 1 – 40%, 2 – 10%, 0 – 60% 1– 90% 0% Э4 (1-стор. ОСА, 48 ч, n=10) 0,4±0,16 2,2±0,43* 1 – 40%, 1 – 100% 0 – 60% 0% Э5 (ПГИ, 72 ч, n=10) 7,4±0,7 - - - Шкала NSS: pК1-К2>0,05 рК1-К3>0,05 рК1-Э1≤0,05 рК1-Э2>0,05 рК1-Э3>0,05 рК1-Э4>0,05 рК2-Э1≤0,001 рК2-Э3≤0,001 рК3-Э2≤0,001 рК3-Э4>0,05 рК4-Э5≤0,05 Примечание: * - уровень значимости при сравнении параметров до и после создания модели 156 В контрольных группах животных либо совсем не было выявлено значимого появления неврологической дисфункции, либо оно было слабовыраженным и связанным в основном с нарушением равновесия у животных, а не с признаками мотосенсорного дефицита, более характерными для развития ишемии головного мозга. Более тяжелое поражение (50%-я смертность и тяжелое/средней тяжести состояние) наблюдалось в группах Э1-Э2 с билатеральной окклюзией ОСА, умеренное повреждение и повреждение средней степени тяжести при 100% выживаемости крыс в тестируемые сроки наблюдалось в группах Э3-Э4 с моделью ишемии головного мозга путем унилатеральной окклюзии ОСА и в группе Э5 с моделью перинатальной гипоксии-ишемии. Таким образом, анализ выраженности неврологической дисфункции у экспериментальных животных подтверждает эффективность примененных методик моделирования ишемии головного мозга у взрослых животных и перинатального гипоксически-ишемического поражения головного мозга у крысят. Выраженность неврологического дефицита у наблюдаемых животных сопровождается, прежде всего, нарушением сенсорной, моторной и рефлекторной сфер. 3.2.2 Тесты для оценки моторной дисфункции передних и задних конечностей в модели острой нейродегенерации Результаты осмотра животных на наличие признаков моторной дисфункции конечностей в группах К1-К3 и Э1-Э4 представлены в таблицах 43-46 и на рисунках 2-4. В тесте «Сужающаяся дорожка» у крыс с острой ишемией головного мозга отмечено значимое появление моторной дисфункции задних лап в группах Э3-Э4 через 24 и 48 часов с момента ее моделирования, в сравнении с исходным значением до моделирования и группами контроля, что выразилось в значимом увеличении общего числа соскальзываний задними лапами крысы справа и слева. В группах Э1 и Э2 тест невозможно было осуществить вследствие очень тяжелого состояния животных и их падения с теста. У контрольных 157 животных в группах К1-К3 не выявлено значимых различий. Таблица 43 – Осмотр животных на наличие моторной дисфункции задних конечностей в тесте «Сужающаяся дорожка» в модели ишемии головного мозга при острой нейродегенерации Группы животных Кол-во соскальзыв. задних лап до после создания модели К1 (интактные, n=10) Пройденный путь, % до после создания модели 0,4±0,31 К2 («ложная операция», 24 ч, n=10) 0,6±0,34 0,7±0,21 К3 («ложная операция», 48 ч, n=10) 0,7±0,34 0,7±0,26 Э1 (2-стор. ОСА, 24 ч, n=10) Э2 (2-стор. ОСА, 48 ч, n=10) Э3 (1-стор. ОСА, 24 ч, n=10) Э4 (1-стор. ОСА, 48 ч, n=10) - 2,6±0,78 - 1,4±0,56 9,9±2,34 100±0 94,4±5,56 7,1±1,27* 88,9±7,35 100±0 pК1-К2>0,05 рК1-К3>0,05 рК1-Э1≤0,01 рК1-Э2≤0,05 рК1-Э3>0,05 рК1-Э4>0,05 рК2-Э1≤0,05 рК2-Э3≤0,005 рК3-Э2>0,05 рК3-Э4≤0,001 В тестах для оценки «грубой» (адгезивный и вибриссовый тесты) и «мелкой» дисфункции передних лап (вермишелевый тест, рисунки 2-4) отмечено появление у крыс моторной дисфункции передних лап в экспериментальных группах Э1-Э4 в сравнении с группой К1 через 24 и 48 часов с момента моделирования ишемии головного мозга, что выразилось в значимом увеличении времени снятия скотча с обеих лап (справа и слева), в тенденции к уменьшению числа правильно выполненных попыток из 5 в группах Э3-Э4 в вибриссовом тесте в сравнении с числом попыток при выполнении теста в этих же группах до моделирования ишемии и в увеличении процента неправильного выполнения теста или отказа от него в группах Э1-Э2 в сравнении с группой К1. Как и в 158 случае моторной дисфункции задних лап, у контрольных животных в отношении дисфункции передних лап не выявлено значимых различий. Таблица 44 – Осмотр животных на наличие моторной дисфункции передних конечностей в тесте «адгезивный» в модели ишемии головного мозга при острой нейродегенерации Группы животных Общее время снятия скотча с лап (с) К1 (интактные, n=10) 8,3±0,95 К2 («ложная операция», 24 ч, n=10) - К3 («ложная операция», 48 ч, n=10) Э1 (2-стор. ОСА, 24 ч, n=10) 39,5±17,67 Э2 (2-стор. ОСА, 48 ч, n=10) 28,4±7,3 Э3 (1-стор. ОСА, 24 ч, n=10) 35,9±11,51 Э4 (1-стор. ОСА, 48 ч, n=10) 26,4±6,13 рК1-Э1≤0,001 рК1-Э2≤0,01 рК1-Э3≤0,005 рК1-Э4≤0,05 Примечание: n=10 во всех исследуемых группах животных Таблица 45 – Осмотр животных на наличие моторной дисфункции передних конечностей в прямом варианте «вибриссового» теста в модели ишемии головного мозга при острой нейродегенерации Правильно выполненные попытки в % Группы животных Э3 до операции (1-стор. ОСА, 24 ч) Э3 после операции (1-стор. ОСА, 24 ч) Э4 до операции (1-стор. ОСА, 48 ч) Э4 после операции (1-стор. ОСА, 48 ч) Слева Справа («пораженная» (контрлатеральная сторона тела) сторона тела) 5±0 4,9±0,1 4,5±0,31 4,2±0,55 5±0 5±0 4,3±0,55 4,3±0,44 159 Рисунок 2 – Осмотр животных в группе К1 на наличие дисфункции «мелкой моторики» передних конечностей в «вермишелевом» тесте в модели ишемии головного мозга при острой нейродегенерации. Рисунок 3 – Осмотр животных в группе Э1 на наличие дисфункции «мелкой моторики» передних конечностей в «вермишелевом» тесте в модели ишемии 160 головного мозга при острой нейродегенерации. Рисунок 4 – Осмотр животных в группе Э1 на наличие дисфункции «мелкой моторики» передних конечностей в «вермишелевом» тесте в модели ишемии головного мозга при острой нейродегенерации. Таким образом, в модели острой нейродегенерации (ишемия головного мозга взрослых крыс) отмечено появление моторной дисфункции передних и задних конечностей. 3.2.3 Изменение интегративных функций мозга (когнитивной функции крыс) в патогенезе острой нейродегенерации Оценка кратковременной памяти животных в тесте «водный лабиринт Морриса» (таблица 46) выявила сходные изменения: в экспериментальных и контрольных группах крыс до создания моделей ишемии головного мозга: отмечалось постепенное снижение времени выполнения тестов от 1-й попытки к 4-й в первый день тренировки, как и в случае интактных животных до создания модели хронической нейродегенерации. 161 Таблица 46 – Динамика изменения кратковременной памяти у исследуемых крыс до создания моделей острой нейродегенерации в тесте «водный лабиринт Морриса» Время достижения платформы в 1-й день тестирования, секунды Группы животных К1 (интактные, n=10) К2 («ложная операция», 24 ч, n=10) К3 («ложная операция», 48 ч, n=10) Э1 (2-стор. ОСА, 24 ч, n=10) Э2 (2-стор. ОСА, 48 ч, n=10) Э3 (1-стор. ОСА, 24 ч, n=9) Э4 (1-стор. ОСА, 48 ч, n=10) Среднее значение по всем группам (n=69) 1 попытка 2 попытка 3 попытка 4 попытка 58,0±2,0 48,4±4,9 31,7±6,9* 13,2±5,3** 53,8±5,4 35,0±6,4* 27,3±7,0 17,8±5,4** 60,0±0,0 43,3±6,3* 43,6±5,9* 44,0±6,2* 57,0±3,0 42,6±7,9 31,1±7,5* 36,6±7,4** 56,0±2,8 36,5±6,1* 24,5±6,9** 18,4±5,1** 58,3±1,7 40,8±7,2* 27,6±6,8* 31,1±6,4** 51,7±4,7 51,5±4,9 43,5±5,8 28,9±7,6* 56,4±1,2 42,6±2,4**** 32,8±2,6**** 27,1±2,6**** Примечание: * - уровни значимости при сравнении 2, 3 и 4 попытки с 1 попыткой тренировки Долговременная память крыс также показала постепенное уменьшение времени поиска крысой платформы в тесте «водный лабиринт Морриса» (таблица 47) практически во всех группах животных и в среднем по группам, наиболее значимое на 3 и 4-е сутки тренировки крыс, до достижения ими в большинстве случаев нормального времени поиска платформы (менее 15 секунд), т. е. у 162 большинства крыс до создания моделей ишемии головного мозга наблюдалась нормальная когнитивная функция крыс, лишь у некоторых крыс исходно отмечалась небольшое нарушение долговременной памяти. Таблица 47 – Динамика изменения долговременной памяти у исследуемых крыс до создания моделей острой нейродегенерации в тесте «водный лабиринт Морриса» Время достижения платформы в 1-4-й дни Группы животных К1 (интактные, n=10) К2 («ложная операция», 24 ч, n=10) К3 («ложная операция», 48 ч, n=10) Э1 (2-стор. ОСА, 24 ч, n=10) Э2 (2-стор. ОСА, 48 ч, n=10) Э3 (1-стор. ОСА, 24 ч, n=9) Э4 (1-стор. ОСА, 48 ч, n=10) Среднее значение по всем группам (n=69) тестирования (4-е попытки), секунды 1 день 2 день 3 день 4 день 13,2±5,3 25,0±5,9** 23,2±6,9 13,4±3,8 17,8±5,4 34,8±7,0 7,1±2,0 12,0±1,9 44,0±6,2 35,2±7,6 16,7±5,3* 16,0±5,5** 36,6±7,4 18,1±4,1 19,6±5,3 12,1±2,4** 18,4±5,1 11,4±1,9 11,5±3,3 11,2±2,8 31,1±6,4 53,1±5,9* 17,0±5,9* 12,9±2,7* 28,9±7,6 34,8±7,3 17,9±6,2 10,7±2,9* 27,1±2,6 30,0±2,6 16,1±2,0**** 12,6±1,2**** Примечание: * - уровни значимости при сравнении 2, 3 и 4 дня тренировки с 1 днем (каждый день оценивалась 4-я попытка тренировки) Обнаружено, что при ишемии головного мозга путем 2-сторонней перевязки 163 ОСА появляется когнитивная дисфункция через 24 и 48 часов с момента ее моделирования с тенденцией к постепенному нарастанию дисфункции (таблица 48). В отношении когнитивной дисфункции при 1-сторонней перевязке ОСА статистически значимые изменения наблюдались только через 48 часов с момента ее моделирования, что, вероятнее всего, связано с легкой степенью повреждений головного мозга в данной модели, что подтверждается и отсутствием смертности у животных после 1-стороннего моделирования ишемии, в сравнении с более тяжелыми повреждениями при ишемии головного мозга путем 2-сторонней перевязки ОСА. Таблица 48 – Появление когнитивной дисфункции крыс в моделях острой нейродегенерации в тесте «водный лабиринт Морриса» Водный лабиринт Морриса, сек Группы животных до ишемии К1 (интактные, n=10) после ишемии 13,4±3,8 К2 («ложная операция», 24 ч, n=10) 12,0±1,9 6,1±1,4* К3 («ложная операция», 48 ч, n=10) 16,0±5,5** 14,8±5,4 Э1 (2-стор. ОСА, 24 ч, n=10) 12,1±2,4** 39,0±11,4 Э2 (2-стор. ОСА, 48 ч, n=10) 11,2±2,8 41,3±10,4** Э3 (1-стор. ОСА, 24 ч, n=9) 12,9±2,7* 15,2±2,1 Э4 (1-стор. ОСА, 48 ч, n=10) 10,7±2,9* 22,3±3,2** pК1-К2>0,05 рК1-К3>0,05 рК1-Э1≤0,05 рК1-Э2≤0,05 рК1-Э3>0,05 рК1-Э4≤0,01 рК2-Э1≤0,01 рК2-Э3>0,05 рК3-Э2≤0,005 рК3-Э4>0,05 Примечание: * - уровни значимости при сравнении последующих попыток тестирования с предыдущими Таким образом, у крыс до создания моделей острой нейродегенерации отмечалась нормальная когнитивная функция (исходно нормальная пространственная кратковременная и долговременная память), связанная с пластичностью обучения. При острой нейродегенерации наблюдалось появление 164 когнитивной дисфункции. 3.2.4 Иммуногистоцитохимическая оценка экспрессии НАД+-зависимых механизмов реализации нейрон-глиальных взаимодействий в моделях острой нейродегенерации Анализ относительного количества (в %) и относительной площади CD38позитивных клеток срезов лобных областей больших полушарий головного мозга в процентах от общей площади нейроглиальных клеток (таблица 49) выявил статистически значимое усиление экспрессии CD38 в клетках головного мозга при глобальной неполной ишемии головного мозга путем 1- и 2-сторонней перевязки ОСА через 24 и 48 часов с момента развития ишемии (Э1-Э4) и тенденцию к усилению количества CD38-экспрессирующих клеток в группе перинатальной гипоксии-ишемии в группе Э5 в сравнении с соответствующими группами контроля (К1, К2 и К3 для ишемии взрослых, К4 для перинатальной гипоксии-ишемии). При оценке экспрессии CD38 иммунопозитивный материал располагался преимущественно диффузно в цитоплазме клеток, регистрировался в перикариальной области, а также по ходу отростков нервных клеток, что соответствует литературным данным об особенностях экспрессии CD38 в клетках головного мозга [388, 403]. К 48 часу развития ишемии головного мозга и 72 часу перинатальной гипоксии-ишемии было обнаружено нарастание количества клеток, экспрессирующих CD38 диффузно в цитоплазме и перинуклеарно, а также по ходу отростков. Для фенотипирования CD38-позитивных клеток (нейронов, глиального окружения) на клетках ЦНС в модели острой нейродегенерации была проведена оценка коэкспрессии CD38 и маркеров вида клеток (нейронов, астроцитов и активированной микроглии), данные представлены в таблице 50. 165 Таблица 49 – Экспрессия CD38 в клетках головного мозга крыс в моделях острой нейродегенерации Параметры теста Группы животных Количество CD38экспрессирующих клеток, % К1 (интактные крысы, n=10) Относительная площадь экспрессии, % - 16,0±1,8 К2 (контроль, 24 ч, n=10) 10,4±1,5 24,0±3,9 К3 (контроль, 48 ч, n=10) 12,3±1,2 12,6±2,9 К4 контроль для ПГИ, 72 ч, n=10) 4,1±0,7 - Э1 (2-стор. ОСА, 24 ч, n=10) 16,5±2,1 25,6±4,2 Э2 (2-стор. ОСА, 48 ч, n=10) 37,1±2,2 26,0±4,05 Э3 (1-стор. ОСА, 24 ч, n=10) 31,0±2,3 - Э4 (1-стор. ОСА, 48 ч, n=10) 30,0±2,2 - Э5 (ПГИ, 72 ч, n=10) 7,1±1,1 - Количество CD38-экспрессирующих клеток: рК2-Э1≤0,05 рК2-Э3≤0,001 рК3-Э2≤0,01 Относительная площадь экспрессии: рК1-Э1≤0,05 рК3-Э2≤0,05 Фенотипирование CD38-позитивных клеток в модели ишемии головного мозга выявило значимое увеличение количества астроцитов (p≤0,01 через 24 и 48 часов), экспрессирующих CD38, в сравнении с контрольными группами, тенденцию к увеличению числа клеток активированной микроглии через 24 и 48 часов и количества нейронов, экспрессирующих CD38, через 48 часов с момента развития ишемии. Полученные результаты согласуются с литературными данными о развитии реактивного астроглиоза и активации микроглии при острой нейродегенерации [97, 252]. 166 Таблица 50 – Фенотипирование CD38-позитивных клеток (в % от общего количества клеток) в модели ишемии головного мозга путем 2-сторонней перевязки ОСА у взрослых животных К1 (интактные крысы), n=5 К2 (контроль, 24 ч), n=5 К3 (контроль, 48 ч), n=5 Нейроны (NSE+) 3,2±1,06 2,7±0,51 3,3±0,58 Астроциты (GFAP+) 2,4±0,40 4,7±1,32 5,6±0,78 Активир. микроглия (MAP2+) 5,5±1,41 4,2±0,43 3,2±0,57 Э1 (2-стор. ОСА, 24 ч), n=5 2,6±0,15 9,9±4,35 9,8±2,22 Группы животных Э2 (2-стор. ОСА, 48 ч) , n=5 4,6±1,12 10,4±0,92 11,6±2,49 GFAP+: рК1-Э1≤0,01 рК1-Э2≤0,01 рК2-Э1≤0,01 рК3-Э2≤0,01 Иммуногистоцитохимическая оценка коэкспрессии антигена CD38 и белка щелевых контактов коннексина 43, маркера нейрон-глиальных взаимодействий [408], представлена в таблицах 51-52. Оценка коэкспрессии CD38 с коннексином 43 выявила значимые различия в отношении количества CD38-экспрессирующих клеток в контралатеральном полушарии при ишемии через 24 часа с момента ее развития. В отношении количества клеток, коэкспрессирующих Cx43/CD38 в % от всех Cx43+ клеток и в % от всех CD38+ клеток, не было выявлено значимых различий в обоих случаях. В модели ПГИ было обнаружно значимое увеличение количества Cx43+клеток и количества клеток, коэкспрессирующих CD38 и Cx43 в ткани головного мозга в сравнении с контрольной группой (таблица 52), причем большая часть (>75%) Cx43+-клеток является CD38+ в физиологических условиях и при развитии перинатальной гипоксии-ишемии. 167 Таблица 51 – Коэкспрессия Cx43/CD38 в ишемизированной ткани головного мозга в модели острой нейродегенерации Группы животных Клеточные субпопуляции Э3 – ишемизи- Э3 – контр- Э4 – ишемизи- Э4 – контр- рованное латеральное рованное латеральное полушарие полушарие полушарие полушарие (ишемия, 24 ч) (ишемия, 24 ч) (ишемия, 48 ч) (ишемия, 48 ч) Кол-во Cx43+ клеток 17,8±0,8 16,5±2,4 21,5±0,8 21,1±2,0 Кол-во CD38+ клеток 15,5±2,7 4,1±2,3* 11,5±0,3 8,7±1,4 22,9±2,4 25,0±6,2 26,2±2,9 24,2±2,8 56,0±2,2 58,9±5,0 54,7±2,3 53,4±0,8 60,1±2,6 83,2±10,3 69,0±2,8 73,1±5,4 40,8±2,9 41,5±7,6 47,7±3,5 45,3±4,7 Кол-во коэкспрессирующих CD38/Cx43+ клеток Кол-во коэкспрессирующих Cx43/CD38 клеток в % от всех Cx43+ клеток Кол-во коэкспрессирующих Cx43/CD38 клеток в % от всех CD38+ клеток Суммарное кол-во Cx43+ клеток Примечания: * - уровень значимости при сравнении ишемизированного и контралатерального полушарий; n=5 во всех исследуемых группах животных 168 Таблица 52 – Коэкспрессия Cx43/CD38 при перинатальной гипоксииишемии Группы животных Клеточные субпопуляции К4 («ложная операция» Э5 (ПГИ, для ПГИ, 72 ч), n=5 72 ч), n=5 7,7±1,8 13,1±1,0* 6,2±1,9 10,1±1,3* 75,9±9,0 76,0±6,9 Кол-во Cx43+ клеток Кол-во коэкспрессирующих CD38/Cx43 клеток Кол-во коэкспрессирующих Cx43/CD38 клеток в % от всех Cx43+ клеток Примечание: * - уровень значимости при сравнении групп Э5 с К4 Иммуногистоцитохимическая оценка экспрессии антигенов, которые могут играть роль в реализации взаимодействий микроглии с другими клетками ЦНС (Р2Х7 рецепторы; CD157; Mac-1 (CD11b/CD18); C3/C3b компонент комплемента) при ишемии головного мозга, представлена в таблицах 53-55. Таблица 53 – Экспрессия Р2Х7 рецепторов в клетках головного мозга при острой нейродегенерации Группы животных Р2Х7+, % К1 (интактные крысы, n=10) 10,1±2,4 К2 (контроль, 24 ч, n=10) 13,5±4,0 К3 (контроль, 48 ч, n=10) 15,9±1,8 Э1 (2-стор. ОСА, 24 ч, n=10) 36,5±10,0 Э2 (2-стор. ОСА, 48 ч, n=10) 53,1±10,1 рК1-Э1≤0,01 рК3-Э2≤0,001 169 Таблица 54 – Коэкспрессия трех маркеров CD157/CD11b/CD18 в модели ишемии головного мозга у взрослых животных коэффициент количество коэкспрессирующих Группы животных клеток в % от общего колокализации антигенов в клетках по данным количества клеток К1 (интактные крысы), n=5 К2 («ложная операция», 24 ч), n=5 К3 («ложная операция», 48 ч), n=5 Э1 (ишемия, 2-стор. ОСА, 24 ч), n=5 Э2 (ишемия, 2-стор. ОСА, 48 ч) , n=5 конфокальной микроскопии 7,4±1,86 0,72±0,03 4,3±0,83 0,64±0,08 3,1±0,39 0,73±0,02 18,5±0,84 0,79±0,03 25,4±1,17 0,73±0,05 Количество коэкспрессирующих клеток: рК1-К3≤0,05 рК1-Э1≤0,05 рК1-Э2≤0,01 рК2-Э1≤0,01 рК3-Э2≤0,01 Коэффициент колокализации: рК2-Э1≤0,05 При ишемии головного мозга через 24 и 48 часов с момента ее развития отмечается значимое (p≤0,01 и p≤0,005) увеличение количества P2X7- экспрессирующих клеток в сравнении с контрольными группами К1-К3. Аналогичная ситуация наблюдается и в отношении других молекул, экспрессируемых на клетках моноцитарно-макрофагального ряда (коэкспрессия CD157/CD11b/CD18 и экспрессия C3/C3b): обнаружено однонаправленное значимое (p≤0,01 и p≤0,005) увеличение как количества CD157/CD11b/CD18коэкспрессирующих и C3/C3b-экспрессирующих клеток коры головного мозга уже через 24 часа с момента развития ишемии головного мозга, сохраняющееся и 170 через 48 часов, так и значимое увеличение коэффициента колокализации CD157/CD11b/CD18 (через 24 часа развития ишемии) и плотности интенсивности флуоресценции C3/C3b на единицу площади (через 24 и 48 часов развития ишемии). Таблица 55 – Экспрессия C3/C3b в коре головного мозга в модели церебральной ишемии у взрослых животных Группы животных К1 (интактные крысы), n=5 К2 («ложная операция», 24 ч), n=5 К3 («ложная операция», 48 ч), n=5 Э1 (ишемия, 2-сторонняя ОСА, 24 ч), n=5 Э2 (ишемия, 1-сторонняя ОСА, 48 ч) , n=5 количество плотность экспрессирующих C3/C3b интенсивности клеток в % от общего флуоресценции C3/C3b количества клеток на единицу площади 5,8±4,36 9,5±1,10 3,6±1,44 10,3±2,22 5,3±0,73 11,6±0,70 16,1±1,59 15,9±0,62 26,3±2,52 16,0±1,30 Количество экспрессирующих клеток: pК1-К2≤0,05 рК1-Э2≤0,05 рК2-Э1≤0,005 рК3-Э2≤0,01 Плотность интенсивности флуоресценции: pК1-Э1≤0,005 рК1-Э2≤0,01 рК2-Э1≤0,05 рК3-Э2≤0,01 Таким образом, фенотипирование CD38-позитивных клеток при развитии острой нейродегенерации путем моделирования ишемии головного мозга у взрослых животных и перинатальной гипоксии-ишемии у крысят выявило важную роль астроцитов через 48 часов с момента развития ишемии головного 171 мозга, а также экспрессируемых на нейронах и глии молекул (CD38, коннексина 43, Р2Х7 рецепторов, CD157/CD11b/CD18 и C3/C3b) в коре головного мозга при острой нейродегенерации. 3.2.5 Иммуногистоцитохимическая оценка экспрессии «раннего» маркера нейрогенеза Pax6 в коре и гиппокампе головного мозга при ишемии Данные о характере экспрессии транскрипционного фактора Pax6, играющего ключевую роль в нейрогенезе головного мозга и являющегося «ранним» маркером нейрогенеза головного мозга, представлены в таблицах 56-57. Таблица 56 – Нейрогенез в коре передних полушарий головного мозга в модели церебральной ишемии у взрослых животных Группы животных количество плотность экспрессирующих Pax6 интенсивности клеток в % от общего флуоресценции Pax6 количества клеток на единицу площади К1 (интактные крысы), n=5 4,5±1,23 9,9±1,39 К2 («ложная операция», 24 ч), n=5 10,0±5,33 12,6±1,26 К3 («ложная операция», 48 ч), n=5 4,9±0,78 13,0±1,32 Э1 (ишемия, 2-стор. ОСА, 24 ч), n=5 17,9±3,27** 16,6±3,00* Э2 (ишемия, 2-стор. ОСА, 48 ч) , n=5 17,2±4,16* 16,5±1,49* Примечание: * - уровень значимости при сравнении групп Э1 и Э2 с К1 При ишемии головного мозга через 24 часа отмечается значимое однонаправленное увеличение количества Pax6-экспрессирующих клеток и плотности интенсивности флуоресценции Pax6 на единицу площади в гиппокампе и коре головного мозга, сохраняющееся через 48 часов и продолжающееся, 172 согласно литературным данным, в течение нескольких недель с момента развития ишемии головного мозга [68, 228]. Таблица 57 – Нейрогенез в гиппокампе головного мозга в модели церебральной ишемии у взрослых животных Группы животных К1 (интактные крысы), n=5 К2 («ложная операция», 24 ч), n=5 К3 («ложная операция», 48 ч), n=5 Э1 (ишемия, 2-стор. ОСА, 24 ч), n=5 Э2 (ишемия, 2-стор. ОСА, 48 ч) , n=5 количество плотность экспрессирующих Pax6 интенсивности клеток в % от общего флуоресценции Pax6 на количества клеток единицу площади 8,6±0,20 12,9±2,23 4,3±0,64 10,1±2,03 8,2±4,83 8,4±2,25 19,4±5,31 17,9±0,83 18,1±3,19 20,5±1,90 Количество экспрессирующих клеток и плотность интенсивности флуоресценции: pК1-Э1≤0,05 рК1-Э2≤0,05 рК2-Э1≤0,05 рК3-Э2≤0,05 3.2.6 Иммуногистоцитохимическая оценка экспрессии P-гликопротеина в коре передних полушарий головного мозга в модели острой нейродегенерации Оценка экспрессии трансмембранного насоса, удаляющего токсины в гематоэнцефалическом барьере, Р-гликопротеина (Pgp), не выявила значимых изменений (таблица 58) при ишемии головного мозга путем 1-сторонней перевязки ОСА в контралатеральном полушарии в сравнении с ишемизированным, наблюдались лишь тенденции к увеличению количества Pgp- 173 экспрессирующих клеток в ишемизированном полушарии через 48 часов с момента ее развития. Таблица 58 – Экспрессия P-гликопротеина в коре передних полушарий головного мозга при ишемии головного мозга Группы животных Э3 – ишемизи- Э3 – контр- Э4 – ишемизи- Э4 – контр- рованное латеральное рованное латеральное полушарие полушарие полушарие полушарие (ишемия, 24 ч) (ишемия, 24 ч) (ишемия, 48 ч) (ишемия, 48 ч) Кол-во Pgp+ клеток, % 37,7±9,4 46,8±1,6 44,6±11,1 35,4±3,8 Примечание: n=5 во всех исследуемых группах животных Таким образом, при острой нейродегенерации у взрослых животных в модели ишемии головного мозга выявлены лишь тенденции к увеличению количества Pgp-экспрессирующих клеток в коре ишемизированного полушария через 48 часов с момента моделирования ишемии. 3.2.7 Идентификация апоптоза клеток головного мозга в модели острой нейродегенерации Детекция разрывов ДНК методом TUNEL в срезах мозга крыс (таблица 59) выявила значимые различия между уровнем TUNEL+ клеток (клеток в позднем апоптозе) между соответствующими контрольными и экспериментальными группами: при ишемии головного мозга и при перинатальной гипоксии-ишемиии отмечено значимое повышение интенсивности апоптоза клеток нейрональной и глиальной природы. 174 Таблица 59 – Идентификация апоптоза клеток головного мозга при острой нейродегенерации методом TUNEL Группы животных % клеток в апоптозе К1 (интактные крысы), n=6 7,0±1,7 К2 («ложная операция», 24 ч), n=6 9,6±2,0 К3 («ложная операция», 48 ч), n=6 4,6±1,6 К4 («ложная операция» для ПГИ, 72 ч), n=10 3,6±1,3 Э1 (ишемия, 2-стор. ОСА, 24 ч), n=10 42,9±9,4 Э2 (ишемия, 2-стор. ОСА, 48 ч), n=8 28,7±3,0 Э5 (ПГИ, 72 ч), n=10 5±0,9 pК1-Э1≤0,001 рК1-Э2≤0,005 рК2-Э1≤0,005 рК3-Э2≤0,005 рК4-Э5≤0,05 Таким образом, развитие острой нейродегенерации в моделях ишемии головного мозга взрослых крыс и перинатальной гипоксии-ишемии сопровождается апоптотической гибелью клеток переднего мозга. 3.2.8 Анализ АДФ-рибозилциклазной активности клеток головного мозга в моделях острой нейродегенерации Исследование изменения активности АДФР-циклазы при развитии глобальной неполной ишемии головного мозга крыс и при перинатальной гипоксии-ишемии (таблица 60) выявило сходные тенденции: отмечено статистически значимое снижение активности этого фермента через 48 часов с момента развития ишемии головного мозга в группе Э2 в сравнении с группой «чистого контроля» К1 и в группе Э5 через 72 часа развития ПГИ в сравнении с группой ложно-оперированных животных К4. 175 Таблица 60 – Изменение АДФР-циклазной активности клеток головного мозга при острой нейродегенерации Группы животных АДФР-циклазная активность (ед/мин/мг белка) К1 (интактные крысы), n=5 0,42±0,269 К2 («ложная операция», 24 ч), n=5 0,07±0,06 К3 («ложная операция», 48 ч), n=5 0,02±0,006 К4 («ложная операция» для ПГИ, 72 ч), n=5 0,2±0,07 Э1 (ишемия, 2-стор. ОСА, 24 ч), n=5 0,04±0,015 Э2 (ишемия, 2-стор. ОСА, 48 ч), n=5 0,01±0,002 Э5 (ПГИ, 72 ч), n=5 0,08±0,03 рК1-Э2≤0,05 рК4-Э5≤0,05 Таким образом, при острой нейродегенерации в моделях ишемии головного мозга взрослых крыс и перинатальной гипоксии-ишемии выявлено значимое снижение активности фермента АДФ-рибозилциклазы. 3.2.9 Модуляция АДФ-рибозилциклазной активности клеток головного мозга в модели острой нейродегенерации При приложении модуляторов нуклеотидных рецепторов (АТФ и оАТФ) и лиганда и субстрата АДФР-циклазы (НАД+) к гомогенату ткани контрольных групп К1, К2, К3 и групп с ишемией Э1 и Э2 наблюдались следующие эффекты (таблица 61): статистически значимым было увеличение активности АДФРциклазы только под действием селективного блокатора нуклеотидных рецепторов Р2Х7 подтипа. Остальные модуляторы при их приложении не показали статистически значимых изменений активности АДФР-циклазы, но отмечалась тенденция к снижению исходной активности в контрольных группах К1 и К2 под действием АТФ; разнонаправленные изменения в контрольной и экспериментальных группах под действием оАТФ и НАД+: в контрольных 176 группах К1, К2 и К3 отмечалась тенденция к снижению этой активности под действием обоих модуляторов, в группе Э1 тенденция к ее усилению, в группе Э2 статистически значимое усиление активности АДФР-циклазы под действием оАТФ, отмечалась также тенденция к снижению АДФ-рибозилциклазной активности в группе Э1 и тенденция к ее усилению в группе Э2. Таблица 61 – АДФР-циклазная активность клеток головного мозга в модели острой нейродегенерации до и после приложении модуляторов нуклеотидных рецепторов (АТФ и оАТФ), лиганда и субстрата АДФР-циклазы (НАД+) Исходная Группы животных активность К1 (интактные крысы), n=5 приложения модуляторов АТФ оАТФ НАД+ 0,42±0,269 0,08±0,057 0,05±0,018 0,23±0,176 К2 («ложная операция», 24 ч), n=5 К3 («ложная операция», 48 ч), n=5 Э1 (ишемия, 2-стор. ОСА, 24 ч), n=5 Э2 (ишемия, 2-стор. ОСА, 48 ч), n=5 АДФР-циклазная активность после 0,07±0,055 0,03±0,007 0,03±0,006 0,06±0,043 0,02±0,006 0,05±0,026 0,01±0,005 0,16±0,121 0,04±0,015 0,03±0,015 0,04±0,023 0,02±0,014 0,01±0,002 0,01±0,007 0,03±0,003* 0,02±0,005 Исходная активность: рК1-Э2≤0,05 Примечания: * - уровень значимости при сравнении эффекта после воздействия модулятора с исходным значением в этой же группе Таким образом, в модуляции АДФР-циклазной активности клеток головного мозга при ишемии значимый эффект оказало приложение селективного блокатора нуклеотидных рецепторов Р2Х7 подтипа – окисленной формы АТФ (оАТФ). 177 3.2.10 Оценка функциональной активности клеток головного мозга в моделях острой нейродегенерации Исследование изменения функциональной активности клеток головного мозга при развитии глобальной неполной ишемии (таблица 62) выявило следующие закономерности, сходные с активностью АДФР-циклазы клеток нейроглии: наблюдалось статистически значимое снижение максимальной амплитуды интегральной кривой кинетики флуоресценции через 24 и 48 часов с момента развития ишемии головного мозга, что свидетельствует о снижении функциональной активности при развитии этого вида острой нейродегенерации. Таблица 62 – Параметры изменения функциональной активности (максимальная амплитуда интегральной кривой кинетики флуоресценции и время достижения полувысоты этой интегральной кривой - τ/2) клеток при ишемии головного мозга Максимальная амплитуда Группы животных интегральной кривой кинетики τ/2 (с) флуоресценции (отн. ед.) К1 (интактные крысы), n=5 0,29±0,182 2076±414,22 К2 («ложная операция», 24 ч), n=5 0,14±0,078 1740±146,97 К3 («ложная операция», 48 ч), n=5 0,20±0,079 1345,7±133,43 Э1 (ишемия, 2-стор. ОСА, 24 ч), n=5 0,07±0,016 1848±215,83 Э2 (ишемия, 2-стор. ОСА, 48 ч), n=5 0,07±0,019 2265±191,90 Максимальная амплитуда: рК2-Э1≤0,05 рК3-Э2≤0,05 τ/2: рК3-Э2≤0,001 В отношении второго параметра функциональной активности нейроглии, времени достижения полувысоты этой интегральной кривой, наблюдались изменения, сходные с характером изменения максимальной амплитуды отмечалось статистически значимое удлинение этого времени через 48 часов с момента развития ишемии головного мозга в группе Э2 в сравнении с группой К3. 178 Таким образом, при ишемии обнаружено однонаправленное с АДФРциклазной активностью снижение функциональной активности клеток головного мозга при удлинении времени достижения полувысоты этой активности в динамике, основанных на регистрации кинетики флуоресценции клеточных флавопротеидов. 3.2.11 Модуляция функциональной активности клеток среднего мозга в моделях острой нейродегенерации Модуляторы нуклеотидных рецепторов (АТФ и оАТФ), лиганда и субстрата АДФР-циклазы (НАД+) и блокатора внутриклеточных флавопротеидов DPI в гомогенатах ткани головного мозга контрольных групп К1, К2, К3 и групп с ишемией Э1 и Э2 оказали следующие эффекты (таблица 63): все модуляторы оказали однонаправленное усиление активности клеток. Так, АТФ и НАД+ показали статистически приемлемую значимость при усилении активности клеток в группах К2, К3, Э1 и Э2 и тенденцию к ее усилению в группе К1; оАТФ и DPI – значимый результат в группе К2 и приемлемо значимое изменение в группах Э1 и Э2. Таким образом, в модуляции функциональной активности клеток среднего мозга при острой нейродегенерации и в нормальных условиях значимый эффект оказало приложение блокатора нуклеотидных рецепторов Р2Х7 подтипа оАТФ и их активатора АТФ, ингибитора флавопротеидов DPI и субстрата/лиганда для НАД+-утилизирующих ферментов - НАД+. 179 Таблица 63 – Изменения максимальной амплитуды интегральной кривой кинетики флуоресценции клеток микроглии при ишемии головного мозга при приложении модуляторов нуклеотидных рецепторов (АТФ и оАТФ), лиганда и субстрата CD38 (НАД+), блокатора флавопротеидов DPI Функциональная активность после Исходная Группы животных активность К1 (интактные крысы), n=5 К2 («ложная операция», 24 ч), n=5 К3 («ложная операция», 48 ч), n=5 Э1 (ишемия, 2-стор. 0,29±0,182 0,14±0,078 0,20±0,079 0,07±0,016 ОСА, 24 ч), n=5 Э2 (ишемия, 2-стор. 0,07±0,019 ОСА, 48 ч), n=5 приложения модуляторов АТФ НАД+ оАТФ DPI 0,40±0,105 0,36±0,082 0,43±0,076 0,27±0,049 0,43±0,130 0,29±0,059 0,37±0,071 0,21±0,030 * 0,75±0,156 * ** 0,50±0,133 * 1,04±0,371 * ** 1,37±1,025 0,31±0,070 0,34±0,026 0,49±0,079 0,29±0,063 * * * * 0,71±0,156 0,41±0,121 0,45±0,110 1,25±0,681 * * * * Исходная активность: рК2-Э1≤0,05 рК3-Э2≤0,05 Примечания: * - уровень значимости при сравнении эффекта после воздействия модулятора с исходным значением в этой же группе 3.2.12 Определение уровня НАД+ в моделях острой нейродегенерации Анализ содержания внутриклеточного уровня НАД+ спектрофотометрическим ультрамикрометодом выявил значимое снижение содержания субстрата и лиганда для фермента АДФР-циклазы - НАД+ при ишемии головного мозга у взрослых животных через 24 часа с момента ее развития и при перинатальной гипоксии-ишемии через 72 часа с момента ее развития (таблица 64), что может быть связано с усиленной АДФ- 180 рибозилциклазной активностью и/или активностью других ферментов, участвующих в утилизации НАД+, снижает его дальнейшую биодоступность для нормального функционирования фермента при острой нейродегенерации, что очень сходно с хронической нейродегенерацией. Таблица 64 – Содержание НАД+ в гомогенате ткани передних полушарий головного мозга при острой нейродегенерации Группы животных Содержание НАД+ (ммоль/мг ткани) К1 (интактные крысы), n=10 2900,0±617,8 К2 («ложная операция», 24 ч), n=10 2360,0±777,6 К3 («ложная операция», 48 ч), n=10 2376,3±1265,0 К4 («ложная операция» для ПГИ, 72 ч), n=10 8702,6±947,7 Э1 (ишемия, 2-сторонняя ОСА, 24 ч), n=10 1102,0±431,2 Э2 (ишемия, 2-сторонняя ОСА, 48 ч), n=10 2160,0±547,4 Э3 (ишемия, 1-сторонняя ОСА, 24 ч), n=10 2620,0±381,3 Э4 (ишемия, 1-сторонняя ОСА, 48 ч), n=10 2460,0±360,0 Э5 (ПГИ, 72 ч), n=10 3344,4±762,8 рК1-Э1≤0,05 рК4-Э5≤0,001 Таким образом, при острой нейродегенерации в моделях ишемии головного мозга взрослых крыс и перинатальной гипоксии-ишемии выявлено значимое снижение внутриклеточного уровня субстрата/лиганда для АДФР-циклаз НАД+. 3.2.13 Определение концентрации лактата в модели острой нейродегенерации Анализ содержания лактата спектрофотометрическим методом (таблица 65) выявил значимое увеличение концентрации лактата через 48 часов с момента развития ишемии головного мозга, в сравнении с контролем (p≤0,05). 181 Таблица 65 – Содержание лактата в гомогенате ткани передних полушарий головного мозга в модели церебральной ишемии Концентрация лактата в Группы животных гомогенате (мкг/мл) К1 (интактные крысы), n=10 28,3±4,5 К2 («ложная операция», 24 ч), n=10 27,8±4,5 К3 («ложная операция», 48 ч), n=10 30,5±2,2 Э1 (ишемия, 2-сторонняя ОСА, 24 ч), n=10 32,4±2,7 Э2 (ишемия, 2-сторонняя ОСА, 48 ч), n=10 51,0±11,5 рК1-Э2≤0,05 3.2.14 Корреляционный анализ в моделях острой нейродегенерации Корреляционный анализ для выявления взаимосвязи между основными параметрами, выявленными в экспериментальных и контрольных группах животных с моделями острой нейродегенерации, представлен в приложениях ЦШ (в приложениях представлены сильные корреляции и средней силы). При проведении корреляционного анализа в моделях ишемии головного мозга у взрослых животных и при перинатальной гипоксии-ишемии в контрольных и экспериментальных группах были выявлены многочисленные сильные корреляции и корреляции средней силы между различными параметрами, меняющимися при острой нейродегенерации. Значимыми были корреляции (p≤0,05, p≤0,01) между выраженностью неврологической симптоматики, уровнем НАД+, количеством Pax6+ клеток в коре головного мозга, количеством C3/C3b+ клеток, GFAP+/CD38+ клеток; между концентрацией лактата и количеством CD38+ клеток; между количеством CD157+/Mac-1+ клеток и концентрацией НАД+; между количеством Pax6+ клеток в коре головного мозга, количеством CD38+ клеток и функциональной активностью клеток мозга; между количеством Pax6+ клеток в гиппокампе, количеством TUNEL+ клеток, функциональной активностью клеток и концентрацией лактата; между 182 количеством C3/C3b+ и CD38+ клеток; между количеством MAP2+/CD38+ клеток, CD38+ клеток, количеством TUNEL+ и C3/C3b+ клеток; между клеток, концентрацией НАД+, количеством количеством GFAP+/CD38+ CD157+/Mac-1+ клеток; между АДФР-циклазной активностью и уровнем экспрессии CD38; между активностью АДФР-циклазы, уровнем НАД+, количеством Р2Х7+ клеток и TUNEL+ клеток; между уровнем НАД+ и количеством CD38+ клеток – в контроле; между выраженностью неврологической симптоматики, количеством Сх43+ и GFAP+/CD38+ клеток; между концентрацией лактата и количеством TUNEL+ клеток; между количеством CD157+/Mac-1+ и TUNEL+ клеток; между количеством Pax6+ клеток в гиппокампе, функциональной активностью клеток и количеством CD157+/Mac-1+ клеток; между количеством NSE+/CD38+ клеток и концентрацией лактата; между количеством MAP2+/CD38+ и Pax6+ клеток в коре головного мозга; между количеством MAP2+/CD38+ клеток, GFAP+/CD38+ клеток и концентрацией НАД+; между концентрацией НАД+ и количеством CD38+ клеток - в эксперименте. 183 ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ Известно, что дифференцировка, ключевые гибель клеточные клеток ЦНС) процессы находятся (пролиферация, под контролем многочисленных факторов: внутриклеточных белков, нуклеотидов (АТФ, НАД +, НАД(Ф)Н, ФАД и др.), цитокинов, ионов Са2+, гормонов, ростовых факторов, активных форм кислорода, азота и других агентов. К примеру, установлено, что апоптотическая и некротическая гибель клеток центральной нервной системы могут быть индуцированы различными внешними (глутаматная эксайтотоксичность, активные формы кислорода и азота, нейротоксины, микроорганизмы и их компоненты при септическом, цитокины при асептическом нейровоспалении, увеличение уровня внеклеточных метаболитов - АТФ и НАД+) и внутренними (ионный дисбаланс: повышение, а затем истощение уровня нуклеотидов АТФ, НАД+; кальциевая перегрузка клеток, генетическая программа запуска клеточной гибели и т.д.) по отношению к клетке факторами [17, 20, 98, 140, 172, 229]. Относительно недавно были обнаружены новые патогенетические механизмы, играющие критическую роль в гомеостазе уровня нуклеотидов (НАД+, АТФ), в активации и функционировании клеток головного мозга, их гибели и жизнеспособности, в ответ на повреждающие воздействия, в их числе – механизмы утилизации НАД+ (НАД+-гликогидролазы/АДФР-циклазы, ПАРП, моноАДФ-рибозилазы, ферменты), глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа нуклеотидные рецепторы Р2Х и P2Y и типов, другие молекулы активированной микроглии (Mac-1, C3/C3b), внутриклеточные транспортеры (Ргликопротеин), белки щелевых контактов (коннексины) и другие взаимодействующие с ними молекулы (аденозин, АТФ, глутамат и др.) которые как было описано ранее, могут также играть роль в нейрон-глиальных взаимодействиях в норме и при патологиях ЦНС [70, 152]. Вместе с тем, в литературе присутствует мало информации о роли этих механизмов в регуляции и дисфункции нейрон-глиальных взаимодействий при острой и хронической нейродегенерации, об их взаимосвязи и роли в патогенезе 184 этих видов нейродегенерации. Известна роль гомеостаза нуклеотидов НАД+ и АТФ в работе нуклеотидных рецепторов и связанных с этими молекулами механизмов (к примеру, CD38). Повышение содержания НАД+ и АТФ в межклеточном пространстве приводит к активации нуклеотидных рецепторов, что вызывает последующую гибель клеток с высвобождением в межклеточное пространство разнообразных клеточных метаболитов (АТФ, НАД+, АМФ, АДФР, цАДФР, Са2+, прооксиданты), что усугубляет нейродегенерацию [28]. У экспериментальных животных обнаружено увеличение количества клеток, экспрессирующих гликопротеид CD38. Известно, что CD38 экспрессируется в клетках нейронов (в теле нейрона вокруг ядра - перикариально, в отростках, в некоторых видах нейронов - примембранно), где он контролирует нейропластичность за счет регуляции внутриклеточного уровня кальция путем продукции циклической АДФ-рибозы [122]. Согласно литературным данным, экспрессия CD38 отмечается диффузно (перикариально и в цитоплазме) и в астроцитах. Микроглия и олигодендроциты, согласно ранним данным, иммунонегативны на CD38. Однако, другими авторами было показано, что микроглия все же экспрессирует CD38, причем при активации микроглии уровень экспрессии CD38 усиливается [286, 403]. Нами были получены данные о локализации CD38 диффузно в цитоплазме клеток, в перикариальной области и по ходу отростков нервных клеток, что соответствует литературным данным об особенностях экспрессии CD38 в клетках головного мозга (нейронах и астроцитах) [286, 403]. Нуклеотидные Р2Х7 рецепторы экспрессируются на предшественниках олигодендроцитов, затем при гипоксии-ишемии их экспрессия на олигодендроцитах снижается, но перед гибелью олигодендроцитов снова повышается [252]. Аналогичным образом Р2Х7 рецепторы экспресируются на астроцитах [101], покоящейся и активированной микроглии [309, 128]. Р2Х7 рецепторы экспрессируются на некоторых видах нейронов (передних ольфакторных ядер, коры головного мозга, пирамидальных нейронах гиппокампа 185 и других) [128]. Выявлено, что развитие острой и хронической нейродегенерации характеризуется увеличением количества CD38- (в 2-4 раза при острой и в 4 раза при хронической нейродегенерации) и Р2Х7-экспрессирующих клеток (в 4-5 раз при острой и в 26 раз при хронической нейродегенерации) и увеличением процента клеток в апоптозе (в 2-5 раз при острой и в 2 раза при хронической нейродегенерации). В норме выявлены сильные корреляции и корреляции умеренной силы у 10дневных крысят (между количеством апоптотических клеток и CD38- экспрессирующих клеток r=0,59) и у крыс молодого возраста (между количеством CD38- и Р2Х7-экспрессирующих клеток r=-0,48, между количеством апоптотических клеток и CD38-/Р2Х7-экспрессирующих клеток, r=0,33-0,9 в разных подгруппах контроля в случае CD38 и r=-0,48 в случае Р2Х7 рецепторов), у крыс зрелого возраста в норме подобных корреляций обнаружено не было. Постнатальный период развития ЦНС у крысят характеризуется выраженной запрограммированной гибелью клеток, что, вероятнее всего, необходимо для реализации процесса нейрогенеза. При ишемии головного мозга у крыс молодого возраста сохраняются корреляции между количеством апоптотических и CD38-позитивных клеток (r=0,50), апоптотических и Р2Х7-позитивных клеток (r= -0,91), количеством Р2Х7и CD38-позитивных клеток (r=0,96) и появляются корреляции между количеством апоптотических клеток и CD38-экспрессирующих клеток (r= -0,3) у зрелых крыс с хронической нейродегенерацией. С учетом полученных результатов об особенностях экспрессии CD38 и Р2Х7 рецепторов на клетках нервной системы, очевидно, что увеличение количества CD38- и Р2Х7-позитивных клеток в поврежденных участках мозга может в основном усугублять повреждение клеток нервной системы за счет повышения внутриклеточного уровня кальция, вследствие чего, согласно литературным данным, развиваются «кальциевая перегрузка клеток», истощение содержания внутриклеточного НАД+, индуцируется клеточная гибель (как апоптотическая, 186 так и некротическая) [74, 347], вероятнее всего, вследствие гиперактивации функциональной активности клеток ЦНС. Предполагаем, что эта метаболическая активность связана главным образом с активированными фагоцитами головного мозга («отдыхающая» микроглия, периваскулярные макрофаги и перициты, «патрулирующие» макрофаги), главным образом микроглией [206]. При острой и хронической нейродегенерации также могут быть задействованы и другие виды клеточной гибели (некроз, апонекроз, аутофагия, пироптоз и т.д.), не выявляемые методом TUNEL. Для установления роли некротической и апонекротической (вторичный некроз) смерти клеток среднего мозга в патогенезе паркинсонизма необходимы дальнейшие исследования их гибели другими методами (например, методами Annexin V или ISOL). При хронической нейродегенерации (болезнь Паркинсона) отмечается резкое снижение количества тирозингидроксилаза-экспрессирующих клеток (в 3 раза снижается число клеток, экспрессирующих только тирозингидроксилазу и в 2 раза снижается суммарное количество клеток, экспрессирующих тирозингидроксилазу), что является подтверждением создания модели болезни Паркинсона и свидетельствует о выраженной гибели дофаминергических нейронов при паркинсонизме (что, вероятнее всего, связано с усилением апоптоза клеток среднего мозга при болезни Паркинсона, описанным выше). Кроме того, обнаруженное увеличение числа клеток, коэкспрессирующих тирозингидроксилазу и CD38, указывает на потенциальную роль CD38 в реализации повреждения и гибели дофаминергических нейронов, а рост числа клеток, не относящихся к дофаминергическим (позитивны только на CD38) указывает на потенциальную роль CD38 во взаимодействии дофаминергических нейронов с другими типами клеток (вероятнее всего, астроциты или клетки микроглии), приводящем к гибели дофаминергических нейронов. Фенотипирование видов клеток головного мозга (нейроны, астроциты и микроглия), экспрессирующих CD38 в среднем мозге, подтвердило наши предположения и выявило преимущественную экспрессию CD38 при болезни Паркинсона в астроцитах и микроглии (в 4 раза повысилась экспрессия CD38 на 187 астроцитах, в 3 раза – на микроглии при развитии болезни Паркинсона), однако показало тенденции к усилению экспрессии и в нейронах (в 1,3 раза – на нейронах при БП), что подтверждает возможную роль CD38 в реализации нейронглиальных (нейрон-астроглиальных и нейрон-микроглиальных) взаимодействиях, приводящих в конечном счете к повреждению и гибели дофаминергических нейронов черного вещества, что и наблюдается в патогенезе этого вида хронической нейродегенерации. В патогенезе острой нейродегенерации на примере ишемии головного мозга взрослых животных фенотипирование CD38экспрессирующих клеток выявило преимущественную экспрессию CD38 на астроцитах через 24 и 48 часов с момента развития ишемии (в 2-4 раза усилилась экспрессия CD38 на астроцитах, в 1,5-3 раза – на микроглии, однако, учитывая разброс полученных данных, изменения не были значимыми; в 1,4-1,7 раза усилилась экспрессия CD38 на нейронах, однако изменения также не были значимыми). Таким образом, основными клетками, экспрессирующими CD38 в период 24-48 часов с момента развития ишемии головного мозга у крыс, являются астроциты, а через 28 суток с момента развития хронической нейродегенерации зрелых крыс, являются астроциты и микроглия, что косвенно свидетельствует о развитии реактивного астроглиоза и/или микроглиоза в патогенезе нейродегенерации. Полученные данные отражают возможность участия CD38 в запуске апоптоза головного мозга в период постнатального развития в физиологических условиях, при острой и хронической нейродегенерации. Вероятнее всего, эти эффекты опосредуются повышением содержания внутриклеточного кальция, что может наблюдаться при генерации АДФР-циклазой кальций-мобилизующих вторичных посредников (цАДФ-рибоза, НААДФ+). Полученные данные соответствуют существующим представлениям о функционировании CD38 в качестве редокс-сенсора, который участвует в сопряжении между клеточным редокс-потенциалом и высвобождением кальция из внутриклеточных депо [124]. Вероятнее всего, неконтролируемое возрастание 188 концентрации кальция в цитоплазме клеток, в том числе обусловленное нарушением кальций-депонирующей функции митохондрий и эндоплазматического ретикулума при гипоксии, работой кальций-мобилизующих посредников (в частности, циклической АДФ-рибозы) и активацией механизма CICR, может стать причиной необратимого повреждения клетки. Еще одной причиной необратимого повреждения клеток при гиперэкспрессии CD38 на астроцитах является развитие в них «глутаматного удара», когда глутамат, высвобождаясь из нейронов, стимулирует экспрессию АДФР-циклаз на клетках глии, что приводит к стимуляции образования цАДФ-рибозы и нарушению механизмов внутриклеточного депонирования кальция в астроцитах [217, 235, 299]. Вход кальция в астроциты определяется также активностью белковконнексинов (образуют щелевые контакты между астроцитами) и ионных обмеенников (в частности, натрий-кальцевого обменника). Благодаря этим каналам происходит сообщение между астроцитами (транспорт ионов кальция, калия, НАД+, глутамата и др.). Кроме увеличения количества CD38- и Р2Х7экспрессирующих клеток, при острой и хронической нейродегенерации также отмечается увеличение количества коннексин-43 экспрессирующих клеток и их коэкспрессии с CD38. Предполагаем, что главным образом экспрессия Cx43 связана с астроцитами, учитывая литературные данные о преимущественной экспрессии коннексина 43 в астроцитах, где он является основным компонентом астроцитарных щелевых контактов [408]. При перинатальной гипоксии-ишемии у 10-дневных крысят отмечено 2кратное усиление экспрессии коннексина 43 (р<0,05 в сравнении с контролем) и тенденции к ее усилению при ишемии головного мозга у молодых крыс. При хронической нейродегенерации также отмечена тенденция к увеличению количества коннексин 43-позитивных клеток и значимое 2-кратное увеличение их коэкспрессии с CD38. Увеличение коэкспрессии CD38 с коннексином 43 свидетельствует о том, что большинство Cx43+-клеток являются одновременно CD38-позитивными (свыше 75% у крысят, более 53% у молодых и около 67% у 189 зрелых крыс) как у здоровых животных, так и при острой или хронической нейродегенерации. Увеличение коэкспрессии Cx43 и CD38 в астроцитах свидетельствует также о наличии функциональной взаимосвязи между АДФ-рибозилциклазной активностью CD38 (катализирует превращение НАД+ в циклическую АДФрибозу) и коннексинами (регулируют биодоступность НАД+ в качестве субстрата реакции, транспортируют НАД+ и АТФ во влеклеточное пространство, где они взаимодействуют с CD38 и P2X7, соответственно). Зарегистрированное нами увеличение экспрессии CD38, Cx43 и P2X7 в очаге повреждения как при острой ишемии, так и при хронической нейродегенерации свидетельствует о том, что общим неспецифическим механизмом для этих процессов является высвобождение АТФ и НАД + из клеток (из поврежденных – через разрушенную мембрану, из неповрежденных – через коннексиновые «полуканалы») во внеклеточное пространство и реализация паракринного и аутокринного механизма действия за счет связывания с P2X7 и CD38, соответственно. Поскольку первый механизм способствует формированию инфламмасом, а второй – образованию вторичных посредников с кальциймобилизующей активностью, то логично предположить вклад инфламмасомызависимого процессинга провоспалительных цитокинов и распространения кальциевой волны повреждения клеток через коннексиновые каналы в пределах астроглиального синцития в повреждение клеток в очаге острой ишеимии или при хронической нейродегенерации. Таким образом, увеличение экспрессии CD38, Cx43 и P2X7 маркирует повреждение клеток «вторичного» характера (вследствие высвобождения активных метаболитов во внеклеточное пространство, рисунок 5). 190 Рисунок 5 – Механизмы вторичного повреждения клеток ЦНС при острой и хронической нейродегенерации. На наличие нейрон-астроцитарных взаимосвязей в патогенезе острой и хронической нейродегенерациии также указывает факт повышения концентрации лактата при экспериментальной болезни Паркинсона (в 1,8 раз увеличилось содержание лактата при болезни Паркинсона) и ишемии головного мозга (почти в 2 раза через 48 часов с момента развития ишемии по сравнению с контролем). Известно, что лактат в физиологических условиях играет роль в нейронглиальных взаимодействиях за счет нейрометаболической связи: лактат, продуцируемый глией, является основным источником энергии для активных нейронов, а не глюкоза [92, 248]. Показано, что в моделях ишемии головного мозга в невысоких концентрациях лактат может оказывать нейропротективный эффект, защищая нейроны от повреждения. В то же время, в концентрации свыше 20 ммоль/л лактат является токсичным для нейронов [291]. При болезни Паркинсона, согласно литературным данным, повышение концентрации лактата может быть также связано с митохондриальной дисфункцией и лактат-ацидозом [227]. 191 При острой и хронической нейродегенерации отмечается увеличение экспрессии молекул CD157 (экспрессируется на фагоцитах), CD11b/CD18 (рецептор комплемента Mac-1, наблюдаемый при активации макрофагов и микроглии) и лиганда к Mac-1 – C3/C3b (компонент комплемента, экспрессируемый на иммунокомпетентных клетках, астроцитах и нейронах), указывающих на возможное наличие взаимосвязи микроглии с нейронами, другими клетками глии (астроциты) и лейкоцитами (увеличение экспрессии обеих молекул отмечается через 24 и 48 часов с момента развития ишемии головного мозга и через 28 суток с момента начала создания экспериментальной болезни Паркинсона). Кроме потенциального участия в реализации нейрон- микроглиальных взаимодействий, усиление экспрессии указанных молекул может свидетельствовать о хронической прогрессии болезни Паркинсона, об участии этих молекул в нейровоспалении и микроглиозе, о роли Mac-1/C3 компонента комплемента в индукции нейровоспаления при ишемии головного мозга [262], об активации микроглии и экспрессируемых в неактивном состоянии молекул (в частности, НАД(Ф)Н-оксидазы), что приводит к генерации активных форм кислорода, нейротоксичности и гибели нейронов при обеих патологиях [224, 411]. С другой стороны, активация данного комплекса, образующегося при клеточном взаимодействии, может играть и нейропротективную роль, как это было показано при болезни Альцгеймера и болезни Паркинсона [136]. Важно отметить, что в данном исследовании впервые зарегистрирована коэскпрессия CD157, CD11b, CD18, что сопровождается увеличением экспрессии лиганда CD11b/CD18-комплекса – C3-компонента комплемента в очаге ишемического повреждения или нейродегенерации. По аналогии с ролью CD157/CD11b/CD18 в регуляции процессов адгезии и миграции активированных лейкоцитов, логично предположить, что развитие нейровоспаления и активация клеток микроглии сопровождается комплемент-опосредованной цитотоксичностью и направленной миграцией клеток. Недавние данные о полиморфизме гена, кодирующего CD157, при некоторых формах болезни Паркинсона, дают право предполагать роль этой молекулы в контроле 192 воспалительного потенциала активированной микроглии в среднем мозге. Эта гипотеза нуждается в дальнейшей экспериментальной проверке. Известно, что в патогенезе острой и хронической нейродегенерации наблюдается дисфункция (при ишемии головного мозга, с одной стороны, наблюдается усиление нейрогенеза – в субвентрикулярной зоне, гиппокампе, коре головного мозга, а с другой стороны, в 80% случаев вновь образованные клетки гибнут) и/или усиление нейрогенеза [139, 268]. Обнаруженное нами усиление нейрогенеза в среднем мозге при болезни Паркинсона (увеличение экспрессии маркера раннего нейрогенеза Pax6 в 5 раз в сравнении с контролем) и в коре головного мозга и гиппокампе при ишемии головного мозга (наблюдается 2-4кратное усиление экспрессии Pax6 в коре и гиппокампе через 24-48 часов с момента развития ишемии, что согласуется с литературными данными: интенсивный нейрогенез при ишемии головного мозга наблюдается в гиппокампе, который начинается на 1-2-е сутки с момента развития ишемии и достигает своего максимума на 10-14-е сутки с момента развития ишемии головного мозга, далее идет на убыль) является защитным механизмом, запускаемым вследствие гибели клеток (рисунок 6) [139, 268, 313]. Кроме дисфункции/усиления нейрогенеза, в патогенезе острой и хронической нейродегенерации, согласно литературным данным, также важную роль играет дисфункция, нарушение целостности и увеличение проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), что может возникать при ишемии головного мозга и перинатальной гипоксии-ишемии вследствие апоптоза нейронов и нейровоспаления [305], при болезни Паркинсона вследствие скопления активированной микроглии и наличия множественных микроразрывов сосудов [72, 114], при обеих патологиях - вследствие изменения экспрессии белков плотных контактов, изменения экспрессии и/или активности белковтранспортеров ГЭБ, главным образом Р-гликопротеина [72, 114, 361, 375]. 193 Рисунок 6 – НАД+-зависимые события, связанные с повреждением и репарацией клеток, при острой и хронической нейродегенерации. При острой и хронической нейродегенерации обнаружено увеличение количества Pgp-позитивных клеток (у взрослых животных с моделью болезни Паркинсона наблюдалось значимое увеличение Pgp-экспрессирующих клеток в среднем мозге, а при ишемии головного мозга - лишь тенденции к увеличению количества Pgp-экспрессирующих клеток в коре ишемизированного полушария через 48 часов с момента ее моделирования). Данная ситуация может являться защитной, как это показано при ишемическом и травматическом повреждении ЦНС, гипералгезии [131, 225, 253]. Согласно литературным данным, P- гликопротеин и другие транспортеры являются «системой детоксикации» в гематоэнцефалическом барьере [155, 253, 264, 265]. Мы предполагаем, что увеличение экспрессии Р-гликопротеина при острой и хронической нейродегенерации может иметь защитное значение в зрелом мозге: увеличение экспрессии P-гликопротеина на клетках ЦНС отмечается спустя некоторое время с момента развития острой и хронической нейродегенерации, на фоне гипоксии головного мозга повышенная устойчивость клеток головного мозга (в особенности нейронов) к ксенобиотикам и продуктам метаболизма может 194 являться защитной реакцией. В то же время, негативным эффектом усиления экспрессии Pgp при патологии ЦНС является снижение чувствительности к лекарственной терапии, возникающей, согласно литературным данным, вследствие оттока веществ из клеток нервной системы и эндотелиоцитов в просвет капилляра при работе P-гликопротеина [143]. Между экспрессией коннексина 43, Р-гликопротеина и гибелью клеток отмечено появление корреляций (приложения Х-Ш), что также подтверждает их роль в патогенезе острой и хронической нейродегенерации. Кроме изменений экспрессии CD38/коннексина 43, P2X7 рецепторов, Mac1/C3-C3b, выявленная апоптотическая гибель клеток при острой и хронической нейродегенерации также может быть связана и с изменением активности ферментов (например, АДФР-циклазной активности, НАД(Ф)Н-оксидазы фагоцитов), функциональной активностью клеток среднего и переднего мозга, что указывает на возможную роль указанных механизмов в патогенезе клеточной гибели при острой и хронической нейродегенерации. В отношении АДФ-рибозилциклазной активности при острой и хронической нейродегенерации отмечены разнонаправленные изменения: при острой нейродегенерации у взрослых в период 24 и 48 часов с момента развития ишемии (снижение в 7-10 раз при развитии ишемии головного мозга) и у 10дневных крысят (снижение в 2,5 раза при развитии ПГИ) через 72 часа с момента моделирования перинатальной гипоксии-ишемии выявлено снижение АДФРциклазной активности клеток ЦНС, при хронической нейродегенерации в ротеноновой модели – их усиление (в 2 раза при развитии хронической нейродегенерации). Снижение АДФ-рибозилциклазной активности может быть связано с отсутствием необходимого уровня субстрата для активности (НАД+) в ткани мозга животных (снижение содержания НАД+ наблюдается, в частности, в патогенезе ишемии головного мозга), а сам факт снижения содержания НАД+ может быть вызван сверхактивацией других ферментов утилизации НАД+ в клетке (например, поли-АДФ-рибозилполимеразы). Однако, вклад других НАД+- 195 конвертирующих ферментов (в частности, ПАРП), кероятнее всего, минимален, так как уровень НАД+ в клетках мозга у ПАРП-нокаутных животных не отличался от контроля, согласно литературным данным [229]. Спад активности АДФ-рибозилциклазы также может быть связан с истощением работы этого фермента. Усиление экспрессии АДФР-циклаз (в данном исследовании CD38 и CD157), наблюдаемое при этом, может являться компенсаторной реакцией организма в ответ на истощение ферментативных клеточных систем, что в условиях снижения концентрации внутриклеточного НАД+ еще больше усугубляет истощение его функциональных резервов. Одним из механизмов усиления активности АДФ-рибозилциклазы в патогенезе хронической нейродегенерации может быть увеличение биодоступности НАД+ как субстрата для его активности, при этом образуемая цАДФ-рибоза служит кальциевым мобилизатором [207, 242, 277]. Между экспрессией и активностью CD38 в норме и при острой и хронической нейродегенерации выявлено наличие корреляционных взаимосвязей (приложения Х-Ш). В регуляции чувствительности клеток к действию апоптогенных стимулов, интересным является изучение внутриклеточного уровня НАД+. Известна доминирующая роль НАД+-гликогидролазы/CD38 в регуляции гомеостаза НАД+ в клетках различной природы [337]. Некоторые клетки, экспрессирующие CD38 на поверхности своей цитоплазматической мембраны, участвуют в метаболизме НАД+ и транспорте цАДФР внутрь клетки. Возможно и перемещение CD38 внутрь клетки, следующее за мембранной олигомеризацией, под влиянием внеклеточного НАД+ (НАД+-индуцированная интернализация CD38) [123]. Все эти факторы влияют на биодоступность НАД+ в качестве субстрата для активности ферментов, его утилизирующих, в норме и при патологии ЦНС. При развитии острой и хронической нейродегенерации обнаружено значимое снижение концентрации внутриклеточного НАД+ (в 1,5-2 раза при развитии ишемии головного мозга, в 3 раза при развитии ПГИ и при хронической нейродегенерации снижается внутриклеточный уровень НАД+). Однако, учитывая 196 разнонаправленный характер изменения АДФ-рибозилциклазной активности CD38 при острой и хронической нейродегенерации, вероятнее всего, это снижение реализуется различными путями утилизации НАД+: при хронической нейродегенерации отмечается активация АДФР-циклазной активности, а при острой нейродегенерации возможны иные пути утилизации НАД +. На основе анализа литературных данных можно предположить, что усиление АДФрибозилциклазной активности ингибирует НАД+-гликогидролазную активность (конкурентный путь использования субстрата НАД+ для синтеза АДФР). Напротив, наличие НАД+-гликогидролазной активности приводит к ингибированию АДФ-рибозилциклазной активности. Поэтому при острой нейродегенерации возможно как функционирование CD38 и/или CD157 не как АДФР-циклазы, а как НАД+-гликогидролазы, так и участие других ферментов, также участвующих в утилизации НАД+ в клетке (например, за счет усиления моно- или поли-АДФ-рибозилизирования белков или активации ферментов гликолиза, к примеру, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы). С одной стороны, снижение концентрации НАД+ может являться следствием процессов, ведущих к нейротоксичности (увеличение АДФРциклазной активности CD38, гиперактивация ПАРП и других механизмов утилизации НАД+), с другой стороны, само снижение концентрации НАД+ может оказывать в некотором роде защитное действие (к примеру, за счет снижения активности ферментов, приводящих к нейротоксичности). Однако, согласно литературным данным, это защитное действие «перекрывается» протеотоксическим действием НАД+ путем воздействия на формирование и катаболизм поврежденных белков (так, низкий уровень НАД+ способствует синтезу метилглиоксаля, который может индуцировать гликозилирование белков, образование активных форм кислорода и дисфункцию митохондрий) [216]. Между АДФ-рибозилциклазной активностью, экспрессией молекул, уровнем НАД+ и апоптозом клеток головного мозга выявлены корреляционные взаимосвязи при острой и хронической нейродегенерации (приложения Х-Ш). Обнаруженные изменения активности АДФ-рибозилциклазы при острой и 197 хронической нейродегенерации, совпадающие, согласно литературным данным и полученным результатам, со временем развития реактивного астроглиоза и коэкспрессией CD38 и Cx43 в кортикальных астроцитах, могут представлять собой нейропротективный компонент на начальных этапах повреждения клеток. Также обнаружено, что АДФ-рибозилциклазы могут определять чувствительность клеток ЦНС к действию апоптоз-индуцирующих факторов при острой и хронической нейродегенерации, что позволяет рассматривать АДФ- рибозилциклазу как молекулу-мишень для фармакологической модуляции при этих поражениях центральной нервной системы [38]. Направленная модуляция активности НАД+-конвертирующих ферментов является перспективным направлением развития фармакотерапии при ишемическом повреждении тканей [281]. Так, нейропротекторное действие никотинамида ассоциируют с торможением активности поли(АДФ)- рибозилполимеразы, что предупреждает истощение внутриклеточного НАД+ и развитие гибели клеток. Вместе с тем, остаются не изученными вопросы, касающиреся возможности направленной модуляции АДФ-рибозилциклазы/CD38 для достижения нейропротекторного и корригирующего действия при повреждении клеток центральной нервной системы. Насколько велик вклад АДФ-рибозилциклазной активности, регулируемой P2X7 подтипом пуринергических рецепторов (согласно литературным данным, CD38 является пурин-изменяем внутриклеточным эктоферментом), в регуляцию жизнедеятельности клеток головного мозга? Для оценки функциональной активности клеток головного мозга в работе использовался оригинальный метод, основанный на регистрации кинетики их аутофлуоресценции [28]. Аутофлуоресценция связана главным образом с процессами внутриклеточного метаболизма, что подтверждается, согласно литературным данным, высокой концентрацией флуорофоров в функционально активных органеллах (в фагоцитах это фагосомы – вторичные лизосомы, с высокой концентрацией внутри них активных форм кислорода и азота) [27, 106, 335]. Спектр аутофлуоресценции биологических клеток и тканей формируется из 198 спектров флуоресценции отдельных эндогенных флуорофоров, которые имеют широкие полосы поглощения и флуоресценции в ультрафиолетовом и видимом диапазонах спектра. К основным эндогенным флуорофорам биологических тканей относятся флавиновые и пиримидиновые нуклеотиды, протеины, порфирины, молекулы дыхательной цепи, ароматические аминокислоты (тирозин, триптофан, фенилаланин), волокна соединительной ткани (эластин, коллаген), депозиты перекисного окисления липидов, продукты некроза, гемоглобин эритроцитов, пигменты (липофусцин), витамины (С, РР, D, A, B2) [27]. Одним из ферментов, реагирующих на повышение содержания кальция в клетке в ответ на выработку кальций-мобилизующих посредников, является многокомпонентно индуцируемый фермент НАД(Ф)Н-оксидаза. Известно, что в клетках нейроваскулярной единицы НАД(Ф)Н-оксидаза может экспрессироваться, прежде всего, на фагоцитирующих клетках (перициты и микроглия), на эндотелиоцитах, некоторых видов нейронов и астроцитах [89, 172, 191, 192, 212]. Показано, что при острой и хронической нейродегенерации НАД(Ф)Н- оксидаза, экспрессируемая на различных видах клеток ЦНС, является одной из причин нейротоксичности]. Согласно литературным данным, активные формы кислорода, продуцируемые внутриклеточными ферментами (главным образом макрофагальной НАД(Ф)Н-оксидазой), в зависимости от уровня их продукции, могут самостоятельно индуцировать апоптоз или некроз клеток головного мозга. Интересно, что НАД(Ф)Н-оксидаза при хронической нейродегенерации (боковой амиотрофический склероз) является причиной дизрегуляции функционирования пуринергических рецепторов Р2Х7 подтипа [173, 178, 310]. В отношении изменений функциональной активности клеток нервной системы при заболеваниях ЦНС были получены результаты, напоминающие характер изменения АДФ-рибозилциклазной активности при острой и хронической нейродегенерации: у взрослых в период 24 и 48 часов с момента развития ишемии головного мозга выявлено снижение функциональной активности клеток ЦНС (снижение максимальной амплитуды интегральной 199 кривой кинетики аутофлуоресценции в 2-3 раза при развитии ишемии головного мозга), в ротеноновой модели – ее усиление (в 2 раза при развитии болезни Паркинсона), однако сходным при острой и хронической нейродегенерации является удлинение времени достижения полувысоты функциональной активности клеток (при ишемии и болезни Паркинсона наблюдается увеличение этого параметра в 1,5-2 раза). Как и в случае АДФР-циклазы, снижение функциональной активности клеток ЦНС может быть связано с недостатком субстратов или стимулов для активации НАД(Ф)Н-оксидазы, ее истощением или включением других ферментов генерации активных форм кислорода и/или азота (в частности, миелопероксидазы, синтазы оксида азота и других ферментов). Косвенно об истощении фагоцитарного резерва НАД(Ф)Н-оксидазы через 24-48 часов с момента развития ишемии также свидетельствует удлинение времени достижения полувысоты функциональной активности клеток вместо его укорочения, наблюдаемого, например, при в фагоцитах при остром перитоните. При острой и хронической нейродегенерации в целом, это может свидетельствовать о постепенном «истощении» функциональных резервов клеток ЦНС. Между функциональной активностью клеток, АДФ-рибозилциклазной активностью, экспрессией молекул, уровнем НАД+ и апоптозом клеток головного мозга выявлены корреляционные взаимосвязи при острой и хронической нейродегенерации (приложения Х-Ш). Установленные закономерности изменения активности и экспрессии молекул метаболизма НАД+ в клетках ЦНС и корреляционные взаимосвязи позволяют рассматривать нейрон-глиальные взаимодействия, опосредованные активностью НАД+-зависимых механизмов, в качестве патогенетически обоснованных мишеней для фармакологической коррекции. Для проверки этой возможности и выявления вероятного метаболического сопряжения между функционированием нуклеотидных рецепторов, АДФрибозилциклазной активностью и функциональной активностью клеток ЦНС, связанной, как мы предполагаем, с ферментом НАД(Ф)Н-оксидазой, в клетках 200 нервной системы при острой и хронической нейродегенерации, были проведены эксперименты с применением селективного антагониста и агониста рецепторов P2X7 подтипа, субстрата и лиганда для CD38 – НАД+ и блокатора внутриклеточных флавопротеидов дифениленйодониума. Были получены интересные данные, свидетельствующие об усилении АДФР-циклазной активности в клетках среднего мозга при ротеноновом паркинсонизме при приложении АТФ и НАД+, также было выявлено усиление АДФР-циклазной активности CD38 при развитии ишемии головного мозга при приложении окисленной формы АТФ, вместо ожидаемой блокады фермента. Полученные данные свидетельствуют о взаимосвязи между пуринергическими рецепторами и активностью CD38 в клетках среднего мозга, однако в клетках переднего мозга при развитии его ишемии подобных взаимосвязей не выявлено. Кроме того, активация АДФР-циклазы клеток нейроглии при ишемии головного мозга может быть связана как с блокадой нуклеотидных рецепторов Р2Х7 подтипа, так и с активацией нуклеотидных рецепторов других подтипов и/или других механизмов внутриклеточной сигнализации. При приложении модуляторов к гомогенату ткани среднего мозга в норме и при развитии нейродегенерации отмечаются тенденции к усилению активности (при приложении АТФ и НАД+) и значимое увеличение активности (при внесении оАТФ), а также значимое ингибирование активности (при применении DPI). При приложении всех модуляторов к гомогенату ткани молодых животных в физиологических условиях и при ишемии головного мозга выявлено значимое однонаправленное усиление функциональной активности. Полученные данные свидетельствуют о потенциальной взаимосвязи между CD38 и функциональной активностью клеток (НАД(Ф)Н-оксидазой) среднего мозга в нормальных условиях; при развитии паркинсонизма и при ишемии головного мозга данной взаимосвязи не прослеживается. Полученные результаты в клетках среднего мозга согласуются с литературными данными о взаимосвязи Р2Х7 рецепторов и фермента CD38 на дендритных клетках и Т-лимфоцитах [28, 327]. В неактивном виде Р2Х7 201 рецепторы представляют из себя димеры, для активации которых необходимо связывание с лигандом (АТФ) и конформационное изменение - НАД+-зависимое АДФ-рибозилирование. Конформационно измененные Р2Х7 рецепторы далее активируют CD38 и НАД(Ф)Н-оксидазу (посредством выработки цАДФ-рибозы и мобилизации кальция). Конформационные изменения молекулы АДФР-циклазы включают образование димеров и тетрамеров, не только проявляющих ферментативную активность, но и транспортирующих синтезируемую циклическую АДФ-рибозу внутрь клетки. Также происходят и изменения конфигурации фермента НАД(Ф)Н-оксидазы, приводящие к образованию активного комплекса - фосфорилирование, перемещение цитозольных факторов ближе к цитоплазматической мембране и их соединение с трансмембранным цитохромом [28]. Усиление АДФР-циклазной и функциональной активностей при приложении активатора и блокатора пуринергических рецепторов можно объяснить следующим образом: первоначально конформационные изменения ферментов отсутствовали (к примеру, неактивное состояние Р2Х7 рецепторов связано с их существованием в виде димеров, CD38 – в виде мономеров, НАД(Ф)Н-оксидазы – в виде конформационно «разделенного» в пространстве комплекта из 2 частей – цитоплазматического и трансмембранного компонентов). Далее, под действием пуринергических модуляторов происходит активация АДФрибозилциклазы опосредованно (через активацию Р2Х7 рецепторов) или напрямую, далее возможна активация НАД(Ф)Н-оксидазы под действием ионов кальция. Анализ литературных данных позволяет предположить, что альтернативным механизмом регуляции активности нуклеотидных рецепторов может являться CD38-опосредованное АДФ-рибозилирование молекул рецепторов или воздействие НАД(Ф)Н-оксидазы по типу обратной отрицательной взаимосвязи. Это возможно с учетом данных об АДФ-рибозилирующей активности CD38 [235], однако высказанное предположение требует дальнейшей экспериментальной проверки. 202 Обнаружение активирующего влияния внеклеточно добавленного НАД+ на АДФ-рибозилциклазу косвенно подтверждает высказанное выше предположение и свидетельствует рибозилциклазы в в пользу клетках наличия головного трансмембранной мозга, формы обладающей АДФ- способностью конвертировать субстрат и транспортировать продукт его реакции в цитозоль, как ранее было описано на астроцитах [235]. Описано, что активация клеток сопровождается увеличенным синтезом НАД+, что считали клеточным ответом на активацию поли-АДФ- рибозилполимеразы вследствие окислительного стресса, что сопровождалось внутриклеточного уровня НАД+ [80]. Полученные данные истощением позволяют предположить существование иного механизма регуляции уровня НАД+ при активации клеток: избыточная продукция свободных радикалов вследствие активации НАД(Ф)Н-оксидазы является не единственной причиной колебаний внутриклеточной концентрации НАД+, другим механизмом может являться активация АДФ-рибозилциклазы, конкурирующего с ПАРП фермента утилизации НАД+. Дифениленйодониум (DPI), неконкурентный ингибитор внутриклеточных флавопротеинов, существенно снижает функциональную активность клеток головного мозга, связанную с активностью пиримидин-чувствительных внутриклеточных ферментов клеток ЦНС (в частности, НАД(Ф)Н-оксидазы) как в контрольной, так и экспериментальной группе при ротеноновом паркинсонизме, что указывает на потенциальную роль флавопротеидов в патогенезе хронической нейродегенерации. Полного ингибирования функциональной активности клеток не наступило. Вероятнее всего, для полной инактивации НАД(Ф)Н-оксидазы необходимы либо более высокие концентрации DPI, либо более длительный контакт с ним. Теория нейропротективной стратегии и этиопатогенетической терапии ишемии головного мозга, базирующихся на направленной модуляции экспрессии и активности пуринергических рецепторов Р2Х7 подтипа, АДФ- рибозилциклазы/CD38, активности НАД(Ф)Н-оксидазы в клетках головного 203 мозга, патогенетически обоснована: указанные сигнальные молекулы могут являться молекулами-маркерами и молекулами-мишенями при острой и хронической нейродегенерации. Для модуляции АДФР-циклазной активности CD38 при ишемии головного мозга целесообразнее всего использовать окисленную форму АТФ (селективный блокатор нуклеотидных рецепторов Р2Х7 подтипа), при болезни Паркинсона, напротив – АТФ и НАД+. Для модуляции функциональной активности клеток нервной системы при ишемии головного мозга и в физиологических условиях можно использовать все нижеперечисленные модуляторы: АТФ, оАТФ, НАД + и DPI, при хронической нейродегенерации – АТФ и DPI, в физиологических условиях в зрелом мозге можно использовать оАТФ и DPI. Однако очевидна необходимость дальнейшего изучения роли модуляторов АДФ-рибозилциклазы и нуклеотидных рецепторов в функционировании и гибели клеток головного мозга при острой и хронической нейродегенерации. Дальнейшее изучение роли НАД+-зависимых механизмов в реализации нейрон-глиальных взаимодействий межклеточных современной и фармакологическая взаимодействиях неврологии, – модуляция одно из патологической этих механизмов перспективных физиологии, в направлений нейробиологии и нейрохимии. Еще одним аспектом патогенеза острой и хронической нейродегенерации является дизрегуляция и нарушение интегративных функций мозга, контролирующих когнитивные функции, социальное и эмоциональное поведение. У исследуемых крыс молодого и зрелого возраста до создания моделей ишемии головного мозга и болезни Паркинсона не было отмечено когнитивной дисфункции (отмечалась нормальная пространственная кратковременная и долговременная память, хорошая непространственная память, связанная с пластичностью обучения). Однако при моделировании ротенонового паркинсонизма (на 28-е сутки с момента начала моделирования), ишемии головного мозга (при ишемии головного мозга путем 2-сторонней перевязки ОСА через 24 и 48 часов с момента ее моделирования с тенденцией к постепенному 204 нарастанию дисфункции; при ишемии головного мозга путем 1-сторонней перевязке ОСА - через 48 часов с момента ее моделирования) обнаружено появление у крыс когнитивной дисфункции в экспериментальной группе в сравнении с исходным значением до моделирования. У крысят с моделями пренатального введения ротенона и комбинации вальпроевая кислота/ротенон не было отмечено появления когнитивной дисфункции (отмечалась нормальная пространственная кратковременная и долговременная память), что может быть связано с хорошей нейропластичностью головного мозга. У крыс с моделью ротенонового паркинсонизма отмечены следующие нарушения социального и эмоционального поведения: нарушение социального распознавания (удлинение времени, проведенного в отсеке со знакомым самцом, в отличие от незнакомого, в тесте «3-камерная активность»), снижение агрессивности крыс (связанное в большей степени с их «пассивностью» вследствие двигательных нарушений, однако у некоторых крыс наблюдалось появление (ауто)агрессивного поведения); появление тревожности и «дефицита внимания» (значимое увеличение числа пересеченных линий, увеличение числа входов в открытые, закрытые рукава и центр, значимое уменьшение времени пребывания в открытых рукавах). У крысят с моделью пренатального введения ротенона и ротенона с вальпроевой кислотой выявлена склонность животных к (ауто)агрессии, появление непроивольных повторяющихся движений (аутогрумминга и рытья подстилки), нарушение социального контакта с особями (увеличение времени контакта с ранее «знакомой» крысой в сравнении с контролем при сохранении социального интереса к «незнакомой» крысе). У этих же животных (пренатальное введение ротенона и ротенона с вальпроевой кислотой) обнаружена часть признаков, характерных для паркинсонизма (появление у большей части животных тремора и нарушения равновесия, а у части животных - нетяжелых нарушений двигательной активности) и часть признаков, характерных для аутизма (появление непроивольных повторяющихся движений – аутогрумминга и рытья подстилки, нарушение социального контакта). 205 Интересно, что между двумя различными вариантами хронической нейродегенерации – хронической нейродегенерацией «взрослых» (болезнь Паркинсона) и «детей» (аутизм) прослеживаются некоторые общие черты развития симптомов и общие патогенетические механизмы (участие дофаминергической системы, гибель дофаминергических нейронов, повреждение ГЭБ) как при пренатальном воздействии (низкая динамика прибавки веса и позднее открытие глаз в обеих моделях с пренатальным воздействием ротенона и ротенона/вальпроевой кислоты по сравнению с контрольными крысятами; появление у них слабовыраженных признаков паркинсонизма и выраженных признаков аутизма), так и во взрослом состоянии (у некоторых животных с моделью болезни Паркинсона выявлены признаки, характерные для аутизма – появление «стереотипных внимания»/тревожности, действий», нарушения агрессии/аутоагрессии, социального «дефицита распознавания), однако полученные результаты неоднозначны и требуют дальнейшего изучения. Между симптомами и патогенетическими механизмами развития двух вариантов острой нейродегенерации – ишемии головного мозга «взрослых» и перинатальной гипоксии-ишемии «детей» - также выявлены схожие черты (особенности экспрессии CD38, коннексина 43, Р-гликопротеина, изменения апоптоза клеток головного мозга и неврологического дефицита). С учетом того, что вальпроевая кислота, примененная в качестве пренатального фактора, индуцирующего развитие аутистического фенотипа у экспериментальных животных, в дополнение к хорошо известным механизмам действия на клетки головного мозга (подавление активности потенциалзависимых натриевых каналов, изменение активности кальциевых каналов), обладает ингибиторным эффектом в отношении НАД+-зависимых деацетилаз (сиртуинов), весьма интригующе предположить, что общность некоторых механизмов повреждения мозга при действии вальпроевой кислоты и при развитии хронической нейродегенерации может быть обусловлена однонаправленными изменениями механизмов поддержания гомеостаза НАД + в клетках нейрональной и глиальной природы, однако эта гипотеза нуждается в 206 дальнейшем изучении. В целом, полученные нами результаты позволяют дополнить существующую концепцию патогенеза ишемического повреждения головного мозга и хронической нейродегенерации (экспериментальная болезнь Паркинсона), что отражено в представленных схемах на рисунках 7-10. Ведущими звеньями патогенеза острой нейродегенерации на примере ишемии головного мозга являются связанные со снижением мозгового кровотока развитие гипоксии, цитотоксического отека вследствие глутаматной эксайтотоксичности и цитотоксичности, активация астроглии, развитие нейровоспаления, снижение активности АДФР-циклазы при уменьшении концентрации субстрата НАД+, снижение функциональной активности клеток, дисфункция нейрон-астроглиальных взаимодействий. В то же время, обнаружены общие механизмы патогенеза острой и хронической нейродегенерации на примере болезни Паркинсона и ишемии головного мозга, маркирующие вторичное повреждение (повышение экспрессии Р2Х7 рецепторов, CD38, CD157, коннексина 43, Mac-1, C3/C3b, увеличение концентрации лактата, интенсификация апоптоза) или потенциальную нейропротекцию (усиление нейрогенеза, увеличение экспрессии Pgp). Выявленные особенности патогенеза острой и хронической нейродегенерации позволят сделать важнейший вклад в области персонифицированной нейродегенерации. диагностики, терапии и профилактики Рисунок 7 – Патогенез болезни Паркинсона 207 Рисунок 8 – Участие НАД+-зависимых механизмов в нейрон-глиальных взаимодействиях в клетках нейроваскулярной единицы при болезни Паркинсона 208 Рисунок 9 – Патогенез ишемии головного мозга 209 Рисунок 10 – Участие НАД+-зависимых механизмов в нейрон-глиальных взаимодействиях в клетках нейроваскулярной единицы при ишемии головного мозга 210 211 ВЫВОДЫ 1. У животных с острой и хронической нейродегенерацией изменяются НАД+зависимые механизмы внутриклеточной сигнализации и межклеточных взаимодействий: усиливается экспрессия Р2Х7 рецепторов (увеличение Р2Х7+ клеток в среднем мозге в 26 раз – гиперэкспрессия Р2Х7 рецепторов при БП; при ишемии головного мозга – в 2-4 раза через 24-48 часов) и CD38/НАД+-гликогидролазы (в 4 раза увеличилось количество CD38+ клеток при БП, в 2-4 раза – при ишемии головного мозга через 24-48 часов ее развития, в сравнении с контролем). Однако у животных с моделью ишемии головного мозга преимущественная локализация CD38 отмечается в астроцитах (9,9% через 24 часа с момента ее развития; 10,4% - через 48 часов), а с экспериментальной болезнью Паркинсона – в астроцитах (13,3%) и микроглии (13,1%). 2. При острой и хронической нейродегенерации в нейрон-астроглиальных взаимодействиях важную роль нейрометаболического посредника выполняет лактат (при БП повышение концентрации лактата до 60,6 мкг/мл, при ишемии – до 51,0 мкг/мл через 48 ч), а реализация НАД+-зависимых сигналов осуществляется посредством увеличения экспрессии CD38 и коннексина 43 на взаимодействующих клетках (более 56% коэкспрессирующих CD38 и коннексин 43 Cx43-позитивных клеток через 24, 53% - через 48 ч с момента развития ишемии; 76% CD38+/Cx43+ клеток при перинатальной гипоксии-ишемии и 84,3% при болезни Паркинсона); в нейрон-микроглиальных, астроцит-микроглиальных и лейкоцит-микроглиальных взаимодействиях ведущую роль выполняют CD157, комплекс Mac-1 и его лиганд C3/C3b (повышение количества CD157/Mac-1-коэкспрессирующих клеток в в 3 раза и C3/C3b+ клеток в 2,5 раза при БП; динамическое увеличение CD157+/Mac-1+ клеток в 2,5 раза через 24 и в 3,4 раза через 48 ч, С3/С3b+ клеток – в 2,7 раз через 24 ч, в 4,5 раза через 48 ч при ишемии). 3. В патогенезе острой и хронической нейродегенерации интенсифицируется апоптоз клеток ЦНС (в 2,2 раза увеличивается количество TUNEL+ клеток при БП, в 6,1 раз – через 24 часа с момента развития ишемии, в 4,1 раза – через 48 часов; в 1,4 раза – в модели ПГИ), коррелирующий с развитием нейровоспаления 212 (гиперэкспрессия CD157/CD11b/CD18; r= -0,74 при БП; r= 0,94 через 48 ч при ишемии), метаболических нарушений (увеличение концентрации лактата в ткани; r= 0,99* через 24 ч при ишемии), гиперэкспрессией НАД+- и АТФ- рецептирующих молекул на мембранах взаимодействующих клеток (увеличение экспрессии CD38 на нейронах, r= 0,98 через 24 ч при ишемии), активности АДФР-циклазы (r= 0,78 через 48 ч при ишемии), экспрессии Р2Х7 рецепторов (r= -0,91 через 48 ч при ишемии). 4. При развитии острой и хронической нейродегенерации усиливается нейрогенез на ранних этапах в гиппокампе (увеличение Pax6+ клеток в 2 раза через 24 и 48 часов) и коре головного мозга (увеличение Pax6+ клеток в 4 раза через 24 и 48 часов) при ишемии, усиливаются нейрогенез (увеличение Pax6+ клеток в 5 раз) и экспрессия белка-транспортера P-гликопротеина в 3,1 раза в среднем мозге – при экспериментальной болезни Паркинсона. 5. При острой и хронической нейродегенерации изменения АДФР-циклазной и функциональной активности клеток поврежденной области мозга носят разнонаправленный характер: при ишемии головного мозга через 24 ч (АДФР-циклаза – в 10,5 раз; функциональная – в 4 раза) и 48 ч (АДФР-циклаза – в 48 раз; функциональная – в 4 раза) они снижаются; при хронической нейродегенерации – обе активности увеличиваются в 2 раза. 6. В патогенезе острой и хронической нейродегенерации нарушение интегративных функций мозга, проявляющееся в виде когнитивной дисфункции при болезни Паркинсона и ишемии головного мозга, нарушений социального и эмоционального поведения при болезни Паркинсона (в том числе и при пренатальном действиии вальпроевой кислоты как индуктора нарушения развития мозга с проявлением аутистического паттерна поведения) коррелирует с уровнем экспрессии CD38 нейронах среднего мозга при экспериментальной болезни Паркинсона (r= -0,44 с эмоциональным поведением крыс в приподнятом крестообразном лабиринте), с уровнем экспрессии CD38 и Cx43 в астроцитах и уровнем НАД+ в коре головного мозга при острой ишемии (корреляция когнитивной дисфункци с: экспрессией CD38 – r= -0,82, экспрессией Cx43 – r= -0,99**, уровнем НАД+ - r= -0,8 [через 24 часа 213 развития ишемии], экспрессией CD38 – r= 0,99**, экспрессией Cx43 – r= 0,44, уровнем НАД+ - r= 0,83 [через 48 часов развития ишемии]). 7. Теория нейропротективной стратегии и этиопатогенетической терапии острой и хронической нейродегенерации, базирующаяся на направленной модуляции экспрессии и активности НАД+-зависимых механизмов реализации нейрон-глиальных взаимодействий, патогенетически обоснована: CD38, нуклеотидные рецепторы Р2Х7 подтипа и НАД(Ф)Н-оксидаза клеток микроглии могут использоваться как потенциальные молекулы-мишени, в качестве модуляторов активности которых эффективны 100 мкМ оАТФ (для изменения активности Р2Х7 рецепторов, АДФрибозилциклазы клеток коры головного мозга при ишемии и функциональной активности клеток среднего мозга в физиологических условиях), 1 мМ АТФ и НАД+ (для изменения функциональной активности клеток коры при ишемии и АДФрибозилциклазы среднего мозга при БП), 10 мкМ DPI (для модуляции функциональной активности клеток коры головного мозга при ишемии и среднего мозга в норме и при БП) in vitro. 214 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Нуклеотидные Р2Х7-рецепторы, АДФ-рибозилциклаза/CD38 и НАД(Ф)Н- оксидаза клеток головного мозга являются молекулами-мишенями для направленной регуляции функциональной активности клеток нейрональной и глиальной природы. При экспериментальной ишемии головного мозга и хронической нейродегенерации in vitro рекомендуется использовать в качестве модуляторов активности этих молекулмишеней АТФ, оАТФ, НАД+ и DPI. 2. В экспериментальных исследованиях рекомендуется к применению метод регистрации кинетики аутофлуоресцении клеток головного мозга in vitro, позволяющий охарактеризовать функциональную активность, контролируемую НАД(Ф)Н- зависимыми механизмами. 3. Оценка экспрессии CD38, Cx43, P2X7, CD157, CD11b/CD18, C3/C3b в очаге повреждения при острой ишемии головного мозга или хронической нейродегенерации рекомендуется к использованию для характеристики нарушения нейрон-астроглиальных и нейрон-микроглиальных взаимодействий. 4. Дифференциация НАД+-зависимых механизмов при острой и хронической нейродегенерации может быть основана на оценке характера экспрессии и активности CD38/CD157 на клетках нейрональной или глиальной природы. 215 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АДФР – аденозиндифосфатрибоза; АТ(Д,М)Ф – аденозинтри(ди, моно)фосфат; АФК(А) – активные формы кислорода(азота); БП – болезнь Паркинсона; БТШ – белки теплового шока/шапероны; В(Г)ДА – вертикальная(горизонтальная) двигательная активность; ГАМК – гамма-аминомасляная кислота; ГБОУ ВПО – государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования; ГМ – гладкая мускулатура; ГТФ – гуанозинтрифосфат; ГЭБ – гематоэнцефалический барьер; ДМСО – диметилсульфоксид; ИЛ – интерлейкин; ИФН – интереферон; К1-6/НК/ПК – группы контроля; НААДФ+ – адениндинуклеотидфосфат никотиновой кислоты; НАД(Ф)Н – никотинамидадениндинуклеотид(фосфат); НВЕ – нейро-васкулярная единица; оАТФ – аденозинтрифосфат, окисленная форма; ОНМК – острое нарушение мозгового кровообращения; ОСА – общая сонная артерия; ОТ – окситоцин; отн. ед. – относительные единицы; ПГИ – перинатальная гипоксия-ишемия; ПЙ – пропидия йодид; ПКЛ – приподнятый крестообразный лабиринт; ПЭГ – полиэтиленгликоль; 216 Р(E)1-17 – дни постнатального(эмбрионального) развития; Р(Д)НК – (дезокси)рибонуклеиновая кислота; СМ – скелетная мускулатура; СМА – средняя мозговая артерия; УТФ – уридинтрифосфат; цА(Г)ДФР – циклическая аденозин(гуанин)дифосфат-рибоза; ЦНС – центральная нервная система; Э1-5/ЭГ – экспериментальные группы; ЭПР – эндоплазматический ретикулум; (i)NOS – (inducible) nitric oxide synthase/(индуцибельная) синтаза оксида азота; (m)ART/АРТ – (mono) ADP-ribosyl transferase (моно)АДФрибозилтрансфераза; 6-OHDA – 6-hydroxydopamin/6-гидроксидофамин; ANLSH – astrocyte-neuron lactate shuttle hypothesis/лактат-челночная гипотеза взаимодействия астроцит-нейрон; BDNF – brain-derived neurotrophic factor/ нейротрофический фактор мозга; BST – bone marrow stromal cell antigen/антиген клеток костной стромы/CD157/АДФР-циклаза 2 типа; C3/C3b – C3/C3b компонент системы комплемента; Ca2+ – ионы кальция; CD – cluster of differentiation/кластер дифференцировки; CICR – calcium induced calcium release/кальций-индуцированное высвобождение кальция; CNTF – ciliary neurotrophic factor/цилиарный нейротрофический фактор; COX – cyclooxygenase/циклооксигеназа; Cx – connexin/коннексин; 217 DPI – дифениленйодониум; FITC/ФИТЦ – fluorescein isothiocyanate (флюоресцеинизотиоционат); GFAP – glial fibrillary acidic protein/глиальный фибриллярный кислый белок; HLA/MHC – major histocompatibility complex/главный комплекс гистосовместимости; Inx – innexin/иннексин; IP3/ИТФ – inositol triphosphate/инозитолтрифосфат; ISOL – in situ oligo ligation/связывание «на месте»/метод детекции апоптоза; LDLR – low-density lipoprotein receptor/ рецептор липопротеинов низкой плотности; L-DOPA – L-3,4-dihydroxyphenylalanine/ левовращающий изомер диоксифенилаланина; Mac-1 – macrophage-1 antigen/макрофагальный антиген 1 типа; MAP2 – microtubule-associated protein 2/микротрубочкиассоциированный белок 2 типа; MCP – monocyte chemotactic protein/фактор хемотаксиса моноцитов; MIP – macrophage inflammatory protein/макрофагальный воспалительный белок; MPP+ – 1-methyl-4-phenylpyridinium/ 1-метил-4-фенилпиридин; MPTP – 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine/ 1-метил-4фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин NGD+/НГД+ – nicotinamide guanine dinucleotide/никотинамидгуаниндинуклеотид; NMDA – N-methyl-D-aspartic acid/ N-метил-D-аспартат; NO – оксид азота; NOX – NAD(P)H oxidase/НАД(Ф)Н-оксидаза; 218 NSCs – neural stem cells/нейрональные предшественники/ нейрональные стволовые клетки; NSE – neuron specific enolase/нейрон-специфическая енолаза; NSS – neurological score system/шкала оценки неврологического дефицита; P2X(Y) – нуклеотидные рецепторы P2X(Y) подтипа; Panx – pannexin/паннексин; PARP/ПАРП – poly (ADP-ribose) polymerase/поли-АДФ-рибозаполимераза; PAX6 – paired box protein/белок аниридии II типа/окулоромбин; PBS – phosphate buffered saline/фосфатно-солевой буфер; PG/ПГ – prostaglandins.простагландины; Pgp – P-glycoprotein/Р-гликопротеин; RyR – ryanodine receptor/рианодиновый рецептор; SGZ – subgranular zone/субгранулярная зона; SIRT – silent information regulator/регулятор замалчивания информации/сиртуин; SVZ – subventricular zone/субвентрикулярная зона; TdT – terminal deoxynucleotidyl transferase/терминальная дезоксиуридин-трансфераза; TH/ТГ – tyrosine hydroxylase/тирозингидроксилаза; TNFa/ФНО-α – tumor necrosis factor-alpha/альфа-фактор некроза опухоли; TUNEL – TdT-mediated dUPT nick end labeling; WGS – whole goat serum/инактивированная козья сыворотка. 219 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Амикишиева, А. В. Поведенческое фенотипирование: современные методы и оборудование / А. В. Амикишиева // Информац. Вестн. ВОГиС. – 2009. – № 3. – С. 529-542. 2. Андрийчук, М. В. Методические указания: методика клинического обследования неврологических больных : метод. пособие [Электронный ресурс] / М. В. Андрийчук. – Арзамас, 1999. – Режим доступа : http://works.tarefer.ru/51/101727/index.html. (дата обращения: 30.08.2013). 3. Воронина, Т. А. Экспериментальное изучение препаратов с противопаркинсонической активностью [Электронный ресурс] / Т. А. Воронина, Е. А. Вальдман, Л. Н. Неробкова // Ведомости Научного центра экспертизы и государственного контроля ЛС. – 1999. – № 1. – Режим доступа : http://www.drugreg.ru/Doc/Vedomosti/0999-1/Vedomosti0999-1_4-3.htm. (дата обращения: 30.08.2013). 4. Гаврилова, С. И. Эпидемиологические и фармакоэкономические аспекты болезни Альцгеймера / С. И. Гаврилова, Я. Б. Калын // Психотерапия. – 2008. – № 4-6. – С. 7-12. 5. Гайдышев, И. Анализ и обработка данных: спец. справочник / И. Гайдышев. – СПб. : Питер, 2001. – 752 с. 6. Гематоэнцефалический барьер открыт / Н. И. Гольдштейн, Р. Гольдштейн, Д. Тертеров и др. // Биохимия. – 2012. – Вып. 5. – С. 525-532. 7. Гореликов, П. Л. Возможное участие лактата в нейрон-глиальном взаимодействии через Н-холинергические синапсы в краниальном шейном симпатическом ганглии / П. Л. Гореликов, С. В. Савельев // Бюл. эксперим. биологии и медицины. – 2006. – № 11. – С. 573-575. 8. Гудков, А. Б. Особенности постурального баланса у пожилых мужчин в условиях разной освещенности [Электронный ресурс] / А. Б. Гудков, А. В. Дёмин // Medline.ru. – 2011. – Т. 12. Геронтология. – С. 864-872. – Режим доступа : 30.08.2013). http://www.medline.ru/public/pdf/12_072.pdf. (дата обращения: 220 9. Гусев, Е. И. Ишемия головного мозга / Е. И. Гусев, В. И. Скворцова. – М. : Медицина, 2001. – 328 с. 10. Гусев, Н. Б. Внутриклеточные Са-связывающие белки. Часть 2. Структура и механизм функционирования / Н. Б. Гусев // Соросовский образовательный журн. – 1998. – № 5. – С. 10-16. 11. Депрессивные расстройства в общемедицинской практике по данным исследования КОМПАС: взгляд кардиолога / Р. Г. Оганов, Г. В. Погосова, С. А. Шальнова, А. Д. Деев // Кардиология. – 2005. – № 8. – С. 38-44. 12. Драпкина, О. М. Роль шаперонов в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний и кардиопротекции / О. М. Драпкина, Я. И. Ашихмин, В. Т. Ивашкин // Рос. мед. вести. – 2008. – № 1. – С. 56-69. 13. Жарков, А. В. Оценка двигательных функций тазовых конечностей у крыс с контузионной травмой спинного мозга : автореф. дис. … канд. вет. наук : 16.00.05 / Жарков Александр Владимирович. – М., 2008. – 19 с. 14. Зиганшин, А. У. Роль рецепторов АТФ (Р2-рецепторов) в нервной системе / А. У. Зиганшин // Неврол. вестн. – 2005. – Вып. 1-2. – С. 45-53. 15. Значение маркеров прогрессии при остеосаркомах у детей / А. В. Андрианов, А. В. Моргун, Т. Е. Таранушенко, А. Б. Салмина // Сиб. онкол. журн. – 2008. – № 5. – С. 37-40. 16. Зубов, А. Н. Исследование механизма изменений мембранного потенциала перитонеальных макрофагов при экстраклеточном действии АТФ / А. Н. Зубов, Л. Н. Писарева // Информац. бюл. РФФИ. – 1996. – № 4. – С. 300. 17. Изменение активности АДФ-рибозилциклазы в клетках нервной системы коррелирует с развитием постишемической когнитивной дисфункции / А. Б. Салмина, Н. А. Шнайдер, С. В. Михуткина и др. // Междунар. неврол. журн. – 2007. – № 1. – С. 71-78. 18. природы Изменение экспрессии и активности CD38 в клетках астроглиальной при перинатальном нарушениях нейрон-глиальных гипоксически-ишемическом взаимодействий поражении головного при мозга 221 / А. Б. Салмина, О. С. Окунева, Н. А. Малиновская и др. // Нейрохимия. – 2009. – № 3. – С. 237-244. 19. кальция Ионные каналы, обеспечивающие рецептор-зависимый вход ионов через плазматическую мембрану в невозбудимых клетках / Г. Н. Можаева, В. А. Алексеенко, Е. В. Казначеева и др. // Информац. бюл. РФФИ. – 1996. – № 4. – С. 299. 20. Кальций-зависимые механизмы регуляции систем преобразования энергии в митохондриях нормальных и опухолевых клеток / Ю. В. Евтодиенко, В. С. Сотникова, В. В. Теплова, С. С. Сидаш // Информац. бюл. РФФИ. – 1994. – № 4. – С. 76. 21. действия Касаткин, Д. С. Нейроваскулярная единица как точка приложения некоторых вазоактивных и нейропротекторных препаратов / Д. С. Касаткин // Здоровье Украины. – 2012. – № 20. – С. 38-39. 22. Килимчук, В. Болезнь Паркинсона: патогенез заболевания и основные принципы лечения / В. Килимчук // Здоровье Украины. – 2011. – № 4. – С. 29. 23. течение Костычев, Н. А. Влияние производных 3-гидроксипиридина на ишемического инсульта у белых крыс / Н. А. Костычев, А. Б. Коршунова // Неврол. вестн. – 2010. – Вып. 2. – С. 19-22. 24. Креатин эффективен для профилактики неврологических и когнитивных нарушений, вызванных глобальной ишемией головного мозга у крыс / В. О. Муровец, М. В. Ленцман, А. И. Артемьева и др. // Нейронауки. – 2006. – № 1. – С. 20-24. 25. Кудрявцева, Н. Н. Молекулярные механизмы социального поведения: комментарии к статье Bertonetal., 2006 / Н. Н. Кудрявцева, Д. Ф. Августинович // Нейронауки. – 2006. – № 4. – С. 33-35. 26. Леушкина, Н. Ф. Характеристика поведения крыс, различающихся по генотипу локуса TAG 1A гена рецептора дофамина второго типа, в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» / Н. Ф. Леушкина, А. В. Ахмадеев, Л. Б. Калимуллина // Фундам. исслед. – 2010. – № 1. – С. 65-69. 222 27. Люминесцентный анализ в гастроэнтерологии / В. А. Лисовский, В. В. Щедрунов, И. Я. Барский и др. – Л. : Наука, 1984. – 236 с. 28. Малиновская, Н. А. Роль Р2Х7-рецепторов и НАД+-гликогидролазы в модуляции функциональной активности перитонеальных макрофагов при остром перитоните : автореф. дис. … канд. мед. наук : 14.00.16 / Малиновская Наталия Александровна. – Томск, 2008. – 24 с. 29. Матвеев, А. Г. Феномен цитотоксичности и механизмы повреждения нейронов новой коры при гипоксии и ишемии / А. Г. Матвеев // Тихоокеан. мед. журн. – 2004. – № 2. – С. 18-23. 30. Мельник, С. А. Изменение обонятельной чувствительности послеэкспериментальной цинковой аносмии и выдерживания в атмосфере камфары / С. А. Мельник, Е. В. Челогузова, В. Т. Троицкая // Вестн. Нижегор. ун-та им. Н. И. Лобачевского. Сер. : биология. – 2001. – № 1. – С. 147-150. 31. Модуляция функциональной активности нейтрофилов лигандами периферических бензодиазепиновых рецепторов / Т. Г. Рукша, В. И. Прохоренков, А. Б. Салмина, А. А. Савченко // Бюл. Сибирского отделения Российской академии медицинских наук. – 2004. – № 1. – С. 89-91. 32. Модуляция экспрессии CD38 в клетках головного мозга ретиноевой кислотой / А. Б. Салмина, Н. А. Малиновская, О. С. Окунева и др. // Сиб. мед. обозрение. – 2009. – № 1. – С. 22-26. 33. Молекулярные механизмы нарушения развития мозга в пре- и неонатальном периоде / А. Б. Салмина, Ю. К. Комлева, Н. В. Кувачева и др. // Вопр. соврем. педиатрии. – 2012. – № 6. – С. 15-20. 34. Моргун, А. В. Значение уровня экспрессии Р-гликопротеина при остеосаркомах у детей / А. В. Моргун, Т. Е. Таранушенко, А. Б. Салмина // Врачаспирант. – 2006. – № 15. – С. 519-524. 35. Моргун, А. В. Основные функции гематоэнцефалического барьера / А. В. Моргун // Сиб. мед. журн. – 2012. – № 2. – С. 5-8. 223 36. Моргун, А. В. Прогностическая значимость Р-гликопротеина в развитии химиорезистентности при онкологических заболеваниях / А. В. Моргун // Сиб. мед. журн. – 2007. – № 3. – С. 12-16. 37. Москалев, биомедицинских А. А. XIII геронтологов конгресс «Общие международной механизмы ассоциации старения, рака и возрастзависимых заболеваний» / А. А. Москалев // Вестн. Института биологии Коми НЦ УрО РАН. – 2009. – № 9. – С. 34-37. 38. НАД+-конвертирующие ферменты в клетках нейрональной и глиальной природы:СD38 как новая молекула-мишень для нейропротекции / А. Б. Салмина, А. И. Инжутова, А. В. Моргун и др. // Вестн. РАМН. – 2012. – № 10. – С. 29-37. 39. Нарушения метаболизма НАД + в нейрональной дисфункции при критических состояниях / А. Б. Салмина, А. А. Фурсов, С. В. Михуткина и др. // Общая реаниматология. – 2008. – № 1. – С. 80-84. 40. Особенности противопаркинсонического действия мексидола в эксперименте при моделировании паркинсонического синдрома и в клинике у пациентов болезнью Паркинсона [Электронный ресурс] / Т. А. Воронина, Г. Н. Авакян, О. А. Попова и др. // Нейрохирургия и Неврология Казахстана. – 2008. – Режим доступа : http://medi.ru/doc/a070102.htm. (дата обращения: 30.08.2013). 41. Патогенетическая гематоэнцефалического барьера роль для нарушения нейроспецифических проницаемости белков при перинатальных гипоксически-ишемических поражениях центральной нервной системы у новорожденных / В. П. Чехонин, С. В. Лебедев, Д. В. Блинов и др. // Вопр. гинекологии, акушерства и перинатологии. – 2004. – № 2. – С. 50-61. 42. Перинатальное гипоксически-ишемическое поражение центральной нервной системы вызывает изменение экспрессии коннексина 43, CD38 и активности АДФ-рибозилциклазы в клетках головного мозга / А. Б. Салмина, Н. А. Малиновская, О. С. Окунева и др. // Бюл. эксперим. биологии и медицины. – 2008. – № 12. – С. 641-645. 224 43. Пискунов, А. К. Биомаркеры нейровоспаления / А. К. Пискунов // Нейрохимия. – 2010. – № 1. – С. 63-73. 44. Подольский, И. Я. Навигационное научение и формирование долговременной пространственной памяти [Электронный ресурс] / И. Я. Подольский, А. А. Лебединский, А. А. Деев // Когнитивная наука: материалы первой Всерос. конф. – Казань, 2004. – Режим доступа : http://old.kpfu.ru/ss/cogsci04/science/cogsci04/sod.php3 (дата обращения: 30.08.2013). 45. Проницаемость гематоэнцефалического барьера в норме и при нарушениях развития головного мозга и нейродегенерации / Н. В. Кувачева, А. Б. Салмина, Ю. К. Комлева и др. // Журн. неврологии и психиатрии им. С. С. Корсакова. – 2013. – № 4. – С. 80-85. 46. Развитие апоптоза и изменение активности АДФ-рибозилциклазы при ишемическом повреждении головного мозга / А. Б. Салмина, А. А. Фурсов, С. В. Михуткина и др. // Сиб. мед. обозрение. – 2006. – № 4. – С. 22-27. 47. Резников, М. К. Использование рисперидона при детском аутизме [Электронный ресурс] / М. К. Резников, Д. Н. Припутневич // Науч.-мед. вестн. Центрального Черноземья. – – 2010. № 41. – Режим доступа : http://www.vsma.ac.ru/publ/vest/041/site/index.html. (дата обращения: 30.08.2013). 48. Рокитский, П. Ф. Биологическая статистика / П. Ф. Рокитский. – Минск : Высшая школа, 1973. – 320 с. 49. Роль нейрон-астроглиальных взаимодействий в дизрегуляции энергетического метаболизма при ишемическом перинатальном поражении головного мозга / А. Б. Салмина, О. С. Окунева, Т. Е. Таранушенко и др. // Анналы клинич. и эксперим. неврологии. – 2008. – № 3. – С. 44-51. 50. Рубин, Б. А. Большой практикум по физиологии растений / Б. А. Рубин. – М. : Высшая школа, 1978. – 408 c. 51. Садоха, К. А. Болезнь Паркинсона: некоторые аспекты патогенеза и эффективное лечение [Электронный ресурс] / К. А. Садоха, Е. В. Мазуренко 225 // Мед. новости. – 2012. – № 10. – Режим доступа : http://www.mednovosti.by/journal.aspx?article=5385 (дата обращения: 30.08.2013). 52. Современные экспериментальные модели депрессии / Н. А. Яузина, Ю. К. Комлева, А. Б. Салмина и др. // Биомедицина. – 2013. – № 1. – С. 61-71. 53. Степанченко, Н. С. Применение метода «Открытое поле» в токсикологических экспериментах [Электронный ресурс] / Н. С. Степанченко, А. В. Лесникова // IV Международная студенческая электронная научная конференция "Студенческий научный форум 2012". – 2012. – Режим доступа : http://www.rae.ru/forum2012/pdf/1512.pdf (дата обращения: 30.08.2013). 54. Структура когнитивных нарушений на разных стадиях болезни Паркинсона [Электронный ресурс] / И. В. Литвиненко, М. М. Одинак, А. В. Шатова, О. С. Сологуб. – Режим доступа : http://parkinson.spb.ru/parkinsons2.pdf. (дата обращения: 30.08.2013). 55. Суслина, З. А. Подтипы ишемических нарушений мозгового кровообращения: диагностика и лечение / З. А. Суслина, Н. В. Верещагин, М. А. Пирадов // Consilium medicum. – 2001. – № 5. – С. 218-221. 56. Тювина, Н. А. Современные представления о патогенезе депрессии и подходы к антидепрессивной терапии (обзор литературы) / Н. А. Тювина // Психиатрия и психофармакотерапия. – 2009. – № 4. – С. 35-38. 57. Уровни белков нейрональной и глиальной природы в крови новорожденных при церебральной ишемии / Т. Е. Таранушенко, О. С. Окунева, И. М. Демьянова и др. // Педиатрия. – 2010. – № 1. – С. 25-31. 58. Физиологические тесты (анксиолитический, адаптогенный, актопротекторный эффекты) [Электронный ресурс] // Институт фармации. – Режим доступа : http://www.ipharm.sp.ru/farm%20m_fiziolog.%20testy.htm. (дата обращения: 30.08.2013). 59. Челышев, Ю. А. Глиальные NG2-клетки в нейроонтогенезе и регенерации / Ю. А. Челышев, Г. Ф. Шаймарданова // Невролог. вестн. – 2010. – Вып. 4. – С. 84-90. 226 60. Шакина, Л. Д. Биомаркеры перинатальной гипоксии / Л. Д. Шакина, И. Е. Смирнов // Молекулярная медицина. – 2010. – № 3. – С. 19-28. 61. Шамионов, Р. М. Субъективное благополучие личности: психологическая картина и факторы / Р. М. Шамионов. – Саратов : Изд-во Сарат. ун-та, 2008. – 294 с. 62. Шапиро, Л. А. Руководство к практическим занятиям по медицинской и биологической статистике / Л. А. Шапиро, Н. Г. Шилина. – Красноярск : Поликом, 2003. – 93 с. 63. Шварц, П. Г. Нарушения акта мочеиспускания при заболеваниях головного мозга [Электронный ресурс] / П. Г. Шварц, В. В. Брюхов // Рус. мед. журн. – 2002. – Режим доступа : http://www.rmj.ru/articles_6345.htm. (дата обращения: 30.08.2013). 64. Экспериментальное моделирование перинатального гипоксически- ишемического поражения мозга / В. П. Чехонин, С. В. Лебедев, Н. Н. Володин и др. // Вопр. гинекологии, акушерства и перинатологии. – 2002. – № 2. – С. 9-16. 65. Экспрессия Р-гликопротеина на лимфоцитах периферической крови при тяжелых формах бронхиальной астмы и его роль в определении чувствительности к терапии глюкокортикостероидам / И. В. Демко, А. Б. Салмина, А. В. Моргун, Н. А. Малиновская // Пульмонология. – 2007. – № 3. – С. 41-46. 66. ноопепта Эффективность на ноотропного стрептозоциновой модели и нейропротекторного болезни Альцгеймера дипептида у крыс / Р. У. Островская, Ю. В. Вахитова, Р. С. Ямиданов и др. // Эксперим. и клинич. фармакология. – 2010. – № 1. – С. 2-6. 67. Якушева, Е. Н. Дозозависимое влияние тироксина на функциональную активность гликопротеина-Р в эксперименте / Е. Н. Якушева, А. В. Щулькин, А. С. Бирюкова // Биомедицина. – 2012. – № 2. – C. 53-60. 68. Ярыгин, К. Н. Нейрогенез в центральной нервной системе и перспективы регенеративной неврологии / К. Н. Ярыгин, В. Н. Ярыгин // Журн. неврологии и психиатрии. – 2012. – № 1. – С. 4-13. 227 69. A novel brain neurovascular unit model with neurons, astrocytes and microvascular endothelial cells of rat / Q. Xue, Y. Liu, H. Qi et al. // Int. J. Biol. Sci. – 2013. – Vol. 9, № 2. – P. 174-189. 70. A role for Mac-1 (CDIIb/CD18) in immune complex-stimulated neutrophil function in vivo: Mac-1 deficiency abrogates sustained Fcgamma receptordependent neutrophil adhesion and complement-dependent proteinuria in acute glomerulonephritis / T. Tang, A. Rosenkranz, K. J. Assmann et al. // J. Exp. Med. – 1997. – Vol. 186, № 11. – P. 1853-1863. 71. A self-restricted CD38-connexin 43 cross-talk affects NAD+ and cyclic ADP-ribose metabolism and regulates intracellular calcium in 3T3 fibroblasts / S. Bruzzone, L. Franco, L. Guida et al. // J. Biol. Chem. – 2001. – Vol. 276, № 51. – P. 48300-48308. 72. Abbott, N. J. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier / N. J. Abbott, L. Ronnback, E. Hansson // Nat. Rev. Neurosci. – 2006. – Vol. 7. – P. 41-53. 73. barrier Absence of glial α-dystrobrevin causes abnormalities of the blood-brain and progressive brain edema / C. F. Lien, S. K. Mohanta, M. Frontczak-Baniewicz et al. // J. Biol. Chem. – 2012. – Vol. 287, № 49. – P. 4137441385. 74. Absence of the P2X7 receptor alters leukocyte function and attenuates an inflammatory response / J. M. Labasi, N. Petrushova, C. Donovan et al. // J. Immunol. – 2002. – Vol. 168, № 12. – P. 6436-6445. 75. Accelerated calcium influx and hyperactivation of neutrophils in chronic granulomatous disease / G. R. Tintinger, A. J. Theron, H. C. Steel, R. Anderson // Clin. Exp. Immunol. – 2001. – Vol. 123, № 2. – P. 254-263. 76. Activated human T cells, B cells, and monocytes produce brain-derived neurotrophic factor in vitro and in inflammatory brain lesions: a neuroprotective role of inflammation? / M. Kerschensteiner, E. Gallmeier, L. Behrens et al. // J. Exp. Med. – 1999. – Vol. 189, № 5. – P. 865-870. 228 77. ADHD and autism: differential diagnosis or overlapping traits? A selective review / R. Taurines, C. Schwenck, E. Westerwald et al. // Atten. Defic. Hyperact. Disord. – 2012. – Vol. 4, № 3. – P. 115-139. 78. ADP-ribosylation of membrane proteins: Unveiling the secrets of a crucial regulatory mechanism in mammalian cells / F. K. Nolte, S. Adriouch, P. Bannas et al. // Ann. Med. – 2006. – Vol. 38, № 3. – P. 188-199. 79. Age-related changes in membrane lipid composition, fluidity and respiratory burst in rat peritoneal neutrophils / E. Alvarez, V. Ruiz-Gutierrez, F. Sobrino, C. Santa-Maria // Clin. Exp. Immunol. – 2001. – Vol. 124, № 1. – P. 95102. 80. Alano, C. C. Poly(ADP-ribose)polymerase-1-mediated cell death in astrocytes requires NAD+ depletion and mitochondrial permeability transition / C. C. Alano, W. Ying, R. A. Swanson // J. Biol. Chem. – 2004. – Vol. 279, Iss. 18. – P. 18895-18902. 81. Aldskogius, H. K. Central neuron-glial and glial-glial interactions following axon injury / H. K. Aldskogius, E. N. Kozlova // Prog. Neurobiol. – 1998. – Vol. 55. – P. 1-26. 82. biomarkers Alteration of neuron-glia interactions in neurodegeneration: molecular and therapeutic strategy / A. B. Salmina, M. M. Petrova, T. E. Taranushenko et al. // Neurodegenerative diseases: processes, prevention, protection and monitoring / ed. R. C.-C. Chang. – Rijeka : InTech, 2011. – P. 273-300. 83. Alterations in glutathione levels in Parkinson’s disease and other neurodegenerative disorders affecting basal ganglia / J. Sian, D. T. Dexter, A. J. Lees et al. // Ann. Neurol. – 1994. – Vol. 36. – P. 348-355. 84. Amyloid-Independent Mechanisms in Alzheimer’s Disease Pathogenesis / S. W. Pimplikar, R. A. Nixon, N. K. Robakis et al. // J. Neurosci. – 2010. – Vol. 30, № 45. – P. 14946-14954. 85. Anderson, M. F. The effects of focal ischemia and reperfusion on the glutathione content of mitochondria from rat brain subregions / M. F. Anderson, N. R. Sims // J. Neurochem. – 2002. – Vol. 81, № 3. – P. 541-549. 229 86. Animal models of acute neurological injuries / eds. J. Chen, Z. C. Xu, X.-M. Xu, J. H. Zhang. – Totowa : Humana Press, 2009. – 498 p. 87. Animal neurotoxicologists models / A. of K. autism Halladay, spectrum D. disorders: Amaral, M. information Aschner et for al. // Neurotoxicology. – 2009. – Vol. 30, № 5. – P. 811-821. 88. Antigen presentation in the peripheral nervous system: Schwann cells present endogenous myelin autoantigens to lymphocytes / H. Wekerle, M. Schwab, C. Linington, R. Meyermann // Eur. J. Immunol. – 1986. – Vol. 16. – P. 1551-1557. 89. Antimicrobial actions of the NADPH phagocyte oxidase and inducible nitric oxide synthase in experimental salmonellosis. I. Effects on microbial killing by activated peritoneal macrophages in vitro / A. Vazquez-Torres, J. Jones-Carson, P. Mastroeni et al. // J. Exp. Med. – 2000. – Vol. 192, № 2. – P. 227-236. 90. Apoptosis has a prolonged role in the neurodegeneration after hypoxic ischemia in the newborn rat / W. Nakajima, A. Ishida, M. S. Lange et al. // J. Neurosci. – 2000. – Vol. 20, № 21. – P. 7994-8004. 91. Apoptosis in neonatal rat model of cerebral hypoxia-ischemia / M. R. Pulera, L. M. Adams, H. Liu et al. // Stroke. – 1998. – Vol. 29. – P. 26222630. 92. Araque, A. Glial cells in neuronal network function / A. Araque, M. Navarrete // Phil. Trans. R. Soc. B. – 2010. – Vol. 365. – P. 2375-2381. 93. Arias-Carrion, O. Basic mechanisms of rTMS: Implications in Parkinson's disease / O. Arias-Carrion // Int. Arch. Med. – 2008. – Vol. 1, № 1. – P. 1-8. 94. Astrocyte–neuron interactions in neurological disorders / G. Ricci, L. Volpi, L. Pasquali et al. // J. Biol. Phys. – 2009. – Vol. 35. – P. 317-336. 95. Astrocytes in Alzheimer's Disease / A. Verkhratsky, M. Olabarria, H. N. Noristani et al. // Neurotherapeutics. 2010. – Vol. 7, № 4. – P. 399-412. 96. Astrocytes protect neurons from nitric oxide toxicity by a glutathione- dependent mechanism / Y. Chen, N. E. Vartiainen, W. Ying et al. // J. Neurochem. – 2001. – Vol. 77, № 6. – P. 1601-1610. 230 97. Astroglial networks: a step further in neuroglial and gliovascular interactions / C. Giaume, A. Koulakoff, L. Roux et al. // Nat. Rev. Neurosci. – 2010. – Vol. 11, № 2. – P. 87-99. 98. ATP acts as an agonist to promote stimulus-induced secretion of IL-1 beta and IL-18 in human blood / D. G. Perregaux, P. McNiff, R. Laliberte et al. // J. Immunol. – 2000. – Vol. 165, № 8. – P. 4615-4623. 99. ATP-activated Ca(2+)-permeable channels in rat peritoneal macrophages / A. P. Naumov, Y. A. Kuryshev, E. V. Kaznacheyeva, G. N. Mozhayeva // FEBS. Lett. – 1992. – Vol. 313, № 3. – P. 285-287. 100. ATP-mediated killing of intracellular mycobacteria by macrophages is a P2X(7)-dependent process inducing bacterial death by phagosome-lysosome fusion / I. P. Fairbairn, C. B. Stober, D. S. Kumararatne, D. A. Lammasm // J. Immunol. – 2001. – Vol. 167. – P. 3300-3307. 101. ATP-stimulated Ca2+ influx and phospholipase D activities of a rat brainderived type-2 astrocyte cell line, RBA-2, are mediated through P2X7 receptors / S. H. Sun, L. B. Lin, A. C. Hung, J. S. Kuo // J. Neurochem. – 1999. – Vol. 73, № 1. – P. 334-343. 102. Attenuation of a delayed increase in the extracellular glutamate level in the peri-infarct area following focal cerebral ischemia by a novel agent ONO-2506 / T. Mori, N. Tateishi, Y. Kagamiishi et al. // Neurochem. Int. – 2004. – Vol. 45, № 2–3. – P. 381-387. 103. Bambrick, L. Astrocyte mitochondrial mechanisms of ischemic brain injury and neuroprotection / L. Bambrick, T. Kristian, G. Fiskum // Neurochem. Res. – 2004. – Vol. 29, № 3. – P. 601-608. 104. Banerjee, S. Neuron-glial interactions in blood-brain barrier formation / S. Banerjee, M. A. Bhat // Annu. Rev. Neurosci. – 2007. – Vol. 30. – P. 235-258. 105. Banks, W. A. The source of cerebral insulin / W. A. Banks // Eur. J. Pharmacol. – 2004. – Vol. 490, № 1-3. – Р. 5-12. 106. Baran, J. Fas (CD95)-Fas ligand interactions are responsible for monocyte apoptosis occurring as a result of phagocytosis and killing of Staphylococcus aureus 231 / J. Baran, K. Weglarczyk, M. Mysiak // Infect. Immun. – 2001. – Vol. 69, № 3. – P. 1287-1297. 107. Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease / B. A. Barres // Neuron. – 2008. – Vol. 60, № 3. – P. 430-440. 108. Begley, D. J. Delivery of therapeutic agents to the central nervous system: the problems and the possibilities / D. J. Begley // Pharmacol. Ther. – 2004. – Vol. 104, № 1. – Р. 29-45. 109. Bezzi, P. A neuron–glia signalling network in the active brain / P. Bezzi, A. Volterra // Curr. Opin. Neurobiol. – 2001. – Vol. 11. – P. 387–394. 110. Biomedical applications of proteomics / J. C. Sanchez, Y. Coute, L. Allard et al. // Proteome research – Concepts, technology and application. / eds. M. R. Wilkins, R. D. Appel, K. L. Williams, D. F. Hochstrasser. Berlin : Springer, 2007. – P. 193-221. 111. Blandini, F. Animal models of Parkinson’s disease / F. Blandini, M. T. Armentero // FEBS J. – 2012. – Vol. 279. – P. 1156–1166. 112. Blomgren, K. Pathological apoptosis in the developing brain / K. Blomgren, M. Leist, L. Groc // Apoptosis. – 2007. – Vol. 12, № 5. – P. 993-1010. 113. Blood-brain barrier glucose transporter: effects of hypo- and hyperglycemia revisited / I. A. Simpson, N. M. Appel, M. Hokari et al. // J. Neurochem. – 1999. – Vol. 72, № 1. – Р. 238-247. 114. Blood-brain barrier pathology in Alzheimer's and Parkinson's disease: implications for drug therapy / B. S. Desai, A. J. Monahan, P. M. Carvey, B. Hendey // Cell. Transplant. – 2007. – Vol. 16. – P. 285-299. 115. Bramlett, H. M. Pathophysiology of cerebral ischemia and brain trauma: similarities and differences / H. M. Bramlett, W. D. Dietrich // J. Cereb. Blood. Flow. Metab. – 2004. – Vol. 24, № 2. – P. 133-150. 116. Brini, M. Calcium signalling: a historical account, recent developments and future perspectives / M. Brini, E. Carafoli // Cell. Mol. Life Sci. – 2000. – Vol. 57, № 3. – P. 354-370. 232 117. Bronchial hyperresponsiveness: insights into new signaling molecules / Y. Amrani, O. Tliba, D. A. Deshpande et al. // Curr. Opin. Pharmacol. – 2004. – Vol. 4. – P. 230-234. 118. Burnstock, G. P2 Purinergic Receptors: Modulation of Cell Function and Therapeutic Potential / G. Burnstock, M. Williams // J. Pharmacol. Exp. Ther. – 2000. – Vol. 295, № 3. – P. 862-869. 119. Burnstock, G. Purinergic signaling and vascular cell proliferation and death / G. Burnstock // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. – 2002. – Vol. 223, № 1. – P. 364-373. 120. Burnstock, G. Purinergic signalling and disorders of the central nervous system / G. Burnstock // Nat. Rev. Drug Discov. – 2008. – Vol. 7. – P. 575-590. 121. Ca2+ stores and Ca2+ entry differentially contribute to the release of IL-1 beta and IL-1 alpha from murine macrophages / D. Brough, R. A. Le Feuvre, R. D. Wheeler et al. // J. Immunol. – 2003. – Vol. 170, № 6. – P. 3029-3036. 122. CD38 disruption impairs glucose-induced increases in cyclic ADP-ribose, [Ca2+]i, and insulin secretion / A. Kato, Y. Yamamoto, M. Fujimura et al. // J. Biol. Chem. – 1999. – Vol. 274. – P. 1869-1872. 123. CD38 expression and functional activities are up-regulated by IFNgamma on human monocytes and monocytic cell lines / T. Musso, S. Deaglio, L. Franco et al. // J. Leukoc. Biol. – 2001. – Vol. 69, № 4. – P. 605-612. 124. CD38/cyclic ADP-ribose signaling: role in the regulation of calcium homeostasis in airway smooth muscle / D. A. Deshpande, T. A. White, S. Dogan et al. // Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. – 2005. – Vol. 288, № 5. – P. L773- L788. 125. CD38/cyclic ADP-ribose-mediated Ca2+ signaling contributes to airway smooth muscle hyper-responsiveness / D. A. Deshpande, T. F. Walseth, R. A. Panettieri, M. S. Kannan // FASEB J. – 2003. – Vol. 17. – P. 452-454. 126. CD38-mediated ribosylation of proteins / J. C. Grimaldi, S. Balasubramanian, N. H. Kabra et al. // J. Immunol. – 1995. – Vol. 155, № 2. – P. 811-817. 233 127. Cellular localization and functional expression of P-glycoprotein in rat astrocyte cultures / P. T. Ronaldson, M. Bendayan, D. Gingras et al. // J. Neurochem. – 2004. – Vol. 3. – P. 788-800. 128. Cellular localization of P2X7 receptor mRNA in the rat brain / Y. Yu, S. Ugawa, T. Ueda et al. // Brain Res. – 2008. – Vol. 1194. – P. 45-55. 129. Cerebrospinal fluid secretory Ca2+-dependent phospholipase A2 activity: a biomarker of blood-cerebrospinal fluid barrier permeability / S. Chalbot, H. Zetterberg, K. Blennow et al. // Neurosci. Lett. – 2010. – Vol. 478, № 3. – P. 179183. 130. Chadwick, D. J. Purinergic signalling in neuron-glia interactions / eds. D. J. Chadwick, J. Goode. – Chichester : John Wiley & Sons, 2006. – 291 p. 131. Chen, Y. Modern methods for delivery of drugs across the blood–brain barrier / Y. Chen, L. Liu // Adv. Drug Deliv. Rev. – 2012. – Vol. 64. – P. 640-665. 132. Chessell, I. P. Effects of antagonists at the human recombinant P2X7 receptor / I. P. Chessell, A. D. Michel, P. P. Humphrey // Br. J. Pharmacol. – 1998. – Vol. 124, № 6. – P. 1314-1320. 133. Chiu, S. L. Insulin receptor signaling in the development of neuronal structure and function / S. L. Chiu, H. T. Cline // Neural. Dev. – 2010. – Vol. 15. – P. 5-7. 134. Chow, S. C. Purines and their roles in apoptosis / S. C. Chow, G. E. Kass, S. Orrenius // Neuropharmacol. – 1997. – Vol. 36, № 9. – P. 1149-1156. 135. Chronic systemic pesticide exposure reproduces features of Parkinson's disease / R. Betarbet, T. B. Sherer, G. MacKenzie et al. // Nat. Neurosci. – 2000. – Vol. 3, № 12. – P. 1301-1306. 136. Complement component C3 and complement receptor type 3 contribute to the phagocytosis and clearance of fibrillar Aβ by microglia / H. Fu, B. Liu, J. L. Frost et al. // Glia. – 2012. – Vol. 60, № 6. – P. 993-1003. 137. Compulsive, abnormal walking caused by anticholinergics in akinetic, 6hydroxydopamine-treated rats / T. Schallert, I. Q. Whishaw, V. D. Ramirez, P. Teitelbaum // Science. – 1978. – Vol. 199, № 4336. – P. 1461-1463. 234 138. Concise review: Pax6 transcription factor contributes to both embryonic and adult neurogenesis as a multifunctional regulator / N. Osumi, H. Shinohara, K. Numayama-Tsuruta, M. Maekawa // Stem Cells. – 2008. – Vol. 26, № 7. – P. 16631672. 139. Concise review: therapeutic strategies for Parkinson disease based on the modulation of adult neurogenesis / M. Geraerts, O. Krylyshkina, Z. Debyser, V. Baekelandt // Stem. Cells. – 2007. – Vol. 25, № 2. – P. 263-270. 140. Connexin 43 hemi channels mediate Ca2+-regulated transmembrane NAD+ fluxes in intact cells / S. Bruzzone, L. Guida, E. Zocchi et al. // FASEB J. – 2001. – Vol. 15, № 1. – P. 10-12. 141. Connexin-specific cell-to-cell transfer of short interfering RNA by gap junctions / V. Valiunas, Y. Y. Polosina, H. Miller et al. // J. Physiol. – 2005. – Vol. 568, Pt 2. – P. 459-468. 142. Corell, M. Neuron-glial interaction in the developing peripheral nervous system : doctoral thesis / Corell Micael. – Uppsala, 2011. – 63 p. 143. Cornford, E. M. Localization of brain endothelial luminal and abluminal transporters with immunogold electron microscopy / E. M. Cornford, S. Hyman // NeuroRx. – 2005. – Vol. 2. – P. 27-43. 144. Covey, M. Pathophysiology of perinatal hypoxia-ischemia and the prospects for repair from endogenous and exogenous stem cells : / M. V. Covey, S. W. Levison // Neoreviews. – 2006. – Vol. 7. – P. e353-e362. 145. Crews, L. Molecular mechanisms of neurodegeneration in Alzheimer’s disease / L. Crews, E. Masliah // Hum. Mol. Genet. – 2010. – Vol. 19(R1). – P. R12R20. 146. Cross-talk between neurons and glia: highlights on soluble factors / F. C. A. Gomes, T. C. L. S. Spohr, R. Martinez, V. Moura Neto // Braz. J. Med. Biol. Res. – 2001. – Vol. 34. – P. 611-620. 147. Current approaches for assessing insulin sensitivity and resistance in vivo: advantages, limitations, and appropriate usage / R. Muniyappa, S. Lee, H. Chen, M. J. Quon // Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. – 2008. – Vol. 294, № 1. – Р. 15-26. 235 148. Cyclic ADP-ribose as a potential second messenger for neuronal Ca 2+ signaling / H. Higashida, M. Hashii, S. Yokoyama et al. // J. Neurochem. – 2001. – Vol. 76, № 2. – P. 321-331. 149. Cyclic ADP-ribose as a second messenger revisited from a new aspect of signal transduction from receptors to ADP-ribosyl cyclase / H. Higashida, M. Hashii, S. Yokoyama et al. // Phramacol. Therapeutics. – 2001. – Vol. 90. – P. 283-296. 150. Cyclic ADP-ribose as a universal calcium signal molecule in the nervous system / H. Higashida, A. B. Salmina, R. Y. Olovyannikova et al. // Neurochem. Int. – 2007. – Vol. 51, № 2-4. – Р. 192-199. 151. Cyclic ADP-ribose is a second messenger in the lipopolysaccharidestimulated activation of murine N9 microglial cell line / L. Franco, N. Bodrato, I. Moreschi et al. // J. Neurochem. – 2006. – Vol. 99, № 1. – P. 165-176. 152. Czura, A. W. CD38 and CD157: biological observations to clinical therapeutic targets / A. W. Czura, C. J. Czura // Mol. Med. – 2006. – Vol. 12, № 1112. – P. 309-311. 153. Dauer, W. Parkinson’s disease: mechanisms and models / W. Dauer, S. Przedborski // Neuron. – 2003. – Vol. 39. – P. 889-909. 154. Dawson, T. M. Genetic animal models of Parkinson's disease / T. M. Dawson, H. S. Ko, V. L. Dawson // Neuron. – 2010. – Vol. 66, № 5. – P. 646661. 155. de Lange, E. C. M. Potential role of ABC transporters as a detoxification system at the blood–CSF barrier / E. C. M. de Lange // Adv. Drug Deliv. Rev. – 2004. – Vol. 56. – P. 1793-1809. 156. Del Zoppo, G. J. Stroke and neurovascular protection / G. J. Del Zoppo // N. Engl. J. Med. – 2006. – Vol. 354, № 6. – P. 553-555. 157. Dementia is associated with insulin resistance in patients with Parkinson's disease / D. Bosco, M. Plastino, D. Cristiano et al. // J. Neurol. Sci. – 2012. – Vol. 315, № 1-2. – P. 39-43. 158. Depletion of intracellular Ca 2+ by caffeine and ryanodine induces apoptosis of chinese hamster ovary cells transfected with ryanodine receptor 236 / Z. Pan, D. Damron, A. L. Nieminen et al. // J. Biol. Chem. – 2000. – Vol. 275, № 26. – P. 19978-19984. 159. Design, synthesis and biological characterization of novel inhibitors of CD38 / M. Dong, Y. Q. Si, S. Y. Sun et al. // Org. Biomol. Chem. – 2011. – Vol. 9, № 9. – P. 3246-3257. 160. Di Lisa, F. Pathophysiological relevance of mitochondria in NAD + metabolism / F. Di Lisa, M. Ziegler // FEBS. Lett. – 2001. – Vol. 492, № 1-2. – P. 4-8. 161. Dickey, E. J. Hypoxic ischemic encephalopathy – what can we learn from humans? / E. J. Dickey, S. N. Long, R. W. Hunt // J. Vet. Intern. Med. – 2011. – Vol. 25. – P. 1231-1240. 162. Differential utilization of cyclic ADP-ribose pathway by chemokines to induce the mobilization of intracellular calcium in NK cells / M. Inngjerdingen, A. AlAoukaty, B. Damaj, A. A. Maghazachi // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 1999. – Vol. 262, № 2. – P. 467-472. 163. Duarte, A. I. Insulin in central nervous system: more than just a peripheral hormone / A. I. Duarte, P. I. Moreira, C. R. Oliveira // J. Aging Res. – 2012. – Vol. 2012. – P. 1-21. 164. Ecto-ADP-Ribosyltransferases (ARTs): Emerging Actors in Cell Communication and Signaling / M. Seman, S. Adriouch, F. Haag, F. Koch-Nolte // Curr. Med. Chem. – 2004. – Vol. 11, № 7. – P. 857-872. 165. Effects of insulin on brain glucose metabolism in impaired glucose tolerance / J. Hirvonen, K.A. Virtanen, L. Nummenmaa et al. // Diabetes. – 2011. – Vol. 60, № 2. – P. 443-447. 166. Effects of the human CD38 glycoprotein on the early stages of the HIV-1 replication cycle / A. Savarino, F. Bottarel, L. Calosso et al. // FASEB J. – 1999. – Vol. 13. – P. 2265-2276. 167. Elevated tauopathy and alpha-synuclein pathology in postmortem Parkinson's disease brains with and without dementia / J. Wills, J. Jones, T. Haggerty et al. // Exp. Neurol. – 2010. – Vol. 225, № 1. – P. 210-208. 237 168. Enhanced production and action of cyclic ADP-ribose during oxidative stress in small bovine coronary arterial smooth muscle / H. Higashida, M. Hashii, S. Yokoyama et al. // Microvasc. Res. – 2004. – Vol. 67. – P. 159-167. 169. Enzymatic synthesis and characterizations of cyclic procedure for distinguishing GDP-ribose: A enzymes with ADP-ribosyl cyclase activity / R. M. Graeff, T. F. Walseth, K. Fryxell et al. // J. Biol. Chem. – 1994. – Vol. 269, № 48. – P. 30260-30267. 170. Enzymic, cysteine-specific ADP-ribosylation in bovine liver mitochondria / D. Jorcke, M. Ziegler, A. Herrero-Yraola, M. Schweiger // Biochem. J. – 1998. – Vol. 332. – P. 189-193. 171. Eroglu, C. Glia as active participants in the development and function of synapses / C. Eroglu, B. A. Barres, B. Stevens // Structural and functional organization of the synapse / eds. J. W. Hell, M. D. Ehlers. – Philadelphia : Springer, 2008. – P. 683-714. 172. Essential requirement of cytosolic phospholipase A2 for stimulation of NADPH oxidase-associated diaphorase activity in granulocyte-like cells / I. Pessach, T. L. Leto, H. L. Malech, R. Levy // J. Biol. Chem. – 2001. – Vol. 276, № 36. – P. 33495-33503. 173. Essential role for Ca2+ in regulation of IL-1 secretion by P2X7 nucleotide receptor in monocytes, macrophages, and HEK-293 cells / L. Gudipaty, J. Munetz, P. A. Verhoef, G. R. Dubyak // Am. J. Physiol. Cell. Physiol. – 2003. – Vol. 285. – P. 286-299. 174. Evidence for an Intracellular ADP-ribosyl Cyclase/NAD-glycohydrolase in Brain from CD38-deficient Mice / C. Ceni, H. Muller-Steffne, F. Lund et al. // J. Biol. Chem. – 2003. – Vol. 278, № 42. – P. 40670-40678. 175. Extracellular ATP induces oscillations of intracellular Ca 2+ and membrane potential and promotes transcription of IL-6 in macrophages / P. J. Hanley, B. Musset, V. Renigunta et al. // PNAS. – 2004. – Vol. 101, № 25. – P. 9479-9484. 176. Extracellular ATP Perturbs Transmembrane Ion Fluxes, Elevates Cytosolic [Ca], and Inhibits Phagocytosis in Mouse Macrophages / S. S. J. Sung, 238 J. D. E. Young, A. M. Origlio et al. // J. Biol. Chem. – 1986. – Vol. 260, № 25. – P. 13442-13449. 177. Extracellular cyclic ADP-ribose increases intracellular free calcium concentration and stimulates proliferation of human hemopoietic progenitors / M. Podesta, E. Zocchi, A. Pitto et al. // FASEB J. – 2000. – Vol. 14, № 5. – P. 680690. 178. Faria, R. X. Are second messengers crucial for opening the pore associated with P2X7 receptor? / R. X. Faria, F. P. de Farias, L. A. Alves // Am. J. Physiol. Cell. Physiol. – 2005. – Vol. 288. – P. 260-271. 179. Ferrero, E. The metamorphosis of a molecule: from soluble enzyme to the leukocyte receptor CD38 / E. Ferrero, F. Malavasi // J. Leukoc. Biol. – 1999. – Vol. 65, № 2. – P. 151-161. 180. Fields, R. D. ATP: an extracellular signaling molecule between neurons and glia / R. D. Fields, B. Stevens // Trends Neurosci. – 2000. – Vol. 23. – P. 625-633. 181. Fields, R. D. Purinergic signalling in neuron-glia interactions / R. D. Fields, G. Burnstock // Nat. Rev. Neurosci. – 2006. – Vol. 7, № 6. – P. 423436. 182. Focal cerebral ischemia induces active proteases that degrade microvascular matrix / S. Fukuda, C. A. Fini, T. Mabuchi et al. // Stroke. – 2004. – Vol. 35, № 4. – P. 998-1004. 183. Forman, H. J. Signaling by the respiratory burst in macrophages / H. J. Forman, M. Torres // IUBMB. Life. – 2001. – Vol. 51, № 6. – P. 365-371. 184. Fragile X Protein is required for inhibition of insulin signaling and regulates glial-dependent neuroblast reactivation in the developing brain / M. A. Callana, N. Clementsa, N. Ahrendt et al. // Brain Res. – 2012. – Vol. 1462. – P. 151-161. 185. Freeman, M. R. Neuron-glia signaling in nervous system development, function, and disease [Electronic resource] / M. R. Freeman // Howard Hughes Medical Institute. – URL : http://www.hhmi.org/research/ecs/freeman.html (дата обращения: 14.03.2013). 239 186. Friberg, H. Mitochondrial permeability transition in acute neurodegeneration / H. Friberg, T. Wieloch // Biochimie. – 2002. – Vol. 84, № 2-3. – P. 241-250. 187. Friedlender, R. M. Apoptosis and caspases in neurodegenerative diseases / R. M. Friedlender // N. Engl. J. Med. – 2003. – Vol. 348. – P. 1365-1375. 188. Fruhbeis, C. Emerging roles of exosomes in neuron–glia communication / C. Fruhbeis, D. Frohlich, E. M. Kramer-Albers // Front. Physiol. – 2012. – Vol. 3. – P. 1-7. 189. Fuchs, E. Experimental animal models for the simulation of depression and anxiety / E. Fuchs, G. Flïugge // Dialogues Clin. Neurosci. – 2006. – Vol. 8, № 3. – P. 323-333. 190. Functional dissection of the paired domain of Pax6 reveals molecular mechanisms of coordinating neurogenesis and proliferation / T. Walcher, Q. Xie, J. Sun et al. // Development. – 2013. – Vol. 140, № 5. – P. 1123-1136. 191. Functional modules and expression of mouse p40phox and p67phox, SH3domain-containing proteins involved in the phagocyte NADPH oxidase complex / K. Mizuki, K. Kadomatsu, K. Hata et al. // Eur. J. Biochem. – 1998. – Vol. 251. – P. 573-582. 192. Fused p47phox and p67phox truncations efficiently reconstitute NADPH oxidase with higher activity and stability than the individual components / K. Ebisu, T. Nagasawa, K. Watanabe et al. // J. Biol. Chem. – 2001. – Vol. 276, № 27. – P. 24498-24505. 193. Galpern, W. R. Interface between tauopathies and synucleinopathies: a tale of two proteins / W. R. Galpern, A. E. Lang // Ann. Neurol. – 2006. – Vol. 59, № 3. – P. 449-458. 194. Galvao, R. P. Brain-derived neurotrophic factor signaling does not stimulate subventricular zone neurogenesis in adult mice and rats / R. P. Galvao, J. M. Garcia-Verdugo, A. Alvarez-Buylla // J. Neurosci. – 2008. – Vol. 28, № 50. – P. 13368-13383. 240 195. Gap junctional communication promotes apoptosis in a connexin-typedependent manner / P. Kameritsch, N. Khandoga, U. Pohl, K. Pogoda // Cell Death Dis. – 2013. – Vol. 4. – P. e584. 196. Gap-junctional coupling between neurons and astrocytes in primary central nervous system cultures / M. M. Froes, A. H. Correia, J. Garcia-Abreu et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. – 1999. – Vol. 96. – P. 7541-7546. 197. Gap-junction-mediated propagation and amplification of cell injury / J. H. C. Lin, H. Weigel, M. L. Cotrina et al. // Nat. Neurosci. – 1998. – Vol. 1. – P. 494-500. 198. Genetic mouse models of Alzheimer's disease / Y. S. Mineur, D. McLoughlin, W. E. Crusio, F. Sluyter // Neural. Plast. – 2005. – Vol. 12, № 4. – P. 299-310. 199. GFAP, S-100, and vimentin proteins in rat after cerebral post-ischemic reperfusion / G. Martinez, M. L. Carnazza, C. Di Giacomo et al. // Int. J. Dev. Neurosci. – 1998. – Vol. 16, № 6. – P. 519-526. 200. Giaume, C. From a glial syncytium to a more restricted and specific glial networking / C. Giaume, X. Liu // J. Physiol. Paris. – 2012. – Vol. 106, № 1-2. – P. 34-39. 201. Giffard, R. G. Ischemia-induced programmed cell death in astrocytes / R. G. Giffard, R. A. Swanson // Glia. – 2005. – Vol. 50, № 4. – P. 299-306. 202. Glutamate, glutamine, and GABA as substrates for the neuronal and glial compartments after focal cerebral ischemia in rats / J. M. Pascual, F. Carceller, J. M. Roda, S. Cerdan // Stroke. – 1998. – Vol. 29. – P. 1048-1057. 203. Glycosylphosphatidylinositol-anchored NAD glycohydrolase is released from peritoneal macrophages activated by interferon-gamma and lipopolysaccharide / M. K. Han, C. Y. Yim, N. H. An et al. // J. Leukoc. Biol. – 1994. – Vol. 56, № 6. – P. 792-796. 204. Gotz, J. Animal models of Alzheimer’s disease and frontotemporal dementia / J. Gotz, L. M. Ittner // Nat. Rev. Neurosci. – 2008. – Vol. 9, № 7. – P. 532544. 241 205. Gotz, M. Pax6 controls radial glia differentiation in the cerebral cortex / M. Gotz, A. Stoykova, P. Gruss // Neuron. – 1998. – Vol. 21, № 5. – P. 1031-1044. 206. Guillemin, G. J. Microglia, macrophages, perivascular macrophages, and pericytes: a review of function and identification / G. J. Guillemin, B. J. Brew // J. Leukoc. Biol. – 2004. – Vol. 5, № 3. – P. 388-397. 207. Guse, A. H. Cyclic ADP-ribose / A. H. Guse // J. Mol. Med. – 2000. – Vol. 78. – P. 26-35. 208. Guse, A. H. Cyclic ADP-ribose: a novel Ca2+-mobilising second messenger / A. H. Guse // Cell. Signal. – 1999. – Vol. 11, № 5. – P. 309-316. 209. Hafler, D. A. T-cells in multiple sclerosis and inflammatory central nervous system diseases / D. A. Hafler, H. L. Weiner // Immunol. Rev. – 1987. – Vol. 100. – P. 307-332. 210. Hall, A. M. Mouse models of Alzheimer's disease / A. M. Hall, E. D. Roberson // Brain Res Bull. – 2012. – Vol. 88, № 1. – P. 3-12. 211. Hallett, M. B. Direct measurement of intracellular free Ca 2+ in rat peritoneal macrophages: correlation with oxygen-radical production / M. B. Hallett, A. K. Campbell // Immunol. – 1983. – Vol. 50, № 3. – P. 487-495. 212. Hancock, J. T. Role of reactive oxygen species in cell signalling pathways / J. T. Hancock, R. Desikan, S. J. Neill // Biochem. Soc. Trans. – 2001. – Vol. 29, № 2. – P. 345-350. 213. Hatton, G. I. Glial-neuronal interactions in the mammalian brain / G. I. Hatton // Advan. in Physiol. Edu. – 2002. – Vol. 26. – P. 225-237. 214. Hawkins, B. T. The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease / B. T. Hawkins, T. P. Davis // Pharmacol. Rev. – 2005. – Vol. 57. – P. 173185. 215. Hematoencephalic barrier. Ultrastructure and histophysiology of the endothelium capillary of the neuronal nuclei of the mesencephalon / R. Gonzalez Santander, G. Martinez Cuadrado, M. Gonzalez-Santander Martínez et al. // Histol. Histopathol. – 1992. – Vol. 7, № 3. – P. 353-361. 242 216. Hipkiss, A. R. NAD+ availability and proteotoxicity / A. R. Hipkiss // Neuromolecular Med. – 2009. – Vol. 11, № 2. – P. 97-100. 217. Hiroshi, O. Recent advances in the Okamoto model: the CD38-cyclic ADP-ribose signal system and the regenerating gene protein (Reg)-Reg receptor system in beta-cells / O. Hiroshi, T. Shin // Diabetes. – 2002. – Vol. 51, № 3. – P. 462473. 218. Human multidrug resistance ABCB and ABCG transporters: Participation in a chemoimmunity defense system / B. Sarkadi, L. Homolya, G. Szakacs, A. Varadi // Physiol. Rev. – 2006. – Vol. 86. – P. 11791-1236. 219. Hypoactivity of the central dopaminergic system and autistic-like behavior induced by a single early prenatal exposure to lipopolysaccharide / T. B. Kirsten, G. P. Chaves-Kirsten, L. M. Chaible et al. // J. Neurosci. Res. – 2012. – Vol. 90, № 10. – P. 1903-1912. 220. Immunohistochemical study of catechol-O methyltransferase in the human mesostriatal system / A. Kastner, P. Anglade, C. Bounaix et al. // Neurosci. – 1994. – Vol. 62. – P. 449-457. 221. Increase of intracellular Ca 2+ during ischemia/reperfusion injury of heart is mediated by cyclic ADP-ribose / G. H. Xie, S. Y. Rah, K. S. Yi et al. // Biochem. Biophys. Res. Comm. – 2003. – Vol. 307, № 3. – P. 713-718. 222. Induction of proliferation and apoptotic cell death via P2Y and P2X receptors, respectively, in rat glomerular mesangial cells / H. Harada, C. M. Chan, A. Loesch et al. // Kidney. Int. – 2000. – Vol. 57, № 3. – P. 949-958. 223. Inflammation links excess fat to insulin resistance: the role of the interleukin-1 family / C. J. Tack, R. Stienstra, L. A. Joosten et al. // Immunol Rev. – 2012. – Vol. 249, № 1. – P. 239-252. 224. Inhibition of Mac-1 (CD11b/CD18) enhances tumor response to radiation by reducing myeloid cell recruitment / G. O. Ahn, D. Tseng, C. H. Liao et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. – 2010. – Vol. 107, № 18. – P. 8363-8368. 243 225. Inhibition of multidrug resistance transporter-1 facilitates neuroprotective therapies after focal cerebral ischemia / A. Spudich, E. Kilic, H. Xing et al. // Nat. Neurosci. – 2006. – Vol. 9, № 4. –. 226. Insulin resistance and risk of ischemic stroke among nondiabetic individuals from the northern Manhattan study / T. Rundek, H. Gardener, Q. Xu et al. // Arch Neurol. – 2010. – Vol. 67, № 10. – P. 1195-1200. 227. Is Parkinson's disease a mitochondrial disorder? / C. Berthet, H. Lei, J. Thevenet et al. // J. Neurol. Sci. – 1992. – Vol. 107, № 1. – P. 29-33. 228. Ischemia-induced neurogenesis of neocortical layer 1 progenitor cells / K. Ohira, T. Furuta, H. Hioki et al. // Nat. Neurosci. – 2010. – Vol. 13, № 2. – P. 173-179. 229. Ischemic brain injury is mediated by the activation of poly(ADPribose)polymerase / M. Endres, Z. Q. Wang, S. Namura et al // J. Cereb. Blood Flow Metab. – 1997. – Vol. 17, № 11. – P. 1143-1151. 230. Isoform expression of the sarcoplasmic reticulum Ca2+ release channel (ryanodine channel) in human myocardium / G. Munch, B. Bolckf, A. Sugaru, R. H. G. Schwinger // J. Mol. Med. – 2000. – Vol. 78. – P. 352-360. 231. James, P. E. Superoxide production by phagocytosing macrophages in relation to the intracellular distribution of oxygen / P. E. James, O. Y. Grinberg, H. M. Swartz // J. Leukoc. Biol. – 1998. – Vol. 64, № 1. – P. 78-84. 232. Jensen, F. E. Role of glutamate receptors in periventricular leukomalacia / F. E. Jensen // J. Child Neurology. – 2005. – Vol. 20. – P. 950-959. 233. Kahn, C. R. Insulin action in the brain and the pathogenesis of Alzheimers disease / C. R. Kahn, R. Suzuki // Diabetes, insulin and Alzheimer`s disease / eds. S. Craft, Y. Christen. – Heidelberg : Springer, 2010. – P. 1-20. 234. Kaidanovich-Beilin, O. Crosstalk between metabolic and neuropsychiatric disorders / O. Kaidanovich-Beilin, D. S. Cha, R. S. McIntyre // F1000 Biol. Rep. – 2012. – Vol. 4. – P. 14. 235. Kinetic competence of the cADP-ribose-CD38 complex as an intermediate in the CD38/NAD+ glycohydrolase-catalysed reactions: implication for 244 CD38 signaling / C. Cakir-Kiefer, H. Muller-Steffner, N. Oppenheimer et al. // Biochem. J. – 2001. – Vol. 358, №2. – P. 399-406. 236. Klein, A. Analysis of skilled forelimb movement in rats: the single pellet reaching test and staircase test / A. Klein, S. B. Dunnett // Curr. Protoc. Neurosci. – 2012. – Vol. 58. – P. 8.28.1- 8.28.15. 237. LaFerla, F. M. Animal models of Alzheimer disease / F. M. LaFerla, K. N. Green // Cold. Spring. Harb. Perspect. Med. – 2012. – Vol. 2, № 11. – P. 1-13. 238. Lambert, C. Fas-beyond death: a regenerative role for Fas in the nervous system / C. Lambert, A. M. Landau, J. Desbarats // Apoptosis. – 2003. – Vol. 8. – P. 551-562. 239. Lee, H. C. Cyclic ADP-ribose and its metabolic enzymes / H. C. Lee, R. Graeff, T. F. Walseth // Biochimie. – 1995. – Vol. 77, № 5. – P. 345-355. 240. Levels of soluble platelet endothelial cell adhesion molecule-1 and Pselectin are decreased in children with autism spectrum disorder / C. E. Onore, C. W. Nordahl, G. S. Young et al. // Biol. Psychistry. – 2012. – Vol. 72, № 12. – P. 1020-1025. 241. Li, X. Genes associated with autism spectrum disorders / X. Li, H. Zou, W. T. Brown // Brain Res. Bull. – 2012. – Vol. 88, № 6. – P. 543-552. 242. Ligand-induced internalization of CD38 results in intracellular Ca 2+ mobilization: role of NAD+ transport across cell membranes / E. Zocchi, C. Usai, L. Guida et al. // FASEB J. – 1999. – Vol. 13. – P. 273-283. 243. Loike, J. D. Increased ATP and creatine phosphate turnover in phagocytosing mouse peritoneal macrophages / J. D. Loike, V. F. Kozler, S. C. Silverstein // J. Biol. Chem. – 1979. – Vol. 254, № 19. – P. 9558-9564. 244. Ly, J. D. The mitochondrial membrane potential in apoptosis; an update / J. D. Ly, D. R. Grubb, A. Lawen // Apoptosis. – 2003. – Vol. 8. – P. 115-128. 245. Ly, J. D. Transplasma membrane electron transport: enzymes involved and biological function / J. D. Ly, A. Lawen // Redox. Report. – 2003. – Vol. 8, № 1. – Р. 3-21. 245 246. MacKenzie, A. B. Functional and molecular diversity of purinergic ion channel receptors / A. B. MacKenzie, A. Surprenant, R. A. North // Ann. N. Y. Acad. Sci. – 1999. – Vol. 868. – P. 716-729. 247. Macrophage antigen complex-1 mediates reactive microgliosis and progressive dopaminergic neurodegeneration in the MPTP model of Parkinson's disease / X. Hu, D. Zhang, H. Pang et al. // J. Immunol. – 2008. – Vol. 181, № 10. – P. 7194-7204. 248. Magistretti, P. J. Neuron-glia metabolic coupling and plasticity / P. J. Magistretti // J. Exp. Biol. – 2006. – Vol. 209. – P. 2304-2311. 249. Manual of stroke models in rats / ed. Y. Wang-Fischer. – Boca Raton : Taylor & Francis Group, 2009. – 332 p. 250. Martinez, A. D. Regulation of astrocyte gap junctions by hypoxiareoxygenation / A. D. Martinez, J. C. Saez // Brain Res. Rev. – 2000. – Vol. 32, № 1. – P. 250-258. 251. Mattson, M. P. Apoptotic and anti-apoptotic synaptic signaling mechanisms / M. P. Mattson // Brain Pathol. – 2000. – Vol. 10. – P. 300-312. 252. Matute, C. Neuroglial interactions mediated by purinergic signalling in the pathophysiology of CNS disorders / C. Matute, F. Cavaliere // Sem. Cell. Devel. Biol. – 2011. – Vol. 22. – P. 252-259. 253. McCaffrey, G. Physiology and pathophysiology of the blood-brain barrier: P-glycoprotein and occludin trafficking as therapeutic targets to optimize central nervous system drug delivery / G. McCaffrey, T. P. Davis // J. Invest. Med. – 2012. – Vol. 60, № 8. – P. 1-10. 254. MDR1-P-glycoprotein (ABCB1) mediates transport of Alzheimer's amyloid-ОІ peptides - Implications for the mechanisms of Aβ clearance at the bloodbrain barrier / D. Kuhnke, G. Jedlitschky, M. Grube et al. // Brain Pathol. – 2007. – Vol. 17, № 4. – P. 347-353. 255. Mechanism of toxicity in rotenone models of Parkinson’s disease / T. B. Sherer, R. Betarbet, C. M. Testa et al. // J. Neurosci. – 2003. – Vol. 23, № 34. – P. 10756-10764. 246 256. Mehta, K. Human CD38, a cell-surface protein with multiple functions / K. Mehta, U. Shahid, F. Malavasi // FASEB J. – 1996. – Vol. 10. – P. 1408-1417. 257. Mehta, S. L. Molecular targets in cerebral ischemia for developing novel therapeutics / S. L. Mehta, N. Manhas, R. Raghubir // Brain Res. Rev. – 2007. – Vol. 54, № 1. – P. 34-66. 258. Meissner, G. Molecular regulation of cardiac ryanodine receptor ion channel / G. Meissner // Cell Calcium. – 2004. – Vol. 35. – P. 621-628. 259. Meredith, G. E. Animal models of Parkinson’s disease progression / G. E. Meredith, P. K. Sonsalla, M. F. Chesselet // Acta Neuropathol. – 2008. – Vol. 115. – P. 385-398. 260. Metabolic inhibition activates a non-selective current through connexin hemichannels in isolated ventricular myocytes / R. P. Kondo, S. Y. Wang, S. A. John et al. // J. Mol. Cell Cardiol. – 2000. – Vol. 32, № 10. – P. 1859-1872. 261. Metabolic-cognitive syndrome: a cross-talk between metabolic syndrome and Alzheimer's disease / V. Frisardi, V. Solfrizzi, D. Seripa et al. // Ageing Res Rev. – 2010. – Vol. 9, № 4. – P. 399-417. 262. Mice deficient in Mac-1 (CD11b/CD18) are less susceptible to cerebral ischemia/reperfusion injury / S. G. Soriano, A. Coxon, Y. F. Wang et al. // Stroke. – 1999. – Vol. 30, № 1. – P. 134-139. 263. Microdomains for neuron–glia interaction: parallel fiber signaling to Bergmann glial cells / J. Grosche, V. Matyash, T. Moller et al. // Nat. Neurosci. – 1999. – Vol. 2. – P. 139-143. 264. Miller, D. S. Modulation of P-glycoprotein at the blood-brain barrier: opportunities to improve central nervous system pharmacotherapy / D. S. Miller, B. Bauer, A. M. S. Hartz // Pharmacol. Rev. – 2008. – Vol. 60, № 2. – P. 196-209. 265. Miller, D. S. Regulation of P-glycoprotein and other ABC drug transporters at the blood–brain barrier / D. S. Miller // Trends Pharmacol. Sci. – 2010. – Vol. 31, № 6. – P. 246-254. 247 266. Miller, D. W. Glial cell inclusions and the pathogenesis of neurodegenerative diseases / D. W. Miller, M. R. Cookson, D. W. Dickson // Neuron. Glia. Biol. – 2004. – Vol. 1, № 1. – P. 13-21. 267. Mitochondrial dysfunction and loss of Parkinson’s disease-linked proteins contribute to neurotoxicity of manganese-containing welding fumes / K. Sriram, G. X. Lin, A. M. Jefferson et al. // FASEB J. – 2010. – Vol. 24. – P. 4989-5002. 268. Mochizuki, H. Adult neurogenesis in Parkinson’s disease / H. Mochizuki // Neurogenesis in the Adult Brain II. Clinical Implications / eds. T. Seki, K. Sawamoto, J. M. Parent, A. Alvarez-Buylla. – Tokyo : Springer, 2011. – P. 23-36. 269. Molecular dissection of Pax6 function: the specific roles of the paired domain and homeodomain in brain development / N. Haubst, J. Berger, V. Radjendirane et al. // Development. – 2004. – Vol. 131, № 24. – P. 6131-6140. 270. Molecular targets related to inflammation and insulin resistance and potential interventions / S. M. Hirabara, R. Gorjao, M. A. Vinolo et al. // J. Biomed. Biotechnol. – 2012. – Vol. 2012. – P. 379024. 271. Mouse models of autism spectrum disorders: the challenge for behavioral genetics / S. S. Moy, J. J. Nadler, T. R. Magnuson, J. N. Crawley // Am. J. Med. Genet. C Semin. Med. Genet. – 2006. – Vol. 142C, № 1. – P. 40-51. 272. Muijsers, R. B. Apocynin inhibits peroxynitrite formation by murine macrophages / R. B. Muijsers, E. van-Den-Worm, G. Folkerts et al. // Br. J. Pharmacol. – 2000. – Vol. 130, № 4. – P. 932-936. 273. Muller, C. D. Fate of ecto-NAD+ glycohydrolase during phagocytosis of normal and mannosylated latex beads by murine macrophages / C. D. Muller, F. Schuber // Biol. Cell. – 1990. – Vol. 68, № 1. – P. 57-64. 274. Murai, K. K. Neuron-glial communication at synapses: insights from vertebrates and invertebrates / K. K. Murai, D. J. Van Meyel // Neuroscientist. – 2007. – Vol. 13, № 6. – P. 657-666. 275. Muscarinic receptor-mediated dual regulation of ADP-ribosyl cyclase in NG108-15 neuronal cell membranes / H. Higashida, S. Yokoyama, M. Hashii et al. // J. Biol. Chem. – 1997. – Vol. 272. – P. 31272-31277. 248 276. Mutations in GFAP, encoding glial fibrillary acidic protein, are associated to Alexander disease / M. Brenner, A. B. Johnson, O. Boespflug-Tanguy et al. // Nat. Genet. – 2001. – Vol. 27. – P. 117-120. 277. Myocardial ischemia and reperfusion reduce the levels of cyclic ADPribose in rat myocardium / Z. D. Ge, P. L. Li, Y. F. Chen et al. // Bas. Res. Cardiol. – 2002. – Vol. 97. – P. 312-319. 278. NAADP mediates insulin-stimulated glucose uptake and insulin sensitization by PPARγ in adipocytes / E. K. Song, Y. R. Lee, Y. R. Kim et al. // Cell Rep. – 2012. – Vol. 2, № 6. – Р. 1607-1619. 279. NAD degradation and regulation of CD38 expression by human monocytes/macrophages / M. Pfister, A. Ogilvie, C. P. da Silva et al. // Eur. J. Biochem. – 2001. – Vol. 268, № 21. – P. 5601-5608. 280. NAD+ metabolism and ADP-ribosyl cyclase as targets for central nervous system therapy / A. B. Salmina, R. Ya. Olovyannikova, M. Noda, H. Higashida // Curr. Med. Chem. – 2006. – Vol. 6. – P. 193-210. 281. NAD+-converting enzymes in neuronal and glial cells: CD38 as a novel target for neuroprotection / A. B. Salmina, A. I. Inzhutova, A. V. Morgun et al. // Vestn. Ross. Akad. Med. Nauk. – 2012. – Vol. 10. – P. 29-37. 282. NAD+-dependent internalization of the transmembrane glycoprotein CD38 in human Namalwa B cells / E. Zocchi, L. Franco, L. Guida et al. // FEBS. Lett. – 1996. – Vol. 396, № 2–3. – P. 327-332. 283. Neurogenesis in substantia nigra of parkinsonian brains? / O. AriasCarrion, E. Yamada, N. Freundlieb et al. // J. Neural. Transm. Suppl. – 2009. – Vol. 73. – P. 279-285. 284. Neurological considerations: autism and Parkinson's disease / E. Hollander, A. T. Wang, A. Braun, L. Marsh // Psychiatry Res. – 2009. – Vol. 170, № 1. – P. 43-51. 285. Neuronal expression of the drug efflux transporter P-glycoprotein in the rat hippocampus after limbic seizures / H. A. Volka, K. Burkhardtb, H. Potschkaa et al. // Neurosci. – 2004. – Vol. 123, № 3. – P. 751-759. 249 286. Neuronal localization of CD38 antigen in the human brain / M. Mizuguchi, N. Otsuka, M. Sato et al. // Brain Res. – 1995. – Vol. 697. – P. 235-240. 287. Neuronal precursors within the adult rat subventricular zone differentiate into dopaminergic neurons after substantia nigra lesion and chromaffin cell transplant / O. Arias-Carrion, S. Hernandez-Lopez, O. Ibanez-Sandoval et al. // J. Neurosci. Res. – 2006. – Vol. 84, № 7. – P. 1425-1437. 288. Neuronal SIRT1 deficiency increases insulin sensitivity in both brain and peripheral tissues / M. Lu, D. A. Sarruf, P. Li et al. // J. Biol. Chem. – 2013. – Vol. 288, № 15. – Р. 10722-10735. 289. Neuronal SIRT1 regulates endocrine and behavioral responses to calorie restriction / D. E. Cohem, A. M. Supinski, M. S. Bonkowski et al. // Genes Develop. – 2009. – Vol. 23. – P. 2812-2817. 290. Neuron-glial interactions during the in vivo and in vitro development of the nigrostriatal circuit / M. A. Gates, T. F. O'Brien, A. Faissnert, D. A. Steindler // J. Chem. Neuroanat. – 1993. – Vol. 6. – P. 179-189. 291. Neuroprotective role of lactate after cerebral ischemia / C. Berthet, H. Lei, J. Thevenet et al. // J. Cereb. Blood Flow Metab. – 2009. – Vol. 29, № 11. – P. 17801789. 292. New twist on neuronal insulin receptor signaling in health, disease, and therapeutics / A. Wada, H. Yokoo, T. Yanagita, H. Kobayashi // J. Pharmacol. Sci. – 2005. – Vol. 99, № 2. – Р. 128-143. 293. Nicotinamide-adenine dinucleotide regulates muscarinic receptor-coupled K+ (M) channels in rodent NG108-15 cells / H. Higashida, J. Robbins, A. Egorova et al. // J. Physiol. – 1995. – Vol. 482, Pt. 2. – P. 317-323. 294. Nihei, O. K. Procedures to characterize and study P2Z/P2X7 purinoceptor: flow cytometry as a promising practical, reliable tool / O. K. Nihei, W. Savino, L. A. Alves // Mem. Inst. Oswaldo-Cruz. – 2000. – Vol. 95, № 3. – P. 415-428. 250 295. NMDA receptors mediate neuron-to-glia signaling in mouse cortical astrocytes / U. Lalo, Y. Pankratov, F. Kirchhoff et al. // J. Neurosci. – 2006. – Vol. 26, № 10. – P. 2673-2683. 296. North, R. A. Molecular physiology of P2X receptors / R. A. North // Physiol. Rev. – 2002. – Vol. 82, № 4. – P. 1013-1067. 297. North, R. A. Nucleotide receptors / R. A. North, E. A. Barnard // Curr. Opin. Neurobiol. – 1997. – Vol. 73. – P. 346-357. 298. Northington, F. J. Apoptosis in perinatal hypoxic-ischemic brain injury: How important is it and should be inhibited? / F. J. Northington, E. M. Graham, L. G. Martin // Brain Res. Rev. – 2005. – Vol. 50, № 2. – P. 244-257. 299. Okamoto, H. Recent advances in the Okamoto model: the CD38-cyclic ADP-ribose signal system and the regenerating gene protein (Reg)-Reg receptor system in beta-cells / H. Okamoto, S. Takasawa // Diabetes. – 2002. – Vol. 51. – P. 462-473. 300. On the importance of long-term functional assessment after stroke to improve translation from bench to bedside / T. Freret, P. Schumann-Bard, M. Boulouard, V. Bouet // Exp. Transl. Stroke. Med. – 2011. – Vol. 3. – P. 1-5. 301. Origin and progeny of reactive gliosis: A source of multipotent cells in the injured brain / A. Buffo, I. Rite, P. Tripathi et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. – 2008. – Vol. 105, № 9. – P. 3581-3586. 302. Ortolan, E. CD157, the Janus of CD38, but with a unique personality / E. Ortolan // Cell Biochem. Funct. – 2002. – Vol. 20. – Р. 319-322. 303. Osumi, N. The role of Pax6 in brain patterning / N. Osumi // Tohoku J. Exp. Med. – 2001. – Vol. 193, № 3. – P. 163-174. 304. Overexpression of PrPC by adenovirus-mediated gene targeting reduces ischemic injury in a stroke rat model / W. C. Shyu, S. Z. Lin, M. F. Chiang et al. // J. Neurosci. – 2005. – Vol. 25, № 39. – P. 8967-8977. 305. Overweight worsens apoptosis, neuroinflammation and blood-brain barrier damage after hypoxic ischemia in neonatal brain through JNK hyperactivation / 251 Y. F. Tu, Y. S. Tsai, L. W. Wang et al. // J. Neuroinflam. – 2011. – Vol. 8, № 40. – P. 1-15. 306. Oxidative damage following cerebral ischemia depends on reperfusion – a biochemical study in rat / D. A. Nita, V. Nita, S. Spulber et al. // J. Cell. Mol. Med. – 2001. – Vol. 5, № 2. – P. 163-170. 307. P2X7 nucleotide receptor mediation of membrane pore formation and superoxide generation in human promyelocytes and neutrophils / B. C. Suh, J. S. Kim, U. Namgung et al. // J. Immunol. – 2001. – Vol. 166, № 11. – P. 6754-6763. 308. P2X7 receptor at the heart of disease / E. Vasileiou, R. M. Montero, C. M. Turner, G. Vergoulas // Hippokratia. – 2010. – Vol. 14, № 3. – P. 155-163. 309. P2X7 receptor modulation on microglial cells and reduction of brain infarct caused by middle cerebral artery occlusion in rat / A. Melani, S. Amadio, M. Gianfriddo et al. // J. Cereb. Blood Flow Metab. – 2006. – Vol. 26, № 7. – P. 7482. 310. P2X7 receptor-dependent and -independent T cell death is induced by nicotinamide adenine dinucleotide / H. Kawamura, F. Aswad, M. Minagawa et al. // J. Immunol. – 2005. – Vol. 174. – P. 1971-1979. 311. P2X7 receptor-mediated release of excitatory amino acids from astrocytes / S. A. Duan, M. Christopher, E. C. Keung et al. // J. Neurosci. – 2003. – Vol. 23, № 4. – P. 1320-1328. 312. Pagotto, U. Where does insulin resistance start? The brain / U. Pagotto // Diabetes Care. – 2009. – Vol. 32, № 2. – Р. 174-177. 313. Parent, J. M. Injury-induced neurogenesis in the adult mammalian brain / J. M. Parent // Neuroscientist. – 2003. – Vol. 9, № 4. – P. 261-272. 314. Parkinson's disease, insulin resistance and novel agents of neuroprotection / I. Aviles-Olmos, P. Limousin, A. Lees et al. // Brain. – 2013. – Vol. 136, Pt. 2. – P. 374-384. 315. Parvovirus H1-induced cell death: influence of intracellular NAD consumption on the regulation of necrosis and apoptosis / Z. H. Ran, B. Rayet, J. Rommelaere, S. Faisst // Virus Res. – 1999. – Vol. 65. – P. 161-174. 252 316. Pax6 promotes neurogenesis in human neural stem cells / T. Kallur, R. Gisler, O. Lindvall, Z. Kokaia // Mol. Cell. Neurosci. – 2008. – Vol. 38, № 4. – P. 616-628. 317. Peça, J. Cellular and synaptic network defects in autism / J. Peça, G. Feng // Curr. Opin. Neurobiol. – 2012. – Vol. 22, № 5. – P. 866-872. 318. Perinatal stress, brain inflammation and risk of autism – review and proposal / A. Angelidou, S. Asadi, K. D. Alysandratos et al. // BMC Pediat. – 2012. – Vol. 12, № 1. – P. 89-110. 319. P-glycoprotein expression: critical determinant in the response to osteosarcoma chemotherapy / H. S. Chan, T. M. Grogan, G. Haddad et al. // J. Natl. Cancer Inst. – 1997. – Vol. 89. – P. 1706-1715. 320. Phillips, J. Monitoring glial cell behaviour and neuron-glial interactions in 3D hydrogel and aggregate culture systems / J. Phillips, J. Loughlin // 10th European Meeting on Glial Cells in Health and Disease. – Prague, 2011. – P. S24. 321. Picello, E. Chelation of cytoplasmic Ca2+ increases plasma membrane permeability in murine macrophages / E. Picello, P. Pizzo, F. Di Virgilio // J. Biol. Chem. – 1990. – Vol. 265, № 10. – P. 5635-5639. 322. Pioggia, G. Special issue on neuron-glia interactions / G. Pioggia // J. Biol. Phys. – 2009. – Vol. 35. – P. 311-315. 323. Postnatal hypoxic-ischemic brain injury alters mechanisms mediating neuronal glucose transport / A. Zovein, J. Flowers-Ziegler, S. Thamotharan et al. // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. – 2004. – Vol. 286. – P. R273-R282. 324. Pre-fibrillar α-synuclein variants with impaired β-structure increase neurotoxicity in Parkinson’s disease models / D. P. Karpinar, M. B. G. Balija, S. Kugler et al. // EMBO J. – 2009. – Vol. 28, № 20. – P. 3256-3268. 325. Priming of macrophages with lipopolysaccharide potentiates P2X7mediated cell death via a caspase-1-dependent mechanism, independently of cytokine production / R. A. Le Feuvre, D. Brough, Y. Iwakura et al. // J. Biol. Chem. – 2002. – Vol. 277, № 5. – P. 3210-3218. 253 326. Probing ligand-induced conformational changes of human CD38 / P. Bannas, S. Adriouch, S. Kahl et al. // Eur. J. Biochem. – 2000. – Vol. 267, № 10. – P. 3056-3064. 327. Proteome analysis of human substantia nigra in Parkinson's disease / C. J. Werner, R. Heyny-von Haussen, G. Mall, S. Wolf // Proteome Sci. – 2008. – Vol. 6. – P. 1-8. 328. Proteomics in human Parkinson's disease research / V. Lickera, E. Kovarib, D. F. Hochstrasserc, P. R. Burkhard // J. Proteomics. – 2009. – Vol. 73, № 1. – P. 10-29. 329. Pullar, J. M. Diphenyleneiodonium triggers the efflux of glutathione from cultured cells / J. M. Pullar, M. B. Hampton // J. Biol. Chem. – 2002. – Vol. 277, № 22. – P. 19402-19407. 330. Purinergic receptor regulation of LPS-induced signaling and pathophysiology / A. N. Guerra, P. L. Fisette, Z. A. Pfeiffer et al. // J. Endotoxin. Res. – 2003. – Vol. 9, № 4. – P. 256-263. 331. Purinergic signalling in the nervous system: an overview / M. P. Abbracchio, G. Burnstock, A. Verkhratsky, H. Zimmermann // Trends Neurosci. – 2009. – Vol. 32, № 1. – P. 19-29. 332. Putman, M. Molecular properties of bacterial multidrug transporters / M. Putman, H. W. van Veen, W. N. Konings // Microbiol. Mol. Biol. Rev. – 2000. – Vol. 64. – P. 672-693. 333. Rat model of perinatal hypoxic-ischemic brain damage / R. C. Vannucci, J. R. Connor, D. T. Mauger et al. // J. Neurosci. Res. – 1999. – Vol. 55, № 2. – P. 158163. 334. Reactive astrocytes and Wnt/[beta]-catenin signaling link nigrostriatal injury to repair in 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine model of Parkinson's disease / F. L'Episcopo, C. Tirolo, N. Testa et al. // Neurobiol. Dis. – 2010. – Vol. 41, № 2. – P. 508-527. 335. Reactive oxygen species mediate cyclooxygenase-2 induction during monocyte to macrophage differentiation: critical role of NADPH oxidase 254 / S. S. Barbieri, S. Eligini, M. Brambilla et al. // Cardiovasc. Res. – 2003. – Vol. 601. – P. 187-197. 336. Regulation of cortical microcircuits by unitary GABA-mediated volume transmission / O. Szabolcs, F. Miklos, K. Gergely et al. // Nature. – 2009. – Vol. 461. – P. 1278-1282. 337. Regulation of intracellular levels of NAD: a novel role for CD38 / P. Aksoy, T. White, M. Thompson, E. N. Chini // Biochem. Biophys. Res. Comm. – 2006. – Vol. 345, № 4. – P. 1386-1392. 338. Regulation of P2X(7) nucleotide receptor function in human monocytes by extracellular ions and receptor density / L. Gudipaty, B. D. Humphreys, G. Buell, G. R. Dubyak // Am. J. Physiol. Cell. Physiol. – 2001. – Vol. 280, № 4. – P. 943-953. 339. Release of glial tissue-specific proteins after acute stroke. A comparative analysis of serum concentrations of protein S-100B and glial fibrillary acidic protein / M. Herrmann, P. Vos, M. T. Wunderlich et al. // Stroke. – 2000. – Vol. 31. – P. 2670-2677. 340. Ren, K. Neuron-glia crosstalk gets serious: Role in pain hypersensitivity / K. Ren, R. Dubner // Curr. Opin. Anaesthesiol. – 2008. – Vol. 21, № 5. – P. 570-579. 341. Requirement of functional ryanodine receptor type 3 for astrocyte migration / M. Matyash, V. Matyash, C. Nolte et al. // FASEB J. – 2002. – Vol. 16. – P. 84-86. 342. Review (Pre)diabetes, brain aging, and cognition / J. S. Roriz-Filho, T. M. Sa-Roriz, I. Rosset et al. // Biochim. et Biophys. Acta. – 2009. – Vol. 1792, № 5. – P. 432-443. 343. Rodent models for autism: a critical review / C. Belzung, S. Leman, P. Vourc’h, C. Andres // Drug Discov. Today Dis. Models. – 2005. – Vol. 2, № 2. – P. 40-51. 344. Rodriguez, J. J. Neuroglial roots of neurodegenerative diseases? / J. J. Rodriguez, A. Verkhratsky // Mol. Neurobiol. – 2011. – Vol. 43, № 2. – P. 8796. 255 345. Role of cyclic ADP-ribose in ATP-activated potassium currents in alveolar macrophages / S. Ebihara, T. Sasaki, W. Hida et al. // J. Biol. Chem. – 1997. – Vol. 272, № 25. – P. 16023-16029. 346. Role of cyclic ADP-ribose in Ca2+-induced Ca release and vasoconstriction in small renal arteries / E. G. Teggatz, G. Zhang, A. Y. Zhang et al. // Microvasc. Res. – 2005. – Vol. 70, № 1-2. – P. 65-75. 347. Role of extracellular ATP in cell-mediated cytotoxicity: a study with ATP-sensitive and ATP-resistant macrophages / A. Zambon, V. Bronte, F. D. Virgilio et al. // Cell. Immunol. – 1994. – Vol. 156, № 2. – P. 458-467. 348. Rotenone model of Parkinson disease. Multiple brain mitochondria dysfunctions after short term systemic rotenone intoxication / A. Panov, S. Dikalov, N. Shalbuyeva et al. // J Biol Chem. – 2005. – Vol. 280, № 51. – P. 42026-42035. 349. Rotenone, deguelin, their metabolites, and the rat model of Parkinson's disease / P. Caboni, T. B. Sherer, N. Zhang et al. // Chem. Res. Toxicol. – 2004. – Vol. 17, № 11. – P. 1540-1548. 350. Sakurai, K. The neurogenesis-controlling factor, Pax6, inhibits proliferation and promotes maturation in murine astrocytes / K. Sakurai, N. Osumi // J. Neurosci. – 2008. – Vol. 28, № 18. – P. 4604-4612. 351. Salmina, A. B. Neuron-glia interactions as therapeutic targets in neurodegeneration / A. B. Salmina // J. Alzheimer's Dis. – 2009. – Vol. 16, № 3. – Р. 485-502. 352. Sanchez, R. Insulin, brain function and Alzheimer’s Disease – Is insulin resistance to blame for Alzheimer’s? [Electronic resource] / R. Sanchez, L. Ac, D. Hom. – URL : http://www.thealzheimerssolution.com/insulin-brain-function-andalzheimers-disease-is-insulin-resistance-to-blame-for-alzheimers/ (дата обращения: 30.08.2013). 353. Sauer, H. Reactive oxygen species as intracellular messengers during cell growth and differentiation / H. Sauer, M. Wartenberg, J. Hescheler // Cell. Physiol. Biochem. – 2001. – Vol. 11, № 4. – P. 173-186. 256 354. Saunders, N. R. Barrier mechanisms in the developing brain / N. R. Saunders, S. A. Liddelow, K. M. Dziegielewska // Front Pharmacol. – 2012. – Vol. 3. – P. 46. 355. Schallert, T. Orienting and Placing / T. Schallert, M. T. Woodlee // The behavior of the laboratory rat: a handbook with tests / eds. I. Whishaw, B. Kolb. – Oxford : Oxford University Press, 2005. – Р. 129-140. 356. Schmidt, H. D. Functional biomarkers of depression: diagnosis, treatment, and pathophysiology / H. D. Schmidt, R. C. Shelton, R. S. Duman // Neuropsychopharmacol. – 2011. – Vol. 36, № 12. – P. 2375-2394. 357. Selective inhibition of Cx43 hemichannels by Gap19 and its impact on myocardial ischemia/reperfusion injury / N. Wang, E. De Vuyst, R. Ponsaerts et al. // Basic Res. Cardiol. – 2013. – Vol. 108, № 1. – P. 309. 358. Selective neuronal vulnerability and specific glial hippocampal and neocortical organotypic cultures submitted reactions to in ischemia / M. Bernaudin, A. Nouvelot, E. T. MacKenzie, E. Petit // Exp. Neurol. – 1998. – Vol. 150. – P. 30-39. 359. Seth, P. Astrocyte, the star avatar: redefi ned / P. Seth, N. Koul // J. Biosci. – 2008. – Vol. 33, № 3. – P. 405-421. 360. Shaham, S. Glia-neuron interactions in nervous system function and development / S. Shaham // Curr. Top. Dev. Biol. – 2005. – Vol. 69. – P. 39-66. 361. Shalev, H. Breaching the blood-brain barrier as a gate to psychiatric disorder / H. Shalev, Y. Serlin, A. Friedman // Cardiovasc. Psychiatry Neurol. – 2009. – Vol. 2009. – P. 278531. 362. SIRT1 is essential for normal cognitive function and synaptic plasticity / S. Michan, Y. Li, M .M. H. Chou et al. // J. Neuroscience. – 2010. – Vol. 30, № 29. – P. 9695-9707. 363. Smalheiser, N. R. Do neural cells communicate with endothelial cells via secretory exosomes and microvesicles? / N. R. Smalheiser // Cardiovasc. Psychiatry. Neurol. – 2009. – Vol. 2009. – P. 1-3. 257 364. Social memory, amnesia, and autism: brain oxytocin secretion is regulated by NAD+ metabolites and single nucleotide polymorphisms of CD38 / H. Higashida, S. Yokoyama, J. J. Huang et al. // Neurochem. Int. – 2012. – Vol. 61, № 6. – P. 828838. 365. Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation / M. V. Sofroniew // Trends Neurosci. – 2009. – Vol. 32, № 12. – P. 638-647. 366. Spatial and nonspatial escape strategies in the Barnes maze / F. E. Harrison, R. S. Reiserer, A. J. Tomarken, M. P. McDonald // Learn Mem. – 2006. – Vol. 13, № 6. – P. 809-819. 367. Spatiotemporal expression patterns of Pax6 in the brain of embryonic, newborn, and adult mice / D. Duan, Y. Fu, G. Paxinos, C. Watson // Brain Struct. Funct. – 2013. – Vol. 218, № 2. – P. 353-372. 368. Spontaneous cell fusion in macrophage cultures expressing high levels of the P2Z/P2X7 receptor / P. Chiozzi, J. M. Sanz, D. Ferrari et al. // J. Cell. Biol. – 1997. – Vol. 138, № 3. – P. 697-706. 369. Stereotaxical infusion of rotenone: a reliable rodent model for Parkinson's disease / N. Xiong, J. Huang, Z. Zhang et al. // PLoS One. – 2009. – Vol. 4, № 11. – P. e7878. 370. Stern, M. Insulin signaling and autism / M. Stern // Front. Endocrinol. (Lausanne). – 2011. – Vol. 2. – P. 54. 371. Stevens, B. Neuron-astrocyte signaling in the development and plasticity of neural circuits / B. Stevens // Neurosignals. – 2008. – Vol. 16, № 4. – P. 278-288. 372. Stress-activated protein kinase/JNK activation and apoptotic induction by the macrophage P2X7 nucleotide receptor / B. D. Humphreys, J. Rice, S. B. Kertesy, G. R. Dubyak // J. Biol. Chem. – 2000. – Vol. 275, № 35. – P. 26792-26798. 373. Stress-induced anhedonia in mice is associated with deficits in forced swimming and exploration / T. Strekalova, R. Spanagel, D. Bartsch et al. // Neuropsychopharmacol. – 2004. – Vol. 29. – P. 2007-2017. 258 374. Structural and functional similarities of calcium homeostasis modulator 1 (CALHM1) ion channel with connexins, pannexins, and innexins / A. P. Siebert, Z. Ma, J. D. Grevet et al. // J. Biol. Chem. – 2013. – Vol. 288. – P. 6140-6153. 375. Structure and function of the blood-brain barrier / N. J. Abbott, A. A. K. Patabendige, D. E. M. Dolman et al. // Neurobiol Dis. – 2010. – Vol. 37. – P. 13-25. 376. Suh, Y. H. Amyloid precursor protein, presenilins, and alpha-synuclein: molecular pathogenesis and pharmacological applications in Alzheimer's disease / Y. H. Suh, F. Checler // Pharmacol. Rev. – 2002. – Vol. 54, № 3. – P. 469-525. 377. Sustained depolarization and ADP-ribose activate a common ionic current in rat peritoneal macrophages / B. Campo, A. Surprenant, R. A. North et al. // J. Immunol. – 2003. – Vol. 170. – P. 1167-1173. 378. Suzumura, A. Neuron-microglia interaction in neuroinflammation / A. Suzumura // Curr. Protein. Pept. Sci. – 2013. – Vol. 14, № 1. – P. 16-20. 379. Sykova, E. Diffusion constraints and neuron-glia interaction during aging / E. Sykova, T. Mazel, Z. Simonova // Exp. Gerontol. – 1998. – Vol. 33, № 7/8. – P. 837-851. 380. Tang, B. L. SIRT1 and neuronal diseases / B. L. Tang, C. E. L. Chua // Mol. Aspect. Med. – 2008. – Vol. 29. – P. 187-200. 381. Tardy, M. Brain aging: insights into neuron-glia interactions / M. Tardy // R. Ci. Med. Biol. Salvador. – 2003. – Vol. 2, № 1. – P. 114-122. 382. Tau deficiency induces parkinsonism with dementia by impairing APPmediated iron export / P. Lei, S. Ayton, D. I. Finkelstein et al. // Nat. Med. – 2012. – Vol. 18, № 2. – P. 1-5. 383. Tauopathies with parkinsonism: clinical spectrum, neuropathologic basis, biological markers, and treatment options / A. C. Ludolpha, J. Kassubeka, B. G. Landwehrmeyera et al. // Eur. J. Neurol. – 2009. – Vol. 16, № 3. – P. 297-309. 384. The adult substantia nigra contains progenitor cells with neurogenic potential / D. C. Lie, G. Dziewczapolski, A. R. Willhoite et al. // J. Neurosci. – 2002. – Vol. 22, № 15. – P. 6639-6649. 259 385. The age-related deficit in LTP is associated with changes in perfusion and blood-brain barrier permeability / C. W. Blau, T. R. Cowley, J. O'Sullivan et al. // Neurobiol. Aging. – 2012. – Vol. 33, № 5, 1005. – P. e23-e25. 386. The CD157-integrin partnership controls transendothelial migration and adhesion of human monocytes / N. Lo Buono, R. Parrotta, S. Morone et al. // J. Biol. Chem. – 2011. – Vol. 286, № 21. – P. 18681-18691. 387. The CD38/cyclic ADP-ribose system: A topological paradox / A. De Flora, L. Guida, L. Franco, E. Zocchi // Int. J. Biochem. Cell. Biol. – 1997. – Vol. 29, № 10. – P. 1149-1166. 388. The CD38-independent ADP-ribosyl cyclase from mouse brain synaptosomes: a comparative study of neonate and adult brain / C. Ceni, N. Pochon, M. Villaz et al. // Biochem. J. – 2006. – Vol. 395. – P. 417-426. 389. The metabolism of 14C-glucose by neurons and astrocytes in subregions following focal cerebral ischemia in rats / A. E. Thoren, S. C. Helps, M. Nilsson, N. R. Sims // J. Neurochem. – 2006. – Vol. 97. – P. 968-978. 390. The neuron-astrocyte-microglia triad in normal brain ageing and in a model of neuroinflammation in the rat hippocampus / F. Cerbai, D. Lana, D. Nosi et al. // PLoS ONE. – 2012. – Vol. 7, № 9. – P. e45250. 391. The role of BK channels in ataxia and tremor produced by fungal toxins [Electronic resource ] / W. L. Imlach, J. E. Dalziel, S. C. Finch, J. Dunlop // Proceedings of the Australian Physiological Society. – 2006. – Vol. 37. – P. 80. – URL : http://aups.org.au/Proceedings/37/80P/80P.pdf (14.03.2013). 392. The role of gap junction channels during physiologic and pathologic conditions of the human central nervous system / E. A. Eugenin, D. Basilio, J. C. Saez et al. // J. Neuroimmune Pharmacol. – 2012. – Vol. 7, № 3. – P. 499-518. 393. The role of mitochondrial porins and the permeability transition pore in learning and synaptic plasticity / E. J. Weeber, M. Levy, M. J. Sampson et al. // J. Biol. Chem. – 2002. – Vol. 277, № 21. – P. 18891-18897. 394. The role of non-neuronal cells in neurodegeneration [Electronic resource]. – URL : http://www.unil.ch/dbcm/page50190_fr.html (16.03.2013). 260 395. The transmembrane glycoprotein CD38 is a catalytically active transporter responsible for generation and influx of the second messenger cyclic ADP-ribose across membranes / L. Franco, L. Guida, S. Bruzzone et al. // FASEB J. – 1998. – Vol. 12, № 14. – P. 1507-1520. 396. The vermicelli handling test: a simple quantitative measure of dexterous forepaw function in rats / R. P. Allred, D. L. Adkins, M. T. Woodlee et al. // J. Neurosci. Methods. – 2008. – Vol. 170, № 2. – P. 229-244. 397. Theodosis, D. T. Activity-dependent structural and functional plasticity of astrocyte-neuron interactions / D. T. Theodosis, D. A. Poulain, S. H. R. Oliet // Physiol. Rev. – 2008. – Vol. 88, № 3. – P. 983-1008. 398. Tieu, K. A guide to neurotoxic animal models of Parkinson's disease / K. Tieu // Cold Spring Harb. Perspect. Med. – 2011. – Vol. 1, № 1. – P. 1-20. 399. Time-course of blood-brain barrier disruption in senescence-accelerated mouse prone 8 (SAMP8) mice / J. Del Valle, J. Duran-Vilaregut, G. Manich et al. // Int. J. Dev. Neurosci. – 2009. – Vol. 27, № 1. – P. 47-52. 400. Tissue distribution of the P2X7 receptor / G. Collo, S. Neidhart, E. Kawashima et al. // Neuropharmacology. – 1997. – Vol. 36, № 9. – P. 1277-1283. 401. Todd, K. G. Animal models of neurological disorders / K. G. Todd, R. F. Butterworth // Neuromethods. – 1998. – Vol. 32. – P. 149-175. 402. Trophic neuron-glia interactions and cell number adjustments in the fruit fly / A. Hidalgo, K. Kato, B. Sutcliffe et al. // Glia. – 2011. – Vol. 59. – P. 1296-1303. 403. Ultrastructural localization of CD38 immunoreactivity in rat brain / M. Yamada, M. Mizugushi, N. Otsuka et al. // Brain Res. – 1997. – Vol. 756, № 1–2. – P. 52-60. 404. van der Heide, L. P. Insulin signaling in the central nervous system: learning to survive / L. P. van der Heide, G. M. Ramakers, M. P. Smidt // Prog. Neurobiol. – 2006. – Vol. 79, № 4. – P. 205-221. 405. Vannucci, R. C. Perinatal hypoxic-ischemic brain damage: evolution of an animal model / R. C. Vannucci, S. J. Vannucci // Dev. Neurosci. – 2005. – Vol. 27, № 2-4. – P. 81-86. 261 406. Velez-Fort, M. Central role of GABA in neuron-glia interactions / M. Velez-Fort, E. Audinat, M. C. Angulo // Neuroscientist. – 2012. – Vol. 18, № 3. – P. 237-250. 407. Ventura, R. Three-dimensional relationships between hippocampal synapses and astrocytes / R. Ventura, K. M. Harris // J. Neurosci. – 1999. – Vol. 19. – P. 6897-6906. 408. Vernadakis, A. Glia-neuron intercommunications and synaptic plasticity / A. Vernadakis // Prog. Neurobiol. – 1996. – Vol. 49. – P. 185-214. 409. Vulnerability to glucose deprivation injury correlates with glutathione levels in astrocytes / M. C. Papadopoulos, I. L. Koumenis, L. L. Dugan et al. // Brain Res. – 1997. – Vol. 748, № 1-2. – P. 151-156. 410. Walf, A. A. The use of the elevated plus maze as an assay of anxietyrelated behavior in rodents / A. A. Walf, C. A. Frye // Nature Protocols. – 2007. – Vol. 2. – P. 322-328. 411. Watters, O. A role for tumor necrosis factor-α in ischemia and ischemic preconditioning / O. Watters, J. J. O’Connor // J. Neuroinflam. – 2011. – Vol. 8, № 87. – P. 1-8. 412. Watts, T. J. The pathogenesis of autism / T. J. Watts // Clin. Med. Pathol. – 2008. – Vol. 1. – P. 99-103. 413. Weber, B. Neuron-glia-vascular interactions studied in vivo [Electronic resource] / B. Weber // European Winter Conference on Brain Research 2012. – URL : http://ewcbr.scicog.fr/documents/EWCBR2012/Abstracts2012/Weber.pdf (дата обращения: 18.03.2013). 414. Weilinger, N. L. Anoxia-induced NMDA receptor activation opens pannexin channels via Src family kinases / N. L. Weilinger, P. L. Tang, R. J. Thompson // J. Neurosci. – 2012. – Vol. 32, № 36. – P. 12579-12588. 415. Whitton, P. S. Inflammation as a causative factor in the aetiology of Parkinson's disease / P. S. Whitton // Br. J. Pharmacol. – 2007. – Vol. 150, № 8. – P. 963-976. 262 416. Williamson, R. Insulin resistance in the brain: an old-age or new-age problem? / R. Williamson, A. McNeilly, C. Sutherland // Biochem. Pharmacol. – 2012. – Vol. 84, № 6. – P. 737-745. 417. Witt, S. N. Hsp70 molecular chaperones and Parkinson's disease / S. N. Witt // Biopolymers. – 2010. – Vol. 93, № 3. – P. 218-228. 418. Woodward, G. Autism and Parkinson's disease / G. Woodward // Med. Hypotheses. – 2001. – Vol. 56, № 2. – P. 246-249. 419. Yager, J. Y. Animal models of perinatal hypoxic-ischemic brain damage / J. Y. Yager, S. Ashwal // Pediatr. Neurol. – 2009. – Vol. 40, № 3. – P. 156-167. 420. Ziegler, M. New functions of a long-known molecule. Emerging roles of NAD in cellular signaling / M. Ziegler // Eur. J. Biochem. – 2000. – Vol. 267, № 6. – P. 1550-1564. 263 Приложение А Особенности и общие черты развития острой и хронической нейродегенерации развивающегося и зрелого мозга [4, 6, 9, 11, 22, 29, 41, 52, 56, 57, 64, 66, 84, 86, 87, 102, 111, 115, 144, 145, 153, 154, 189, 198, 204, 210, 237, 249, 259, 271, 343, 356, 376, 398, 401, 405, 412, 419] Вид Распростра нейродег ненность енерации Основной патогенетический механизм Патогенез до конца не известен, обнаружены генетические и иммунопатогенетическ ие причины аутизма, существуют теории нейронных связей, 6 случаев нейронной миграции, на 1000 нервно-ингибирующей Аутизм новорожде нейронной активности, нных дендритной морфологии, нейроиммунитета, кальциевой сигнализации, «зеркальных» нейронов, снижения апоптоза и другие Когнитивные нарушения, прогрессивная нейродегенерация, синаптическая потеря, 10.4% Болезнь формирование людей Альцгейм амилоидных бляшек и старше 60 ера нейрофибриллярных лет клубков, состоящих из гипрефосфорилирован ного тау-белка, дефектный эндолизосомальный Основные модели на животных Генетические модели (с дефицитом нейропептидов), модели пренатальной токсичности (воздействие вальпроевой кислоты или 5-метокситриптамина), модели неонатального поражения мозга (мозжечка, миндалины, медиальной префронтальной коры), модели генетических заболеваний человека, связанных с аутизмом (синдром Мартина-Белл) Генетические модели, хирургическое разрушение отделов мозга, введение химических веществ и токсинов (локальное или системное), ускоренное старение Общие механизмы развития нейродегене рации Дисфункция нейронглиальных взаимодейст вий, нарушение проницаемо сти ГЭБ, нейровоспал ение 264 1 до 2% Болезнь людей Паркинсо старше 60 на лет 15-40% в юношеско м возрасте, 10% Депресси населения я старше 40 лет, 30% среди лиц старше 65 лет Перината В 65-80% льная случаев гипоксия- поражение траффик и протеолиз, патогенные взаимодействия между β-амилоидом, пресенилинами и/или α-синуклеином Дегенерация дофаминергических нейронов, сопровождающаяся снижением уровня дофамина в базальных ганглиях вследствие мисфолдинга белков и образования телец Леви, дисфункции митохондрий и убиквитинпротеасомного пути, активации микроглии, нейровоспаления, окислительного стресса, эксайтотоксичности и апоптоза Включает нейрофизиологический (наличие функциональной дисфункции органов), нейроанатомический (наличие соматических заболеваний), нейрохимический (моноаминовая теория дефицита биогенных аминов) и патопсихологический (психологические факторы, стресс) компоненты Перивентрикулярная лейкомаляция, незрелость Генетические модели, нейротоксические модели: с системным или локальным введением экзогенных (ротенон, паракват и MPTP) и эндогенных (6гидроксидофамин, MPP+, L-DOPA) нейротоксинов, «симптоматические» модели (галоперидоловая/катале птическая модель) Модели повреждения (генетические модели, модель удаления обонятельных луковиц), модели острого (водноиммерсионная модель, модель «выученной беспомощности») и хронического (непредсказуемый стресс) стресса и социальные модели (стресса раннего периода жизни, социальной изоляции) Различают модели повреждения серого и белого вещества 265 ишемия ЦНС у детей связано с перинаталь ной гипоксиейишемией Ежегодно в мире переносят инсульт Ишемия около 6 головног млн о мозга человек, в России — более 450000 человек гематоэнцефалическог головного мозга, они о барьера, нарушение включают сочетание электровозбудимости окклюзии одной или нейронов, расстройства двух общих сонных микроциркуляции, артерий (ОСА) с общей окислительный стресс, гипоксической гиперпродукция гипоксией, перманентная цитокинов, изменение или преходящая секреции и рецепции окклюзия средней нейротрансмиттеров, мозговой артерии активация микроглии и (СМА), сочетанная с макрофагов, развитие преходящей окклюзией апоптоза и некроза ОСА, преходящая гипоксическая аноксия новорожденных и внутриутробная ишемия плода, модели с созданием патологических условий (гипогликемии, гипокапнии или тяжелой гиперкапнии) Снижение белкового Различают модели синтеза, селективная глобальной полной экспрессия генов, (декапитация, остановка энергодефицит и сердца и др.) и неполной лактат-ацидоз, (модели гипоксииглутаматная ишемии, 1- и 2-сторонняя эксайтотоксичность, перевязка ОСА, 4цитотоксичность и сосудистая окклюзия и цитотоксический отек, т.д.), фокальной кальциевая перегрузка, (перевязка или окклюзия окислительный и СМА, фотохимический метаболический тромбоз, модели стресс, дисфункция эмболии) и митохондрий, мультифокальной активация (модели многоочаговой нейтрофилов, эмболии) ишемии, а нейровоспаление, также модели с апоптоз клеток, постоянной или патологическая роль преходящей окклюзии с оксида азота реперфузией или без нее 266 Приложение Б Роли глии в головном мозге животных [59, 92, 171, 185, 359, 360, 402] Вид глии Полиде ндроцит ы (NG2 клетки), радиаль ная глия, астроци ты Различн ые виды глии Выполняем ые роли Примеры выполняемых ролей В нейроонтогенезе полидендроциты дают начало миелинобразующим олигодендроцитам и NG2-глии, которая затем может давать начало нейронам или астроцитам. NG2клетки контактируют с астроцитами, перицитами и нейронами, участвуя в формировании нейроваскулярной единицы и ГЭБ. В коре головного мозга радиальные глиальные клетки служат «треками», по которым вновь созданные нейроны мигрируют до места назначения. Напротив, нейронные процессы могут Участие во служить ориентиром для мигрирующих глиальных клеток: взрослом и клетки глии эмбрионов Zebrafish ориентируются на аксоны эмбриональнейронов боковой линии. Астроциты участвуют в росте ном нейритов, нейрональном управлении и синаптогенезе. NG2нейрогенезе клетки формируют многочисленные контакты с нейронами, и синаптоотростки которых образуют функционирующие синапсы. генезе Вскоре после рождения астроциты млекопитающих внедряются в богатые синапсами участки мозга и образуют тесные взаимосвязи практически со всеми синапсами (роль в формировании, созревании и силе синапсов). Во взрослом состоянии в мозге дрозофилы обнаружено глиальное подавление фагоцитарной активности, что приводит к накоплению огромного количества пресинаптического «мусора» и резкому снижению образования новых синаптических «бутонов». Показан глиальный контроль образования синапсов, их функционирования, коммуникаций, цереброваскулярной регуляции тонуса сосудов и иммунной регуляции в головном мозге. Центральная роль глии в: формировании синапсов (секреция синаптогенных факторов: холестерола, TGFβ), их «Глиоцентри элиминации (фагоцитоз аксосом, дегенерация синапсов, ческая» индукция каскада комплемента), «обслуживании» синапсов теория (контроль ионного гомеостаза, секреция факторов для функционир поддержания структуры и функций синапсов), синаптической ования пластичности (гомеостаз различных ионов), синаптической синапсов функции: модуляция пресинаптической и постсинаптической функций, коммуникация с другими видами клеток. Так, глия может экспрессировать различные транспортеры (например, глицина GlyT1, играющий роль в его клиренсе, везикулярный транспортер глутамата VGLUT), синаптические медиаторы 267 Различн ые виды глии Влияние на (олиго- функционир дендроование глия, нейронов астроциты) Ключевые Астроци элементы ты гомеостаза мозга (ГАМК, АТФ) или ингибиторы нейротрансмиттеров, имеющие значение в регуляции синаптической активности. Секретируемый белок тромбоспондин, играющий роль в свертывании крови, может служить для стабилизации физических взаимодействий между нейронами в синапсе, однако для его стабилизации необходимы глиальные белки. Влияние на электрические свойства нейронов: миелин в изоляции аксонов (роль олтгодендроцитов), глия параузловых участках аксонов в качестве электрических изоляторов (за счет взаимодействия глиального белка нейрофасцина155 с нейронными белками контактином и контактинассоциированным белком). Роль в нервной проводимости участие глии в создании нейронных контактов, глия может изменять возбудимость нейронов, регулируя уровень ионов калия в теле нейронов вызывая секрецию глутамата (запуск нейронов может регулироваться глией как прямыми электрическими и химическими связями, так и путем управления образования миелина). Роль в выживании нейронов за счет трофической, питательной и метаболической поддержки (выработка глией нейротрофических факторов) - при развитии нервной системы у плодовой мушки дрозофилы трофические взаимодействия происходят при установлении взаимосвязи между аксонами фоторецепторов и нейронами зрительной коры головного мозга и поддерживают жизнеспособность нейронов, многие типы глиальных клеток экспрессируют рецепторы нейротрофинов, выявлены сигнальные пути внутри нейронов в ответ на трофические стимулирующие факторы; известно, что удаление глии из среды для культивирования нейронов без добавления специфических факторов приводит к их гибели, в культурах нейронов даже 5% содержание глии позволяет поддерживать их выживаемость, лактат-челночная гипотеза мектаболической поддержки астроцитами активных нейронов. Роль «информационных процессоров» в функционировании головного мозга. Астроциты могут находиться в контакте с тысячами синапсов, вызывая при необходимости активацию множества нейронов. Астроциты регулируют локальные концентрации ионов и нейромедиаторов и локальный мозговой кровоток, могут трансформировать сигналы нейромедиаторов: эндоканнабиноиды, высвобожденные из нейронов, ретроградно подавляют синаптическую передачу посредством активации пресинаптических каннабиноидных рецепторов. Однако они же могут привести к усилению синаптической передачи в отдаленных синапсах посредством стимуляции астроцитов. 268 Приложение В Классификация и модуляторы нуклеотидных Р2 рецепторов, их тканевое распределение, механизмы сигнальной трансдукции и роли в нервной системе [14, 28, 120, 296, 297] Р2 Селективн Механизм Тканевое Селективные подти ые сигнальной распределение Роли в клетках ЦНС антагонисты пы агонисты трансдукции и экспрессия Обуславливают ранний фазовый ответ в осуществлении Гладкая isoPPADS, симпатического и α,βмускулатура Ip5I, MRS Катионный парасимпатического MeАТФ, (ГМ), ганглии, 2159, канал нервного контроля BzATФ, мозжечок, NF023, (pCa2+/pNa+ органов, вызывают P2X1 HT-AMФ, сердце, NF279, ~4) повышение внутри PAPETтромбоциты, PPNDS, Вход внутрь клеточного кальция и ATФ, задние сурамин, клетки сократительный Ap5A корешки TNP-ATP ответ; короткий спинного мозга парасимпатический ответ резко усиливается при патологиях ЦНС, ГМ, Катионный сетчатка, Роль в сенсорной 2канал RB-2, хромаффинные трансмиссии и MeSATФ, (pCa2+/pNa+ P2X2 сурамин, клетки, модуляции ATФγS, ~2) PPADS вегетативные и синаптической Ap4A Вход внутрь чувствительны функции клетки е ганглии Роль в передаче α,βсигналов о Ганглии, MeАТФ , isoPPADS растяжении нейрональный D-β,γBBG, Ионный трубчатых или путь, MeАТФ, сурамин, канал мешотчатых органов P2X3 чувствительны HT-АМФ , NF023, (pCa2+/pNa+ и болевых сигналов еи Ap5A, Ip5I, ~4) (при сильном симпатические PAPETTNP-ATP растяжении) в нейроны АТФ афферентной нервной системе, 269 роль в сигнальной трансмиссии и высвобождении глутамата в ЦНС P2X4 P2X5 P2X6 P2X7 P2Y1 ЦНС, Катионный Сенсоры поджелудочная канал астроцитарной 2железа, (pCa2+/pNa+ активности и MeSАТФ, — толстый ~4) триггеры CTP кишечник, ГМ, Вход внутрь высвобождения семенники, клетки цитокинов микроглия Сердце, нервные 2Ингибируют ганглии, MeSАТФ , пролиферацию и Сурамин, Ионный спинной мозг, dАТФ ускоряют PPADS канал кишечник, (слабый) дифференцировку тимус, кожа клеток (пролиферирую щие клетки) Скелетная мускулатура Функционируют как Не функционирует как (СМ), ЦНС, гетеродимерные Ионный гомомультимер двигательные каналы в комбинации канал мотонейроны с P2X2 и P2X4 спинного субъединицами мозга, ганглии Ассоциируются с образованием крупных пор, Макрофаги, запускают апоптоз и лимфоциты, некроз клеток; Катионный апоптотические сенсоры KN-62 , канал, клетки, кожа, BzАТФ, астроцитарной HMA, формирован клетки ATФ активности и оАТФ, ие пор при поджелудочной триггеры BBG длительной железы, высвобождения активации астроциты, цитокинов; активация олигодедроцит критическая для ы, микроглия микроглияопосредованного повреждения АДФβS, A3P5PS, Gq/11 Мышцы, Метасимпатический 2RB-2, (повышение эндотелий, (интрамуральный) MeSАДФ, PPADS, ИТФ/ДАГ) эпителий, нервный контроль 270 тромбоциты, расслабления иммунные кишечника клетки, остеокласты Эпителий, Сенсоры остеокласты, астроцитарной УТФγS, Gq/11 эндотелий, активности и АТФγS Сурамин (повышение почки, иммунтриггеры ИТФ/ДАГ) ные клетки, высвобождения микроглия цитокинов RB2, Gq/11 Митогенная УТФ PPADS (повышение Эндотелиоциты активность (слабый) ИТФ/ДАГ) RB2, Gq/11 Эпителиоциты, УДФ, Роль в эпителиальной PPADS, (повышение T-клетки, УДФβS пролиферации Сурамин ИТФ/ДАГ) тимус, плацента Роль в созревании и ARGq/11 и Gs Селезенка, миграции C67085MX, RB2, (повышение кишечные дендритных клеток, dАТФ, Сурамин ИТФ/ДАГ и гранулоциты гранулоцитарной BzАТФ цАМФ) дифференцировке Сенсоры астроцитарной активности и триггеры ARвысвобождения C67085MX, Тромбоциты, 2Gi цитокинов; участие в ARглиальные MeSАДФ, (модуляция микроглиальном C69931MX, клетки, АДФ цАМФ) рекрутинге и клопидогре микроглия активации, л, АТФ хемотаксис микроглии на ранних стадиях ответа на повреждение ЦНС Селезенка, АДФ, 2головной и Функции пока не MeSАДФ, — костный мозг, выяснены АТФ лимфоузлы Плацента, Хемоаттрактантный УДФадипоциты, рецептор для галактоза, желудок, стволовых клеток — УДФкишечник, костного мозга, глюкоза отдельные активация участки мозга дендритных клеток 2-MeSАТФ, MRS 2179, PAPETMRS 2279 АТФ P2Y2 P2Y4 P2Y6 P2Y11 P2Y12 P2Y13 P2Y14 271 Приложение Г Особенности нейрогенеза и функционирования гематоэнцефалического барьера (ГЭБ)/нейроваскулярной единицы (НВЕ) при острой и хронической нейродегенерации развивающегося и зрелого мозга [93, 287, 305] Вид нейродегенерации Перинатальная гипоксия/ишемия (острая нейродегенерация развивающегося мозга) Ишемия головного мозга (острая нейродегенерация молодого и зрелого мозга) Нарушение механизмов нейрогенеза Нарушение механизмов функционирования ГЭБ и НВЕ Развитие нейровоспаления, Повышение регуляции гиперпродукция продукции клетокпровоспалительных цитокинов предшественников, уровня и апоптоз нейронов цитокинов и миграционных белков в SVZ приводит к Гиперактивация увеличению числа нейронов протеолитических ферментов, «взрослого» происхождения, развитие нейровоспаления т.е. к стимуляции нейрогенеза вследствие гипоксической гипоперфузии Существуют противоречивые данные: с одной стороны, при БП описано снижение нейрогенеза в SVZ. С другой стороны, описано, что после Развитие нейровоспаления, разрушения нигрогиперпродукция стриатального пути некоторые провоспалительных Болезнь Паркинсона предшественники из SVZ цитокинов, (хроническая начинают экспрессировать трансэндотелиальная миграция нейродегенерация тирозингидроксилазу и лейкоцитов вследствие зрелого мозга) нейрональные маркеры повреждения (нейрогенез дофаминергических нейронов дофаминергических нейронов (в т.ч. токсического) в SVZ), нейрогенез дофаминергических нейронов также может происходить в черном веществе Отмечена дисфункция Продукция аутоантител, Аутизм (хроническая нейрогенеза (усиление развитие нейровоспаления и нейродегенерация нейрогенеза при нарушении активация развивающегося миграции нейронов), трансэндотелиальной мозга) приводящая к нарушению миграции лейкоцитов цитоархитектоники мозга. 272 Приложение Д Особенности нейрон-глиальных взаимодействий при острой и хронической нейродегенерации развивающегося и зрелого мозга [18, 20, 33, 46, 82, 97, 104, 114, 129, 158, 173, 182, 188, 199, 201, 211, 213, 216, 221, 224, 240, 250, 252, 262, 276, 282, 305, 318, 320, 331, 339, 344, 364, 400, 407, 413, 414] Вид нейродегенерации Нарушение механизмов нейронглиальных взаимодействий Молекулы, играющие в роль в патогенезе межклеточных взаимодействий нарушение нейрон-астроглиального метаболического сопряжения, глиоваскулярного контроля АТФ и аденозин, локального кровотока в активных НАД+, пока не зонах мозга и изменением активности идентифицированная Перинатальная микроглиальных клеток, АДФР-циклаза, гипоксия/ишемия определяющих развитие подобная CD38 и (острая нейровоспаления, нарушение CD157, кальций, нейродегенерация структуры тесных контактов и селектины, развивающегося межклеточных взаимодействий в циркулирующие мозга) структуре ГЭБ и НВЕ, апоптоз аутоантитела к нейронов, нейровоспаление и фетальным белкам повреждение ГЭБ, экспрессия головного мозга, селектинов, вследствие чего АФК, NO повышается проницаемость капилляров АТФ и аденозин, CD38 и окситоцин, пока не нарушение структуры тесных идентифицированная Аутизм контактов и межклеточных АДФР-циклаза, (хроническая взаимодействий в структуре ГЭБ и подобная CD38 и нейродегенерация НВЕ, активация процесса CD157, кальций, CD31 развивающегося трансэндотелиальной миграции (sPECAM-1), мозга) лейкоцитов циркулирующие аутоантитела к фетальным белкам головного мозга, АФК, NO Ишемия головного Астроциты и микроглия претерпевают АТФ и аденозин, Р2Х7 мозга (острая процесс ремоделирования: рецепторы, НАД+, 273 нейродегенерация зрелого мозга) Болезнь Паркинсона (хроническая нейродегенерация зрелого мозга) реактивные астроциты могут потерять свои непересекающиеся домены, переплетаться, экзосомы могут вызывать трансфер антигенов микроглиальных клеток и индуцировать воспалительную реакцию. При реперфузии возникает дизрегуляция Cx43 в астроцитах и разобщение астроцитов в пределах астроглиального синцития. Нарушение структуры плотных контактов и межклеточных взаимодействий в структуре ГЭБ и НВЕ, экспрессия селектинов, вследствие чего повышается проницаемость капилляров Ранние стадии связаны с генерализованной атрофией астроглии, поздние - астроглиоз, активация микроглии. Нарушение структуры тесных контактов и межклеточных взаимодействий в структуре ГЭБ и НВЕ, экзосомы могут вызывать трансфер антигенов микроглиальных клеток и индуцировать воспалительную реакцию, перегруппировка и изменение экспрессии белков плотных контактов, увеличение экспрессии селектинов, что вызывает взаимодействие лейкоцитов с эндотелиоцитами сосудов CD38 и АДФР, кальций, Cx43, Panx1, Mac-1, MCP-1 и MIP2, селектины, АФК, NO АТФ и аденозин, Р2Х7 рецепторы, кальций, Cx43, НАД(Ф)Ноксидаза, CD11b/CD18 и Mac1, молекулы HLA-DR I и II классов, MCP-1 и MIP-2, ФНО-α, ИЛ-1 и ИФН-γ, iNOS, COX2, CD23, NO, АФК, LDLR, белки плотных контактов (ZO-1 и окклюдин), белки клеточной адгезии (ICAM-1 и др.) 274 Приложение Е Функции крыс и виды тестов, используемых для тестирования животных [1, 13, 17, 44, 137, 236, 300, 355, 366] Вид функции Тест Цели теста Оценка общей (локомоторной, вертикальной и горизонтальной двигательной активности) функции и Открытое поле исследовательской активности, вегетативной функции, редких или стереотипных движений, груминга, эмоциональности и т.д. Активный Общее обычное поведение: движения, прыжки, питье, мониторинг еда, груминг, фырканье, чихание, сон и т.д. Мышечная Прибор для изучения нейромышечных функций у сила грызунов Ротород Балансир Моторная координация, баланс и равновесие Карабканье по стене Моторны «Отпечатки Анализ походки по следам лап» е тесты «Вермишелев ый» тест «Семечковый» тест Оценка мелкой моторной функции передних лап Staircase test Single pellet reaching test Адгезивный тест Оценка моторной функции передних лап Цилиндрическ ий тест «Cужающаяся Оценка моторной функции задних лап дорожка» «Горячая площадка» Оценка пороговой чувствительности острой боли «Отдергивание хвоста» Сенсорны Используется для изучения многих свойств ЦНС, в том е тесты «Стартлчисле привыкания к раздражителям, преимпульсного рефлекс» ингибирования, оценка зрения крыс Ольфакторный Изучение способности распознавать запахи тест 275 Мотосенс орные тсеты Когнитив ная функция (обучение и память) Эмоциона льные/мо тивацион ные тесты Социальн ые тесты Вибриссовый Получение тактильной информации из окружающей тест среды Неврологическ ие шкалы Оценка мотосенсорных функций, неврологических (NSS, McGraw, рефлексов и неврологического статуса крыс Katz, Menzies, Garcia и др.) Рефлекс Ассоциативное обучение и память, обучение при активного многократных повторениях, оценка динамики избегания выработки условного рефлекса Водный Оценка пластичности обучения, кратковременной и лабиринт долговременной пространственной памяти, Морриса навигационного научения (в случае «Водного Т-лабиринт лабиринта») тест Барнса Тест на распознавание Оценка памяти на объекты нового объекта Пассивное/ активное Общепринятые тесты для оценки тревожного состояния избегание особей, позволяет оценить тревожность и параметры оценки риска, исследовательскую активность, Приподнятый крестообразны эмоциональное состояние, двигательную активность й лабиринт Тест Порсолта Оценка состояния депрессивности у животных Изучение поведения грызунов в условиях переменной стрессогенности, позволяет оценить предпочтение «Темнотемноты/света, выраженность и динамику поведения светлая «выглядывания», привыкание, ориентировочную камера» активность, исследовательскую активность, норковое поведение «Перегородка» 3-камерная активность Позволяет количественно оценить коммуникативность мышей по поведенческой активности Быстрый тест на социальное распознавание 276 Приложение Ж Шкала оценки признаков паркинсонизма Шкала в баллах 0б 1б 2б Основные признаки паркинсонизма Слабо Умеренно Двигательные Гипо-, бради- и выраженные выраженные расстройства олигокинезия двигательные двигательные отсутствуют расстройства расстройства Слабо Умеренно Постуральная Постуральная выраженная выраженная нестабильност нестабильность постуральная постуральная ь отсутствует нестабильность нестабильность Слабо Умеренно Неустойчивост Неустойчивость выраженная выраженная ь походки походки неустойчивость неустойчивость отсутствует походки походки Дополнительные признаки паркинсонизма Признаки паркинсонизма 3б Резко выраженные двигательные расстройства Резко выраженная постуральная нестабильность Резко выраженная неустойчивость походки Упор мышцы Упор мышцы в Упор мышцы в Ригидность Отсутствие на протяжении конце движения конце движения мышц по типу ригидности и всего сгибания при отсутствии при наличии «зубчатого гипертонии при гипертонии гипертонии колеса» мышц выраженной мышцы мышцы гипертонии Слабовыраженны Выраженный Выраженный й локальный локальный генерализованн тремор тремор ый тремор Отсутствие (локальный (локальный (генерализован Тремор покоя тремора мелкоамплитудны среднеамплиту ный мелко й тремор головы, дный тремор или передних лап и головы, хвоста, среднеамплиту хвоста) передних лап) дный тремор) Крепкое сжатие Попытка балансира и Падение без Сохранение сохранить отвисание попытки равновесия и равновесие на Оценка конечностей балансировать стабильное балансире равновесия вдоль балансира, или ухватиться положение (более 20 сек), или кружение на за балансир тела но падение с балансире (более (менее 20 сек) него 60 сек) Суммарное значение признаков паркинсонизма при осмотре животных: 0 баллов – отсутствие паркинсонизма, 1-18 баллов – наличие признаков паркинсонизма 277 Приложение И Параметры, оцениваемые в тесте «Открытое поле» [53, 58] Параметр Описание параметра Время с момента посадки крысы до начала движения крысы (в секундах) Латентный период Горизонтальная двигательная активность (ГДА) Climbing Вертикальная двигательная (ВДА) Rearing Общая ВДА Коротких Число и продолжительность грумингов Длинных Общее число Число норковых рефлексов Обнюхивание краев Голова «по глаза» Совокупное время замирания крысы Время нахождения в центральном круге Время нахождения в периферическом круге Гипо-, бради- и олигокинезия Наличие нарушений ходьбы Постуральная нестабильность Неустойчивость походки Число пересеченных квадратов Число подъемов на задние лапы, когда передние лапы упираются в стенку поля Число подъемов на задние лапы, когда передние лапы остаются на весу Общая сумма эпизодов ВДА (Climbing+Rearing) Число актов и продолжительность умывания области головы и передних лап Число актов и продолжительность умывания области головы и передних лап, переходящего в умывание всего тела и гениталий Общая сумма грумингов и их общая продолжительность (коротких+длинных) Число неглубоких норковых рефлексов (по типу обнюхивания краев) Число глубоких норковых рефлексов (с погружением головы крысы «по глаза») Совокупное время замирания крысы за последние 3 минуты (в секундах) Время нахождения крысы в центральном круге теста (в секундах) Время нахождения крысы в периферическом круге теста (в секундах) Наличие нарушений ходьбы в виде гипокинезии, брадикинезии или олигокинезии (в баллах от 0 до 3) Наличие постуральной нестабильности (в баллах от 0 до 3) Наличие неустойчивости походки (в баллах от 0 до 3) 278 Приложение К Стандартный протокол выполнения NSS теста [17] Макс. число баллов Протокол оценки (отметить ⃝ или подчеркнуть баллы справа при тестировании) Оценка моторной функции Подвешивание крысы за хвост: 0 0 1 – сгибание передней лапы 1 1 1 – сгибание задней лапы 2 2 1 – отклонение головы более чем на 10 градусов от вертикальной 3 3 оси в течение 30 сек Помещение крысы на пол: 0 0 0 – нормальное движение по полу 1 1 1 – неспособность сохранять направленное движение 2 2 2 – движение по кругу в сторону паретичных конечностей 3 3 3 – падение на паретичную сторону Оценка сенсорной функции: 0 0 1 – укладывание (зрительный и тактильный тесты) 1 1 1 – проприоцептивный тест (придавливание лапки к краю стола) 2 2 Отсутствие рефлексов или патологическая двигательная активность 1 – рефлекс с ушной раковины (при дотрагивании до слухового 0 0 бугорка – тряска головой) 1 1 1 – роговичный рефлекс (при дотрагивании до роговицы 0 0 кусочком ваты – мигание) 1 1 1 – рефлекс испуга (двигательный ответ на короткий шум при 0 0 щелкании зажима для бумаги) 1 1 Оценка равновесия: 0 – сохранение равновесия и стабильное положение тела 1 – захватывание балансира 2 – крепкое сжатие балансира и отвисание одной паретичной конечности вдоль балансира 0 0 3 – крепкое сжатие балансира и отвисание двух паретичных 1 1 конечностей вдоль балансира, или кружение на балансире (более 2 2 60 сек) 3 3 4 – попытка сохранить равновесие на балансире (более 40 сек), 4 4 но падение с него 5 5 5 – попытка сохранить равновесие на балансире (менее 40 сек), 6 6 но падение с него 6 – падение без попытки балансировать или ухватиться (менее 20 сек) 0 1 2 3 3 0 1 2 3 3 0 1 2 2 4 0 1 0 1 0 1 0 1 2 3 4 5 6 1 1 1 6 279 1 – судороги, миоклонус, миодистония 0 1 0 1 0 1 1 Итоговое количество баллов 18 Примечание: один балл соответствует невозможности выполнять задание или отсутствие тестируемого рефлекса; 13 – 18 баллов – выраженное повреждение; 7 – 12 баллов – повреждение средней степени тяжести; 1 – 6 баллов – умеренное повреждение. 280 Приложение Л Особенности выполнения тестов для оценки моторной дисфункции конечностей [133, 236] Цель проведения теста Оценка моторной дисфункции главным образом задних конечностей Оценка сенсомоторной дисфункции передних конечностей Оценка общей моторной Особенности проведения теста Оцениваемые параметры «Сужающаяся дорожка» (beam-walking) Установка представляет собой две сужающиеся доски, расположенные друг Число соскальзываний под другом, где нижняя доска имеет борта левой и правой для расположения конечностей конечностей во время животного во время соскальзывания. выполнения теста и Крыс обучали в течение 1 дня (10 длина прохождения попыток) пересекать «сужающуюся крысой теста (в дорожку» перед индукцией процентах от длины нейродегенерации. Затем крыс установки) тестировали до и после создания моделей, движения записывались на видеокамеру «Вибриссовый» тест По 5 раз с каждой стороны прикасались вибриссами животного поверхности стола, на что крыса должна реагировать вытягиванием соответствующей лапки (если прикасаются вибриссами слева, то крыса должна вытягивать вперед левую переднюю лапу) вперед (прямой вариант теста), существует также «перекрестный» Число попыток вибриссовый тест, при котором правильного соответствующая лапка поджимается выполнения теста слева экспериментатором и зажимается, а крыса и справа вынуждена вытягивать вперед противоположную конечность. Проводилось по 5 попыток слева и справа. Дисфункция данного теста у животных может быть связана как с моторной дисфункцией передних конечностей, так и повреждением вибрисс (сенсорный дефицит) Адгезивный тест Для проведения теста животное Оценивали время помещали в банку с прозрачными снятия скотча с левой и 281 дисфункции высокими стенками, до выполнения теста, правой лап, по передних перед посадкой крысы в тест, ей на бинарной шкале конечностей гладкую часть передних лап приклеивали оценивали факт маленькие кусочки скотча (площадью 113 наличия дисфункции мм2). При выполнении адгезивного теста слева и справа: 0 баллов крыса в норме должна снять липкие – выполнен тест (<60 с), кусочки с обеих лап за 2 минуты (не 1 балл – не выполнен более 60 секунд с каждой стороны), в тест (>60 с) этом процессе участвуют не только обе лапы, но и зубы животного, при повреждении ЦНС отмечается удлинение времени снятия крысой скотча и отклонение животного в унилатеральную сторону, что свидетельствует о сенсомоторной асимметрии и дисфункции пораженной конечности. «Вермишелевый» тест (Vermicelli Handling Test) Для проведения вермишелевого теста использовали кусок сырой вермишели длиной 6 см. При манипуляциях крысой Оценка передними лапами одной лапой она типичное «мелкой» удерживает кусок вермишели, а другую использование моторной использует для мелких движений движений было дисфункции пальцами, чтобы придвинуть кусок в рот. принято за 0 баллов, передних При поражении передних конечностей атипичные движения – конечностей отмечается плохая способность за 1 балл. удержания куска вермишели, появление аномальных и неуклюжих движений (Приложение М). «Семечковый» тест (Sunflower Seed Opening) Оценивали число съеденных семян из 5, время открытия В отдельную прозрачную клетку клали 5 каждого семени Оценка семян, после чего туда помещали крысу и подсолнечника и число «мелкой» проводили видеонаблюдение. У частей кожуры, моторной интактных животных нормой является оставшихся после дисфункции открытие 5 семян за общее время до 175 открытия семян. По передних секунд (время открытия каждого семечка бинарной шкале также конечностей - до 35 секунд) и очистка кожуры на 11 оценивали факт частей и менее. наличия дисфункции: 0 баллов – выполнен тест (< 175 с или <11 частей кожуры), 1 балл – не 282 выполнен тест (>175 с или >11 частей). Оценка «мелкой» моторной дисфункции передних конечностей «Лестничный» тест (Staircase test) Является высокочувствительным тестом, позволяющим оценить незначительные нарушения в работе конечности, кисти и пальцев. Тест используется для оценки неврологического дефицита у крыс при моделировании различных патологических состояний. Животным во время обучения уменьшали на 90% от привычного суточный рацион. В каждую Оценивали число лунку теста помещали по 3 пищевые съеденных пищевых гранулы (по 21 с каждой стороны). гранул с левой и правой Животное помещали внутрь теста через стороны аппарата. заднюю часть аппарата и закрывали крышку теста на 15 минут. Животное тренировали в течение 14 суток подряд. Из теста исключали животных, которые не доставали по 9 пищевых гранул с каждой стороны за 3 дня обучения. Интактные животные в норме способны достать по 9 и более кусочков пищи с каждой стороны. 283 Приложение М Типичное и атипичное положение лап крысы при выполнении вермишелевого теста [396] Типичное положение лап при вермишелевом тесте: Крысы используют скоординированное асимметричное удержание вермишели (B): одна лапа является «захватывающей» (держит макаронину в лапе целиком и, как правило помещается ниже, т.е. далеко от рта). Лапа «направляющая» («лапа-гид») располагается ближе ко рту в начале еды и используется для направления вермишелины в рот. Часто «лапа-гид» держит макаронину между одним(двумя) пальцами и частью большого пальца. Во время еды лапы могут сближаться (С), но все равно наблюдается асимметричность в положении лап (выше «лапа-гид», ниже лапа «захватывающая». Когда почти весь кусок съеден, лапы сближаются полностью и располагаются симметрично (D). 284 Атипичное и спорадическое положение лап при вермишелевом тесте: A - лапы находятся вместе долго (приведение лап в симметричное положение, без четкого разделения функций лап); B - лапа «направляющая» и «захватывающая» меняются местами, роли нормальных конечностей включаются лишь во время еды; C - отсутствие контакта, лапа не контактирует с макаронами во время еды, за исключением моментов корректировки передними лапами еды; D - роняет, макаронное изделие упало в начале еды; E - лапы не в состоянии двигаться симметрично; Вытягивают морду (F) и используют рот (G) для передвижения макаронины; «Сгорбившаяся поза»: крыса склоняется над макаронами и движется вниз (H, J). 285 Приложение Н Тесты для оценки неврологического и физического развития крысят Р1 Разм ер поме та, числ о живы хи мерт вых крыс ят Р Р 2 3 Р4 числ о живы хи мерт вых крыс ят Дни постнатального развития животных Р Р Р Р1 Р7 Р8 Р10 Р12 5 6 9 1 числ о живы плавател хи ьный мерт тест вых крыс ят плавател ьный тест появление первичног о прорезывание волосяног резцов (в среднем о покрова – 8 день) (в норме в среднем – 5 день) поиск гнезда (Р9-Р11), отдельно отлипание оценивали ушной отрицательный ползание и раковины геотаксис ольфакторную (в среднем (оценивается с Р5, в дискриминаци – 2 день) среднем – 7 день) ю (обонятельная реакция, в среднем – 1011 день) подъем оцен головы и ка передних веса лап (Р8-Р9) переворачивание на плоскости (с Р2, в среднем – 8 день) плавател ьный тест Р1 Р1 Р1 Р1 Р14 3 5 6 7 числ о живы мышечна хи я сила мерт вых крыс ят опора на задние конечности, подъем всего тела открытие глаз (в среднем – 14 день) оцен ка веса 286 Приложение П Протокол проведения иммуногистоцитохимии (Cuello A. C., 1993) Протокол иммуногистохимического метода для парафиновых блоков 1. Депарафинизация среза: 1.1. 3 смены ксилола по 5 минут; 1.2. 2 смены абсолютного этанола по 5 минут; 1.3. 1 смена 95% этанола и 1 смена 79% этанола по 3 минуты; 1.4. 1 смена PBS по 5 минут. 2. Предобработка среза: 2.1. на срез нанести 15 мкл раствора протеиназы К (предварительно готовится stock solution: 5 мг/мл протеиназы К в PBS, который разливается по аликвотам (по 10 мкл) и замораживается; при использовании этот раствор разводится до концентрации 20 мкг/мл в PBS (разведение 250 раз: 2 мкл stock solution + 498 мкл PBS); 2.2. инкубировать срез 15 минут при комнатной температуре во влажной камере; 2.3. промыть срез 2-мя сменами PBS по 2 минуты. 3. Блокирование сывороткой: 3.1. на срез нанести 15 мкл 10% раствора WGS (whole goat serum) в PBS; 3.2. инкубировать срез 20-30 минут при +37оС во влажной камере; 3.3. осторожно слить раствор со среза. 4. Добавление первичных антител: 4.1. на срез нанести 15 мкл первичных антител в рабочем разведении (обычно 1:25-1:100) в PBS с 1% WGS ; 4.2. инкубировать срез при +37оС 1 час (или в холодильнике до 18 часов) во 287 влажной камере; 4.3. промыть срез 2-мя сменами PBS по 2 минуты. 5. Добавление вторичных антител (в темноте): 5.1. на срез нанести 15 мкл вторичных антител в рабочем разведении (обычно 1:100-1:200) в PBS с 1% WGS; 5.2. инкубировать срез при +37оС 30 минут (или в холодильнике 30 минут) во влажной камере в темноте; 5.3. промыть срез 2-мя сменами PBS по 2 минуты. 6. Микроскопирование: 6.1. нанести на срез монтирующую жидкость (15 мкл 70% глицерина в PBS); 6.2. накрыть срез покровным стеклом; 6.3. микроскопировать. Примечание: в случае использования первичных меченых антител этап 5 пропускается, а этап 4 проводится в темноте. Протокол иммуногистоцитохимического метода для препаратов клеток и замороженных срезов 1. Фиксация препарата: 1.1. поместить препарат в 1% раствор формалина или в парах 10% формалина (рН=7,4); 1.2. инкубировать препарат в растворе формалина 10 минут при комнатной температуре (или 18 часов в холодильнике); 1.3. удалить остатки формалина с препарата; 1.4. промыть препарат 2-мя сменами PBS по 5 минут; 288 2. Пост-фиксация (пермеабилизация препарата): 2.1. поместить препарат в охлажденную смесь этанола и уксусной кислоты (2:1); 2.2. инкубировать препарат 5 минут в морозильнике (-20оС); 2.3. промыть препарат 2-мя сменами PBS по 5 минут. 3. Блокирование сывороткой: 3.1. на срез нанести 15 мкл 10% раствора WGS (whole goat serum) в PBS; 3.2. инкубировать срез 20-30 минут при +37оС во влажной камере; 3.3. осторожно слить раствор со среза. 4. Добавление первичных антител: 4.1. на срез нанести 15 мкл первичных антител в рабочем разведении (обычно 1:25-1:100) в PBS с 1% WGS ; 4.2. инкубировать срез при +37оС 1 час (или в холодильнике до 18 часов) во влажной камере; 4.3. промыть срез 2-мя сменами PBS по 2 минуты. 5. Добавление вторичных антител (в темноте): 5.1. на срез нанести 15 мкл вторичных антител в рабочем разведении (обычно 1:100-1:200) в PBS с 1% WGS; 5.2. инкубировать срез при +37оС 30 минут (или в холодильнике 30 минут) во влажной камере в темноте; 5.3. промыть срез 2-мя сменами PBS по 2 минуты. 6. Микроскопирование: 6.1. нанести на срез монтирующую жидкость (15 мкл 70% глицерина в PBS); 6.2. накрыть срез покровным стеклом; 6.3. микроскопировать. 289 Примечание 1: в случае использования первичных меченых антител этап 5 пропускается, а этап 4 проводится в темноте. Примечание 2: можно использовать препарат клеток, приготовленный следующим образом: 1. Суспензию клеток (5 х 106/мл) инкубировать в свежеприготовленном 1% растворе формалина (рН=7,4) 10 минут при комнатной температуре. 2. Нанести 50-100 мкл клеточной суспензии на предметное стекло. 3. Поместить препарат в охлажденную смесь этанола и уксусной кислоты (2:1). 4. Инкубировать препарат 5 минут в морозильнике (-20оС). 5. Промыть препарат 2-мя сменами PBS по 5 минут. 6. Перейти к этапу 3. 290 Приложение Р Протокол метода детекции апоптоза TUNEL Набор “TUNEL” (Apo-BrdU Apoptosis Detection Kit, 88-6671, Millipore) для препаратов клеток и замороженных срезов 1. Фиксация препарата: 1.1. поместить препарат в 1% раствор формалина (рН=7,4) или в парах 10% формалина; 1.2. инкубировать препарат в растворе формалина 15 минут на льду (или 18 часов в холодильнике); 1.3. удалить остатки формалина с препарата; 1.4. промыть препарат 2-мя сменами PBS по 5 минут (1 смена, если в парах); 2. Пост-фиксация (пермеабилизация препарата): 2.1. поместить препарат в охлажденную смесь этанола и уксусной кислоты (2:1); 2.2. инкубировать препарат 5 минут в морозильнике (-20оС); 2.3. промыть препарат 1-й сменой PBS на 5 минут, 1-й сменой 1-го отмывочного буфера (Wash Buffer, голубая крышка) на 5 минут. 3. На срезы внести раствор для окраски ДНК, приготовленный, как указано ниже (объем рассчитан на 3 среза): 3.1. Приготовить раствор для окраски ДНК (на 3 среза): TdT Reaction Buffer (зелёная крышка) - 10.00 мкл, TdT Enzyme (жёлтая крышка) - 0.75 мкл, Br-dUTP (фиолетовая крышка) - 8.00 мкл, дистиллированная вода - 32.25 мкл ; 3.2. Осторожно удалить остатки PBS со среза, добавить 17 мкл раствора для окраски ДНК на срез; 3.3. Инкубировать во влажной камере в термостате при +37оС 1 час. Замечание: Смешивайте только количество реагентов, достаточное для 291 проведения серии тестов. Раствор для окраски ДНК сохраняет активность в течение примерно 24 часов. Замечание: Реакцию окрашивания ДНК допустимо ставить на ночь при 22-24°C. 3.4. Промыть препарат 2-мя сменами 2-го отмывочного буфера (Rinse Buffer, красная крышка) по 5 минут. 4. Добавление раствора антител, приготовленного, как указано ниже (объем рассчитан на 3 среза): 4.1. Приготовить раствор антител (на 3 среза): Fluorescein~PRB-1 (оранжевая крышка) – 0,5 мкл, Rinse Buffer (красная крышка) – 44,5 мкл; 4.2. Инкубировать 30 минут в темноте при комнатной температуре (Совет: прикройте стекла алюминиевой фольгой или работайте в специальной темной комнате); 4.3. Добавить на срез 15 мкл раствора пропидия йодида/РНКазы А (Propidium Iodide/RNase A Solution, флакон из тёмного стекла) – инкубировать 30 минут в темноте при комнатной температуре. 4.4. промыть срез в 1 смене PBS 2 минуты при комнатной температуре в темноте. 5. Монтирование и микроскопия: 5.1. Анализ следует провести в течение не более 3 часов после окрашивания. 5.2. Добавить на срез монтирующую жидкость по 15 мкл на срез (если не добавляли на этапе 4 ПЙ с раствором РНКазы А, то можно его добавить в монтирующую смесь – в концентрации 0,5-1,0 мкл/мл монтирующей жидкости); 5.3. Накрыть срез покровным стеклом; 5.4. Микроскопировать. 292 Набор «MEBSTAIN Apoptosis kit Direct», Part # IM3171 1 . Депарафинизация среза: 1.1.3 смены ксилола по 3 минут; 1.2. 2 смены абсолютного этанола по 5 минут; 1.3. 1 смена 90% этанола и 1 смена 80% этанола по 3 минуты; 1.4. 4 смены дистиллированной воды по 2 минуты 2.Обработка протеиназой К (РК)*: * Примечание: этот пункт не требуется для замороженных срезов. 2.1.На срез нанести 500 мкл PBS и инкубировать во влажной камере 30 минут при 37°С; 2.2.Осторожно удалить остатки PBS со среза; 2.3.На срез нанести 15 мкл раствора протеиназы К (предварительно готовиться раствор: Протеиназа К разводится растором PBS в 25 раз, то есть на три среза 2 мкл ПК и 48 мкл PBS, полученный раствор перед нанесением прогреть при 37°С); 2.4. Промыть срез 4 сменами дистиллированной воды по 2 минуты З.В это время приготовить раствор TdT (готовить на льду!): смешать в эппендорфе 45 мкл TdT-buffer, 2,5 мкл FITC-Dutp и 2,5 мкл TdT, хорошо перемешать на вортексе, хранить при 4°С, количества достаточно для 3 срезов. 4.Нанести на срез 15 мкл TdT-buffer, инкубировать при комнатной температуре 10 мин во влажной камере. Удалить остатки TdT-buffer со среза. 5.Нанести на срез предваварительно приготовленного (см.п.З) раствора TdT и инкубировать 1 час во влажной камере при 37°С. 6. Осторожно удалить остатки раствора TdT со среза. 293 7.Нанести на срез раствор ТВ (предварительно готовиться разведением ТВbuffer в 10 раз дистиллированной водой, для трех срезов: 5 мкл TB-buffer + 45 мкл дистиллированной воды - храниться при +4°С!). 8.Инкубировать при комнатной температуре 15 мин. 9.Промыть срезы 4 сменами дистиллированной воды по 2 минуты. 10.Добавить 15 мкл (на 1 стекло) пропидия йодида (из набора Annexin V), содержащих 0,5 мгл/мл (0,5-1 мкл ПЙ: 14-14,5 мкл PBS на 1 стекло), и инкубировать 15-20 мин при 4°С. 11. Промыть срезы в растворе PBS 3 мин. 12.Нанести монтирующую жидкость. 13 .Микроскопировать. Вскрытый TB-buffer хранить при +4°С. Вскрытые протеиназу К, TdT, TdT-buffer, FITC-Dutp хранить при -20°С. 294 Приложение С Протокол оценки АДФР-циклазной активности CD38 клеток нейроглии крыс (R.M. Graeff, 1994) Из клеточной суспензии (600 мкл) отделяли 100 мкл на АДФ- 1. рибозилциклазную активность, 500 мкл - на определение содержания белка по микрометоду Лоури. 100 мкл суспензии смешивали с реакционной смесью до конечного 2. объема 2 мл: 60 мкM NGD+(16,5 мкл 7млМ р-ра), 50 млМ Трис-HCl (pH 6.6)- 1663,5 мкл, 100 млМ KCl (200 мкл 1М р-ра), 10 мкM CaCl2 (20 мкл 1 млМ р-ра) Образцы помещали в спектрофлоуриметр CM 2203 (ЗАО «Солар», 3. Беларусь) в режиме «кинетика флуориметрии» в режиме постоянного перемешивания при температуре 37ºC, длина волны возбуждения λ=300 нм, длина волны эмиссии λ=410 нм) в течение 15 минут. По кривой кинетики обнаруживали максимальное значение флуоресценции (х) и соответствующее ему время (y) и значение флуоресценции, соответствующее 0 минуте. Разность м/у 0 и У минутой выражали по формуле: ХУ-Х0 (1) Пересчет активности АДФР-циклазы проводили по формуле: (ХУ-Х0) · 1000 · 10 ед/мин/мг белка (2) содержание белка (мкг/мл) · У (мин) где 1000 – коэффициент пересчета мкг в мг, 10 – коэффициент пересчета объема. 295 Приложение Т Протокол оценки концентрации белка в образце микрометодом Лоури без осаждения белка (стандартный протокол MicroLowry test, Sigma, USA) Описание метода Процедура базируется на двух химических реакциях. Первая – биуретовая реакция, в которой в щелочной среде образуются комплексы реактива тартрата с пептидными связями. Вторая реакция - добавление реактива Фолина и фенольного реактива Чиокальто, что приводит к фиолетовой окраске. Проводится фотометрия при поглощении между λ=500 и λ=800 нм. Концентрация белка определяется по калибровочной кривой. Процедура определения содержания белка без его осаждения: 1. Подготовить пробирки для опытных, стандартных растворов белка и контрольную пробу по схеме: Названия проб Опыт Контроль Суспензия клеток Дистиллированная вода Реактив Лоури Реактив Станд. Фолина и р-р Чиокальто белка 0,5 мл 1,25 мл 0,5 мл 0,25 мл - 0,5+1,25 мл 0,5 мл 0,25 мл 0,5 мл 0,25 мл 0,5 мл 0,25 мл 0,5 мл 0,25 мл 0,5 мл 0,25 мл 0,5 мл 0,25 мл Станд.р-ры: 50 мкг/мл - 100 мкг/мл - 200 мкг/мл - 300 мкг/мл - 400 мкг/мл - 0,438+1,25 мл 0,375+1,25 мл 0,250+1,25 мл 0,125+1,25 мл 1,25 мл 0,062 мл 0,125 мл 0,250 мл 0,375 мл 0,5 мл 296 2. Добавить по 0,5 мл раствора Лоури к стандартным, контрольной и опытным растворам. Все растворы должны постоять при комнатной температуре 20 минут. 3. Добавить по 0,25 мл рабочего раствора реактивов Фолина и Чиокальто в каждую пробирку, перемешать. Дать постоять 30 минут, разовьется фиолетовая окраска. 4. Добавить по 1,25 мл дистиллированной воды в каждую пробирку, перемешать. 5. Перелить растворы в кюветы и измерить степень поглощения стандартных растворов и опытных растворов против контрольного бесцветного раствора при длине волны между 500 и 800 нм. По степени поглощения стандартных растворов построить калибровочную кривую. Обратите внимание: яркость окраски варьирует при определении белков с различной структурой. 6. Определить концентрацию белка в опытных растворах по калибровочной кривой. Умножить результаты на соответствующий фактор разведения (в данном случае 2), чтобы получить концентрацию белка в первоначальном образце. 297 Приложение У Параметры модуляции экспрессии и АДФР-циклазной активности CD38 клеток нейроглии и функциональной активности микроглии крыс Модуляторы Концентрации В каких методах модуляторов используются Параметры инкубации Оценка АДФР-циклазной активности CD38 АТФ 1 мМ нейроглии Оценка функциональной инкубация 15 мин при 37°С активности микроглии Оценка АДФР-циклазной активности CD38 оАТФ 100 мкМ нейроглии Оценка функциональной активности микроглии инкубация с 5 мкМ АТФ 15 мин при 37°С, затем инкубация с оАТФ 60 мин при 37°С Оценка АДФР-циклазной активности CD38 НАД+ 1 мМ нейроглии Оценка функциональной инкубация 15 мин при 37°С активности микроглии DPI 10 мкМ Оценка функциональной инкубация 45 мин при активности микроглии 22°С 298 Приложение Ф Протокол оценки концентрации лактата и НАД+ (Hohorst H.J., 1957; Nisselbaum J.S. et al., 1969) Определение концентрации лактата 1. Состав реакционной смеси: гомогенат (20 мкл), дистиллированная вода (500 мкл), 1 М глициновый буфер (рН 9,5, 400 мкл), 0,56 М гидразина сульфат (рН 8,6, 50 мкл), 0,1 М НАД+ (рН 6,75, 20 мкл). 2. Через 5 минут (после перемешивания) при + 37оС добавляют 10 мкл (2,7 единиц/мкл) лактатдегидрогеназы. 3. В динамике измеряют поглощение при 340 нм (соответствует степени восстановления НАД+ до НАДН). 4. В качестве контроля используют смесь без добавления фермента или без гомогената. Определение концентрации НАД+ Концентрация НАД+ в тканевом гомогенате, клеточном экстракте или супернатанте плазмы определяется спектрофотометрическим ультрамикрометодом с использованием алкогольдегидрогеназы и тиазолила синего. Инкубационная среда содержит (1 мл): -0,08 мг тиазолила синего, -0,3 мг феназина метосульфата, -0,25 мг алкогольдегидрогеназы, -0,065 М глицилглициновый буфер (рН 7,4), -0,065 М никотинамид, -0,33 М этанол, -0,1 мл клеточного экстракта или тканевого гомогената (опытная проба). Оптическая плотность продукта реакции измеряется 30 минут в динамике при 556 нм при 37°С. 299 Приложение Х Корреляционный анализ в ротеноновой модели хронической нейродегенерации Сила и уровень значимости корреляционных связей Группы животных К5 Э6 Между признаками развития ротенонового паркинсонизма (сумма 0,93* баллов) и уровнем экспрессии CD38 (количеством CD38+ клеток) Между признаками развития ротенонового паркинсонизма (сумма 0,84 баллов) и АДФР-циклазной активностью Между признаками развития ротенонового паркинсонизма (сумма -0,72 баллов) и функциональной активностью клеток среднего мозга Между признаками развития ротенонового паркинсонизма (сумма баллов) и уровнем коэкспрессии CD157/CD11b/CD18 (количеством -0,83 + + + CD157 /CD11b /CD18 клеток) Между признаками развития ротенонового паркинсонизма (сумма баллов) и уровнем экспрессии CD38 на астроцитах (количеством 0,99** + + GFAP /CD38 клеток) Между признаками развития ротенонового паркинсонизма (сумма -0,91* -0,89* баллов) и уровнем экспрессии P- гликопротеина (количеством Pgp+) Между концентрацией лактата и активностью АДФР-циклазы 0,88* + Между концентрациями лактата и НАД -0,78 Между концентрацией лактата и уровнем экспрессии Cx43 -0,84 (количеством Cx43+ клеток) Между концентрацией лактата и количеством апоптотических клеток -0,82 Между концентрацией лактата и функциональной активностью 0,89 клеток среднего мозга Между уровнем коэкспрессии CD157/CD11b/CD18 и экспрессии 0,77 CD38 (количеством CD157+/CD11b+/CD18+ и CD38+ клеток) Между уровнем коэкспрессии CD157/CD11b/CD18 (количеством -0,74 CD157+/CD11b+/CD18+ клеток) и количеством апоптотических клеток Между уровнем коэкспрессии CD157/CD11b/CD18 (количеством -0,99* CD157+/CD11b+/CD18+ клеток) и активностью АДФР-циклазы Между уровнем нейрогенеза в среднем мозге (количеством Pax6+ -0,98 клеток) и уровнем экспрессии CD38 (количеством CD38+ клеток) Между уровнем нейрогенеза в среднем мозге (количеством Pax6+ -0,77 клеток) и уровнем экспрессии коннексина 43 (количеством Cx43+) Между уровнем нейрогенеза в среднем мозге (количеством Pax6+ 0,83 клеток) и количеством апоптотических клеток Между уровнем нейрогенеза в среднем мозге (количеством Pax6+ клеток) и активностью АДФР-циклазы 0,91 - 300 Между уровнем нейрогенеза в среднем мозге (количеством Pax6+ клеток) и функциональной активностью клеток среднего мозга Между уровнем нейрогенеза в среднем мозге (количеством Pax6+ клеток) и концентрацией НАД+ Между уровнем нейрогенеза в среднем мозге (количеством Pax6+ клеток) и уровнем коэкспрессии CD157/CD11b/CD18 (количеством CD157+/CD11b+/CD18+ клеток) Между уровнем экспрессии C3/C3b компонента комплемента (количеством C3/C3b+ клеток) и уровнем экспрессии CD38 (количеством CD38+ клеток) Между уровнем экспрессии C3/C3b компонента комплемента (количеством C3/C3b+ клеток) и количеством апоптотических клеток Между уровнем экспрессии C3/C3b компонента комплемента (количеством C3/C3b+ клеток) и функциональной активностью клеток среднего мозга Между уровнем экспрессии C3/C3b компонента комплемента (количеством C3/C3b+ клеток) и уровнем НАД+ Между уровнем экспрессии C3/C3b компонента комплемента (количеством C3/C3b+ клеток) и уровнем нейрогенеза в среднем мозге (количеством Pax6+ клеток) Между уровнем экспрессии CD38 на нейронах (количеством NSE+/CD38+ клеток) и количеством клеток в апоптозе Между уровнем экспрессии CD38 на нейронах (количеством NSE+/CD38+ клеток) и активностью АДФР-циклазы Между уровнем экспрессии CD38 на нейронах (количеством NSE+/CD38+) и функциональной активностью клеток среднего мозга Между уровнем экспрессии CD38 на нейронах (количеством NSE+/CD38+ клеток) и концентрацией НАД+ Между уровнем экспрессии CD38 на нейронах (количеством NSE+/CD38+ клеток) и уровнем нейрогенеза в среднем мозге (количеством Pax6+ клеток) Между уровнем экспрессии CD38 на нейронах (количеством NSE+/CD38+ клеток) и уровнем коэкспрессии CD157/CD11b/CD18 (количеством CD157+/CD11b+/CD18+ клеток) Между уровнем экспрессии CD38 на нейронах (количеством NSE+/CD38+ клеток) и уровнем экспрессии C3/C3b компонента комплемента (количеством C3/C3b+ клеток) Между уровнем экспрессии CD38 на активированной микроглии (количеством MAP2+/CD38+ клеток) и количеством клеток в апоптозе Между уровнем экспрессии CD38 на активированной микроглии (количеством MAP2+/CD38+ клеток) и функциональной активностью клеток среднего мозга Между уровнем экспрессии CD38 на активированной микроглии (количеством MAP2+/CD38+ клеток) и НАД+ -0,75 - 0,87 - -0,89 - 0,98 - -0,97 - 0,94 - -0,98 - -0,93 - 0,85 - 0,89 - -0,78 0,85 0,89 - -0,86 - 0,99* - -0,95 - 0,99** - -0,98 - 0,99 - 301 Между уровнем экспрессии CD38 на активированной микроглии (количеством MAP2+/CD38+ клеток) и концентрацией лактата Между уровнем экспрессии CD38 на активированной микроглии (количеством MAP2+/CD38+ клеток) и уровнем нейрогенеза в среднем мозге (количеством Pax6+ клеток) Между уровнем экспрессии CD38 на активированной микроглии (количеством MAP2+/CD38+ клеток) и C3/C3b компонента комплемента (количеством C3/C3b+ клеток) Между уровнем экспрессии CD38 на активированной микроглии и на нейронах (количеством MAP2+/CD38+ и NSE+/CD38+ клеток) Между уровнем экспрессии CD38 на астроцитах (количеством GFAP+/CD38+ клеток) и коннексина 43 (количеством Cx43+ клеток) Между уровнем экспрессии CD38 на астроцитах и активностью АДФР-циклазы Между уровнем экспрессии CD38 на астроцитах (количеством GFAP+/CD38+ клеток) и коэкспрессии CD157/CD11b/CD18 (количеством CD157+/CD11b+/CD18+ клеток) Между уровнем экспрессии CD38 на астроцитах (количеством GFAP+/CD38+ клеток) и уровнем нейрогенеза в среднем мозге (количеством Pax6+ клеток) Между функциональной активностью клеток среднего мозга и уровнем НАД+ Между функциональной активностью клеток среднего мозга и количеством CD38+ клеток Между количеством апоптотических клеток и уровнем экспрессии коннексина 43 (количеством Сх43+ клеток) Между уровнем экспрессии CD38 на астроцитах (количеством GFAP+/CD38+ клеток) и уровнем экспрессии P-гликопротеина (количеством Pgp+ клеток) Между активностью АДФР-циклазы и уровнем экспрессии Pгликопротеина (количеством Pgp+ клеток) Между уровнем экспрессии CD38 и Pgp (количеством CD38+ и Pgp+) Между нарушением социального поведения (время, проведенное в отсеке 3-камерная активность со «знакомым» самцом) и уровнем экспрессии CD38 на нейронах (количеством CD38+/NSE+ клеток) Между нарушением эмоционального поведения (время, проведенное в открытом рукаве теста ПКЛ) и уровнем экспрессии CD38 на нейронах (количеством CD38+/NSE+ клеток) * - уровень значимости в корреляционном анализе -0,82 - 0,84 -0,73 -0,98 -0,78 0,86 -0,83 0,96 - -0,80 - 0,83 -0,87* - -0,84 -0,87* - - -0,89* 0,85 - 0,95 - -0,87* - - -0,72 -0,67 - 0,61 -0,44 302 Приложение Ц Корреляционный анализ в модели перинатальной гипоксии-ишемии при острой нейродегенерации Группы Сила и уровень значимости корреляционных связей Между выраженностью неврологической симптоматики и уровнем экспрессии CD38 (количеством CD38+ клеток) Между выраженностью неврологической симптоматики и АДФР-циклазной активностью Между выраженностью неврологической симптоматики и уровнем НАД+ Между АДФР-циклазной активностью фермента CD38 и уровнем его экспрессии (количеством CD38+ клеток) Между активностью АДФР-циклазы и уровнем НАД+ Между активностью АДФР-циклазы и количеством апоптотических клеток Между уровнем НАД+ и количеством апоптотических клеток Между количеством апоптотических клеток и уровнем экспрессии CD38 (количеством CD38+ клеток) * - уровень значимости в корреляционном анализе животных К4 Э5 0,54 - 0,54 - 0,55 - -0,77 0,81 0,84 - -0,62 - -0,49 - 0,59 - 303 Приложение Ш Корреляционный анализ в модели ишемии головного мозга при острой нейродегенерации Группы контроля Сила и уровень значимости корреляционных связей Между выраженностью неврологической симптоматики (сумма баллов) и уровнем экспрессии CD38 (количеством CD38+ клеток) Между выраженностью неврологической симптоматики (сумма баллов) и функциональной активностью клеток мозга Между выраженностью неврологической симптоматики (сумма баллов) и уровнем НАД+ Между выраженностью неврологической симптоматики (сумма баллов) и уровнем экспрессии CD38 на нейронах (количеством NSE+/CD38+ клеток) Между выраженностью неврологической симптоматики (сумма баллов) и уровнем нейрогенеза в коре головного мозга (количеством Pax6+ клеток) Между выраженностью неврологической симптоматики (сумма баллов) и уровнем экспрессии C3/C3b компонента комплемента (количеством C3/C3b+ клеток) Между выраженностью неврологической симптоматики (сумма баллов) и уровнем коэкспрессии CD157/CD11b/CD18 (количеством CD157+/CD11b+/CD18+ клеток) Между выраженностью неврологической симптоматики (сумма баллов) и уровнем экспрессии CD38 на нейронах (количеством NSE+/CD38+ клеток) Между выраженностью неврологической симптоматики (сумма баллов) и уровнем экспрессии CD38 на астроцитах (количеством GFAP+/CD38+ клеток) Между концентрацией лактата и уровнем экспрессии CD38 (количеством CD38+ клеток) Между концентрацией лактата и количеством апоптотических клеток Между концентрацией лактата и активностью АДФР-циклазы Между концентрацией лактата и функциональной активностью клеток головного мозга Между уровнем коэкспрессии CD157/CD11b/CD18 (количеством CD157+/CD11b+/CD18+ клеток) и уровнем НАД+ Группы животных К1 К2 К3 - - -0,88 - -0,74 - 0,99** - -0,79 0,97 - - -0,92 -0,99* - 0,99** - - - - 0,96 - - 0,96 0,99* - - 0,99* - - - 0,98 - -0,96 - - -0,94 - - 0,92 0,99* - 304 Между уровнем коэкспрессии CD157/CD11b/CD18 (количеством CD157+/CD11b+/CD18+ клеток) и уровнем экспрессии CD38 (количеством CD38+ клеток) Между уровнем коэкспрессии CD157/CD11b/CD18 (количеством CD157+/CD11b+/CD18+ клеток) и активностью АДФР-циклазы Между уровнем нейрогенеза в коре головного мозга (количеством Pax6+ клеток) и количеством апоптотических клеток Между уровнем нейрогенеза в коре головного мозга (количеством Pax6+ клеток) и уровнем экспрессии CD38 (количеством CD38+ клеток) Между уровнем нейрогенеза в коре головного мозга (количеством Pax6+ клеток) и функциональной активностью клеток головного мозга Между уровнем нейрогенеза в коре головного мозга (количеством Pax6+ клеток) и концентрацией НАД+ Между уровнем нейрогенеза в гиппокампе (количеством Pax6+ клеток) и уровнем экспрессии CD38 (количеством CD38+ клеток) Между уровнем нейрогенеза в гиппокампе (количеством Pax6+ клеток) и уровнем экспрессии P2X7 рецепторов (количеством P2X7+ клеток) Между уровнем нейрогенеза в гиппокампе (количеством Pax6+ клеток) и количеством апоптотических клеток Между уровнем нейрогенеза в гиппокампе (количеством Pax6+ клеток) и функциональной активностью клеток Между уровнем нейрогенеза в гиппокампе (количеством Pax6+ клеток) и концентрацией лактата Между уровнем нейрогенеза в гиппокампе (количеством Pax6+ клеток) и концентрацией НАД+ Между уровнем нейрогенеза (количество Pax6+ клеток) в гиппокампе и коре головного мозга Между уровнем экспрессии C3/C3b компонента комплемента (количеством C3/C3b+ клеток) и уровнем экспрессии P2X7 рецепторов (количеством P2X7+ клеток) Между уровнем экспрессии C3/C3b компонента комплемента (количеством C3/C3b+ клеток) и количеством апоптотических клеток Между уровнем экспрессии C3/C3b компонента комплемента (количеством C3/C3b+ клеток) и уровнем экспрессии CD38 (количеством CD38+ клеток) Между уровнем экспрессии C3/C3b компонента комплемента (количеством C3/C3b+ клеток) и концентрацией НАД+ - -0,95 -0,95 - -0,94 - -0,92 - - - -0,99* - - 0,99* -0,99* -0,97 - - 0,94 - - - - -0,90 - -0,99* - - - 0,99* 0,95 -0,99* - - - -0,93 - - -0,98 0,94 - - - 0,98 -0,92 -0,99 -0,99* 0,98 - 305 Между уровнем экспрессии C3/C3b компонента комплемента (количеством C3/C3b+ клеток) и активностью АДФР-циклазы Между уровнем экспрессии C3/C3b компонента комплемента (количеством C3/C3b+ клеток) и уровнем коэкспрессии CD157/CD11b/CD18 (количеством CD157+/CD11b+/CD18+ клеток) Между уровнем экспрессии C3/C3b компонента комплемента (количеством C3/C3b+ клеток) и уровнем нейрогенеза в коре головного мозга (количеством Pax6+ клеток) Между уровнем экспрессии CD38 на нейронах (количеством NSE+/CD38+ клеток) и уровнем экспрессии CD38 (количеством CD38+ клеток) Между уровнем экспрессии CD38 на нейронах (количеством NSE+/CD38+ клеток) и уровнем экспрессии P2X7 рецепторов (количеством P2X7+ клеток) Между уровнем экспрессии CD38 на нейронах (количеством NSE+/CD38+ клеток) и активностью АДФР-циклазы Между уровнем экспрессии CD38 на нейронах (количеством NSE+/CD38+ клеток) и концентрацией НАД+ Между уровнем экспрессии CD38 на нейронах (количеством NSE+/CD38+ клеток) и уровнем нейрогенеза в коре головного мозга (количеством Pax6+ клеток) Между уровнем экспрессии CD38 на нейронах (количеством NSE+/CD38+ клеток) и уровнем коэкспрессии CD157/CD11b/CD18 (количеством CD157+/CD11b+/CD18+ клеток) Между уровнем экспрессии CD38 на активированной микроглии (количеством MAP2+/CD38+ клеток) и количеством апоптотических клеток Между уровнем экспрессии CD38 на активированной микроглии (количеством MAP2+/CD38+ клеток) и активностью АДФР-циклазы Между уровнем экспрессии CD38 на активированной микроглии (количеством MAP2+/CD38+ клеток) и функциональной активностью клеток головного мозга Между уровнем экспрессии CD38 на активированной микроглии (количеством MAP2+/CD38+ клеток) и концентрацией НАД+ Между уровнем экспрессии CD38 на активированной микроглии (количеством MAP2+/CD38+ клеток) и уровнем коэкспрессии CD157/CD11b/CD18 (количеством CD157+/CD11b+/CD18+ клеток) - - 0,94 0,97 0,98 0,92 -0,93 - - - 0,90 - - - -0,97 - 0,98 - - -0,98 -0,95 0,97 - - - -0,99 - 0,99* - 0,95 -0,98 - -0,96 -0,98 - - - 0,98 - - 0,97 - 306 Между уровнем экспрессии CD38 на активированной микроглии (количеством MAP2+/CD38+ клеток) и уровнем экспрессии C3/C3b компонента комплемента (количеством C3/C3b+ клеток) Между уровнем экспрессии CD38 на астроцитах (количеством GFAP+/CD38+ клеток) и уровнем экспрессии P2X7 рецепторов (количеством P2X7+ клеток Между уровнем экспрессии CD38 на астроцитах (количеством GFAP+/CD38+ клеток) и концентрацией НАД+ Между уровнем экспрессии CD38 на астроцитах (количеством GFAP+/CD38+ клеток) и концентрацией лактата Между уровнем экспрессии CD38 на астроцитах (количеством GFAP+/CD38+ клеток) и уровнем коэкспрессии CD157/CD11b/CD18 (количеством CD157+/CD11b+/CD18+ клеток) Между уровнем экспрессии CD38 на астроцитах (количеством GFAP+/CD38+ клеток) и уровнем экспрессии C3/C3b компонента комплемента (количеством C3/C3b+ клеток) Между уровнем экспрессии CD38 на астроцитах (количеством GFAP+/CD38+ клеток) и функциональной активностью клеток головного мозга Между уровнем экспрессии CD38 на астроцитах (количеством GFAP+/CD38+ клеток) и уровнем нейрогенеза (количеством Pax6+ клеток) в коре головного мозга Между уровнем экспрессии CD38 на астроцитах (количеством GFAP+/CD38+ клеток) и уровнем нейрогенеза (количеством Pax6+ клеток) в гиппокампе Между активностью АДФР-циклазной активности фермента CD38 и уровнем его экспрессии (количеством CD38+ клеток) Между активностью АДФР-циклазы и уровнем НАД+ Между активностью АДФР-циклазы и количеством апоптотических клеток Между активностью АДФР-циклазы и функциональной активностью клеток Между функциональной активностью клеток мозга и количеством апоптотических клеток Между функциональной активностью клеток мозга и уровнем экспрессии CD38 (количеством CD38+ клеток) Между функциональной активностью клеток мозга и уровнем экспрессии Р2Х7 рецепторов (количеством Р2Х7+ клеток) Между уровнем НАД+ и количеством апоптотических клеток Между уровнем НАД+ и уровнем экспрессии CD38 (количеством CD38+ клеток) - - -0,99* 0,98 - - 0,96 0,99* - - - -0,97 0,99* 0,99 - 0,98 - - - - 0,95 - - -0,97 - - 0,93 -0,96* 0,74 -0,89 - -0,93* - -0,93* - -0,83 0,91 - - -0,74 -0,78 - -0,79 - - - - -0,75 0,75 - - - -0,91* - 307 Между количеством апоптотических клеток и уровнем экспрессии CD38 (количеством CD38+ клеток) Между нарушением когнитивной функции (время достижения платформы в тесте «водный лабиринт») и уровнем экспрессии CD38 на астроцитах (количеством CD38+/GFAP+ клеток) Между нарушением когнитивной функции (время достижения платформы в тесте «водный лабиринт») и концентрацией НАД+ * - уровень значимости в корреляционном анализе 0,90 - - 0,69 -0,78 - 0,79 - 0,93 Экспериментальные группы Сила и уровень значимости корреляционных связей Группы животных Э1 Э2 Э3 Э4 Между выраженностью неврологической симптоматики (сумма баллов) и уровнем экспрессии CD38 (количеством 0,87 - -0,92 CD38+ клеток) Между выраженностью неврологической симптоматики -0,98 (сумма баллов) и уровнем экспрессии коннексина 43 -0,84 * (количеством Сх43+ клеток) Между выраженностью неврологической симптоматики (сумма баллов) и уровнем экспрессии Р2Х7 рецепторов 0,97 (количеством Р2Х7+ клеток) Между выраженностью неврологической симптоматики -0,92 (сумма баллов) и АДФР-циклазной активностью Между выраженностью неврологической симптоматики (сумма баллов) и функциональной активностью клеток 0,81 мозга Между выраженностью неврологической симптоматики 0,77 0,76 - -0,93 (сумма баллов) и уровнем НАД+ Между выраженностью неврологической симптоматики (сумма баллов) и уровнем коэкспрессии 0,90 CD157/CD11b/CD18 (количеством CD157+/CD11b+/CD18+ клеток) Между выраженностью неврологической симптоматики (сумма баллов) и уровнем нейрогенеза (количеством Pax6+ 0,90 клеток) в гиппокампе Между выраженностью неврологической симптоматики (сумма баллов) и уровнем экспрессии CD38 на астроцитах 0,94* + + (количеством GFAP /CD38 клеток) Между концентрацией лактата и количеством 0,99* апоптотических клеток 308 Между уровнем коэкспрессии CD157/CD11b/CD18 (количеством CD157+/CD11b+/CD18+ клеток) и концентрацией НАД+ Между уровнем коэкспрессии CD157/CD11b/CD18 (количеством CD157+/CD11b+/CD18+ клеток) и количеством апоптотических клеток Между уровнем нейрогенеза в коре головного мозга (количеством Pax6+ клеток) и функциональной активностью клеток головного мозга Между уровнем нейрогенеза в коре головного мозга (количеством Pax6+ клеток) и концентрацией НАД+ Между уровнем нейрогенеза в гиппокампе (количеством Pax6+ клеток) и концентрацией НАД+ Между уровнем нейрогенеза в гиппокампе (количеством Pax6+ клеток) и функциональной активностью клеток головного мозга Между уровнем нейрогенеза в гиппокампе (количеством Pax6+ клеток) и уровнем коэкспрессии CD157/CD11b/CD18 (количеством CD157+/CD11b+/CD18+ клеток) Между уровнем экспрессии C3/C3b компонента комплемента (количеством C3/C3b+ клеток) и уровнем экспрессии CD38 (количеством CD38+ клеток) Между уровнем экспрессии C3/C3b компонента комплемента (количеством C3/C3b+ клеток) и активностью АДФР-циклазы Между уровнем экспрессии C3/C3b компонента комплемента (количеством C3/C3b+ клеток) и функциональной активностью клеток Между уровнем экспрессии C3/C3b компонента комплемента (количеством C3/C3b+ клеток) и уровнем нейрогенеза (количество Pax6+ клеток) в коре ЦНС Между уровнем экспрессии CD38 на нейронах (количеством NSE+/CD38+ клеток) и количеством апоптотических клеток Между уровнем экспрессии CD38 на нейронах (количеством NSE+/CD38+ клеток) и уровнем экспрессии Р2Х7 рецепторов (количеством Р2Х7+ клеток) Между уровнем экспрессии CD38 на нейронах (количеством NSE+/CD38+ клеток) и концентрацией лактата Между уровнем экспрессии CD38 на нейронах (количеством NSE+/CD38+ клеток) и активностью АДФРциклазы 0,97 - - - - 0,94* - - -0,91 - - - - -0,92 - - -0,97 - - - - 0,93* - - -0,99 ** - - - -0,98 - - - 0,95 - - - -0,99* - - - 0,95 - - - 0,98 - - - - -0,92 - - 0,99* - - - - 0,90 - - 309 Между уровнем экспрессии CD38 на активированной микроглии (количеством MAP2+/CD38+ клеток) и функциональной активностью клеток головного мозга Между уровнем экспрессии CD38 на активированной микроглии (количеством MAP2+/CD38+ клеток) и уровнем нейрогенеза (количество Pax6+ клеток) в коре ЦНС Между уровнем экспрессии CD38 на активированной микроглии (количеством MAP2+/CD38+ клеток) и уровнем экспрессии C3/C3b компонента комплемента (количеством C3/C3b+ клеток) Между уровнем экспрессии CD38 на активированной микроглии (количеством MAP2+/CD38+ клеток) и концентрацией НАД+ Между уровнем экспрессии CD38 на астроцитах (количеством GFAP+/CD38+ клеток) и концентрацией НАД+ Между уровнем экспрессии CD38 на астроцитах (количеством GFAP+/CD38+ клеток) и уровнем коэкспрессии CD157/CD11b/CD18 (количеством CD157+/CD11b+/CD18+ клеток) Между уровнем экспрессии CD38 на астроцитах (количеством GFAP+/CD38+ клеток) и уровнем нейрогенеза (количеством Pax6+ клеток) в гиппокампе Между активностью АДФР-циклазной активности фермента CD38 и уровнем его экспрессии (количеством CD38+ клеток) Между активностью АДФР-циклазной активности и уровнем экспрессии Р2Х7 рецепторов (количеством Р2Х7+ клеток) Между активностью АДФР-циклазы и количеством апоптотических клеток Между активностью АДФР-циклазы и функциональной активностью клеток Между функциональной активностью клеток мозга и уровнем экспрессии CD38 (количеством CD38+ клеток) Между функциональной активностью клеток мозга и уровнем экспрессии Р2Х7 рецепторов (количеством Р2Х7+ клеток) Между уровнем НАД+ и уровнем экспрессии CD38 (количеством CD38+ клеток) Между количеством апоптотических клеток и уровнем экспрессии Р2Х7 рецепторов (количеством Р2Х7+ клеток) Между уровнем экспрессии CD38 и Р2Х7 рецепторов (количеством CD38+ и Р2Х7+ клеток) 0,93 - - - -0,99* - - - -0,96 - - - - 0,95* - - 0,99* - - - 0,96 - - - -0,97 - - - -0,99* - - - - - -0,99* -0,80 - 0,78 - - -0,98 - - - 0,99 0,89 - - 0,93 - - - - - - -0,91 - 0,96 - - 0,86 0,99* - 310 Между уровнем НАД+ и уровнем экспрессии Pгликопротеина (количеством Pgp+ клеток) Между уровнем экспрессии CD38 и Pgp (количеством CD38+ и Pgp+ клеток) Между уровнем экспрессии и Cx43 и Pgp рецепторов (количеством и Cx43+ и Pgp+ клеток) Между нарушением когнитивной функции (время достижения платформы в тесте «водный лабиринт») и уровнем экспрессии CD38 на астроцитах (количеством CD38+/GFAP+ клеток) Между нарушением когнитивной функции (время достижения платформы в тесте «водный лабиринт») и уровнем экспрессии коннексина 43 (количеством Cx43+ клеток) Между нарушением когнитивной функции (время достижения платформы в тесте «водный лабиринт») и концентрацией НАД+ * - уровень значимости в корреляционном анализе - - -0,90 -0,96 - - - -0,96 - - 0,77 - -0,82 0,99* * - - - - 0,99* * - -0,80 0,83 - - 311 Приложение Щ Фотографии флуоресцентной и/или конфокальной микроскопии (ко)экспрессии антигенов в ткани головного мозга при острой и хронической нейродегенерации Коэкспрессия тирозингидроксилазы(TH) и CD38 в среднем мозге животных с моделью хронической нейродегенерации А. Мозг крысы с моделью БП (х 400) Б. Мозг интактной крысы (х 400) В. Внутриклеточная локализация антигена CD38 в клетках среднего мозга (конфокальная микроскопия, х900 за счет оптического и цифрового увеличения) 312 Коэкспрессия маркера нейронов(NSE) и CD38 в коре переднего и среднем мозге животных с моделями острой и хронической нейродегенерации А. Мозг крысы с моделью БП (х400) Б. Мозг интактной крысы для модели БП (х400) В. Мозг крысы с моделью ишемии Г. Мозг интактной крысы для модели (х400) ишемии (х400) 313 Коэкспрессия маркера астроцитов(GFAP) и CD38 в коре переднего и среднем мозге животных с моделями острой и хронической нейродегенерации А. Мозг крысы с моделью БП (х400) Б. Мозг интактной крысы для модели БП (х400) В. Мозг крысы с моделью ишемии Г. Мозг интактной крысы для модели (х400) ишемии (х400) 314 Коэкспрессия маркера активированной микроглии(MAP2) и CD38 в коре переднего и среднем мозге животных с моделями острой и хронической нейродегенерации А. Мозг крысы с моделью БП (х400) Б. Мозг интактной крысы для модели (х400) БП В. Мозг крысы с моделью ишемии Г. Мозг интактной крысы для модели (х400) ишемии (х400) 315 Коэкспрессия коннексина 43(Cx43) и CD38 в коре переднего и среднем мозге животных с моделями острой и хронической нейродегенерации А. Мозг крысы с моделью БП (х400) Б. Мозг интактной крысы для модели БП (х400) В. Мозг крысы с моделью ишемии Г. Мозг крысы с моделью ишемии (ишемизированное полушарие) (х500) (контралатеральное (х500) полушарие) 316 Коэкспрессия CD157, CD11b и CD18 в коре переднего и среднем мозге животных с моделями острой и хронической нейродегенерации А. Мозг крысы с моделью БП (х400) Б. Мозг интактной крысы для модели (х400) БП В. Мозг крысы с моделью ишемии Г. Мозг интактной крысы для модели (х400) ишемии (х400) Д. Внутриклеточная колокализация антигенов CD157/CD11b/CD18 в клетках головного мозга (конфокальная микроскопия, х1200 за счет оптического и цифрового увеличения) 317 Экспрессия P2X7 рецепторов в коре переднего и среднем мозге животных с моделями острой и хронической нейродегенерации (конфокальная микроскопия) А. Мозг крысы с моделью БП (х600 за Б. Мозг интактной крысы для модели счет оптического и цифрового БП (х600 за счет оптического и увеличения) цифрового увеличения) В. Мозг крысы с моделью ишемии Г. Мозг интактной крысы для модели (х600 за счет оптического цифрового увеличения) и ишемии (х600 за счет оптического и цифрового увеличения) 318 Экспрессия C3/C3b в коре переднего и среднем мозге животных с моделями острой и хронической нейродегенерации А. Мозг крысы с моделью БП (х400) Б. Мозг интактной крысы для модели (х400) БП В. Мозг крысы с моделью ишемии Г. Мозг интактной крысы для модели (х400) ишемии (х400) 319 Экспрессия Pax6 в коре переднего мозга, гиппокампе и среднем мозге животных с моделями острой и хронической нейродегенерации А. Мозг крысы с моделью БП (х400) Б. Мозг интактной крысы для модели БП (х400) В. Мозг крысы с моделью ишемии Г. Мозг интактной крысы для модели (гиппокамп, х200) ишемии (гиппокамп, х200) Д. Мозг крысы с моделью ишемии Е. Мозг интактной крысы для модели (кора, х400) ишемии (кора, х400) 320 Экспрессия P-гликопротеина (Pgp) в коре переднего и среднем мозге животных с моделями острой и хронической нейродегенерации А. Мозг крысы с моделью БП (х400) Б. Мозг интактной крысы для модели БП (х400) В. Мозг крысы с моделью ишемии Г. Мозг крысы с моделью ишемии (ишемизированное полушарие, х400) (контралатеральное полушарие, х400) 321 Апоптотические (TUNEL+) клетки в коре переднего и среднем мозге животных с моделями острой и хронической нейродегенерации А. Мозг крысы с моделью БП (х400) Б. Мозг интактной крысы для модели БП (х400) В. Мозг крысы с моделью ишемии Г. Мозг интактной крысы для модели (х400) ишемии (х400)
