Федеральное государственное бюджетное учреждение науки
advertisement
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова Российской академии наук На правах рукописи Зайцев Алексей Васильевич МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА РАЗНЫХ ТИПОВ НЕЙРОНОВ И ИХ СИНАПТИЧЕСКИЕ СВЯЗИ В ПРЕФРОНТАЛЬНОЙ КОРЕ МАКАКИ И КРЫСЫ 03.03.01 – Физиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант: чл.-корр. РАН, д.б.н., проф., Магазаник Лев Гиршевич Санкт-Петербург – 2013 СОДЕРЖАНИЕ Введение Глава 1. 6 Нейрофизиология префронтальной коры и ее функции (литературный обзор) 12 1.1. Критерии для определения префронтальной коры .........................................................12 1.2. Функции префронтальной коры .......................................................................................13 1.3. Эволюция префронтальной коры. Сравнительная анатомия префронтальной коры у крыс и обезьян ....................................................................................................................16 1.4. Развитие и инволюция префронтальной коры в онтогенезе ..........................................19 1.5. Цитоархитектоника префронтальной коры обезьян .......................................................21 1.6. Афферентные и эфферентные связи префронтальной коры у приматов .....................23 1.7. Нейроны префронтальной коры и их основные характеристики ..................................27 1.8. Заключение по литературному обзору .............................................................................37 Глава 2. Методы исследования 39 2.1. Приготовление переживающих срезов коры мозга макаки и крысы ............................39 2.2. Регистрация и анализ электрофизиологических свойств нейронов префронтальной коры .....................................................................................................................................41 2.3. Гистологические методы и морфологическая реконструкция нейронов .....................52 2.4. Статистическая обработка данных ...................................................................................54 Глава 3. Пирамидные нейроны префронтальной коры обезьяны 3.1. Электрофизиологическая классификация пирамидных 55 клеток на основе многомерного статистического анализа ..........................................................................55 3.2. Электрофизиологические свойства пирамидных клеток разных классов ....................62 3.3. Особенности электрофизиологии пирамидных клеток обезьян ....................................76 3.4. Функциональная роль пирамидных клеток разных электрофизиологических классов в коре обезьян .......................................................................................................79 2 Глава 4. Интернейроны префронтальной коры обезьяны 4.1. Морфологические группы интернейронов 82 2-3 слоев дорсолатеральной префронтальной коры мозга макаки ................................................................................83 4.2. Электрофизиологические характеристики интернейронов ...........................................92 4.3. Иммуногистохимические характеристики интернейронов префронтальной коры макаки ................................................................................................................................107 4.4. Функциональная роль разных типов интернейронов префронтальной коры макаки116 Глава 5. Сравнение свойств нейроглиаформных и корзинчатых интернейронов префронтальной коры крысы и обезьяны 126 5.1. Характеристики нейроглиаформных нейронов префронтальной коры у обезьяны и крысы .................................................................................................................................127 5.2. Характеристики быстроразряжающихся парвальбумин-положительных корзинчатых нейронов префронтальной коры у обезьяны и крысы ...........................138 5.3. Функциональное значение межвидовых различий в морфологических и физиологических свойствах нейроглиаформных и корзинчатых клеток крысы и обезьяны ............................................................................................................................148 Глава 6. Функциональные особенности возбуждающих синаптических входов у различных нейронов префронтальной коры обезьяны и крысы 6.1. Cвойства миниатюрных ВПСП и ВПСТ 151 пирамидных клеток и быстроразряжающихся интернейронов у обезьян и крыс............................................152 6.2. Cвойства вызванных ВПСП пирамидных клеток и быстроразряжающихся интернейронов крыс и обезьян .......................................................................................157 6.3. Субъединичный состав глутаматных AMPA рецепторов различается у интернейронов и пирамидных клеток ............................................................................164 6.4. Функциональное значение различий в свойствах ВПСП у интернейронов и пирамидных клеток: механизм упреждающего дисинаптического торможения в коре ....................................................................................................................................166 3 6.5. Значение различий в организации возбуждающих входов для функционирования префронтальной коры крысы и обезьяны ......................................................................171 Глава 7. Особенности взаимодействия быстроразряжающихся интернейронов и пирамидных клеток префронтальной коры крысы 7.1. Свойства синаптических соединений 173 между пирамидными нейронами и быстроразряжающимися интернейронами ....................................................................175 7.2. Краткосрочная динамика синаптической передачи в возбуждающих и тормозных синапсах ............................................................................................................................180 7.3. Реципрокные синаптические соединения имеют более высокую эффективность и надежность, чем односторонние .....................................................................................183 7.4. Пресинаптические потенциалзависимые кальциевые каналы .....................................185 7.5. Функциональное значение ..............................................................................................188 Глава 8. Особенности долговременной синаптической пластичности пирамидных клеток префронтальной коры крысы 193 8.1. Синаптическая пластичность во 2-3 слоях префронтальной коры, вызванная синхронизирующим протоколом, не подчиняется правилу Хэбба .............................194 8.2. Ингибирование кальцийзависимого калиевого тока, обеспечивающего медленную следовую гиперполяризацию, восстанавливает хэббову пластичность .....................198 8.3. Нейромодуляторы, подавляющие медленную следовую гиперполяризацию, восстанавливают хэббову пластичность ........................................................................201 8.4. Сайт экспрессии синаптической пластичности в префронтальной коре ....................204 8.5. Фармакологические свойства пластичности в префронтальной коре ........................206 8.6. Функциональное значение ..............................................................................................209 Глава 9. Особенности функционального созревания возбуждающих синапсов пирамидных клеток префронтальной коры макаки 211 9.1. Плотность шипиков на дендритах пирамидных нейронов 3 слоя префронтальной коры макаки значительно уменьшается в возрасте от 15 до 42 месяцев ....................212 4 9.2. Функциональное созревание глутаматергической передачи в префронтальной коре макаки в возрасте от 3 до 84 месяцев: постсинаптические изменения .......................214 9.3. Функциональное созревание глутаматергической передачи в коре макаки: пресинаптические изменения ..........................................................................................219 9.4. Функциональные значение выявленных изменений в работе возбуждающих синапсов префронтальной коры макаки в ходе постнатального развития .................223 Заключение 227 Выводы 231 Список литературы 233 5 ВВЕДЕНИЕ Актуальность. Префронтальная кора – важнейший интегративный центр нервной системы. Эта область мозга необходима для организации целенаправленных действий во времени, она обеспечивает удержание в памяти недавних событий (сенсорных стимулов), концентрацию внимания на целевых стимулах и подготовку к выполнению будущих действий. Важную роль префронтальная кора играет в регуляции эмоций, социальном поведении, контроле вегетативных функций. Под префронтальной корой в настоящее время понимают участок лобной коры, имеющий наиболее тесные связи с ассоциативным медиодорсальным ядром таламуса и получающим многочисленные дофаминергические проекции от стволовых ядер [1]. Префронтальная кора также имеет тесные двусторонние связи с большинством вторичных и третичных сенсорных и моторных областей коры, восходящие и нисходящие проекции от многих ядер таламуса, покрышки мозга [2], гипоталамуса [3-6], бледного шара [7], амигдалы [5, 8-10], гиппокампа [11], ретикулярной формации среднего мозга [12, 13], черной субстанции среднего мозга [14], мозжечка и ряда других структур. Префронтальная кора значительно увеличивается в размерах в ходе эволюции млекопитающих, достигая наибольшего размера у приматов. У человека она составляет до 29% от общей поверхности коры. Развитие префронтальной коры в онтогенезе продолжается длительный период, у человека созревание префронтальной коры продолжается до 20-летнего возраста [15-19]. Эти нейробиологические данные хорошо соотносятся с тем, что высшие психические функции, напрямую связанные с работой префронтальной коры, такие как принятие решений, планирование, языковые навыки достигают своего полного развития примерно в этот же возраст [1]. Префронтальная кора задействована в патогенезе многих психических заболеваний, включая шизофрению, депрессию и другие [20, 21]. Исходя из исключительно важной роли префронтальной коры в организации психической деятельности человека и ее вовлеченности в ряде патологий, в настоящее время ведутся интенсивные исследования клеточных нейрофизиологических механизмов осуществления функций префронтальной корой, а также изучается специфический вклад разных типов нейронов. Для понимания механизмов работы префронтальной коры необходимо доскональное изучение свойств структурных элементов коры (нейронов) и особенностей их взаимодействий. 6 В настоящее время широко распространено предположение, что нейронные сети внутрикорковых модулей у всех видов млекопитающих состоят из сходных структурных элементов и построены по единому каноническому принципу [22, 23]. Межвидовые различия возникают в основном из-за различий в количестве этих модулей и особенностей их внешних связей. Поэтому большинство сведений о нейронной организации коры были получены при работе со срезами коры грызунов, так как этот объект существенно удобнее для изучения. Однако к настоящему времени накоплено большое количество данных, указывающих, что сами структурные компоненты корковых модулей могут отличаться у различных видов [2426], поэтому остается дискуссионным вопрос: насколько правомерно использование этих результатов для выяснения функций префронтальной коры приматов? Вместе с тем экспериментальных работ, посвященных изучению свойств нейронов префронтальной коры приматов, в особенности ГАМКергических тормозных интернейронов, крайне мало. Это делает необходимым проведение комплексного изучения нейронов префронтальной коры приматов. Цель работы. Провести комплексное электрофизиологическое и морфологическое изучение гетерогенной популяции нейронов дорсолатеральной префронтальной коры макаки (Macaca fascicularis), выявить основные типы нейронов и дать описание их характеристик, определить свойства их синаптических связей, а также провести сравнение свойств нейронов префронтальной коры крысы и макаки, и тем самым приблизиться к пониманию особенностей механизмов работы префронтальной коры и роли отдельных типов нейронов в осуществлении функций. Основные задачи исследования. 1. Провести изучение электрофизиологических свойств популяции пирамидных нейронов 23 слоев префронтальной коры макаки и выявить основные физиологические классы пирамидных нейронов, используя методы многомерного статистического анализа. Определить возможную роль разных классов пирамидных нейронов в функционировании префронтальной коры. 2. Изучить и биохимические проанализировать свойства морфологические, гетерогенной популяции электрофизиологические ГАМКергических и тормозных интернейронов 2-3 слоев префронтальной коры макаки и разработать их классификацию; 7 предсказать возможную функциональную роль каждого из изученных типов интернейронов. 3. Провести сравнение электрофизиологических и морфологических свойств сходных типов интернейронов префронтальной коры крысы и макаки и тем самым установить, насколько схожи и насколько различаются гомологичные элементы нейронных сетей у двух видов, стоящих на разных ступенях эволюционного развития. 4. Изучить и сопоставить свойства возбуждающих постсинаптических ответов у разных типов нейронов префронтальной коры крысы и макаки. В частности, исследовать свойства миниатюрных и вызванных постсинаптических возбуждающих ответов, изучить субъединичный состав постсинаптических глутаматных рецепторов. Выявить функциональное значений различий в постсинаптических ответах у разных типов нейронов, их роль в реализации упреждающего дисинаптического торможения. Исследовать особенности синаптических связей между пирамидными нейронами и тормозными быстроразряжающимися корзинчатыми клетками в префронтальной коре крысы. 5. Выявить специфические особенности формирования долговременной синаптической пластичности у пирамидных клеток префронтальной коры крысы и определить факторы, влияющие на возникновение пластичности. Изучить роль и механизмы действия некоторых нейромодуляторов на синаптическую пластичность. 6. Определить, есть ли связь между массовой элиминацией глутаматергических кортикальных синапсов и их функциональным созреванием в подростковом возрасте у приматов. Для этого исследовать особенности функционального созревания возбуждающих синапсов пирамидных клеток 2-3 слоя префронтальной коры макаки, выявить пресинаптические (вероятность освобождения медиатора) и постсинаптические (соотношение вклада AMPA и NMDA рецепторов, субъединичный состав рецепторов) изменения в ходе онтогенеза. Научная новизна. На основе статистически репрезентативной серии экспериментов и кластерного анализа результатов впервые выявлено, что пирамидные клетки 2-3 слоев коры приматов по электрофизиологическим свойствам подразделяются на 4 класса: регулярноразряжающиеся нейроны с низким и высоким входным сопротивлением, залповые низкопороговые нейроны и нейроны с промежуточным паттерном. Эти результаты 8 существенно отличаются от данных, полученных ранее при изучении коры грызунов, где почти все пирамидные клетки 2-3 слоев относятся к регулярноразряжающимся нейронам. Впервые проведено комплексное исследование ГАМКергических интернейронов префронтальной коры макаки, включающее изучение морфологических, электрофизиологических и биохимических характеристик, на основе чего была разработана классификация интернейронов коры макаки. Впервые обнаружены и охарактеризованы типы интернейронов, не встречающиеся в коре грызунов. Впервые проведено прямое сравнение свойств интернейронов префронтальной коры крысы и обезьяны, выявлено, что, морфологически сходные интернейроны крысы и обезьяны могут относиться к разным электрофизиологическим типам. Впервые показано, что интернейроны у обезьяны характеризуются большей возбудимостью, чем у крысы. Впервые всесторонне изучены и сопоставлены возбуждающие постсинаптические ответы пирамидных клеток и быстроразряжающихся интернейронов префронтальной коры крысы и макаки. Выявлено, что у обоих видов постсинаптические ответы быстроразряжающихся интернейронов характеризуются более быстрой кинетикой, большей амплитудой и при суммации раньше вызывают потенциалы действия, чем у пирамидных клеток. При изучении синаптически связанных пар интернейронов и пирамидных клеток крысы впервые показано, что латеральное торможение в префронтальной коре, реализуемое через быстроразряжающиеся интернейроны, слабее, чем возвратное торможение. Впервые обнаружено, что в префронтальной коре крысы при использовании синхронизирующих протоколов наблюдается нарушение правила Хэбба о знаке долговременной синаптической пластичности: протоколы с негативной задержкой и позитивной задержкой вызывают долговременную депрессию в отличие от других районов коры. Впервые установлено, что подавление медленной следовой гиперполяризации позволяет восстановить выработку долговременной потенциации при использовании синхронизирующего протокола с позитивной задержкой. Выявлен возможный механизм действия нейромодуляторов на синаптическую пластичность через ингибирование медленной следовой гиперполяризации. Впервые показано, что функциональное созревание возбуждающих синапсов пирамидных клеток префронтальной коры макак завершается до подросткового возраста, и что 9 массовая элиминация возбуждающих синапсов в подростковом возрасте происходит через механизмы, не связанные с их функциональной зрелостью. Теоретическая и практическая значимость работы Проведенное комплексное электрофизиологическое и морфологическое изучение гетерогенной популяции нейронов дорсолатеральной префронтальной коры макаки, идентификация основных типов нейронов, описание их характеристик и синаптических свойств позволяет приблизиться к пониманию клеточных механизмов работы префронтальной коры и предсказать роль отдельных типов нейронов в осуществлении функций в норме и при патологиях ЦНС. Использованные в работе методы многомерного статистического анализа позволили выявить фундаментальные закономерности в проявлении электрофизиологических свойств нейронов, полученные результаты прямо свидетельствуют в пользу существования ограниченного количества классов нейронов с определенным набором свойств. Проведенное межвидовое сравнение свойств разных типов интернейронов выявило различие в их электрофизиологических характеристиках, что свидетельствует о различиях в функционировании префронтальной коры представителей грызунов и приматов. Новые данные об особенностях функционального становления синаптической передачи в онтогенезе, а также синаптической пластичности в префронтальной коре важны для понимания механизмов развития психических функций в норме, также они будут полезны при изучении патогенеза ряда заболеваний ЦНС, связанных с нарушениями в развитии. Важное практическое значение имеют результаты, полученные при изучении субъединичного состава синаптических рецепторов у разных типов нейронов, они позволяют разрабатывать фармакологические подходы с избирательным воздействием на целевые группы нейронов. Положения, выносимые на защиту 1. Методы многомерного статистического анализа позволяют идентифицировать непересекающиеся группы нейронов коры и выявить наиболее важные критерии для классификации и идентификации типов нейронов. 2. Морфологически сходные интернейроны префронтальной коры крысы и макаки могут различаться по электрофизиологическим свойствам, что свидетельствует о преимущественно функциональных различиях в организации работы префронтальной коры грызунов и приматов. 10 3. Различия в свойствах синаптических входов у пирамидных клеток и интернейронов имеет важное функциональное значение для обеспечения работы коры. 4. В префронтальной коре крысы, в отличие от других областей коры и гиппокампа, протоколы с синхронизацией пре- и постсинаптической активности независимо от их последовательности вызывают долговременную депрессию синаптической передачи. 5. Функциональное и морфологическое созревание возбуждающих синапсов в префронтально коре приматов происходит в онтогенезе в разное время. Личный вклад автора. Планирование и выполнение экспериментов, обработка, анализ и подготовка результатов к публикации проводилось лично автором или совместно с сотрудниками Питтсбургского университета (США), университета Тринити-Колледж (Ирландия), ИЭФБ РАН (Россия) Н.В. Повышевой; D.A. Lewis; R. Anwyl, L.S. Krimer; G. Gonzalez-Burgos; D. Rotary; Л.Г. Магазаником, Д.Б. Тихоновым, К.Х. Ким. Техническую помощь оказывали сотрудники Питтсбургского университета O. Krimer и J. Kosakowski. Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на Annual Meetings of Society for Neuroscience (Новый Орлеан, 2003; Сан-Диего, 2004; Вашингтон, 2005; Атланта, 2006; Вашингтон, 2008; Чикаго, 2009), FENS Forums of Neuroscience (Амстердам, 2010; Барселона, 2012), WPIC’s Fourth Annual Research Day (Питтсбург, 2004), WPIC’s Sixth Annual Research Day (Питтсбург, 2006), 3rd Annual Neuroscience Ireland Conference (Дублин, 2008), III съезде физиологов СНГ (Ялта, 2011), XIV Международного совещания и VII Школы по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2011), Восьмом международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Ялта, 2012), II Всероссийская конференция с международным участием «Гиппокамп и память: норма и патология» (Пущино, 2012), XXII Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Волгоград, 2013), FENS Featured Regional Meeting (Прага, 2013). Публикации. Основные результаты диссертации представлены в 49 печатных работах, в числе которых 16 статей в журналах, включенных в систему цитирования Web of Science. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 278 страницах и состоит из введения, обзора литературы, характеристики методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, изложенных в 9 главах, заключения, выводов и списка литературы, включающего 590 источников. Диссертация иллюстрирована 116 рисунками и 20 таблицами. 11 Глава 1. НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ ПРЕФРОНТАЛЬНОЙ КОРЫ И ЕЕ ФУНКЦИИ (ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР ) 1.1. Критерии для определения префронтальной коры Префронтальной корой обычно называют участок коры, расположенный в передней части лобных долей мозга млекопитающих (спереди от моторной и премоторной коры), однако общепринятого определения префронтальной коры не существует. Границы префронтальной коры в зависимости от методологии исследования и используемых критериев определяют поразному: на основе электрофизиологических данных. Префронтальная кора – это «молчащая» область лобной коры, при ее электрической стимуляции не наблюдается двигательной активности. Это определение было предложено в конце XIX века, один из авторов шотландский невролог Дэвид Ферриер (цит. по [27]). на основе цитоархитектонического строения. Префронтальная кора – это гранулярная область лобной коры, в отличие от агранулярной моторной и премоторной областей коры. Определение было предложено Бродманом в 1909 году [28]. К префронтальной коре были отнесены поля 8-11, 44-47 (в основном расположены дорсолатерально) мозга человека, или поля 8-14, 45, 46 мозга макаки. Так как гранулярная лобная кора выражена только у приматов, то Бродман считал эту область коры присущей только приматам. на основе таламических проекций. Префронтальная кора – это участок коры, получающий афферентные связи от медиодорсального ядра таламуса [29, 30]. Роуз и Вулси показали, что медиодорсальное ядро присутствует не только у приматов, поэтому корковые области гомологичные префронтальной коре приматов были показаны у кошек, овец и кроликов [31]. Кроме того, они показали, что у приматов проекции от медиодорсального ядра таламуса идут не только к гранулярной лобной коре, но и к агранулярной орбитальной коре. В 1964 году Экерт дополнил теорию Роуза и Вулси, подразделив префронтальную кору на три области в соответствии с иннервацией из трех зон медиодорсального ядра [32]. У приматов орбитальная префронтальная кора получает проекции от медиальной крупноклеточной зоны ядра, дорсолатеральная префронтальная кора, прилежащая к главной борозде (s. principal) – от латеральной мелкоклеточной зоны, а дорсолатеральная префронтальная кора рядом с арочной бороздой (s. arcuate) – от латеральной 12 крупноклеточной мультиформной зоны ядра [32]. Аналогичные 3 зоны префронтальной коры были в дальнейшем найдены в мозге хищных и грызунов [33-35]. на основе дофаминергических афферентных связей со средним мозгом. В 1970-е гг. было обнаружено, что префронтальная кора приматов избирательно получает большое количество входов от дофаминергических ядер среднего мозга [36, 37]. Дивак и соавт. выявили, что у многих млекопитающих дофаминергические волокна и афференты от медиодорсального ядра таламуса идут к одним и тем же корковым полям [38]. Однако позднее было показано, что дофаминергические проекции от стволовых ядер идут также к первичной моторной коре, премоторной области, передней области поясной извилины [39, 40]. на основе функций префронтальной коры. Префронтальная кора обеспечивает разные аспекты принятия решений и избирательного целенаправленного поведения, способность к программированию двигательных задач и способность к сличению результата с исходными намерениями. Хотя эти функции нельзя полностью локализовать в префронтальной коре, именно эта область мозга является организующим центром для этих функций Использование термина «префронтальная кора» в современной англоязычной литературе считается более предпочтительным по отношению к синонимичным терминам «лобная гранулярная кора» и «лобная ассоциативная кора» [1], так как лобная гранулярная кора, определяемая на основе цитоархитектоники, есть только у приматов, а слово «ассоциативная» имеет в английском языке несколько значений, затрудняющих однозначное понимание термина. В русскоязычной научной литературе обычно используется термин «лобная ассоциативная кора». 1.2. Функции префронтальной коры Первоначально функции префронтальной коры изучались путем ее удаления или перерезкой нервных волокон, идущих к данной области, у экспериментальных животных, а также наблюдением за людьми с соответствующими корковыми повреждениями. Первые же исследования выявили, что префронтальная кора является важнейшим интегративным центром, обеспечивающим перцептивный синтез и целевое поведение [41-44]. 13 Удаление префронтальной коры у обезьян приводит к гиперактивности с повышенной локомоцией [45, 46]. Движения обезьян, однако, не являются спонтанными, а определяются их повышенной реакцией к внешним стимулам. Поэтому данная гиперактивность является скорее гиперреактивностью [1, 47]. У таких обезьян обнаружены также серьезные нарушения внимания и повышенная отвлекаемость на разные стимулы, незатормаживаемый ориентировочный рефлекс [48, 49]. У фронтальных крыс и кошек существенно меняется поведение: они становятся более прожорливыми и агрессивными [50, 51]. Небольшие же повреждения фронтальной коры, как правило, не вызывают увеличения аппетита и повышения агрессии, а, наоборот, ведут к противоположному эффекту [1]. У обезьян с удаленной префронтальной корой серьезно страдает социальное поведение, они становятся менее агрессивны, апатичны, у них теряются такие формы социального поведения, как грумминг, забота о потомстве, они не могут адекватно взаимодействовать с другими животными и, как правило, попадают в изоляцию [52]. Префронтальная кора необходима для организации целенаправленных действий во времени, она обеспечивает удержание в памяти недавних событий (сенсорных стимулов), концентрацию внимания на целевых стимулах и подготовку к выполнению будущих действий. Так у обезьян с удаленной префронтальной корой или перерезкой путей к ней существенно затрудняется выполнение задач дифференцировки стимулов, если на один из стимулов надо давать двигательный ответ, а на другой нет (задача go/no go). Такие животные не могут подавить двигательную реакцию и дают двигательный ответ на оба стимула [1, 53]. С задачей, когда требуется выбрать один из двух стимулов при их одновременной подаче, фронтальные животные справляются легко, однако переучить их выбирать другой стимул из данной пары затруднительно [47, 54]. У животных с поврежденной префронтальной корой наиболее серьезно страдает выполнение задач, требующих удержания информации в оперативной памяти (working memory task). В тестах такого типа обезьянам показывают, в какой коробочке спрятана еда (стимул), затем закрывают данную область экраном на несколько секунд или минут (задержка), а после этого обезьяне дают возможность выбрать коробочку, где находится еда. Если коробочка выбрана правильно, то обезьяна может съесть еду. Животные с удаленной префронтальной корой очень долго учатся выполнять данные тесты, а время максимальной задержки существенно меньше чем у интактных животных [55-57]. 14 Электрофизиологические исследования в значительной мере дополняют и расширяют представления о функциях префронтальной коры. Так, полевые регистрации и записи с одиночных нейронов подтверждают вовлеченность префронтальной коры в контроль двигательных актов и произвольного внимания, вовлеченность медиальной и орбитальной префронтальной коры в регуляцию эмоций и контроль ряда вегетативных функций [1]. В настоящее время среди различных исполнительных функций дорсолатеральной префронтальной коры, обеспечивающих целенаправленное действие и принятие решений, наиболее изучены нейронные механизмы оперативной памяти [58]. Первые достижения были получены в экспериментах с регистрацией нейронной активности у бодрствующих, свободно двигающихся животных, натренированных на выполнение задач, требующих удержания информации в оперативной памяти [59, 60]. Эти исследования показали, что некоторые нейроны префронтальной коры активизируется в течение периода задержки и, таким образом, являются клеточным коррелятом процесса удержания информации в памяти. Нейроны остаются активными в течение нескольких секунд, обычно до 15-20 секунд [61, 62], такие нейроны были названы клетками памяти. В опытах, где от обезьян требовалось удерживать в памяти, в какой области зрения находится целевой объект, было обнаружено, что нейроны памяти обладают «полем памяти», то есть разряжаются с максимальной частотой только когда животному надо запомнить положение объекта в определенной небольшой области пространства и снижают частоту разрядов ниже фонового уровня при нахождении объекта в другой области [62]. Предполагается, что в организации «полей памяти» важную роль играют ГАМКергические тормозные интернейроны, а применение блокатора ГАМКА рецепторов бикукуллина приводило к расширению «полей памяти» [63-68] Многие нейроны префронтальной коры генерируют потенциалы действия в течение нескольких этапов выполнения тестов на оперативную память: во время показа стимулов, периода задержки и во время ответа [69]. Поэтому различия, в какой из этапов выполнения теста будет активен нейрон, скорее всего зависят от морфологических особенностей нейронов и их связей с соседними нейронами, как это характерно для сложных нейронов зрительной коры [58]. Например, нейрон, активный в течение нескольких этапов выполнения теста, может иметь тесные связи с несколькими нейронами, которые активируются только в течение отдельных этапов [69]. 15 Клетки памяти могут быть найдены во всех частях префронтальной коры, но особенно распространены в ее латеральных областях. Таким образом, центральный механизм сохранения информации в оперативной памяти состоит в реверберации нервных импульсов в специализированных нейронных сетях. Реверберация нервных импульсов может протекать на нескольких уровнях, как в локальных нейронных сетях префронтальной коры, так и в распределенных нейронных сетях с вовлечением нейронов префронтальной и затылочнотеменной и височной ассоциативной коры [1]. 1.3. Эволюция префронтальной коры. Сравнительная анатомия префронтальной коры у крыс и обезьян Согласно одной из гипотез неокортекс млекопитающих возник из двух исходных компонентов, прилегающих соответственно к гиппокампу и пириформной коре. В процессе эволюции эти участки коры сильно разрастаются латерально и кзади и дифференцируются с появлением 6-слойной организации [70, 71]. Префронтальная кора как часть неокортекса также состоит из двух этих исходных компонентов, но кроме этого, филогенетически позднее, уже у приматов префронтальная кора увеличивается за счет дифференциации моторной коры. Таким образом, как было показано [72], префронтальная кора приматов развивается в результате конвергенции трех исходных компонентов: парагиппокампального, парапириформного (цингулярная кора) и части моторной коры. Префронтальная кора значительно увеличивается в размерах в ходе эволюции, достигая наибольшего размера у приматов (Рис. 1). Это было выявлено как на основе палеонтологических данных, так и методами сравнительной анатомии [73-75]. Наиболее убедительно увеличение размеров префронтальной коры в ряду приматов показал Бродман [28]. Согласно его расчетам на основе цитоархитектонических критериев префронтальная кора у лемура занимает 8.5% площади, 11.5% - у гиббона и макак, 17% - у шимпанзе, 29% - у человека (цит. по [1]). 16 Рис. 1. Площадь префронтальной коры (выделена) у 6 видов млекопитающих [1]. Проследить филогенетические изменения префронтальной коры, сравнивая лишь ныне живущие виды в отсутствие общего предка [76, 77], очень сложно. Для определения гомологичных структур используются цито- и миелоархитектонические критерии, однако точно обосновать гомологию структур мозга удается не всегда [76, 77]. Морфология лобных долей столь различна у разных видов, что провести гомологию между бороздами и извилинами префронтальной коры можно достаточно условно. Так, s. proreal у хищных считается гомологом прямой борозды (s. rectus) полуобезьян, основной борозды (s. principalis) у макак и части нижней лобной борозды (s. frontalis inferior) у человека и высших обезьян [72]. Само наличие префронтальной коры у грызунов до сих пор остается дискуссионным вопросом, например, в двух обзорах с аналогичным названием «Есть ли префронтальная кора у крыс» [27, 78], авторы приходят к прямо противоположным выводам. Преусс [27] критически анализирует концепцию Роуза, Уилси [31] и Экерта [32] согласно которой префронтальная кора определяется как корковая проекция медиодорсального таламического ядра и рассматривает аргументы в пользу данной гипотезы. Разрушение участков лобной коры крыс не приводило к гибели нейронов в медиодорсальном ядре, как это происходит у хищных и приматов [79]. Однако разрушение медиодорсального ядра позволило проследить ход 17 проекций от этого ядра, используя метод окраски дегенерирующих аксонов с помощью серебряной импрегнации [35, 79]. Леонард описала две основных области дегенерации таламических окончаний в коре: 1) область вдоль и сбоку от s. rhinal и 2) и на медиальной поверхности полушарий спереди от мозолистого тела (Рис. 2). Дальнейшие исследования с использованием авторадиографического метода и пероксидазы хрена подтвердили существование проекций медиодорсального ядра к этим корковым областям [80-84]. Б Рис. 2. Гомологичные области префронтальной коры у макаки (A) и крысы (Б) (вверху медиальная, внизу латеральная поверхности полушарий) согласно концепции Роуза, Уилси и Экерта. Дорсолатеральная область у макак и ее аналог у крыс заполнена точками, штриховкой показана орбитальная префронтальная кора. С изменениями из [27]. Однако есть ряд моментов, которые не позволяют сделать однозначный вывод в пользу гомологии этих корковых областей у грызунов и приматов. Обе области префронтальной коры крысы не имеют выраженного IV гранулярного слоя, характерного для префронтальной коры приматов. Эти области коры по некоторым характеристикам ближе к аллокортексу (лимбической коре), чем изокортексу. Эти анатомические особенности даже отражены в названии данных областей (например, прелимбическая и инфралимбическая кора). Также в настоящее время выяснено, что у медиодорсального ядра приматов есть проекции к передней части поясной извилины, а также к некоторым областям премоторной и вторичной моторной коры, височной и теменной коры [78, 85-89]. Таким образом, специфичность взаимосвязей между медиодорсальным ядром и префронтальной корой ставится некоторыми авторами под сомнение, и они предполагают, что области коры, к которым идут проекции от медиодорсального ядра у грызунов, гомологичны не префронтальной коре, а скорее лимбической (поясная извилина) и премоторной коре приматов [27, 90, 91]. Чтобы в какой-то мере разрешить это противоречие Уилингс и Ван Иден [92] 18 предложили относить к префронтальной коре только те корковые области, в которых реципрокные связи с медиодорсальным ядром таламуса выраженнее (больше количество связей и плотность терминалей), чем с другими таламическими ядрами. Однако даже использование количественного анализа пока не дает однозначного ответа [78]. Если вопрос о полной гомологии медиальной фронтальной коры грызунов и префронтальной коры приматов не может быть решен однозначно, то, принимая во внимание, что медиальная фронтальная кора грызунов по своим функциям, в частности, участию в процессах оперативной памяти, очень напоминает префронтальную кору приматов, эту область коры грызунов можно считать аналогом префронтальной коры приматов. В данном исследовании именно медиальная префронтальная кора крысы была использована для сравнения с латеральной префронтальной корой макаки. 1.4. Развитие и инволюция префронтальной коры в онтогенезе Гистогенез и созревание префронтальной коры идет аналогично другим областям коры и включает в себе миграцию нервных клеток, распределение их по слоям и дальнейшую дифференцировку и синаптогенез [73]. У грызунов послойная архитектура префронтальной коры продолжает формироваться после рождения [93], тогда как у человека послойная организация префронтальной коры практически завершается к седьмому месяцу внутриутробного развития [94]. После того, как послойная организация сформирована, начинается рост дендритов [95]. Апикальные дендриты формируются раньше базилярных. У человека дендриты пирамидных нейронов префронтальной коры рудиментарны при рождении, но быстро увеличиваются в размерах в течение первых двух лет жизни, а затем их рост замедляется [96]. Рост дендритов определяется внешними воздействиями, как было показано на крысах [97, 98]. Развитие префронтальной коры продолжается в онтогенезе длительный период. В целом созревание более глубоких слоев (4-6) происходит раньше, чем более поверхностных 2-3 слоев [73]. У человека дифференцировка пирамидных нейронов 3 слоя префронтальной коры продолжается в подростковом возрасте [99, 100]. Следует отметить, что именно пирамиды 3 слоя получают основные синаптические входы от других корковых отделов и от них же идут основные потоки к различным областям коры. Таким образом, этот слой наиболее важен для выполнения высших ассоциативных функций [1, 101]. 19 Синаптогенез в префронтальной коре приматов происходит примерно в те же сроки, что и в остальных областях коры [102-104]. Плотность синапсов резко возрастает перед рождением остается наиболее высокой сразу после рождения. Затем часть синапсов элиминируется и количество синапсов стабилизируется к подростковому возрасту. В настоящее время остаются разногласия о том, как протекает элиминация синапсов во времени. Идет ли оно синхронно во всех областях коры мозга [102] или с некоторой задержкой в префронтальной коре [105, 106]. Предполагается, что у человека элиминация синапсов в префронтальной коре может по времени совпадать с манифестацией подростковой шизофрении [107]. Миелинизация волокон в префронтальной коре начинается намного позже, чем в других областях мозга и продолжается долгие годы [108, 109]. Как у человека [110], так и обезьян [111] миелинизация завершается в последнюю очередь во 2 и 3 слоях префронтальной коры. Хронология миелинизации тесно связана с развитием функций коры. Современные методы визуализации (магнитно-резонансная томография) также свидетельствуют о том, что созревание лобных долей мозга и в особенности префронтальной коры продолжается у человека до 20 лет или даже дольше [15-19]. Согласно большинству исследований развитие коры сопровождается уменьшением объема серого вещества, что связано с элиминацией избыточных синапсов и нейронов и увеличением доли белого вещества (миелинизацией). Эти нейробиологические данные хорошо соотносятся с тем, что высшие психические функции, напрямую связанные с работой префронтальной коры, такие как, принятие решений, планирование, языковые навыки достигают своего полного развития примерно в этот же возраст [1]. Морфологическое развитие коры сопровождается созреванием нейромедиаторных систем, при этом эти процессы могут не совпадать по времени, например, созревание моноаминергических систем происходит дольше [112-114]. В зрелом возрасте морфологических изменений в коре практически не наблюдается, однако, при старении наблюдается процесс дегенерации коры, сопровождающийся истончением и уменьшением объема серого вещества коры, уменьшением плотности нейронов [115, 116]. У обезьян в дорсолатеральной коре происходит сокращение числа синапсов [117] и уменьшение миелинизации волокон [118]. К 70-80 годам у человека размер, объем и плотность нейронов значимо уменьшаются в префронтальной коре [119, 120]. Изменения в размерах обусловлено уменьшением и исчезновением части дендритного дерева нейронов [120, 121]. 20 Наряду с морфологическими изменениями при старении наблюдаются и изменения биофизических мембранных свойств нейронов [122, 123]. 1.5. Цитоархитектоника префронтальной коры обезьян Интерес к морфологии префронтальной коры приматов сохраняется в течение многих десятилетий. Первые полные цитоархитектонические карты коры больших полушарий человека и обезьяны были опубликованы Кэмпбелом и Бродманом соответственно в 1905 год (цит. по [1]). В дальнейшем целым рядом исследователей было проведено детальное изучение цито- и миелоархитектоники коры с уточнением корковых полей [90, 124-131]. Так как префронтальная кора произошла как минимум из двух источников, то можно выделить 2 отдельных тренда (дорсальный и вентральный) в которых прослеживается усложнение цитоархитектоники, с выделением 4 типов корковой организации. Наиболее примитивной является трехслойная кора (аллокортекс), непосредственно к ней примыкает периаллокортекс со слабо дифференцированными слоями. К периаллокортексу примыкает произокортекс с зарождающейся ламинарной организацией. Наиболее эволюционно продвинутой является новая кора (изокортекс) с хорошо выраженной шестислойной организацией [132]. Дорсальный (гиппокампальный) тренд происходит от медиального префронтального аллокортекса и включает в себя медальную и дорсолатеральную префронтальную кору. Вентральный (пириформный) тренд происходит от заднего орбитального аллокортекса и объединяет вентральную и вентролатеральную префронтальную кору. Латеральная часть префронтальной коры макак (поля 8, 9, 10, 45, 46 и 47 [131, 133], Рис. 3) состоит из 6 хорошо различимых слоев клеток с выраженным внутренним гранулярным слоем (слой IV). Наличие четвертого слоя отличает префронтальную кору от других отделов лобной коры [32, 130, 134]. Этот слой становится толще по мере приближения к фронтальному полюсу, тогда как сама кора становится тоньше. В четвертом слое найдены малые пирамидные клетки, гранулярные клетки, малые клетки Гольджи II типа, обладающих значительным полиморфизмом. Наиболее распространенными являются звездчатые клетки с короткими дендритами, которые разветвляются в непосредственной близости от тела нейрона во всех направлениях, образуя сферическое дендритное дерево. Их аксоны также достаточно короткие, не покидают коры и формируют аксонные сети вокруг соседних пирамидных клеток. Пирамиды III и V слоев тем больше по размеру, чем ближе они расположены к слою IV. 21 Пирамидные клетки увеличиваются в размере и при приближении к задней границе префронтальной области [1]. Префронтальная кора медиальной и орбитальной областей состоит из многочисленных цитоархитектонически различных областей [135, 136] (Рис. 3). Большинство этих полей, за исключением самой передней орбитальной области, не имеют 6-слойного строения. Их можно отнести к «агранулярной» или «дисгранулярной» коре. В этих полях хорошо выражены V и VI слои и практически отсутствует слой IV. Рис. 3. Цитоархитектонические поля префронтальной коры (медиальная, дорсолатеральная и орбитальная поверхности). Приводится по [131]. 22 Вертикальная организация префронтальной коры до сих пор остается малоизученной. Аналогично сенсорным областям в префронтальной коре можно выделить идущие через определенные промежутки вертикально ориентированные ряды кортико-кортикальных волокон и таламических афферентов [137-139]. Кроме того в префронтальной коре апикальные дендриты пирамидных клеток VI слоя формируют характерные пучки [140]. 1.6. Афферентные и эфферентные связи префронтальной коры у приматов Для понимания функций префронтальной коры необходимо знание афферентных и эфферентных связей этой области мозга с другими отделами. Использование современных методов с применением антероградных и ретроградных гистохимических трейсеров (авторадиографический метод, использование биотинизированных аминодекстранов, пероксидазы хрена, холеротоксина, некоторых флуоресцентных красителей, нейротропных вирусов (PRV, вирус герпеса)) позволило выявить огромное количество связей между префронтальной корой и другими областями мозга, которые в наибольшей степени выражены у приматов. Основные подкорковые афференты идут к префронтальной коре от медиодорсального ядра таламуса [32, 85, 87, 89, 141, 142]. Таламические проекции организованы топографически, хотя некоторые детали этой организации до сих пор не ясны [143]. У приматов медиодорсальное ядро состоит из двух цитоархитектонически различных частей: медиальная часть («магноцеллюлярная») состоит из клеток большого размера, тогда как латеральная часть («парвоцеллюлярная») содержит клетки малого размера [144, 145]. Магноцеллюлярная часть ядра проецируется в основном к орбитальной и медальной префронтальной коре (развивающейся раньше в онто- и филогенезе), тогда как парвоцеллюлярная часть проецируется к филогенетически более новой дорсолатеральной коре [32, 85, 87, 141]. Наиболее латеральная часть ядра, расположенная между мелкоклеточной частью и внутренней капсулой, проецируется к глазодвигательной зоне коры (8 область по Бродману) [32, 146], тем не менее все части медиодорсального ядра проецируются ко всем областям префронтальной коры в той или иной степени [147]. Кроме медиодорсального ядра к префронтальной коре идут проекции от вентрального переднего ядра, ростральных интраламинарных ядер таламуса, ядра подушки [10, 85, 87, 148], большинство этих проекций организованы топографически [87]. Несмотря на разнообразие таламических входов к префронтальной коре, большинство (80%) таламических нейронов, 23 проецирующихся к префронтальной коре, расположены в медиодорсальном ядре [85]. Через медиодорсальное ядро таламуса префронтальная кора получает входы от многих подкорковых структур, при этом разные части медиодорсального ядра могут получать входы от разных структур. К настоящему времени описаны афференты от ретикулярной формации среднего мозга [12, 13], черной субстанции среднего мозга [14], от амигдалы [142, 149, 150], препириформной и нижней височной коры [142] Некоторые подкорковые и лимбические входы могут идти к префронтальной коре напрямую, минуя таламические ядра. Найдены прямые входы в кору от покрышки мозга [2], гипоталамуса [3-6], бледного шара [7], амигдалы [5, 8-10], гиппокампа [11]. Проекции от гиппокампа, амигдалы и других отделов лимбической системы идут в основном к медиальной и орбитальной областям префронтальной коры [4, 10, 151]. Поле 46 префронтальной коры получает входы от коры мозжечка [152] и вентральной части зубчатого ядра мозжечка [153]. Другие проекции от мозжечка к префронтальной коре идут через базальные ганглии и латеральные ядра таламуса [154]. Эти связи играют важнейшую роль во временной организации моторных действий. Также префронтальная кора получает регуляторные входы от базального крупноклеточного ядра Мейнерта, голубого пятна, вентральной покрышечной области, ядер шва – основных центров холинергической, норадренергической, дофаминергической и серотонинергической систем. Все эти ядра иннервируют в той или иной степени латеральную, медиальную и орбитальную области префронтальной коры [155-158]. Таким образом, префронтальная кора прямо или через таламические ядра получает входы от большинства отделов ЦНС. Входы от гиппокампа могут быть критичны для обеспечения моторной памяти и активации памяти, входы от черной субстанции и некоторых нижележащих мозговых центров - для выполнения движений. Входы от среднего мозга, гипоталамуса, миндалины могут быть связаны организацией потребностей и мотивации. Входы от мозжечка – с координацией движений. Области префронтальной коры тесно связаны между собой и с другими корковыми областями. Организация связей внутри префронтальной коры хорошо согласуется с концепцией о ее происхождении из двух источников [132]. Связи внутри префронтальной коры организованы таким образом, что обеспечивают последовательное взаимодействие менее дифференцированных областей с более высокоорганизованными внутри каждого эволюционного тренда [147]. Предположительно такая организация обеспечивает пошаговую 24 интеграцию между слабо дифференцированными медиальными и орбитальными областями и высоко дифференцированными латеральными областями [132]. Показано, что к префронтальной коре обезьян сходятся корково-корковые пути, которые начинаются в первичных соматосенсорных, слуховых, зрительных, обонятельных и вкусовых областях коры. Однако следует отметить, что к префронтальной коре практически не поступают прямые афференты от первичных сенсорных и моторных корковых областей, тогда как иннервация от вторичных и ассоциативных сенсорных и моторных областей очень существенна [159]. Количество синаптических передач по ходу каждого сенсорного пути к префронтальной коре и их значение до сих пор является предметом разногласий. Однако несомненно, что каждый уровень обеспечивает обработку того или иного аспекта сенсорной информации. Корковые сенсорные пути следуют относительно независимо друг от друга, пока они не достигнут префронтальной коры. Таким образом, префронтальная кора является важнейшим ассоциативным центром [1]. Дихотомический принцип организации префронтальной коры прослеживается и по организации проводящих путей, которые идут как к дорсальному, так и вентральному трендам префронтальной коры [132]. Другой важной особенностью является соблюдение топологического принципа в организации ассоциативных путей. Так, каждый проводящий пучок обеспечивает достаточно точное топологическое соответствие между сенсорными ассоциативными зонами и префронтальной корой. Например, между полем 7 и префронтальной корой [160, 161]. Эфферентные связи [162] префронтальной коры практически полностью совпадают с афферентными, поэтому большинство описанных выше путей являются реципрокными. Есть, однако, исключение из этого правила. Например, от префронтальной коры идут эфференты к базальным ганглиям, от которых они не получают прямой афферентации. Основная масса эфферентных волокон из префронтальной коры идет к медиодорсальному ядру таламуса [144, 163-166], однако также описаны проекции к вентральному и интраламинарному ядрам таламуса [167, 168]. От вентральной (орбитальной) области префронтальной коры идут проекции к гипоталамусу, перегородке, среднему мозгу и мосту [141, 169-171]. Описаны многочисленные проекции от префронтальной коры к структурам лимбической системы, включая миндалину [172-174] и лимбическую кору [137, 175, 176]. Такие прямые реципрокные связи между префронтальной корой и миндалиной, 25 медиальной корой височной доли вероятно обеспечивают запоминание новой информации [174] или воспоминание старой [10]. Подобно другим областям лобной доли коры, префронтальная кора посылает большое количество эфферентных волокон к базальным ганглиям: хвостатому ядру и скорлупе [10, 35, 137, 177, 178]. Эфференты от префронтальной коры идут также к бледному шару [167, 168, 172, 179], ограде [167, 180], черной субстанции [172, 173, 179]. Через ядра моста префронтальная кора посылает эфференты к мозжечку. В настоящее время показано, что три корковых области: дорсолатеральная префронтальная кора, премоторная и двигательная кора вовлечены в контроль движений. Анализ кортико-кортикальных связей в лобной доле, показывает, что от префронтальной коры начинается эфферентный каскад идущий к премоторной коре и дополнительной моторной коре (поле 6), а оттуда к первичной моторной коре (поле 4). Этот реципрокный каскад моторных связей топологически организован и достаточно хорошо изучен [175, 181-183]. При этом каждая корковая область образует относительно независимые связи с подкорковыми структурами и таким образом представляет собой субстрат для трехстадийного иерархического управления движениями. На самом высоком уровне префронтальная кора отвечает за организацию наиболее глобальных и абстрактных аспектов поведения, тогда как на уровне моторной коры идет регуляция элементарных аспектов двигательного акта [184, 185]. Таким образом, префронтальная кора получает и отдает огромное количество афферентных и эфферентных проекций от структур среднего и промежуточного мозга, лимбической системы. Префронтальная кора тесно связана с различными областями новой коры. Большинство связей префронтальной коры являются реципрокными за исключением связей с базальными ганглиями и некоторыми ядрами моста, к которым идут только эфференты от коры. Также следует отметить, что разные области коры имеют разный набор реципрокных связей, что явно выражено в мозге приматов. Орбитальная и медиальная префронтальная кора наиболее тесно связана с медиальным таламусом, гипоталамусом, миндалиной, лимбической и медиальной височной корой, включая гиппокамп. Этот комплекс тесно связанных структур представляет собой филогенетически старый, рано развивающийся в онтогенезе анатомический субстрат обеспечивающий эмоциональное, инстинктивное поведение. Латеральная кора в первую очередь связана с латеральными таламическими 26 ядрами, дорсальной частью хвостатого ядра и неокортексом. Это эволюционно наиболее молодая система обеспечивает когнитивные функции и произвольное поведение [1]. 1.7. Нейроны префронтальной коры и их основные характеристики Префронтальная кора в настоящее время привлекает внимание многих исследователей, однако на клеточном уровне эта область мозга гораздо менее изучена, чем гиппокамп или сенсорные зоны коры. Предполагается, что нейроны, образующие нейронные сети в разных зонах коры, в целом похожи, поэтому в данном обзоре используются данные, полученные в разных областях новой коры млекопитающих. В настоящее время общепринятым является разделение всех нейронов коры на две большие группы [186]. Первая группа состоит из многочисленных, но относительно схожих по своим свойствам пирамидных нейронов, или главных клеток коры (principle cells). Каждая пирамидная клетка имеет ветвистые и густо покрытые шипиками апикальный и несколько базальных дендритов, получающих синаптические входы от нейронов коры и таламуса. В свою очередь аксоны пирамидных клеток идут как к клеткам коры, так и таламуса. Медиатором пирамидных нейронов является глутамат, поэтому эти нейроны обеспечивают передачу возбуждения в коре и от коры к таламусу [186]. Клеток второй группы в коре существенно меньше (20-30%), но они разнообразнее по морфологии, электрофизиологическим свойствам и содержанию биохимических маркеров [186-193]. Аксоны этих клеток обычно не выходят за пределы коры, и поэтому их называют интернейронами. Большинство интернейронов содержит ГАМК в качестве основного медиатора, и, соответственно, является тормозными клетками коры. Для ГАМКергических интернейронов характерны маловетвящиеся дендриты с незначительным количеством шипиков; приходящие возбуждающие синаптические контакты могут оканчиваться не только на их дендритах, но и прямо на теле интернейронов, что нетипично для пирамидных клеток. Пирамидные клетки коры. Пирамидные клетки коры в основном изучались в сенсорных и моторных областях коры [194-196], тогда как данные по префронтальной коре в литературе немногочисленны [197]. В настоящее время выявлено, что пирамидные клетки 6-го слоя в соматосенсорной коре подразделяются на 3 основных группы: два класса кортико-таламических пирамидных клеток 27 и кортико-кортикальные пирамидных клеток пирамидные посылает клетки. аксоны Первый к класс кортико-таламических специфическим ядрам таламуса (вентропостериомедиальному ядру для соматосенсорной коры), второй класс кортикоталамических клеток - к ретикулярному ядру таламуса. Оба класса кортико-таламических пирамидных клеток, как правило, имеют хорошо выраженный апикальный отросток с многочисленными разветвлениями, аксонные разветвления обычно не поднимаются выше 4го слоя. У этих клеток аксоны не образуют длинных горизонтально идущих коллатералей. У кортико-кортикальных пирамидных нейронов апикальные дендриты обычно заканчиваются в глубоких слоях, а аксоны распространяются по горизонтали на большие расстояния [197]. Электрофизиологические исследования показали, что кортико-кортикальные пирамидные клетки характеризуются очень быстрой частотной адаптацией и в ответ на деполяризующий ток отвечают только 2-3 спайками. Кортико-таламические пирамидные клетки продолжают отвечать в течение всего действия деполяризующего тока, хотя частота потенциалов действия уменьшается. Кортико-кортикальные клетки в основном синаптически соединены с другими пирамидными клетками 5-6 слоев, их синаптические ответы характеризуются выраженной депрессией [198]. Вероятность нахождения синаптических связей с другими нейронами коры для кортико-таламических пирамидных клеток в 4 раза ниже, чем для кортико-кортикальных клеток, а амплитуда ВПСП меньше. Кортикоталамические пирамиды контактируют как с другими пирамидами, так и с интернейронами, для их постсинаптических ответов характерна фасилитация [199]. Пирамидные клетки 5 слоя проецируются как к другим клеткам коры, так и ряду подкорковых структур, неспецифические ядра которые таламуса, в зависимости ядра от четверохолмия, коркового моста отдела и включают спинного мозга. Электрофизиологически пирамидные клетки 5 слоя подразделяют на два основных типа: залповые нейроны (intrinsically burst firing) и регулярноразряжающиеся нейроны (regular spiking, RS) [200]. Залповые пирамидные нейроны разряжаются короткими высокочастотными пачками потенциалов действия. Обычно это крупные клетки с длинными апикальными дендритами [201, 202], аксоны этих клеток идут к четверохолмию или мосту [203]. Регулярноразряжающиеся пирамидные нейроны на деполяризацию отвечают одиночными потенциалами действия, частота которых в ходе ответа уменьшается [204]. Как правило, это небольшие клетки с короткими апикальными дендритами, их аксоны идут к 28 корковым областям другого полушария, а так же к соседним пирамидным клеткам. Показано, что близкорасположенные пирамидные клетки 5-го слоя соматосенсорной коры молодых крыс образуют синаптические связи с вероятностью 10% [205]. Залповые пирамидные клетки 5-го слоя получают множество возбуждающих входов от пирамидных клеток 3-го слоя, тогда как небольшие регулярноразряжающиеся пирамиды практически не имеют синаптических входов от пирамид 3-го слоя [206]. Пирамидные нейроны 2-3 слоев коры в основном синаптически связаны с пирамидными нейронами 3-го слоя противоположного полушария [207]. В сенсорных областях к их базальным дендритам идут входы от соответствующих сенсорных ядер таламуса [208]. Аксоны пирамидных клеток 3-го слоя ветвятся во 2-3 слоях, а также спускаются к 5 слою, где также могут интенсивно ветвиться, в 4 слое аксоны практически не образуют разветвлений [209-211]. Электрофизиологически пирамидные клетки 3 слоя у грызунов довольно однородны и относятся к регулярноразряжающимся нейронам [212-215]. Интернейроны коры ГАМКергические интернейроны коры чрезвычайно разнообразны, однако большинство исследователей убеждено, что интернейроны можно разделить на отдельные классы, которые специализируются на выполнении той или иной функции в нейронных сетях [216, 217]. В идеале интернейроны одного класса должны быть сходны по своим морфологическим, электрофизиологическим, молекулярным и функциональным свойствам, однако в реальности интернейроны внутри одного класса могут существенно различаться по ряду признаков. Тем не менее, различия между классами будут более выраженными, чем внутри одного и того же класса [218]. На основе каких критериев следует выделять классы интернейронов является предметом многолетних дебатов. Эти критерии выбирались различными исследователями во многом произвольно, поэтому сравнение результатов, полученных в разных лабораториях часто затруднено. В 2008 году в родном городке Кахаля Петилья-де-Арагон (Испания) была проведена специальная конференция по выработке единых подходов к классификации интернейронов [218]. Согласно рекомендациям Петилья конференции описание любого класса интернейронов должно строится с учетом изучения их морфологических, молекулярных и электрофизиологических свойств (Таблица 1). 29 Таблица 1 Основные характеристики, используемые для описания свойств интернейронов коры Критерии Основные характеристики Морфологический Тело (форма, размер, ориентация и др.) Дендриты (число и расположение, постсинаптические элементы) особенности ветвления, Аксоны (траектория и особенности ветвления, форма терминальных окончаний, форма синаптических бутонов, синаптические цели) Синапсы (электрические и химические, расположение и распределение) Биохимический Транскрипционные факторы Нейромедиаторы и синтезирующие их ферменты Нейропептиды Кальцийсвязывающие белки Рецепторы (ионотропные, метаботропные) Ионные каналы Структурные белки, поверхностные маркеры, коннексины Транспортеры (мембранные, везикулярные) Физиологический Подпороговые мембранные свойства (потенциал покоя, постоянная времени мембраны, входное сопротивление, осцилляции и резонансные частоты, выпрямление, реобаза и другие) Свойства потенциала действия (амплитуда, порог, полуширина, следовые потенциалы, изменение формы в ходе пачечного ответа) Характеристики ответов на длительную деполяризацию (начальный ответ и ответ после адаптации, частотные характеристики) Постсинаптические ответы (спонтанные и вызванные, соотношение рецепторов разных типов, пространственная и временная суммация) 30 Морфологические критерии Исторически, первые классификации интернейронов были сделаны исключительно на основе морфологических свойств при изучении препаратов мозга, окрашенных по методу Гольджи. Кахаль первым описал в коре классы интернейронов известные сейчас как нейроглиаформные клетки, клетки с двойным букетом, клетки Мартинотти [193]. Позднее Лоренцо де Но описал более десятка различных типов интернейронов в соматосенсорной коре мыши [219]. В дальнейшем многочисленные классы интернейронов были описаны в различных отделах коры у разных видов млекопитающих, при этом названия разных классов интернейронов, описанных в разных лабораториях, часто не совпадают [188, 220]. Появление методов, позволяющих окрасить отдельные нейроны путем внутриклеточного введения красителя, сделало возможным получение более детальных реконструкций нейронов. В настоящее время на сайте http://neuromorpho.org ведется работа по созданию банка трехмерных морфологических реконструкций нейронов, уже сейчас он включает сотни примеров корковых интернейронов [221]. Так как выделение классов интернейронов исходило из идеи, что разные интернейроны выполняют различные функции в коре, то практически сразу же стало ясно, что при классификации следует в первую очередь учитывать особенности ветвления аксона, горизонтальное и вертикальное распространение его коллатералей. Именно это определяет, какие клетки и какие их участки будет иннервировать данный интернейрон, а соответственно насколько эффективным будет оказываемое им торможение [218]. Так, коллатерали аксона у интернейронов из некоторых классов расположены весьма компактно и практически не выходят за пределы слоя и колонки, в котором располагается тело (например, это клеткиканделябры, нейроглиаформные клетки) и, таким образом, обеспечивают торможение только соседних с ними клеток. У других интернейронов коллатерали аксона идут в основном вертикально и проходят через все слои своей корковой колонки, но практически не заходят в соседние колонки (например, клетки с двойным букетом), или идут к первому слою коры и формируют там густое сплетение, распространяющееся на довольно большое расстояние, как у клеток Мартинотти. У многих корзинчатых интернейронов аксон находится в основном в том же слое, что и тело, при этом коллатерали могут идти горизонтально на большие расстояния, обеспечивая латеральное торможение соседних колонок [222]. Кроме этого описаны некоторые ГАМКергические нейроны, аксоны которых покидают кору и, таким образом, формально не могут считаться интернейронами [223]. 31 Методом электронной микроскопии было выявлено, что разные интернейроны образуют синаптические контакты лишь с определенными частями постсинаптических клеток [186]. Некоторые классы интернейронов формируют синаптические контакты преимущественно на телах и проксимальных дендритах пирамидных клеток (корзинчатые интернейроны), другие на различных частях дендритов пирамидных клеток (клетки с двойным букетом, нейроглиаформные клетки), либо в основном на дистальных участках апикальных дендритов пирамидных клеток (клетки Мартинотти), на начальном сегменте аксона пирамидных клеток (клетки-канделябры), или на других интернейронах (некоторые вертикальноориентированные интернейроны) [190, 191]. Форма тела и дендритов гораздо реже используются для классификации интернейронов, так как могут быть очень похожи у представителей разных классов. В то же время, у интернейронов, относящихся к одному морфологическому классу, форма тела и дендритов могут различаться: например, есть корзинчатые клетки с мультиполярным телом и радиально расходящимися дендритами и интернейроны этот же класса с овоидным телом и вертикально идущими пучками дендритов. На основе дендро-соматической морфологии могут быть успешно опознаны только нейроглиаформные нейроны, для которых характерны сферическая форма тела с многочисленными (обычно более 10) тонкими, радиально расходящимися, слабо ветвящимися изогнутыми дендритами [26]. Молекулярные критерии Интернейроны содержат на своей мембране многочисленные ионотропные и метаботропные рецепторы, в их цитоплазме обнаружены различные кальцийсвязывающие белки, кроме того часть интернейронов в дополнение к основному медиатору ГАМК синтезирует нейромодуляторные пептиды (соматостатин, ВИП, холецистокинин, нейропептид Y и др.). Некоторые маркеры часто находятся в одном нейроне совместно, например, соматостатин и кальбиндин, ВИП и кальретинин, тогда как другие белки обычно не встречаются попарно: например, парвальбумин и соматостатин. По особенностям экспрессии молекулярных маркеров интернейроны можно разделить на несколько непересекающихся популяций. Например, почти все интернейроны соматосенсорной коры мыши подразделяются на 3 группы: парвальбумин-, соматостатин-положительные нейроны и интернейроны, экспрессирующие ионотропный серотониновый рецептор 5HT3a [224]. Интернейроны зрительной коры крысы делятся на три группы: содержащие парвальбумин, кальретинин или 32 соматостатин. В префронтальной коре обезьян выявлены три непересекающиеся группы интернейронов, экспрессирующих соответственно один из кальцийсвязывающих белков парвальбумин, кальретинин или кальбиндин [225]. Однако молекулярные критерии, хорошо работающие у одного вида животных, могут не работать у другого вида, либо в другом отделе коры. Так, в коре крыс, в отличие от обезьян, в некоторых интернейронах парвальбумин и кальбиндин, либо кальретинин и кальбиндин могут экспрессироваться совместно [190, 226228]. В настоящее время установлено, что разные морфологические классы интернейронов, как правило, содержат специфические для них маркеры, хотя обнаружено очень большое количество исключений [191]. У разных видов животных парвальбумин обычно выявляют в корзинчатых интернейронах и клетках-канделябров [190, 229, 230], однако есть корзинчатые клетки, содержащие холецистокинин вместо парвальбумина [228, 231], а у беличьих обезьян (саймири) описаны 2 субпопуляции клеток-канделябров, содержащих соответственно парвальбумин или кортикотропин-рилизинг-фактор [232]. Соматостатин чаще всего встречается у клеток Мартинотти [222, 231, 233], а кальретинин может быть найден у разных типов нейронов с вертикально идущими аксонами [188, 190, 191, 234, 235]. Недавние исследования выявили значимые корреляции между экспрессией генов для ряда ионных каналов, характеристиками биохимических интернейронов [236, маркеров 237]. и Кластерный электрофизиологическими анализ корреляционных взаимоотношений показал, что существует всего 3 основных типа коэкспрессии генов ионных каналов в интернейронах коры, каждый из которых связан с одним из кальцийсвязывающих белков (парвальбумином, кальретинином или кальбиндином). Как правило, парвальбуминсодержащие интернейроны отвечают на деполяризацию частыми и очень короткими по длительности потенциалами действия без существенной частотной адаптации (быстроразряжающиеся (fast-spiking) нейроны), тогда как нейроны, содержащие другие маркеры, при сходной деполяризации отвечают с меньшей частотой разрядов, которая уменьшается в ходе ответа [235]. Идея о том, что различные классы интернейронов экспрессируют разные биохимические маркеры получила бурное развитие в последние годы. Методы генной инженерии позволяют создавать линии мышей, у которых экспрессия того или иного биохимического маркера сопровождается экспрессией флуоресцентного белка, что позволяет 33 исследователям легко идентифицировать нужный интернейрон в срезе и, следовательно, эффективнее изучать его электрофизиологические свойства и синаптические связи. В 2000 году были опубликованы первые результаты такого рода на линии мышей GIN (GFP-expressing Inhibitory Neurons), у которой соматостатин-позитивные интернейроны коры и гиппокампа экспрессировали зеленый флуоресцентный белок [238], после этого была создана линия мышей (EGFP) с флуоресцентными парвальбумин-положительными нейронами [239], а затем линия мышей (GAD67-GFP) у которых все ГАМКергические нейроны содержали зеленый флуоресцентный белок [240]. К настоящему времени проведено систематическое изучение генетических маркеров у различных групп интернейронов и создано более 20 различных линий мышей на основе Cre driver, у которых избирательной флуоресценцией обладают практически все известные классы интернейронов мыши [241]. Однако и данный подход не решает полностью проблему пересекающихся классов, так как интернейроны могут экспрессировать одновременно несколько маркеров. Нельзя не отметить, что избирательная экспрессия тех или иных маркеров у определенных классов интернейронов может быть использована для селективного воздействия на эти интернейроны. Этот подход получил очень широкое развитие с момента открытия двух светозависимых, ион-проницаемых бактериальных опсинов, которые можно с помощью лентавирусов экспрессировать в определенных классах интернейронов [242]. Каналородопсин 2 (ChR2) является катионным каналом, активирующимся при действии синего света. При экспрессии ChR2 на мембране нейрона освещение синим светов ведет к быстрой деполяризации нейрона и возникновению потенциала действия. Другой бактериальный опсин, галородопсин (NpHR) является хлорным каналом, который активируется при освещении желтым светом, что приводит к гиперполяризации мембранного потенциала нейронов. Таким образом, воздействуя светом с разной длиной волны можно активировать или ингибировать определенные популяции интернейронов. Электрофизиологические критерии Электрофизиологические свойства нейронов обычно изучают, используя метод пэтчклампа в конфигурации целая клетка. На нейрон подают ступени гипер- и деполяризующего тока и регистрируют изменения мембранного потенциала. В ответ на деполяризующий ток, превышающий пороговое значение, клетки генерируют потенциалы действия. Первоначально все интернейроны относили к быстроразряжающимся клеткам в отличие от пирамидных 34 клеток, относящихся к регулярноразряжающимся (regular-spiking) и залповым (burst-spiking) нейронам [243]. Быстроразряжающиеся интернейроны уже при пороговых значениях тока отвечают пачками спайков с частотой от 10-20 Гц, тогда как регулярноразряжающиеся нейроны на пороговую деполяризацию отвечают обычно одиночными потенциалами действия. Залповые нейроны на пороговую стимуляцию отвечают 2-5 спайками высокой частоты (порядка 100 Гц) за которыми могут следовать одиночные потенциалы действия, очень напоминающие ответы регулярноразряжающихся нейронов. Частота потенциалов действия возрастает при увеличении силы тока, однако у быстроразряжающихся нейронов частота спайков нарастает быстрее, чем у регулярноразряжающихся. Частота спайков в залпе незначительно меняется при увеличении силы тока, зато частота последующих одиночных спайков у залповых нейронов нарастает аналогично регулярноразряжающимся нейронам. Другое важное отличие между паттернами ответов нейронов - наличие частотной адаптации: у регулярноразряжающихся клеток частота спайков максимальна в самом начале ответа, а затем уменьшается, выходя на плато с более низкой частотой. Частотная адаптация может развиваться очень быстро в течение 100 мс (быстроадаптирующиеся нейроны), либо в течение более длительного времени 200-500 мс (медленноадаптирующиеся нейроны) [222]. У быстроразряжающихся нейронов частота спайков остается практически неизменной, поэтому их часто называют неадаптирующимися нейронами. Очень скоро было выявлено, что интернейроны не являются однородной группой, а весьма разнообразны по своим спайковым ответам. Были описаны регулярноразряжающиеся интернейроны (regular-spiking non-pyramidal cell) и залповые интернейроны (burst-spiking nonpyramidal), напоминающие по своим характеристикам соответствующие типы пирамидных клеток [190, 244, 245]. Важной особенностью залповых интернейронов было то, что их спайки генерируются при более низких значениях мембранного потенциала, чем у других классов интернейронов, поэтому они также известны как низкопороговые (low-threshold-spiking) интернейроны. Также были описаны интернейроны с задержанным спайковым ответом на пороговую деполяризацию, или поздноразряжающиеся нейроны (late-spiking cell). Некоторые авторы в отдельную группу выделяют интернейроны с нерегулярным спайковым паттерном (irregular-spiking), такие интернейроны в начале ответа часто дают залп спайков высокой частоты за которым следуют отдельные потенциалы действия через неравные промежутки времени [187, 246]. 35 Наряду с данной классификацией существует альтернативная схема описания электрофизиологических свойств интернейронов [189, 191], которая в настоящее время используется реже, но рекомендована к использованию Петилья конференцией [218]. Согласно этой схеме необходимо отдельно описывать начальный ответ (onset response) нейрона на деполяризацию и его поведение в ходе продолжительной деполяризации (steady-state response). Начальный ответ может быть залповым (bursts), задержанным (delays) или обычным (classical или continuous). Спайковый паттерн в ходе продолжительной деполяризации может быть неадаптирующимся по частоте (non-accommodating), адаптирующимся (accommodating); прерывистым (stuttering) и нерегулярным (irregular). Благодаря комбинациям этих ответов можно выделить до 15 электрофизиологических подклассов интернейронов [191]. Для количественного описания свойств интернейронов часто также используют характеристики отдельных потенциалов действия и ответы нейронов на подпороговую стимуляцию (Таблица электрофизиологических 1). Использование характеристик требует многочисленных специальных количественных многомерных методов статистического анализа для выделения классов нейронов. Одним из наиболее широко используемых методов стало применение кластерного анализа с построением дендрограмм [234, 247-249], а также методов факторного и дискриминантного анализа [222, 250]. Как правило, многомерные статистические методы позволяют достоверно различить интернейроны и пирамидные клетки, а среди интернейронов выделить два непересекающихся электрофизиологических класса [247, 250]. К первому классу относятся быстроразряжающиеся неадаптирующиеся интернейроны, которые кроме описанных выше признаков характеризуются очень короткими по длительности потенциалами действия и большой по амплитуде быстрой следовой гиперполяризацией (fast afterhyperpolarization). Второй класс составляют адаптирующиеся интернейроны (adapting), у них длительность потенциалов действия несколько выше, а быстрая следовая гиперполяризация меньше по амплитуде. У интернейронов этого класса частота спайков уменьшается в ходе ответа, кроме того, они отвечают на сходный по силе деполяризующий ток с меньшей частой, чем быстроразряжающиеся интернейроны. Адаптирующиеся интернейроны представляют собой неоднородную группу и могут быть подразделены на ряд подклассов, напоминающих регулярноразряжающиеся, залповые и нерегулярные интернейроны [250]. Важным классификационным критерием служат свойства возбуждающих и тормозных постсинаптических ответов интернейронов. Разные классы ГАМКергических нейронов 36 различаются как по соотношению подтипов постсинаптических рецепторов, так и по кинетике самих ответов [218]. Кратковременная синаптическая динамика также различается у разных классов нейронов, например, повторная стимуляция возбуждающих входов парвальбуминпозитивных быстроразряжающихся интернейронов ведет к депрессии ВПСП, тогда аналогичная стимуляция соматостатин-содержащих низкопороговых интернейронов вызывает фасилитацию ВПСП [251]. Выделение нейромедиатора регулируется рядом нейромодуляторов, таких как норадреналин, серотонин, ацетилхолин, эндоканнабиноиды, показано, что они оказывают избирательное воздействие на разные классы интернейронов [252-255]. Таким образом, в настоящее время при классификации интернейронов учитывается целый комплекс критериев. Такой подход позволил успешно выделить несколько больших достаточно четко ограниченных классов интернейронов у грызунов. В этих классах интернейронов наблюдается соответствие друг другу всех критериев. Однако данный подход практически не применялся при изучении интернейронов коры приматов. Как правило, классификации ГАМКергических клеток префронтальной коры приматов проводились только на основе морфологических критериев и ряда молекулярных маркеров [188, 220, 256-258], тогда как систематического электрофизиологического изучения нейронов до настоящего времени не проводилось. 1.8. Заключение по литературному обзору Префронтальная кора играет исключительно важную роль в организации психической деятельности человека, а нарушения ее нормального функционирования связывают с рядом таких тяжелых заболеваний, как шизофрения, депрессия и другие. Поэтому исследование механизмов работы префронтальной коры является одной из приоритетных задач современной нейрофизиологии. В настоящее время изучение функций префронтальной коры производится во многих лабораториях мира с использованием широкого арсенала методов. На наш взгляд, одним из перспективных подходов является изучение клеточных механизмов работы префронтальной коры, для чего требуется детальное знание характеристик и свойств разнообразных нейронов коры, а также особенностей их синаптических взаимодействий. Анализ современной литературы показывает, что нейроны коры чрезвычайно гетерогенны, при этом их свойства могут различаться в разных отделах коры и у разных видов животных. В случае префронтальной коры эти факторы следует учитывать особо, так как в процессе 37 эволюции млекопитающих значение префронтальной коры в организации поведения существенно нарастало, а ее относительные размеры выросли многократно. В настоящее время получен достаточно обширный экспериментальный материал о морфологических, нейрохимических и электрофизиологических свойствах пирамидных нейронов и тормозных ГАМКергических интернейронах сенсорных и моторных отделов коры грызунов, начинает выясняться специфическая роль различных популяций нейронов в реализации тех или иных функций коры. Однако остается нерешенным вопрос, насколько возможно использование этих данных для понимания специфических функций нейронов префронтальной коры приматов? В современной литературе описано очень мало экспериментальных работ, посвященных изучению характеристик нейронов префронтальной коры приматов, в особенности ГАМКергических интернейронов. Это делает необходимым проведение экспериментального изучения нейронов префронтальной коры приматов. Поэтому целью данной работы стало комплексное электрофизиологическое и морфологическое изучение гетерогенной популяции нейронов дорсолатеральной префронтальной коры макаки (Macaca fascicularis), выявление основных типов нейронов, их функций и особенностей взаимодействия, а также сравнение свойств нейронов префронтальной коры крысы и макаки, что позволит лучше понять особенности механизмов работы префронтальной коры приматов и роль отдельных типов нейронов в осуществлении функций. 38 Глава 2. 2.1. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Приготовление переживающих срезов коры мозга макаки и крысы Первая часть экспериментов была проведена на переживающих срезах префронтальной коры мозга половозрелых (3.5-6 кг, 3.5-5 лет) особей яванских макак (Macaca fascicularis). Эти эксперименты были выполнены в Питтсбургском университете (США) в соответствие с правилами по работе с лабораторными животными, разработанными Национальным Институтом Здоровья США. Биопсию ткани мозга с участком префронтальной коры производил профессор Д. Льюис. Биопсия осуществлялась по стандартной процедуре. Сначала животное получало кетаминовый наркоз (кетамина гидрохлорид, 25 мг/кг и дексаметазона фосфат, 0.5 мг/кг, внутримышечно; атропина сульфат, 0,05 мг/кг, подкожно). Для поддержания анестезии в трахею вводились эндотрахеальные трубки, в течение операции дыхание производилось смесью 1% галотана / 28% О2 в воздушной смеси. Далее животное помещалось в стереотаксическую установку, краниотомия проводилась в области черепа над дорсолатеральной префронтальной корой. Определение нужного участка коры производилось по стереотаксическим координатам и расположению борозд и извилин на поверхности мозга. Для экспериментов извлекался участок коры содержащий латеральный и медиальный края основной борозды (s. principalis), поля 9 и 46 (Рис. 4). После операции животным вводились антибиотик широкого спектра действия (хлорамфеникол (левомицетин); 15 мг/кг, внутримышечно) и анальгетик (гидроморфон, 0.02 мг/кг, внутримышечно) 3 раза в сутки в течение 3-х дней. Животные быстро восстанавливались, никаких видимых нарушений поведения у них не наблюдалось. Через 2-4 недели производилась вторая операция, в ходе которой производилась биопсия участка дорсолатеральной префронтальной коры другого полушария. После второй операции животное усыпляли. Примерно у половины экспериментальных животных первая операция производилась на левом полушарии, а другой половины – на правом полушарии. Чтобы уменьшить возможный эффект компенсаторных реакций, развивающихся в контралатеральном полушарии, при второй биопсии участок мозга выбирался более рострально или каудально по отношению к участку, изъятому в ходе первой биопсии. Сравнение результатов экспериментов, полученных на срезах мозга после первой и второй биопсии, а также из разных 39 полушарий не выявило никаких значимых различий, поэтому в дальнейшем все данные приводятся без учета этих факторов. С Рис. 4. Экспериментальная процедура приготовления переживающих срезов коры обезьяны и крысы. (А) Схематическое изображение мозга макаки, оранжевым отмечена область коры мозга, из которой осуществлялась биопсия. PS - основная борозда (s. principalis). (B) Схематическое изображение типичного среза префронтальной коры макаки. Цифрами отмечены корковые поля 9 и 46, WM – белое вещество. (С) Схематическое изображение типичного среза коры мозга крысы. Серой рамкой отмечена зона, в которой производились регистрации. PL - прелимбическая и IL -инфралимбическая кора. Кусочек коры мозга сразу после биопсии помещался в ледяную искусственную спинномозговую жидкость (ИСМЖ) следующего состава, в мМ: 230 сахарозы, 1.9 KCl, 1.2 Na2HPO4, 33 NaHCO3, 6 MgCl2, 1 CaCl2, 10 глюкозы и 2 кинуреновой кислоты; pH 7.3–7.4; раствор аэрировался газовой смесью 95% O2/5% CO2. Вторая часть экспериментов была проведена на переживающих срезах медиальной фронтальной (прелимбической и инфралимбической) коры мозга крысы (Рис. 4C) в Питтсбургском университете (США), Тринити колледже Дублина (Ирландия) и Институте эволюционной физиологии и биохимии РАН (РФ). Для экспериментов использовались крысы линии Вистар в возрасте 14-120 дней. Все эксперименты проводились в соответствии с правилами по работе с лабораторными животными. Коронарные срезы коры мозга обезьян и крыс толщиной 300-350 мкм приготавливали на вибротоме (VT 1000S, Leica, Германия или на вибротомах других моделей) и инкубировали в течение часа при температуре 37 ˚С, а затем при комнатной температуре до начала 40 электрофизиологических опытов в ИСМЖ следующего состава, в мМ: 126 NaCl, 2.5 KCl, 1.2 Na2HPO4, 25 NaHCO3, 2.0 CaCl2, 1.0 MgCl2, 10 глюкозы; pH 7.3–7.4; раствор аэрировался газовой смесью 95% O2/5% CO2. ИСМЖ такого же состава обычно использовалась и при проведении электрофизиологических регистраций. Эксперименты на срезах коры крысы обычно продолжались в течение 4-6 часов после их изготовления, на срезах мозга макаки – в течение 12-16 часов, в течение этого срока существенного ухудшения качества срезов не происходило. 2.2. Регистрация и анализ электрофизиологических свойств нейронов префронтальной коры Для регистрации электрофизиологических свойств нейронов срез помещался под микроскоп, в перфузируемую записывающую камеру общим объемом около 1-2 см3. В этой камере обеспечивался постоянный проток ИСМЖ, подогретой до 30-32 ˚С и аэрируемой газовой смесью 95% O2/5% CO2. Скорость потока жидкости составляла не менее 1.5-3 мл/мин. Визуализация нейронов обеспечивалась с помощью оптики Номарского (дифференционно-интерференционного контраста, DIC). На микроскопе для улучшения визуализации использовался инфракрасный (ИК) источник света, так как ИК свет меньше рассеивается в ткани мозга. Для визуализации нейронов использовался длиннофокусный водный иммерсионный объектив (40х). Изображение передавалось на камеру и демонстрировалось на мониторе. Такая комбинация методов визуализации позволяла хорошо различать форму нейронов и производить их первоначальную идентификацию (Рис. 5). Регистрация токов и/или потенциалов производилась методом локальной фиксации потенциалов/токов (voltage clamp/current clamp) в конфигурации целая клетка (whole cell mode). Электроды изготавливались из боросиликатного стекла на пуллере (Sutter Instrument). В зависимости от типа эксперимента и его задач сопротивление электродов менялось в диапазоне от 2 до 8 МОм. Преимущественно использовались электроды с низким сопротивлением (3-5 МОм), что позволяло уменьшить сопротивление доступа (access resistance) и улучшить характеристики записи. Однако в экспериментах, требующих морфологической реконструкции интернейронов обычно использовались электроды с более высоким сопротивлением (5-7 МОм), так как эти клетки имеют малые размеры и электроды с большим кончиком могут повредить клетку. В тех случаях, когда планировался иммуногистохимический анализ на наличие растворенных в цитоплазме белков, также 41 использовали электроды с высоким сопротивлением, чтобы уменьшить скорость диализа. Для изготовления электродов использовались капилляры с внешним диаметром 1.5 мм и внутренним 0.86 мм, либо с внешним диаметром 1.0 мм и внутренним 0.58 мм. Рис. 5. Микрофотография переживающего среза мозга дорсолатеральной префронтальной коры мозга макаки. Большая стрелка указывает на микроэлектрод, с помощью которого производится регистрация с пирамидного нейрона, маленькие стрелки указывают на другие пирамидные нейроны. Масштаб = 50 мкм. В экспериментах, в которых регистрировались мембранные свойства нейронов обычно использовался внутриклеточный раствор следующего состава, в мМ: 114 глюконата калия, 6 KCl, 10 HEPES, 0.2 EGTA, 4 Mg-ATP, 0.3 GTP, pH 7.25. В экспериментах, в которых в дальнейшем проводилась морфологическая идентификация нейронов во внутриклеточный раствор добавлялся биоцитин (0.5%) либо один из флуоресцентных красителей группы Alexa (Alexa 350, Alexa 488, Alexa 546, Alexa568, Alexa 633) 0.1 мМ (Invitrogen, США). В экспериментах, в которых регистрировались трансмембранные токи при позитивных значениях мембранного потенциала, глюконат калия заменялся на глюконат цезия или фторид цезия, чтобы заблокировать калиевую проводимость. Чтобы заблокировать потенциалзависимые натриевые каналы, во внутриклеточный раствор дополнительно добавляли 5 мМ QX314. 42 Пэтч-кламп нейронов осуществлялся по стандартной методике. Для пэтч-клампа обычно использовались нейроны, залегающие на глубине 20-60 мкм от поверхности. При выборе нейрона учитывались его морфологические признаки и функциональное состояние. Пирамидные нейроны идентифицировали по характерной пирамидной форме и выраженному апикальному отростку. Интернейроны имели меньший размер, у них отсутствовал апикальный отросток. У всех нейронов, подходящих для пэтч-клампа, обычно была ровная гладкая поверхность мембраны, у таких нейронов не было видно ядро. Сигналы от нейронов усиливались с помощью одного из усилителей MultiClamp 700A, MultiClamp 700B (Axon Instruments, США), Intracellular Electrometers IE-210 (Warner Instrument Corporation, США), фильтровались он-лайн с частотой 4-5 кГц и оцифровывались с частотой 10-20 кГц с помощью аналогово-цифрового преобразователя (АЦП) Power 1401 (CED, Великобритания), используя программу Signal или с помощью АЦП Digidata (Axon Instruments, США), используя программу pClamp того же производителя. В работе проводилось несколько типов электрофизиологических экспериментов, которые можно разделить на 3 группы по предмету изучения: 1) изучение электрофизиологических мембранных свойств нейронов; 2) изучение свойств синаптической передачи; 3) изучение долговременной синаптической потенциации и депрессии. 2.2.1. Эксперименты по изучению электрофизиологических мембранных свойств нейронов Электрофизиологические свойства нейронов изучались при локальной фиксации токов (current clamp mode). На нейрон подавались гиперполяризующие или деполяризующие прямоугольные импульсы тока длительностью 500 мс в диапазоне от -100 до +300 пА. Величина тока изменялась с каждым пробегом на 5, 10 или 20 пА, пробеги производились с частотой 0.2 Гц. На основе полученных записей анализировался ряд Электрофизиологических показателей: 1) ПП (мВ): потенциал покоя – стабильный мембранный потенциал, который регистрировался на нейроне через несколько минут после прорыва мембраны без приложения внешнего тока. 43 Характеристики подпороговых мембранных ответов: 2) Rin (МОм): входное сопротивление мембраны нейроны, измерялось как тангенс угла наклона линейного участка зависимости «смещение мембранного потенциала – сила тока»: (1) Обычно измерялось в диапазоне подаваемых токов от -50 пА до -10 пА. 3) τ (мс): постоянная времени мембраны, определялась на основе аппроксимации изменений мембранного потенциала в ответ на гиперполяризующую ступеньку тока моноэкспоненциальной функции вида: (2) 4) I0 (пА): Пороговый ток мембраны нейрона (реобаза) определялся как минимальный деполяризующий ток, необходимый для генерации потенциалов действия. 5) Sag (%): спад мембранного потенциала в ответ на гиперполяризующий ток, определялся как процент изменения между максимальной (Vhmax) и минимальной (Vhss) величиной мембранного потенциала в течение 500-миллисекундной прямоугольной гиперполяризующей ступени тока. (3) Для анализа использовали 3 градации: «0», если величина Sag составляла меньше 20% от максимального изменения мембранного потенциала в ответ на гиперполяризующую ступень тока; «1», если величина Sag была меньше чем 50%, но больше, чем 20%; «2», если величина Sag была больше 50%. 6) Hump (%): кратковременный подъем мембранного потенциала (деполяризационный горб) в ответ на околопороговый деполяризующий ток, определялся как процент изменений между максимальной (Vdmax) и минимальной (Vdss) величиной мембранного потенциала в течение 500-миллисекундной прямоугольной околопороговой деполяризующей ступени тока. (4) 44 Использовались те же градации, что и для Sag. RD (%): возвратная следовая деполяризация (rebound depolarization), определялась по 7) амплитуде деполяризации мембранного потенциала относительно ПП (Vrdmax), возникающей после отмены действия гиперполяризующего тока. (5) Для анализа использовалось 3 градации: «0», если величина RD составляла меньше 20% от амплитуды изменения потенциала мембраны в ответ на действие ступеньки гиперполяризующего тока. «1», если величина RD была больше 20%, но не вызывала потенциал(-ов) действия. «2», если RD вызывала потенциал(-ы) действия. Характеристики потенциала действия (параметры рассчитывались для первого потенциала действия при стимуляции минимальным надпороговым током) Латентный период (мс), от начала действия деполяризующего тока до первого 8) потенциала действия. ISI1-2 (мс): межспайковый интервал (interspike interval), время между первым и 9) вторым потенциалами действия при стимуляции минимальным надпороговым током. 10) Порог возникновения потенциала действия (мВ), определялся как мембранный потенциал, при котором изменение потенциала действия (dV/dt) составляет > 10 мВ/1 мс. 11) Амплитуда потенциала действия (мВ), измерялась от порога до пика потенциала действия. 12) Длительность потенциала действия (мс), измерялась на половине высоты потенциала действия. 13) AHPA (мВ): амплитуда следовой гиперполяризации, определялась от порога потенциала действия до наиболее негативного мембранного потенциала после первого потенциала действия. 45 14) fAHP (мВ): амплитуда быстрого компонента следовой гиперполяризации, определялась от порога потенциала действия до мембранного потенциала, при котором скорость гиперполяризации (dV/dt) уменьшается до 5 мВ/1 мс. 15) mAHP (мВ): амплитуда промежуточного компонента следовой гиперполяризации, измерялась от окончания быстрого компонента следовой гиперполяризации до наиболее негативного мембранного потенциала после первого потенциала действия. 16) Длительность развития следовой гиперполяризации (мс), измерялась от начала следовой гиперполяризации до наиболее негативного мембранного потенциала после первого потенциала действия. Характеристики паттернов разрядов (измерялись при стимуляции деполяризующим током величиной в 2 реобазы в течение 500 мс) 17) fss (Гц): стабильная частота разрядов нейрона, рассчитывалась как величина обратная количеству потенциалов действия в течение последних 250 мс стимуляции. 18) kISIs (безразмерная величина): коэффициент вариации межспайковых интервалов, измерялся в течение последних 250 мс стимуляции. 19) FFA_late (в %): полная частотная адаптация, определялась как процент уменьшения частоты от первоначального уровня (величина обратная первому межспайковому интервалу) до стабильной частоты разрядов нейрона (fss). 20) FFA_early (в %): начальная частотная адаптация, определялась как процент уменьшения частоты разрядов после первого и второго потенциала действий; частоты рассчитывались как величины обратные первому и второму межспайковому интервалу. 21) Изменение амплитуды потенциалов действия от первого к последнему в пачке (в %). 22) Изменение амплитуды следовой гиперполяризации от первого к последнему потенциалу действия в пачке (в %). Характеристики функциональной зависимости частоты разряда от силы деполяризующего тока 46 23) kfn (Гц/пА): коэффициент нарастания мгновенной частоты разрядов, рассчитывался как тангенс угла наклона линейного участка зависимости «частота разрядов – сила тока»: (6) Коэффициенты определялись для мгновенных частот разрядов, вычисленных как обратные величины к первому, второму и т.д. межспайковым интервалам, а так же для стабильной частоты разрядов нейрона. (Гц): начальная мгновенная частота разрядов, рассчитывалась на линейном 24) участке зависимости «частота разрядов – сила тока» как значение функции при силе тока равном реобазе. Характеристики потенциала действия, определяемые по фазовым диаграммам (dV/dt(V)). На фазовых диаграммах показана скорость изменения мембранного потенциала (dV/dt) в зависимости от мгновенного значения мембранного потенциала. Дифференцирование мембранного потенциала было сделано в программе Signal 3. Информация о временных параметрах потенциала действия на этих диаграммах теряется, однако более ясно определяются некоторые другие параметры. Потенциал действия на этих диаграммах представлен в виде замкнутой петли (Рис. 30). Начало восходящей части кривой отражает порог потенциала действия, при котором dV/dt резко увеличивается, на пике потенциала действия dV/dt = 0. Во время реполяризации dV/dt имеет негативные значения и приближается к 0 в момент окончания быстрой фазы следовой гиперполяризации. Разница в потенциале между начальной и конечной точками кривой отражает амплитуду быстрой фазы следовой гиперполяризации. Кроме того, так как (7), где – суммарный ток через мембрану, а С – емкость мембраны нейрона, то фазовые диаграммы позволяют определить при каком мембранном потенциале наблюдается максимальный ток через мембрану. Позитивным значениям dV/dt соответствует входящий ток, а негативным – выходящий. 47 2.2.2. Эксперименты по регистрации синаптической активности нейронов; кратковременная синаптическая динамика Эксперименты проводились в нескольких модификациях: проводилась либо регистрация постсинаптических токов (ВПСТ/ТПСТ), либо постсинаптических потенциалов (ВПСП/ТПСП). Синаптические явления, связанные с изучаемыми каналами, проводились при фармакологической блокаде остальных каналов. Так как в коре есть 2 основных нейромедиатора: глутамат и ГАМК, то, для блокады глутаматных AMPA-рецепторов использовался один из следующих блокаторов: CNQX, NBQX, или DNQX (10 мкМ); для блокады глутаматных NMDA-рецепторов - D-AP5 (50 мкМ); ГАМКA рецепторов - бикукуллин (10 мкМ) или пикротоксин (100 мкМ). ГАМКВ рецепторы, каинатные рецепторы и метаботропные глутаматные рецепторы в большинстве экспериментов специально не блокировались. При изучении субъединичного состава рецепторов использовался ряд селективных к субъединичному составу блокаторов, которые приведены в соответствующих разделах результатов. Регистрация всех постсинаптических потенциалов обычно велась при потенциале покоя. Регистрация токов через AMPA-рецепторы обычно производилась при -80 мВ, через NMDA-рецепторы при -60 мВ или при +40 мВ. Так как потенциал равновесия для ионов хлора при использовании стандартных внутриклеточных растворов (см. состав выше) и ИСМЖ, рассчитанный по уравнению Нернста, равен -79 мВ и близок к потенциалу покоя, то для регистрации тормозных постсинаптических потенциалов использовали 2 подхода. В некоторых экспериментах постсинаптическую клетку деполяризовали примерно до -50 мВ, чтобы ответ был более выражен; в других экспериментах изменяли состав внутриклеточного раствора: глюконат калия заменялся эквивалентным количеством хлорида калия или хлорида цезия, чтобы сместить равновесный потенциал к 0 мВ. Производилась регистрация двух основных типов постсинаптических ответов: 1) Миниатюрные синаптические события – синаптические события, вызванные спонтанным выбросом медиатора независимо от потенциала действия. Чтобы исключить самопроизвольные потенциалы действия в срезе в ИСМЖ добавляли тетродотоксин (0.5 мкМ). Так как в срезах коры обычно не наблюдается самопроизвольных потенциалов действия, то в некоторых случаях тетродотоксин не добавлялся и записывались спонтанные синаптические события, в которых наряду с миниатюрными 48 синаптическими событиями могли присутствовать синаптические события, вызванные самопроизвольными потенциалами действия в пресинаптических клетках. 2) Вызванные синаптические ответы – синаптические ответы, вызванные потенциалами действия в пресинаптическом нейроне или нейронах. Ответы вызывали несколькими способами: a. вызванные синаптические ответы в соединенных парах нейронов. В этом случае потенциал действия, индуцированный деполяризацией известного пресинаптического нейрона, вызывал синаптический ответ в постсинаптическом нейроне. Данные ответы характеризуют синаптическую связь между двумя известными нейронами. b. Синаптические ответы, вызванные локальной электрической стимуляцией. Производилась подача коротких (длительностью 0.1-0.5 мс) импульсов постоянного тока через моно- или биполярный электрод. Стимуляционный электрод обычно помещался на небольшом расстоянии (50-100 мкм) от исследуемого нейрона. Величина стимулов подбиралась таким образом, чтобы вызвать стабильный по амплитуде ответ, обычно величина стимулов превышала пороговое значение в 2 раза. Зарегистрированный ответ в этих экспериментах представляет собой суммацию нескольких постсинаптических ответов, вызванных возбуждением нескольких пресинаптических терминалей. c. Синаптические ответы, вызванные минимальной локальной электрической стимуляцией. В отличие от предыдущего типа ответов здесь использовалась околопороговая стимуляция, вызывающая ответ только в части случаев. В данных экспериментах строилась зависимость амплитуды вызванного ответа от величины стимуляционного тока. Величина силы тока подбиралась в интервале, в котором изменение силы стимуляции приводило только к изменению вероятности появления ответа, но не меняло его амплитуду. Предполагается, что данные вызванные ответы обусловлены возбуждением только одного пресинаптического аксона. Стимуляция обычно производилась с частой 0.1 – 0.033 Гц, чтобы избежать синаптической пластичности и истощения пресинаптических терминалей. Стимулы подавались по одному, в парах или пачками по 5-10 штук. Частота стимулов в пачке определялась задачами конкретного эксперимента. 49 Для анализа свойств спонтанных/миниатюрных событий усредняли 100-300 событий. Поиск событий осуществлялся в автоматическом режиме с помощью программ MiniAnalysis (Synaptosoft, США) или Clampfit (Axon Instruments, США). Детекция событий осуществлялась на основе заданных пороговых значений амплитуды ответов, как правило для постсинаптических токов пороговая амплитуда составляла 7-10 пА, для потенциалов – 0.3-0.5 мВ. Отобранные автоматически события в последующем визуально контролировались и ошибочно включенные шумы исключались. Для анализа свойств вызванных ответов усредняли от 10 до 50 сигналов. На основе полученных результатов анализировался ряд показателей: 1) Амплитуда ответа (мВ или пА) рассчитывалась для спонтанных событий и ответов, вызванных минимальной локальной электрической стимуляцией либо в соединенных парах. 2) Время восходящей фазы (10-90%) (мс) рассчитывалось как время необходимое для развития ответа от 10% до 90% полной амплитуды. 3) Постоянная затухания ответа (мс) моноэкспоненциальной функции вида определялась на основе аппроксимации нисходящей фазы ответа. В некоторых случаях, например, для части NMDA ответов, моноэкспоненциальная функция не позволяла сделать качественную аппроксимацию. В этом случае использовали аппроксимацию суммой двух моноэкспоненциальных функций, и рассчитывали средневзвешенную постоянную затухания по формуле: . 4) Время синаптической задержки (мс) определялось от момента начала стимуляции (пика потенциала действия в соединенных парах) до начала ответа. 5) Количество пропусков (%) определялось в соединенных парах. Пропуском считалось отсутствие синаптического ответа в течение 1-2 мс после пресинаптического потенциала действия. Минимальная величина ответа бралась за 1.5 средних квадратичных шума (RMS noise). 6) Соотношение амплитуд при парной стимуляции определялось как отношение амплитуды второго ответа к первому, обычно стимулы в парах подавались с задержкой от 20 до 50 мс. 50 2.2.3. Эксперименты по изучению долговременной пластичность синаптических ответов В работе изучалась пластичность возбуждающих глутаматергических синапсов пирамидных нейронов 2-3 слоев префронтальной коры крыс. Для повышения эффективности выработки долговременной пластичности ГАМКергические ответы блокировались бикукуллином (10 мкМ) или пикротоксином (100 мкМ). Синаптические ответы вызывали внеклеточной электрической стимуляцией с помощью биполярного стеклянного электрода (Рис. 6А). Базовое значение амплитуды синаптических ответов определялось в течение 5-10 минут при стимуляции 0.05-0.033 Гц одиночными или парными стимулами (интервал между стимулами в паре 50 мс). Регистрация возбуждающих постсинаптических токов (ВПСТ) производилась при фиксации мембранного потенциала при -80 мВ. Рис. 6. Методика изучения долговременной пластичности у пирамидных нейронов префронтальной коры. стимулирующего электрода экспериментальных (А) Схема, и иллюстрирующая регистрирующего синхронизирующих протоколов, типичное электрода. (B используемых расположение и для С) Схема изучения долговременной пластичности (пояснения в тексте). Синаптическая пластичность вызывалась двумя различными протоколами. В обоих протоколах стимуляция синаптических входов к изучаемому нейрону осуществлялась через внеклеточный биполярный стеклянный электрод. Стимуляция производилась при фиксации токов (current clamp mode), потенциал мембраны нейрона был равен потенциалу покоя и обычно составлял ~ -70 мВ. В первом протоколе долговременную потенциацию вызывали 51 высокочастотной стимуляцией. Для этого 3 раза каждые 10 с подавались 10 пачек стимулов, состоящих из 8 стимулов каждая. Интервал между пачками в серии составлял 0.5 с; интервал между стимулами в пачке 20 мс. Во втором, синхронизирующем, протоколе долговременную пластичность вызывали временной ассоциацией пресинаптических стимулов, вызывающих возбуждающие постсинаптические ответы, и потенциалов действия в изучаемом нейроне (spike-timingdependent synaptic plasticity protocol). В первом варианте данного протокола [STDP(1+3)] одиночная пресинаптическая стимуляция на 10 мс предшествовала трем спайкам в постсинаптическом нейроне (интервал между спайками 50 мс). Такая стимуляция повторялась 50 раз каждые 10 секунд (Рис. 6В). Во втором варианте этого протокола [STDP(5+5)] каждый из пяти пресинаптических стимулов предшествовал на 5 мс пяти потенциалам действия в постсинаптическом нейроне. Стимулы в пачке подавались с частотой 50 Гц, пачки подавались каждые 10 с и повторялись 20 раз (Рис. 6С). 2.3. Гистологические методы и морфологическая реконструкция нейронов Для морфологической идентификации нейронов, а также иммуногистохимического анализа нейроны во время регистрации помечались с помощью биоцитина или флуоресцентного красителя Alexa (Invitrogen, США), растворенных во внутриклеточном растворе. Сразу после регистрации электрофизиологических показателей срез фиксировали в 4% растворе парафармальдегида. Фиксация проводилась в течение 1-3 суток в темноте при температуре +4°С. После фиксации срезы тщательно отмывались от парафармальдегида в 0.1 М фосфатном буфере и использовались для анализа сразу, либо помещались в криопротекторный раствор (1/3 глицерина, 1/3 этиленгликоля, 1/3 0.1 М фосфатного буфера) и хранились при -80°С до момента анализа. В экспериментах, где использовался биоцитин, срезы инкубировали в течение 24-48 ч в растворе фосфатного буфера, содержащего конъюгат стрептавидина и Alexa 633 (Invitrogen, США, использовалось разбавление 1:500) и 0.4% Тритона Х-100 при температуре 4°С, что позволяло визуализировать нейроны, заполненные биоцитином. После этого нейроны реконструировали, используя конфокальный лазерный сканирующий микроскоп Olympus Fluoview 500 (Olympus, США), оснащенный ×20/0.80 N.A. масляным иммерсионным объективом. 52 Иммуногистохимическое выявление кальцийсвязывающих белков и нейропептидов проводили методом непрямой иммунофлуоресценции [259]. Для этого после конфокальной реконструкции нейронов срезы разрезали на вибротоме на секции толщиной 40-50 мкм и затем инкубировали в течение 2-3 дней при температуре 4°С в растворе фосфатного буфера, содержащем 10% козью сыворотку, 2% бычий сывороточный альбумин, смесь из двух первичных антител, полученных в разных животных. Точные концентрации антител подбирались в каждой серии экспериментов (Таблица 2). Таблица 2 Список первичных антител Антиген Животное Разведение Моно/поликлональное Источник Кальбиндин Мышь 1:1000 Моноклональное Swant (300) Кальретинин Мышь 1:1000 Моноклональное Chemicon (MAB1568) Кальретинин Кролик 1:1500 Поликлональное Swant (7699/4) Нейропептид Y Кролик 1:500 Поликлональное Sigma (N9528) Парвальбумин Мышь 1:2000 Моноклональное Sigma (P3088) Парвальбумин Кролик 1:2000 Поликлональное Swant (PV 28) 1:200 Моноклональное Chemicon (MAB354) Соматостатин-14 Крыса После тщательной отмывки, срезы инкубировали в смеси 2-х соответствующих вторичных антител, конъюгированных с разными флуоресцентными метками: Alexa Fluor 546 и Alexa Fluor 488, разведенных в концентрации 1:500 (Invitrogen). Такая гистохимическая процедура позволяла проверить наличие двух пептидов в каждом из зарегистрированных нейронов, помеченных с помощью Alexa Fluor 633. Локализацию нейропептидов и кальцийсвязывающих белков анализировали с помощью конфокальной микроскопии. После анализа флуоресцентных сигналов срезы обрабатывали 1% Н2О2 в течение 2-3 ч при комнатной температуре, тщательно отмывали и инкубировали с авидин-биотинпероксидазным комплексом (1:100; Vector Laboratories, США) в фосфатном буфере в течение 4 часов при комнатной температуре. После этого срезы промывали и окрашивали с помощью 3,3'-диаминобензидина (DAB), размещали на предметных стеклах, обезвоживали, заполняли бальзамом и накрывали покровными стеклами. В некоторых случаях на основе этих 53 препаратов проводили полную прорисовку отростков нейрона с помощью специализированного пакета для реконструкции нейронов Neurolucida (MicroBrightField, США). 2.4. Статистическая обработка данных Статистическая обработка данных проводилась с помощью программных пакетов Excel MS Office, Origin, Statistica. Данные в большинстве случаев приводятся как средние значения со стандартными ошибками измерения или как среднее со стандартным отклонением. Описание методов многомерной статистики, используемых в работе, дается по ходу изложения результатов, полученных с их помощью. 54 Глава 3. 3.1. ПИРАМИДНЫЕ НЕЙРОНЫ ПРЕФРОНТАЛЬНОЙ КОРЫ ОБЕЗЬЯНЫ Электрофизиологическая классификация пирамидных клеток на основе многомерного статистического анализа В экспериментах, требующих от животного удержания в оперативной памяти какой- либо информации, было выявлено, что пирамидные нейроны префронтальной коры часто остаются активными в течение всего периода задержки. Таким образом, эти нейроны являются клеточным коррелятом процесса удержания информации в памяти [61, 62]. Электрофизиологические мембранные свойства пирамидных нейронов коры являются важнейшими детерминантами функционирования нейронов in vivo, поэтому изучение мембранных свойств необходимо, чтобы лучше понять механизмы работы коры при выполнении различных функций. Например, показано, что возрастные изменения электрофизиологических свойств пирамидных нейронов префронтальной коры обезьяны, таких как входное сопротивление, характеристики функциональной зависимости частоты разряда от силы деполяризующего тока коррелируют с нарушениями оперативной памяти [122, 123, 260, 261]. Несмотря на важность изучения электрофизиологических свойств пирамидных нейронов префронтальной коры приматов, есть лишь несколько работ, посвященных изучению данного вопроса на примере свойств пирамидных нейронов 5 слоя префронтальной коры обезьяны [262]. Поэтому данное исследование было сфокусировано на изучении биофизических свойств пирамидных нейронов 2-3 слоев. Были проанализированы электрофизиологические свойства 77 пирамидных нейронов префронтальной коры обезьяны. Первоначальная идентификация типа нейронов проводилась визуально в ходе эксперимента, основываясь на пирамидной форме тела и наличию выраженного апикального отростка. После электрофизиологических регистраций и фиксации срезов производилась реконструкция нейронов с помощью конфокального микроскопа или прорисовка их дендритного дерева при наблюдении в светлом поле с помощью специального программного обеспечения Neurolucida. На основе этих изображений был точно установлен морфологический тип нейронов. Все пирамидные клетки имели хорошо выраженные апикальный и базальные дендриты, густо покрытые шипиками. Тела изучаемых пирамидных нейронов были расположены в слое 2/3 на глубине 300-800 мкм от поверхности коры (Рис. 7). 55 Рис. 7. Типичные идентификационный примеры номер морфологии клетки и ее пирамидных клеток. Вверху электрофизиологический тип. указаны RS – регулярноразряжающиеся нейроны, LTS – низкопороговые залповые нейроны, IM – нейроны с промежуточным паттерном. Внизу – электрофизиологический кластер (пояснения в тексте). Согласно современным электрофизиологическим классификациям [213, 214, 262-266] среди пирамидных клеток выделяют низкопороговые нейроны (low-threshold spiking, LTS), известные так же как залповые нейроны (intrinsic bursting) и регулярноразряжающиеся нейроны (regular spiking, RS). Регулярноразряжающиеся нейроны часто подразделяют на несколько подклассов на основе величины изменений амплитуды, порога возникновения потенциала действия и степени частотной адаптации в ходе пачечного ответа [214, 262, 267, 268]. Однако эти критерии выбраны произвольно и поэтому не всегда очевидно, как соотносятся между собой подклассы пирамидных клеток, выделенные в разных работах [214]. Надежная электрофизиологическая классификация пирамидных клеток должна учитывать максимальное количество функционально значимых электрофизиологических характеристик нейронов. В данной работе был применен метод кластерного анализа, перспективность которого для классификации нейронов была показана ранее [234, 235, 247, 248]. Сначала для кластерного анализа были отобраны 24 электрофизиологических параметра, наиболее полно описывающих ответы нейронов на подпороговую стимуляцию, свойства 56 потенциала действия и паттерна пачечного ответа (полное описание выбранных параметров приведено в Методах). Важно, чтобы выбранные параметры были независимы друг от друга и описывали разные биофизические характеристики. Для того, чтобы исключить взаимозависимые параметры, были рассчитаны коэффициенты корреляции между выбранными величинами (Таблица 3). Между большинством параметров были выявлены слабые корреляции в диапазоне 0.20 ÷ 0.40, а более высокие корреляции (r >0.50) встречались только между небольшим числом переменных. Из двух сильно коррелирующих параметров только один был использован для кластерного анализа. Всего в кластерный анализ были включены 16 переменных: 1) входное сопротивление; 2) постоянная времени мембраны; 3-5) порог, амплитуда и длительность потенциала действия; 6-7) амплитуда полной следовой гиперполяризации и ее промежуточного компонента; 8) амплитуда следовой деполяризации; 9) период достижения максимальной следовой гиперполяризации; 10) стабильная частота разрядов; 11-12) начальная и полная частотная адаптация; 13) первый межспайковый интервал; 14) коэффициент нарастания первой мгновенной частоты; 15) первая мгновенная частота при пороговом токе; 16) суммарный показатель, характеризующий спад мембранного потенциала при гиперполяризации, горб при деполяризации и возвратную следовую деполяризацию. Среднее абсолютное значение коэффициента корреляции между этими 16 переменными составило 0.21 ± 0.01 (p >0.05), что позволяет считать эти переменные независимыми параметрами. В работе использовался алгоритм иерархической кластеризации Уорда в многомерном Евклидовом пространстве, кластерный анализ проводился с помощью программы Statistica после предварительной нормализации данных. Анализ полученной дендрограммы свидетельствует, что существует 4 различных электрофизиологических класса пирамидных нейронов (Рис. 8). Для валидизации результатов кластерного анализа было проведено их сопоставление с классификацией на основе визуального анализа паттернов разрядов нейронов в ответ на деполяризующие токи. Было найдено, что кластеры 1 (n = 27) и 2 (n = 13) включают в себя в основном регулярноразряжающиеся пирамидные нейроны. Эти нейроны при действии порогового деполяризующего тока генерировали потенциалы действия с небольшой частотой, при этом в ходе пачечного ответа частота разрядов снижалась (Рис. 9). Частота потенциалов действия и степень частотной адаптации возрастали с увеличением силы деполяризующего тока. 57 Таблица 3 Коэффициенты корреляции между электрофизиологическими параметрами пирамидных клеток Параметры 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 Потенциал покоя 2 Входное сопротивление 0.05 3 Постоянная мембраны 0.21 0.50 4 Реобаза -0.09 -0.73 -0.5 5 Спад потенциала при гиперполяризации 0.27 -0.42 -0.18 0.22 6 Возвратная следовая деполяризация 0.22 -0.42 -0.14 0.23 0.86 7 Горб при деполяризации 0.22 -0.27 -0.14 0.16 0.66 0.67 8 Латентный период первого потенциала действия -0.30 0.17 0.30 -0.16 -0.34 -0.32 -0.47 9 Порог потенциала действия 0.27 0.23 0.08 0.07 -0.15 -0.3 -0.32 0.19 10 Амплитуда потенциала действия -0.26 -0.49 -0.18 0.42 0.07 0.1 11 Длительность потенциала действия 0.02 0.12 0.54 -0.19 -0.14 -0.07 -0.08 0.28 -0.10 -0.10 12 Амплитуда следовой гиперполяризации -0.02 -0.02 -0.17 0.13 -0.01 -0.12 -0.17 0.01 0.50 0.11 -0.33 13 Амплитуда быстрой 0.08 0.13 -0.03 -0.06 -0.04 -0.15 -0.06 -0.13 0.33 0.12 -0.21 0.82 следовой гиперполяризации 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 0.02 -0.13 -0.31 58 14 Параметры 1 Амплитуда следовой деполяризации 0.11 -0.32 -0.26 0.29 0.15 0.12 0.19 -0.21 0.02 0.20 -0.05 0.23 0.27 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Амплитуда промежуточной -0.11 -0.39 -0.27 0.38 0.13 0.18 0.00 0.13 0.02 0.03 -0.04 -0.13 -0.61 0.27 следовой гиперполяризации Период достижения 16 максимальной следовой -0.07 -0.46 -0.22 0.48 0.21 0.21 0.09 0.06 0.02 0.07 -0.11 -0.10 -0.45 0.26 0.75 гиперполяризации Коэффициент нарастания 17 0.07 0.43 -0.02 -0.45 -0.16 -0.13 -0.17 0.04 0.06 -0.47 -0.20 -0.07 -0.05 -0.09 -0.03 -0.01 первой мгновенной частоты 15 18 Первая мгновенная частота 0.05 0.09 0.14 -0.09 0.06 0.17 0.47 -0.15 -0.30 -0.06 0.11 -0.46 -0.13 0.03 -0.29 -0.27 -0.19 при пороговом токе 19 Коэффициент нарастания 0.12 0.44 0.01 -0.43 -0.11 -0.12 -0.01 -0.08 -0.02 -0.55 -0.09 -0.19 0.00 -0.03 -0.23 -0.21 0.73 0.14 второй мгновенной частоты 20 Вторая мгновенная частота 0.11 0.16 0.17 -0.20 0.03 0.08 0.33 -0.18 -0.19 -0.09 0.02 -0.27 0.01 -0.27 -0.45 -0.43 -0.17 0.72 0.04 при пороговом токе 21 Первый интерспайковый интервал 0.06 -0.33 -0.33 0.36 0.16 0.10 -0.15 -0.05 0.16 0.16 -0.16 0.23 -0.05 0.04 0.37 0.34 0.07 -0.68 -0.12 -0.42 22 Начальная частотная адаптация 0.03 -0.28 -0.17 0.28 0.34 0.31 0.32 -0.02 -0.03 0.07 0.07 -0.21 -0.33 0.40 0.49 0.47 0.19 0.07 -0.08 -0.23 0.02 23 Полная частотная адаптация 0.02 0.04 0.08 -0.08 0.23 0.27 0.47 -0.15 -0.17 -0.12 0.18 -0.36 -0.17 0.22 -0.02 0.01 0.24 0.62 0.30 0.35 -0.44 0.61 24 Стабильная частота разрядов -0.18 0.34 -0.2 -0.23 -0.27 -0.30 -0.22 -0.05 0.10 -0.23 -0.32 0.11 0.22 -0.13 -0.31 -0.26 0.57 -0.15 0.59 -0.06 0.00 -0.24 -0.04 59 Рис. 8. Электрофизиологическая классификация пирамидных нейронов, полученная на основе кластерного анализа. (A) Дендрограмма указывает на наличие 4 классов пирамидных нейронов. (B) Взаимосвязь результатов кластерного анализа с субъективной классификацией, полученной на основе визуального анализа паттерна разрядов нейрона. Гистограмма показывает, что 1 и 2 кластеры содержат в основном регулярноразряжающиеся нейроны (RS), RS_LRi и RS_HRi – нейроны с низким и высоким входным сопротивлением мембраны соответственно. Большинство пирамидных нейронов с промежуточным паттерном (IM) вошли в кластер 3, а залповые пирамидные нейроны (LTS) – в кластер 4. В кластер 4 (n = 13) вошли в основном низкопороговые залповые нейроны. Эти клетки в отличие от нейронов с регулярным паттерном отвечали на пороговый деполяризующий ток не одиночными потенциалами действия, а залпами (пачками) из 2-5 высокочастотных спайков (Рис. 9). 60 Рис. 9. Типичные примеры ответов пирамидных нейронов разных классов из 2-3 слоев префронтальной коры макаки: (A) регулярноразряжающийся нейрон, (B) залповый нейрон, (C) нейрон с промежуточным паттерном. Показаны записи ответов при применении деполяризующих токов равных соответственно 1.0, 1.5 и 2.0 реобазам. 61 В ходе короткого залпа порог потенциала действия несколько возрастал, а амплитуда снижалась. После начального залпа нейроны продолжали отвечать обычными одиночными спайками. Так же как и у регулярноразряжающихся нейронов частота потенциалов действия уменьшалась в течение ответа, а их амплитуда и порог оставались неизменными. В кластер 3 (n = 24) вошли регулярноразряжающиеся пирамидные нейроны и нейроны, которые в зависимости от условий напоминали либо низкопороговые нейроны, либо регулярноразряжающиеся нейроны, поэтому эти клетки были названы нейронами с промежуточными свойствами (intermediate, IM) (Рис. 9). При околопороговой силе деполяризующего тока эти нейроны вели себя как регулярноразряжающиеся нейроны, однако при увеличении силы тока начинали ответ с залпа потенциалов действия высокой частоты как низкопороговые пирамидные клетки. 3.2. Электрофизиологические свойства пирамидных клеток разных классов Кластерный анализ помогает сгруппировать нейроны по схожести признаков, однако он не позволяет судить о различиях между выявленными группами. Для нахождения статистически значимых различий между классами пирамидных клеток использовался однофакторный дисперсионный анализ с последующим проведением теста парных сравнений Фишера (Таблица 4). Дисперсионный анализ выявил различия между классами нейронов по 21 из 24 электрофизиологических показателей, что подтверждает статистическую значимость предложенной классификации. Согласно результатам теста парных сравнений Фишера класс низкопороговых пирамидные нейроны (4-ый класс) отличался от всех остальных по максимальному количеству признаков (9 из 24), включая почти все свойства, характеризующие потенциал действия и взаимоотношения между силой деполяризующего тока и частотой разрядов нейрона. Клетки с промежуточными свойствами (3-й класс) отличались от других по своим подпороговым свойствам (спаду потенциала при гиперполяризации и входному сопротивлению), кинетике следовых процессов и частотной адаптации. Регулярноразряжающиеся пирамидные нейроны из 1-го и 2-го классов, различались между собой входным сопротивлением и частотными характеристиками (Таблица 4). 62 Таблица 4 Электрофизиологические свойства пирамидных нейронов 2-3 слоев префронтальной коры обезьяны Электрофизиологические параметры класс 1* класс 2 класс 3 класс 4 F p парные сравнения** Потенциал покоя (мВ) -73.2±1.1# -71.3±1.9 -71.8±1.0 -71.7±1.1 0.5 0.70 (1,2,3,4) Входное сопротивление (МОм) 174±16 332±28 118±7 261±42 18.1 <0.001 (3); (1); (2, 4) Постоянная мембраны (мс) 19.6±0.9 20.8±2.3 17.2±0.7 25.3±3.0 4.5 <0.01 (1,2,3); (2,4) Реобаза (пА) 106±8 52±9 120±7 60±12 12.8 <0.001 (2,4); (1,3) Спад потенциала при гиперполяризации (%) 9.7±1.2 6.6±0.9 20.2±2.6 13.2±2.0 9.1 <0.001 (1,2,4); (3) Возвратная следовая деполяризация (%) 8.9±1.4 7.3±0.9 19.0±2.0 14.8±2.4 8.8 <0.001 (1,2); (3;4) Горб при деполяризации (%) 11.8±1.9 8.6±2.3 31.2±3.7 32.3±4.6 14.2 <0.001 (1,2); (3;4) Латентный период первого потенциала действия (мс) 136±10 150±20 117±8 126±17 1.2 0.31 (1,2,3,4) Порог потенциала действия (мВ) -40.4±0.9 -40.0±0.9 -41.4±0.7 -44±0.8 3.1 <0.05 (1,2,3); (3,4) Амплитуда потенциала действия (мВ) 82±2 64±4 82±2 78±2 10.9 <0.001 (2); (1,3,4) Длительность потенциала действия (мс) 0.93±0.02 0.88±0.04 0.90±0.03 1.12±0.11 3.3 <0.05 (1,2,3); (4) Амплитуда следовой гиперполяризации (мВ) 11.9±0.8 9.6±1.0 10.4±0.6 6.6±1.0 5.9 <0.01 (4); (1,2,3) Амплитуда быстрой следовой гиперполяризации (мВ) 7.2±1.5 5.5±1.7 5.5±1.1 6.0±1.0 0.40 0.75 (1,2,3,4) 63 класс 4 F p парные сравнения** 0.52±0.28 2.4±0.35 n/a 6.7 <0.001 (1,2); (3) 5.5±0.7 4.6±0.9 7.3±0.6 n/a 10.1 <0.001 (1,2); (3) 37±4 32±6 61±6 1.3±0.2 19.8 <0.001 (4); (1,2); (3) 0.42±0.04 1.22±0.15 0.70±0.06 0.49±0.07 19.4 <0.001 (1,4); (3,4);(2) 1.1±1.2 1.0±5.4 102±15 34.1 <0.001 (1,2,3); (4) 0.25±0.03 0.92±0.17 0.33±0.05 0.55±0.07 14.6 <0.001 (1,3); (3,4);(2) 1.67±0.65 0.52±2.17 -1.1±1.1 39±10 23.5 <0.001 (1,2,3); (4) Первый межспайковый интервал (мс) 215±13 165±28 186±24 27±15 13.2 <0.001 (4); (1,2,3) Начальная частотная адаптация (%) 37±2 37±5 66±3 42±3 21.7 <0.001 (1,2,4); (3) Полная частотная адаптация (%) 50±2 58±5 76±2 86±2 34.4 <0.001 (1,2); (3);(4) Стабильная частота разрядов (Гц) 16.3±0.7 26.6±2.4 17.1±0.9 16.5±1.0 13.9 <0.001 (1,3,4); (2) Электрофизиологические параметры класс 1* класс 2 Амплитуда следовой деполяризации (мВ) 0.84±0.21 Амплитуда промежуточной следовой гиперполяризации (мВ) Период достижения максимальной следовой гиперполяризации (мс) Коэффициент нарастания первой мгновенной частоты (Гц/пА) Первая мгновенная частота при пороговом токе (Гц) Коэффициент нарастания второй мгновенной частоты (Гц/пА) Вторая мгновенная частота при пороговом токе (Гц) класс 3 16.8±7.7 * Класс 1 – регулярноразряжающиеся нейроны с низким входным сопротивлением (n=27), класс 2 – регулярноразряжающиеся нейроны с высоким входным сопротивлением (n=13), класс 3 – нейроны с промежуточным паттерном (n=24), класс 4 – низкопороговые нейроны (n=13). ** Классы пирамидных нейронов, стоящие вместе в круглых скобках, статистически не отличаются друг от друга. # Среднее ± стандартная ошибка. 64 В соответствие с этими характеристиками выделенные классы пирамидных нейронов были обозначены: класс 1 (RS_LRi) – регулярноразряжающиеся пирамидные нейроны с низким входным сопротивлением, класс 2 (RS_HRi) – регулярноразряжающиеся пирамидные нейроны с высоким входным сопротивлением, класс 3 (IM) – пирамидные нейроны с промежуточным паттерном, класс 4 (LTS) – низкопороговые пирамидные нейроны. 3.2.1. Ответы пирамидных нейронов на подпороговую стимуляцию Мембранный потенциал покоя не различался у выделенных классов пирамидных клеток (F = 0.5, p = 0.70) и в среднем составил 72.2 ± 0.6 мВ. Распределение значений мембранного потенциала в исследуемой популяции нейронов соответствовало нормальному (тест Колмогорова-Смирнова, d = 0.08, p >0.20). Входное сопротивление мембраны различалось у клеток разных классов (Рис. 10). Клетки с промежуточным паттерном имели самое низкое сопротивление (118 ± 7 МОм); у регулярноразряжающихся нейронов с низким входным сопротивлением оно было несколько выше (174 ± 16 МОм); а у регулярноразряжающихся пирамидных нейронов с высоким сопротивлением и низкопороговых нейронов было наиболее высокое входное сопротивление мембраны (332 ± 28 и 261 ± 42 МОм, соответственно). Регулярноразряжающиеся нейроны с высоким входным сопротивлением и низкопороговые нейроны имели более низкую реобазу, чем пирамидные нейроны из двух других классов. Постоянная времени мембраны была максимальной у клеток с промежуточным паттерном, что позволяет этим клеткам наиболее эффективно суммировать синаптические возбуждающие потенциалы. В ответ на прямоугольный импульс гиперполяризующего тока у пирамидных клеток с промежуточным паттерном наблюдался медленный спад мембранного потенциала (sag), приближающий его к потенциалу покоя (Рис. 10В). Этот спад потенциала был интенсивнее, если клетки гиперполяризовали более чем на 10-20 мВ по сравнению с потенциалом покоя. 65 Спад потенциала связан с активацией Ih тока, идущего через HCN каналы (Hyperpolarizationactivated and Cyclic Nucleotide-gated channels) [269-271]. Рис. 10. (A-D) Подпороговые мембранные свойства пирамидных нейронов четырех классов (обозначения классов приведены на стр. 65). На графиках показаны зависимости изменения потенциала на мембране от силы тока, измеренные при максимальном отклонении в начале применения тока (треугольники) и при установлении стабильного потенциала (кружки). (Е) Итоговая диаграмма по разным классам. Sag - спад потенциала при гиперполяризации, RD возвратная следовая деполяризация и Hump - горб при деполяризации. 66 Если у пирамидных клеток с промежуточным паттерном наблюдался наибольший спад потенциала (23.5 ± 2.9%), то у пирамидных клеток из других классов спада мембранного потенциала обычно не было или он был незначительным и составлял 7-13% (Рис. 10). У большинства пирамидных клеток, имеющих сильный спад потенциала при действии гиперполяризующего тока, при последующем снятии тока наблюдалась возвратная следовая деполяризация. Положительная корреляция между спадом и возвратной следовой деполяризацией (r = 0.86, р <0.001) показывает (Рис. 11), что ионные механизмы этих явлений схожи и Ih ток может обуславливать возвратную следовую деполяризацию. В отличие от данных предыдущих исследований [213, 214, 265] возвратная следовая деполяризация в наших экспериментальных условиях никогда не вызывала потенциалов действия. Рис. 11. Свойства подпороговых ответов пирамидных нейронов. (А и В) Диаграммы рассеяния, выявляющие сильные корреляции между спадом мембранного потенциала при гиперполяризации и возвратной деполяризацией (А) или деполяризационным горбом (В), расшифровка классов приведена на стр. 65. (С) Потенциалзависимость амплитуды деполяризационного горба у низкопороговой пирамидной клетки. 67 В ответ на действие подпорогового деполяризующего тока почти все низкопороговые пирамидные клетки и клетки с промежуточным паттерном вначале показывали кратковременный подъем мембранного потенциала, напоминающий по форме «горб» (hump). Этот деполяризационный горб не был характерен для регулярноразряжающихся пирамидных клеток (Рис. 10А и D). Предполагается, что в основе этого феномена лежит активация низкопороговых кальциевых каналов. В пользу экспериментальных фактов. этого предположения свидетельствует несколько Первый, наличие залпов из потенциалов действия у низкопороговых пирамидных клеток в начале ответа. Второй, кратковременная деполяризация в форме горба была потенциалзависимой: амплитуда горба была больше, если деполяризующий ток подавался при более низком мембранном потенциале (Рис. 11С). Амплитуда «горба» коррелирует с величиной спада потенциала при гиперполяризации (r = 0.66, р <0.001) и с величиной возвратной следовой деполяризацией (r = 0.67, р <0.001), что косвенно указывает на вклад Ih тока в формирование деполяризационного горба. Следует также отметить, что наклон линий регрессии между амплитудой спада и «горба» отличается у разных классов пирамидных клеток (Рис. 11В). 3.2.2. Свойства потенциала действия у пирамидных клеток разных классов Латентный период возникновения потенциала действия при пороговой стимуляции у пирамидных клеток разных классов не различался, среднее значение составило 131 ± 6 мс. Порог возникновения потенциала действия был ниже у низкопороговых пирамидных нейронов (-44.0 ± 0.8 мВ), чем у регулярноразряжающихся пирамидных клеток (-40.4 ± 0.9 мВ пирамиды с низким входным сопротивлением и -40.0 ± 0.9 мВ с высоким входным сопротивлением), что указывает на большую возбудимость низкопороговых нейронов. Наибольшая длительность потенциала действия наблюдалась у низкопороговых нейронов (1.12 ± 0.11 мс), тогда в других классах пирамидных клеток она составляла 0.88 ÷ 0.93 мс. Наименьшая амплитуда потенциала действия была отмечена у регулярноразряжающихся пирамидных клеток с низким входным сопротивлением (64 ± 4 мВ), у остальных электрофизиологических классов пирамидных клеток она составляла 78 ÷ 82 мВ. 68 У многих пирамидных нейронов каждый потенциал действия завершался схожей последовательностью следовых потенциалов: (1) быстрая следовая гиперполяризация, (2) следовая деполяризация, (3) промежуточная следовая гиперполяризация. Однако величина следовой деполяризации сильно варьировала и в некоторых клетках полностью отсутствовала (Рис. 12). Рис. 12. Последовательность следовых потенциалов у пирамидных клеток различных классов: (А) регулярноразряжающаяся клетка с высоким входным сопротивлением; (В) регулярноразряжающаяся клетка с низким входным сопротивлением; (С) клетка с промежуточным паттерном; (D) низкопороговые пирамидные клетки. (Е) Диаграмма, показывающая амплитуды следовых потенциалов у клеток разных классов: AHP – амплитуда следовой гиперполяризации, fAHP – амплитуда быстрого компонента следовой гиперполяризации, ADP – амплитуда следовой деполяризации, mAHP - амплитуда промежуточного компонента следовой гиперполяризации. 69 Следовая деполяризация была наиболее выраженной в пирамидных клетках с промежуточным паттерном (2.4 ± 0.4 мВ), тогда как у регулярноразряжающихся клеток была небольшой (0.8 ± 0.2 мВ для пирамид с низким входным сопротивлением и 0.5 ± 0.3 мВ – с высоким входным сопротивлением). Промежуточная следовая гиперполяризация у регулярноразряжающихся пирамид с низким входным сопротивлением была больше по амплитуде и почти в два раза дольше по длительности, чем у регулярноразряжающихся клеток с высоким входным сопротивлением. У низкопороговых пирамидных клеток сильно выраженная следовая деполяризация вызывала последующий потенциал действия, который полностью маскировал промежуточную следовую гиперполяризацию. За первоначальной пачкой потенциалов действия у низкопороговых клеток обычно следовали одиночные спайки с той же последовательностью следовых потенциалов, что и у регулярноразряжающихся пирамидных клеток. 3.2.3. Характеристики паттерна разрядов пирамидных клеток разных классов Начальный ответ Одна из отличительных особенностей низкопороговых пирамидных клеток - это их способность давать короткий залп потенциалов действия в начале ответа на минимальную надпороговую ступеньку деполяризующего тока. Типичная низкопороговая пирамидная клетка из слоя 2/3 дает один первоначальный высокочастотный залп, состоящий из 3-4 потенциалов действия, за которым следуют одиночные потенциалы действия со значительно меньшей частотой. В отличие от низкопороговых пирамидных клеток, регулярноразряжающиеся пирамиды и клетки с промежуточным паттерном при небольшой надпороговой деполяризации отвечают потенциалами действия с низкой частотой. Для количественной оценки этого аспекта паттерна разрядов был измерен межспайковый интервал между первыми двумя потенциалами действия (ISI1-2) при минимальной величине деполяризующего тока, вызывающего пачки потенциалов действия. У низкопороговых пирамидных клеток был наименьший межспайковый интервал ISI1-2 (27 ± 15 мс), а средние значения ISI1-2 у других классов пирамидных клеток были в несколько раз больше (165 ÷ 215 мс) (Рис. 13). 70 Рис. 13. Гистограмма, иллюстрирующая величину первых межспайковых интервалов у пирамидных клеток различных электрофизиологических классов. Расшифровка названий классов приведена на стр. 65. Частотная адаптации Чтобы оценить степень частотной адаптации, были построены графики зависимости мгновенной частоты потенциалов действия от их порядкового номера в пачке. Мгновенную частоту потенциала действия вычисляли как величину обратную соответствующему межспайковому интервалу. При околопороговых деполяризующих ступенях тока в обоих классах регулярноразряжающихся пирамидных клеток межспайковые интервалы практически не меняются и, таким образом, у этих пирамидных клеток нет частотной адаптации, в то время как у низкопороговых клеток наблюдается сильная частотная адаптации (Рис. 14). Увеличение силы деполяризующего тока повышало величину частотной адаптации у регулярноразряжающихся клеток и клеток с промежуточным паттерном. У регулярноразряжающихся пирамидных клеток частотная адаптация происходила в течение первых 3-6 потенциалов действия (первых 100-200 мс после начала действия тока), позже частота потенциалов действия оставалась относительно стабильной до конца действия тока. При увеличении силы деполяризующего тока большинство пирамидных клеток с промежуточным паттерном начинали свой ответ с дублета потенциалов действия за которым следовали отдельные потенциалы действия без выраженной частотной адаптации. Для корректного сравнения степени частотной адаптации у разных классов пирамидных клеток ее измеряли при силе тока равной двум реобазам. Полная частотная адаптация определялась как процент уменьшения частоты от первоначального уровня (величина обратная первому межспайковому интервалу) до стабильной частоты разрядов нейрона, а 71 начальная частотная адаптация определялись как процент уменьшения частоты разрядов после первого и второго потенциала действий; частоты рассчитывались как величины обратные первому и второму межспайковому интервалу. Рис. 14. Частотная адаптации пирамидных клеток различных электрофизиологических классов (А-D), расшифровка названий классов приведена на стр. 65. (Е) Диаграмма, показывающая величины начальной (FFA_early) и полной (FFA_late) частотной адаптации у нейронов разных классов. Полная частотная адаптация была выше у низкопороговых пирамидных нейронов (86 ± 2%) и клеток с промежуточным паттерном (76 ± 2%), тогда как у регулярноразряжающихся пирамидных клеток она была меньше (50 ± 2% у пирамид с низким входным сопротивлением и 58 ± 5% у пирамид с высоким входным сопротивлением). Наибольшая начальная частотная адаптация была найдена у клеток с промежуточным паттерном (66 ± 3%), тогда как во всех остальных классах пирамидных клеток она составляла около 40% (Рис. 14E). 72 Интересно, что изменение величины частотной адаптации у разных классов пирамидных клеток с увеличением силы деполяризующего тока различалось. Чтобы оценить изменения частотной адаптации при увеличении силы деполяризующего тока был введен коэффициент частотной адаптации, который рассчитывался как отношение между длительностями последнего и первого межспайковых интервалов. Коэффициент частотной адаптации у регулярноразряжающихся клеток был максимальным при околопороговых значениях тока и монотонно уменьшался с увеличением силы деполяризующего тока (Рис. 15). У клеток с низким входным сопротивлением коэффициент частотной адаптации был выше, чем у клеток с высоким входным сопротивлением при всех значениях тока. Низкопороговые клетки, напротив, имели минимальное значение коэффициента адаптации при околопороговых значениях тока, однако коэффициент частотной адаптации возрастал при увеличении силы тока. Рис. 15. Изменения коэффициента частотной адаптации пирамидных клеток различных электрофизиологических классов, расшифровка названий классов приведена на стр. 65. У клеток с промежуточным паттерном коэффициент частотной адаптации уменьшался при увеличении силы тока, однако его изменения были меньше, чем регулярноразряжающихся пирамид. Различие по коэффициенту частотной адаптации между разными классами пирамидных клеток было максимальным при околопороговых значениях тока, тогда как при возрастании деполяризующего тока над порогом на 150-200 пА эти различия между пирамидными клетками практически исчезали (Рис. 15). Таким образом, различия между разными классами пирамидных клеток при сильной стимуляции уменьшаются. 73 Взаимосвязь между силой деполяризующего тока и частотой потенциалов действия в разных классах пирамидных клеток Одним из важных свойств нейронов является их способность к пространственной и временной суммации синаптических входов и трансформация их в потенциалы действия. Количественная взаимосвязь между приходящими деполяризующими синаптическими воздействиями и частотой разрядов нейрона является важнейшей функциональной характеристикой. Поэтому была рассмотрена взаимосвязь между силой деполяризующего тока и частотой потенциалов действия в разных классах пирамидных клеток (Рис. 16). Рис. 16. Взаимосвязь между силой деполяризующего тока и частотой потенциалов действия у пирамидных клеток разных классов. Пояснения в тексте. 74 Сначала было исследовано, как изменяется латентный период возникновения первого спайка при увеличении силы деполяризующего тока. Для этого была рассчитана мгновенная частота (f0) как величина обратная латентному периоду возникновения первого потенциала действия. Мгновенная частота (f0) нарастала линейно с увеличением силы деполяризующего тока у всех пирамидных клеток. При этом скорость нарастания мгновенной частоты различалась у пирамидных клеток разных классов, будучи максимальной у регулярноразряжающихся пирамид с высоким входным сопротивлением (0.75 ± 0.01 Гц/пА) и минимальной у клеток с промежуточным паттерном (0.30 ± 0.01 Гц/пА) (Рис. 16). Далее было проанализировано, как частота спайков изменяется с увеличением силы деполяризующего тока в разных электрофизиологических классах пирамидных клеток. Так как для пирамидных клеток характерна существенная частотная адаптация, то были отдельно изучены изменения начальной и стабильной частоты разрядов. Для этого были построены графики зависимости мгновенных частот от величины деполяризующего тока (f = f(I)). Мгновенные частоты, соответствующие первому межспайковому интервалу (f1) возрастали с увеличением деполяризующего тока быстрее, чем другие мгновенные частоты (fn) у всех пирамидных клеток. Характер нарастания мгновенной частоты f1 был специфичным в каждом классе. Так, у большинства регулярноразряжающихся пирамидных клеток (30 из 40 клеток) и пирамидных клеток с промежуточным паттерном (16 из 24 нейронов), f1 возрастала линейно с увеличением силы деполяризующего тока (Рис. 16Е). У некоторых регулярноразряжающихся нейронов (10 из 40) на графике f = f1(I) были хорошо различимы 2 участка: при небольших токах мгновенная частота нарастала медленно, а при больших токах мгновенная частота разрядов нарастала с большей скоростью (Рис. 16В). И, наоборот, у трети клеток с промежуточным паттерном (8 из 24) и во всех низкопороговых клетках скорость нарастания первой мгновенной частоты уменьшалась при увеличении деполяризующего тока (Рис. 16С и D). Разная динамика нарастания мгновенной частоты f1 при увеличении силы тока была формализована с помощью линейной аппроксимации. Линия регрессии пересекала ось ординат примерно при нулевых значениях частоты, если наблюдалась линейная зависимость. При наличии двух участков с разным наклоном на графике f = f1(I) линия регрессии могла пересекать ось ординат при отрицательных значениях, если медленное нарастание частоты сменялось более быстрым, или при положительных значениях, если нарастание частоты разрядов замедлялось. Это значение показывает частоту разрядов при пороговом значении деполяризующего тока. Было 75 обнаружено, что у регулярноразряжающихся клеток частота разрядов при пороговом значении тока была близка к 0 Гц (1.1 ± 1.2 у клеток с низким входным сопротивлением и 1.0 ± 5.4 у клеток с высоким входным сопротивлением), тогда как у низкопороговых клеток эта частота была равна 102 ± 15 Гц, а у пирамидных клеток с промежуточным паттерном составляла 17 ± 8 Гц. Коэффициент нарастания первой мгновенной частоты так же значительно отличался у разных классов пирамидных клеток, будучи максимальным у регулярноразряжающихся пирамидных клеток с высоким входным сопротивлением (1.22 ± 0.15 Гц/пА), тогда как в других классах пирамидных клеток этот коэффициент был примерно в два-три раза меньше (Таблица 4). На основе частоты разрядов при пороговом значении деполяризующего тока и коэффициента нарастания первой мгновенной частоты можно легко различить регулярноразряжающиеся пирамидные клетки и низкопороговые нейроны (Рис. 16F). Графики зависимости 2-ой мгновенной частоты от силы деполяризующего тока (f = f2(I)) были аналогичны рассмотренным выше, однако у меньшего количества клеток можно было выявить 2 участка с разным наклоном. Стабильные частоты линейно возрастали с увеличением силы тока у всех клеток. 3.3. Особенности электрофизиологии пирамидных клеток обезьян Как описано выше, пирамидные клетки 2-3 слоев префронтальной коры обезьяны очень разнообразны по мембранным электрофизиологическим свойствам и относятся к разным классам. Эти результаты существенно отличаются от данных, полученных при изучении коры грызунов, где почти все пирамидные клетки 2-3 слоев относятся к регулярноразряжающимся; пирамидные клетки с другими мембранными свойства обычно находят в глубоких слоях коры грызунов [212-215, 266, 272, 273]. Тем не менее, различные по электрофизиологическим свойствам пирамидные нейроны были обнаружены в 2-3 слоях коры кошки и человека [248, 263, 264, 268, 274]. Таким образом, кора головного мозга обезьяны, как и кора мозга человека, отличается от коры грызунов по электрофизиологическим свойствам пирамидных клеток 2-3 слоев. На основе результатов кластерного анализа пирамидные клетки 2-3 слоев префронтальной коры обезьяны были разделены на четыре электрофизиологических класса. Два класса содержат регулярноразряжающиеся клетки, что составляет 52% от общего числа 76 пирамидных клеток, следующий класс включает в себя низкопороговые клетки (17%), а последний класс состоит из клеток с промежуточным паттерном (31%). Два класса регулярноразряжающихся клеток отличаются входным сопротивлением мембраны, постоянной времени мембраны, реобазой, амплитудой потенциала действия и частотой потенциалов действия (Таблица 4). Пирамидные клетки с высоким входным сопротивлением более возбудимы, чем пирамидные клетки с низким входным сопротивлением, и в ответ на синаптическую стимуляцию будут отвечать с меньшим порогом, а при одинаковой стимуляции будут разряжаться с более высокой частотой. Благодаря этому функциональная роль этих клеток в коре может различаться. Следует отметить, что в предыдущих исследованиях пирамидных клеток различия во входном сопротивлении мембраны учитывались крайне редко [244, 275]. Обычно регулярноразряжающиеся пирамидные клетки разделяли на две или три подгруппы на основе изменений величины порога потенциалов действия и частотной адаптации в течение пачки спайковых разрядов [214, 262, 267]. В отличие от ранее опубликованных данных, у пирамидных клеток коры обезьяны мы обычно не наблюдали изменений величины порога потенциалов действия и уменьшения амплитуды ответов во всем диапазоне прилагаемых деполяризующих токов. Кроме того, в данной популяции нейронов не было обнаружено пирамидных клеток с быстрой частотной адаптацией (RS fast-adapting pyramidal cells), которые отвечают только на включение деполяризующего тока 2-10 потенциалами действия, в дальнейшем эти нейроны спайков не генерируют [214, 262, 268, 276]. Регулярноразряжающиеся пирамидные клетки, найденные нами в префронтальной коре обезьяны по своим свойствам в наибольшей степени походили на описанные в литературе RS1 [267], RS [215, 244, 265], медленно адаптирующиеся RS1 [214] пирамидные клетки из коры крысы; медленно адаптирующиеся RS [268], RS [248, 274] из коры кошки; non-LTS RS1 коры макаки [262]; RS [263] и non-LTS пирамидные клетки коры человека [264]. Важно подчеркнуть, что во 2-3 слоях префронтальной коры обезьяны по крайней мере 1/3 популяции пирамидных клеток не является регулярноразряжающимися. Низкопороговые клетки начинают ответ с высокочастотного залпа потенциалов действия даже при пороговой деполяризации, а клетки промежуточного типа генерируют высокочастотные пачки потенциалов действия при более сильной деполяризации. Залп спайковой активности 77 пирамидной клетки состоит, как правило, из 2-5 потенциалов действия, при этом залп из двух потенциалов действия более характерен для пирамидных клеток промежуточного типа, залп из 3-5 спайков для низкопороговых клеток. Как уже упоминалось выше, залповые пирамидные клетки у грызунов встречается только в глубоких слоях коры головного мозга [213, 215, 275, 277]. Например, в медиальной префронтальной коре грызунов низкопороговые залповые клетки составляют до 64-68% в 5 и 6 слоях и не более 5% во 2-3 слоях [213, 265, 273]. В то же время клетки, генерирующие залпы из двух потенциалов действия (дублеты), описаны в разных слоях коры [243, 267, 278]. Стоит также отметить, что описанные ранее низкопороговые пирамидные клетки коры головного мозга человека [263] больше похожи на клетки промежуточного типа обезьяны, чем на собственно залповые низкопороговые клетки. Так, низкопороговые клетки коры человека отвечают типичным регулярным паттерном спайкового ответа при потенциале мембраны более позитивном, чем -69 мВ; в то время как при более низком потенциале покоя они отвечают коротким залпом из двух, реже трех потенциалов действия, за которым следуют регулярные спайки [263, 264]. Принято считать, что низкопороговый паттерн спайковых ответов определяется присутствием низкопороговых кальциевых каналов [213, 265]. В настоящем исследовании прямо не исследовались ионные механизмы низкопорогового паттерна пирамидных нейронов коры обезьян, однако некоторые наблюдения позволяют предположить наличие низкопороговых кальциевых каналов в низкопороговых клетках и клетках промежуточного типа. Например, было обнаружено, что деполяризационный горб у нейронов этих двух электрофизиологических классов был сильнее выражен, если деполяризующий ток применялся с более отрицательного мембранного потенциала. Регулярноразряжающиеся пирамидные клетки обычно не выказывали деполяризационный горб ни при каком мембранном потенциале. Еще одним признаком низкопороговых кальциевых каналов является присутствие следовой деполяризации после потенциала действия [265]. Хотя ионные механизмы следовой деполяризации сильно отличается в различных центральных нейронах [279]; в пирамидных нейронах префронтальной коры крысы, вход ионов Ca2+ играет основную роль в электрогенезе следовой деполяризации [265]. Клетки промежуточного типа выказывали максимальную по амплитуде следовую деполяризацию, в низкопороговых клетках следовая деполяризация была настолько сильна, что вызывала всплеск спайковой активности, и, 78 наоборот, в регулярноразряжающихся пирамидных клетках следовая деполяризация была слабо выражена или полностью отсутствовала. 3.4. Функциональная роль пирамидных клеток разных электрофизиологических классов в коре обезьян Дорсолатеральная префронтальная кора играет ключевую роль в сложных когнитивных функциях, например, в обеспечении оперативной памяти. Предполагается, что постоянно поддерживаемая спайковая активность нейронов префронтальной коры в период отставленного ответа представляет собой нейронный механизм удержания информации в оперативной памяти, необходимой для правильного выполнения задачи [58]. Способность пирамидных нейронов префронтальной коры поддерживать спайковую активность в ходе отставленного ответа может во многом определяться электрофизиологическими свойствами мембран этих клеток. Например, сильная частотная адаптация в ходе пачечного ответа будет существенно ограничивать возможности участия такого нейрона в реверберации нервных импульсов по нервным цепочкам [280, 281]. В компьютерных моделях было показано, что клетки с сильной частотной адаптацией могут снижать эффективность хранения информации в кратковременной памяти [280]. Следует отметить, что в исследуемой быстроадаптирующихся клеток популяции с пирамидных регулярным клеток паттерном, не было описанных найдено другими исследователями у разных видов животных и в разных корковых отделах [214, 262, 268, 276]. Более того, частотной адаптации спайкового ответа практически не наблюдалось у пирамидных клеток с регулярным паттерном ответа при малой интенсивности деполяризующего тока (Рис. 15). При большей силе деполяризующего тока частота потенциалов действия оставалась относительно стабильной после короткого периода частотной адаптации: у низкопороговых клеток и регулярноразряжающихся пирамидных клеток с высоким входным сопротивлением частотная адаптация происходила в первые 100200 мс после начала импульса тока (3-6 начальных потенциала действия), а у регулярноразряжающихся клеток с низким входным сопротивлением и клеток промежуточного типа частотная адаптация происходила еще быстрее (Рис. 14). Полученные результаты позволяют предположить, что среди разных классов пирамидных клеток, описанных в данном исследовании, регулярноразряжающиеся клетки обладают наиболее 79 подходящими электрофизиологическими свойствами для поддержания рециркуляции нервных импульсов в префронтальной коре. В ходе выполнения тестов на оперативную память некоторые нейроны префронтальной коры не выказывали постоянной активности, а возбуждались только при предъявлении целевого стимула или в момент выполнения ответа [69]. Поэтому возникает закономерный вопрос, могут ли различия в электрофизиологических мембранных свойствах нейронов определять, какой тип реагирования будет присущ определенному нейрону? Однако многие, если не большинство нейронов префронтальной коры, генерируют потенциалы действия в течение нескольких этапов выполнения тестов на оперативную память: во время показа стимулов, периода задержки и во время ответа [69]. Поэтому различия, в какой из этапов выполнения теста будет активен нейрон, вряд ли определяются только их электрофизиологическими свойствами, а зависят также от морфологических особенностей нейронов и их связей с соседними нейронами. Например, нейрон, активный в течение нескольких этапов выполнения теста, может иметь тесные связи с несколькими нейронами, которые активируются только в течение отдельных этапов [69]. Нейронная активность в префронтальной коре приматов имеет решающее значение для координации сенсорной и моторной деятельности, памяти и других психических процессов, необходимых для достижения конкретной цели [282, 283]. Когнитивный контроль, осуществляемый префронтальной корой, обеспечивается сложными формами обработки информации в нейронных сетях префронтальной коры, специфичных для этого отдела коры. Следует отметить, что нейроны с залповой активностью могут играть уникальную роль в передаче информации, а кроме того участвовать в некоторых формах кратковременной синаптической пластичности. Например, залпы спайковой активности могут усиливать сигнал при передаче информации по цепочке нейронов [284], могут изменять частоту передачи сигнала [285], или передавать возбуждение на определенные типы нейронов [286]. Важно отметить, что в то время как низкопороговые клетки выказывают залпы спайковой активности независимо от силы деполяризующего стимула или их мембранного потенциала, то характер спайкового ответа клеток промежуточного типа зависит от этих двух параметров. При одних условиях эти клетки будут разряжаться регулярно, а в других условиях залпами спайковой активности. Таким образом, соотношение регулярноразряжающихся и клеток с залповой активностью может меняться в зависимости от функционального состояния и общего уровня активности в нейронных сетях коры 80 обезьян. Различная возбудимость пирамидных клеток, разные зависимости между силой деполяризующего тока и частотой потенциалов действия в описанных классах пирамидных клеток могут играть важную роль в функционировании корковых нейронных сетей. Например, низкопороговые пирамиды и регулярноразряжающиеся пирамидные клетки с высоким входным сопротивлением будут вовлекаться в спайковую активность при меньшей силе синаптической стимуляции, кроме того, так как у этих пирамидных клеток обычно большая постоянная времени мембраны, то они могут эффективнее суммировать приходящие возбуждающие синаптические потенциалы. Напротив, пирамидные клетки промежуточного типа и клетки с регулярным паттерном и низким входным сопротивлением будут активироваться только сильными раздражителями. Регулярноразряжающиеся пирамидные клетки обеспечивают практически линейную трансдукцию силы синаптических входов в величину частоты спайков, при этом клетки с низким входным сопротивлением имеют значительно меньший коэффициент усиления (f=f(I) наклон кривой, Рис. 16), чем клетки с высоким входным сопротивлением и, таким образом, при одинаковой синаптической стимуляции эти клетки будут генерировать спайки с разной частотой. Следует нейромодуляторы, отметить, которые что возбудимость оказывают сразу нейронов несколько регулируют эффектов, многие влияя на электрофизиологические свойства мембраны [287, 288]. Например, дофамин сильно влияет на возбудимость пирамидных нейронов префронтальной коры приматов [289] и их паттерн активности в ходе выполнения тестов на оперативную память в экспериментах in vivo [290292]. Более того, отмечено повышение концентрации внеклеточного дофамина в префронтальной коре обезьян в ходе выполнения тестов на оперативную память [293]. В целом ряде исследований, как на крысах, так и на приматах, показано, что, по крайней мере, при определенных условиях, дофамин через D 1 рецепторы повышает возбудимость нейронов префронтальной коры [287], изменяя, таким образом, взаимосвязь между силой синаптической стимуляции и частотой потенциалов действия в пирамидных клетках. Полученные результаты показывают, что неоднородность электрофизиологических мембранных свойств пирамидных клеток может влиять на особенности обработки информации в префронтальной коре. Однако дополнительные исследования необходимы, чтобы понять, как конкретные электрофизиологические особенности отдельных нейронов префронтальной коры определяют их поведение при действии различных внутренних и внешних факторов в ходе когнитивной деятельности. 81 Глава 4. ИНТЕРНЕЙРОНЫ ПРЕФРОНТАЛЬНОЙ КОРЫ ОБЕЗЬЯНЫ Интернейроны играют важную роль в выполнении специфических функций префронтальной коры, в частности, блокада ГАМКергических рецепторов ведет к серьезным нарушениям при выполнении тестов на оперативную память [65]. Также показано избирательное повреждение интернейронов при таких заболеваниях как шизофрения [294-296] и эпилепсия [297-299]. Нарушения ГАМКергической синаптической передачи найдены в префронтальной коре при болезни Альцгеймера [300]. Корковые ГАМКергические интернейроны – это неоднородная популяция нейронов, различающаяся по морфологическим, электрофизиологическим характеристикам и экспрессируемым молекулярным маркерам [187, 190, 191]. В настоящее время выделяют около десятка различных классов интернейронов, однако общепринятой классификации интернейронов еще не выработано [218]. Роль отдельных классов интернейронов в выполнении тех или иных функций коры, а так же при патологических процессах в ЦНС только сейчас начинает выясняться, однако большинство подобных исследований выполнено на грызунах. Хотя описано несколько гомологичных классов интернейронов у приматов и грызунов, ряд экспериментальных данных свидетельствует, что прямой перенос данных между разными видами вряд ли возможен: 1) в коре приматов доля ГАМКергических клеток существенно выше чем в коре грызунов [226, 258, 301-307]; 2) некоторые морфологические формы вертикальноориентированных интернейронов типичные у обезьян практически отсутствуют у грызунов [188, 220, 222, 308]; 3) онтогенетическое происхождение интернейронов у приматов и грызунов различается [24, 25]; 4) пропорции интернейронов, экспрессирующих разные кальцийсвязывающие белки различаются [190, 225, 257, 258, 303]. Экспериментальных данных, полученных непосредственно на интернейронах коры приматов и человека, в настоящее время достаточно мало, а электрофизиологические свойства многих классов интернейронов обезьян в литературе не описаны совсем. Поэтому целью данного исследование стало изучение электрофизиологических, морфологических и иммуногистохимических свойств интернейронов 2-3 слоев дорсолатеральной префронтальной коры мозга макаки. Всего в выборку было включено 194 электрофизиологически охарактеризованных интернейрона, у всех из них аксонное дерево было в достаточной степени реконструировано, что позволило точно идентифицировать их морфологический тип. 82 4.1. Морфологические группы интернейронов 2-3 слоев дорсолатеральной префронтальной коры мозга макаки Идентификация типов интернейронов префронтальной коры мозга макаки проводилась на основе классификации, предложенной Ланд и Льюисом [220]. Данная классификация была нами модифицирована (Рис. 17), так как заполнение интернейронов красителем во время электрофизиологической регистрации позволило выполнить более качественную морфологическую реконструкцию, чем в оригинальной работе, где использовались препараты с окраской по Гольджи. В основе предложенной классификационной схемы лежат 2 четко определяемых морфологических критерия: 1) распределение ветвей аксона интернейрона по слоям и колонкам коры, что отражает функциональную роль интернейрона в корковых сетях; 2) особенности паттерна аксонной арборизации, форма терминальных окончаний аксона и расположение пресинаптических бутонов, что позволяет выявить, с какими частями постсинаптических нейронов синаптически связан данный интернейрон. На основе этих двух критериев выделены 3 группы интернейронов, включающие 8 морфологических типов. Интернейроны первой группы проецируют свои аксоны к 1 слою коры, формируя там широкое и сильно разветвленное аксонное дерево. Эти интернейроны обеспечивают торможение наиболее дистальных участков дендритов пирамидных клеток своей и соседних колонок. Клетки с подобным аксонным деревом неоднократно описывались в различных участках коры разных видов животных [190, 309-312], в том числе медиальной префронтальной коре макаки [257] и известны как клетки Мартинотти. Вторую группу составляют клетки, формирующие узкое, идущее преимущественно вертикально вниз, аксонное дерево. Интернейроны этой группы обеспечивают интеграцию разных слоев коры в корковой колонке. Так как интернейроны этой группы различаются по морфологии, то их конкретные функции могут различаться. У одного морфологического типа интернейронов из этой группы терминали аксонов несут несколько хорошо выраженных пресинаптических бутонов и идут вдоль тел других нейронов, формируя своеобразные петли. Такая морфологическая особенность сближает данный тип интернейронов с корзинчатыми клетками и поэтому вертикальноориентированные эти нейроны корзинчатые были клетки классифицированы как У типа (Рис. 18). другого интернейронов с аксонами ориентированными вертикально таких терминальных структур не 83 наблюдается, а по многим другим характеристикам они напоминают клетки с двойным букетом (Рис. 18), описанные у многих видов [188, 220, 225, 308, 313, 314]. Согласно литературным данным они контактируют с дистальными участками дендритов. Рис. 17. Схема определения морфологических типов интернейронов 2-3 слоя дорсолатеральной префронтальной коры обезьяны. Все нейроны были 3D реконструированы с помощью компьютерной программы Нейролюсида трейсинг. Тело и дендриты показаны красным, аксоны – синим цветом. Линейка = 100 мкм. Слои отмечены арабскими цифрами. 84 Рис. 18. Примеры реконструированных клеток, проецирующих аксоны к глубоким слоям коры. (А) Конфокальная реконструкция интернейрона с двойным букетом. (В) Реконструкция вертикальноориентированной корзинчатой клетки с помощью конфокального микроскопа (В1) и с помощью компьютерной программы Нейролюсида трейсинг (B2). Тело и дендриты показаны красным, аксоны – синим, потенциальные постсинаптические клетки оранжевым цветом. Линейка = 50 мкм. (С) На вставке показаны микрофотографии, показывающие возможные синаптические контакты вертикальноориентированной корзинчатой клетки с телами постсинаптических нейронов. 85 Третья группа интернейронов наиболее разнообразна. Аксоны клеток этой группы наиболее интенсивно ветвятся в том же слое, где и находится тело. Веточки аксонов могут уходить в другие слои, но обычно они не образуют там больших сплетений. По особенностям строения терминальных окончаний нейроны подразделяются на 2 подгруппы. В первую подгруппу вошли нейроны, у которых терминальные части аксонов сильно отличались по плотности пресинаптических бутонов от более проксимальных участков. Это клеткиканделябры (Рис. 19), описанные у многих видов животных [190, 220, 257, 315], и малые корзинчатые клетки (Рис. 20), терминали которых клешнеобразно охватывают тела постсинаптических нейронов. Рис. 19. Примеры реконструированных клеток-канделябров 2-3 слоя дорсолатеральной префронтальной коры обезьяны. Все нейроны были 3D реконструированы с помощью конфокального микроскопа. Линейка = 100 мкм. Рис. 20. Примеры реконструированных малых корзинчатых клеток 2-3 слоя дорсолатеральной префронтальной коры обезьяны. Все нейроны были 3D реконструированы с помощью конфокального микроскопа. Линейка = 100 мкм. 86 Во вторую подгруппу с равномерной плотностью пресинаптических бутонов вошли три морфологических типа интернейронов. В этой подгруппе нейроны хорошо различались по паттернам аксонной арборизации. Нами было выделено два основных паттерна арборизации: извилистый и прямой (Рис. 21). Рис. 21. Примеры паттернов аксонной арборизации интернейронов коры обезьяны. (А1-А3) Извилистая арборизация. А1 и А2 – участки аксонного дерева гнездообразных корзинчатых клеток. А3 – аксонное ветвлении нейроглиаформной клетки. (В1-В2) Прямая арборизация у двух классических корзинчатых клеток. Линейка = 10 мкм. При извилистом паттерне арборизации аксоны между точками ветвления часто меняют направление своего движения, при этом могут поворачивать даже на 180°, формируя переплетающуюся нейронную сеть. При прямой арборизации аксоны между точками бифуркации чаще следуют по прямым линиям на значительные расстояния. После бифуркации аксоны расходятся под острыми или прямыми углами. Как правило, большинство аксонов следует в направлении от тела клетки. Извилистый паттерн арборизации был типичен для гнездообразных корзинчатых клеток (Рис. 22) и нейроглиаформных интернейронов (Рис. 23) [190, 220, 257, 316], которые различались между собой по числу первичных дендритов и форме аксонного дерева (Рис. 17). Линейный паттерн был типичен для больших корзинчатых клеток (Рис. 24). 87 Рис. 22. Примеры реконструированных гнездообразных корзинчатых интернейронов 2-3 слоя дорсолатеральной префронтальной коры обезьяны. Линейка = 100 мкм. Рис. 23. Примеры реконструированных нейроглиаформных интернейронов 2-3 слоя дорсолатеральной префронтальной коры обезьяны. Все нейроны были 3D реконструированы с помощью конфокального микроскопа. Линейка = 100 мкм. 88 Рис. 24. Примеры реконструированных больших корзинчатых интернейронов 2-3 слоя дорсолатеральной префронтальной коры обезьяны. Чтобы оценить надежность морфологической классификации интернейронов, было исследовано, различаются ли выделенные морфологические типы нейронов по определенным количественным морфологическим параметрам. Были измерены размер тела нейронов, число первичных дендритов, размер аксонного дерева по горизонтали и вертикали. Количественный анализ был проведен по выборке из 95 нейронов (Рис. 25). 89 Рис. 25. Результаты post-hoc теста Фишера для количественных морфологических свойств. (A) Размер тела. (В) Число первичных дендритов. (C) Горизонтальный и (D) Вертикальный размер аксонного дерева. Линиями одного цвета соединены морфологические типы сходные по данному признаку. Синие линии соединяют нейроны с наименьшими значениями, зеленые и желтые со средними, и красные – с наибольшими значениями. Обозначения клеток: LAC – классические корзинчатые, ChC – клетки-канделябры, CAC – гнездообразные корзинчатые клетки, DBC – нейроны с двойным букетом, MC – клетки Мартинотти, VOBC – вертикальноориентированные корзинчатые клетки, LPBC – малые корзинчатые, NGF – нейроглиаформные клетки. По результатам однофакторного дисперсионного анализа и post-hoc тестов, все 4 параметра различались между восьмью морфологическими групп статистически значимым образом (р <0.01), что подтверждает валидность данной классификации. По размеру тела интернейроны подразделялись на 3 частично пересекающиеся подгруппы: Подгруппа 1. Интернейроны с малым телом: клетки-канделябры (74 ± 8 мкм2) и малые корзинчатые клетки (81 ± 10 мкм2). Подгруппа 2. Интернейроны со средним телом: клетки Мартинотти (93 ± 14 мкм2), классические корзинчатые клетки (104 ± 24 мкм2), нейроглиаформные клетки (105 ± 30 мкм2), клетки с двойным букетом (106 ± 26 мкм2). Подгруппа 3. Интернейроны с большим телом: вертикальноориентированные корзинчатые клетки (112 ± 21 мкм2) и гнездообразные корзинчатые клетки (117 ± 27 мкм2). Форма и ориентация тела интернейронов так же значимо различалась между различными типами интернейронов. В большинстве случаев интернейроны имели овальное, 90 слегка вытянутое в радиальном направлении тело и соотношение между радиальным диаметром (перпендикулярным к поверхности коры) и тангенциальным диаметром (Drd/ Dtgn) было больше 1. Это соотношение изменялось от 1.05 ± 0.16 у нейроглиаформных клеток с их практически сферическим телом до 1.34 ± 0.24 у вертикальноориентированных корзинчатых клеток с веретенообразным телом (Рис. 26). Рис. 26. Диаграммы, иллюстрирующие соотношение между радиальным и тангенциальным диаметром тела (Drd/ Dtgn) у разных типов нейронов (слева) и число первичных дендритов у разных типов интернейронов (справа). Обозначения типов клеток как на Рис. 25. Число первичных дендритов варьировало от 2 до 16 у разных нейронов, при этом у нейроглиаформных нейронов было наибольшее число первичных дендритов (10.9 ± 2.8), что является характерной чертой данного морфологического типа (Рис. 19, Рис. 22 и Рис. 25). Оба типа интернейронов с вертикально ориентированным аксонным деревом имели наименьшее число первичных дендритов (2.8 ÷ 3.8), тогда как среднее число дендритов в остальных морфологических группах варьировало от 4.2 до 6.0 (Рис. 26). Интернейроны обезьяны сильно различаются по горизонтальным (тангенциальным) и вертикальным (радиальным) размерам аксонного дерева (Рис. 27). Наименьший вертикальный размер аксонного дерева (201 ± 69 мкм) был обнаружен у малых корзинчатых клеток, у этих нейронов аксоны обычно не выходят из слоя, в котором расположено их тело. Вертикальный размах аксонного дерева у других интраламинарных интернейронов (клетки-канделябры, нейроглиаформные клетки, большие и гнездообразные корзинчатые клетки) был в диапазоне от 450 до 550 мкм. Клетки Мартинотти, направляющие свои аксоны в первый слой имели лишь немного больший вертикальный размер (603 ± 230 мкм), чем интраламинарные клетки. Вертикальный размер аксонного дерева у клеток с двойным букетом (1125 ± 181 мкм) и вертикальноориентированных корзинчатых клеток (1543 ± 835 мкм) был в 2-3 раза больше. 91 Рис. 27. Горизонтальный и вертикальный размер аксонного дерева у различных типов интернейронов. Показаны средние значения и стандартные отклонения. Обозначения типов клеток как на Рис. 25. По величине горизонтального размаха аксонов нейроны подразделяются на 2 группы. Первая группа состоит из клеток, у которых аксоны не выходят за пределы одной корковой колонки, в эту группу попали малые корзинчатые клетки (191 ± 56 мкм), вертикальноориентированные корзинчатые клетки (209 ± 67 мкм), клетки с двойным букетом (261 ± 77 мкм) и клетки-канделябры (277 ± 75 мкм). Остальные 4 морфологических типа интернейронов посылают свои аксоны за пределы одной корковой колонки и, таким образом, обеспечивают интеграцию между соседними колонками. В эту группу вошли нейроглиаформные клетки (439 ± 128 мкм), гнездообразные корзинчатые клетки (545 ± 257 мкм), клетки Мартинотти (581 ± 89 мкм), большие корзинчатые клетки (661 ± 340 мкм). 4.2. Электрофизиологические характеристики интернейронов У каждого интернейрона были измерены 21 электрофизиологических свойства, которые можно подразделить на три группы: 1) свойства ответов интернейронов на действие подпороговых токи; 2) характеристики потенциала действия; 3) характеристики пачечного ответа нейронов (см. Методику). Проведенный однофакторный дисперсионный анализ показал, что морфологические группы интернейронов отличаются друг от друга по большинству параметров за исключением мембранного потенциала покоя и латентного периода первого спайка (Таблица 5). Post-hoc анализ с использованием теста Фишера парных сравнений (Fisher LSD test) выявил, что каждый морфологический тип обладает уникальным набором электрофизиологических признаков. Некоторые морфологические типы отличались друг от друга по большинству электрофизиологических параметров (например, классические и гнездообразные корзинчатые клетки различались по 18 параметрам), тогда как другие были очень похожи (гнездообразные корзинчатые клетки и клетки Мартинотти отличались только по 1 параметру) (Таблица 6). 92 Таблица 5. Электрофизиологические свойства интернейронов различных морфологических типов КлК* Канд ГнК ДвБук Март ВертОр МалК Нейрогл N=59 N=13 N=41 N=21 N=14 N=13 N=14 N=19 Потенциал покоя (мВ) -70±7# -65±8 -67±9 -70±7 -68±9 -71±9 -68±8 -69±7 Входное сопротивление (МОм) 215±91 330±144 437±178 665±430 430±207 483±189 458±220 363±150 Постоянная мембраны (мс) 10.9±3.9 10.1±2.3 18.4±5.3 16.5±6.8 15.8±4.9 15.7±5.1 15±4.5 12.5±4.4 Реобаза (пА) 59±34 40±27 23±15 23±19 24±9 25±18 18±13 36±30 Спад потенциала при гиперполяризации (баллов) 0.3±0.5 0.7±0.6 0.6±0.7 0.8±0.7 1±0.7 0.8±0.7 1.1±0.9 0.1±0.4 Горб при деполяризации (баллов) 0.6±0.6 0.4±0.8 0.7±0.7 0.9±0.8 1.1±0.9 0.9±0.9 1.2±0.7 0.2±0.4 Возвратная следовая деполяризация (баллов) 0.2±0.5 0.5±0.5 0.7±0.8 0.8±0.7 1±0.7 0.5±0.7 1.5±0.8 0±0 Суммарный показатель (баллов)** 1.1±1.1 1.5±1.5 2±2 2.4±1.8 3.1±1.7 2.3±1.8 3.8±1.9 0.3±0.5 Латентный период первого потенциала действия (мс) 118±114 145±174 100±98 68±77 53±27 77±57 64±68 69±39 Порог потенциала действия (мВ) -39±5 -43±5 -43±5 -46±4 -44±6 -46±5 -47±3 -40±5 Амплитуда потенциала действия (мВ) 52±12 52±12 63±13 59±12 58±11 68±17 66±9 55±10 Длительность потенциала действия (мс) 0.38±0.11 0.32±0.06 0.68±0.12 0.74±0.19 0.68±0.17 0.53±0.12 0.52±0.09 0.62±0.13 Амплитуда быстрой следовой гиперполяризации (мВ) 21.8±4.4 18.1±3.4 Показатель 17.9±4.2 14.4±6.3 13.1±5.7 14±4.4 13.7±5 12±3.6 93 КлК* Канд ГнК ДвБук Март ВертОр МалК Нейрогл N=59 N=13 N=41 N=21 N=14 N=13 N=14 N=19 1.3±1.6 1.1±1.8 2.6±2.8 2.2±1.7 1.9±1.4 1.5±1.5 3.1±2.9 7.3±3.7 2.9±2.8 2.9±3.5 7.8±8.4 6±4.4 9.8±9.7 4.7±5 6.8±5.9 13.5±4.7 52±18 86±29 30±13 43±13 34±11 44±11 39±14 22±6 Коэффициент вариации межспайковых интервалов (%) 4±2.2 4.6±2.1 8.3±6.2 13.8±21 6±2 7.1±3.7 6.7±2.3 5.3±2 Начальная частотная адаптация (%) 1.9±9.9 5.6±14 11.5±12.8 7.2±11.3 4.8±21.2 -0.9±24.1 -3.5±18.2 28±11.9 Полная частотная адаптация (%) 17±20 11±20 34±19 25±22 36±19 18±28 25±19 48±14 Изменение амплитуды потенциала действия (%) -0.5±3.8 -2.5±6.2 -7.3±8.8 -9.8±5.1 -11.4±8.9 -9.1±5.5 -11±7.4 1.2±2.4 Изменение амплитуды следовой гиперполяризации (%) 3.9±13.2 5.6±22.9 30.4±42.5 27.6±27.1 21.1±40.3 8.7±21.9 Показатель Амплитуда промежуточной следовой гиперполяризации (мВ) Период достижения максимальной следовой гиперполяризации (мс) Стабильная частота разрядов (Гц) 14.3±22.2 62.9±41.9 Условные обозначения: * Типы клеток: КлК – классические корзинчатые, Канд – клетки-канделябры, ГнК – гнездообразные корзинчатые клетки, ДвБук – нейроны с двойным букетом, Март – клетки Мартинотти, ВертОр – вертикальноориентированные корзинчатые клетки, МалК – малые корзинчатые, Нейрогл – нейроглиаформные клетки. ** Суммарный показатель рассчитывался по сумме баллов спада потенциала при гиперполяризации, горба мембранного потенциала при деполяризации и возвратной следовой деполяризации. # Среднее ± стандартное отклонение 94 Таблица 6. Результаты теста Фишера парных сравнений электрофизиологических свойств интернейронов различных морфологических типов КлК* Канд ГнК Март ДвБук ВертОр МалК Нейрогл N=59 N=13 N=41 N=14 N=21 N=13 N=14 N=19 КлК Канд 6** ГнК 18 11 Март 14 9 1 ДвБук 15 8 3 2 ВертОр 10 5 6 5 5 МалК 13 11 8 2 6 3 Нейрогл 11 10 13 9 17 14 14 Условные обозначения: * Обозначения приведены в Таблице 5. ** Количество электрофизиологических свойств (n из 19), по которым данные морфологические типы статистически значимо различаются. 4.2.1. Ответы интернейронов на действие подпороговых токов Разные по морфологии нейроны по-разному отвечают на гиперполяризующий и подпороговый деполяризующий токи (Рис. 28). Входное сопротивление мембраны, определенное на основе изменений мембранного потенциала в ответ на приложение гиперполяризующего тока, отличается у разных типов. Большие (классические) корзинчатые клетки и клетки-канделябры имеют низкое входное сопротивление (215 ± 91 и 330 ± 144 МОм соответственно), тогда как клетки с двойным букетом наиболее высокое 95 (665 ± 430 МОм). Остальные морфологические типы показывают промежуточные значения входного сопротивления мембраны. Наиболее быстрая постоянная времени мембраны зарегистрирована у классических корзинчатых клеток (10.9 ± 3.9 мс), клеток-канделябров (10.1 ± 2.3 мс) и нейроглиаформных клеток (12.5 ± 4.4 мс), тогда как у других морфологических типов нейронов она составляет от 15 до 18.5 мс. У некоторых интернейронов в течение действия ступеньки гиперполяризующего тока отмечается спад мембранного потенциала, сдвигающий его к потенциалу покоя (sag) (Рис. 28С и D). Обычно это явление наблюдается, когда начальное отклонение мембранного потенциала в ответ на действие гиперполяризующего тока превышает 15-20 мВ. Наиболее вероятно, что этот спад определяется активацией Ih тока через HCN каналы (Hyperpolarization-activated and Cyclic Nucleotide-gated channels) [269-271]. Рис. 28. Типичные примеры подпороговых ответов интернейронов. (A) Пример рамповой деполяризации у клетки-канделябра (B) Подпороговые ответы нейроглиаформного интернейрона. (C и D) Подпороговые ответы гнездообразной корзинчатой клетки (C) имеют меньшие амплитуды горба (стрелка), спада потенциала при гиперполяризации (треугольник) и возвратной деполяризации (звездочка), чем у малой корзинчатой клетки (D). 96 У большинства интернейронов с сильным спадом мембранного потенциала при снятии гиперполяризующего тока возникает кратковременная возвратная следовая деполяризация (Рис. 28С и D), которая в некоторых случаях вызывает один или несколько спайков. Эта деполяризация может быть обусловлена продолжающейся активацией HCN каналов [271, 317]. В соответствии с этим была обнаружена значимая корреляция (r = 0.76, p <0.01) между величиной возвратной следовой деполяризации и спадом потенциала при гиперполяризации. Дополнительным источником возвратной следовой деполяризации может служить активация низкопороговых потенциалзависимых кальциевых каналов T-типа [318, 319]. В ответ на действие подпорогового деполяризующего тока у нескольких интернейронов, среди которых были клетки-канделябры (n = 4), гнездообразные корзинчатые клетки (n = 2), клетка Мартинотти (n = 1) и клетка с двойным букетом (n = 1), наблюдалось постепенное нарастание деполяризации мембраны (depolarizing ramp) (Рис. 28А). Такая нарастающая деполяризация может быть связана с медленной инактивацией выходящего калиевого тока, например, A-тока, или медленной активацией входящего тока или двумя этими причинами. Однако чаще наблюдалась другая картина: многие интернейроны в начале ответа на деполяризующий ток давали максимально выраженную деполяризацию (деполяризационный горб), затем величина деполяризации мембраны уменьшалась. Данное явление определяется инактивацией HCN каналов, о чем свидетельствует корреляция между амплитудами спада потенциала при гиперполяризации и горба при деполяризации мембраны (0.51) и с величиной возвратной следовой деполяризации (0.53). Рис. 29. Суммарная гистограмма амплитуд подпороговых ответов: Sag – спад мембранного потенциала, RD – возвратная следовая деполяризация, Hump - деполяризационный горб. Обозначения типов клеток как на Рис. 25. 97 Анализ подпороговых электрофизиологических свойств у разных морфологических типов интернейронов (Рис. 29) указывает на различия в экспрессии некоторых ионных каналов, определяющих эти свойства. Например, у нейроглиаформных клеток практически не выражены спад потенциала при гиперполяризации, горб при деполяризации мембраны и следовая возвратная деполяризация (Рис. 28В), что указывает на отсутствие или слабую выраженность HCN каналов у этого типа клеток. И, наоборот, практически у всех клеток Мартинотти, клеток с двойным букетом, малых и вертикальноориентированных корзинчатых клеток, а так же у многих гнездообразных корзинчатых клеток можно предполагать наличие HCN каналов, из-за выраженного спада потенциала и следовой возвратной деполяризации. Более того, часто отмечаемые потенциалы действия после снятия гиперполяризующего тока у клеток Мартинотти и малых корзинчатых клеток могут указывать на наличие низкопороговых потенциалзависимых кальциевых T-каналов, обеспечивающих возникновение низкопороговых спайков. 4.2.2. Параметры потенциала действия у разных морфологических типов интернейронов Среди параметров, описывающих потенциал действия интернейронов, длительность спайков является наиболее важной для определения типа. По результатам дисперсионного анализа было выделено 3 группы клеток с различной длительность потенциала действия. 1. Клетки с быстрыми спайками. Наиболее короткий спайк наблюдается у клетокканделябров (0.32 ± 0.06 мс) и больших корзинчатых клеток (0.38 ± 0.11 мс); это типичные значения длительности спайка для быстроразряжающихся (fast-spiking) интернейронов [247]. 2. Клетки со средней продолжительность спайков. Средний по длительности спайк зарегистрирован у вертикальноориентированных корзинчатых клеток (0.53 ± 0.12 мс) и малых корзинчатых клеток (0.52 ± 0.09 мс). 3. Клетки с продолжительными спайками. Длительность потенциалов действия у остальных четырех морфологических типов была существенно больше: у нейроглиаформных интернейронов – 0.62 ± 0.13 мс, у клеток Мартинотти – 0.68 ± 0.17 мс, у гнездообразных корзинчатых клеток – 0.68 ± 0.12 мс и у клеток с двойным букетом – 0.74 ± 0.19 мс. 98 Длительность спайка определяется многими факторами, в том числе типом калиевых каналов, отвечающих за фазу реполяризации. Например, наиболее короткие спайки обеспечиваются калиевыми каналами из Kv3 семейства [320, 321]. Наличие различных каналов, отличающихся по своим биофизическим свойствам, существенно влияет на форму потенциала действия. Однако быстрая кинетика спайков затрудняет непосредственное сравнение их формы, поэтому используют специальный метод анализа формы потенциалов действия на основе фазовых диаграмм (dV/dt(V)). На фазовой диаграмме видно, как изменяется суммарный ток через мембрану нейрона при разных потенциалах на мембране в течение спайка [322]. На такой диаграмме потенциал действия представляет собой петлю. У интернейронов можно выделить три разных формы петли (Рис. 30). Рис. 30. Продолжительность и форма потенциала действия у интернейронов разных морфологических типов. (A) Форма потенциала действия и его производной у классической (LAC) и гнездообразной (CAC) корзинчатых клеток. (B) Примеры потенциалов действия у интернейронов разных типов, представленные в форме фазовых диаграмм. Обозначения типов клеток как на Рис. 25. 99 Спайки классических корзинчатых клеток и клеток-канделябров на фазовой диаграмме напоминают по форме кресло-качалку. У этих типов нейронов входящий ионный ток через мембрану нарастает от порога потенциала действия вплоть до позитивных значений мембранного потенциала, только непосредственно перед пиком потенциала действия ионный ток резко уменьшается. Такое позднее и относительно резкое изменение свидетельствует о том, что потенциалзависимые калиевые каналы, экспрессируемые в этих интернейронах, имеют высокий порог активации, близкий к 0 мВ мембранного потенциала. Такие характеристики активации типичны для каналов Kv3 семейства [321, 323]. Во время реполяризации выходящий ионный ток быстро нарастает, достигая максимальных значений при потенциале мембраны около -10...-20 мВ, а затем линейно уменьшается по мере реполяризации мембраны. Следует отметить, что максимальные величины выходящего тока почти сопоставимы с величинами входящего тока, а это означает, что фаза реполяризации занимает по длительности примерно такое же время, что и фаза деполяризации, обеспечивая короткую длительность всего спайка. Быстрая реполяризация идет до потенциала существенно более негативного, чем порог возникновения спайка, обеспечивая большую амплитуду быстрого компонента следовой гиперполяризации. Форма потенциала действия у малых и вертикальноориентированных корзинчатых клеток на фазовых диаграммах напоминает улитку. Начальная часть деполяризационной петли у этих клеток в целом похожа на описанную для классических корзинчатых клеток и клеток-канделябров. Здесь также наблюдается нарастание входящего тока вплоть до позитивных значений мембранного потенциала, однако в дальнейшем динамика ионных токов отличается. Во-первых, входящий ток затухает медленнее, а, следовательно, нейроны этих типов находятся при позитивных значениях мембранного потенциала дольше. Во-вторых, выходящий ток достигает своих максимальных, но относительно небольших значений по сравнению с входящим током еще при положительных потенциалах близких к пику потенциала действия. Такая динамика токов может свидетельствовать об асинхронном подключении калиевых каналов. Из-за того, что выходящий ток существенно меньше по величине входящего, фаза реполяризации длится намного дольше, чем фаза деполяризации. Вероятно, что именно удлиненная фаза реполяризации и определяет большую длительность потенциала действия у этих интернейронов по сравнению с классическими корзинчатыми клетками и клетками-канделябрами. 100 Наиболее симметричный тип петли, по форме напоминающей вертикально ориентированное яйцо, был найден у интернейронов оставшихся четырех морфологических типов (гнездообразных корзинчатых клеток, клеток Мартинотти, клеток с двойным букетом и нейроглиаформных нейронов). Максимальный входящий ток достигался у этих интернейронов еще при негативных значениях мембранного потенциала и был обычно меньше по величине, чем у предыдущих типов, что свидетельствует о наличии калиевых каналов с порогом активации более низким, чем у Kv3 семейства. Так как максимальные величины dV/dt были гораздо меньше, чем у описанных выше типов интернейронов, то длительность фазы деполяризации была у этих интернейронов длиннее. Максимальный выходящий ток был примерно в 2 раза меньше по амплитуде, чем входящий и достигался при мембранном потенциале -10 ... -20 мВ. У классических корзинчатых клеток и клеток-канделябров сразу за спайками наблюдается большая по амплитуде (~20 мВ) и быстрая по динамике (~3 мс) следовая гиперполяризация (Рис. 31). Рис. 31. Форма следовой гиперполяризации у интернейронов разных морфологических типов. (A) Основные варианты следовой гиперполяризации (пояснения в тексте). (B) Диаграмма, иллюстрирующая соотношение амплитуд быстрой и промежуточной следовой гиперполяризации. (С) Диаграмма, показывающая длительность следовой гиперполяризации. Обозначения типов клеток как на Рис. 25. 101 Следовой деполяризации и промежуточного компонента следовой гиперполяризации у этих клеток не отмечается, в отличие от пирамидных клеток (Рис. 12). Такая форма следовых потенциалов типична для быстроразряжающихся интернейронов [244]. Быстрые следовые гиперполяризационные следовые потенциалы так же указывают на наличие калиевых каналов Kv3 семейства, для которых характерна очень быстрая инактивация [324]. У вертикальноориентированных корзинчатых клеток следовые потенциалы такие же по форме, как у классических корзинчатых клеток и клеток-канделябров, однако больше по длительности (~5 мс). У оставшихся 5 морфологических типов клеток следовые гиперполяризационные потенциалы имеют 2 компонента, что указывает на вклад как минимум двух типов калиевых каналов, имеющих различную кинетику. Суммарная амплитуда следовой гиперполяризации у этих интернейронов варьируется от 15 до 20 мВ. У четырех морфологических типов (малых и гнездообразных корзинчатых клеток, клеток Мартинотти, клеток с двойным букетом) промежуточный компонент следовой гиперполяризации составляет лишь небольшую часть (~15%) от общей следовой гиперполяризации, тогда как у нейроглиаформных интернейронов промежуточный компонент следовой гиперполяризации выражен гораздо больше и составляет около 40%. Кроме этого длительность следовой гиперполяризации у нейроглиаформных клеток гораздо больше, чем у всех остальных типов интернейронов (13.5 ± 4.7 мс). 4.2.3. Характеристики пачечных спайковых ответов интернейронов Паттерн пачечного спайкового ответа каждого интернейрона на деполяризующий ток длительностью 0.5 с был количественно оценен по величине начальной и полной частотной адаптации. Согласно двум этим характеристикам можно выделить 3 основных паттерна пачечных спайковых ответов с различной частотной адаптацией (Рис. 32). 1. Спайковый ответ без частотной адаптации. Некоторые интернейроны практически не изменяют частоту своих разрядов во время действия деполяризующего тока, максимальные изменения в частоте спайков не превышают 25%. Такой паттерн ответа характерен для классических корзинчатых клеток и клеток-канделябров. 2. Спайковый ответ с медленной частотной адаптацией. Частота спайков постепенно понижается в течение действия деполяризующего тока. Величина адаптации у таких нейронов практически не зависит от силы деполяризации. Этот паттерн ответа характерен для клеток Мартинотти, клеток с двойным букетом, малых, гнездообразных и 102 вертикальноориентированных корзинчатых клеток. У некоторых малых и вертикальноориентированных корзинчатых клеток наблюдается вариация данного паттерна: после первого потенциала действия следует увеличенный следовой гиперполяризационный потенциал и, как следствие этого, первый межспайковый интервал длиннее второго. После этого наблюдается равномерная частотная адаптация. 3. Спайковый ответ с быстрой частотной адаптацией. Данный тип паттерна выявлен только у нейроглиаформных нейронов. Частотная адаптация этих клеток сильно зависит от силы деполяризующего тока. При околопороговой деполяризации наблюдается паттерн без частотной адаптации. При увеличении деполяризации частотная адаптация возрастет. Рис. 32. Основные типы паттернов спайковых ответов: без адаптации (1 колонка, клетка канделябр), с медленной адаптацией (2 и 3 колонки, вертикальноориентированная и гнездообразная корзинчатые клетки) и с быстрой частотной адаптацией (4 колонка, нейроглиаформная клетка). (A) Наложение первого (серый) и последнего (черный) потенциалов действия из пачки разрядов. (В) Примеры ответов нейронов на деполяризующие токи, равные одной и двум реобазам. (C) Частотная адаптации при разных значениях деполяризующего тока (шаг - 10 пА). Обозначения типов клеток как на Рис. 25. 103 Изменения величины частотной адаптации при спайковом ответе с быстрой частотной адаптацией сопровождается существенным уменьшением амплитуды промежуточного компонента следовой гиперполяризации после первого спайка (Рис. 33). Рис. 33. Форма следовой гиперполяризации у нейроглиаформной клетки при разных значениях надпорогового деполяризующего тока. Стрелкой отмечена следовая деполяризация. Светлосерая линия указывает порог возникновения потенциала действия (APT), серая и черная – амплитуды быстрой (AHPF) и промежуточной (AHPM) следовой гиперполяризации. Пояснения в тексте. Более того, при увеличении силы деполяризующего тока появляется следовая деполяризация, смещающая потенциал на мембране к порогу возникновения потенциала действия и ведущая к ранней инициации второго потенциала действия, полностью маскирующего промежуточный компонент следовой гиперполяризации. Одним из объяснений данного явления может быть достаточно медленная кинетика активации каналов, обеспечивающих промежуточный компонент следовой гиперполяризации. В случаях, когда подается небольшой деполяризующий ток, требуется достаточно большое время для достижения порогового потенциала, необходимого для генерации спайков (69 ± 39 мс), тогда как при подаче большого деполяризующего тока клетка достигает порога за 10 мс и меньше. В отличие от медленной частотной адаптации в течение всей пачки разрядов, описанной выше, у нейроглиаформных клеток изменения по частоте спайков происходили только в пределах первых 3-5 спайков, после этого частота оставалась практически неизменной. Таким образом, нейроглиаформные нейроны макаки показывают только начальную частотную адаптацию и напоминают клетки с начальной частотной адаптацией (iAD), описанные в коре мыши [325] 104 Стабильная частота разрядов нейрона, измеренная в конце пачки потенциалов действия при деполяризующем токе равном двум реобазам, так же различается у интернейронов разных морфологических типов. У классических корзинчатых клеток и клеток-канделябров выявлена максимальная частота разрядов (52 ± 18 Гц и 86 ± 29 Гц соответственно), тогда как у нейроглиаформных клеток – минимальная частота (22 ± 6 Гц). У других типов интернейронов стабильная частота разрядов находится в диапазоне 30-45 Гц. Чтобы охарактеризовать регулярность паттерна разряда был рассчитан коэффициент вариации межспайковых интервалов kISIs, этот показатель измерялся в течение последних 250 мс действия деполяризующего тока силой в 2 реобазы. У большинства интернейронов (166 из 189) kISIs был меньше 10%, что свидетельствует о высокой степени регулярности спайков. Только у 4 клеток в изученной выборке kISIs был больше 20%, что позволяет отнести эти клетки к иррегулярноразряжающимся. Эти нейроны были морфологически неоднородны: 2 клетки с двойным букетом, одна клетка Мартинотти и одна гнездообразная корзинчатая клетка. Среди всех морфологических типов у классических корзинчатых клеток и клеток-канделябров отмечается наименьший kISIs (4.0 ± 2.2% и 4.6 ± 2.1%, соответственно), а наибольший коэффициент наблюдается у клеток с двойным букетом (13.8 ± 20.5%). Эти результаты хорошо соотносятся с данными, полученными на коре крысы, где наибольшая иррегулярность паттерна разрядов отмечена для вертикальноориентированных клеток [187]. Не только частота спайков изменяется в течение пачечного ответа нейрона на деполяризующий ток, но и форма индивидуальных спайков подвержена существенным изменениям. Проводилась оценка изменений амплитуды потенциалов действия и следовой гиперполяризации между первым и последним спайком в пачке (см. Методы). Аккомодации размера спайков не происходит у классических корзинчатых клеток, клеток-канделябров и нейроглиаформных клеток, тогда как у всех остальных морфологических типов нейронов отмечено уменьшение амплитуды потенциалов действия на 6-12% (Рис. 32). Общая амплитуда следовой гиперполяризации практически не изменялась у интернейронов без частотной адаптации (классических корзинчатых клеток и клетокканделябров), однако нарастала на 10-30% у клеток с медленной частотной адаптацией, а и в наибольшей степени (65%) возрастала у нейроглиаформных клеток, показывающих паттерн с быстрой частотной адаптацией. Чтобы выявить какие еще характеристики спайков 105 изменяются в течение пачечного ответа, все потенциалы действия из пачки были нанесены на фазовую диаграмму (dV/dt(V)) (Рис. 34). Рис. 34. Форма спайков в ходе пачки разрядов у разных морфологических типов интернейронов. (A) Паттерны разрядов и их производные у клеткиканделябра и клетки с двойным букетом. (B) Фазовые диаграммы последовательных потенциалов действия в пачке у разных типов нейронов. Первый потенциал действия выделен красным, второй – зеленым. Обозначения типов клеток как на Рис. 25. Потенциалы действия у классических корзинчатых клеток и клеток-канделябров формируют набор практически идентичных петель, и первый потенциал действия в пачке неотличим от последующих. Это указывает на то, что все ионные каналы, обеспечивающие генерацию потенциала действия в нейроне, полностью восстанавливаются от одного 106 потенциала действия к следующему и никаких новых каналов не подключается в ходе пачечного ответа. У нейроглиаформных нейронов потенциалы действия практически идентичны по форме, но в отличие от классических корзинчатых клеток и клетокканделябров первый потенциал действия в пачке несколько сдвинут влево, то есть порог возникновения потенциала действия в ходе пачки повышается. Это может указывать на открытие дополнительных калиевых каналов, частично шунтирующих входящий ток , и, таким образом, смещающих порог возникновения потенциала действия. У остальных типов интернейронов наблюдается тенденция к последовательному уменьшению размера петель потенциала действия в ходе пачечного ответа, что указывает на уменьшение амплитуды входящих и выходящих токов, по всей вероятности связанное с частичной инактивацией ионных каналов. Во многих случаях это приводит к увеличению длительности спайка, что в свою очередь может существенно изменять свойства синаптической передачи. Так, удлинение спайка, вызванное инактивацией некоторых потенциалзависимых калиевых каналов, может приводить к увеличению количества ионов Ca2+, поступающих в пресинаптические терминали и увеличивать вероятность выброса медиатора [326]. 4.3. Иммуногистохимические характеристики интернейронов префронтальной коры макаки Кальцийсвязывающие белки и целый ряд нейропептидов избирательно экспрессируются в различных субпопуляциях интернейронов [187, 225, 327]. Однако нет полного соответствия между экспрессией этих маркеров, электрофизиологическими и морфологическими характеристиками интернейронов [191, 222, 235]. Один и тот же маркер может экспрессироваться в морфологически различных группах интернейронов (парвальбумин обнаружен у классических корзинчатых клеток и клеток-канделябров), а электрофизиологически различающиеся интернейроны могут экспрессировать один и тот же маркер. В данной работе интернейроны были протестированы на наличие трех кальцийсвязывающих белков [парвальбумина (PV), кальретинина (CR) и кальбиндина D28k (СВ)] и двух нейропептидов [соматостатина-14 (SST) и нейропептида Y (NPY)]. Каждый интернейрон, как правило, одновременно проверялся на наличие двух маркеров. 107 4.3.1. Распределение кальцийсвязывающих белков в разных слоях префронтальной коры Для подтверждения иммунофлуоресцентное дорсолатеральной специфичности окрашивание префронтальной антител было коры к сделано обезьян. кальцийсвязывающим белкам на срезах фиксированных Интернейроны, экспрессирующие парвальбумин, кальретинин и кальбиндин, встречались во всех слоях коры, однако их плотность в разных слоях различалась (Рис. 35). Рис. 35. Иммунофлуоресцентный анализ экспрессии кальцийсвязывающих белков в префронтальной коре макак. Микрофотографии срезов дорсолатеральной префронтальной коры макаки (поле 46) с указанием слоев (арабские цифры слева). Слева направо срезы с окраской по Нисслю, на парвальбумин (PV), кальретинин (CR) и кальбиндин (CB). Наибольшая плотность интернейронов, экспрессирующих кальбиндин была отмечена во 2 и 3 слоях коры, парвальбумин-положительных интернейронов в срединных слоях коры, а кальретинин-положительных - во 2 слое и глубоком 3-ем и 4-ом слоях. Полученные нами данные о распределении нейронов, содержащих разные кальцийсвязывающие белки, по слоям коры полностью согласуется с литературными данными о локализации различных кальцийсвязывающих белков в коре мозга обезьяны [225, 256], что свидетельствует о надежности используемого в работе иммунофлуоресцентного метода. 108 4.3.2. Распределение кальцийсвязывающих белков в разных морфологических типах интернейронов Сто шесть интернейронов с известной морфологией были проверены на наличие кальцийсвязывающих белков и нейропептидов (Таблица 7). Таблица 7. Экспрессия кальцийсвязывающих белков и нейропептидов в интернейронах различных морфологических типов Тип интернейронов PV CR CB SS NPY Клетки Мартинотти 0/1 n/a 3/4 4/5 n/a Клетки-канделябры 3/4 0/3 n/a n/a n/a Малые корзинчатые клетки 0/2 2/3 1/6 0/4 n/a Нейроглиаформные клетки 0/3 0/2 8/11 0/4 4/10 Вертикальноориентированные корзинчатые клетки 0/6 5/8 0/2 0/1 n/a Клетки с двойным букетом 0/12 10/12 1/6 0/5 n/a Большие корзинчатые клетки 14/24 0/9 1/8 0/8 0/2 Гнездообразные корзинчатые клетки 0/13 4/12 1/13 0/2 1/15 Из 65 интернейронов, протестированных на наличие парвальбумина, только 17 клеток были парвальбумин-позитивными (Рис. 36). Все эти интернейроны относились к двум морфологическим типам: большим корзинчатым клеткам и клеткам-канделябрам. Следует отметить, что парвальбумин был найден только примерно в половине (58%) протестированных больших корзинчатых клетках. Кальретинин был обнаружен в 18 из 52 протестированных интернейронов (Рис. 36). Кальретинин-позитивные интернейроны были представлены малыми и вертикальноориентированными корзинчатыми клетками, нейронами с двойным букетом. 109 Кальбиндин был обнаружен в 18 из 49 нейронов, относящихся в основном к клеткам Мартинотти и нейроглиаформным клеткам. Кроме того, кальбиндин был найден у небольшого процента малых, больших и гнездообразных корзинчатых клеток (Рис. 36, Рис. 38, Рис. 37). Рис. 36. Определение экспрессии кальцийсвязывающих белков и нейропептидов методом двойного (либо тройного) иммунофлуоресцентного анализа. В верхней строке приведены конфокальные реконструкции 4-х интернейронов (VOBC – вертикальноориентированный корзинчатый нейрон, MC – клетка Мартинотти, LAC – большой корзинчатый нейрон, NGF – нейроглиаформная клетка), заполненных биоцитином во время электрофизиологической записи, тела этих нейронов отмечены стрелками. По середине результаты иммунофлуоресцентного окрашивания тех же нейронов на ряд маркеров. В нижней строке объединенные реконструкции, демонстрирующие локализацию тестируемых маркеров в интернейронах. 110 Рис. 37. Морфологические примеры нейронов, экспрессирующие разные кальцийсвязывающие белки (PV – парвальбумин, CR – кальретинин, CB – кальбиндин). Соматостатин наиболее часто встречался в клетках Мартинотти (4 из 5) (Рис. 36), также была найдена 1 соматостатин-позитивная гнездообразная корзинчатая клетка (из 13 протестированных). Нейропептид Y был обнаружен в нейроглиаформных нейронах (4 из 10) (Рис. 36). 111 Ни в одном случае не было выявлено колокализации двух кальцийсвязывающих белков в одном интернейроне. В то же время колокализация нейропептидов и кальцийсвязывающих белков была обнаружена: нейроглиаформные клетки могли экспрессировать одновременно кальбиндин и нейропептид Y, а клетки Мартинотти – кальбиндин и соматостатин. Рис. 38. Микрофотография, показывающая экспрессию кальцийсвязывающего белка кальбиндина в нейроглиаформной клетке. 4.3.3. Электрофизиологические свойства интернейронов, экспрессирующих разные кальцийсвязывающие белки Дополнительно нами были исследованы электрофизиологические свойства интернейронов, экспрессирующих разные кальцийсвязывающие белки (Таблица 8). Входное сопротивление мембраны у парвальбумин- позитивных клеток было в 2 раза ниже, чем у кальретинин- и кальбиндин- позитивных интернейронов. Кроме того, постоянная времени мембраны и продолжительность потенциала действия были короче у парвальбуминпозитивных клеток, чем в двух других типов интернейронов. 112 Таблица 8 Электрофизиологические свойства интернейронов, экспрессирующих разные кальцийсвязывающие белки Электрофизиологические характеристики Группы интернейронов, содержащих кальретинин кальбиндин ANOVA Post-hoc тесты Входное сопротивление мембраны (МОм) 235 ± 68 (117)1 585 ± 137 (256) 582 ± 195 (232) p<0.001 (PV), (CR, CB)2 Постоянная времени мембраны (мс) 8.5 ± 1.9 (3.2) 15.8 ± 3.8 (7.2) 18.9 ± 4.0 (4.8) p<0.001 (PV), (CR, СB) Коэффициент адаптации 0.80 ± 0.11 (0.20) 0.64 ± 0.12 (0.16) 0.61 ± 0.17 (0.18) p=0.07 Порог потенциала действия (мВ) -42 ± 4 (7) -46 ± 4 (8) p=0.26 (PV, CB, CR) Длительность потенциала действия (мс) 0.35 ± 0.06 (0.10) 0.65 ± 0.08 (0.16) 0.68 ± 0.15 (0.17) p<0.001 (PV), (CR, CB) Амплитуда потенциала действия (мВ) 50 ± 8 (13) 67 ± 8 (15) 62 ± 11 (14) p<0.01 21 ± 3 (5) 15 ± 2 (4) 19 ± 7 (9) p<0.05 Амплитуда следовой гиперполяризации (мВ) парвальбумин Статистический анализ -41 ± 5 (6) 1 среднее ± доверительный интервал (стандартное отклонение) 2 Группы интернейронов в скобках не отличаются значимо друг от друга согласно post-hoc тесту. (PV, CB), (CR, CB) (PV, CB), (CB, CR) (PV, CB), (CR, CB) 113 У большинства парвальбумин-позитивных клеток длительность потенциала действия была <0.45 мс (медианное значение 0.31 мс), что вдвое короче, чем у кальретинин- и кальбиндин-позитивных интернейронов. Средняя амплитуда потенциала действия была меньше у парвальбумин-положительных клеток, чем у кальретинин-положительных интернейронов. У кальбиндин-положительных клеток, амплитуда потенциала действия была промежуточной по значению и не отличалась статистически значимо от двух других групп. У большинства клеток, независимо от содержащихся в них кальцийсвязывающих белков, потенциалы действия завершались монофазной следовой гиперполяризацией, однако у нескольких кальретинин- и кальбиндин-положительных клеток следовая гиперполяризация была двухфазной. Амплитуда следовой гиперполяризации была в среднем выше у парвальбумин-позитивных клеток, чем у кальретинин-позитивных интернейронов. Паттерн пачечного разряда, вызванного сверхпороговыми токами, у парвальбумин-позитивных нейронов существенно отличался от паттернов двух других групп интернейронов практически полным отсутствием частотной адаптации. В целом, по своим электрофизиологическим характеристикам кальретинин- и кальбиндин-позитивные клетки были ближе друг к другу, чем к парвальбумин-позитивным клеткам. Для более точного выявления связей между электрофизиологическими свойствами и содержанием кальцийсвязывающих белков был проведен кластерный анализ (Рис. 39). Рис. 39. Дендрограмма, полученная в результате кластерного анализа. Интернейроны поделились на два класса: быстроразряжающиеся интернейроны без адаптации (большинство парвальбуминпозитивных клеток) (FSIs) и интернейроны с частотной адаптацией (кальретинин- и кальбиндинпозитивные нейроны) (RSNPs). 114 В данный анализ было включено 76 интернейронов. Для кластерного анализа использовались 7 электрофизиологических характеристик (Таблица 8). Все переменные были предварительно нормализованы, для кластеризации использовался алгоритм Уорда. Полученная в результате кластерного анализа дендрограмма (Рис. 39) свидетельствует о наличии как минимум 2 электрофизиологических групп интернейронов. В первую группу вошли 32, а во вторую - 44 клетки. У интернейронов первой группы (Таблица 9) были меньше входное сопротивление и постоянная времени мембраны, короче потенциалы действия с меньшей амплитудой, большая по амплитуде следовая гиперполяризация, чем у интернейронов из второй группы. Таблица 9 Свойства интернейронов из двух кластеров Электрофизиологические характеристики Кластер 1; n=32 Кластер 2; n=44 Входное сопротивление мембраны (МОм) 317± 46 (129)1 677±104 (343)*** Постоянная времени мембраны (мс) 9.5±1.1 (3.1) 17.6±2.6 (8.7)*** Порог потенциала действия (мВ) -43±2 (6) -43±2 (8) Амплитуда потенциала действия (мВ) 55±5 (13) 67±4 (13)*** Длительность потенциала действия (мс) 0.39±0.03 (0.10) 0.69±0.04 (0.14)*** Амплитуда следовой гиперполяризации (мВ) 20.8±1.6 (4.5) 17.4±2.0 (6.5)* Коэффициент адаптации 0.72±0.07 (0.20) 0.60±0.06 (0.18)** Кальцийсвязывающие белки 1 14 PV, 2 CR, 1 CB 13 CR, 6 CB среднее ± доверительный интервал (стандартное отклонение) *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001 Таким образом, по своим характеристикам первая группа соответствует ранее описанным быстроразряжающимся интернейронам без частотной адаптации, а вторая интернейронам с частотной адаптацией [191, 313]. Парвальбумин-позитивные интернейроны 115 попали только в первую группу, тогда как кальбиндин- и кальретинин-позитивные клетки вошли в основном во вторую. 4.4. Функциональная роль разных типов интернейронов префронтальной коры макаки В этом исследовании нами было выявлено 8 морфологических типов интернейронов префронтальной коры обезьян на основе 1) распределения аксонного дерева по слоям и колонкам коры и 2) особенностям паттернов аксонной арборизации, форме терминальных окончаний аксона и расположению пресинаптических бутонов. Все морфологические типы интернейронов охарактеризованы электрофизиологически и гистохимически, при этом электрофизиологические свойства большинства морфологических типов были описаны у приматов впервые, а для остальных типов получен ряд новых данных (Таблица 10). Эти морфологические типы встречаются в префронтальной коре макаки с разной вероятностью (Рис. 40), при этом соотношение разных типов интернейронов не совпадает с тем, что описано в соматосенсорной коре крыс [191]. Вертикальноориентирован корзинчатые клетки Гнездообразн 7% Большие корзинчатые клетки 30% корзинчатые клетки 21% Малые корзинчатые клетки 7% Клетки Мартинотти 7% Рис. 40. Клеткиканделябры 7% Нейроглиаформные клетки 10% Распространенность разных Клетки с двойным букетом 11% морфологических типов интернейронов в префронтальной коре макаки 116 Таблица 10 Основные характеристики интернейронов префронтальной коры обезьяны Морфологический тип Морфологические Молекулярный маркер Длительность особенности Частотная спайка адаптация парвальбумин Быстрый без адаптации Большие корзинчатые клетки прямой паттерн аксонной (n=59) арборизации Клетки-канделябры (n=13) аксонные картриджи парвальбумин Быстрый без адаптации Нейроглиаформные клетки (n=19) извилистая арборизация; кальбиндин (и Медленный с быстрой многочисленные радиально нейропептид Y) адаптацией расходящиеся дендриты Клетки Мартинотти (n=14) разветвленный аксонный соматостатин (и кластер в 1 слое коры кальбиндин) Гнездообразные корзинчатые извилистая арборизация; кальбиндин или клетки (n=41) немногочисленные, кальретинин в вертикально идущие дендриты некоторых клетках, Медленный с медленной адаптацией Медленный с медленной адаптацией другие маркеры (?) 117 Морфологический тип Морфологические Молекулярный маркер Длительность особенности Клетки с двойным букетом (n=21) тонкие, слабо ветвящиеся, кальретинин (или вертикально идущие аксонные кальбиндин в коллатерали некоторых клетках) Вертикальноориентированные толстые аксонных ствола, от кальретинин корзинчатые клетки (n=13) каждого из которых отходит Частотная спайка адаптация Медленный с медленной адаптацией Промежуточный с медленной адаптацией много коротких ветвящихся коллатералей Малые корзинчатые клетки (n=14) плотное и компактное кальретинин (или аксонное дерево, крупные кальбиндин в пресинаптические бутоны некоторых клетках) Промежуточный с медленной адаптацией 118 В префронтальной коре макаки выявлен существенно больший процент нейроглиаформных клеток и клеток-канделябров, тогда как клетки Мартинотти встречаются чаще в коре крысы. Различаются по количественному составу и колончатые интернейроны. Все эти факты указывают, что функциональная организация префронтальной коры макаки имеет свою специфику. Однако многие интернейроны коры макаки по большинству характеристик напоминают интернейроны, описанные у грызунов [187, 189-191], поэтому можно предположить, что их функциональная роль у разных видов животных может быть схожей. Корзинчатые клетки одни из самых распространенных интернейронов коры макаки, их высокая распространенность была выявлена и в коре грызунов [191]. Свое название эти клетки получили потому, что первоначально считалось, что их аксоны формируют перицеллюлярные сетевые сплетения – «корзинки» вокруг тел пирамидных клеток [328]. Однако эти сплетения образованы переплетениями окончаний аксонов многих клеток, и, если рассматривать аксоны индивидуальной корзинчатой клетки, то никаких специальных «корзинчатых» структур обнаружить не удается, поэтому некоторые авторы стараются не использовать это название [220, 329]. Тем не менее большинство синаптических контактов корзинчатых клеток расположено именно на теле и проксимальных дендритах пирамидных клеток, таким образом, корзинчатые интернейроны обеспечивают перисоматическое торможение. Корзинчатые клетки коры макаки – сборная группа клеток, в ее состав входят несколько различающихся по физиологии, морфологии и биохимическим маркерам популяций клеток. выделены 4 группы корзинчатых клеток (большие, малые, Нами были гнездообразные и вертикальноориентированные). Большие корзинчатые клетки описаны у многих видов, они содержат парвальбумин [327, 330, 331], по электрофизиологическим критериям это типичные быстроразряжающиеся интернейроны без частотной адаптации [190, 332]. Это крупные мультиполярные клетки, их дендриты практически лишены шипиков, обычно идут вертикально, проходят через все слои коры. Одна из наиболее постоянных характеристик – особенности ветвления аксона: ветви аксона практически не имеют изгибов, идут на большие расстояния (размах ветвления может превышать 1 мм), дочерние ветви формируются редко и отходят от материнских под большими (60-90 градусов) углами. Плотность пресинаптических бутонов на аксонах низкая, бутоны слабо выделяются на поверхности аксона. В результате, получается аксонное дерево с 119 довольно низкой плотностью коллатералей, с характерным угловатым типом ветвления. Как правило, аксоны избегают первого слоя и наибольшая плотность ветвления наблюдается в том же слое, где залегает тело клетки [222]. Такие особенность ветвления аксонов позволяют предположить, что эти клетки являются основным источником латерального торможения в коре. Аксоны больших корзинчатых клеток наиболее часто оканчиваются вблизи тела пирамидных клеток. Согласно результатам многих работ вероятность нахождения синаптической связи между корзинчатым нейроном и соседней пирамидной клеткой составляет 40-70% [333-335], а в соматосенсорной коре мыши даже достигает 100 % [336]. Корзинчатые клетки образуют химические синапсы с другими интернейронами, в первую очередь с интернейронами своего класса [335, 337, 338]. Интересно, что парвальбуминположительные корзинчатые интернейроны часто формируют электрические синапсы друг с другом, что позволяет им синхронизировать свою активность [339]. Корзинчатые интернейроны получают возбуждающие входы от соседних пирамидных клеток. Вероятность нахождения возбуждающей синаптической связи довольно высока, хотя в разных работах даже в одной и той же первичной зрительной коре крысы были получены различные данные от 19% [340] до 60% [333] и до 88% в зрительной коре мыши [341]. ВПСП, записанные с корзинчатых интернейронов характеризуются очень быстрой кинетикой, что может быть обусловлено высоким содержанием кальций-проницаемых AMPA рецепторов на их постсинаптической мембране [342-344]. Благодаря быстрой кинетике постсинаптических ответов и тесным синаптическим связям между пирамидными клетками и корзинчатыми интернейронами, последние идеально подходят для регуляции ритмической активности в корковых сетях [333, 345]. Считается, что именно корзинчатые парвальбумин-положительные интернейроны ответственны за поддержание гамма-ритма (30-80 Гц) в коре [216, 346, 347], обеспечивающего синхронизацию активности и функциональное объединение пространственно удаленных популяций нейронов при осуществлении сознательной деятельности [346]. Возбуждение больших парвальбумин-положительных корзинчатых интернейронов также обеспечивается таламическими входами [344, 348-350]. Интересно, что при активации таламических входов корзинчатые интернейроны достигают порога генерация потенциалов действия раньше по времени и при меньшей силе стимуляции, чем соседние с ними 120 возбуждающие пирамидные и звездчатые клетки. Тем самым корзинчатые клетки обеспечивают упреждающее дисинаптическое торможение соседних с ними возбуждающих клеток [344, 350-353]. Упреждающее торможение лимитирует временной промежуток, в течение которого может происходить суммация возбуждающих таламических входов и генерация потенциала действия в звездчатых и пирамидных клетках, благодаря этому обеспечивается временная точность передачи сигналов от таламуса к коре [344, 352]. Функции гнездообразных и малых корзинчатых клеток менее изучены, у грызунов они часто являются холецистокинин-положительными [228], однако в данной работе содержание холецистокинина в этих интернейронах не проверялось. У гнездообразных корзинчатых интернейронов наблюдается характерный извилистый паттерн арборизации аксонов: аксоны ветвятся достаточно редко, формируя плавно изгибающиеся коллатерали с редкими бутонами. Большинство коллатералей аксонов остается в том же слое и колонке, что и тело нейрона, однако часть аксонных коллатералей может заходить в первый слой, не образуя там значительного кластера, либо следовать в глубокие слои. Аксоны малых корзинчатых нейронов не покидают колонку и слой, в котором расположено тело. Аксон очень сильно ветвится, его коллатерали образуют многочисленные изгибы, формируя довольно плотное и компактное аксонное дерево. На аксонах хорошо различимы крупные пресинаптические бутоны. Аксонные терминали обычно изогнутые, формируют своеобразный крючок вокруг тел нейронов (пирамидных клеток и интернейронов). Так же как и парвальбумин-положительные корзинчатые клетки малые и гнездообразные холецистокинин-положительные клетки образуют тесные синаптические связи с соседними пирамидными клетками и играют важную роль в поддержании ритмической активности, однако их вклад различается по ряду характеристик. Например, выявлено, что у анестезированных животных парвальбумин- и холецистокинин-положительные корзинчатые интернейроны гиппокампа активны в течение разных фаз тета-ритма [354]. В отличие от быстроразряжающихся парвальбумин-положительных клеток, холецистокинин-положительные клетки относятся к регулярноразряжающимся клеткам с частотной адаптацией [330]. Выброс медиатора у парвальбумин-положительных интернейронов обеспечивается активацией P/Q-типа потенциал-зависимых пресинаптических кальциевых каналов и происходит синхронно, тогда как у холецистокинин-положительных корзинчатых интернейронов вход кальция происходит через N-тип каналов, что ведет к 121 асинхронному выбросу медиатора [355-357], в результате этого холецистокинин- положительные нейроны не играют важной роли в упреждающем торможении. Согласно нашим оценкам, клетки-канделябры составляют около 7% от общего числа интернейронов коры макаки, в коре грызунов эти клетки встречаются гораздо реже и обычно находятся на границе первого и второго слоев [358, 359]. Эти небольшие парвальбуминположительные мультиполярные клетки напоминают театральную люстру с подсвечниками благодаря характерному ветвлению аксона, формирующему многочисленные, вертикально ориентированные, специализированные терминали - картриджи с рядом выраженных пресинаптических бутонов. Каждый картридж клеток-канделябров идет вдоль начального сегмента аксона пирамидных клеток и образует около десятка близко расположенных синаптических контактов, поэтому часто используется другое их название - аксо-аксональные интернейроны [360, 361]. Один интернейрон может контактировать с начальными сегментами аксонов нескольких сотен пирамидных клеток [362], при этом с каждой пирамидной клеткой, как правило, контактирует 4 клетки канделябра [363]. Так как синапсы клеток-канделябров расположены в непосредственной близости от места генерации потенциалов действия, то эти клетки считаются наиболее эффективными регуляторами спайковой активности пирамидных клеток. В настоящее время получен ряд данных, что клетки-канделябры могут не только эффективно затормаживать пирамидные клетки, но и вызывать генерацию потенциалов действия у неактивных пирамидных клеток при некоторых функциональных состояниях в нейронных сетях, что является уникальной чертой данного типа клеток [358, 359]. Это связано с тем, что в начальном сегменте аксона пирамидных клеток очень мало калий-хлорного котранспортера KCC2, что в ряде случаев ведет к локальному повышению концентрации Cl- ионов, в результате чего активация хлорных ГАМКА рецепторов вызывает деполяризацию мембраны, приводящую к генерации потенциалов действия [358]. Клетки Мартинотти встречаются во 2-3 слоях коры макаки существенно реже (7%), чем в тех же слоях коры крысы (15-20%) [191]. Эти соматостатин-положительные интернейроны обычно имеют мультиполярное или веретеновидное тело, сильно ветвящееся дендритное дерево, проходящее через несколько слоев, но не выходящее за пределы одной клеточной колонки. Характерной особенностью этого типа нейронов является восходящее аксонное дерево, которое создает широко расходящийся (до 1 мм в диаметре) аксонный кластер в 1 слое 122 коры, именно там клетки Мартинотти формируют многочисленные синаптические контакты с дистальными участками апикальных дендритов пирамидных клеток [190, 222, 233]. Было установлено, что клетка Мартинотти формирует тормозные контакты практически с каждой близкорасположенной пирамидной клеткой [364], в свою очередь получая от них возбуждающие входы. Возбуждающие входы к клеткам Мартинотти показывают сильно выраженную фасилитацию [251], а, следовательно, эти нейроны переходят в возбужденное состояние только при достаточно высокой частоте стимуляции [309]. Именно эта особенность клеток Мартинотти лежит в основе феномена частотно-зависимого дисинаптического торможения (frequency dependent disynaptic inhibition, FDDI): торможение возникает, а затем резко усиливается только при достижении определенной частоты стимуляции [365]. Тормозный эффект одиночной клетки Мартинотти слаб в силу дистального расположения синапсов, однако одновременное действие нескольких клеток Мартинотти оказывает весьма эффективное торможение. Совместная активация клеток Мартинотти достигается, если какаято субпопуляция пирамидных клеток начинает разряжаться синхронно. Клетки Мартинотти в этом случае обеспечивают возвратное торможение к этой субпопуляции пирамид, и одновременно приводят к латеральному торможению соседних субпопуляций пирамид [309]. Предполагается, что именно эти интернейроны способствуют наиболее эффективному восстановлению баланса между возбуждением и торможением в коре. С точки зрения теории передачи информации они также препятствуют избыточному усилению сигнала в коре [366]. В экспериментах in vivo было установлено, что клетки Мартинотти 2-3 слоев соматосенсорной коры мыши спонтанно активны в период спокойного бодрствования, однако в отличие от других типов нейронов гиперполяризуются при пассивном или активном использовании вибрисс [217]. Таким образом, при активной обработке сенсорной информации клетки Мартинотти выключаются, высвобождая дистальные участки апикальных дендритов от тормозного контроля. Вероятно, в этом случае усиливается интеграция всех возбуждающих импульсов на пирамидных клетках, в том числе идущих к дистальным частям их апикальных дендритов от моторной коры [217]. Нейроглиаформные клетки достаточно часто встречаются в коре макаки (10%), однако очень редки (1%) в коре грызунов [191]. Эти клетки имеют характерную морфологию и напоминают паука, сидящего в густой паутине, за что и были первоначально названы паутинными клетками [367]. Это небольшие мультиполярные нейроны с ровным шарообразным телом и многочисленными (обычно более 6 штук) радиально расходящимися 123 первичными дендритами. Тонкие, относительно короткие и мало ветвящиеся дендриты формируют почти правильную сферу небольшого размера. Аксон нейроглиаформной клетки многократно ветвится и формирует густую сеть из тонких сильно переплетенных веточек, которая занимает в несколько раз больший объем, чем дендритное дерево [26]. Важная особенность этих интернейронов - очень близкое расположением соседних пресинаптических окончаний вдоль аксона, кроме того тормозный медиатор ГАМК может выделяться этими клетками и вне пресинаптических терминалей [316, 368, 369]. Благодаря этому возбуждение нейроглиаформной клетки обеспечивает объемную нейротрансмиссию: активацию не только синаптических, но и экстрасинаптических ГАМКА рецепторов во всем занимаемом клеткой объеме [369], при этом вызванные ими ТПСТ характеризуются очень медленной кинетикой [370]. Еще одна особенность нейроглиаформных клеток – это их способность обеспечивать долговременное торможение пирамидных клеток посредством ГАМКВ рецепторов [316]. Кроме этого, нейроглиаформные клетки – единственный класс интернейронов, образующий электрические синапсы с интернейронами других классов [371], таким образом, нейроглиаформные клетки могут объединяться с разными интернейронными сетями и играть центральную роль в генерации и формировании синхронной активности в коре. Конкретная роль нейроглиаформных клеток в различных корковых процессах только сейчас начинает выясняться. Например, в соматосенсорной коре мыши активация нейроглиаформных клеток избирательно подавляет упреждающее дисинаптическое торможение звездчатых клеток, однако не оказывает воздействия на их моносинаптическое возбуждение таламическими входами [372]. Хорошо известно, что упреждающее торможение, вызванное парвальбуминположительными быстроразряжающимися клетками ограничивает временной промежуток, в который возможна интеграция приходящих возбуждающих постсинаптических потенциалов и генерация потенциала действия звездчатыми клетками. Активация нейроглиаформных клеток практически удваивает этот временной промежуток, увеличивая интегративные возможности звездчатых клеток, однако снижает временную точность при передаче сенсорной информации в коре [372]. Колончатые интернейроны с вертикально ориентированными аксонами, представлены в коре макаки двумя основными типами: клетками с двойным букетом и вертикальноориентированными корзинчатыми клетками. Интересно, что у грызунов наличие клеток с двойным букетом сейчас ставится под сомнение [308], возможно их аналогом в коре крыс являются биполярные клетки [234, 373]. Их толстые первичные дендриты обычно 124 выходят вертикально у каждого из полюсов и почти сразу разделяются на вторичные и третичные, формируя 2 пучка вертикально идущих дендритов. Аксоны также распространяются в основном вдоль колонки, часто поднимаются к 1 слою и спускаются до 56 слоев коры. У большинства видов колончатые интернейроны, как правило, содержат кальцийсвязывающий белок кальретинин, реже кальбиндин и не содержат парвальбумин. Эти интернейроны часто экспрессируют вазоактивный интестинальный полипептид (ВИП), реже холецистокинин и нейропептид Y [191, 345]. Эти интернейроны получают возбуждающие входы от соседних пирамидных клеток [246], а также прямые таламические входы [374]. На телах и дендритах этих клеток были найдены парвальбумин-позитивные синаптические бутоны, свидетельствующие, что они получают тормозные входы от корзинчатых интернейронов [375]. Важно отметить, что кальретинин-положительные (или ВИПпозитивные синаптические бутоны чаще всего находят на телах и дендритах интернейронов, особенно в поверхностных слоях коры [376-379]. Предполагается, что кальретининположительные интернейроны специализируются на растормаживании нейронных сетей, путем ингибирования тормозных интернейронов, в первую очередь соматостатин- положительных клеток Мартинотти [345]. Таким образом, описанные типы интернейронов коры макаки, специализированы на выполнении разных аспектов торможения в коре. Следует подчеркнуть, что найденное различие в процентном соотношении морфологических типов интернейронов в коре макаки и крысы может быть одним из важных факторов, определяющих различия в функциональных возможностях этих животных. Другим важным фактором, определяющим особенности функционирования коры приматов, могут быть различия в мембранных биофизических свойствах сходных типов интернейронов у крысы и обезьяны. Выяснению данного вопроса посвящена следующая глава. 125 Глава 5. СРАВНЕНИЕ СВОЙСТВ НЕЙРОГЛИАФОРМНЫХ И КОРЗИНЧАТЫХ ИНТЕРНЕЙРОНОВ ПРЕФРОНТАЛЬНОЙ КОРЫ КРЫСЫ И ОБЕЗЬЯНЫ В настоящее время считается общепринятым, что нейронные сети внутрикорковых модулей состоят из сходных структурных элементов и построены по единому принципу. Такая каноническая структура коркового модуля сохраняется у всех видов млекопитающих [22, 23]. Как следствие, полагают, что межвидовые различия в корковых функциях возникают в основном из-за различий в количестве этих модулей и особенностей их внешних связей. Однако, существуют данные, указывающие, что сами структурные компоненты корковых модулей могут отличаться у различных видов. Так, интернейроны в коре приматов составляют существенно большую долю нейронов (25-34%), чем у грызунов (11.5-25%) [226, 258, 301-307]. Кроме того, у грызунов и приматов пропорции интернейронов иммунореактивных для различных кальцийсвязывающих белков значительно отличаются. Парвальбумин-положительные интернейроны являются доминирующей субпопуляцией в префронтальной коре крыс [190, 303], в то время как в префронтальной коре обезьян преобладают кальретинин-положительные интернейроны [225, 258]. Интернейроны коры грызунов могут экспрессировать несколько кальцийсвязывающих белков, тогда как коэкспрессия нескольких кальцийсвязывающих белков нехарактерна для интернейронов коры обезьян [190, 225]. Более того, подтипы корковых интернейронов у грызунов и приматов отличаются по своему эмбриональному происхождению [24, 25]. У грызунов большинство ГАМКергических интернейронов неокортекса закладываются в подкорковых ганглиозных возвышениях конечного мозга [24, 380], тогда как у человека и других приматов предшественники ГАМКергических нейронов были найдены не только в подкорковых ганглиозных возвышениях, но и в корковой субвентрикулярной зоне [25, 381]. Морфологическое и функциональное разнообразие корковых интернейронов [23, 190, 191] делает прямое межвидовое сравнений свойств интернейронов нетривиальной задачей, так как сложно идентифицировать полностью гомологичные типы интернейронов у разных видов. В данном исследовании была поставлена задача провести межвидовое сравнение двух типов интернейронов: (1) нейроглиаформных клеток, и (2) парвальбумин-положительных быстроразряжающихся корзинчатых клеток [186, 225, 303]. Нейроглиаформные клетки обладают весьма характерными морфологическими особенностями и поэтому хорошо 126 отличимы от других типов интернейронов у многих видов млекопитающих [220, 313]. Парвальбумин-положительные быстроразряжающиеся корзинчатые клетки одни из самых распространенных интернейронов в коре млекопитающих. Они отличимы от других интернейронов по характерной совокупности признаков: наличию кальцийсвязывающего белка парвальбумина в цитоплазме, высокочастотному спайковому ответу без адаптации и морфологическим особенностям. Исследование было проведено на срезах коры мозга взрослых животных. Использовались самцы крыс линии Вистар в возрасте от 56 до 135 дней (масса тела 350-550 г) и самцы макаки (Macaca fascicularis) 4-5 лет (3.5-6.0 кг). 5.1. Характеристики нейроглиаформных нейронов префронтальной коры у обезьяны и крысы 5.1.1. Морфологические характеристики нейроглиаформных клеток у взрослых обезьян и крыс Нейроглиаформные клетки обезьяны (Рис. 41) и крысы (Рис. 42) были идентифицированы на основе ряда морфологических критериев, предложенных ранее [220, 313, 382]. Нейроглиаформные нейроны несколько напоминают паука, сидящего в густой паутине, за что и были первоначально названы паутинными клетками [383]. Рис. 41. Нейроглиаформная клетка префронтальной коры обезьяны. Дендриты показаны справа, аксоны слева. 127 Рис. 42. Примеры двух нейроглиаформных клеток прелимбической коры крысы. Дендриты показаны справа, аксоны слева. Нейроглиаформные нейроны крысы и обезьяны формируют большое количество первичных дендритов (обычно более 6). Дендриты этих клеток короткие, гладкие или с рядом регулярных утолщений, отходят радиально от небольшого округлого клеточного тела, формируют лишь несколько вторичных ветвей, образуя компактное сферической формы дендритное дерево. Аксоны нейроглиаформных клеток отходят либо от тела, либо от одного из первичных дендритов. Аксон каждой нейроглиаформной клетки сильно ветвится, его ветви многократно меняют направление, формируя густую сеть. Аксон занимает объем в несколько раз больший, чем дендриты, но он тоже в основном расположен в пределах того же слоя, где и тело клетки. Для количественной оценки морфологии нейроглиаформных клеток обезьяны и крысы были морфологически реконструированы 22 нейроглиаформных интернейрона обезьяны и 7 нейронов крысы. Размер тела нейроглиаформных нейронов обезьяны был на 40% больше, чем у крысы (Таблица 11); число первичных дендритов было на 43% больше у обезьян, чем у крыс, хотя общая длина дендритов не отличались между видами (Таблица 11). Дендриты нейроглиаформных клеток крысы, как правило, ветвились сильнее, чем у обезьяны; у половины нейроглиаформных клеток крысы наблюдались ветвления дендритов вплоть до шестого порядка, в то время как у большинства клеток обезьяны были ветвления только третьего или четвертого порядка (Рис. 43). 128 Таблица 11 Морфометрический анализ нейроглиаформных клеток обезьяны и крысы Обезьяна Крыса Параметр (n = 22) (n = 9) Площадь тела, мкм2* 92 ± 8# 66 ± 6 Число первичных дендритов* 10.0 ± 0.6 7.0 ± 0.4 Общая длина дендритов, мм 1.1 ± 0.2 1.4 ± 0.2 Горизонтальная протяженность дендритов, мкм 78 ± 8 107 ± 9 Вертикальный протяженность дендритов, мкм 172 ± 37 104 ± 10 23.0 ± 2.8 29.4 ± 3.3 Общая длина аксонов, мм (n = 9) (n = 7) Число ветвлений аксона* 180 ± 18 349 ± 60 Горизонтальная протяженность аксонов, мкм* 407 ± 21 540 ± 39 Вертикальная протяженность аксонов, мкм 486 ± 32 547 ± 46 * Достоверность различий между видами при p <0.05. # Среднее ± стандартная ошибка Морфологический анализ по методике Шолла [384] показал, что дендриты нейроглиаформных клеток обезьяны расположены более компактно, чем у крысы: с первым кругом Шолла (10 мкм) пересекается большее количество дендритных ветвей (Рис. 44). Аксоны нейроглиаформных клеток крысы ветвятся сильнее, чем у обезьяны, однако общая длина аксонов не различается у этих видов. Вблизи тела плотность аксонных ветвлений сходна у крысы и обезьяны, однако на большем расстоянии от тела (200-400 мкм) плотность аксонных ветвлений выше у крысы. В целом, аксоны и дендриты нейроглиаформных клеток обезьяны располагаются более компактно. У обоих видов общая протяженность аксонов 129 превышает длину дендритов примерно в 20 раз, а общая длина дендритов и аксонов сопоставима у обоих видов. Рис. 43. Диаграмма, показывающая процент нейронов, имеющих дендриты n-порядка у обезьяны (n = 22) и крысы (n = 9). Рис. 44. Анализ по Шоллу дендритных (слева) и аксонных (справа) деревьев нейроглиаформных клеток обезьяны (белые треугольники) и крысы (черные кружки) показывает среднее количество пересечений дендритов с условными сферами разного диаметра. * р <0.05. 130 5.1.2. Особенности мембранных ответов нейроглиаформных клеток коры обезьяны и крысы при действии подпороговых токов Мембранный потенциал покоя нейроглиаформных клеток крысы и обезьяны сходен (Таблица 12), однако многие другие мембранные характеристики различаются. Входное сопротивление мембраны выше у нейроглиаформных клеток обезьяны (Рис. 45). Рис. 45. Входное сопротивление мембраны нейроглиаформных нейронов коры обезьяны и крысы. Типичные примеры ответов нейронов обезьяны (слева) и крысы (в центре) на гиперполяризующий ток и вольтамперные характеристики этих нейронов (справа). Гиперполяризующий ток одинаковой силы вызывает большее отклонение мембранного потенциала у нейроглиаформных клеток крысы, чем обезьяны. Соответственно вольтамперная характеристика нейроглиаформных клеток обезьян показывает больший наклон, чем у крыс. При сильной гиперполяризации мембраны происходит выпрямление вольт-амперных характеристик у обоих видов. Кроме этого, у 56% нейроглиаформных нейронов обезьяны во время действия гиперполяризующего тока отмечается спад мембранного потенциала, сдвигающий его к потенциалу покоя, что нехарактерно для нейроглиаформных интернейронов крысы (Рис. 46). При действии подпорогового деполяризующего тока у большинства нейроглиаформных нейронов крысы наблюдается дополнительный медленный деполяризационный сдвиг мембранного потенциала (ramp) (Рис. 46). Этот деполяризационный сдвиг мембранного потенциала считается отличительной электрофизиологической чертой нейроглиаформных клеток крысы [313]. Этот медленный деполяризационный сдвиг потенциала полностью 131 отсутствовал у нейронов обезьяны, более того у небольшого числа клеток наблюдалось даже уменьшение величины деполяризации мембраны в ходе действия тока (Рис. 46). Таблица 12 Электрофизиологические свойства нейроглиаформных клеток коры обезьяны и крысы# Обезьяна, Крыса, n=30 n=19 Потенциал покоя, мВ –67 ± 5 –66 ± 4 Входное сопротивление мембраны, МОм 370 ± 200 238 ± 80** Постоянная времени мембраны, мс 11 ± 4 10 ± 4 Порог потенциала действия, мВ –41 ± 4 –35 ± 3*** Амплитуда потенциала действия, мВ 58 ± 9 60 ± 7 Длительность потенциала действия, мс 0.63 ± 0.12 0.67 ± 0.07 Время нарастания потенциала действия (10–90%), мс 0.28 ± 0.05 0.29 ± 0.04 Скорость нарастания потенциала действия, мВ/мс 184 ± 45 180 ± 25 Время спада потенциала действия (10–90%), мс 0.54 ± 0.09 0.57 ± 0.06 Скорость спада потенциала действия, мВ/мс 95 ± 25 93 ± 13 Латентный период первого потенциала действия, мс 59 ± 36 209 ± 122*** Амплитуда следовой гиперполяризации, мВ 19 ± 4 25 ± 4*** Электрофизиологические характеристики Адаптационный коэффициент Начальная частота при 2х реобазах, Гц Стабильная частота при 2х реобазах, Гц Число потенциалов действия при пороговом токе 0.47 ± 0.15 (n=21) 50 ± 28 (n=21) 24 ± 11 (n=21) 3.1 ± 1.5 0.69 ± 0.16*** 26 ± 11** 17 ± 4* 2.0 ± 1.0** # Среднее ± стандартное отклонение * Различия между видами достоверны при р <0.05;** р <0.01; *** р <0.001 132 Рис. 46. Типичные примеры ответов нейроглиаформных нейронов обезьяны (справа) и крысы (слева) на подпороговый деполяризующий ток. 5.1.3. Характеристики потенциала действия и паттерна разрядов у нейроглиаформных клеток обезьян и крыс Потенциалы действия нейроглиаформных клеток обезьяны и крысы похожи по многим параметрам: нами не найдено различий по амплитуде и длительности спайка, времени нарастания и спада потенциала действия (Таблица 12). Однако обнаружены различия в амплитуде следовых потенциалов, пороге и латентном периоде возникновения спайка. Следовая гиперполяризация у нейроглиаформных клеток крысы и обезьяны состоит из быстрого (fast AHP) и промежуточного (medium AHP) компонентов. Амплитуда быстрого компонента больше у крысы (17 ± 3 мВ), чем у обезьяны (12 ± 3 мВ, t-тест, p <0.05), тогда как амплитуда промежуточного компонента не различается (обезьяна: 7.4 ± 4.1 мВ; крыса: 7.6 ± 3.2 мВ; t-тест, p >0.1). Суммарная амплитуда следовой гиперполяризации больше у клеток крысы (Рис. 47). Порог возникновения потенциала действия в среднем на 6 мВ ниже у нейронов коры обезьяны (Рис. 48). Различия в пороге возникновения спайка могут быть связаны с различием во входном сопротивлении мембраны [385]. Полученные нами результаты указывают, что нейроглиаформные нейроны обезьяны обладают большей возбудимостью. 133 Рис. 47. (A) Форма потенциала действия у обезьяны (серая линия) и крысы (черная линия). (B) Быстрый (fast AHP) и промежуточный (medium AHP) компоненты следовой гиперполяризации у нейроглиаформных клеток. Рис. 48. Порог возникновения потенциала действия ниже у нейроглиаформных нейронов обезьяны (слева), чему у крысы (справа). (Потенциалы действия частично обрезаны). У всех нейроглиаформных нейронов коры крысы потенциал действия при пороговой стимуляции возникает с большим латентным периодом (209 ± 122 мс) (Рис. 49). Латентный период прогрессивно сокращается при увеличении силы деполяризующего тока. Такая характерная задержка с ответом при пороговой деполяризации послужила основой для выделения нейроглиаформных клеток грызунов в отдельный электрофизиологический класс поздноразряжающихся (late-spiking) нейронов [313, 386]. Нейроглиаформные клетки обезьяны при околопороговой стимуляции отвечают с коротким латентным периодом (59 ± 36 мс, t-тест, p <0.001) 134 Следует отметить еще одно отличие между видами: латентный период нейроглиаформных клеток крысы зависел от исходного мембранного потенциала, а у обезьян нет. Латентный период у нейронов крысы был дольше, если пороговый ток подавался при более низком исходном мембранном потенциале (-70 ... -80 мВ) и уменьшался при деполяризации мембраны (-60 мВ) (286 ± 139 и 194 ± 131 мс соответственно, р <0.05, n = 9). Аналогичные данные были получены ранее для нейроглиаформных клеток коры двухтрехнедельных крыс [313]. У нейроглиаформных клеток обезьяны латентный период при -80 мВ составлял 57 ± 23 мс, а при деполяризации мембраны был равен 72 ± 33 мс (t-тест, р >0.1, n = 5). А В Рис. 49. (А) Ответы на пороговую стимуляцию при разных значениях мембранного потенциала. (В) График, показывающий зависимость латентного периода возникновения потенциала действия от силы деполяризующего тока у нейроглиаформных клеток обезьяны (n = 17) и крысы (n = 19). Звездочками отмечены различия при р <0.05. При действии сверхпорогового деполяризующего тока у нейроглиаформных нейронов крысы и обезьяны наблюдалась ранняя частотная адаптация: первый межспайковый интервал был значительно короче последующих (Рис. 50). Кроме того, величина частотной адаптации увеличивалась при возрастании силы деполяризующего тока, соответственно отношение между первым и последним межспайковыми интервалами (AR) нарастало (Рис. 51). 135 Рис. 50. (А) Типичные примеры записей ответов нейроглиаформных нейронов обезьяны и крысы на деполяризующий ток в 2 и 3 раза больший порогового. (B) Графики, показывающие изменение частоты потенциалов действия в пачечных ответах, приведенных на (А). У обоих видов пачечный ответ характеризуется ранней частотной адаптацией (показано треугольниками). Рис. 51. График зависимости коэффициента адаптации (AR) от силы деполяризующего тока у обезьян (треугольники) и крыс (кружки). Хотя паттерн спайковых ответов у нейроглиаформных клеток крысы и обезьяны сходен, у клеток обезьяны частотная адаптация сильнее выражена, и, соответственно, коэффициент 136 адаптации (AR) был меньше при всех значениях силы стимуляции (Рис. 51). Кроме этого, у нейроглиаформных нейронов крысы после первого короткого межспайкового интервала потенциалы действия следовали с постоянной частотой, у обезьян же частота спайков снижалась. Так отношение второго межспайкового интервала к последнему при деполяризующем токе равному двум пороговым у крысы было близко к 1, тогда как у обезьяны было статистически значимо меньше (крыса: 0.92 ± 0.17, n = 19; обезьяна: 0.68 ± 0.18, n = 21, р <0.001). Для оценки возбудимости нейроглиаформных клеток коры крысы и обезьяны была измерена частота спайков в пачечных ответах. Так как частота спайков нейроглиаформных клеток уменьшается в ходе пачки, то сравнивались начальная и стабильная частоты при деполяризующем токе кратном двум реобазам. Оба показателя были выше у нейроглиаформных клеток обезьяны. Дополнительно были построены графики зависимости начальной и стабильной частоты спайков от величины деполяризующего тока (f = f(I)) (Рис. 52). Рис. 52. Графики зависимости частоты спайков в пачечном ответе от силы деполяризующего тока. Начальная частота (слева) и стабильная частота (справа) были больше у клеток обезьяны (треугольники), чем у крысы (кружки) при всех значениях деполяризующего тока. У обезьяны эти графики имели больший тангенс угла наклона, чем у крысы (для начальных частот: 1.30 ± 0.12 Гц/пА (n = 17) и 0.30 ± 0.03 Гц/пА (n = 19), p <0.001; для стабильных частот: 0.24 ± 0.16 Гц/пА и 0.10 ± 0.04 Гц/пА, соответственно, p <0.05). При пороговой силе стимуляции нейроглиаформные клетки обезьяны генерировали в среднем больше спайков (3.1 ± 1.5, n = 30), чем крысы (2.0 ± 1.0, n = 19, р <0.01). 137 Таким образом, нейроглиаформные клетки обезьяны обладают более высокой возбудимостью и генерируют большее количество спайков при широком диапазоне стимуляции, чем нейроглиаформные клетки крысы. 5.2. Характеристики быстроразряжающихся парвальбумин-положительных корзинчатых нейронов префронтальной коры у обезьяны и крысы Корзинчатые клетки были отобраны на основе морфологических [220, 313, 387] и электрофизиологических критериев [247, 313]. К корзинчатым нейронам относят крупные мультиполярные клетки, их дендриты практически лишены шипиков, обычно идут вертикально, проходят через все слои коры. Одна из наиболее постоянных характеристик – особенности ветвления аксона: ветви аксона обычно не имеют изгибов, идут на большие расстояния (размах ветвления может превышать 1 мм), дочерние ветви формируются редко и отходят от материнских под большими (60-90 градусов) углами. Плотность пресинаптических бутонов на аксонах низкая, бутоны слабо выделяются на поверхности аксона. В результате получается аксонное дерево с довольно низкой плотностью коллатералей, с характерным угловатым типом ветвления. Аксоны корзинчатых интернейронов избегают первого слоя и наибольшая плотность ветвления наблюдается в том же слое, где залегает тело клетки (Рис. 53). Рис. 53. Примеры реконструированных корзинчатых клеток из префронтальной коры обезьяны (слева) и крысы (справа). Дендриты показаны черным, аксоны - красным. Шкала = 100 мкм. Парвальбумин-положительные корзинчатые интернейроны относятся к быстроразряжающимся интернейронам с низкой частотной адаптацией. В исследуемую 138 выборку были включены только корзинчатые клетки с коротким потенциалом действия (<0.51 мс) и отношением между первым и последним межспайковыми интервалами близким к 1 (адаптационный коэффициент, AR >0.61). Данные критерии были выбраны на основе ранее проведенной классификации нейронов префронтальной коры обезьяны с помощью кластерного анализа [247]. Похожие критерии для выделения быстроразряжающихся интернейронов у крысы использовались другими исследователями [313, 388]. Часть корзинчатых клеток была проверена на содержание кальцийсвязывающих белков. В 14 из 21 (67%) корзинчатых интернейронов обезьяны и в 11 из 14 (78%) клеток крысы был обнаружен парвальбумин (Рис. 54). Ни в одном из протестированных быстроразряжающихся корзинчатых интернейронов обезьяны (n=9) не было обнаружено кальретинина или кальбиндина. Рис. 54. Пример парвальбумин-положительного корзинчатого нейрона из префронтальной коры крысы. Слева – визуализация интернейрона, заполненного биоцитином, по центру – визуализация парвальбумина, справа – совмещение микрофотографий. Отсутствие парвальбумина у части клеток может быть связано с тем, что во время электрофизиологического эксперимента концентрация парвальбумина, растворенного в цитоплазме, снижается из-за разбавления [389], что не позволяет его выявить с помощью иммуногистохимического метода. 5.2.1. Количественные морфологические характеристики корзинчатых нейронов у взрослых обезьян и крыс Корзинчатые клетки различаются по горизонтальной протяженности аксонов, поэтому их часто разделяют на несколько групп [220, 329]. Корзинчатые клетки с разной протяженностью аксонов иннервируют различное количество корковых колонок, и, соответственно, их функции в коре могут различаться. Поэтому нами было проведено 139 сравнение горизонтальных и вертикальных размеров корзинчатых клеток у обезьяны и крысы (Рис. 55). Различий в среднем размере аксонных деревьев между корзинчатыми клетками крысы и обезьяны обнаружено не было (Таблица 13). Распределения корзинчатых нейронов крысы и обезьяны по горизонтальным размерам аксонов также не различались (критерий Колмогорова-Смирнова, p >0.1, Рис. 55). Таблица 13 Морфометрический анализ корзинчатых интернейронов обезьяны и крысы# Обезьяна Крыса (n = 11) (n = 14) 92 ± 25 94 ± 19 Число первичных дендритов 6.8 ± 2.1 6.1 ± 1.8 Общая длина дендритов, мм 2.00 ± 0.97 2.27 ± 0.94 12 ± 5 14 ± 5 0.81 ± 0.39 0.75 ± 0.53 (n = 26) (n = 19) 0.58 ± 0.17 0.55 ± 0.09 (n = 26) (n = 19) 21.9 ± 4.0* 34.6 ± 5.2 (n = 4) (n = 3) 161 ± 36* 359 ± 83 (n = 4) (n = 3) Параметр Площадь тела, мкм2 Число точек ветвления дендритов Горизонтальная протяженность аксонов, мм Вертикальный протяженность аксонов, мм Общая длина аксонов, мм Число точек ветвления аксона # Среднее ± стандартное отклонение * Достоверность различий между видами при p <0.05. Дополнительный количественный морфологический анализ был проведен на полностью реконструированных клетках. По большинству параметров (размер тела, количество первичных дендритов, общая длина дендритов, порядок ветвления дендритов) различий между корзинчатыми клетками крысы и обезьяны не было выявлено (Таблица 13). 140 Рис. 55. Распределение горизонтальных размеров аксонных деревьев у корзинчатых нейронов обезьяны (черные столбцы) и крысы (серые столбцы). Морфологический анализ распределения дендритов по методике Шолла не выявил различий между корзинчатыми нейронами крысы и обезьяны (Рис. 56). Различия были найдены только в числе ветвлений аксонов и их общей длине, оба показателя были выше у интернейронов крысы. Рис. 56. Типичные примеры дендритных деревьев корзинчатых клеток у обезьяны (вверху) и крысы (внизу), шкала – 100 мкм. Слева диаграмма, иллюстрирующая пространственного расположения дендритных деревьев по методу Шолла (клетки обезьяны (п = 10) и крысы (п = 12)). 141 5.2.2. Характеристики мембранных ответов корзинчатых нейронов обезьяны и крысы на подпороговые токи Мембранный потенциал покоя корзинчатых нейронов крысы и обезьяны был одинаковым и составил -67 мВ, однако большинство других свойств мембранных ответов на подпороговые токи у этих двух видов различались (Таблица 14). Таблица 14 Электрофизиологические свойства быстроразряжающихся корзинчатых клеток коры обезьяны и крысы# Обезьяна Крыса (n=39) (n=31) -68 ± 8 -67 ± 6 Входное сопротивление мембраны, МОм 251 ± 130* 182 ± 83 Постоянная времени мембраны, мс 9.5 ± 2.8* 7.7 ± 3.8 Порог возникновения потенциала действия, мВ –41 ± 5*** –34 ± 3 Порог возникновения потенциала действия, пА 74 ± 50*** 132 ± 69 55 ± 11 52 ± 7 0.34 ± 0.06* 0.38 ± 0.08 Электрофизиологические свойства Потенциал покоя, мВ Амплитуда потенциала действия, мВ Длительность потенциала действия, мс Время нарастания потенциала действия (10–90%), мс 0.15 ± 0.03*** 0.21 ± 0.04 Время спада потенциала действия (10–90%), мс 0.23 ± 0.06 0.25 ± 0.03 Латентный период первого потенциала действия, мс 71 ± 69*** 220 ± 159 23 ± 8 24 ± 5 0.90 ± 0.13 0.85 ± 0.12 16 ± 5** 11 ± 5 5.1 ± 2.2*** 27 ± 26 Амплитуда следовых потенциалов, мВ Коэффициент адаптации Число спайков (20 пА выше порога) Коэффициент вариации межспайковых интервалов (20 пА выше порога) # * Среднее ± стандартное отклонение Различия между видами достоверны при р <0.05;** р <0.01; *** р <0.001 Входное сопротивление было достоверно выше у корзинчатых клеток обезьяны (251 ± 130 МОм), чем крысы (182 ± 83 МОм), что указывает на их большую возбудимость. Вольт142 амперные характеристики, построенные на основе подпороговых ответов на гиперполяризующий и деполяризующий ток, у нейронов обезьяны имели больший угол наклона, чем у крыс (Рис. 57). Постоянная времени мембраны была больше у корзинчатых нейронов обезьяны (9.5 ± 2.8 мс), чем крысы (7.7 ± 3.8 мс). Рис. 57. Типичные примеры записей ответов корзинчатых клеток обезьяны и крысы на гиперполяризующий и подпороговый деполяризующий ток. Справа вольт-амперные характеристики, построенные для этих ответов. Ранее в экспериментах in vivo было показано, что спонтанная синаптическая активность может изменять входное сопротивление мембраны клетки [390], и, следовательно, наблюдаемые различия между корзинчатыми клетками обезьяны и крысы могут быть связаны с потенциальной разницей в синаптической активности. Чтобы оценить влияние спонтанной синаптической активности на входное сопротивление мембраны в условиях переживающего среза мозга, были зарегистрированы ответы нейронов на подпороговые гиперполяризующие импульсы тока после полной фармакологической блокады синаптической передачи с помощью габазина (4.5-6 мкМ), CNQX (20 мкМ), и AP5 (50 мкМ). Блокада спонтанной синаптической активности не изменила входное сопротивление мембраны ни у корзинчатых нейронов крысы (р = 0.79, n = 8), ни обезьяны (р = 0.75, n = 4, tтест парных сравнений). Был сделан вывод, что различия во входном сопротивлении обусловлены биофизическими характеристиками мембран клеток и не связаны с шунтированием, вызванным активностью постсинаптических рецепторов. При увеличении гиперполяризующего тока корзинчатые клетки обезьяны и крысы показывали выпрямление вольт-амперных характеристик (Рис. 57). Кроме этого у некоторых 143 корзинчатых клеток обезьяны в ходе действия гиперполяризующего тока отмечался спад мембранного потенциала, сдвигающий его к потенциалу покоя (sag). Спад мембранного потенциала у корзинчатых клеток обезьяны в ходе ответа на гиперполяризующий ток -50 пА составил 19 ± 9% (n = 32). Рис. 58. Типичные примеры ответов корзинчатых нейронов обезьяны (слева) и крысы (справа) на гиперполяризующий ток (спад потенциала показан стрелками, возвратная деполяризация наконечниками стрелок). Внизу показан эффект действия ZD7288 (20 мкМ), который устраняет спад потенциала и возвратную деполяризацию у корзинчатых клеток обезьяны. У корзинчатых клеток крысы при той же силе гиперполяризующего тока и даже при увеличении до -100 пА (Рис. 58) спад мембранного потенциала практически не регистрировался. Спад мембранного потенциала в клетках обезьяны полностью предотвращался применением антагониста Ih-каналов, ZD7288 (20 мкМ) (Рис. 58) 5.2.3. Характеристики потенциала действия и паттерна разрядов корзинчатых клеток префронтальной коры обезьяны и крысы Многие характеристики потенциала действия, включая его амплитуду и форму следовой гиперполяризации, схожи у корзинчатых клеток крысы и обезьяны, однако по ряду других показателей выявлены межвидовые различия (Таблица 14). У корзинчатых клеток обезьяны 144 длительность потенциала действия была меньше (0.34 ± 0.06 мс), чем у крысы (0.38 ± 0.08 мс). Различия обусловлены более коротким временем восходящей фазы потенциала действия у обезьяны, тогда как длительность нисходящей фазы не отличается. При действии порогового деполяризующего тока корзинчатые клетки крысы генерируют спайк с большим латентным периодом (220 ± 159 мс), чем клетки обезьяны (71 ± 69 мс) (Рис. 59А). Порог возникновения потенциала действия был ниже у клеток обезьяны, чем крысы (Рис. 59B), что может быть связано с большим входным сопротивлением мембраны [385]. Эти различия также могут быть обусловлены наличием низкопороговых K+-каналов [391] у нейронов крысы. В пользу этого свидетельствует также различие в величине латентных периодов возникновения потенциалов действия при пороговой стимуляции: у нейронов крысы потенциал действия возникает с большим латентным периодом. Сохранятся ли межвидовые различия в величине порогов, если потенциалы действия будут вызваны с одинаково коротким латентным периодом? Чтобы ответить на этот вопрос, был измерен порог тех потенциалов действия, которые генерировались с латентным периодом ~8 мс, что примерно соответствует латентному периоду возникновения спайков в интернейронах в ответ на приходящее возбуждение [392, 393]. В этих условиях порог возникновения потенциала действия был ниже у клеток обезьяны, чем у крысы (Рис. 59C и D). Вклад низкопороговых K+-каналов был проверен фармакологически с использованием селективного Kv1 каналоблокатора, α-дендротоксина (150–200 нM). α-Дендротоксин уменьшал латентный период возникновения потенциала действия на 47% (137 ± 39 мс и 72 ± 20 мс, р <0.05, n = 5, t-тест парных сравнений) у крысы, но не оказывал воздействия на латентный период у клеток обезьяны. Кроме этого, блокада Kv1 каналов приводила к снижению порогов примерно на 6 мВ как у корзинчатых клеток крысы (-33.0 ± 1.6 мВ в контроле, -39.5 ± 1.2 мВ после применения блокатора, n = 5, р <0.01), так и клеток обезьяны (с -41.5 ± 2.5 мВ до -47 ± 2.5 мВ, n = 4, р <0.05) (Рис. 59Е). Полученные результаты показывают, что вклад Kv1 каналов является определяющим для возникновения запаздывающего потенциала действия у корзинчатых клеток крыс, однако не может объяснить различий между видами в величине порога. 145 Рис. 59. Характеристики потенциалов действия корзинчатых клеток обезьяны и крысы. (А) При пороговой стимуляции потенциал действия возникает с большой задержкой в клетках крысы. (B) Порог потенциала действия ниже у нейронов обезьяны. (C) Потенциалы действия, вызванные с задержкой в 8 мс, имеют более низкий порог у клеток обезьяны (п = 15), чем у крысы (п = 14). (D) Диаграмма, суммирующая результаты экспериментов по определению порогов генерации потенциалов действия. Планки погрешностей показывают стандартную ошибку измерения. (E) α-дендротоксин понижает пороги потенциалов действий как у корзинчатых клеток обезьяны (п = 4), так и крысы (п = 5). Корзинчатые интернейроны крысы и обезьяны при генерации потенциалов действия практически не выказывали частотной адаптации. При высокой силе стимуляции паттерны ответов у клеток крысы и обезьяны были очень похожи, однако при небольшой силе 146 надпорогового деполяризующего тока у корзинчатых клеток крыс чаще наблюдались периоды «молчания» (Рис. 60), в результате которых паттерн ответа был иррегулярным. Рис. 60. Примеры записей ответов корзинчатых нейронов обезьяны (слева) и крысы (справа) при разной силе деполяризующего тока. Степень иррегулярности была оценена с помощью коэффициента вариации межспайковых интервалов. Дисперсионный анализ показал, что коэффициент вариации был выше у клеток крысы (n = 23), чем у клеток обезьяны (n = 28) при силе надпорогового деполяризующего тока 0 - 60 пА (F = 32.5, р <0.001) (Рис. 61). Периоды «молчания» и иррегулярность паттерна ответов полностью устранялись блокадой Kv1 каналов с помощью αдендротоксина (Рис. 61). 147 Рис. 61. Диаграмма показывает величину коэффициента вариации межспайковых интервалов при разной силе надпорогового тока. Звездочками указаны различия между клетками крысы и обезьяны при р <0.05. Справа приведены записи ответов корзинчатого нейрона крысы до и после применения α-дендротоксина (150 - 200 нМ). Чтобы сравнить возбудимость клеток крысы и обезьяны, было подсчитано количество потенциалов действия в ответ на ступеньки надпорогового деполяризующего тока (0 - 100 пА выше порога). Было выявлено, что количество потенциалов действия выше у клеток обезьяны, чем у крысы во всем диапазоне применяемых токов (р <0.05, n = 20). 5.3. Функциональное значение межвидовых различий в морфологических и физиологических свойствах нейроглиаформных и корзинчатых клеток крысы и обезьяны Результаты проведенного межвидового сравнения показали, что между нейроглиаформными и быстроразряжающимися корзинчатыми интернейронами крысы и обезьяны есть ряд морфологических и электрофизиологических различий. Оба типа интернейронов крысы имели больше разветвлений аксонов и большую суммарную длину аксона, чем соответствующие типы обезьяны, однако большинство других морфологических показателей были сходны. Следует подчеркнуть, что густая сеть аксонов у нейроглиаформных клеток играет важную функциональную роль. Особенность этих интернейронов - очень близкое расположением пресинаптических окончаний вдоль аксона, а кроме того медиатор может 148 выделяться и вне пресинаптических терминалей [316, 368, 369]. Благодаря этому возбуждение нейроглиаформной клетки обеспечивает объемную нейротрансмиссию - активацию не только синаптических, но и экстрасинаптических ГАМКА рецепторов во всем занимаемом клеткой объеме [369], при этом вызванные ими ТПСТ характеризуются очень медленной кинетикой [370]. Еще одна важная особенность нейроглиаформных клеток – это их способность обеспечивать долговременное торможение пирамидных клеток посредством ГАМК В рецепторов [316]. Учитывая, что нейроглиаформные клетки у обезьян занимают меньший объем, чем у крысы, можно предполагать, что оказываемое ими действие в нейронной сети распространяется более локально. Среди электрофизиологических отличий выделяется большее входное сопротивление мембраны и меньший порог возникновения потенциала действия у клеток обезьяны, чем у крысы. При пороговой стимуляции потенциал действия у клеток обезьяны генерируется с существенно меньшим латентным периодом, при надпороговой стимуляции число спайков (и их частота) при сходной силе стимуляции больше, чем у клеток крысы. Эти показатели свидетельствуют о большей возбудимости корзинчатых и нейроглиаформных клеток обезьяны. Следует подчеркнуть, что у нейроглиаформных клеток крысы длительный латентный период возникновения спайка при пороговой деполяризации является настолько характерным признаком, что послужил основанием для выделения этих клеток в особый класс поздноразряжающихся клеток. У нейроглиаформных клеток обезьяны латентный период ответа гораздо короче и не отличается по длительности от ответов других типов нейронов. Задержанный спайковый ответ на синаптическую стимуляцию может играть определяющую роль в выполнении функций в нейронной сети. Нейроглиаформные клетки коры крысы при пороговой синаптической активации будут отвечать только при длительной активации, тогда как транзиентное возбуждение будет отфильтровываться. Для нейроглиаформных клеток обезьяны характерна быстрая частотная адаптация, поэтому эти нейроны, наоборот, будут генерировать спайки чаще в начале действия стимула. У быстроразряжающихся корзинчатых клеток крысы в ходе продолжающейся деполяризации мембраны спайковый ответ часто прерывается молчащими периодами, тогда как клетки обезьяны отвечают без перерывов. Иррегулярность спайкового ответа у крысы по всей вероятности связана с работой низкопороговых потенциалзависимых калиевых каналов 149 Kv1 типа, так как их блокада специфическим антагонистом дендротоксином приводила к исчезновению молчащих периодов. Так как спайковая активность нейрона возникает в ответ на приходящее синаптическое возбуждение, то наличие молчащих периодов может искажать передачу информацию в нейронных сетях. Выявленные электрофизиологические различия между гомологичными типами интернейронов позволяют лучше понять различия в функционировании префронтальной коры, обнаруженные в экспериментах in vivo при изучении оперативной памяти. Например, «клетки памяти» префронтальной коры, остающиеся активными в течение периода задержки в тестах на оперативную память, генерируют потенциалы действия с меньшей частотой у крысы, чем у обезьяны, это справедливо как для пирамидных клеток, так и для интернейронов [63, 68, 394]. Полученные результаты свидетельствуют, что даже морфологически схожие интернейроны, по крайней мере по ряду электрофизиологических свойств, различаются у разных видов, что указывает на необходимость более осторожной экстраполяции данных от грызунов к приматам, и, в конечном счете, к людям. 150 Глава 6. ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ВОЗБУЖДАЮЩИХ СИНАПТИЧЕСКИХ ВХОДОВ У РАЗЛИЧНЫХ НЕЙРОНОВ ПРЕФРОНТАЛЬНОЙ КОРЫ ОБЕЗЬЯНЫ И КРЫСЫ Нейроны префронтальной коры получают основные возбуждающие входы от пирамидных клеток, расположенных локально, либо в других корковых полях того же полушария, либо второго полушария, а также от таламуса [1]. Ранее, на примере соматосенсорной и зрительной коры, было показано, что свойства возбуждающих синаптических входов у интернейронов и пирамидных клеток существенно различаются, что приводит к различиям в порогах возбуждения интернейронов и пирамидных клеток. Так, в экспериментах in vivo, было обнаружено, что в ответ на приходящее возбуждение быстроразряжающиеся интернейроны отвечают с меньшим латентным периодом и при меньшей силе раздражителя, чем пирамидные клетки [395-397]. Такие особенности более раннего вовлечения интернейронов в спайковую активность обусловлены специфическими свойствами их постсинаптических возбуждающих ответов. Возбуждающие постсинаптические потенциалы (ВПСП) интернейронов обычно больше по амплитуде и имеют более быструю кинетику, чем у пирамидных клеток [392, 393, 398]. В предыдущих исследованиях сенсорных областей коры грызунов были также показаны различия между свойствами возбуждающих ответов в быстроразряжающихся интернейронах и пирамидных клетках, записанных в синаптически соединенных парах пирамида – быстроразряжающийся интернейрон, пирамида – пирамида [399, 400]. Тем не менее, простая экстраполяция этих результатов на префронтальную кору приматов невозможна в силу того, что нейроны приматов имеют ряд отличий от нейронов грызунов. В частности, быстроразряжающиеся интернейроны макаки обладают большей возбудимостью, обусловленной большим входным сопротивлением мембраны и меньшим порогом возникновения потенциала действия, чем у крысы. (Глава 5). Поэтому основной задачей данной работы стало проведение сравнения свойств возбуждающих входов к пирамидным клеткам и быстроразряжающимся интернейронам в префронтальной коре обезьяны и крысы. Для этого регистрировали миниатюрные ВПСП/ВПСТ, ВПСП, вызванные внеклеточной стимуляцией и ВПСП в соединенных парах пирамидных клеток и интернейронов. Также были изучены механизмы, лежащие в основе упреждающего дисинаптического торможения. 151 6.1. Cвойства миниатюрных ВПСП и ВПСТ пирамидных клеток и быстроразряжающихся интернейронов у обезьян и крыс Для сравнения возбуждающих входов пирамидных клеток и быстроразряжающихся интернейронов крысы и обезьяны была проведена регистрация миниатюрных ВПСП, возникающих в результате спонтанного выделения глутамата в синаптическом окончании. Чтобы исключить постсинаптические события, вызванные потенциалами действия, во всех экспериментах во внеклеточный раствор добавлялся тетродотоксин (0.5 мкМ) (Рис. 62). Рис. 62. Типичные примеры записей миниатюрных ВПСП у больших корзинчатых интернейронов (слева) и пирамидных клеток (справа). Записи у обезьяны показаны черным, а у крысы серым. Даже качественная визуальная оценка полученных регистраций показывает существенные различия между миниатюрными ВПСП (Рис. 62) интернейронов и пирамидных клеток. Количественный анализ подтверждает, что у быстроразряжающихся интернейронов миниатюрные ВПСП были больше по амплитуде, чем у пирамидных клеток, что справедливо как для крыс, так и обезьян (Таблица 15). Кумулятивная гистограмма частотного распределения миниатюрных ВПСП имеет меньший наклон у интернейронов, чем у пирамидных клеток (Рис. 63); это указывает на значительную долю больших по амплитуде миниатюрных ВПСП у интернейронов. Коэффициент вариации (CV) амплитуды миниатюрных ВПСП был так же больше у интернейронов, чем у пирамидных клеток (52.8 ± 7.2% против 36.5 ± 9.3%, p<0.001). У миниатюрных ВПСП, зарегистрированных в интернейронах, были короче время нарастания и постоянная времени спада, чем у пирамидных клеток (Таблица 15). Диаграмма рассеяния (постоянная времени спада против времени нарастания) показывает, что быстро разряжающиеся интернейроны и пирамидные клетки образуют две непересекающихся клеточных популяций (Рис. 64). 152 Таблица 15 Свойства миниатюрных ВПСП пирамидных клеток и быстроразряжающихся интернейронов префронтальной коры крысы и обезьяны# Пирамидные клетки Интернейроны Крыса (n=11) Обезьяна (n=7) Крыса (n=11) Обезьяна (n=8) Амплитуда, мВ 0.52±0.09* 0.45±0.04* 0.94±0.21 0.93±0.29 Время нарастания (10-90%), мс 3.8±0.2* 3.3±0.2* 1.7±0.3 1.8±0.2 Постоянная времени спада (τ), мс 30±6* 28±5* 11±3 13±5 Частота минВПСП, Гц 1.9±0.5 1.8±0.6 24±7 3±1 Параметры миниатюрных ВПСП *Значимые различия между пирамидами и интернейронами при сравнении внутри одного вида (P <0.05) # Среднее ± стандартное отклонение Рис. 63. Кумулятивные частотные гистограммы распределения амплитуд ВПСП в пирамидных клетках (пунктирная линия) и интернейронах (сплошная линия), для построения взято по 200 событий на клетку. Распределения различаются по критерию Колмогорова-Смирнова (KS Z = 4.6, p <0.001). Рис. 64. Диаграммы рассеяния ВПСП (слева) и ВПСТ (справа); интернейроны (кружки) и пирамидные клетки (треугольники). 153 Биофизические мембранные свойства могут по-разному влиять на форму и амплитуду постсинаптических потенциалов в пирамидных клетках и интернейронах [392, 398, 401-403], так как их мембранные свойства разительно отличаются (Таблица 16). Можно предположить, что возбуждающие постсинаптические токи (ВПСТ) у пирамидных клеток и интернейронов не будут различаться столь существенно, поэтому в дополнение к ВПСП были изучены ВПСТ, зарегистрированные при -80 мВ (Рис. 65). Таблица 16 Электрофизиологические свойства пирамидных клеток и быстроразряжающихся интернейронов крысы и обезьяны Электрофизиологические параметры Входное сопротивление, МОм Пирамидные клетки Интернейроны Крыса Обезьяна Крыса Обезьяна (n=12) (n=14) (n=34) (n=16) 13539 13655* 16149 24578 183* 72 93 Постоянная времени мембраны, мс 196* * Значимые различия с интернейронами у одного и того же вида (p<0.05) Рис. 65. (A) Типичные примеры записей миниатюрных ВПСТ и (В) усредненные ВПСТ у пирамидных клеток (слева) и больших корзинчатых клеток (справа) крысы. Было обнаружено, что частота миниатюрных ВПСТ, как правило, выше, чем ВПСП в одних и тех же нейронах. В пирамидных клетках частота ВПСТ составила 2.6 ± 0.8 Гц, тогда 154 как частота ВПСП только 1.8 ± 0.5 Гц (t-тест парных сравнений, p < 0.05, n=5); в быстроразряжающихся интернейронах: 25.6 ± 7.4 Гц и 21.5 ± 7.2 Гц соответственно (р < 0.05, n = 4). Этот результат свидетельствует, что регистрация ВПСТ более чувствительный метод, и позволяет детектировать большее количество синаптических событий, чем регистрация ВПСП. Миниатюрные ВПСТ у быстроразряжающихся интернейронов оказались в 2 раза больше по амплитуде, чем у пирамидных клеток (21.0 ± 1.1 пА, n = 12 и 10.0 ± 0.6 пА, n = 12 соответственно, р <0.001), что примерно соответствует соотношению результатов, полученным для амплитуд ВПСП (Таблица 15). Кинетика миниатюрных постсинаптических токов также была быстрее у интернейронов, чем у пирамидных нейронов: время нарастания 10-90% (0.45±0.02 мс и 0.76 ± 0.08 мс соответственно, р <0.001); постоянная времени спада (2.0±0.1 мс против 6.5±0.4 мс, р <0.001). На диаграмме рассеяния времени нарастания и постоянной времени спада ВПСТ интернейроны и пирамидные клетки формируют два непересекающихся облака (Рис. 64). Таким образом, кинетические свойства ВПСТ у пирамидных клеток и интернейронов также как и у ВПСП существенно различаются. Межвидовое сравнение свойств миниатюрных ответов показывает, что амплитуды и кинетика ответов у клеток одного типа схожи у крысы и обезьяны. В то же время выявлено, что частота миниатюрных ВПСП у быстроразряжающихся интернейронов крысы в 8 раз выше, чем у обезьяны (Таблица 15). Данные различия нельзя объяснить разницей в качестве срезов, полученных из коры крысы и обезьяны или какими-то иными экспериментальными артефактами, так как частоты ВПСП у пирамидных клеток крысы и обезьяны, записанные в тех же экспериментальных условиях, не различались. Таким образом, найденная разница в частоте миниатюрных событий у интернейронов крысы и обезьяны отражает функциональные различия в организации нейронных сетей в коре мозга этих двух видов животных. Эти различия скорее всего обусловлены различным числом возбуждающих синапсов, приходящих к одному интернейрону у крысы и обезьяны, либо особенностями спонтанного освобождения медиатора. Окончательный вывод можно сделать только после проведения дополнительных исследований. В любом случае эти различия ведут к важным функциональным последствиям. Известно, что уменьшение числа возбуждающих синаптических входов через некоторое время приводит к увеличению возбудимости нейронов, обусловленное включением долговременных 155 гомеостатических механизмов или механизмов метапластичности [404, 405]. Например, было показано, что если в культуре нейронов полностью блокировать синаптическую передачу в течение 48 часов, то возбудимость нейронов существенно возрастает: понижается порог возникновения потенциалов действия и требуется гораздо меньший деполяризующий ток, чтобы вызвать потенциалы действия в нейроне [404]. И, наоборот, если увеличить возбуждающую синаптическую передачу путем блокирования торможения в нейронных сетях, через некоторое время компенсаторно происходит увеличение порогов возбуждения [406]. Следовательно, если существует разница в числе возбуждающих синапсов между интернейронами крысы и обезьяны, то, чтобы равноэффективно осуществлять торможение в нейронных сетях, быстроразряжающиеся интернейроны обезьяны должны обладать большей возбудимостью по сравнению с интернейронами крысы. И, действительно, как было рассмотрено выше (Таблица 14) быстроразряжающиеся интернейроны обезьяны имеют более высокое входное сопротивление, меньшую реобазу и порог возникновения потенциала действия, чем у крысы. Кроме того, у них больше длительность постоянной времени мембраны, что облегчает суммацию приходящих ВПСП. Все вместе эти биофизические особенности ведут к большей возбудимости интернейронов обезьяны. Чтобы дополнительно экспериментально проверить, есть ли связь возбудимостью нейрона и числом возбуждающих входов, была посчитана корреляция между частотами миниатюрных ВПСП и пороговым деполяризующим током, вызывающим потенциалы действия у корзинчатых интернейронов крыс. Была найдена значимая положительная корреляция (r=0.63, P<0.01) между этими двумя параметрами (Рис. 66), что свидетельствует о существовании ассоциации между силой синаптических входов и мембранными свойствами нейронов. Рис. 66. Частота ВПСП положительно коррелирует с реобазой в клетках крыс (п=16). 156 6.2. Cвойства вызванных ВПСП пирамидных клеток и быстроразряжающихся интернейронов крыс и обезьян В отличие от миниатюрных ВПСП, которые обусловлены выделением единичных квантов медиатора, вызванные ВПСП, как правило, обеспечиваются одновременным освобождением нескольких квантов медиатора, при этом медиатор может высвобождаться сразу в нескольких синаптических контактах, так как разветвления одного аксона обычно формируют несколько синапсов на иннервируемой клетке [205, 407-409]. Лишь иногда на постсинаптическом нейроне аксон формирует одиночный синапс [329, 410]. Таким образом, форма ВПСП, вызванных стимуляцией одного аксона, определяется количеством и расположением отдельных синаптических контактов, сформированных данным аксоном. Поскольку среднее число синаптических контактов, образуемых одним аксоном с пирамидными клетками и быстроразряжающимися интернейронами может различаться, то различия, отмеченные для миниатюрных ВПСП, могут как усиливаться, так и ослабляться в случае вызванных ВПСП. Следует подчеркнуть еще одну особенность вызванных ВПСП. Поскольку возбуждение к нейронам префронтальной коры может приходить как от соседних пирамидных клеток, так и от других источников, например, таламических входов, то при анализе миниатюрных событий установить, какие пресинаптические нейроны обеспечили тот или иной миниатюрный синаптический ответ невозможно. В случае вызванных ВПСП при некоторых экспериментальных условиях источник может быть точно известен (записи в синаптически соединенных парах), а в других случаях можно ожидать преимущественной активации тех или иных синаптических входов при определенном месторасположении внеклеточного стимулирующего электрода. В зависимости от источника свойства вызванных ВПСП также могут различаться. Поэтому были изучены характеристики вызванных ВПСП у быстроразряжающихся интернейронов и пирамидных клеток в условиях, при которых были задействованы преимущественно разные входы. В первом случае производилась внутриклеточная электрическая стимуляция пресинаптического пирамидного нейрона при одновременной записи ответов второго нейрона, синаптически связанного с ним (Рис. 67). В этом случае мы точно знали, что источником приходящего возбуждения являются близкорасположенные пирамидные клетки 2-3 слоев префронтальной коры. 157 Рис. 67. Свойства ВПСП пирамидных клеток (Pyr) и быстро разряжающихся интернейронов (FS), записанных в синаптически соединенных парах. (А) Типичные примеры регистраций у крыс ВПСП в синаптически соединенных: пирамида-пирамида (слева) и пирамидаинтернейрон (справа). Вверху – запись потенциала действия в пресинаптической пирамидной клетке, посередине – наложенные записи вызванных ВПСП в постсинаптическом нейроне, внизу – усредненная запись этих вызванных ВПСП. (B) Конфокальная реконструкция соединенной пары пирамидная клетка (красная)-интернейрон (зеленый) из коры крысы. Шкала – 100 мкм. Вызванные ВПСП в синаптически соединенных парах, записанные у быстроразряжающихся интернейронов и пирамидных клеток крысы и обезьяны (Таблица 17), различаются по тем же параметрам, что и спонтанные миниатюрные ВПСП. При этом соответствующие кинетические параметры миниатюрных (Таблица 15) и вызванных ВПСП (Таблица 17) почти совпадают. Кинетика ВПСП у пирамидных клеток медленнее, чем у быстроразряжающихся интернейронов, что справедливо как для крысы, так и обезьяны. Длительность постоянной времени спада у пирамидных клеток была примерно в 2.5 раза дольше, чем у интернейронов, что позволяет пирамидным нейронам в течение более длительного времени суммировать приходящие ВПСП. Другой важный момент, это различие в соотношении амплитуд ответов между пирамидными клетками и интернейронами. Если миниатюрные ВПСП интернейронов 158 превышали ответы пирамидных клеток всего в 2 раза, то ответы в соединенных парах различались в 3-4 раза. Эти различия могут быть обусловлены одной или несколькими причинами: пирамидные клетки при контакте с интернейронами могут формировать большее число синапсов, чем с пирамидными клетками, либо эти синапсы в среднем содержат большее число активных зон, либо имеют более высокую вероятность выброса медиатора. Чтобы установить, какая из этих причин верна, необходимо проведение дополнительных исследований. Таблица 17 Свойства ВПСП пирамидных клеток и быстроразряжающихся интернейронов префронтальной коры крыс и обезьян, зарегистрированных в синаптически соединенных парах# Пирамидные клетки Интернейроны Крысы Обезьяны Крысы Обезьяны (n = 14) (n = 9) (n = 6) (n = 4) Амплитуда, мВ 0.55 ± 0.43* 0.46 ± 0.29* 1.6 ± 1.6 2.2 ± 1.1 Время нарастания (10-90%), мс 3.3 ± 1.7* 3.5 ± 1.9* 1.9 ± 0.9 2.4 ± 1.6 Постоянная времени спада (τ), мс 25 ± 7* 31 ± 9* 11 ± 4 14 ± 9 *Значимые различия между пирамидными клетками и интернейронами при сравнении внутри одного вида (р <0.05) # Среднее ± стандартное отклонение Во втором типе экспериментов, ВПСП в пирамидных клетках и интернейронах вызывали, используя метод внеклеточной минимальной стимуляции [411, 412] (Рис. 68). Суть данного метода состоит в том, чтобы стимулировать нейрон с такой интенсивностью, что при небольшом изменении силы стимуляции происходит только изменение вероятности появления ответа, но не меняется его амплитуду. Предполагается, что при данных экспериментальных 159 условиях вызванные ответы обусловлены возбуждением только одного пресинаптического аксона. Рис. 68. Пример реализации эксперимента с минимальной стимуляцией (слева). Кружки обозначают ответы, крестики – пропуски. Стрелками обозначен диапазон минимальной стимуляции. ВПСП, вызванные минимальной стимуляцией у быстроразряжающихся интернейронов (FS), больше по амплитуде и обладают более быстрой кинетикой по сравнению с пирамидными клетками (Pyr). Стимулирующий стеклянный электрод располагали на границе между белым веществом и слоем 6. Благодаря такому расположению электродов в этом типе экспериментов преимущественно стимулировались таламические входы к нейронам коры, хотя нельзя исключить, что в некоторых случаях могла производится стимуляция аксонов пирамидных клеток коры. В этих экспериментах вызванные ВПСП, зарегистрированные у быстроразряжающихся интернейронов крыс и обезьян, имели большие амплитуды и показывали более короткое время нарастания и спада по сравнению с пирамидными клетками у этих же видов (Таблица 18). В целом, полученные результаты, хорошо соответствуют данным, полученным в экспериментах с соединенными парами. Таким образом, оба типа экспериментов по регистрации вызванных ВПСП, обусловленных активацией одного аксона, показывают, что амплитуда ВПСП у быстроразряжающихся интернейронов гораздо выше, чем у пирамидных клеток, а кинетика ответов существенно быстрее. 160 Таблица 18. Свойства ВПСП пирамидных клеток и быстроразряжающихся интернейронов префронтальной коры крыс и обезьян, вызванных методом минимальной стимуляции# Пирамидные клетки Интернейроны Крысы Обезьяны Крысы Обезьяны (n = 7) (n = 6) (n = 6) (n = 3) Амплитуда, мВ 0.56 ± 0.22* 0.60 ± 0.18* 1.32 ± 0.65 1.12 ± 0.04 Время нарастания (10-90%), мс 3.1 ± 0.1* 2.7 ± 0.9* 1.6 ± 0.4 1.6 ± 0.4 Постоянная времени спада (τ), мс 20 ± 3* 28 ± 6* 12 ± 8 11 ± 4 *Значимые различия между пирамидными клетками и интернейронами при сравнении внутри одного вида (р <0.05) # Среднее ± стандартное отклонение Так как стимуляция единичного аксона в естественных условиях обычно вызывает только подпороговые ответы в пирамидных клетках и интернейронах [413], то для того, чтобы вызвать потенциал действия в интернейронах и особенно в пирамидных клетках, требуется одновременная активация нескольких аксонов, приводящая к суммации ВПСП. Механизмы суммации ВПСП могут зависеть от амплитуды ВПСП [414, 415], например, при суммации больших по амплитуде ВПСП могут дополнительно активироваться потенциалзависимые натриевые каналы, тогда как суммация малых по амплитуде событий – пассивный биофизический процесс. Поэтому мы можем ожидать, что при одновременной стимуляции нескольких пресинаптических аксонов суммация ВПСП в пирамидных клетках и интернейронах будет происходить по-разному. Для сравнения свойств суммарных вызванных ВПСП в пирамидных клетках и интернейронах были проведены дополнительные эксперименты. Стимуляция в этих экспериментах так же осуществлялась с границы белого вещества и 6 слоя. 161 В-первом эксперименте интенсивность стимуляции постепенно увеличивали с шагом 510 мкА регистрировали зависимость амплитуды ВПСП от силы стимуляции у пирамидных нейронов и быстроразряжающихся интернейронов. Для сопоставления данных, полученных от разных нейронов, силу стимуляции, при которой возникал минимальный ВПСП, принимали за 0. Зависимость между амплитудой ВПСП и интенсивностью стимуляции хорошо аппроксимировалась линейной функцией как для быстроразряжающихся интернейронов, так и для пирамидных клеток (Рис. 69). Рис. 69. Диаграмма, показывающая зависимость величины амплитуды вызванных ВПСП от силы стимуляции у пирамидных клеток (треугольники) и интернейронов (кружки). Тангенс угла наклона прямой был значительно выше для быстроразряжающихся интернейронов (0.23 мВ/мкА), чем для пирамидных клеток (0.06 мВ/мкА). Таким образом, при увеличении силы стимуляции амплитуда ответа в интернейронах нарастала почти в 4 раза быстрее, чем у пирамидных клеток, что примерно соответствует данным, полученным нами в соединенных парах. Данный результат показывает, что различия между пирамидными клетками и интернейронами сохраняются и для суммарных вызванных ВПСП. Во втором эксперименте вызванные ВПСП регистрировали одновременно в двух нейронах: либо в двух пирамидных клетках, либо в пирамидных клетках и быстроразряжающегося интернейрона. Эти нейроны как правило не были синаптически соединены между собой. Такой эксперимент позволил сравнить ответы двух типов клеток в ответ на одинаковую внеклеточную стимуляцию. Поскольку минимальная интенсивность стимуляции, необходимая, чтобы вызвать ВПСП, была сопоставима в этих двух типах клеток (48±4 мкА в быстроразряжающихся интернейронах, n=7 и 46±11 мкА в пирамидных клетках, 162 n=8), то сравнение амплитуд ВПСП у пирамидных клеток и быстроразряжающихся интернейронов представляется правомерным (Рис. 70). Рис. 70. Эксперименты с внеклеточной стимуляцией пар нейронов: пирамида -пирамида (Pyr) и пирамида-интернейрон (FS). Слева показаны диаграммы, суммирующие результаты экспериментов с одновременной стимуляцией двух нейронов (жирные линии – крыса, пунктирные линии – обезьяна). Справа типичный пример вызванных ВПСП, записанных при одновременной стимуляции с пирамидной клетки и интернейрона из коры крысы. В данном эксперименте использовалась небольшая по силе стимуляция, поэтому амплитуда вызванных ВПСП, как правило, была невысокой, однако большей, чем амплитуда ВПСП, вызванных минимальной стимуляцией, что указывает на активацию более чем одного пресинаптического аксона. Вызванные ВПСП, зарегистрированные одновременно в паре соседних пирамидных клеток, были похожи по амплитуде и временной динамике. Напротив, ВПСП быстроразряжающихся интернейронов были больше по амплитуде, чем соседних пирамидных клеток (Рис. 70); ВПСП интернейронов характеризовались большей скоростью нарастания и спада по сравнению с ВПСП пирамидных клеток (Рис. 71). Рис. 71. Кинетика вызванных ВПСП при парной стимуляции пирамидных клеток (Pyr) и быстроразряжающихся интернейронов (FS) у крыс и обезьян. Интернейроны имеют более короткое время нарастания и постоянную времени спада, чем пирамидные клетки. 163 Таким образом, проведенные эксперименты выявили, что свойства ВПСП у быстроразряжающихся интернейронов и пирамидных клеток существенно различаются как по кинетическим свойствам, так и по амплитуде. В то же время явных межвидовых различий между крысой и обезьяной в свойствах вызванных ВПСП выявлено не было. 6.3. Субъединичный состав глутаматных AMPA рецепторов различается у интернейронов и пирамидных клеток Найденные различия в свойствах ВПСП и ВПСТ между интернейронами и пирамидными клетками могут быть обусловлены различиями в типе и соответственно субъединичном составе синаптических рецепторов. Выделяют три основных типа глутаматных рецепторов: АМРА, NMDA и каинатные рецепторы. Среди них АМРА рецепторы в наибольшей степени ответственны за быструю передачу возбуждения между нейронами и определяют форму ВПСП и ВПСТ, зарегистрированных при мембранном потенциале покоя. АМРА рецептор представляет собой комплекс из четырех одинаковых или двух пар разных субъединиц (GluA1-4) [416]. Свойства рецептора существенно зависят от наличия в его составе субъединицы GluA2. Так, АМРА рецепторы, не содержащие в своем составе субъединиц GluA2, в отличие от остальных вариантов АМРА рецепторов, проницаемы для ионов Ca2+, имеют более высокую ионную проводимость, а также блокируются эндогенными полиаминами при положительных значениях мембранного потенциала, что приводит к выпрямлению их вольт-амперной характеристики [417, 418]. Такие кальцийпроницаемые АМРА (Ca-АМРА) рецепторы широко распространены в нейронах млекопитающих на самых ранних этапах онтогенеза. У взрослых животных их обнаруживают преимущественно в популяциях бесшипиковых нейронов [417], например, в ГАМКергических интернейронах коры, гигантских холинергических нейронах стриатума и др. [419-421]. В данной работе было проверено наличие Ca-АМРА рецепторов в синапсах пирамидных клеток и быстроразряжающихся интернейронов. Блокаду Ca-АМРА глутаматных рецепторов, не содержащих CluA2-субъединицу, вызывали аппликацией 100 мкМ препарата ИЭМ-1460, который обладает высокой селективностью по отношению к Ca-АМРА рецепторам (IC50 = 2.6 мкМ для Ca-АМРА, 1.1 мМ для Са-непроницаемых АМРА и более 300 мкМ для NMDA рецепторов) [419], либо ИЭМ-1925 (5 мкМ) [342]. Эффект ИЭМ-1460 на амплитуду ВПСП интернейронов и пирамидных клеток изучали в условиях, когда вклад активации ГАМК и 164 NMDA рецепторов фармакологически устранен (бикукуллин, 10 мкМ и D-AP5, 50 мкМ). В этих условиях ИЭМ-1460 не влиял на амплитуду одиночных ВПСП в пирамидных клетках (7.6 ± 1.1 мВ в контроле; 7.2 ± 1.3 мВ после применения ИЭМ-1460, t-тест парных сравнений = 0.82, р = n.s, n = 6). Эффект ИЭМ-1460 отсутствовал также при регистрации амплитуды суммарных ВПСП, вызванных пачечной стимуляцией (6.4 ± 1.4 мВ в контроле; 6.2 ± 1.5 мВ после применения ИЭМ-1460, t-тест парных сравнений, р = n.s, n = 5) (Рис. 72). Рис. 72. Действие блокатора ИЭМ-1460 на амплитуду ВПСП пирамидных клеток (А и Б) и интернейронов (В и Г). Примеры записей ответов пирамидных клеток (А) и интернейронов (В) при одиночной и пачечной стимуляции в контрольных условиях и после применения блокатора Ca-АМРА рецепторов. Диаграммы, иллюстрирующие эффект блокатора ИЭМ1460 на амплитуду одиночных (од.) и суммарных (сум.) ВПСП у пирамидных клеток (Б) и интернейронов (Г). 165 Напротив, блокирующее действие ИЭМ-1460 на быстроразряжающиеся интернейроны было выраженным. Амплитуда одиночных и суммарных ВПСП уменьшилась примерно на 40% (одиночные ВПСП 11.8 ± 3.4 мВ в контроле, 7.1 ± 2.0 мВ после применения ИЭМ-1460, tтест парных сравнений = 2.7, р < 0.05, n = 8; суммарные ВПСП в контроле 13.1 ± 3.0 мВ в контроле, 8.0 ± 3.0 мВ после применения ИЭМ-1460, t-тест = 3.3, р < 0.05, n = 4). Различия в субъединичном составе АМРА рецепторов позволяют объяснить различия свойств ВПСП и ВПСТ у интернейронов и пирамидных клеток. Так как ионный канал СаАМРА рецептора имеет в несколько раз более высокую проводимость, чем канал кальцийнепроницаемого АМРА рецептора [422, 423], то амплитуда миниатюрных и вызванных ВПСП у ГАМКергических интернейронов выше, чем у пирамидных клеток [351, 424]. Кроме того, более быстрая кинетика Са-АМРА рецепторов [420] обеспечивает большую скорость нарастания и спада ВПСП у интернейронов, чем у пирамидных клеток [344, 351, 425]. 6.4. Функциональное значение различий в свойствах ВПСП у интернейронов и пирамидных клеток: механизм упреждающего дисинаптического торможения в коре Различия в свойствах ВПСП у быстроразряжающихся интернейронов и пирамидных клеток, а именно более быстрая кинетика и большая амплитуда (см. разделы 6.1-6.3), ведут к тому, что возбуждение быстроразряжающихся интернейронов наступает при меньшей силе стимуляции и с более коротким латентным периодом, чем у пирамидных клеток [392, 393]. В результате этого интернейроны коры активируются раньше соседних с ними пирамидных клеток и могут дисинаптически вызывать упреждающее торможение. Чтобы смоделировать эту ситуацию, внеклеточный стимулирующий электрод разместили на границе между белым веществом и слоем 6 и производили одновременную запись ответов от пирамидной клетки и быстроразряжающегося интернейрона 2-3 слоев коры. Пирамидные клетки деполяризовали до -50 ... -60 мВ для того, чтобы видеть ТПСП. Если небольшая по силе стимуляция вызывала только подпороговые ВПСП у пирамидного нейрона и быстроразряжающегося интернейрона, то большая по силе стимуляция приводила к возникновению в пирамидных клетках комплексного ответа, состоящий из ВПСП и следующего за ним ТПСП (Рис. 73). ТПСП были более изменчивы по форме и латентному 166 периоду, чем предшествующие им моносинаптические ВПСП. Одновременно с дисинаптическим торможением в пирамидных клетках мы регистрировали потенциалы действия в соседних быстроразряжающихся интернейронах (в семи из девяти зарегистрированных пар у крыс и в одной паре, записанной у обезьян). Рис. 73. Ответы пирамидной клетки (верхние записи) и интернейрона (нижние записи) при разной силе внеклеточной стимуляции в условиях одновременной записи. Треугольником указано время, в которое производилась внеклеточная стимуляция. Стрелкой указан дисинаптический ТПСП. Бикукуллин (10-20 мкМ), антагонист ГАМКА рецепторов, полностью блокировал ТПСП (Рис. 74А). Антагонисты АМРА рецепторов CNQX (20 мкМ) и NMDA рецепторов AP5 (50 мкМ) блокировали не только моносинаптические ВПСП, но и ТПСП, подтверждая дисинаптический характер торможения (Рис. 74В). Рис. 74. Воздействие бикукуллина (А) и блокаторов ионотропных глутаматных рецепторов CNQX и AP5 (В) на дисинаптическое торможение в пирамидных клетках. 167 Потенциал действия генерировался интернейроном до появления ТПСП в пирамидной клетке (Рис. 75), что также подтверждает его дисинаптическое происхождение. Однако, при мембранном потенциале близком к -50 мВ латентный период ТПСП трудно корректно оценить, поскольку предыдущий моносинаптический ВПСП может маскировать начало ТПСП. Поэтому были проведены дополнительные эксперименты. В этих экспериментах во внутриклеточный раствор был добавлен QX-314 (5 мМ), чтобы блокировать потенциалзависимые натриевые каналы и предотвратить появление потенциалов действия. Пирамидные клетки (n=7) деполяризовали соответственно до 0 мВ, потенциала мембраны близкого к потенциалу реверсии глутаматергических ВПСП. При этом мембранном потенциале ВПСП были не видны, и начало дисинаптического ТПСП можно было четко определить. В этих экспериментах ТПСП в пирамидной клетке также регистрировался с небольшой задержкой (около 1 мс) после возникновения потенциала действия в быстроразряжающемся интернейроне (Рис. 75). Рис. 75. Определение латентного периода дисинаптического торможения. Верхняя и средняя записи – ответы пирамидного нейрона на внеклеточную стимуляцию с границы белого вещества и 6 слоя при разных значениях мембранного потенциала. Стрелкой указано начало возникновения дисинаптического ТПСП. Нижняя запись – ответ быстроразряжающегося интернейрона. Треугольником указано время внеклеточной стимуляции. Для того, чтобы удостовериться, что время от пика потенциала действия в быстроразряжающемся интернейроне до начала ТПСП в пирамидных клетках сопоставимо с моносинаптической задержкой, были зарегистрированы ТПСП в соединенных парах интернейронов и пирамидных клеток префронтальной коры крысы и обезьяны (Рис. 76). Для этого пирамидный нейрон деполяризовали примерно до -55 мВ. Характеристики ТПСП, 168 зарегистрированные в срезах коры обезьяны (n = 4) и крысы (n = 4), были объединены, так как различий в свойствах ТПСП между этими видами найдено не было. Латентный период синаптического ответа составлял 1.02 ± 0.14 мс для ТПСП обезьяны и 0.92 ± 0.18 мс для ТПСП крысы. Ни амплитуды (обезьяна: 0.61 ± 0.31 мВ; крыса: 0.64 ± 0.32 мВ), ни время нарастания (обезьяна: 2.2 ± 0.9 мс; крыса: 2.3 ± 1.1 мс) не различались. Задержка дисинаптического ТПСП, измеренного при 0 мВ оказалась сходной с латентным периодом ТПСП в соединенных парах (Рис. 76). Рис. 76. Латентный период дисинаптического торможения (dIPSP) и ТПСП в соединенных парах интернейрон – пирамида (uIPSP) сопоставимы. (Пояснения в тексте). Таким образом, проведенные эксперименты подтверждают важную роль быстроразряжающихся интернейронов для возникновения упреждающего дисинаптического торможения в префронтальной коре как у крысы, так и у обезьяны. Так как быстроразряжающиеся интернейроны и пирамидные клетки различаются по субъединичному составу AMPA рецепторов, то мы дополнительно исследовали, как повлияет на упреждающее дисинаптическое торможение избирательная блокада Ca-АМРА рецепторов. Эти эксперименты были проведены на срезах префронтальной коры крысы. Внеклеточную стимуляцию производили с границы 6-го слоя и белового вещества, для этого подавались 5 стимулов с частотой 50 Гц. Записи производились внутриклеточно с пирамидных нейронов 3 слоя при мембранном потенциале -60 мВ. В контрольном эксперименте пачечная стимуляция пирамидной клетки вызывала кратковременную деполяризацию (первые 2-3 ВПСП), сменяющуюся выраженной гиперполяризацией, обусловленной развивающимся 169 дисинаптическим торможением, тогда как при гиперполяризации пирамидной клетки до -80 мВ дисинаптическое торможение не регистрировалось (Рис. 77А). Рис. 77. Феномен дисинаптического торможения. (А) Примеры ответов пирамидной клетки на пачечную стимуляцию при разном мембранном потенциале (-60 мВ, -80 мВ). Дисинаптическое торможение выражено только при -60 мВ. (Б) ИЭМ-1460 частично блокирует дисинаптическое торможение. (В) Бикукуллин полностью блокирует дисинаптическое торможение (потенциалы действия частично обрезаны). (Г) Диаграмма, показывающая эффект блокатора ИЭМ-1460 на величину дисинаптического торможения (n = 4). Блокада Ca-АМРА рецепторов (ИЭМ-1460, 100 мкМ) не изменяла амплитуду ВПСП пирамидных клеток, но снизила амплитуду дисинаптического ТПСП с -2.8 ± 1.3 мВ до -0.4 ± 0.8 мВ (Рис. 77 В и Г). Таким образом, избирательная блокада Ca-АМРА рецепторов существенно ослабляет дисинаптическое торможение в коре мозга крысы и может приводить к парадоксальному эффекту растормаживания в нейронных сетях, смещая баланс возбуждения и торможения в сторону возбуждения. Это явление должно учитываться при разработке фармакологических препаратов, избирательно действующих на Ca-АМРА рецепторы. Так как дисинаптическое упреждающее торможение ограничивает временной промежуток, в течение которого передается сигнал по нейронной сети [350, 352, 426], то 170 избирательная блокада Ca-АМРА рецепторов может приводить к нарушению временных параметров передачи сигналов в коре, а с точки зрения теории информации повышать величину шума при передаче сигнала, так как суммация подпороговых ВПСП может происходить в течение более длительного времени. 6.5. Значение различий в организации возбуждающих входов для функционирования префронтальной коры крысы и обезьяны Прежде всего следует отметить, что нами не обнаружено достоверных межвидовых различий в амплитуде и кинетических свойствах ВПСП между крысой и обезьяной. Межвидовые различия были обнаружены только по частоте миниатюрных ВПСП в быстроразряжающихся интернейронах. В то же время различия в свойствах ВПСП у пирамидных клеток и быстроразряжающихся интернейронов были явно выраженными. Эти результаты свидетельствуют о том, что данные признаки являются консервативными и определяют базовые механизмы функционирования нейронных сетей. Все виды подпороговых возбуждающих ответов, записанных в префронтальной коре крыс и обезьян, имели большую амплитуду и более быструю динамику у быстроразряжающихся интернейронов по сравнению с пирамидными клетками. Эти данные хорошо согласуются с рядом предыдущих исследований в других областях коры. Например, в слоях 2-3 и 4 крыс, соматосенсорной и зрительной коры, возбуждающие ответы были больше по амплитуде и быстрее по динамике у быстроразряжающихся интернейронов по сравнению с пирамидными клетками [333, 399]. Аналогичные данные были получены в соединенных парах нейронов во 2-3 слоях медиальной префронтальной коре хорьков [427]. Кроме того, прямая минимальная стимуляция таламических входов вызывала больший и более быстрый ответ у быстроразряжающихся интернейронов, чем у пирамидных клеток в слоях 4 и 5 соматосенсорной коры [338]. Тем не менее, ВПСП в пирамидных клетках и быстроразряжающихся интернейронах при записи в соединенных парах в слоях 2-5 из неокортекса крыс были сопоставимы по амплитуде, хотя и различались по кинетике [400]. Целый ряд факторов может обеспечивать различия в свойствах возбуждающих входов между пирамидными клетками и быстроразряжающимися интернейронами. Во-первых, различия в мембранных свойствах этих нейронов, которые были показаны в данном 171 исследовании и во многих других работах [212, 244, 398, 401, 425, 428]. Во-вторых, различиями в субъединичном составе AMPA рецепторов [344, 425, 429]. В-третьих, различным расположением синаптических контактов. Многочисленные исследования показывают, что у интернейронов возбуждающие синапсы расположены не только на дендритах, но и на соме, тогда как у пирамидных клеток возбуждающие синапсы на теле отсутствуют [186]. Кроме того, дендритные деревья интернейронов значительно более компактны, чем у пирамидных клеток. Таким образом, у быстроразряжающихся интернейронов возбуждающие ответы могут быть больше, так как меньше фильтруются при распространению по дендритам и поэтому возникают более благоприятные условия для пространственной суммации. Также нельзя исключить вероятность того, что у интернейронов и пирамидных клеток различается соотношение плотности тормозных и возбуждающих синапсов на дендритах, однако для окончательного вывода требуется проведение дополнительных условий. Считается, что тормозные интернейроны являются критически важным элементом нейронных сетей дорсолатеральной префронтальной коры для обеспечения оперативной памяти [58, 64, 65, 430, 431]. Действительно, введение бикукуллина в префронтальную кору обезьяны нарушает оперативную память [66, 67] и фазовую настройку нейронов во время выполнения задач на оперативную память [65]. Токи через ГАМКергические синапсы необходимы для регуляции активности пирамидных клеток в течение периода задержки при выполнении задач на оперативную памяти [432, 433]. Важная роль быстроразряжающихся интернейронов для фазовой настройки пирамидных клеток в процессе решения пространственных задач, требующих вовлечения оперативной памяти была показана как в модельных исследованиях [431, 434], так и в экспериментах с блокадой ГАМКергической передачи, которые приводили к расширению рецептивных полей нейронов префронтальной коры [65]. Так как особенности синаптического взаимодействия быстроразряжающихся интернейронов и пирамидных клеток в префронтальной коре до сих гораздо менее изучены, чем в других отделах коры, то нами было проведено дополнительное исследование, посвященное изучению синаптически соединенных пар пирамидных клеток и быстроразряжающихся интернейронов, описанное в следующей главе. 172 Глава 7. ОСОБЕННОСТИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ БЫСТРОРАЗРЯЖАЮЩИХСЯ ИНТЕРНЕЙРОНОВ И ПИРАМИДНЫХ КЛЕТОК ПРЕФРОНТАЛЬНОЙ КОРЫ КРЫСЫ Взаимодействие между быстроразряжающимися тормозными интернейронами и возбуждающими пирамидальными нейронами обуславливает основные фундаментальные свойства нейронных сетей коры, и эти взаимодействия могут быть проанализированы in vitro в срезах мозга путем одновременной записи пресинаптических и постсинаптических нейронов [197]. В ряде исследований были описаны синаптические связи между пирамидными нейронами и быстроразряжающимися интернейронами и функциональные свойства таких соединений в сенсорных и моторных областях коры разных видов млекопитающих [228, 251, 333, 334, 336, 341, 349, 364, 435-441], однако аналогичные данные для ассоциативных зон коры, таких как префронтальная кора весьма ограниченны [355, 442]. Как уже обсуждалось ранее, префронтальная кора имеет целый ряд особенностей организации, и поэтому прямой перенос данных, полученных на сенсорных областях коры, невозможен. Так как записи в соединенных парах достаточно сложный эксперимент, требующий больших трудозатрат и значительного количества срезов, то систематическое изучение большого количества соединенных пар в коре обезьяны было невозможным, поэтому данные эксперименты проводились на срезах коры крысы. Были детально изучены свойства синаптических соединений между пирамидными клетками и быстроразряжающимися интернейронами 2/3 слоев медиальной префронтальной коры 19 - 21-дневных самцов крыс линии Вистар. Идентификация быстроразряжающихся интернейронов производилась по критериям, описанным ранее [247, 313, 332]. Только клетки с полушириной потенциала действия <0.51 мс и коэффициентом адаптации >0.65 были включены в данное исследование. В среднем продолжительность потенциала действия у быстроразряжающихся интернейронов составила 0.46 ± 0.01 мс. Для этих интернейронов характерно достаточно низкое входное сопротивление (234 ± 13 MОм) и небольшая постоянная времени мембраны (8.1 ± 0.6 мс). На сверхпороговую деполяризацию эти клетки отвечали пачкой потенциалов действия, при этом изменений частоты спайков в ходе пачки практически не наблюдалось (коэффициент частотной адаптации 0.91 ± 0.03; Рис. 78А). У пирамидных клеток, напротив, была выраженная частотная адаптация (коэффициент частотной адаптации 0.38 ± 0.08; Рис. 78А). Длительность потенциала действия была гораздо дольше (1.16 ± 0.05 мс), входное сопротивление мембраны 173 было сопоставимо по величине (260 ± 16 MОм), а постоянная времени мембраны выше (28.0 ± 1.6 мс). Рис. 78. Физиологические (А) и морфологические (В) свойства быстроразряжающегося интернейрона (FS) и пирамидной клетки (Pyr), образующих синаптически соединенную пару. Дендриты и тело интернейрона показаны зеленым, его аксон черным цветом. Тело и дендриты пирамидной клетки показаны красным цветом. (C) Пара нейронов заполнена биоцитином и визуализирована с помощью комплекса стрептавидин-Alexa 633 (красный цвет), парвальбумин с помощью комплекса антитела с Alexa 488 (зеленый цвет). Интернейрон (указан стрелкой) содержит парвальбумин. Часть быстроразряжающихся интернейронов была морфологически реконструирована, все они относились к большим корзинчатым интернейронам (Рис. 78В). Некоторые из быстроразряжающихся интернейронов были также проверены на содержание парвальбумина 174 и в большинстве протестированных клеток этот кальцийсвязывающий белок был обнаружен (Рис. 78С). 7.1. Свойства синаптических соединений между пирамидными нейронами и быстроразряжающимися интернейронами Так как во время приготовления срезов коры часть аксонов перерезается, то это может серьезно влиять на частоту обнаружения синаптических связей между нейронами [333]. Поэтому были приложены все усилия, чтобы минимизировать эффект перерезки аксонов. Для этого в экспериментах использовали только срезы, в которых дендриты пирамидных клеток шли параллельно поверхности среза. Регистрации проводили на клетках, тела которых располагались на глубине от 40-50 мкм от поверхности среза. Тела пирамидных нейронов и интернейронов, как правило, были расположены на расстоянии 10-50 мкм друг от друга (Рис. 78). Чтобы иметь возможность регистрировать ТПСП в пирамидных клетках при мембранном потенциале покоя, для пирамидных клеток использовался внутриклеточный раствор с высоким содержанием Cl- ионов. В этом случае расчетный потенциал реверсии для хлорного тока через ГАМКА рецепторы составлял около 0 мВ. Для быстроразряжающихся интернейронов использовался стандартный внутриклеточный раствор. Чтобы избежать возникновения долговременных синаптических модификаций, стимуляция проводилась с частотой 0.05 - 0.10 Гц. Всего была протестирована 51 пара нейронов. Среди них 13 пар (25%) имели только возбуждающие связи, 12 пар (24%) имели только тормозные связи, 8 пар (16%) имели реципрокные соединения (Рис. 79). Такая высокая вероятность нахождения синаптических связей между пирамидными клетками и интернейронами показывает, что большинство аксонов изучаемых нейронов не пострадали. Рис. 79. Диаграмма, иллюстрирующая распределение пар нейронов с разными типами синаптических связей (слева направо: нет связи, только возбуждающая, только тормозная, реципрокные). 175 7.1.1. Амплитуды ВПСП и ТПСП и надежность синаптической передачи в паре быстроразряжающийся интернейрон – пирамидная клетка Эффективность синаптических связей, измеряемая по средней амплитуде постсинаптических ответов при мембранном потенциале покоя (интернейроны -72 ± 2 мВ, пирамидные клетки -69 ± 3 мВ), была высокой в обоих типах синапсов префронтальной коры крыс. Средняя амплитуда ВПСП составила 3.4 ± 0.7 мВ (n = 19) и ТПСП - 2.6 ± 0.7 мВ (n = 18). Так как в пирамидных клетках использовался внутриклеточный раствор с высоким содержанием хлора, а в интернейронах стандартный внутриклеточный раствор, то потенциал реверсии для токов через ионотропные глутаматные рецепторы и через ГАМКА рецепторы был равен примерно 0 мВ. Эффективность возбуждающих и тормозных связей существенно варьировала в разных парах нейронов: в некоторых соединенных парах средняя амплитуда постсинаптических потенциалов достигла 8-12 мВ, в то время как в других она было менее 0.5 мВ, что иллюстрируют приведенные распределения амплитуд ВПСП и ТПСП (Рис. 80). Рис. 80. Распределение амплитуд ВПСП (А) и ТПСП (В) в разных синаптически соединенных парах. Следует отметить, что средняя амплитуда ВПСП, зарегистрированная на быстроразряжающихся интернейронах была выше, чем амплитуда ВПСП, регистрируемая в парах из сенсорной и моторной коры, где, согласно литературным данным, она составляет 1 – 2 мВ [251, 335, 407, 429, 440, 443], что может свидетельствовать о более высокой эффективности возбуждающей синаптической передачи в префронтальной коре. Однако в одной из работ на соматосенсорной коре [333] так же была показана высокая эффективность передачи в парах пирамида – быстроразряжающийся интернейрон (амплитуда ВПСП = 3.48 ± 2.52 мВ). В силу большого разброса экспериментальных данных сделать окончательны вывод о более высокой эффективности синаптической передачи в префронтальной коре представляется преждевременным. Важно подчеркнуть еще одну особенность: сила синаптических связей между пирамидами и быстроразряжающимися интернейронами была значительно больше, чем в 176 парах пирамидных клеток. Амплитуда ВПСП в парах пирамидных клеток обычно меньше 1 мВ как сенсорных и моторных областях [197, 333, 444] так и в префронтальной коре [351]. Коэффициент вариации (CV) амплитуды индивидуальных постсинаптических потенциалов в разных синапсах был относительно небольшим и составлял от 15% до 56% (среднее значение 32 ± 3%) для возбуждающих синапсов и от 19 до 56% (среднее значение 36 ± 2%) для тормозных синапсов (Рис. 81). Для возбуждающих синапсов было найдено, что CV обратно пропорционально амплитуде ВПСП (r = -0.75, n = 18, р <0.01), тогда как для тормозных синапсов значимой корреляции между CV и амплитудой ТПСП не было выявлено (r = -0.35, n = 17, р> 0.05) (Рис. 81). Рис. 81. Диаграммы, характеризующие взаимоотношения между CV амплитуд и величинами ВПСП (слева) и ТПСП (справа). Низкий фоновый шум записей позволил надежно определить, в каких случаях пресинаптический потенциал действия обеспечил синаптическую передачу, а в каких нет. Надежность синаптических связей, измеряемая по частоте пропусков при синаптической передаче, была высокой в обоих типах соединений. Доля пропусков в возбуждающих синапсах составила только 0.12 ± 0.04 (диапазон 0.00-0.50) и в тормозных синапсах была 0.20 ± 0.06 (диапазон 0.00-0.72). В обоих типах синаптических соединений амплитуда и частота пропусков отрицательно коррелировали между собой (для возбуждающих синапсов, r = -0.56, n = 18, р <0.05; тормозных связей, r = -0.56, n = 17, р <0.05) (Рис. 82). Рис. 82. Диаграммы, характеризующие отношения между долей пропусков при синаптической передаче и величинами ВПСП и ТПСП. Частота пропусков была относительно высокой (>0.2) в возбуждающих и тормозных синапсах с низкой амплитудой синаптических потенциалов (<1.0 мВ). Надежность 177 синаптической передачи возрастала практически до 100% в синапсах со средней амплитудой ответов больше 2 мВ. 7.1.2. Латентный период постсинаптических потенциалов и их кинетические свойства Средний латентный период ВПСП и ТПСП варьировал в диапазоне от 0.5 до 1.6 мс для разных соединенных пар и составлял в среднем 0.87 ± 0.07 мс для возбуждающих связей (n = 19) и 0.86 ± 0.07 мс для тормозных связей (n = 18), что свидетельствует о высокой скорости синаптической передачи в обоих типах синаптических контактов (Рис. 83). Рис. 83. Латентный период синаптической передачи. Примеры ВПСП (А) и ТПСП (В), вызванных в паре взаимно соединенных интернейрона (верхние записи) и пирамиды (нижние записи). (С) и (D) гистограммы распределения латентных периодов для постсинаптических событий в этой паре нейронов. Вариативность индивидуальных латентных периодов ВПСП и ТПСП в большинстве соединенных пар была небольшой по величине (среднее стандартное отклонение латентных периодов ВПСП составило 0.29 ± 0.04 мс, для ТПСП - 0.24 ± 0.04 мс, коэффициент вариации для латентных периодов ВПСП = 21 ± 3%, для ТПСП - 18 ± 2%). Гистограммы распределения 178 индивидуальных латентных периодов были одномодальными и характеризовались небольшим разбросом (Рис. 83С и D). Было обнаружено, что в возбуждающих синапсах коэффициент вариации латентного периода синаптической задержки коррелирует со многими параметрами (Рис. 84). Например, низкая вариативность времени синаптической задержки характерна для возбуждающих синапсов с большой амплитудой ВПСП (r = -0.71), малой величиной коэффициента вариации (CV) амплитуды (r = 0.82), малым числом пропусков при синаптической передаче (r = 0.87) и сильно выраженной кратковременной синаптической депрессией (r = 0.67). Такие корреляции не были выявлены для тормозных синапсов. Рис. 84. (А) Диаграмма, показывающая распределение средних латентных периодов синаптической передачи в возбуждающих и тормозных синапсах. (В-D) Взаимосвязь между коэффициентом вариации латентных периодов и (В) средней амплитудой ВПСП, (С) долей пропусков, (D) величиной кратковременной депрессии. Кинетика возбуждающих постсинаптических ответов, измеренная при потенциале покоя была значительно быстрее, чем у тормозных ответов: время нарастания (1.55 ± 0.14 мс для ВПСП и 2.76 ± 0.37 мс для ТПСП, t-тест = 3.13, р <0.01), постоянная времени спада (τ = 10.0 ± 0.9 мс для ВПСП и 43.1 ± 3.5 мс для ТПСП, t-тест = 9.2, р <0.001) (Рис. 85). Было обнаружено, что время нарастания и постоянная времени спада время значимо коррелировали друг с другом (для ВПСП r = 0.72, р <0.01; для ТПСП r = 0.60, р <0.05). Постоянная времени спада ВПСП коррелировала с постоянной времени мембраны интернейронов (r = 0.50, n = 14, р = 0.07), тогда как время нарастания ВПСП не коррелировало с постоянной времени мембраны (r = -0.01, n = 14, р >0.1). 179 Рис. 85. Кинетика ВПСП и ТПСП в синаптически соединенных парах пирамида-интернейрон. Слева пример регистрации ТПСП (верхняя запись) и ВПСП (нижняя запись). Диаграммы, показывающие различия в кинетике ВПСП для времени нарастания (центр) и постоянной времени спада (справа). 7.2. Краткосрочная динамика синаптической передачи в возбуждающих и тормозных синапсах Для определения функциональных свойств синаптических ответов при повторяющейся активации синаптических входов в пресинаптических нейронах вызывали по 5 потенциалов действия с частотой 20 Гц (Рис. 86). Рис. 86. Примеры записей пяти ВПСП с быстроразряжающихся интернейронов (A) и ТПСП с пирамидных клеток (В) при пачечной стимуляции пресинаптических нейронов. В большинстве соединенных пар нейронов наблюдалось снижение амплитуд ВПСП / ТПСП в ходе пачки стимулов. Уменьшение амплитуды, как правило, наблюдалось, начиная со второго постсинаптического ответа. Так как краткосрочная депрессия амплитуд постсинаптических ответов наиболее характерна для синапсов с высокой вероятностью выброса медиатора (р) [412], то полученные результаты свидетельствуют о том, что оба вида синапсов, тормозные и возбуждающие, имеют относительно высокую вероятность выброса медиатора. 180 При пачечной стимуляции возбуждающие связи показывали гораздо большую степень депрессии, чем тормозные связи (Рис. 86): пятый ТПСП в пачке уменьшался по амплитуде до 68 ± 5% от начального значения, тогда как амплитуда пятого ВПСП снижалась до 37 ± 4 %. Разница в краткосрочной депрессии между возбуждающими и тормозными связями было значимой начиная с третьего постсинаптического ответа (Рис. 87). Следует также отметить, что в связи с быстрой кинетикой ВПСП, при стимуляции в 20Гц не наблюдалось суммации постсинаптических ответов, тогда как суммация ТПСП была достаточно выраженной (Рис. 86). Рис. 87. Динамика амплитуд (слева) и доли пропусков при синаптической передаче (справа) при пачечной стимуляции с частотой 20 Гц. ВПСП обозначены кружками и ТПСП – треугольниками. В ходе пачечной передачи частота пропусков значительно увеличивается как в тормозных, так и возбуждающих синаптических соединениях (Рис. 87). В возбуждающих связях частота пропусков увеличилась с 0.16 ± 0.05 (медиана = 0.05) для 1-го ВПСП в пачке до 0.37 ± 0.06 (медиана = 0.43) для 5-го ВПСП (дисперсионный анализ, F (4,68) = 11.6, р <0.001). В тормозных связях частота пропусков в пачке возросла с 0.24 ± 0.06 до 0.36 ± 0.07 (дисперсионный анализ, F (4,64) = 6.5, р <0.001). Для большинства возбуждающих синапсов была обнаружена значимая отрицательная корреляция между амплитудами первого и второго ВПСП (r = -0.36 ± 0.06, n = 18, изменялась в диапазоне от -0.82 до 0.11) (Рис. 88). Тогда как между амплитудами первого и второго тормозных ответов корреляции выявлено не было (r = -0.03 ± 0.06, n = 17), за исключением двух тормозных синаптических соединений с низкими амплитудами ТПСП и высоким числом пропусков при синаптической передаче (r = - 0.60 и r = -0.33). 181 Рис. 88. (А) и (В) Примеры диаграмм, показывающих взаимоотношения между амплитудами первых и вторых постсинаптических ответов в пачке для возбуждающей и тормозной связей соответственно. В возбуждающих синапсах величина синаптической депрессии, рассчитанная как отношение амплитуд между 5-м и 1-м постсинаптическими ответами, значимо коррелирует с начальной частотой пропусков (r = 0.76, р <0.05, n = 16). Это свидетельствует о том, что синапсы с изначально более надежной синаптической передачей показывают более выраженную синаптическую депрессию (Рис. 89). Рис. 89. Величина депрессии в возбуждающих и тормозных синапсах с различной надежностью передачи. (А) и (В) Примеры кратковременной динамики ВПСП в синаптических соединениях с высокой (А) и низкой (В) надежностью. Диаграммы, показывающие изменение нормализованных амплитуд ВПСП (С) и ТПСП (D) в синаптических соединениях без пропусков (черные кружки и треугольники соответственно) и с частотой пропусков выше 0.2 (белые фигуры). 182 Действительно, амплитуда последнего пятого ВПСП в парах без пропусков составила всего 31 ± 5% от амплитуды первого ВПСП (n = 10), тогда как в парах с изначально высокой частотой пропусков (более 0.2) амплитуда пятого ВПСП составила 52 ± 10% (n = 5). В отличие от возбуждающих связей, краткосрочная динамика ТПСП не зависит от надежности нейротрансмиссии (Рис. 89D). 7.3. Реципрокные синаптические соединения имеют более высокую эффективность и надежность, чем односторонние В данной работе было также исследовано, различаются ли по своим функциональным свойствам реципрокные и односторонние синаптические связи (Таблица 19). Было обнаружено, что латентный период синаптического ответа и его кинетические свойства не отличаются в односторонних и реципрокных синаптических соединениях. Зато эффективность нейротрансмиссии была выше в парах с реципрокной иннервацией. Так, амплитуда ВПСП в парах со взаимными связями была больше, чем в парах только с возбуждающей связью (5.6 ± 1.9 мВ, n = 6 и 2.3 ± 0.5 мВ, n = 13, t-тест = 2.24, р <0.05). Амплитуда ТПСП в парах с реципрокными связями также была больше (4.7 ± 1.4 мВ, n = 7), чем в парах только с тормозной связью (1.17 ± 0.23 мВ n = 11, t-тест = 3.1, р <0.01). Рис. 90. Сравнение свойств реципрокных и односторонних пар. (А и В) сравнение амплитуд и (С и D) доли пропусков при синаптической передаче. Обозначения: кружки – ВПСП, треугольники – ТПСП, белые фигуры – реципрокные, черные – односторонние связи, *Р <0.05, ** P <0.01. 183 Таблица 19 Свойства синаптической передачи в парах пирамида – быстроразряжающийся интернейрон с односторонними и реципрокными связями Свойства Тормозные синапсы Возбуждающие синапсы И → П# И↔П П→И П↔И (11 пар) (7 пар) (13 пар) (6 пар) Синаптическая задержка, мс 0.9 ± 0.1 0.8 ± 0.1 0.9 ± 0.1 0.8 ± 0.1 Амплитуда, мВ 1.2 ± 0.2** 4.7 ± 1.4 2.3 ± 0.5* 5.6 ± 1.9 Время нарастания, мс 3.2 ± 0.6 2.0 ± 0.2 1.5 ± 0.2 1.6 ± 0.3 Постоянная времени спада 43 ± 6 43 ± 4 10.1 ± 1.2 9.7 ± 1.5 Доля пропусков (1-ый ответ) 0.32 ± 0.07* 0.04±0.03 0.14 ± 0.05 0.09 ± 0.07 Доля пропусков (5-ый ответ) 0.48±0.08* 0.19±0.10 0.46±0.07* 0.17±0.09 # И → П – односторонняя тормозная связь между интернейроном (И) и пирамидной клеткой (П), И ↔ П – реципрокная связь. * Различия между парами с односторонними и реципрокными связями по t-тесту при р <0.05 Эти данные позволяют предположить, что быстроразряжающиеся интернейроны оказывают наибольшее тормозное воздействие на пирамидные клетки от которых получают возбуждающие входы, что сходно с результатами, полученными в зрительной коре [340]. Таким образом, возвратное торможение в медиальной префронтальной коре выражено гораздо сильнее, чем латеральное торможение. Важно отметить, что в соматосенсорной коре мыши такой закономерности выявлено не было: амплитуды ТПСП в парах с реципрокными связями 184 и в парах только с тормозной связью не различались [335], таким образом, эти особенности организации Начальная доля пропусков при глутаматергической синаптической передачи не различалась в парах с реципрокной и односторонней связью, однако была почти в 3 раза выше в пятому ответу (Таблица 19). Надежность тормозной нейротрансмиссии была всегда выше в парах с реципрокными связями. 7.4. Пресинаптические потенциалзависимые кальциевые каналы Одним из факторов, определяющих свойства синаптической передачи, является преобладающий тип пресинаптических кальциевых каналов. Cav2.1 (P/Q-тип) и Cav2.2 (N-тип) кальциевые каналы играют доминирующую роль в выбросе нейромедиатора как в возбуждающих, так и тормозных синапсах коры [445, 446]. В предыдущих исследованиях было показано, что ГАМКергические синапсы содержат в основном только один из подтипов кальциевых каналов [356, 357, 443, 447]. Хотя преимущества дифференциального распределения N- и P/Q- типов кальциевых каналов остаются неясными [446], различные типы потенциалзависимых кальциевых каналов по-разному влияют на синаптические свойства. Например, кальциевый ток через P/Q-тип каналов обеспечивает более синхронный выброс медиатора, чем ток через N-тип, так как P/Q-каналы расположены в непосредственной близости от активной зоны [357, 448]. Эти различия могут объяснить наблюдаемую разницу в кратковременной синаптической динамике; так P/Q-тип кальциевых каналов обычно находят в синапсах, выказывающих депрессию, тогда как каналы N-типа – в синапсах с фасилитацией ответов [443]. Кроме того, найдены различия в G-белок-опосредованном ингибирования Nтипа и P/Q-типа каналов [449, 450]. Так ингибирование P/Q-типа каналов изменяет эффективность синаптической передачи, но не влияет на ее временные параметры. В отличие от этого G-протеин-опосредованное ингибирование N-типа кальциевых каналов не только снижает эффективность, но также влияет на временные параметры и синхронность синаптической передачи [451]. Таким образом, преобладание P/Q-типа кальциевых каналов можно предполагать в синапсах с высокой нейротрансмиссии, вероятностью например, парвальбуминсодержащими в выброса таких медиатора как и большой тормозные быстроразряжающимися интернейронами синапсы скоростью между и пирамидными клетками коры головного мозга, тогда как в возбуждающих синапсах может преобладать N185 тип кальциевых каналов. Предыдущие исследования косвенно подтверждают эту гипотезу для синапсов гиппокампа [356, 357, 447], однако противоречащие этой гипотезе данные были найдены для синапсов неокортекса молодых крыс [443]. Поэтому, чтобы установить преобладающие типы кальциевых каналов в разных типах синапсах, были использованы специфические блокаторы кальциевых каналов ω-конотоксин-GVIa и ω-агатоксин-IVa [452455]. Во всех протестированных соединенных парах (быстроразряжающийся интернейрон → пирамидная клетка, n = 5) применение ω-конотоксина-GVIa (1 мкМ), специфического антагониста N-типа кальциевых каналов, в течение 10-15 мин не оказывало существенного влияния на амплитуду ТПСП, количество пропусков или кратковременную синаптическую динамику (парный t-тест, P> 0.05 во всех случаях) (Рис. 91). В отличие от этого, применение ω-агатоксина-IVa (0.5 мкМ), специфического антагониста P/Q-типа кальциевых каналов, полностью блокировало тормозную передачу во всех соединённых парах нейронов (n = 11, в 5-ти парах влияние ω- агатоксина-IVa было испытано после применения ω-конотоксина-GVIa, а в 6-ти пар, эффект ω- агатоксина-IVa был протестирован независимо). После применения ω- агатоксина-IVa, амплитуда ТПСП падала экспоненциально до 0 мВ с постоянной времени 38 ± 2.8 с (n = 5). Тормозная синаптическая передача не восстанавливалась даже частично после 10-20 мин отмывания токсина. Воздействие ω-конотоксина-GVIa (1 мкМ) и ω-агатоксина-IVa (0.5 мкМ) на возбуждающую синаптическую передачу также было изучено в соединённых парах (пирамидная клетка → быстроразряжающийся интернейрон, n = 4, Рис. 91F и G). Применение ω-агатоксина-IVa (3 пары) приводило к значительному снижению амплитуды ВПСП (11, 13 и 31% от контроля). Воздействие ω-конотоксина-GVIa (1 пара) на амплитуду было меньше, чем в случае ω-агатоксина-IVa, но все же существенным (снижение до 47% от контроля). Так как связь между величиной пресинаптического тока кальция и выбросом нейромедиатора не линейна [456], то небольшой ток кальция через каналы отличные от P/Qтипа может способствовать освобождению медиатора, однако, в одиночку, эти каналы не могут обеспечить выброс медиатора. В то же время такие каналы могут обеспечить выброс медиатора при высокочастотной стимуляции, когда накопление остаточного кальция в пресинаптических окончаниях может быть существенным. Чтобы проверить эту возможность, пресинаптический интернейрон длительно (500 мс) деполяризовали, вызывая в нем потенциалы действия с 186 Рис. 91. Определение типа пресинаптических кальциевых каналов, участвующих в выбросе медиатора. (А) Типичный пример хода проведения эксперимента. (В) Усредненные записи ТПСП из этого эксперимента, зарегистрированные с пирамидного нейрона. (С) График, показывающий динамику ингибирования тормозной передачи после применения ωагатоксина-IVa (5 пар). (D) График, иллюстрирующий изменение амплитуд ТПСП в ходе пачки в контроле и после применения ω-конотоксина-GVIa. (E) График, суммирующий эффекты воздействия специфических блокаторов на амплитуду ТПСП. (F и G): Эффект ωагатоксина-IVa (F) и ω-конотоксина-GVIa (G) на амплитуды ВПСП. (H) Ингибирование P/Q-каналов полностью блокировало тормозную передачу даже при высоких частотах. высокой частотой, регистрацию синаптических ответов проводили в постсинаптических пирамидных нейронах (n = 2) до и после применения ω-агатоксина-IVa. В контрольных 187 условиях, высокочастотный разряд интернейронов приводил к сильной деполяризации постсинаптического пирамидного нейрона и увеличению частоты спонтанных событий, после применения ω-агатоксина-IVa, стимуляция пресинаптического интернейрона никак не влияла на постсинаптический пирамидный нейрон. Таким образом, тормозная синаптическая передача между быстроразряжающимися интернейронами и пирамидными клетками коры крысы происходит при исключительном участии P/Q-типа кальциевых каналов, N-тип каналов в этой передаче не задействован. Напротив, в возбуждающих синапсах между пирамидными клетками и интернейронами для нормальной синаптической передачи требуется участие обоих типов каналов. 7.5. Функциональное значение Выявленные в данной работе характеристики синаптических связей между пирамидными клетками и быстроразряжающимися интернейронами в префронтальной коре указывают на некоторые важные особенности функционирования данного отдела коры. Мы выявили, что вероятность синаптической связи между близкорасположенными пирамидными клетками и быстроразряжающимися интернейронами в префронтальной коре крысы достаточно велика (около 40% в нашей выборке как для тормозных, так и для возбуждающих связей), эти результаты хорошо согласуются с ранее опубликованными данными о межнейронных связях в других отделах коры [197, 333-335, 340, 341, 457]. Согласно данным разных авторов, вероятность нахождения возбуждающих связей между этими клетками может сильно различаться, так, например, в первичной зрительной коре составляет от 19% [340] до 60% [333] у крысы и даже до 88% в зрительной коре мыши [341]. Вероятность нахождения тормозных связей между близлежащими быстроразряжающимися интернейронами и пирамидными клетками обычно лежит в пределах 40-70% [333-335], однако в некоторых работах было найдено, что практически каждый быстроразряжающийся интернейрон формирует тормозные связи со всеми пирамидными клетками [336], тогда как в других вероятность нахождения тормозных связей составляла всего 16% [457]. Следует отметить, что паттерны синаптических взаимодействий различаются в разных отделах коры. Так, в зрительной коре крысы вероятность нахождения тормозной связи между интернейроном и пирамидной клеткой сильно повышается в том случае, если пирамидная клетка образует возбуждающую связь к интернейрону в данной паре [340], то есть каждая пирамидная клетка в зрительной коре получает возвратное торможение. По всей вероятности, 188 такой тип синаптической организации благоприятствует обработке быстро меняющегося потока зрительной информации. Однако такой зависимости не было выявлено в соматосенсорной коре мыши [335] и крысы [333, 336]. В нашей выборке пар нейронов из префронтальной коры, вероятность нахождения тормозной связи не зависела от наличия возбуждающей связи между этими нейронами в паре. Согласно нашим данным вероятность нахождения реципрокных синаптических соединений (16%) свидетельствует о том, что формирование тормозных и возбуждающих связей происходит независимо друг от друга (вероятность нахождения возбуждающей связи (0.4) * вероятность нахождения тормозной связи (0.4) = вероятность нахождения реципрокных связей (0.16)). Такая организация синаптических связей, возможно, благоприятствует реверберации нервных импульсов в префронтальной коре, нейронному механизму оперативной памяти. Мы также обнаружили, что в префронтальной коре свойства реципрокных синаптических связей отличаются от свойств односторонних связей. Так, амплитуда ТПСП была в 4 раза больше, а пропусков при тормозной синаптической передачи было в 8 раз меньше в парах с реципрокными связями по сравнению с парами, где была только односторонняя связь между интернейроном и пирамидной клеткой. Эти данные свидетельствуют о том, что тормозные интернейроны оказывают свое воздействие в первую очередь на те пирамидные клетки, от которых получают возбуждающие входы. Таким образом, возвратное торможение в префронтальной коре оказывается более выраженным, чем латеральное. Интересно, что в соматосенсорной коре такой закономерности не было выявлено, так у мыши амплитуда ТПСП не различалась в парах с односторонними и реципрокными связями [335]. Характеристики возбуждающих ответов в парах зависели от наличия тормозных обратных синаптических связей от интернейронов. Разница в ответах между реципрокными и односторонними связями была более выраженной, если использовалась пачечная стимуляция. Вместе взятые, эти результаты свидетельствуют о наличии особых нейронных подсетей между быстроразряжающимися интернейронами и пирамидными клетками префронтальной коры крыс. Тормозные и возбуждающие синапсы характеризовались кратковременной депрессией синаптической передачи, при этом уровень пропусков оставался невысоким. Изменения амплитуды синаптических ответов во время пачечной стимуляции определяется в основном пресинаптическими механизмами [ 458], а также динамикой концентрации кальция в пресинаптических терминалях [459]. Обычно, синапсы с низкой вероятностью выброса 189 медиатора при синаптической передаче характеризуются большим количеством пропусков и фасилитацией ответов при ритмической стимуляции, и, наоборот, синапсы с высокой вероятностью выброса медиатора характеризуются низким процентом пропусков при передаче и депрессией амплитуды постсинаптических ответов в пачке [459, 460]. Таким образом, мы предполагаем, что возбуждающие и тормозные синапсы между пирамидными клетками и корзинчатыми интернейронами характеризуются высокой вероятностью выброса медиатора. Тормозные и возбуждающие синапсы различаются по некоторым свойствам кратковременной синаптической динамики. Например, мы наблюдали большую величину депрессии и большее увеличение числа пропусков во время ритмической стимуляции в возбуждающих синапсах, чем в тормозных. Мы обнаружили ряд корреляций между характеристиками синаптической передачи для возбуждающих синапсов: 1) обратная корреляция между амплитудами первого и второго ВПСП, 2) положительная корреляция между величиной кратковременной депрессии и вероятностью пропусков при синаптической передаче и 3) обратная корреляция между CV и средним значением амплитуды ВПСП (М). Интересно, что таких корреляций не было выявлено для тормозных синапсов Отрицательная корреляция между первым и вторым постсинаптическими ответами была описана ранее в центральных синапсах с относительно низким числом релиз-сайтов (n) и с высокой вероятностью выброса медиатора (р) из-за истощения немедленно доступного пула везикул [458, 461]. Модель депрессии на основе истощения пула везикул также обеспечивает наиболее простое объяснение положительной корреляции между величиной кратковременной депрессии и вероятностью пропусков при нейротрансмиссии [458]. В синапсах с более высокой вероятностью выброса медиатора (низкой начальный процент пропусков при передаче) происходит более быстрое истощение пула везикул медиатора и, следовательно, уменьшение амплитуды ВПСП в ходе ритмической активности происходит сильнее. Большое CV при низком среднем значении амплитуды ВПСП может возникать в результате небольшого n, в частности, когда величина кванта (q) является достаточно большой, что справедливо для возбуждающих синапсов между пирамидными клетками и корзинчатыми интернейронами [399, 462]. Эти результаты показывают, что в пресинаптическом окончании возбуждающего синапса находится небольшое число релиз-сайтов, а пул везикул, непосредственно доступный для выброса, мал и быстро истощается при ритмической стимуляции. В противоположность 190 этому, в тормозном пресинаптическом окончании число релиз-сайтов и пул везикул с медиатором могут быть больше. Этот вывод хорошо согласуется с морфологическими данными. Пирамидные клетки образуют один или несколько синаптических контактов с постсинаптическими тормозными нейронами, а каждый синапс имеет один или 2-5 релизсайтов [329, 407, 410, 463]. В отличие от пирамидных нейронов, каждый корзинчатый интернейрон образуют более десяти синаптических контактов с пирамидной клеткой [464]. Пресинаптические окончания аксонов корзинчатых клеток больше по размеру, чем у пирамидных клеток и содержат больше везикул и митохондрий [186, 461, 465]. Мы выявили, что величина коэффициента вариации латентного периода ВПСП, которая отражает синхронность синаптического выброса, коррелирует со многими параметрами постсинаптических ответов. Например, низкая вариативность латентного периода ВПСП была характерна для синапсов с большой амплитудой ответов, низким коэффициентов вариации амплитуды, малым числом пропусков при нейротрансмиссии и более выраженной кратковременной депрессией при ритмической стимуляции. Все вместе эти данные указывают на наличие двух функциональных типов возбуждающих синапсов к быстроразряжающимся интернейронами. Первый тип синапсов с низким коэффициентом вариации латентного периода ВПСП ответственен за быструю и точную по времени активацию быстроразряжающихся интернейронов, в то время второй тип соединений с большей вариативностью латентного периода ВПСП за счет меньшей синаптической депрессии может быть более эффективным при ритмической стимуляции. Эти различия могут быть обусловлены различными пресинаптическими механизмами. Например, эти синапсы могут различаться по соотношению N- и P/Q-типов пресинаптических потенциалзависимых Ca2+каналов [443, 446, 459]. Синапсы, содержащие главным образом N-тип Ca2+ каналов, характеризуются более асинхронным выбросом медиатора, чем те, которые содержат основном P/Q-тип каналов [330]. N-тип Ca2+ каналов преобладает в синаптических соединениях, показывающих фасилитацию при ритмической стимуляции, а P/Q-тип каналов депрессию [443]. Свойства синапсов между пирамидными клетками и быстроразряжающимися интернейронами, описанные выше, позволяют лучше понять роль данных клеток и их взаимодействий в организации работы нейронных сетей. Так биофизические свойства мембран и быстрая кинетика ВПСП у быстроразряжающихся интернейронов не позволяет этим клеткам быть надежными временными интеграторами, поэтому чтобы достичь порога потенциала 191 действия эти клетки должны получить несколько возбуждающих входов практически одновременно [429]. Временная интеграция поэтому ограничивается очень узким временным окном, в ходе которого эффективное суммирование может произойти. Принимая во внимание существенную величину депрессии возбуждающих синаптических ответов, можно предположить, что активация интернейронов критически зависит от синхронной активности в нескольких пирамидальных клеток. Наличие эффективных взаимных связей между популяциями возбуждающих пирамидных и тормозных интернейронов считается основой для гамма-ритмов в различных нейронных сетях [346]. В модельных исследованиях показано, что циклы возбуждения и торможения в таких сетях могут существовать в течение длительного времени. Наличие сильных реципрокных взаимодействий между пирамидами и интернейронами значительно повышает способность нейронной сети к синхронных колебаниям [466]. Таким образом, полученные данные указывают, что нейронная организация префронтальной коры хорошо подходят для генерации гамма-ритма, который является одной из важнейших форм синхронизации нейронной активности в коре головного мозга при бодрствовании и играет важную роль в различных когнитивных функций, в том числе таких как оперативная память [347]. 192 Глава 8. ОСОБЕННОСТИ ДОЛГОВРЕМЕННОЙ СИНАПТИЧЕСКОЙ ПЛАСТИЧНОСТИ ПИРАМИДНЫХ КЛЕТОК ПРЕФРОНТАЛЬНОЙ КОРЫ КРЫСЫ Синаптическая пластичность является одним из наиболее важных механизмов, лежащих в основе памяти и научения, поэтому ее изучению уделяется особое внимание в нейрофизиологии. Большинство исследований синаптической пластичности проводятся на нейронах гиппокампа, тогда как изучение синаптической пластичности в коре распространено гораздо меньше. Сведений о синаптической пластичности в префронтальной коре в современной литературе относительно мало [например, 467, 468], поэтому в данной работе были изучены особенности выработки и механизмы долговременной синаптической пластичности пирамидных нейронов 2-3 слоев префронтальной коры крыс. В настоящее время для индукции долговременной синаптической потенциации (longterm potentiation – LTP) и депрессии (long-term depression – LTD) в коре используются различные протоколы. Наряду с классическими протоколами, при которых долговременная потенциация вызывается высокочастотной (тетанической) стимуляцией, а долговременная депрессия – низкочастотной стимуляцией [469], синаптическая пластичность может быть вызвана протоколами, имитирующими естественную активность нейронов. Так эффективность синаптической передачи может быть изменена путем временной корреляции активности пре- и постсинаптического нейронов (синхронизирующие протоколы). Эти протоколы основаны на хорошо известном постулате Хэбба [470], согласно которому «если аксон клетки А находится в непосредственной близости около клетки В, чтобы возбуждать её, и постоянно участвует в её активации, то в одной или обеих клетках происходят такие метаболические изменения или процессы роста, что эффективность А как одной из клеток, активирующих В, повышается». Поэтому часто эту форму клеточного обучения называют «хэббовой пластичностью», а знак пластичности при использовании синхронизирующих протоколов определяется правилом Хэбба. В своей простейшей форме, если потенциал действия в пресинаптическом нейроне предшествует на несколько миллисекунд потенциалу действия в постсинаптическом нейроне (позитивная временная задержка), то после нескольких таких сочетаний наблюдается долговременная потенциация синаптической передачи между этими нейронами. Если же постсинаптический нейрон разряжается раньше, чем пресинаптический (негативная временная задержка), то вырабатывается долговременная депрессия [471-473]. 193 Как правило, временная задержка между спайками должна быть достаточно короткой, около 15 мс для индукции долговременной синаптической потенциации и до 100 мс для индукции долговременной депрессии [428, 474]. Во многих синапсах для выработки долговременной пластичности недостаточно синхронизации индивидуальных спайков в пре- и постсинаптическом нейронах, и чаще применяется синхронизация коротких пачек разрядов в этих нейронах [428, 468, 475-477]. Точные механизмы, которые обеспечивают синаптическую пластичность в результате синхронной активности нейронов, до конца не понятны, однако предполагается, что такая пластичность зависит от динамики активации NMDA рецепторов и центробежного распространения потенциалов действия по дендритам постсинаптического нейрона [474, 478]. Правила индукции синаптической пластичности, обусловленной коррелированной активностью нейронов, существенно варьируют в разных участках мозга, а также между разными типами нейронов [478]. Выработка долговременной синаптической пластичности существенно зависит от активности модуляторных систем мозга [479-482]. В некоторых синапсах правило Хэбба может не выполняться совсем: депрессия вызывается, если спайк в пресинаптическом нейроне развивается раньше, чем в постсинаптическом. Такая форма пластичности называется «антихэббовой пластичностью». 8.1. Синаптическая пластичность во 2-3 слоях префронтальной коры, вызванная синхронизирующим протоколом, не подчиняется правилу Хэбба В данной работе исследовались механизмы и свойства синаптической пластичности вызванной коррелированной активностью пре- и постсинаптических пирамидных нейронов во 2/3 слоях префронтальной коры крысы. Активация пресинаптических входов производилась путем внеклеточной стимуляции стеклянным биполярным электродом, находящимся примерно в 50-100 мкм от записываемого пирамидного нейрона (Рис. 6А). Так как активация ГАМКергических входов может препятствовать индукции синаптической пластичности [478], то во всех экспериментах использовались антагонисты ГАМКА рецепторов (в большинстве экспериментов применяли пикротоксин, 100 мкМ). Ингибирование ГАМКергической системы приводило к понижению порога эпилептиформной активности в переживающем срезе, поэтому в эксперименте использовались вызванные ответы небольшой амплитуды, не имеющие пропусков. 194 Вызванные ВПСТ были небольшими по амплитуде (101 ± 9 пА, n = 53), им соответствовали ВПСП амплитудой 3.9 ± 0.6 мВ. Изолированные миниатюрные ВПСТ у популяции пирамидных клеток аналогичной этой составляли 17.4 ± 1.7 пА (n = 13). Учитывая, что каждый аксон в коре обычно оканчивается несколькими синапсами на пирамидной клетке [205, 444], то число активируемых аксонов в данных экспериментах должно быть относительно небольшим. В предварительных экспериментах было найдено, что синхронизация индивидуальных спайков с одиночными ВПСП не вызывает синаптической пластичности, поэтому были взяты протоколы с использованием пачек стимулов, которые показали свою эффективность в других отделах коры. В частности, были использованы протоколы из работ Невиана и Сакманна [476] и Сьострома с соавт. [477]. Невиан и Сакманн вызывали одиночный ВПСП на пирамидном нейроне соматосенсорной коры, стимулируя пресинаптические входы, а через 10 мс вызывали короткую пачку из 3 спайков частотой 50 Гц (протокол 1 + 3; Рис. 6В). Данная процедура повторялась 50 раз с частотой 0.1 Гц. Сьостром с соавт. использовали пачки из 5 ВПСП и 5 спайков с частотой 50 Гц, при этом каждый спайк следовал за ВПСП со сдвигом в 5 мс, процедура повторялась 20 раз с частотой 0.1 Гц (протокол 5 + 5; Рис. 6С). В экспериментах, проведенных в данной работе на нейронах префронтальной коры, оба протокола приводили к небольшой, но устойчивой долговременной депрессии, в среднем амплитуда ВПСТ после индукции составляла 0.91 ± 0.05 от контрольных значений (t-тест = 2.08, р <0.05, n = 24) (Рис. 92). Так как протоколы с позитивной задержкой вызвали вместо потенциации депрессию, то были проведены дополнительные эксперименты с негативной задержкой. Синхронизирующие протоколы с негативной задержкой, в которых постсинаптический потенциал действия предшествует пресинаптической активации обычно вызывают долговременную депрессию [477, 483, 484]. В этих экспериментах использовался протокол аналогичный протоколу 1+3, но в нем 3 постсинаптических спайков предшествовали на 10 мс 1 ВПСП. Значимая синаптическая депрессия было вызвано в большинстве клеток (7 из 10), а в оставшихся клетках существенной пластичности не было выявлено. В среднем по всей выборке депрессия составила 0.87 ± 0.05 (t-test = 3.35, p <0.01, n = 10) (Рис. 93). 195 Рис. 92. Синхронизирующий протокол (STDP) с позитивной временной задержкой приводил к долговременной депрессии у пирамидных нейронов префронтальной коры. Слева пример эксперимента с регистрацией амплитуды ВПСТ, сопротивления доступа (Series R) и входного сопротивления мембраны (Input R). Справа диаграмма с усредненными результатами экспериментов (n = 24). Рис. 93. Синхронизирующий протокол с негативной временной задержкой (negSTDP) приводил к долговременной депрессии у пирамидных нейронов префронтальной коры (n = 10). Обозначения как на Рис. 92. 196 Динамика развития долговременной депрессии синаптической передачи была схожей в обоих экспериментах: она развивалась постепенно и достигала максимальных значений через 15 - 20 минут после действия индукционного протокола (Рис. 92 и Рис. 93). Таким образом, синаптическая пластичность в возбуждающих синапсах пирамидных клеток 2-3 слоя префронтальной коры нарушает правило хэббовой пластичности: депрессия вырабатывается после применения синхронизирующих протоколов как с позитивной, так и негативной временной задержкой. Согласно литературным данным аналогичные нарушения правила пластичности Хэбба наблюдаются для дистально расположенных синапсов [485-487], поэтому было исследовано, какие синапсы активируются в наших экспериментах. Известно, что временные параметры синаптического ответа значимо коррелируют с местоположением синаптического контакта: ответы синапсов, находящихся ближе у телу нейроны, характеризуются более коротким временем нарастания [205, 487]. В наших экспериментах время нарастания ВПСТ составило 1.41 ± 0.13 мс (n = 19), в контрольных экспериментах при стимуляции из 1 слоя коры и, соответственно, при активации дистальных синапсов время нарастания ВПСТ было существенно больше (3.5 ± 0.8 мс, n = 6). Кроме этого в наших экспериментах стимулирующий электрод всегда располагался во 2-3 слоях в непосредственной близости от записываемого нейрона (на расстоянии около 50 мкм), поэтому вероятность того, что задействованы дистально расположенные синапсы, невелика. Кроме того, если величина и знак синаптической пластичности зависят от месторасположения синаптического контакта, то тогда должна существовать отрицательная корреляция между временем нарастания и величиной пластичности, однако в наших экспериментах такой корреляции найдено не было (r = 0.18, n = 19, p = n.s.). Все эти факты свидетельствуют о том, что в экспериментах были активированы синапсы, расположенные проксимально. Еще одним фактором, который может оказывать воздействие на выработку потенциации, является диализ содержимого нейрона в ходе записи. Было показано, что способность к выработке долговременной потенциации теряется со временем из-за потери каких-то цитоплазматических факторов, необходимых для выработки синаптической пластичности [488]. 197 В наших экспериментах индукция пластичности проводилась в среднем через 8-12 минут после прорыва мембраны клетки, и обычно за такой срок не происходит утраты способности нейрона к выработке долговременной потенциации. Однако, чтобы исключить данный фактор, были проделаны дополнительные эксперименты по выработке долговременной потенциации с помощью высокочастотного протокола. В данном протоколе применялись 10 пачек стимулов, повторяющихся каждые 0.5 с, в каждой пачке было по 8 стимулов с частотой 100 Гц. Протокол проводился с тремя повторениями через 10 с. Стимулирующий электрод располагался так же, как в предыдущих экспериментах. Этот протокол применялся примерно через 10 минут после прорыва мембраны нейрона. В целом во всей популяции долговременная потенциация составила 1.22 ± 0.07 (n = 16). В отличие от экспериментов с синхронизацией спайков частотный протокол вызывал быстро развивающиеся синаптические изменения, максимальная величина потенциации достигалась в течение 5 минут (Рис. 94). Рис. 94. Высокочастотный протокол вызывает долговременную потенциацию синаптических ответов в префронтальной коре крысы. 8.2. Ингибирование кальцийзависимого калиевого тока, обеспечивающего медленную следовую гиперполяризацию, восстанавливает хэббову пластичность Ранее было показано, что медленная следовая гиперполяризация регулирует синаптическую возбудимость [489], повышает порог для индукции долговременной потенциации [490, 491] и изменяет временное окно для выработки долговременной потенциации с помощью синхронизирующих протоколов [492]. Медленная следовая 198 гиперполяризация избирательно уменьшает амплитуду NMDA компонента в составе ВПСП [493] и, соответственно, уменьшает кальциевый вход через NMDA каналы. Таким образом, блокада медленной следовой гиперполяризации в течение синхронизирующего протокола ведет к большей деполяризации мембраны и большему току кальция внутрь нейрона, что в свою очередь ведет к понижению порога для долговременной потенциации. Поэтому эффект блокады медленной следовой гиперполяризации был изучен в данной работе. Чтобы заблокировать медленную следовую гиперполяризацию был использован селективный блокатор UCL2077 (10 мкМ) [494]. Эффективность блокатора была протестирована в серии экспериментов, в которых медленный следовой гиперполяризационный ток вызывали деполяризацией мембраны нейрона с -60 мВ до -10 мВ в течение 250 мс. Гиперполяризационный ток регистрировали при -60, его амплитуда под действие блокатора уменьшалась примерно на 70% (9.5 ± 0.5 пА в контроле, 3.1 ± 0.2 пА при действии UCL2077, t-тест = 12.0, p <0.001, n=5 (Рис. 95). Рис. 95. Эффект UCL2077 (10 мкМ) на амплитуду медленного гиперполяризующего тока, вызванного деполяризацией мембраны нейрона на +50 мВ в течение 250 мс с -60 мВ и регистрируемого при -60 мВ. Блокада медленной следовой гиперполяризации существенно влияла на выработку синаптической пластичности синхронизирующим протоколом. Протокол с позитивной задержкой вызвал долговременную потенциацию со средним значением 1.22 ± 0.09 (t-тест = 2.46, p <0.05 n = 14). 199 Рис. 96. Синхронизирующий протокол (STDP) с позитивной временной задержкой в присутствии UCL2077 ведет к долговременной потенциации у пирамидных нейронов префронтальной коры. Дополнительно было проверено, как ингибирование медленной следовой гиперполяризации влияет на пластичность, индуцированную синхронизирующим протоколом с негативной задержкой (3 постсинаптические потенциала действия предшествовали на 10 мс одному ВПСП). Было обнаружено, что данный протокол вызывает долговременную депрессию 0.85 ± 0.06 (n = 7, t-тест = 2.45, p <0.05) (Рис. 97). Рис. 97. Синхронизирующий протокол (STDP) с негативной временной задержкой в присутствии UCL2077 ведет к долговременной депрессии. 200 Таким образом, блокада медленной следовой гиперполяризации восстановила хэббову пластичность в пирамидных нейронах префронтальной коры (Рис. 98). Рис. 98. Диаграмма, иллюстрирующая величину синаптической пластичности в контрольных условиях и в присутствии UCL2077 после синхронизирующего протокола с позитивной и негативной задержкой. 8.3. Нейромодуляторы, подавляющие медленную следовую гиперполяризацию, восстанавливают хэббову пластичность Многие нейромедиаторы и нейромодуляторы воздействуют на амплитуду медленной следовой гиперполяризации. Так активация мускариновых рецепторов, β-адренорецепторов, серотониновых, H2-гистаминовых, метаботропных глутаматных рецепторов через ряд вторичных мессенджеров ведет к блокаде медленной следовой гиперполяризации. Механизмы блокады медленной адренорецепторы следовой воздействуют гиперполяризации на следовую могут различаться, гиперполяризацию например, через β- активацию аденилатциклазы, а мускариновые рецепторы M1/M3 через протеин фосфатазу [495-502]. Поэтому в данной работе был проверен эффект 2 разных агонистов: изопротеренола (10 мкМ) – агониста β-адренорецепторов и карбахола (10 мкМ) – холинергического агониста. Оба агониста оказывали существенное воздействие на медленную следовую гиперполяризацию, при этом изопротеренол только уменьшал гиперполяризационный ток, а карбахол вызывал даже небольшой следовой деполяризующий ток (Рис. 99). 201 Рис. 99. Воздействие изопротеренола (А) и карбахола (В) на медленную следовую гиперполяризацию. Данный результат согласуется с ранее высказанным предположением, что активация мускариновых рецепторов вызывает катионный ток через неселективные TRPC каналы [503]. Так как агонист β-адренорецепторов может усиливать амплитуду возбуждающих постсинаптических ответов в пирамидных клетках [504], то эффект кратковременного применения изопротеренола (10 мин, 10 мкМ) был предварительно протестирован. Изопротеренол действительно увеличивал амплитуду ВПСТ, однако его эффект был временным и полностью исчезал в течение 15-20 минут после отмыва агониста (n=4). В дальнейшем было исследовано действие этих агонистов адренергической и холинергической систем на синаптическую пластичность, индуцированную с помощью синхронизирующих протоколов. Карбахол апплицировался в течение всего эксперимента, а изопротеренол только во время применения синхронизирующего протокола. Оба агониста – карбахол и изопротеренол значимо воздействовали на синаптическую пластичность. Протокол с позитивной задержкой индуцировал долговременную потенциацию: в присутствии изопротеренола потенциация составила 1.18 ± 0.06, n = 14, t-тест = 3.0, p = 0.01 (Рис. 100), в присутствии карбахола – 1.16 ± 0.08, t-тест = 2.1, p = 0.06, n = 12 (Рис. 101). Таким образом, один и тот же протокол в присутствии любого из двух агонистов вызывал синаптическую потенциацию, тогда как в контроле – депрессию. Недавно было показано, что активация β-адренорецепторов во время синхронизирующих протоколов может вызвать выработку долговременной потенциации независимо от того позитивная или негативная задержка применяется в протоколе. Было высказано предположение, что нейромодулятор в этом случае влияет на индукцию синаптической пластичности на более позднем этапе, чем активация NMDA рецепторов [481]. В нашем исследовании было проверено это предположение, поэтому изопротеренол был использован в экспериментах с негативной задержкой. Было обнаружено, что в этом случае 202 индуцируется долговременная депрессия, в среднем она составила 0.84±0.05 (n = 9, t-тест = 3.1, p <0.05) (Рис. 102). Рис. 100. Эффект воздействия изопротеренола на синаптическую пластичность, вызванную синхронизирующим протоколом с позитивной задержкой. Слева – пример эксперимента, справа - диаграмма с усредненными результатами экспериментов. Рис. 101. Эффект воздействия карбахола на синаптическую пластичность, вызванную синхронизирующим протоколом с позитивной задержкой. Слева – пример эксперимента, справа - диаграмма с усредненными результатами экспериментов. 203 Рис. 102. Эффект воздействия изопротеренола на синаптическую пластичность, вызванную синхронизирующим протоколом с негативной задержкой. Таким образом, эффект изопротеренола был зависим от временной синхронизации преи постсинаптических спайков и вероятнее всего именно ингибирование медленной следовой гиперполяризации влияло на синаптическую пластичность (Рис. 103). Рис. 103. Диаграмма, иллюстрирующая величину синаптической пластичности в контрольных условиях и в присутствии изопротеренола или карбахола после синхронизирующего протокола с позитивной и негативной задержкой. 8.4. Сайт экспрессии синаптической пластичности в префронтальной коре Важную роль для понимания механизмов синаптической пластичности играет определение локализации происходящих процессов. Изменения, происходящие на пре- и постсинаптической мембранах, можно определить по ряду показателей. Одним из таких показателей является соотношение амплитуд синаптических ответов при парной стимуляции. В контрольных экспериментах, где пластичность была вызвана синхронизацией с позитивной задержкой, соотношение амплитуд после индукционного протокола возросло с 0.97 ± 0.05 до 204 1.16 ± 0.06 (n = 18, парный t-тест = 5.28, p <0.001). Данные результаты свидетельствуют о том, что в клетках с долговременной синаптической депрессией происходит уменьшение вероятности выброса медиатора, то есть депрессия обусловлена пресинаптическими изменениями. Рис. 104. Изменение соотношения амплитуд при парной стимуляции после синхронизирующего протокола с позитивной задержкой. Слева – пример записи, справа – суммарная диаграмма на основе 18 опытов. Отсутствие изменений в соотношении амплитуд свидетельствует в пользу перестроек на постсинаптической мембране. Не было обнаружено изменений с соотношении амплитуд у клеток с долговременной потенциацией после частотного протокола (1.11 ± 0.13 – до частотного протокола, 1.10 ± 0.09 – после, n = 10, парный t-тест = 0.06, p >0.05) (Рис. 105). Рис. 105. Соотношение амплитуд при парной стимуляции после индукции долговременной потенциации частотным протоколом не изменяется. Слева – пример записи, справа – суммарная диаграмма на основе 10 опытов. 205 8.5. Фармакологические свойства пластичности в префронтальной коре Чтобы исследовать является ли синаптическая пластичность в префронтальной коре зависимой от активации NMDA рецепторов, был проведен ряд экспериментов с использованием высокочастотного и синхронизирующего протоколов в присутствии специфического антагониста NMDA рецепторов - D-AP5 (50 мкМ). Практически полная блокада пластичности наблюдалась при использовании любого из протоколов. В присутствии АР5 после синхронизирующего протокола среднее значение нормализованной амплитуды ВПСТ было 0.99±0.03 (n=10), после высокочастотного протокола амплитуда составила 0.97±0.05 от контроля (n=10). (Рис. 106). Рис. 106. АР5 (50 мкМ) полностью подавляет синаптическую пластичность, как при воздействии синхронизирующим протоколом (А), так и высокочастотным протоколом (В). Следует отметить, что применение антагониста NMDA рецепторов не повлияло на временные характеристики ВПСТ (постоянная времени затухания ответа в контроле = 6.1 ± 0.3 мс, n = 46, vs. 5.7 ± 0.3 мс, n = 20, при использовании антагониста t-тест = 0.76, р >0.05), что указывает на незначительный вклад NMDA рецепторов в развитие одиночных ВПСТ при -70 мВ. В то же время соотношение амплитуд ВПСТ при парной стимуляции значимо возрастает в присутствии D-AP5 (контроль: 0.98 ± 0.04, n = 46; в присутствии AP5: 1.17 ± 0.07, n = 20, tтест = 2.35, p <0.05), что свидетельствует об уменьшении вероятности выброса медиатора [458] при блокаде NMDA рецепторов. Данные результаты хорошо согласуются с ранее опубликованными данными о том, что тоническая активация пресинаптических NMDA 206 рецепторов повышает вероятность спонтанного выделение медиатора, а также усиливает вызванные ответы [505-509]. Пресинаптический сайт экспрессии долговременной депрессии предполагает наличие ретроградного мессенджера от постсинаптической клетки к пресинаптическим терминалям. На роль такого мессенджера хорошо подходят эндоканнабиноиды, участие которых было показано во многих формах хэббовой и антихэббовой пластичности в различных кортикальных областях [484, 510-512]. Нейроанатомические данные так же свидетельствуют в пользу того, что рецепторы I типа к эндоканнабиноидам (CB1) широко распространены во всей коре, однако их большая плотность отмечена в ростральных отделах коры, по сравнению с каудальными [513]. В то же время в префронтальной коре наблюдается большая плотность CB1 рецепторов в верхних слоях коры, по сравнению с глубокими слоями [514, 515]. Таким образом, участие эндоканнабиноидов в выработке долговременной депрессии весьма вероятно. Были проведены специальные эксперименты, чтобы проверить эту гипотезу. CB1 рецепторы были заблокированы с помощью селективного антагониста AM251 (1 мкМ), в экспериментах применялся синхронизирующий протокол с позитивной задержкой. При использование AM251 данный протокол практически не вызывал долговременной депрессии, а, наоборот, у многих нейронов наблюдалась выработка долговременной потенциации. В целом по всей выборке долговременная потенциация составила 1.13 ± 0.07 (Рис. 107). В присутствии антагониста CB1 рецепторов синхронизирующий протокол не повлиял на соотношение амплитуд ВПСТ при парной стимуляции (до индукции синаптической пластичности 1.13 ± 0.10, после 1.12 ± 0.08, n = 12, парный t-тест = 0.16, p >0.05), что свидетельствует в пользу постсинаптических перестроек, приводящих к долговременной потенциации. Полученные результаты свидетельствуют о том, что выявленная в контрольных экспериментах пресинаптическая антихэббова долговременная депрессия зависит от совместной активации NMDA и CB1 рецепторов (Рис. 108). Применение AM251 не влияло на пластичность, индуцированную высокочастотным протоколом. Величина долговременной потенциации была сопоставима полученной в контрольных экспериментах без использования блокатора (1.19 ± 0.06 при использовании AM251; 1.22 ± 0.07 в контроле) (Рис. 107). Не было обнаружено изменений в соотношении амплитуд ВПСТ при парной стимуляции (до высокочастотного протокола 1.02 ± 0.08 vs. после 207 0.96 ± 0.09, t-тест = 0.47, p >0.05), что согласуется с гипотезой о постсинаптическом локусе экспрессии синаптической пластичности. Рис. 107. Воздействие на AM251 синаптическую пластичность, вызванную синхронизирующим протоколом с позитивной задержкой (слева) и высокочастотным протоколом (справа). Рис. 108. Диаграммы, иллюстрирующие эффект, вызванный воздействием АР5 и АМ251 на синаптическую пластичность, индуцированную синхронизирующим (слева) и высокочастотным (справа) протоколами. Однако наши данные, подтвердив участие NMDA рецепторов в этой форме синаптической пластичности, не позволяют однозначно сказать являются ли они пре- или постсинаптическими NMDA рецепторами. Кроме того, блокада CB1 рецепторов выявила постсинаптическую долговременную потенциацию, что позволяет предположить, что пресинаптическая долговременная депрессия и постсинаптическая долговременная потенциация развиваются одновременно или альтернативно после применения одного и того же протокола. Синаптическая пластичность, индуцированная высокочастотным протоколом, не связана с активацией CB1 рецепторов. 208 8.6. Функциональное значение Проведенное гиперполяризации исследование для регуляции выявило важную долговременной роль медленной синаптической следовой пластичности в префронтальной коре, однако механизм этого явления требует дальнейшего исследования. Для активации каналов, обеспечивающих медленную следовую гиперполяризацию, требуется подъем концентрации цитозольного кальция, к тому же эти каналы являются потенциалнезависимыми. Хотя были сделаны многочисленные попытки идентифицировать, какие именно каналы определяют медленную следовую гиперполяризацию, их молекулярная природа до сих пор остается загадкой [516]. Так как их структура неизвестна, то и локализация каналов, определяющих медленную следовую гиперполяризацию, на поверхности нейрона точно не установлена. Например, даже у пирамидных нейронов гиппокампа, где эти каналы очень интенсивно изучаются, их локализация остается спорной; согласно одним данным эти каналы располагаются в основном на соме пирамид, где они по локализации и функции связаны с L-типом кальциевых каналов [517], согласно данным других исследователей – они расположены на дендритах пирамид [518-520]. Некоторые исследования показали, что медленная следовая гиперполяризация влияет на форму ВПСП, что свидетельствует о расположении данных каналов вблизи возбуждающих синапсов на дендритах [489, 493]. Медленная следовая гиперполяризация снижает приток кальция через NMDA каналы путем шунтирования ВПСП и снижения их деполяризующего действия [518], повышает порог для индукции долговременной потенциации [490, 491] и изменяет временное окно для выработки долговременной потенциации с помощью синхронизирующих протоколов [492]. Основываясь на наших результатах, что ингибирование медленной следовой гиперполяризации ведет к восстановлению хеббовой пластичности у пирамидных клеток 2-3 слоев, можно предположить, что в контрольных условиях постсинаптические потенциалы действия активируют медленную следовую гиперполяризацию, которая затем может шунтировать ВПСП и, следовательно, снижать активность постсинаптических NMDA рецепторов. Кроме того, медленная следовая гиперполяризация может уменьшать клеточную возбудимость и распространение потенциалов действия по дендритам [491, 521]. Оба эти фактора сильно уменьшают вероятность выработки постсинаптической долговременной потенциации, которая оказывается полностью замаскированной пресинаптической долговременной депрессией. Подавление медленной следовой гиперполяризации ведет к 209 увеличению NMDA тока и улучшает распространение потенциалов действия по дендритам, что, в свою очередь, способствует индукции долговременной потенциации с помощью синхронизирующих протоколов с позитивной временной задержкой. Поскольку амплитуда токов, определяющих медленную следовую гиперполяризацию, записанная с тела пирамид относительно невелика и так как синхронизирующий протокол с негативной временной задержкой после блокады данных каналов по-прежнему вызывает долговременную депрессию, то можно предположить, что каналы, обеспечивающие медленную следовую гиперполяризацию расположены близко к сайту индукции синаптической пластичности. В данном исследовании было показано, что применение агониста β-адренорецепторов изопротеренола и агониста мускариновых холинорецепторов карбахола сильно уменьшало амплитуду медленной следовой гиперполяризации и приводило к восстановлению Хеббовой пластичности у пирамидных нейронов префронтальной коры. Известно, что нейромодуляторы, такие как норадреналин и ацетилхолин, играют важную роль в нейронной пластичности [522], однако механизмы их действия полностью не изучены. Следует отметить, что их действие на клеточном уровне не ограничивается только инактивацией медленной следовой гиперполяризации. Например, активация β-адренергических и холинергических рецепторов увеличивает амплитуду потенциалов действия на дендритах, благодаря частичному ингибированию калиевого тока А-типа в дендритах [523, 524]. Следует отметить, что нарушение Хэббовой пластичности обнаружено нами только в префронтальной коре, тогда как в сенсорных областях коры (зрительной и сенсомоторной) правило Хэбба для определения знака синаптической пластичности выполнялось. Восстановление правила Хэбба в префронтальной коре происходит при блокаде медленной следовой гиперполяризации. Основываясь на полученных данных, можно предположить, что величина медленной следовой гиперполяризации - это важный регулирующий фактор, лежащий в основе механизма синаптической пластичности в пирамидных клетках префронтальной коры. Поскольку амплитуда медленной следовой гиперполяризации находится под контролем нескольких нейромодуляторных систем, то она может являться важным связующим звеном между активностью нейромодуляторных систем и успешностью обучения. 210 Глава 9. ОСОБЕННОСТИ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОЗРЕВАНИЯ ВОЗБУЖДАЮЩИХ СИНАПСОВ ПИРАМИДНЫХ КЛЕТОК ПРЕФРОНТАЛЬНОЙ КОРЫ МАКАКИ Длительный подростковой период у приматов характеризуется заметными изменениями в поведении, эмоциональной и познавательной сферах [525], происходят существенные преобразования в организации кортикальных нейронных сетей. В новой коре головного мозга человека и других приматов в этот период происходит массовая элиминация возбуждающих синапсов, в избытке сформированных в течение перинатального периода [102, 106]. В дорсолатеральной префронтальной коре обезьян сокращение числа возбуждающих синаптических контактов сопровождается уменьшением плотности дендритных шипиков, являющихся морфологическим коррелятом возбуждающих входов к пирамидным клеткам [526]. Существенные перестройки возбуждающих связей в дорсолатеральной префронтальной коре в течение подросткового возраста вносят важный вклад в нормальное функциональное созревание этого отдела мозга. Проведенные на людях исследования показали, что в подростковом возрасте происходит существенное уменьшение толщины серого вещества [527], что обычно связывают с происходящей в этот период массовой элиминацией синаптических контактов [528]. Нейропсихологические исследования в сочетании с функциональной МРТ показали, что заметное улучшение функций оперативной памяти в подростковом возрасте сопровождается увеличением вклада дорсолатеральной префронтальной коры [529, 530]. У макак вклад дорсолатеральной префронтальной коры в поведенческих тестах, задействующих оперативную память, становится полностью сформированным ближе к концу подросткового возраста [531]. Неадекватную элиминацию синапсов в подростковом возрасте считают одной из причин развития шизофрении, поскольку клинические симптомы шизофрении, в том числе нарушения оперативной памяти, как правило, возникают ближе к концу подросткового возраста или в ранней юности [20]. Избыточные синапсы, присутствующие в префронтальной коре до начала подросткового возраста, предположительно могут компенсировать дисфункцию возбуждающей синаптической передачи, обусловленную изменениями в экспрессии определенных синаптические белков [532, 533]. Чтобы понять, как сокращение числа возбуждающих синапсов в подростковом возрасте может способствовать возрастным изменениям в работе префронтальной коры, а так же при 211 определенных условиях приводить к развитию заболеваний, необходимо знать, какими функциональными свойствами обладают синапсы, подвергающиеся элиминации. Одной из возможностей является то, что элиминируются функционально незрелые синапсы. Например, на ранних стадиях развития мозга активно работающие синапсы стабилизируют, и их эффективность со временем увеличивается, в то время как незрелые и мало используемые синапсы устраняются [534-536]. В соответствии с этой гипотезой, в коре мозга мыши в подростковом возрасте преимущественно элиминируются незрелые шипики [537]. Так как функциональное созревание большинства синапсов в префронтальной коре может происходить еще до подросткового возраста, то другие факторы будут определять, каким из функционально зрелых синапсов суждено подвергнуться элиминации [538]. Для того чтобы выяснить, какая из этих двух альтернатив верна, были изучены физиологические свойства возбуждающих синапсов в префронтальной коре обезьян на разных этапах онтогенеза. 9.1. Плотность шипиков на дендритах пирамидных нейронов 3 слоя префронтальной коры макаки значительно уменьшается в возрасте от 15 до 42 месяцев В подростковом возрасте плотность шипиков по всей длине дендритов пирамидных нейронов 3 слоя префронтальной коры макак значительно уменьшается [526], аналогично происходит элиминация возбуждающих синапсов в других слоях [102, 103]. В отличие от плотности шипиков размер тела пирамидных клеток и длина их дендритов в 3 месяца уже близки к таковым показателям взрослых животных, а в 15 месяцев полностью им идентичны [526]. Отсутствие изменений в линейных размерах пирамидных клеток 3 слоя коры позволяет предположить, что сокращение общего числа возбуждающих синаптических входов в подростковом возрасте коррелирует со снижением плотности шипиков. Чтобы убедиться, что снижение плотности шипиков, действительно наблюдается в изучаемой выборке, была определена плотность шипиков на дистальных участках дендритов 3 слоя пирамидных клеток, которые были заполнены биоцитином во время проведения электрофизиологических записей (Рис. 109А). Шипики в дистальных отделах апикальных дендритов пирамидных нейронов 3-го слоя были разнообразны по морфологии (Рис. 109В). Однако, при использовании только световой микроскопии, надежно охарактеризовать морфологию отдельных шипиков было невозможно. Поэтому плотность шипиков измерялась независимо от их морфологического 212 типа (Рис. 109С). Средняя плотность шипиков у 42-месячных макак была ниже на 17% по сравнению с 15-месячными животными (t-тест, p <0.05. Рис. 109D). Рис. 109. Анализ плотности шипиков на дендритах пирамидных нейронов обезьяны. (А) Типичный пример пирамидного нейрона, заполненного биоцитином во время электрофизиологического эксперимента. (В) Микрофотография участка апикального дендрита пирамидного нейрона 3-го слоя. (С) Реконструкция дендрита, показанного на рисунке B. (D) Гистограмма, иллюстрирующая среднюю плотность шипиков у животных разного возраста (t-тест, p <0.05). 213 Ранее было показано, что к концу подросткового возраста плотность шипиков снижается в среднем на 40-50% [526]. Однако, степень элиминации шипиков зависит от участка дендрита. Например, на апикальных пучках дендритов плотность шипиков уменьшается на ~15% в период между 18 и 32 месяцами [526]. Таким образом, обнаруженное нами 17%-ное снижение плотности шипиков на апикальных дендритах нейронов префронтальной коры между 15 и 42 месяцами возраста полностью соответствует возрастным изменениям, описанным в предыдущих исследованиях. 9.2. Функциональное созревание глутаматергической передачи в префронтальной коре макаки в возрасте от 3 до 84 месяцев: постсинаптические изменения В коре мозга новорожденных крыс функционально незрелые глутаматергические синапсы уже содержат NMDA рецепторы, но в них мало или полностью отсутствуют АМРА рецепторы, поэтому при потенциале покоя эти синапсы отвечают слабо или «молчат», однако отвечают при деполяризации мембраны нейрона [539]. Созревание возбуждающих глутаматергических синапсов сопровождается появлением АМРА рецепторов в постсинаптической мембране [540-543], соответственно, уменьшается доля синапсов с низким представительством АМРА рецепторов [544, 545]. Чтобы определить, увеличивается ли относительный вклад АМРА рецепторов в суммарный ВПСТ у пирамидных нейронов во время созревания префронтальной коры макаки, было определено соотношение вкладов АМРА и NMDA рецепторов в суммарный ВПСТ, вызванный внеклеточной стимуляцией. Для этого ВПСТ вызывали при мембранном потенциале -80 мВ и +40 мВ. Регистрацию АМРА компонента проводили по пику ВПСТ при -80 мВ, а регистрацию NMDA компонента при +40 мВ через 10 мс после стимуляции. В это время вклад АМРА рецепторов был незначительным. Для усреднения использовалось не менее 20 ответов при каждом значении потенциала. На Рис. 110А показаны примеры записей ВПСТ пирамидных нейронов 3- и 15-месячных животных. Соотношение вкладов АМРА/NMDA рецепторов в суммарный ВПСТ значительно возрастает с 3 до 15 месяцев, но в дальнейшем это соотношение не изменяется (Рис. 110B). Увеличение вклада АМРА рецепторов свидетельствует о значительном снижении доли функционально незрелых синапсов в возрасте от 3 до 15 месяцев. 214 Рис. 110. Соотношение вкладов АМРА/NMDA рецепторов в суммарный ВПСТ. (А) Примеры регистраций ВПСТ от пирамидных нейронов 3- и 15-месячных животных. (В) Соотношение вкладов АМРА/NMDA рецепторов в разном возрасте (разными буквами отмечены различающиеся значения) В ходе раннего постнатального развития у крыс уменьшается постоянная времени спада (τ) ВПСТ, обусловленных активацией NMDA рецепторов. Это объясняется сменой субъединичного состава NMDA рецепторов, которое происходит по мере созревания синапсов [546]. В данном исследовании были измерены характеристики спада ВПСТ, вызванных активацией NMDA рецепторов пирамидных нейронов в срезах, полученных из мозга обезьян разного возраста (от 3 до 84 месяцев). Для фармакологической изоляции NMDA компонента ВПСТ использовались блокаторы АМРА рецепторов CNQX (10 мкМ) и ГАМКА рецепторов бикукуллин (10 мкМ). На Рис. 111А показаны типичные примеры регистрации ВПСТ, нисходящая часть ВПСТ аппроксимирована экспоненциальной функцией. Обнаружено, что τ ВПСТ уменьшается в возрасте от 3 до 15 месяцев. После 15-го месяца τ больше не изменяется. Длительность восходящей фазы ВПСТ оставалась неизменной. Эти результаты свидетельствуют о функциональном созревании постсинаптических глутаматергических синапсов на пирамидных клетках 3-го слоя в возрасте от 3 до 15 месяцев. 215 Рис. 111. Кинетика NMDA компонента ВПСТ изменяется в возрасте от 3- до 15-ти месяцев. (А) Типичные примеры регистраций NMDA компонента ВПСТ в присутствии блокаторов AMPA и ГАМКА рецепторов. (B) Постоянная времени спада ВПСТ (τ) больше у животных 3-х месяцев (однофакторный дисперсионный анализ F3, 103 = 9.39, p=0.0002). Ускорение кинетики NMDA компонента ВПСТ может вести к переоценке соотношения АМРА/NMDA рецепторов у взрослых животных, так как вклад NMDA компонента при мембранном потенциале +40 мВ может быть недооценен. Если это предположение справедливо, то АМРА/NMDA соотношение и постоянная времени спада NMDA компонента ВПСТ должны быть обратно пропорциональны. Чтобы проверить это предположение, был рассчитан коэффициент корреляции между этими параметрами. Как показано на Рис. 112, нами не выявлено корреляции между соотношением АМРА/NMDA вкладом и постоянной времени спада NMDA ВПСТ (r = -0.11, p = 0.57). Несколько факторов могут способствовать уменьшению постоянной времени спада NMDA компонента ВПСТ в процессе развития. Например, структурные изменения синапсов [547] могут сократить продолжительность нахождения глутамата в синаптической щели, путем изменения кинетики секреции глутамата в синаптическую щель или скорости клиренса [548550]. Изменение времени присутствия высокой концентрации глутамата в синаптической щели не должно изменять активацию синаптических NMDA рецепторов [551]. Тем не менее, форма NMDA компонента ВПСТ может быть отчасти опосредована внесинаптическими NMDA рецепторами [552, 553], активация которых зависит от продолжительности присутствия высокой концентрации глутамата в синаптической щели [554, 555]. 216 Рис. 112. Диаграмма рассеяния между соотношением вкладов АМРА/NMDA рецепторов и постоянной времени спада NMDA компонента ВПСТ (белые кружки – пирамидные нейроны 3-месячных животных, светло-серые – 15-месячных, темно-серые – 42 -месячных, черные – 84-месячных животных). Корреляция между этими параметрами отсутствует. Если уменьшение постоянной времени спада NMDA компонента ВПСТ связано с уменьшением времени присутствия высокой концентрации глутамата в синаптической щели, то и постоянная времени спада АМРА ВПСТ также может сократиться [547, 549]. Чтобы проверить это, была исследована кинетика спада АМРА компонента ВПСТ (Рис. 113). Рис. 113. Типичные примеры регистраций AMPA компонента ВПСТ в присутствии блокаторов NMDA и ГАМКА рецепторов. Постоянная времени спада AMPA ВПСТ (τ) не отличается у животных разного возраста (однофакторный дисперсионный анализ F3, 30 = 0.40, p=0.75). 217 Было обнаружено, что постоянная времени спада АМРА ВПСТ не различается между возрастными группами, даже между теми возрастными группами, где наблюдалось значительное уменьшение τ NMDA компонента ВПСТ. Эти результаты показывают, что изменение скорости спада ВПСТ является специфическим для NMDA компонента. Рис. 114. Воздействие ифенпродила на NMDA компонент ВПСТ. (А) Типичный пример воздействия ифенпродила (10 мкМ) на амплитуду NMDA компонента ВПСТ. (В) Диаграмма, показывающая эффект ифенпродила на амплитуду NMDA ВПСТ в разных возрастных группах. Эффект наиболее выражен у трехмесячных животных (однофакторный дисперсионный анализ F2,26 = 5.84, P = 0.008). (C) Диаграмма, показывающая эффект воздействия ифенпродила на τ NMDA компонента ВПСТ в разных возрастных группах. Значимый эффект выявлен только у трехмесячных животных. Разными буквами отмечены различающиеся значения. 218 Важным фактором, регулирующим изменение кинетики NMDA компонента ВПСТ в гиппокампе и неокортексе крыс в ходе постнатального развития, является смена субъединичного состава рецепторного комплекса NMDA. На ранних этапах развития преобладают NMDA-рецепторы с NR2B субъединицей, которая и определяет большую продолжительность ВПСТ. И наоборот, NMDA-рецепторы, содержащие NR2A субъединицу, преобладают в зрелой коре [556-558] и обеспечивают более быстрые NMDA ВПСТ [546, 559561]. Чтобы установить, связано ли уменьшение продолжительности NMDA компонента ВПСТ с уменьшением вклада NR2B субъединиц, было изучено действие ифенпродила, селективного антагониста NMDA-рецепторов, содержащих NR2B субъединицу [562]. Применение ифенпродила (10 мкМ) значительно уменьшало амплитуду NMDA компонента ВПСТ у животных всех возрастных групп (Рис. 114А). Тем не менее, эффект ифенпродила был сильнее выражен в опытах на пирамидных нейронах трехмесячных животных (Рис. 114B). Кроме того, у трехмесячных животных ифенпродил снижал продолжительность NMDA компонента ВПСТ (Рис. 114С). Полученные результаты позволяют предположить, что уменьшение продолжительности NMDA компонента ВПСТ во время постнатального развития обезьян по крайней мере отчасти происходит из-за снижения доли NMDA рецепторов, содержащих NR2B субъединицу. 9.3. Функциональное созревание глутаматергической передачи в коре макаки: пресинаптические изменения Полученные результаты показывают, что возбуждающие глутаматергические входы к пирамидным нейронам у 3-месячных животных содержат относительно низкую долю АМРА рецепторов (Рис. 110 и Рис. 111). Незрелые синапсы с низким содержанием АМРА рецепторов обычно имеют низкий уровень пропусков [563] и более высокую вероятность выброса медиаторы, чем зрелые синапсы с высокой долей АМРА рецепторов [564]. Созревание пресинаптического отдела, как правило, связано с уменьшением вероятности выброса медиатора [565-568]. Таким образом, чтобы сравнить степень зрелости пресинаптических отделов необходимо сравнить вероятности выброса медиатора в разные возрастные периоды. 219 Для этого была определена скорость блока NMDA компонента ВПСТ селективным, необратимо связывающимся, каналоблокатором MK801 [569]. Так как для блокады канала NMDA рецептора необходим переход его в активированное состояние, то синапсы с более высокой вероятностью выброса медиатора при одинаковой частоте стимуляции будут заблокированы быстрее [570]. Амплитуда NMDA компонента ВПСТ регистрировалась в пирамидных клетках 3-го слоя префронтальной коры обезьян. Внеклеточная стимуляция проводилась в присутствии 25 мкМ MK801 (Рис. 115). Снижение амплитуды ВПСТ лучше описывается двухэкспоненциальными, чем моноэкспоненциальными функциями во всех возрастных группах. Это позволяет предположить, что существует как минимум две субпопуляции синапсов с различными вероятностями выброса медиатора (Рис. 116). Рис. 115. Схема экспериментального протокола для определения скорости блокады NMDA ВПСТ с помощью МК801. 220 Рис. 116. Кинетика блока NMDA компонента ВПСТ с помощью каналоблокатора МК801 в разных возрастных группах описывается двойной экспоненциальной функцией (слева). Справа показано изменение tау F, постоянной времени быстрого экспоненциального спада. Различающиеся столбцы обозначены разными буквами (однофакторный дисперсионный анализ F3,57 = 3.84, P = 0.002). Начальная скорость блока ВПСТ была максимальна у нейронов 3-месячных животных, тогда как позднее скорость блока ВПСТ в разных возрастных группах совпадала (Рис. 116). Результаты аппроксимации кинетики блока двухэкспоненциальными функциями показывают, что только постоянная времени быстрого экспоненциального спада (tау F) была значительно короче в нейронах 3-месячных животным, чем в нейронах других возрастных групп. Остальных параметры аппроксимации статистически не различались (Таблица 20). Таким образом, полученные данные показывают, что у 3-месячных животных есть субпопуляции синапсов с более высокой вероятностью выброса медиатора, чем у животных других возрастных групп. Соответственно это позволяет предположить, что доля синаптических входов с незрелыми пресинаптическими свойствами уменьшается еще в подростковом возрасте, в период между 3 и 15 месяцами. 221 Таблица 20. Временные параметры блока NMDA компонента ВПСТ, вызванного МК801 у разных возрастных групп животных* 3 месяца (n = 15 месяцев (n 42 месяца (n 84 месяца 19) = 17) = 15) (n = 10) FB 0.45 ± 0.05 0.49 ± 0.07 0.37 ± 0.04 tau F 16.4 ± 4.1 38.9 ± 11.1 SB 0.56 ± 0.04 tau S 463 ± 81 Параметр F p 0.52 ± 0.14 0.45 0.72 37.6 ± 8.8 56.9 ± 19.8 3.84 <0.01 0.48 ± 0.07 0.60 ± 0.05 0.46 ± 0.15 0.71 0.55 1386 ± 1340 642 ± 158 609 ± 478 1.69 0.17 * Для каждой возрастной группы кинетика блока NMDA компонента ВПСТ, вызванного применением МК801, была аппроксимирована с помощью двойной экспоненциальной функции: 𝐸(𝑡) = 𝐹𝐵 × 𝑒 −𝑡⁄𝑡𝑎𝑢 𝐹 + 𝑆𝐵 × 𝑒 −𝑡⁄𝑡𝑎𝑢 𝑆 , где E – амплитуда NMDA компонента ВПСТ, t – время с начала стимуляции в присутствии MK801 Скорость блокады NMDA ВПСТ может зависеть не только от вероятности выброса медиатора, но и от того, насколько эффективно MK801 связывается и блокирует NMDAканалы [570, 571]. Эффективность блокады NMDA-каналов при действии MK801 может различаться у нейронов животных различных возрастных групп. Поскольку в данной работе использовалась насыщающая концентрация MK801 (25 мкМ), то возрастные различия в сродстве NMDA-каналов к MK801 вряд ли играют роль в этом случае. Чтобы исключить возможность того, что и другие факторы определяют различия в скорости блокады NMDAканалов, было исследовано действие MK801 на время спада ВПСТ. Увеличение скорости спада NMDA ВПСТ при действии MK801 показывает долю каналов, заблокированных при выбросе глутамата [570, 571], так как MK801 блокирует NMDA-каналы не только на пике ВПСТ, но и во время спада [572]. Чтобы определить, как изменяется эффективность блокады NMDA 222 рецепторов у разных возрастных групп, было протестировано действие MK801 на время спада NMDA ВПСТ в нейронах 3-, 15- и 42-месячных животных. Было обнаружено, что MK801 (25 мкМ) значительно ускоряет постоянную времени спада NMDA компонента ВПСТ. Для каждого нейрона, постоянную времени спада рассчитывали на основе усредненных последних 5 регистраций NMDA ВПСТ до применения MK801, а также на основе первых 5 регистраций NMDA ВПСТ сразу после возобновления стимуляции в присутствии MK801 (3 месяца: контроль - 84 ± 30 мс, в присутствии MK801 - 47 ± 24 мс, n=10 клеток; 15 месяцев: контроль - 49 ± 9 мс, в присутствии MK801 - 30 ± 15 мс, n=10 клеток; 42 месяца: контроль - 63 ± 12 мс, в присутствии MK801 - 48 ± 30 мс, n = 9 клеток). Двухфакторный дисперсионный анализ выявляет значительное влияние MK801 (F = 18.6, p <0.001) и возраста (F = 7.27, p <0.01), но отсутствие значимого взаимодействия между эффектами MK801 и возраста (F = 1.03, p = 0.36). Полученные результаты показывают, что эффективность блокирования NMDA-каналов, вызванного МК801 у разных возрастных групп, не различается существенно. Это свидетельствует, что различие в вероятности выброса медиатора является наиболее значимым фактором более быстрой кинетики блока NMDA ВПСТ в нейронах 3-месячных животных. 9.4. Функциональные значение выявленных изменений в работе возбуждающих синапсов префронтальной коры макаки в ходе постнатального развития Увеличение соотношения AMPA/NMDA рецепторов при синаптической передаче, обнаруженное в данном исследовании, обычно связывают с процессами постсинаптического созревания [541, 573-576]. Увеличение вклада AMPA рецепторов может происходить как за счет увеличения доли AMPA рецепторов, так и за счет уменьшения доли NMDA рецепторов. АМРА/NMDA соотношение увеличивается за счет роста AMPA ответа, тогда как вклад NMDA компонента ответа не изменяется в процессе онтогенетического развития синапсов покрышки у лягушки [574] и во время зависимого от активности созревания таламокортикальных синапсов [575]. Напротив, в обонятельной коре крыс АМРА/NMDA соотношение увеличивается в основном за счет подавления NMDA компонента [576]. За счет чего увеличивается относительный вклад АМРА компонента (увеличения числа AMPA рецепторов или 223 сокращения числа NMDA рецепторов) в процессе развития в коре макак еще предстоит определить. Было показано, что в синапсах гиппокампа новорожденных крыс при повторном возбуждении пресинаптической клетки происходит быстрое удаление АМРА-рецепторов из постсинаптической мембраны [577]. В данной работе не изучалось специально происходит ли уменьшение числа АМРА рецепторов в ходе эксперимента, которое могло бы объяснить более низкое соотношение АМРА / NMDA токов в нейронах 3-месячных животных. Тем не менее, амплитуда АМРА компонента ВПСТ обычно оставалась стабильной при стимуляции с частотой 0.1 Гц. Было обнаружено, что синапсы 3-месячных животных не только показывают наиболее низкое соотношение АМРА / NMDA токов, но и более медленную кинетику NMDA ВПСТ, что обусловлено иным субъединичным составом NMDA рецепторов, с преобладанием NR2B субъединиц (результаты опытов с применением ифенпродила). Эти результаты согласуются с последними данными о том, что незрелые синапсы с низким содержанием рецепторов АМРА содержат только NR2B подтип NMDA рецепторов и при созревании происходит встраивание дополнительных синаптических АМРА рецепторов и NMDA рецепторов, содержащих NR2A субъединицы [578]. Преобладание NMDA-рецепторов NR2B подтипа способствует индукции синаптической пластичности (как долговременной потенциации, так и депрессии) благодаря специфическим свойствам этого подтипа рецепторов, образующего более эффективные ассоциации с Ca2+/кальмодулин-протеинкиназой II [579]. Таким образом, снижение доли NR2B подтипа NMDA рецепторов при созревании ведет к относительному снижению пластичности синапсов в коре головного мозга взрослых приматов. Тем не менее, полученные нами данные свидетельствуют о том, что NR2B подтип NMDA рецепторов продолжает присутствовать в синапсах взрослых животных. Это согласуются с данными, полученными путем мРНК гибридизации [580]. На ранних этапах постнатального развития, только активные синапсы усиливаются и стабилизируются, тогда как незадействованные синапсы остаются слабыми и незрелыми и впоследствии элиминируются [536]. В коре головного мозга мыши значительная доля морфологически незрелых синапсов устраняется в подростковом возрасте [537, 581], таким образом у грызунов аналогичные механизмы элиминации синапсов действуют на ранних стадиях развития и в подростковом возрасте. Подростковый возраст составляет примерно одну 224 и ту же долю от общей продолжительности жизни у млекопитающих [582], однако продолжительность жизни приматов значительно дольше, чем грызунов. Поэтому, если аналогичные механизмы лежат в основе элиминации синапсов как на ранних стадиях развития приматов, так и в подростковом возрасте, то эти механизмы должны оставаться активными в течение чрезвычайно длительного времени. Например, подростковый возраст макак начинается примерно в 2-3 года [107]. Полученные данные свидетельствуют о том, что большинство синапсов полностью созревают к подростковому возрасту и, таким образом, у приматов в подростковом возрасте скорее всего элиминируются уже созревшие синапсы, в отличие от грызунов. Не исключено, однако, что синапсы устраняемые в подростковом возрасте являются незрелыми по ряду молекулярных или ультраструктурных характеристик, которые не отражены в функциональных свойствах, исследовавшихся в данной работе. Проведенные эксперименты не позволяют непосредственно определить, связаны ли изменения в функциональных свойствах возбуждающих синапсов в возрасте от 3 до 15 месяцев с созреванием одних и тех же синапсов или их заменой. Ранее было показано, что никаких изменений плотности синапсов в слое 3 дорсолатеральной префронтальной коры обезьян в возрасте от 3 до 15 месяцев не происходит [103, 526], однако нельзя исключить, что функционально незрелые синапсы элиминируются и заменяются вновь возникающими синапсами, обеспечивающими поддержания плотности синапсов постоянной. В зрелом возрасте, когда плотность синапсов практически не изменяется, большинство шипиков сохраняется продолжительное время и лишь небольшая их часть элиминируется или возникает вновь на дендритах пирамидных клеток в коре головного мозга мыши [537, 581, 583-585]. Тем не менее, вновь возникающие шипики могут образовывать синапсы с аксонными бутонами, демонстрируя, что синаптогенез происходит и в коре головного мозга взрослых мышей [585, 586]. Недавнее исследование показывает, что синаптогенез в коре головного мозга приматов активно продолжается на протяжении всей жизни [587]. Таким образом, более высокая скорость элиминации синапсов, чем их возникновения ведет к снижению числа синапсов в подростковом возрасте у приматов. С другой стороны, если скорости этих двух процессов сбалансированы, то плотность синапсов не изменяется, как, например, в коре головного мозга взрослых приматов, однако скорость смены синапсов может быть удивительно высокой - около 7% в неделю [587]. Проведенные эксперименты показали, что возбуждающие синапсы у 3-месячных животных являются относительно незрелыми. Известно, что в этот возрастной период 225 синаптогенез еще продолжается быстрыми темпами, и многие вновь образованные синапсы возникают на дендритах пирамидных клеток 3-го слоя [102, 103, 526]. В совокупности, наши результаты и данные предыдущих анатомических исследований показывают, что в этом возрасте у приматов идет функциональное созревание как отдельных синапсов, так и нейронных сетей в целом, что является связанными между собой процессами. Например, формирование колонок глазодоминантности, идет благодаря упрочению одних синапсов и элиминации других синапсов [588], этот процесс наблюдается в зрительной коре обезьян в течение первых 12 недель после рождения [589, 590]. Этот период полностью совпадает с периодом активного синаптогенеза в слое 4 зрительной коры обезьяны [104]. Наши данные и результаты предыдущих исследований показывают, что созревание возбуждающей синаптической передачи в префронтальной коре приматов происходит до подросткового возраста (2-3 лет), однако реорганизация возбуждающих связей в подростковом возрасте происходит через механизмы, которые, не зависят от созревания отдельных синапсов, так как функциональное созревание большинства синапсов происходит на более ранних этапах индивидуального развития. 226 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Дорсолатеральная префронтальная кора играет ключевую роль в сложных когнитивных функциях. Одним из базовых механизмов реализации этих функций является постоянно поддерживаемая спайковая активность нейронов префронтальной коры после действия стимулов, что позволяет удержать в оперативной памяти необходимую информацию для правильного выполнения задачи. Проведенная экспериментальная работа выявила целый ряд важных нейрофизиологических особенностей организации префронтальной коры, которые обеспечивают ее особую функциональную роль. Одной из таких особенностей являются специфические паттерны ритмической активности пирамидных клеток при действии длительного деполяризующего тока. Так, в изученной популяции пирамидных клеток коры обезьяны мы не наблюдали изменений величины порога потенциалов действия и уменьшения амплитуды ответов при ритмической активности, хотя такие изменения описаны в литературе для пирамидных клеток из других областей коры. Также в префронтальной коре обезьяны мы не обнаружили пирамидных клеток с быстрой частотной адаптацией, которые отвечают только на включение деполяризующего тока 2-10 потенциалами действия, описанных в других корковых отделах. Напротив, в префронтальной коре у всех электрофизиологических классов пирамидных клеток частота потенциалов действия оставалась относительно стабильной после короткого периода частотной адаптации: у низкопороговых клеток и регулярноразряжающихся пирамидных клеток с высоким входным сопротивлением частотная адаптация происходила в первые 100200 мс после начала импульса тока (3-6 начальных потенциала действия), а у регулярноразряжающихся клеток с низким входным сопротивлением и клеток промежуточного типа частотная адаптация происходила еще быстрее. Таким образом, мембранные свойства пирамидных клеток префронтальной коры обеспечивают возможность рециркуляции нервных импульсов. Способствовать рециркуляции нервных импульсов может особая организация нейронных сетей в префронтальной коре. В ходе данного исследования мы выявили в префронтальной коре крысы особый паттерн синаптического взаимодействия между пирамидными клетками и быстроразряжающимися корзинчатыми интернейронами, отличный от описанного для сенсорных областей коры. В нашей выборке пар нейронов, регистрируемых одновременно, вероятность нахождения тормозной связи не зависела от наличия 227 возбуждающей связи между этими нейронами в паре. В зрительной же коре вероятность нахождения тормозной связи между интернейроном и пирамидной клеткой сильно повышается в том случае, если пирамидная клетка образует возбуждающую связь к интернейрону в данной паре, то есть каждая пирамидная клетка в зрительной коре получает возвратное торможение. Мы также обнаружили, что в префронтальной коре свойства реципрокных синаптических связей отличаются от свойств односторонних связей. Так, амплитуда ответов была больше, а пропусков при синаптической передачи было меньше в парах с реципрокными связями по сравнению с парами, где была только односторонняя связь нейронами. Разница в ответах между реципрокными и односторонними связями была более выраженной, если использовалась пачечная стимуляция. Вместе взятые, эти результаты свидетельствуют о наличии особых нейронных подсетей между быстроразряжающимися интернейронами и пирамидными клетками префронтальной коры крыс. Такая организация синаптических связей, возможно, благоприятствует реверберации нервных импульсов в префронтальной коре. В префронтальной коре крысы, в отличие от других корковых отделов и гиппокампа, выявлено нарушение правила Хэбба о долговременной синаптической пластичности: синхронизирующие протоколы с позитивной задержкой не вызывали долговременной потенциации. Правило Хэбба восстанавливалось в том случае, если медленная следовая гиперполяризация в пирамидных клетках подавлялась специфическими антагонистами, либо одним из нейромодуляторов. Можно предположить, что этот феномен является важной функциональной особенностью префронтальной коры, так как предотвращает избыточную синаптическую пластичность при рециркуляции нервных импульсов, характерной для префронтальной коры. Дополнительная регуляция долговременной пластичности через нейромодуляторные системы обеспечивает тонкую настройку эффективности синаптической передачи в этой области коры. В ходе эволюции префронтальная кора значительно увеличивается в размерах, достигая наибольшего размера у приматов. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что морфофункциональная организация префронтальной коры приматов отличается от коры крысы по ряду характеристик. Мы выявили, что пирамидные клетки 2-3 слоев префронтальной коры обезьяны более разнообразны по мембранным электрофизиологическим свойствам, чем пирамидные клетки крысы. Если все пирамидные клетки поверхностных слоев коры крысы относятся к регулярноразряжающимся нейронам, то в коре макаки регулярноразряжающиеся 228 клетки составляют лишь половину от общего числа пирамидных клеток. В коре макаки также найдены низкопороговые клетки с залповой активностью (17%) и клетки с промежуточным паттерном (31%). Важно отметить, что в то время как низкопороговые клетки выказывают залпы спайковой активности независимо от силы деполяризующего стимула или их мембранного потенциала, то характер спайкового ответа клеток промежуточного типа зависит от этих двух параметров. При одних условиях эти клетки будут разряжаться регулярно, а в других условиях залпами спайковой активности. Таким образом, соотношение регулярноразряжающихся и клеток с залповой активностью может меняться в зависимости от функционального состояния и общего уровня активности в нейронных сетях коры обезьян. Наличие дополнительных классов пирамидных клеток у приматов, а также возможность модуляции свойств клеток с промежуточным паттерном может существенно расширять функциональные возможности префронтальной коры по переработке информации. Например, залпы спайковой активности могут усиливать сигнал при передаче информации по цепочке нейронов [284], могут изменять частоту передачи сигнала [285], или передавать возбуждение на определенные типы нейронов [286]. В коре приматов, по сравнению с корой крысы, выше доля наиболее высокоспециализированных ГАМКергических нейронов, таких как клетки-канделябры, формирующих аксо-аксональные синапсы с пирамидными клетками, и нейроглиаформные клетки. В коре макаки нами описан тип вертикальноориентированных корзинчатых клеток, формирующий контакты с телами многих нейронов внутри одной колонки коры, этот тип интернейронов не встречаются в коре грызунов. Эти морфологические данные свидетельствуют о более сложной организации коры приматов. Гомологичные интернейроны электрофизиологическим свойствам: обезьяны у и крысы интернейронов различаются обезьяны по больше своим входное сопротивление мембраны и меньше порог возникновения потенциала действия, чем у крысы. При пороговой стимуляции потенциал действия у клеток обезьяны генерируется с существенно меньшим латентным периодом, при надпороговой стимуляции число спайков (и их частота) при сходной силе стимуляции больше, чем у клеток крысы. Эти показатели свидетельствуют о большей возбудимости корзинчатых и нейроглиаформных клеток обезьяны. Возможно более высокая возбудимость интернейронов обезьяны по сравнению с крысой обусловлена различиями в синаптической организации у этих двух видов, так частота спонтанных возбуждающих ответов, записанных у быстроразряжающихся интернейронов 229 крысы в 8 раз выше, чем у интернейронов обезьяны. Эти электрофизиологические характеристики интернейронов обезьяны обеспечивают их более раннее вовлечение в процесс переработки информации в префронтальной коре и возможно лучшее соотношение сигнала к шуму при передаче информации. Таким образом, в данной работе выявлен целый ряд существенных нейрофизиологических особенностей организации префронтальной коры, важных для понимания механизмов ее работы, также установлено, что префронтальная кора макаки отличается по своим морфофункциональным свойствам от коры крысы, что указывает на необходимость более осторожной экстраполяции данных от грызунов к приматам, и, в конечном счете, к людям. 230 ВЫВОДЫ 1. Пирамидные клетки 2-3 слоев коры макаки по своим электрофизиологическим свойствам подразделяются на 4 класса: нейроны с регулярным паттерном и низким входным сопротивлением, нейроны с регулярным паттерном и высоким входным сопротивлением, нейроны с промежуточным паттерном, низкопороговые пирамидные нейроны. Установлено, что характер ритмической активности у пирамидных нейронов с промежуточным паттерном может изменяться в зависимости от мембранного потенциала покоя, тогда как у остальных типов он более постоянен. 2. Интернейроны префронтальной коры макаки подразделяются на 8 морфофункциональных типов на основе распределения аксонного дерева по слоям и колонкам коры, особенностям паттернов аксонной арборизации, форме терминальных окончаний аксона и расположению пресинаптических бутонов. Идентифицированы и описаны свойства клеток-канделябров, нейроглиаформных клеток, клеток Мартинотти, клеток с двойным букетом, вертикальноориентированных, малых, гнездообразных и классических корзинчатых клеток. 3. Одинаковые по морфологическому типу интернейроны префронтальной коры крысы и макаки различаются по электрофизиологическим свойствам. Большие корзинчатые клетки и нейроглиаформные клетки обезьян характеризуются большей возбудимостью, чем интернейроны крысы, что проявляется в большем входном мембранном сопротивлении и более низком пороге генерации потенциалов действия. При пороговой стимуляции потенциал действия у клеток обезьяны генерируется с меньшим латентным периодом, при надпороговой стимуляции число спайков (и их частота) при сходной силе стимуляции больше, чем у клеток крысы. 4. Возбуждающие постсинаптические ответы быстроразряжающихся интернейронов характеризуются более быстрой кинетикой и большей амплитудой, а потенциалы действия в интернейронах возникают при меньшей синаптической стимуляции, чем в пирамидных клетках как у крыс, так и у обезьян. Более легкое и раннее возбуждение интернейронов лежит в основе механизма упреждающего торможения. Показано, что быстроразряжающиеся интернейроны содержат в основном кальцийпроницаемые AMPA рецепторы, тогда как пирамидные нейроны - кальцийнепроницаемые AMPA рецепторы, поэтому фармакологическая блокада кальцийпроницаемых AMPA 231 рецепторов нарушает упреждающее торможение и ведет к растормаживанию в нейронных сетях. 5. Большинство быстроразряжающихся интернейронов и пирамидных клеток 2-3 слоев префронтальной коры синаптически связаны. Синаптические соединения между ними характеризуются высокой надежностью и эффективностью. Выявлено, что амплитуда ответов больше, а пропусков при синаптической передачи меньше в парах с реципрокными связями по сравнению с парами, где была только односторонняя связь между нейронами. 6. В префронтальной коре крысы при использовании синхронизирующих протоколов наблюдается нарушение правила Хэбба о долговременной синаптической пластичности: протоколы с негативной задержкой и позитивной задержкой вызывают долговременную депрессию. Впервые установлено, что подавление медленной следовой гиперполяризации позволяет восстановить выработку долговременной потенциации при использовании синхронизирующего протокола с позитивной задержкой. Выявлен новый механизм действия нейромодуляторов на долговременную синаптическую пластичность через ингибирование медленной следовой гиперполяризации. 7. Функциональное созревание возбуждающих синапсов пирамидных клеток префронтальной коры макак происходит до периода их массовой элиминации в подростковом возрасте. Таким образом, реорганизация возбуждающих связей в префронтальной коре в подростковом возрасте происходит через механизмы, которые, не зависят от созревания отдельных синапсов. 232 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Fuster J.M. 2008. The prefrontal cortex. Fourth Edition ed. London, Burlington, San Diego: Acadamic Press. 2. Porrino L.J., Goldman-Rakic P.S. 1982. Brainstem innervation of prefrontal and anterior cingulate cortex in the rhesus monkey revealed by retrograde transport of HRP. J Comp Neurol. 205 (1), 63-76. 3. Kievit J., Kuypers H.G. 1975. Basal forebrain and hypothalamic connection to frontal and parietal cortex in the Rhesus monkey. Science. 187 (4177), 660-2. 4. Price J.L. 2007. Definition of the orbital cortex in relation to specific connections with limbic and visceral structures and other cortical regions. Ann N Y Acad Sci. 1121, 54-71. 5. Roberts A.C., Tomic D.L., Parkinson C.H., Roeling T.A., Cutter D.J., Robbins T.W., Everitt B.J. 2007. Forebrain connectivity of the prefrontal cortex in the marmoset monkey (Callithrix jacchus): an anterograde and retrograde tracttracing study. J Comp Neurol. 502 (1), 86-112. 6. Rempel-Clower N.L., Barbas H. 1998. Topographic organization of connections between the hypothalamus and prefrontal cortex in the rhesus monkey. J Comp Neurol. 398 (3), 393-419. 7. Middleton F.A., Strick P.L. 2002. Basal-ganglia 'projections' to the prefrontal cortex of the primate. Cereb Cortex. 12 (9), 926-35. 8. Krettek J.E., Price J.L. 1974. A direct input from the amygdala to the thalamus and the cerebral cortex. Brain Res. 67 (1), 169-74. 9. Barbas H., De Olmos J. 1990. Projections from the amygdala to basoventral and mediodorsal prefrontal regions in the rhesus monkey. J Comp Neurol. 300 (4), 549-71. 10. Cavada C., Company T., Tejedor J., Cruz-Rizzolo R.J., Reinoso-Suarez F. 2000. The anatomical connections of the macaque monkey orbitofrontal cortex. A review. Cereb Cortex. 10 (3), 220-42. 11. Schwindel C.D., McNaughton B.L. 2011. Hippocampal-cortical interactions and the dynamics of memory trace reactivation. Prog Brain Res. 193, 163-77. 12. Erickson S.L., Melchitzky D.S., Lewis D.A. 2004. Subcortical afferents to the lateral mediodorsal thalamus in cynomolgus monkeys. Neuroscience. 129 (3), 675-90. 233 13. Velayos J.L., Reinoso-Suarez F. 1982. Topographic organization of the brainstem afferents to the mediodorsal thalamic nucleus. J Comp Neurol. 206 (1), 17-27. 14. Melchitzky D.S., Erickson S.L., Lewis D.A. 2006. Dopamine innervation of the monkey mediodorsal thalamus: Location of projection neurons and ultrastructural characteristics of axon terminals. Neuroscience. 143 (4), 1021-30. 15. Jernigan T.L., Trauner D.A., Hesselink J.R., Tallal P.A. 1991. Maturation of human cerebrum observed in vivo during adolescence. Brain. 114 ( Pt 5), 203749. 16. Paus T. 2005. Mapping brain maturation and cognitive development during adolescence. Trends Cogn Sci. 9 (2), 60-8. 17. Bunge S.A., Wright S.B. 2007. Neurodevelopmental changes in working memory and cognitive control. Curr Opin Neurobiol. 17 (2), 243-50. 18. White T., Su S., Schmidt M., Kao C.Y., Sapiro G. 2010. The development of gyrification in childhood and adolescence. Brain Cogn. 72 (1), 36-45. 19. Toga A.W., Thompson P.M., Sowell E.R. 2006. Mapping brain maturation. Trends Neurosci. 29 (3), 148-59. 20. Lewis D.A., Levitt P. 2002. Schizophrenia as a disorder of neurodevelopment. Annu Rev Neurosci. 25, 409-32. 21. Puig M.V., Gulledge A.T. 2011. Serotonin and prefrontal cortex function: neurons, networks, and circuits. Mol Neurobiol. 44 (3), 449-64. 22. Douglas R.J., Martin K.A. 2004. Neuronal circuits of the neocortex. Annu Rev Neurosci. 27, 419-51. 23. Nelson S.B., Sugino K., Hempel C.M. 2006. The problem of neuronal cell types: a physiological genomics approach. Trends Neurosci. 29 (6), 339-45. 24. Butt S.J. 2005. The temporal and spatial origins of cortical interneurons predict their physiological subtype. Neuron. 48, 591-604. 25. Letinic K., Zoncu R., Rakic P. 2002. Origin of GABAergic neurons in the human neocortex. Nature. 417 (6889), 645-9. 26. Povysheva N.V., Zaitsev A.V., Kroner S., Krimer O.A., Rotaru D.C., GonzalezBurgos G., Lewis D.A., Krimer L.S. 2007. Electrophysiological differences between neurogliaform cells from monkey and rat prefrontal cortex. J Neurophysiol. 97 (2), 1030-9. 27. Preuss T.M. 1995. Do rats have prefrontal cortex - the Rose-Woolsey-Akert program reconsidered. J Cogn Neurosci. 7 (1), 1-24. 234 28. Brodmann K. 1909. Verglefcbende Lokalfsationslehre der Gmsshirnrhind. Leipzig: Barth. 29. McCulloch W.C. 1944. The functional organization of the cerebral cortex. Physiological Reviews. 24, 390-417. 30. Rose J.E., Woolsey C.N. 1949. Organization of the mammalian thalamus and its relationships to the cerebral cortex. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 1 (4), 391-403; discussion 403-4. 31. Rose J.E., Woolsey C.N. 1948. The orbitofrontal cortex and its connections with the mediodorsal nucleus in rabbit, sheep and cat. Res Publ Assoc Res Nerv Ment Dis. 27 (1 vol.), 210-32. 32. Akert K. 1964. Comparative anatomy of frontal cortex and thalamofrontal connections. In: The frontal granular cortex and behavior. Eds. Warren J.M. and Akert K. New York: McGraw-Hil. p. 372-396. 33. Cavada C., Reinoso-Suarez F. 1985. Topographical organization of the cortical afferent connections of the prefrontal cortex in the cat. J Comp Neurol. 242 (3), 293-324. 34. Kolb B. 1984. Functions of the frontal cortex of the rat: a comparative review. Brain Res. 320 (1), 65-98. 35. Leonard C.M. 1969. The prefrontal cortex of the rat. I. Cortical projection of the mediodorsal nucleus. II. Efferent connections. Brain Res. 12 (2), 321-43. 36. Bjorklund A., Divac I., Lindvall O. 1978. Regional distribution of catecholamines in monkey cerebral cortex, evidence for a dopaminergic innervation of the primate prefrontal cortex. Neurosci Lett. 7 (2-3), 115-9. 37. Brown R.M., Crane A.M., Goldman P.S. 1979. Regional distribution of monoamines in the cerebral cortex and subcortical structures of the rhesus monkey: concentrations and in vivo synthesis rates. Brain Res. 168 (1), 133-50. 38. Divac I., Bjorklund A., Lindvall O., Passingham R.E. 1978. Converging projections from the mediodorsal thalamic nucleus and mesencephalic dopaminergic neurons to the neocortex in three species. J Comp Neurol. 180 (1), 59-71. 39. Gaspar P., Stepniewska I., Kaas J.H. 1992. Topography and collateralization of the dopaminergic projections to motor and lateral prefrontal cortex in owl monkeys. J Comp Neurol. 325 (1), 1-21. 40. Williams S.M., Goldman-Rakic P.S. 1993. Characterization of the dopaminergic innervation of the primate frontal cortex using a dopamine-specific antibody. Cereb Cortex. 3 (3), 199-222. 235 41. Bianchi L. 1895. The Functions of the Frontal Lobes. Brain. 18 (4), 497-522. 42. Бехтерев В.М. 1903-07. Основы учения о функциях мозга. Vol. 1-7. СПб. 43. Павлов И.П. 1951. Полное собрание сочинений. Vol. Т. 3, кн. 2. М., Л.: Издво АН СССР. 44. Franz S.I. 1902. On the functions of the cerebrum. I. The frontal lobes in relation to the production and retention of simple sensory-motor habits. American Journal of Physiology. 8 (1), 1-22. 45. Jacobsen C.F. 1931. A study of cerebral function in learning. The frontal lobes. The Journal of Comparative Neurology. 52 (2), 271-340. 46. Miller M.H., Orbach J. 1972. Retention of spatial alternation following frontal lobe resections in stump-tailed macaques. Neuropsychologia. 10 (3), 291-8. 47. Gross C.G. 1963. Locomotor activity following lateral frontal lesions in rhesus monkeys. J Comp Physiol Psychol. 56, 232-6. 48. Oscar-Berman M. 1975. The effects of dorsolateral-frontal and ventrolateralorbitofrontal lesions on spatial discrimination learning and delayed response in two modalities. Neuropsychologia. 13 (2), 237-46. 49. Iversen S.D., Mishkin M. 1970. Perseverative interference in monkeys following selective lesions of the inferior prefrontal convexity. Exp Brain Res. 11 (4), 37686. 50. de Bruin J.P., van Oyen H.G., Van de Poll N. 1983. Behavioural changes following lesions of the orbital prefrontal cortex in male rats. Behav Brain Res. 10 (2-3), 209-32. 51. Kennard M.A. 1945. Focal Autonomic Representation in the Cortex and Its Relation to Sham Rage. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 4 (3), 295-304. 52. Myers R.E., Swett C., Miller M. 1973. Loss of social group affinity following prefrontal lesions in free-ranging macaques. Brain Res. 64, 257-69. 53. Sakurai Y., Sugimoto S. 1985. Effects of lesions of prefrontal cortex and dorsomedial thalamus on delayed go/no-go alternation in rats. Behav Brain Res. 17 (3), 213-9. 54. Treichler F.R. 1973. Effects of extensive training on object reversal by frontal monkeys. Neuropsychologia. 11 (1), 57-65. 55. Divac I., Warren J.M. 1971. Delayed response by frontal monkeys in the Nencki testing situation. Neuropsychologia. 9 (2), 209-17. 236 56. Pribram K.H., Mishkin M., Rosvold H.E., Kaplan S.J. 1952. Effects on delayedresponse performance of lesions of dorsolateral and ventromedial frontal cortex of baboons. J Comp Physiol Psychol. 45 (6), 565-75. 57. Skeen L.C., Masterton R.B. 1976. Origins of anthropoid intelligence. III. Role of prefrontal system in delayed-alternation and spatial-reversal learning in a prosimian (Galago senegalensis). Brain Behav Evol. 13 (2-3), 179-95. 58. Goldman-Rakic P.S. 1995. Cellular basis of working memory. Neuron. 14 (3), 477-85. 59. Fuster J.M., Alexander G.E. 1971. Neuron activity related to short-term memory. Science. 173 (3997), 652-4. 60. Kubota K., Niki H. 1971. Prefrontal cortical unit activity and delayed alternation performance in monkeys. J Neurophysiol. 34 (3), 337-47. 61. Kojima S., Goldman-Rakic P.S. 1982. Delay-related activity of prefrontal neurons in rhesus monkeys performing delayed response. Brain Res. 248 (1), 439. 62. Funahashi S., Bruce C.J., Goldman-Rakic P.S. 1989. Mnemonic coding of visual space in the monkey's dorsolateral prefrontal cortex. J Neurophysiol. 61 (2), 33149. 63. Constantinidis C., Goldman-Rakic P.S. 2002. Correlated discharges among putative pyramidal neurons and interneurons in the primate prefrontal cortex. J Neurophysiol. 88 (6), 3487-97. 64. Rao S.G., Williams G.V., Goldman-Rakic P.S. 1999. Isodirectional tuning of adjacent interneurons and pyramidal cells during working memory: evidence for microcolumnar organization in PFC. J Neurophysiol. 81 (4), 1903-16. 65. Rao S.G., Williams G.V., Goldman-Rakic P.S. 2000. Destruction and creation of spatial tuning by disinhibition: GABA(A) blockade of prefrontal cortical neurons engaged by working memory. J Neurosci. 20 (1), 485-94. 66. Sawaguchi T., Matsumura M., Kubota K. 1988. Delayed response deficit in monkeys by locally disturbed prefrontal neuronal activity by bicuculline. Behav Brain Res. 31 (2), 193-8. 67. Sawaguchi T., Matsumura M., Kubota K. 1989. Depth distribution of neuronal activity related to a visual reaction time task in the monkey prefrontal cortex. J Neurophysiol. 61 (2), 435-46. 68. Wilson F.A., O'Scalaidhe S.P., Goldman-Rakic P.S. 1994. Functional synergism between putative gamma-aminobutyrate-containing neurons and pyramidal neurons in prefrontal cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (9), 4009-13. 237 69. Goldman-Rakic P.S. 1996. Regional and cellular fractionation of working memory. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (24), 13473-80. 70. Abbie A.A. 1940. Cortical lamination in the Monotremata. The Journal of Comparative Neurology. 72 (3), 429-467. 71. Abbie A.A. 1942. Cortical lamination in a polyprotodont marsupial, Perameles nasuta. The Journal of Comparative Neurology. 76 (3), 509-536. 72. Sanides F. 1970. Functional architecture of motor and sensory cortices in primates in the light of a new concept of neocortex evolution. In: The Primate Brain. Eds. Noback C.R. and Montagna W. New York, NY: Appleton-CenturyCrofts. p. 137-208. 73. Поляков Г.И. 1966. О структурной организации коры лобной доли мозга в связи с ее функциональным значением. In: Лобные доли и регуляция психических процессов. Eds. Лурия А.Р. and Хомская Е.Д. М.: Изд-во Московского унив. p. 38-60. 74. Radinsky L.B. 1969. Outlines of Canid and Felid brain evolution. Annals of the New York Academy of Sciences. 167 (1), 277-288. 75. Ariens C.U., Huber G.C., Crosby F.C. 1970. The Comparative Anatomy of the Nervous System of Vertebrates Including Man. Hafner Press. 76. Hodos W. 1970. Evolutionary interpretation of neural and behavioral studies of living vertebrates. In: The Neurosciences: Second Study Program. Ed. Schmidt F.O. New York, NY: Rockefeller University Press. p. 26 – 39. 77. Campbell C.B.G. 1975. The central nervous system: its uses and limitations in assessing phylogenetic relationships. In: Phylogeny of the Primates. Eds. Luckett W.P. and Szalay F.S. New York, NY: Plenum. p. 183 – 197. 78. Uylings H.B., Groenewegen H.J., Kolb B. 2003. Do rats have a prefrontal cortex? Behav Brain Res. 146 (1-2), 3-17. 79. Leonard C.M. 1972. The connections of the dorsomedial nuclei. Brain Behav Evol. 6 (1), 524-41. 80. Groenewegen H.J. 1988. Organization of the afferent connections of the mediodorsal thalamic nucleus in the rat, related to the mediodorsal-prefrontal topography. Neuroscience. 24 (2), 379-431. 81. Beckstead R.M. 1976. Convergent thalamic and mesencephalic projections to the anterior medial cortex in the rat. J Comp Neurol. 166 (4), 403-16. 82. Divac I., Kosmal A., Bjorklund A., Lindvall O. 1978. Subcortical projections to the prefrontal cortex in the rat as revealed by the horseradish peroxidase technique. Neuroscience. 3 (9), 785-96. 238 83. Krettek J.E., Price J.L. 1977. The cortical projections of the mediodorsal nucleus and adjacent thalamic nuclei in the rat. J Comp Neurol. 171 (2), 157-91. 84. Ray J.P., Price J.L. 1992. The organization of the thalamocortical connections of the mediodorsal thalamic nucleus in the rat, related to the ventral forebrainprefrontal cortex topography. J Comp Neurol. 323 (2), 167-97. 85. Barbas H., Henion T.H., Dermon C.R. 1991. Diverse thalamic projections to the prefrontal cortex in the rhesus monkey. J Comp Neurol. 313 (1), 65-94. 86. Giguere M., Goldman-Rakic P.S. 1988. Mediodorsal nucleus: areal, laminar, and tangential distribution of afferents and efferents in the frontal lobe of rhesus monkeys. J Comp Neurol. 277 (2), 195-213. 87. Goldman-Rakic P.S., Porrino L.J. 1985. The primate mediodorsal (MD) nucleus and its projection to the frontal lobe. J Comp Neurol. 242 (4), 535-60. 88. Akert K., Hartmann-von Monakow K. 1980. Relationships of precentral premotor and prefrontal cortex to the mediodorsal and intralaminar nuclei of the monkey thalamus. Acta Neurobiol Exp (Wars). 40 (1), 7-25. 89. Kievit J., Kuypers H.G. 1977. Organization of the thalamo-cortical connexions to the frontal lobe in the rhesus monkey. Exp Brain Res. 29 (3-4), 299-322. 90. Preuss T.M., Goldman-Rakic P.S. 1991. Myelo- and cytoarchitecture of the granular frontal cortex and surrounding regions in the strepsirhine primate Galago and the anthropoid primate Macaca. J Comp Neurol. 310 (4), 429-74. 91. Markowitsch H.J., Pritzel M., Wilson M., Divac I. 1980. The prefrontal cortex of a prosimian (Galago senegalensis) defined as the cortical projection area of the thalamic mediodorsal nucleus. Neuroscience. 5 (10), 1771-9. 92. Uylings H.B., van Eden C.G. 1990. Qualitative and quantitative comparison of the prefrontal cortex in rat and in primates, including humans. Prog Brain Res. 85, 31-62. 93. van Eden C.G., Kros J.M., Uylings H.B. 1990. The development of the rat prefrontal cortex. Its size and development of connections with thalamus, spinal cord and other cortical areas. Prog Brain Res. 85, 169-83. 94. Mrzljak L., Uylings H.B., Kostovic I., Van Eden C.G. 1988. Prenatal development of neurons in the human prefrontal cortex: I. A qualitative Golgi study. J Comp Neurol. 271 (3), 355-86. 95. Juraska J.M., Fifkova E. 1979. A Golgi study of the early postnatal development of the visual cortex of the hooded rat. J Comp Neurol. 183 (2), 247-56. 96. Schade J.P., van G.W. 1961. Structural organization of the human cerebral cortex. 1. Maturation of the middle frontal gyrus. Acta Anat (Basel). 47, 74-111. 239 97. Feria-Velasco A., del Angel A.R., Gonzalez-Burgos I. 2002. Modification of dendritic development. Prog Brain Res. 136, 135-43. 98. Bock J., Gruss M., Becker S., Braun K. 2005. Experience-induced changes of dendritic spine densities in the prefrontal and sensory cortex: correlation with developmental time windows. Cereb Cortex. 15 (6), 802-8. 99. Mrzljak L., Uylings H.B.M., Van Eden C.G., Judás M. 1990. Neuronal development in human prefrontal cortex in prenatal and postnatal stages. In: The Prefrontal Cortex: Its Structure, Function and Pathology. Eds. Uylings H.B., et al. Amsterdam: Elsevier. p. 185. 100. Koenderink M.J., Uylings H.B., Mrzljak L. 1994. Postnatal maturation of the layer III pyramidal neurons in the human prefrontal cortex: a quantitative Golgi analysis. Brain Res. 653 (1-2), 173-82. 101. Fuster J.M. 2009. Cortex and memory: emergence of a new paradigm. J Cogn Neurosci. 21 (11), 2047-72. 102. Rakic P., Bourgeois J.P., Eckenhoff M.F., Zecevic N., Goldman-Rakic P.S. 1986. Concurrent overproduction of synapses in diverse regions of the primate cerebral cortex. Science. 232 (4747), 232-5. 103. Bourgeois J.P., Goldman-Rakic P.S., Rakic P. 1994. Synaptogenesis in the prefrontal cortex of rhesus monkeys. Cereb Cortex. 4 (1), 78-96. 104. Bourgeois J.P., Rakic P. 1993. Changes of synaptic density in the primary visual cortex of the macaque monkey from fetal to adult stage. J Neurosci. 13 (7), 280120. 105. Huttenlocher P.R. 1990. Morphometric study of human cerebral cortex development. Neuropsychologia. 28 (6), 517-27. 106. Huttenlocher P.R., Dabholkar A.S. 1997. Regional differences in synaptogenesis in human cerebral cortex. J Comp Neurol. 387 (2), 167-78. 107. Lewis D.A. 1997. Development of the prefrontal cortex during adolescence: insights into vulnerable neural circuits in schizophrenia. Neuropsychopharmacology. 16 (6), 385-98. 108. Fuster J.M. 2002. Frontal lobe and cognitive development. J Neurocytol. 31 (35), 373-85. 109. Yakovlev P.I. 1962. Morphological criteria of growth and maturation of the nervous system in man. Res Publ Assoc Res Nerv Ment Dis. 39, 3-46. 110. Brody B.A., Kinney H.C., Kloman A.S., Gilles F.H. 1987. Sequence of central nervous system myelination in human infancy. I. An autopsy study of myelination. J Neuropathol Exp Neurol. 46 (3), 283-301. 240 111. Gibson K.R. 1991. Myelination and behavioral development: a comparative perspective on questions of neoteny, altriciality and intelligence. In: Brain Maturation and Cognitive Development. Eds. Gibson K.R. and Petersen A.C. New York, NY: Aldine de Gruyter. p. 29 – 63. 112. Goldman-Rakic P.S., Brown R.M. 1982. Postnatal development of monoamine content and synthesis in the cerebral cortex of rhesus monkeys. Brain Res. 256 (3), 339-49. 113. Lidow M.S., Rakic P. 1992. Scheduling of monoaminergic neurotransmitter receptor expression in the primate neocortex during postnatal development. Cereb Cortex. 2 (5), 401-16. 114. Rosenberg D.R., Lewis D.A. 1995. Postnatal maturation of the dopaminergic innervation of monkey prefrontal and motor cortices: a tyrosine hydroxylase immunohistochemical analysis. J Comp Neurol. 358 (3), 383-400. 115. Salat D.H., Buckner R.L., Snyder A.Z., Greve D.N., Desikan R.S., Busa E., Morris J.C., Dale A.M., Fischl B. 2004. Thinning of the cerebral cortex in aging. Cereb Cortex. 14 (7), 721-30. 116. Van Petten C., Plante E., Davidson P.S., Kuo T.Y., Bajuscak L., Glisky E.L. 2004. Memory and executive function in older adults: relationships with temporal and prefrontal gray matter volumes and white matter hyperintensities. Neuropsychologia. 42 (10), 1313-35. 117. Duan H., Wearne S.L., Rocher A.B., Macedo A., Morrison J.H., Hof P.R. 2003. Age-related dendritic and spine changes in corticocortically projecting neurons in macaque monkeys. Cereb Cortex. 13 (9), 950-61. 118. Peters A., Sethares C. 2002. Aging and the myelinated fibers in prefrontal cortex and corpus callosum of the monkey. J Comp Neurol. 442 (3), 277-91. 119. Tisserand D.J., Pruessner J.C., Sanz Arigita E.J., van Boxtel M.P., Evans A.C., Jolles J., Uylings H.B. 2002. Regional frontal cortical volumes decrease differentially in aging: an MRI study to compare volumetric approaches and voxel-based morphometry. Neuroimage. 17 (2), 657-69. 120. Uylings H.B., de Brabander J.M. 2002. Neuronal changes in normal human aging and Alzheimer's disease. Brain Cogn. 49 (3), 268-76. 121. de Brabander J.M., Kramers R.J., Uylings H.B. 1998. Layer-specific dendritic regression of pyramidal cells with ageing in the human prefrontal cortex. Eur J Neurosci. 10 (4), 1261-9. 122. Luebke J., Barbas H., Peters A. 2010. Effects of normal aging on prefrontal area 46 in the rhesus monkey. Brain Res Rev. 62 (2), 212-32. 241 123. Luebke J.I., Amatrudo J.M. 2012. Age-related increase of sI(AHP) in prefrontal pyramidal cells of monkeys: relationship to cognition. Neurobiol Aging. 33 (6), 1085-95. 124. Саркисов С.А., Филимонов И.Н., Кононова Е.П., Преображенская И.С., Кукуев Л.А. 1955. Атлас цитоархитектоники коры большого мозга человека. Москва: Медгиз. 125. Sanides F. 1962. Die Architektonik des Menschlichen Stirnhirns. Berlin: Springer-Verlag. 126. Rajkowska G., Goldman-Rakic P.S. 1995. Cytoarchitectonic definition of prefrontal areas in the normal human cortex: II. Variability in locations of areas 9 and 46 and relationship to the Talairach Coordinate System. Cereb Cortex. 5 (4), 323-37. 127. Rajkowska G., Goldman-Rakic P.S. 1995. Cytoarchitectonic definition of prefrontal areas in the normal human cortex: I. Remapping of areas 9 and 46 using quantitative criteria. Cereb Cortex. 5 (4), 307-22. 128. Semendeferi K., Lu A., Schenker N., Damasio H. 2002. Humans and great apes share a large frontal cortex. Nat Neurosci. 5 (3), 272-6. 129. Semendeferi K., Armstrong E., Schleicher A., Zilles K., Van Hoesen G.W. 1998. Limbic frontal cortex in hominoids: a comparative study of area 13. Am J Phys Anthropol. 106 (2), 129-55. 130. Walker A.E. 1940. A cytoarchitectural study of the prefrontal area of the macaque monkey. Journal of Comparative Neurology. 73 (1), 59-86. 131. Petrides M., Tomaiuolo F., Yeterian E.H., Pandya D.N. 2012. The prefrontal cortex: comparative architectonic organization in the human and the macaque monkey brains. Cortex. 48 (1), 46-57. 132. Yeterian E.H., Pandya D.N., Tomaiuolo F., Petrides M. 2012. The cortical connectivity of the prefrontal cortex in the monkey brain. Cortex. 48 (1), 58-81. 133. Petrides M., Pandya D.N. 1999. Dorsolateral prefrontal cortex: comparative cytoarchitectonic analysis in the human and the macaque brain and corticocortical connection patterns. Eur J Neurosci. 11 (3), 1011-36. 134. Economo C.V. 1929. The cytoarchitectonics of the human cerebral cortex. London: Oxford University Press. 135. Carmichael S.T., Price J.L. 1994. Architectonic subdivision of the orbital and medial prefrontal cortex in the macaque monkey. J Comp Neurol. 346 (3), 366402. 242 136. Petrides M., Pandya D.N. 2002. Comparative cytoarchitectonic analysis of the human and the macaque ventrolateral prefrontal cortex and corticocortical connection patterns in the monkey. Eur J Neurosci. 16 (2), 291-310. 137. Goldman P.S., Nauta W.J. 1977. Columnar distribution of cortico-cortical fibers in the frontal association, limbic, and motor cortex of the developing rhesus monkey. Brain Res. 122 (3), 393-413. 138. Goldman-Rakic P.S., Schwartz M.L. 1982. Interdigitation of contralateral and ipsilateral columnar projections to frontal association cortex in primates. Science. 216 (4547), 755-7. 139. Schwartz M.L., Goldman-Rakic P.S. 1984. Callosal and intrahemispheric connectivity of the prefrontal association cortex in rhesus monkey: relation between intraparietal and principal sulcal cortex. J Comp Neurol. 226 (3), 40320. 140. Sakai M. 1985. Dendritic bundles formed by layer VI pyramidal cells in the monkey frontal association cortex. Exp Brain Res. 58 (3), 609-12. 141. Tanaka D., Goldman P.S. 1976. Silver degeneration and autoradiographic evidence for a projection from the principal sulcus to the septum in the rhesus monkey. Brain Res. 103 (3), 535-40. 142. Ray J.P., Price J.L. 1993. The organization of projections from the mediodorsal nucleus of the thalamus to orbital and medial prefrontal cortex in macaque monkeys. J Comp Neurol. 337 (1), 1-31. 143. Steriade M., Jones E.G., McCormick D. 1997. Thalamus: Organisation and function. Oxford: Elsevier. 144. Le Gros Clark W.E. 1932. The Structure and Connections of the Thalamus. Brain. 55 (3), 406-470. 145. Walker A.E. 1936. An experimental study of the thalamo-cortical projection of the macaque monkey. The Journal of Comparative Neurology. 64 (1), 1-39. 146. Barbas H., Mesulam M.M. 1985. Cortical afferent input to the principalis region of the rhesus monkey. Neuroscience. 15 (3), 619-37. 147. Pandya D.N., Yeterian E.H. 1996. Comparison of prefrontal architecture and connections. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 351 (1346), 1423-32. 148. Morecraft R.J., Geula C., Mesulam M.M. 1992. Cytoarchitecture and neural afferents of orbitofrontal cortex in the brain of the monkey. J Comp Neurol. 323 (3), 341-58. 149. Nauta W.J. 1972. Neural associations of the frontal cortex. Acta Neurobiol Exp (Wars). 32 (2), 125-40. 243 150. Porrino L.J., Crane A.M., Goldman-Rakic P.S. 1981. Direct and indirect pathways from the amygdala to the frontal lobe in rhesus monkeys. J Comp Neurol. 198 (1), 121-36. 151. Barbas H. 2007. Specialized elements of orbitofrontal cortex in primates. Ann N Y Acad Sci. 1121, 10-32. 152. Kelly R.M., Strick P.L. 2003. Cerebellar loops with motor cortex and prefrontal cortex of a nonhuman primate. J Neurosci. 23 (23), 8432-44. 153. Dum R.P., Strick P.L. 2003. An unfolded map of the cerebellar dentate nucleus and its projections to the cerebral cortex. J Neurophysiol. 89 (1), 634-9. 154. Kelly R.M., Strick P.L. 2004. Macro-architecture of basal ganglia loops with the cerebral cortex: use of rabies virus to reveal multisynaptic circuits. Prog Brain Res. 143, 449-59. 155. Lewis D.A., Campbell M.J., Foote S.L., Morrison J.H. 1986. The monoaminergic innervation of primate neocortex. Hum Neurobiol. 5 (3), 181-8. 156. Mesulam M.M. 1998. From sensation to cognition. Brain. 121 ( Pt 6), 1013-52. 157. Steriade M. 1996. Arousal: revisiting the reticular activating system. Science. 272 (5259), 225-6. 158. Arnsten A.F. 1997. Catecholamine regulation of the prefrontal cortex. J Psychopharmacol. 11 (2), 151-62. 159. Jones E.G., Powell T.P. 1970. An anatomical study of converging sensory pathways within the cerebral cortex of the monkey. Brain. 93 (4), 793-820. 160. Cavada C., Goldman-Rakic P.S. 1989. Posterior parietal cortex in rhesus monkey: II. Evidence for segregated corticocortical networks linking sensory and limbic areas with the frontal lobe. J Comp Neurol. 287 (4), 422-45. 161. Cavada C., Goldman-Rakic P.S. 1989. Posterior parietal cortex in rhesus monkey: I. Parcellation of areas based on distinctive limbic and sensory corticocortical connections. J Comp Neurol. 287 (4), 393-421. 162. Zikopoulos B., Barbas H. 2007. Circuits formultisensory integration and attentional modulation through the prefrontal cortex and the thalamic reticular nucleus in primates. Rev Neurosci. 18 (6), 417-38. 163. Mettler F.A. 1947. Extracortical connections of the primate frontal cerebral cortex; corticifugal connections. J Comp Neurol. 86 (2), 119-66. 164. Goldman P.S. 1979. Contralateral projections to the dorsal thalamus from frontal association cortex in the rhesus monkey. Brain Res. 166 (1), 166-71. 165. Siwek D.F., Pandya D.N. 1991. Prefrontal projections to the mediodorsal nucleus of the thalamus in the rhesus monkey. J Comp Neurol. 312 (4), 509-24. 244 166. Schwartz M.L., Dekker J.J., Goldman-Rakic P.S. 1991. Dual mode of corticothalamic synaptic termination in the mediodorsal nucleus of the rhesus monkey. J Comp Neurol. 309 (3), 289-304. 167. Devito J.L., Smith O.A., Jr. 1964. Subcortical Projections of the Prefrontal Lobe of the Monkey. J Comp Neurol. 123, 413-23. 168. Johnson T.N., Rosvold H.E., Mishkin M. 1968. Projections from behaviorallydefined sectors of the prefrontal cortex to the basal ganglia, septum, and diencephalon of the monkey. Exp Neurol. 21 (1), 20-34. 169. Von Bonin G., Green J.R. 1949. Connections between orbital cortex and diencephalon in the macaque. J Comp Neurol. 90 (2), 243-54. 170. Alheid G.F., Heimer L. 1996. Theories of basal forebrain organization and the "emotional motor system". Prog Brain Res. 107, 461-84. 171. Zaborszky L., Pang K., Somogyi J., Nadasdy Z., Kallo I. 1999. The basal forebrain corticopetal system revisited. Ann N Y Acad Sci. 877, 339-67. 172. Leichnetz G.R., Astruc J. 1977. The course of some prefrontal corticofugals to the pallidum, substantia innominata, and amygdaloid complex in monkeys. Exp Neurol. 54 (1), 104-9. 173. Leichnetz G.R., Astruc J. 1976. The efferent projections of the medial prefrontal cortex in the squirrel monkey (Saimiri sciureus). Brain Res. 109 (3), 455-72. 174. McGaugh J.L., Cahill L., Roozendaal B. 1996. Involvement of the amygdala in memory storage: interaction with other brain systems. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (24), 13508-14. 175. Bates J.F., Goldman-Rakic P.S. 1993. Prefrontal connections of medial motor areas in the rhesus monkey. J Comp Neurol. 336 (2), 211-28. 176. Goldman-Rakic P.S., Selemon L.D., Schwartz M.L. 1984. Dual pathways connecting the dorsolateral prefrontal cortex with the hippocampal formation and parahippocampal cortex in the rhesus monkey. Neuroscience. 12 (3), 719-43. 177. Kitai S.T., Kocsis J.D., Preston R.J., Sugimori M. 1976. Monosynaptic inputs to caudate neurons identified by intracellular injection of horseradish peroxidase. Brain Res. 109 (3), 601-6. 178. Selemon L.D., Goldman-Rakic P.S. 1985. Longitudinal topography and interdigitation of corticostriatal projections in the rhesus monkey. J Neurosci. 5 (3), 776-94. 179. Haber S.N., Kunishio K., Mizobuchi M., Lynd-Balta E. 1995. The orbital and medial prefrontal circuit through the primate basal ganglia. J Neurosci. 15 (7 Pt 1), 4851-67. 245 180. Leichnetz G.R., Astruc J. 1975. Efferent connections of the orbitofrontal cortex in the marmoset (Saguinus oedipus). Brain Res. 84 (2), 169-80. 181. Arikuni T., Watanabe K., Kubota K. 1988. Connections of area 8 with area 6 in the brain of the macaque monkey. J Comp Neurol. 277 (1), 21-40. 182. Morecraft R.J., Van Hoesen G.W. 1993. Frontal granular cortex input to the cingulate (M3), supplementary (M2) and primary (M1) motor cortices in the rhesus monkey. J Comp Neurol. 337 (4), 669-89. 183. Watanabe-Sawaguchi K., Kubota K., Arikuni T. 1991. Cytoarchitecture and intrafrontal connections of the frontal cortex of the brain of the hamadryas baboon (Papio hamadryas). J Comp Neurol. 311 (1), 108-33. 184. Бернштейн Н.А. 1990. Физиология движений и активность. М.: Наука. 185. Brown J. 1977. Mind, Brain, and Consciousness. New York, NY: Academic Press. 186. Somogyi P., Tamas G., Lujan R., Buhl E.H. 1998. Salient features of synaptic organisation in the cerebral cortex. Brain Res Brain Res Rev. 26 (2-3), 113-35. 187. Cauli B., Audinat E., Lambolez B., Angulo M.C., Ropert N., Tsuzuki K., Hestrin S., Rossier J. 1997. Molecular and physiological diversity of cortical nonpyramidal cells. J Neurosci. 17 (10), 3894-906. 188. DeFelipe J. 1997. Types of neurons, synaptic connections and chemical characteristics of cells immunoreactive for calbindin-D28K, parvalbumin and calretinin in the neocortex. J Chem Neuroanat. 14 (1), 1-19. 189. Gupta A., Wang Y., Markram H. 2000. Organizing principles for a diversity of GABAergic interneurons and synapses in the neocortex. Science. 287 (5451), 273-8. 190. Kawaguchi Y., Kubota Y. 1997. GABAergic cell subtypes and their synaptic connections in rat frontal cortex. Cereb Cortex. 7 (6), 476-486. 191. Markram H., Toledo-Rodriguez M., Wang Y., Gupta A., Silberberg G., Wu C. 2004. Interneurons of the neocortical inhibitory system. Nat Rev Neurosci. 5 (10), 793-807. 192. McBain C.J., Fisahn A. 2001. Interneurons unbound. Nat Rev Neurosci. 2 (1), 11-23. 193. Soltesz I. 2006. Diversity in the neuronal machine: order and variability in interneuronal microcircuits. Oxford, New York: Oxford University Press. 238 p. 194. Lund J.S. 1987. Local circuit neurons of macaque monkey striate cortex: I. Neurons of laminae 4C and 5A. J Comp Neurol. 257 (1), 60-92. 246 195. Wiser A.K., Callaway E.M. 1996. Contributions of individual layer 6 pyramidal neurons to local circuitry in macaque primary visual cortex. J Neurosci. 16 (8), 2724-39. 196. Zhang Z.W., Deschenes M. 1998. Projections to layer VI of the posteromedial barrel field in the rat: a reappraisal of the role of corticothalamic pathways. Cereb Cortex. 8 (5), 428-36. 197. Thomson A.M., Lamy C. 2007. Functional maps of neocortical local circuitry. Front Neurosci. 1 (1), 19-42. 198. Mercer A., West D.C., Morris O.T., Kirchhecker S., Kerkhoff J.E., Thomson A.M. 2005. Excitatory connections made by presynaptic cortico-cortical pyramidal cells in layer 6 of the neocortex. Cereb Cortex. 15 (10), 1485-96. 199. West D.C., Mercer A., Kirchhecker S., Morris O.T., Thomson A.M. 2006. Layer 6 cortico-thalamic pyramidal cells preferentially innervate interneurons and generate facilitating EPSPs. Cereb Cortex. 16 (2), 200-11. 200. Connors B.W., Gutnick M.J., Prince D.A. 1982. Electrophysiological properties of neocortical neurons in vitro. J Neurophysiol. 48 (6), 1302-20. 201. Deuchars J., West D.C., Thomson A.M. 1994. Relationships between morphology and physiology of pyramid-pyramid single axon connections in rat neocortex in vitro. J Physiol. 478 Pt 3, 423-35. 202. Thomson A.M., West D.C. 1993. Fluctuations in pyramid-pyramid excitatory postsynaptic potentials modified by presynaptic firing pattern and postsynaptic membrane potential using paired intracellular recordings in rat neocortex. Neuroscience. 54 (2), 329-46. 203. Hallman L.E., Schofield B.R., Lin C.S. 1988. Dendritic morphology and axon collaterals of corticotectal, corticopontine, and callosal neurons in layer V of primary visual cortex of the hooded rat. J Comp Neurol. 272 (1), 149-60. 204. Kasper E.M., Larkman A.U., Lubke J., Blakemore C. 1994. Pyramidal neurons in layer 5 of the rat visual cortex. I. Correlation among cell morphology, intrinsic electrophysiological properties, and axon targets. J Comp Neurol. 339 (4), 45974. 205. Markram H., Lubke J., Frotscher M., Roth A., Sakmann B. 1997. Physiology and anatomy of synaptic connections between thick tufted pyramidal neurones in the developing rat neocortex. Journal of Physiology-London. 500 (2), 409-440. 206. Thomson A.M., Bannister A.P. 1998. Postsynaptic pyramidal target selection by descending layer III pyramidal axons: dual intracellular recordings and biocytin filling in slices of rat neocortex. Neuroscience. 84 (3), 669-83. 247 207. Porter L.L., White E.L. 1986. Synaptic connections of callosal projection neurons in the vibrissal region of mouse primary motor cortex: an electron microscopic/horseradish peroxidase study. J Comp Neurol. 248 (4), 573-87. 208. White E.L., Hersch S.M. 1981. Thalamocortical synapses of pyramidal cells which project from SmI to MsI cortex in the mouse. J Comp Neurol. 198 (1), 167-81. 209. Burkhalter A. 1989. Intrinsic connections of rat primary visual cortex: laminar organization of axonal projections. J Comp Neurol. 279 (2), 171-86. 210. Lund J.S., Yoshioka T., Levitt J.B. 1993. Comparison of intrinsic connectivity in different areas of macaque monkey cerebral cortex. Cereb Cortex. 3 (2), 14862. 211. Kritzer M.F., Goldman-Rakic P.S. 1995. Intrinsic circuit organization of the major layers and sublayers of the dorsolateral prefrontal cortex in the rhesus monkey. J Comp Neurol. 359 (1), 131-43. 212. Connors B.W., Gutnick M.J. 1990. Intrinsic firing patterns of diverse neocortical neurons. Trends Neurosci. 13 (3), 99-104. 213. de la Pena E., Geijo-Barrientos E. 1996. Laminar Localization, Morphology, and Physiological Properties of Pyramidal Neurons that Have the Low-Threshold Calcium Current in the Guinea-Pig Medial Frontal Cortex. J. Neurosci. 16 (17), 5301-5311. 214. Degenetais E., Thierry A.M., Glowinski J., Gioanni Y. 2002. Electrophysiological properties of pyramidal neurons in the rat prefrontal cortex: an in vivo intracellular recording study. Cereb Cortex. 12 (1), 1-16. 215. Mason A., Larkman A. 1990. Correlations between morphology and electrophysiology of pyramidal neurons in slices of rat visual cortex. II. Electrophysiology. J Neurosci. 10 (5), 1415-28. 216. Cardin J.A., Carlen M., Meletis K., Knoblich U., Zhang F., Deisseroth K., Tsai L.H., Moore C.I. 2009. Driving fast-spiking cells induces gamma rhythm and controls sensory responses. Nature. 459 (7247), 663-7. 217. Gentet L.J., Kremer Y., Taniguchi H., Huang Z.J., Staiger J.F., Petersen C.C. 2012. Unique functional properties of somatostatin-expressing GABAergic neurons in mouse barrel cortex. Nat Neurosci. 15 (4), 607-12. 218. Petilla Interneuron Nomenclature G., Ascoli G.A., Alonso-Nanclares L., Anderson S.A., Barrionuevo G., Benavides-Piccione R., Burkhalter A., Buzsaki G., Cauli B., Defelipe J., Fairen A., Feldmeyer D., Fishell G., Fregnac Y., Freund T.F., Gardner D., Gardner E.P., Goldberg J.H., Helmstaedter M., Hestrin S., Karube F., Kisvarday Z.F., Lambolez B., Lewis D.A., Marin O., Markram H., 248 Munoz A., Packer A., Petersen C.C., Rockland K.S., Rossier J., Rudy B., Somogyi P., Staiger J.F., Tamas G., Thomson A.M., Toledo-Rodriguez M., Wang Y., West D.C., Yuste R. 2008. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nat Rev Neurosci. 9 (7), 557-68. 219. Lorente de No R., Fairen A., Regidor J., Kruger L. 1922. Trabajos del Laboratorio de Investigaciones Biologicas de la Universidad de Madrid. Somatosens Mot Res. 20, 41-78. 220. Lund J.S., Lewis D.A. 1993. Local circuit neurons of developing and mature macaque prefrontal cortex: Golgi and immunocytochemical characteristics. J Comp Neurol. 328 (2), 282-312. 221. Ascoli G.A., Donohue D.E., Halavi M. 2007. NeuroMorpho.Org: a central resource for neuronal morphologies. J Neurosci. 27 (35), 9247-51. 222. Zaitsev A.V., Povysheva N.V., Gonzalez-Burgos G., Rotaru D., Fish K.N., Krimer L.S., Lewis D.A. 2009. Interneuron diversity in layers 2-3 of monkey prefrontal cortex. Cereb Cortex. 19 (7), 1597-615. 223. Tomioka R., Rockland K.S. 2007. Long-distance corticocortical GABAergic neurons in the adult monkey white and gray matter. J Comp Neurol. 505 (5), 52638. 224. Rudy B., Fishell G., Lee S., Hjerling-Leffler J. 2011. Three groups of interneurons account for nearly 100% of neocortical GABAergic neurons. Dev Neurobiol. 71 (1), 45-61. 225. Conde F., Lund J.S., Jacobowitz D.M., Baimbridge K.G., Lewis D.A. 1994. Local circuit neurons immunoreactive for calretinin, calbindin D-28k or parvalbumin in monkey prefrontal cortex: distribution and morphology. J Comp Neurol. 341 (1), 95-116. 226. Gonchar Y., Burkhalter A. 1997. Three distinct families of GABAergic neurons in rat visual cortex. Cereb Cortex. 7 (4), 347-58. 227. Kubota Y., Hattori R., Yui Y. 1994. Three distinct subpopulations of GABAergic neurons in rat frontal agranular cortex. Brain Res. 649 (1-2), 159-73. 228. Wang Y., Gupta A., Toledo-Rodriguez M., Wu C.Z., Markram H. 2002. Anatomical, physiological, molecular and circuit properties of nest basket cells in the developing somatosensory cortex. Cereb Cortex. 12 (4), 395-410. 229. DeFelipe J. 1993. Neocortical neuronal diversity: chemical heterogeneity revealed by colocalization studies of classic neurotransmitters, neuropeptides, calcium-binding proteins, and cell surface molecules. Cereb Cortex. 3 (4), 27389. 249 230. Hof P.R., Glezer, II, Conde F., Flagg R.A., Rubin M.B., Nimchinsky E.A., Vogt Weisenhorn D.M. 1999. Cellular distribution of the calcium-binding proteins parvalbumin, calbindin, and calretinin in the neocortex of mammals: phylogenetic and developmental patterns. J Chem Neuroanat. 16 (2), 77-116. 231. Kawaguchi Y., Kubota Y. 1998. Neurochemical features and synaptic connections of large physiologically-identified GABAergic cells in the rat frontal cortex. Neuroscience. 85 (3), 677-701. 232. Lewis D.A., Lund J.S. 1990. Heterogeneity of chandelier neurons in monkey neocortex: corticotropin-releasing factor- and parvalbumin-immunoreactive populations. J Comp Neurol. 293 (4), 599-615. 233. Wang Y., Toledo-Rodriguez M., Gupta A., Wu C., Silberberg G., Luo J., Markram H. 2004. Anatomical, physiological and molecular properties of Martinotti cells in the somatosensory cortex of the juvenile rat. J Physiol. 561 (Pt 1), 65-90. 234. Cauli B., Porter J.T., Tsuzuki K., Lambolez B., Rossier J., Quenet B., Audinat E. 2000. Classification of fusiform neocortical interneurons based on unsupervised clustering. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 6144-9. 235. Zaitsev A.V., Gonzalez-Burgos G., Povysheva N.V., Kroner S., Lewis D.A., Krimer L.S. 2005. Localization of calcium-binding proteins in physiologically and morphologically characterized interneurons of monkey dorsolateral prefrontal cortex. Cereb Cortex. 15 (8), 1178-86. 236. Toledo-Rodriguez M., Blumenfeld B., Wu C., Luo J., Attali B., Goodman P., Markram H. 2004. Correlation maps allow neuronal electrical properties to be predicted from single-cell gene expression profiles in rat neocortex. Cereb Cortex. 14 (12), 1310-27. 237. Toledo-Rodriguez M., Goodman P., Illic M., Wu C., Markram H. 2005. Neuropeptide and calcium-binding protein gene expression profiles predict neuronal anatomical type in the juvenile rat. J Physiol. 567 (Pt 2), 401-13. 238. Oliva A.A., Jr., Jiang M., Lam T., Smith K.L., Swann J.W. 2000. Novel hippocampal interneuronal subtypes identified using transgenic mice that express green fluorescent protein in GABAergic interneurons. J Neurosci. 20 (9), 3354-68. 239. Meyer A.H., Katona I., Blatow M., Rozov A., Monyer H. 2002. In vivo labeling of parvalbumin-positive interneurons and analysis of electrical coupling in identified neurons. J Neurosci. 22 (16), 7055-64. 240. Tamamaki N., Yanagawa Y., Tomioka R., Miyazaki J., Obata K., Kaneko T. 2003. Green fluorescent protein expression and colocalization with calretinin, 250 parvalbumin, and somatostatin in the GAD67-GFP knock-in mouse. J Comp Neurol. 467 (1), 60-79. 241. Taniguchi H., He M., Wu P., Kim S., Paik R., Sugino K., Kvitsiani D., Fu Y., Lu J., Lin Y., Miyoshi G., Shima Y., Fishell G., Nelson S.B., Huang Z.J. 2011. A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex. Neuron. 71 (6), 995-1013. 242. Madisen L., Mao T., Koch H., Zhuo J.M., Berenyi A., Fujisawa S., Hsu Y.W., Garcia A.J., 3rd, Gu X., Zanella S., Kidney J., Gu H., Mao Y., Hooks B.M., Boyden E.S., Buzsaki G., Ramirez J.M., Jones A.R., Svoboda K., Han X., Turner E.E., Zeng H. 2012. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nat Neurosci. 15 (5), 793-802. 243. McCormick D.A., Connors B.W., Lighthall J.W., Prince D.A. 1985. Comparative electrophysiology of pyramidal and sparsely spiny stellate neurons of the neocortex. J Neurophysiol. 54 (4), 782-806. 244. Kawaguchi Y. 1993. Groupings of nonpyramidal and pyramidal cells with specific physiological and morphological characteristics in rat frontal cortex. J Neurophysiol. 69 (2), 416-31. 245. Kawaguchi Y., Kubota Y. 1993. Correlation of physiological subgroupings of nonpyramidal cells with parvalbumin- and calbindin(D28k)-immunoreactive neurons in layer V of rat frontal cortex. J Neurophysiol. 70 (1), 387-396. 246. Porter J.T., Cauli B., Staiger J.F., Lambolez B., Rossier J., Audinat E. 1998. Properties of bipolar VIPergic interneurons and their excitation by pyramidal neurons in the rat neocortex. Eur J Neurosci. 10, 3617-3628. 247. Krimer L.S., Zaitsev A.V., Czanner G., Kroner S., Gonzalez-Burgos G., Povysheva N.V., Iyengar S., Barrionuevo G., Lewis D.A. 2005. Cluster analysisbased physiological classification and morphological properties of inhibitory neurons in layers 2-3 of monkey dorsolateral prefrontal cortex. J Neurophysiol. 94 (5), 3009-22. 248. Nowak L.G., Azouz R., Sanchez-Vives M.V., Gray C.M., McCormick D.A. 2003. Electrophysiological classes of cat primary visual cortical neurons in vivo as revealed by quantitative analyses. J Neurophysiol. 89 (3), 1541-66. 249. McGarry L.M., Packer A.M., Fino E., Nikolenko V., Sippy T., Yuste R. 2010. Quantitative classification of somatostatin-positive neocortical interneurons identifies three interneuron subtypes. Front Neural Circuits. 4, 12. 250. Druckmann S., Hill S., Schurmann F., Markram H., Segev I. 2012. A Hierarchical Structure of Cortical Interneuron Electrical Diversity Revealed by Automated Statistical Analysis. Cereb Cortex. 251 251. Reyes A., Lujan R., Rozov A., Burnashev N., Somogyi P., Sakmann B. 1998. Target-cell-specific facilitation and depression in neocortical circuits. Nat Neurosci. 1 (4), 279-85. 252. Kawaguchi Y., Shindou T. 1998. Noradrenergic excitation and inhibition of GABAergic cell types in rat frontal cortex. J Neurosci. 18 (17), 6963-76. 253. Bacci A., Huguenard J.R., Prince D.A. 2004. Long-lasting self-inhibition of neocortical interneurons mediated by endocannabinoids. Nature. 431 (7006), 312-6. 254. Xiang Z., Huguenard J., Prince D.A. 1998. Cholinergic Switching Within Neocortical Inhibitory Networks. Science. 281 (5379), 985-988. 255. Ferezou I., Cauli B., Hill E.L., Rossier J., Hamel E., Lambolez B. 2002. 5-HT3 receptors mediate serotonergic fast synaptic excitation of neocortical vasoactive intestinal peptide/cholecystokinin interneurons. J Neurosci. 22 (17), 7389-97. 256. Dombrowski S.M., Hilgetag C.C., Barbas H. 2001. Quantitative architecture distinguishes prefrontal cortical systems in the rhesus monkey. Cereb Cortex. 11 (10), 975-88. 257. Gabbott P.L., Bacon S.J. 1996. Local circuit neurons in the medial prefrontal cortex (areas 24a,b,c, 25 and 32) in the monkey: I. Cell morphology and morphometrics. J Comp Neurol. 364 (4), 567-608. 258. Gabbott P.L., Bacon S.J. 1996. Local circuit neurons in the medial prefrontal cortex (areas 24a,b,c, 25 and 32) in the monkey: II. Quantitative areal and laminar distributions. J Comp Neurol. 364 (4), 609-36. 259. Karadottir R., Attwell D. 2006. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nat Protoc. 1 (4), 1977-86. 260. Chang Y.M., Rosene D.L., Killiany R.J., Mangiamele L.A., Luebke J.I. 2005. Increased action potential firing rates of layer 2/3 pyramidal cells in the prefrontal cortex are significantly related to cognitive performance in aged monkeys. Cerebral Cortex. 15 (4), 409-418. 261. Wang M., Gamo N.J., Yang Y., Jin L.E., Wang X.J., Laubach M., Mazer J.A., Lee D., Arnsten A.F. 2011. Neuronal basis of age-related working memory decline. Nature. 476 (7359), 210-3. 262. Chang Y.M., Luebke J.I. 2007. Electrophysiological diversity of layer 5 pyramidal cells in the prefrontal cortex of the rhesus monkey: in vitro slice studies. J Neurophysiol. 98 (5), 2622-32. 252 263. Foehring R.C., Lorenzon N.M., Herron P., Wilson C.J. 1991. Correlation of physiologically and morphologically identified neuronal types in human association cortex in vitro. J Neurophysiol. 66 (6), 1825-37. 264. Tasker J.G., Hoffman N.W., Kim Y.I., Fisher R.S., Peacock W.J., Dudek F.E. 1996. Electrical properties of neocortical neurons in slices from children with intractable epilepsy. J Neurophysiol. 75 (2), 931-9. 265. Yang C.R., Seamans J.K., Gorelova N. 1996. Electrophysiological and morphological properties of layers V-VI principal pyramidal cells in rat prefrontal cortex in vitro. J Neurosci. 16 (5), 1904-21. 266. Hattox A.M., Nelson S.B. 2007. Layer V neurons in mouse cortex projecting to different targets have distinct physiological properties. J Neurophysiol. 98 (6), 3330-40. 267. Agmon A., Connors B.W. 1992. Correlation between intrinsic firing patterns and thalamocortical synaptic responses of neurons in mouse barrel cortex. J Neurosci. 12 (1), 319-29. 268. Nunez A., Amzica F., Steriade M. 1993. Electrophysiology of cat association cortical cells in vivo: intrinsic properties and synaptic responses. J Neurophysiol. 70 (1), 418-30. 269. Pape H.C. 1996. Queer current and pacemaker: the hyperpolarization-activated cation current in neurons. Annu Rev Physiol. 58, 299-327. 270. Robinson R.B., Siegelbaum S.A. 2003. Hyperpolarization-activated cation currents: from molecules to physiological function. Annu Rev Physiol. 65, 45380. 271. Wahl-Schott C., Biel M. 2009. HCN channels: structure, cellular regulation and physiological function. Cell Mol Life Sci. 66 (3), 470-94. 272. Agmon A., Connors B.W. 1989. Repetitive burst-firing neurons in the deep layers of mouse somatosensory cortex. Neurosci Lett. 99 (1-2), 137-41. 273. Otsuka T., Kawaguchi Y. 2011. Cell diversity and connection specificity between callosal projection neurons in the frontal cortex. J Neurosci. 31 (10), 3862-70. 274. Chen W., Zhang J.J., Hu G.Y., Wu C.P. 1996. Electrophysiological and morphological properties of pyramidal and nonpyramidal neurons in the cat motor cortex in vitro. Neuroscience. 73 (1), 39-55. 275. Schwindt P., O'Brien J.A., Crill W. 1997. Quantitative analysis of firing properties of pyramidal neurons from layer 5 of rat sensorimotor cortex. J Neurophysiol. 77 (5), 2484-98. 253 276. Otsuka T., Kawaguchi Y. 2008. Firing-pattern-dependent specificity of cortical excitatory feed-forward subnetworks. J Neurosci. 28 (44), 11186-95. 277. Larkum M.E., Waters J., Sakmann B., Helmchen F. 2007. Dendritic spikes in apical dendrites of neocortical layer 2/3 pyramidal neurons. J Neurosci. 27 (34), 8999-9008. 278. Connors B.W. 1984. Initiation of synchronized neuronal bursting in neocortex. Nature. 310 (5979), 685-7. 279. Higashi H., Tanaka E., Inokuchi H., Nishi S. 1993. Ionic mechanisms underlying the depolarizing and hyperpolarizing afterpotentials of single spike in guinea-pig cingulate cortical neurons. Neuroscience. 55 (1), 129-38. 280. Carter E., Wang X.J. 2007. Cannabinoid-mediated disinhibition and working memory: dynamical interplay of multiple feedback mechanisms in a continuous attractor model of prefrontal cortex. Cereb Cortex. 17 Suppl 1, i16-26. 281. Pinto D., Ermentrout G. 2001. Spatially Structured Activity in Synaptically Coupled Neuronal Networks: I. Traveling Fronts and Pulses. SIAM J. Appl. Math. 62 (1), 206. 282. Miller E.K. 2000. The prefrontal cortex and cognitive control. Nat Rev Neurosci. 1 (1), 59-65. 283. Miller E.K., Cohen J.D. 2001. An integrative theory of prefrontal cortex function. Annu Rev Neurosci. 24, 167-202. 284. Lisman J.E. 1997. Bursts as a unit of neural information: making unreliable synapses reliable. Trends Neurosci. 20 (1), 38-43. 285. Abbott L.F., Varela J.A., Sen K., Nelson S.B. 1997. Synaptic depression and cortical gain control. Science. 275 (5297), 220-4. 286. Berger T.K., Silberberg G., Perin R., Markram H. 2010. Brief bursts self-inhibit and correlate the pyramidal network. PLoS Biol. 8 (9). 287. Seamans J.K., Yang C.R. 2004. The principal features and mechanisms of dopamine modulation in the prefrontal cortex. Prog Neurobiol. 74 (1), 1-58. 288. Saar D., Barkai E. 2009. Long-lasting maintenance of learning-induced enhanced neuronal excitability: mechanisms and functional significance. Mol Neurobiol. 39 (3), 171-7. 289. Henze D.A., Gonzalez-Burgos G.R., Urban N.N., Lewis D.A., Barrionuevo G. 2000. Dopamine increases excitability of pyramidal neurons in primate prefrontal cortex. J Neurophysiol. 84 (6), 2799-809. 290. Williams G.V., Goldman-Rakic P.S. 1995. Modulation of memory fields by dopamine D1 receptors in prefrontal cortex. Nature. 376 (6541), 572-5. 254 291. Sawaguchi T. 2001. The effects of dopamine and its antagonists on directional delay-period activity of prefrontal neurons in monkeys during an oculomotor delayed-response task. Neurosci Res. 41 (2), 115-28. 292. Wang M., Vijayraghavan S., Goldman-Rakic P.S. 2004. Selective D2 receptor actions on the functional circuitry of working memory. Science. 303 (5659), 8536. 293. Watanabe M., Kodama T., Hikosaka K. 1997. Increase of extracellular dopamine in primate prefrontal cortex during a working memory task. J Neurophysiol. 78 (5), 2795-8. 294. Lewis D.A., Curley A.A., Glausier J.R., Volk D.W. 2012. Cortical parvalbumin interneurons and cognitive dysfunction in schizophrenia. Trends Neurosci. 35 (1), 57-67. 295. Lewis D.A., Hashimoto T., Volk D.W. 2005. Cortical inhibitory neurons and schizophrenia. Nat Rev Neurosci. 6 (4), 312-24. 296. Ramamoorthi K., Lin Y. 2011. The contribution of GABAergic dysfunction to neurodevelopmental disorders. Trends Mol Med. 17 (8), 452-62. 297. Ben-Ari Y. 2006. Seizures beget seizures: the quest for GABA as a key player. Crit Rev Neurobiol. 18 (1-2), 135-44. 298. Prince D.A., Parada I., Scalise K., Graber K., Jin X., Shen F. 2009. Epilepsy following cortical injury: cellular and molecular mechanisms as targets for potential prophylaxis. Epilepsia. 50 Suppl 2 (Suppl 2), 30-40. 299. Rossignol E. 2011. Genetics and function of neocortical GABAergic interneurons in neurodevelopmental disorders. Neural Plast. 2011, 649325. 300. Pugliese M., Carrasco J.L., Geloso M.C., Mascort J., Michetti F., Mahy N. 2004. Gamma-aminobutyric acidergic interneuron vulnerability to aging in canine prefrontal cortex. J Neurosci Res. 77 (6), 913-20. 301. Beaulieu C. 1993. Numerical data on neocortical neurons in adult rat, with special reference to the GABA population. Brain Res. 609 (1-2), 284-92. 302. DeFelipe J., Alonso-Nanclares L., Arellano J.I. 2002. Microstructure of the neocortex: comparative aspects. J Neurocytol. 31 (3-5), 299-316. 303. Gabbott P.L., Dickie B.G., Vaid R.R., Headlam A.J., Bacon S.J. 1997. Localcircuit neurones in the medial prefrontal cortex (areas 25, 32 and 24b) in the rat: morphology and quantitative distribution. J Comp Neurol. 377 (4), 465-99. 304. Meinecke D.L., Peters A. 1987. GABA immunoreactive neurons in rat visual cortex. J Comp Neurol. 261 (3), 388-404. 255 305. Fitzpatrick D., Lund J.S., Schmechel D.E., Towles A.C. 1987. Distribution of GABAergic neurons and axon terminals in the macaque striate cortex. J Comp Neurol. 264 (1), 73-91. 306. Meyer H.S., Schwarz D., Wimmer V.C., Schmitt A.C., Kerr J.N., Sakmann B., Helmstaedter M. 2011. Inhibitory interneurons in a cortical column form hot zones of inhibition in layers 2 and 5A. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (40), 16807-12. 307. Ren J.Q., Aika Y., Heizmann C.W., Kosaka T. 1992. Quantitative analysis of neurons and glial cells in the rat somatosensory cortex, with special reference to GABAergic neurons and parvalbumin-containing neurons. Exp Brain Res. 92 (1), 1-14. 308. Yanez I.B., Munoz A., Contreras J., Gonzalez J., Rodriguez-Veiga E., DeFelipe J. 2005. Double bouquet cell in the human cerebral cortex and a comparison with other mammals. J Comp Neurol. 486 (4), 344-60. 309. Silberberg G., Markram H. 2007. Disynaptic inhibition between neocortical pyramidal cells mediated by martinotti cells. Neuron. 53 (5), 735-746. 310. Wahle P. 1993. Differential regulation of substance P and somatostatin in Martinotti cells of the developing cat visual cortex. J Comp Neurol. 329 (4), 51938. 311. Wang Y. 2004. Anatomical, physiological and molecular properties of Martinotti cells in the somatosensory cortex of the juvenile rat. J. Physiol. (Lond.). 312. Xu X.M., Roby K.D., Callaway E.M. 2006. Mouse cortical inhibitory neuron type that coexpresses somatostatin and calretinin. Journal of Comparative Neurology. 499 (1), 144-160. 313. Kawaguchi Y. 1995. Physiological subgroups of nonpyramidal cells with specific morphological characteristics in layer II/III of rat frontal cortex. J Neurosci. 15 (4), 2638-55. 314. Somogyi P., Cowey A. 1981. Combined Golgi and electron microscopic study on the synapses formed by double bouquet cells in the visual cortex of the cat and monkey. J Comp Neurol. 195 (4), 547-66. 315. DeFelipe J., Hendry S.H., Jones E.G., Schmechel D. 1985. Variability in the terminations of GABAergic chandelier cell axons on initial segments of pyramidal cell axons in the monkey sensory-motor cortex. J Comp Neurol. 231 (3), 364-84. 316. Tamas G., Lorincz A., Simon A., Szabadics J. 2003. Identified sources and targets of slow inhibition in the neocortex. Science. 299 (5614), 1902-5. 256 317. Aizenman C.D., Linden D.J. 1999. Regulation of the rebound depolarization and spontaneous firing patterns of deep nuclear neurons in slices of rat cerebellum. J Neurophysiol. 82 (4), 1697-709. 318. Huguenard J.R. 1996. Low-threshold calcium currents in central nervous system neurons. Annu Rev Physiol. 58, 329-48. 319. Perez-Reyes E. 2003. Molecular physiology of low-voltage-activated t-type calcium channels. Physiol Rev. 83 (1), 117-61. 320. Lau D., Vega-Saenz de Miera E.C., Contreras D., Ozaita A., Harvey M., Chow A., Noebels J.L., Paylor R., Morgan J.I., Leonard C.S., Rudy B. 2000. Impaired fast-spiking, suppressed cortical inhibition, and increased susceptibility to seizures in mice lacking Kv3.2 K+ channel proteins. J Neurosci. 20 (24), 907185. 321. Rudy B., McBain C.J. 2001. Kv3 channels: voltage-gated K+ channels designed for high-frequency repetitive firing. Trends Neurosci. 24 (9), 517-26. 322. Bean B.P. 2007. The action potential in mammalian central neurons. Nat Rev Neurosci. 8 (6), 451-65. 323. Coetzee W.A., Amarillo Y., Chiu J., Chow A., Lau D., McCormack T., Moreno H., Nadal M.S., Ozaita A., Pountney D., Saganich M., Vega-Saenz de Miera E., Rudy B. 1999. Molecular diversity of K+ channels. Ann N Y Acad Sci. 868, 23385. 324. Rudy B., Chow A., Lau D., Amarillo Y., Ozaita A., Saganich M., Moreno H., Nadal M.S., Hernandez-Pineda R., Hernandez-Cruz A., Erisir A., Leonard C., Vega-Saenz de Miera E. 1999. Contributions of Kv3 channels to neuronal excitability. Ann N Y Acad Sci. 868, 304-43. 325. Miyoshi G., Butt S.J., Takebayashi H., Fishell G. 2007. Physiologically distinct temporal cohorts of cortical interneurons arise from telencephalic Olig2expressing precursors. J Neurosci. 27 (29), 7786-98. 326. Geiger J.R.P., Jonas P. 2000. Dynamic control of presynaptic Ca2+ inflow by fastinactivating K+ channels in hippocampal mossy fiber boutons. Neuron. 28 (3), 927-939. 327. Kawaguchi Y., Kondo S. 2002. Parvalbumin, somatostatin and cholecystokinin as chemical markers for specific GABAergic interneuron types in the rat frontal cortex. J Neurocytol. 31 (3-5), 277-287. 328. Szentagothai J. 1965. The synapse of short local neurons in the cerebral cortex. In: Modern trends in neuromorphology. Ed. Szentagothai J. Budapest: Akademiai Kiado. p. 251-276. 257 329. Krimer L.S., Goldman-Rakic P.S. 2001. Prefrontal microcircuits: membrane properties and excitatory input of local, medium, and wide arbor interneurons. J Neurosci. 21 (11), 3788-96. 330. Armstrong C., Soltesz I. 2012. Basket cell dichotomy in microcircuit function. J Physiol. 590 (Pt 4), 683-94. 331. Curley A.A., Lewis D.A. 2012. Cortical basket cell dysfunction in schizophrenia. J Physiol. 590 (Pt 4), 715-24. 332. Povysheva N.V., Zaitsev A.V., Rotaru D.C., Gonzalez-Burgos G., Lewis D.A., Krimer L.S. 2008. Parvalbumin-positive basket interneurons in monkey and rat prefrontal cortex. J Neurophysiol. 100 (4), 2348-60. 333. Holmgren C., Harkany T., Svennenfors B., Zilberter Y. 2003. Pyramidal cell communication within local networks in layer 2/3 of rat neocortex. J Physiol. 551 (Pt 1), 139-53. 334. Kapfer C., Glickfeld L.L., Atallah B.V., Scanziani M. 2007. Supralinear increase of recurrent inhibition during sparse activity in the somatosensory cortex. Nat Neurosci. 10 (6), 743-53. 335. Avermann M., Tomm C., Mateo C., Gerstner W., Petersen C.C. 2012. Microcircuits of excitatory and inhibitory neurons in layer 2/3 of mouse barrel cortex. J Neurophysiol. 107 (11), 3116-34. 336. Packer A.M., Yuste R. 2011. Dense, unspecific connectivity of neocortical parvalbumin-positive interneurons: a canonical microcircuit for inhibition? J Neurosci. 31 (37), 13260-71. 337. Tamas G., Somogyi P., Buhl E.H. 1998. Differentially interconnected networks of GABAergic interneurons in the visual cortex of the cat. J Neurosci. 18 (11), 4255-70. 338. Gibson J.R., Beierlein M., Connors B.W. 1999. Two networks of electrically coupled inhibitory neurons in neocortex. Nature. 402 (6757), 75-9. 339. Galarreta M., Hestrin S. 1999. A network of fast-spiking cells in the neocortex connected by electrical synapses. Nature. 402 (6757), 72-5. 340. Yoshimura Y., Callaway E.M. 2005. Fine-scale specificity of cortical networks depends on inhibitory cell type and connectivity. Nat Neurosci. 8 (11), 1552-9. 341. Hofer S.B., Ko H., Pichler B., Vogelstein J., Ros H., Zeng H., Lein E., Lesica N.A., Mrsic-Flogel T.D. 2011. Differential connectivity and response dynamics of excitatory and inhibitory neurons in visual cortex. Nat Neurosci. 14 (8), 104552. 258 342. Zaitsev A.V., Kim K.K., Fedorova I.M., Dorofeeva N.A., Magazanik L.G., Tikhonov D.B. 2011. Specific mechanism of use-dependent channel block of calcium-permeable AMPA receptors provides activity-dependent inhibition of glutamatergic neurotransmission. J Physiol. 589 (Pt 7), 1587-601. 343. Angulo M.C., Lambolez B., Audinat E., Hestrin S., Rossier J. 1997. Subunit composition, kinetic, and permeation properties of AMPA receptors in single neocortical nonpyramidal cells. J Neurosci. 17 (17), 6685-96. 344. Hull C., Isaacson J.S., Scanziani M. 2009. Postsynaptic mechanisms govern the differential excitation of cortical neurons by thalamic inputs. J Neurosci. 29 (28), 9127-36. 345. Gentet L.J. 2012. Functional diversity of supragranular GABAergic neurons in the barrel cortex. Front Neural Circuits. 6, 52. 346. Buzsaki G., Wang X.J. 2012. Mechanisms of gamma oscillations. Annu Rev Neurosci. 35, 203-25. 347. Fries P. 2009. Neuronal gamma-band synchronization as a fundamental process in cortical computation. Annu Rev Neurosci. 32, 209-24. 348. Porter J.T., Johnson C.K., Agmon A. 2001. Diverse types of interneurons generate thalamus-evoked feedforward inhibition in the mouse barrel cortex. J Neurosci. 21 (8), 2699-710. 349. Sun Q.Q., Huguenard J.R., Prince D.A. 2006. Barrel cortex microcircuits: thalamocortical feedforward inhibition in spiny stellate cells is mediated by a small number of fast-spiking interneurons. J Neurosci. 26 (4), 1219-30. 350. Swadlow H.A. 2003. Fast-spike interneurons and feedforward inhibition in awake sensory neocortex. Cereb Cortex. 13 (1), 25-32. 351. Povysheva N.V., Gonzalez-Burgos G., Zaitsev A.V., Kroner S., Barrionuevo G., Lewis D.A., Krimer L.S. 2006. Properties of excitatory synaptic responses in fast-spiking interneurons and pyramidal cells from monkey and rat prefrontal cortex. Cereb Cortex. 16 (4), 541-52. 352. Callaway E.M. 2004. Feedforward, feedback and inhibitory connections in primate visual cortex. Neural Netw. 17 (5-6), 625-32. 353. Зайцев А.В., Ким К.Х., Магазаник Л.Г. 2012. Роль кальций-проницаемых амра рецепторов в механизме дисинаптического торможения в префронтальной коре крысы. Биол. мембраны. 29 (1-2), 114-122. 354. Klausberger T., Somogyi P. 2008. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321 (5885), 53-7. 259 355. Zaitsev A.V., Povysheva N.V., Lewis D.A., Krimer L.S. 2007. P/Q-type, but not N-type, calcium channels mediate GABA release from fast-spiking interneurons to pyramidal cells in rat prefrontal cortex. J Neurophysiol. 97 (5), 3567-73. 356. Wilson R.I., Kunos G., Nicoll R.A. 2001. Presynaptic specificity of endocannabinoid signaling in the hippocampus. Neuron. 31 (3), 453-62. 357. Hefft S., Jonas P. 2005. Asynchronous GABA release generates long-lasting inhibition at a hippocampal interneuron-principal neuron synapse. Nat Neurosci. 8 (10), 1319-28. 358. Szabadics J., Varga C., Molnar G., Olah S., Barzo P., Tamas G. 2006. Excitatory effect of GABAergic axo-axonic cells in cortical microcircuits. Science. 311 (5758), 233-5. 359. Woodruff A.R., McGarry L.M., Vogels T.P., Inan M., Anderson S.A., Yuste R. 2011. State-dependent function of neocortical chandelier cells. J Neurosci. 31 (49), 17872-86. 360. Jones E.G. 1975. Varieties and distribution of non-pyramidal cells in the somatic sensory cortex of the squirrel monkey. J Comp Neurol. 160 (2), 205-67. 361. Somogyi P. 1977. A specific 'axo-axonal' interneuron in the visual cortex of the rat. Brain Res. 136 (2), 345-50. 362. DeFelipe J. 1999. Chandelier cells and epilepsy. Brain. 122 ( Pt 10), 1807-22. 363. Inan M., Blazquez-Llorca L., Merchan-Perez A., Anderson S.A., DeFelipe J., Yuste R. 2013. Dense and overlapping innervation of pyramidal neurons by chandelier cells. J Neurosci. 33 (5), 1907-14. 364. Fino E., Yuste R. 2011. Dense inhibitory connectivity in neocortex. Neuron. 69 (6), 1188-203. 365. Berger T.K., Perin R., Silberberg G., Markram H. 2009. Frequency-dependent disynaptic inhibition in the pyramidal network: a ubiquitous pathway in the developing rat neocortex. J Physiol. 587 (Pt 22), 5411-25. 366. Lee C.K., Huguenard J.R. 2011. Martinotti cells: community organizers. Neuron. 69 (6), 1042-5. 367. Cajal S.R.Y. 1911. Histologie du Système Nerveux de l'Homme et des Vertébrés. Paris: Maloine. 993 p. 368. Karube F., Kubota Y., Kawaguchi Y. 2004. Axon branching and synaptic bouton phenotypes in GABAergic nonpyramidal cell subtypes. J Neurosci. 24 (12), 2853-65. 260 369. Olah S., Fule M., Komlosi G., Varga C., Baldi R., Barzo P., Tamas G. 2009. Regulation of cortical microcircuits by unitary GABA-mediated volume transmission. Nature. 461 (7268), 1278-81. 370. Szabadics J., Tamas G., Soltesz I. 2007. Different transmitter transients underlie presynaptic cell type specificity of GABAA,slow and GABAA,fast. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (37), 14831-6. 371. Simon A., Olah S., Molnar G., Szabadics J., Tamas G. 2005. Gap-junctional coupling between neurogliaform cells and various interneuron types in the neocortex. J Neurosci. 25 (27), 6278-6285. 372. Chittajallu R., Pelkey K.A., McBain C.J. 2013. Neurogliaform cells dynamically regulate somatosensory integration via synapse-specific modulation. Nat Neurosci. 16 (1), 13-5. 373. Bayraktar T., Welker E., Freund T.F., Zilles K., Staiger J.F. 2000. Neurons immunoreactive for vasoactive intestinal polypeptide in the rat primary somatosensory cortex: morphology and spatial relationship to barrel-related columns. J Comp Neurol. 420 (3), 291-304. 374. Staiger J.F., Zilles K., Freund T.F. 1996. Innervation of VIP-immunoreactive neurons by the ventroposteromedial thalamic nucleus in the barrel cortex of the rat. J Comp Neurol. 367 (2), 194-204. 375. Staiger J.F., Freund T.F., Zilles K. 1997. Interneurons immunoreactive for vasoactive intestinal polypeptide (VIP) are extensively innervated by parvalbumin-containing boutons in rat primary somatosensory cortex. Eur J Neurosci. 9 (11), 2259-68. 376. Meskenaite V. 1997. Calretinin-immunoreactive local circuit neurons in area 17 of the cynomolgus monkey, Macaca fascicularis. J Comp Neurol. 379 (1), 11332. 377. Melchitzky D.S., Lewis D.A. 2008. Dendritic-targeting GABA neurons in monkey prefrontal cortex: comparison of somatostatin- and calretininimmunoreactive axon terminals. Synapse. 62 (6), 456-65. 378. Melchitzky D.S., Eggan S.M., Lewis D.A. 2005. Synaptic targets of calretinincontaining axon terminals in macaque monkey prefrontal cortex. Neuroscience. 130 (1), 185-95. 379. David C., Schleicher A., Zuschratter W., Staiger J.F. 2007. The innervation of parvalbumin-containing interneurons by VIP-immunopositive interneurons in the primary somatosensory cortex of the adult rat. Eur J Neurosci. 25 (8), 232940. 261 380. Xu Q., Cobos I., De La Cruz E., Rubenstein J.L., Anderson S.A. 2004. Origins of cortical interneuron subtypes. J Neurosci. 24 (11), 2612-22. 381. Petanjek Z., Berger B., Esclapez M. 2009. Origins of cortical GABAergic neurons in the cynomolgus monkey. Cereb Cortex. 19 (2), 249-62. 382. Jones E.G. 1984. Neurogliaform or spiderweb cells. In: Cerebral Cortex. Eds. Peters A. and Jones E.G. New York: Plenum. p. 409–418. 383. Cajal S.R.Y., Swanson N., Swanson L.W. 1995. Histology of the nervous system of man and vertebrates. Oxford University Press. 384. Sholl D.A. 1953. Dendritic organization in the neurons of the visual cortex and motor cortices of the cat. J. Anat. 87, 387-406. 385. Prescott S.A., Ratte S., De Koninck Y., Sejnowski T.J. 2006. Nonlinear interaction between shunting and adaptation controls a switch between integration and coincidence detection in pyramidal neurons. J Neurosci. 26 (36), 9084-97. 386. Chu Z., Galarreta M., Hestrin S. 2003. Synaptic interactions of late-spiking neocortical neurons in layer 1. J Neurosci. 23 (1), 96-102. 387. Jones E.G., Hendry S.H.C. 1984. Basket cells. In: Cerebral Cortex 1, Cellular Components of the Cerebral Cortex. Eds. Peter A. and Jones E.G. New York: Plenum. p. 309–336. 388. Thomson A.M., West D.C., Hahn J., Deuchars J. 1996. Single axon IPSPs elicited in pyramidal cells by three classes of interneurones in slices of rat neocortex. J Physiol. 496 ( Pt 1), 81-102. 389. Baimbridge K.G., Celio M.R., Rogers J.H. 1992. Calcium-binding proteins in the nervous system. Trends Neurosci. 15 (8), 303-8. 390. Steriade M., Timofeev I., Grenier F. 2001. Natural waking and sleep states: a view from inside neocortical neurons. J Neurophysiol. 85 (5), 1969-85. 391. Banks M.I., Haberly L.B., Jackson M.B. 1996. Layer-specific properties of the transient K current (IA) in piriform cortex. J Neurosci. 16 (12), 3862-76. 392. Fricker D., Miles R. 2000. EPSP amplification and the precision of spike timing in hippocampal neurons. Neuron. 28 (2), 559-69. 393. Maccaferri G., Dingledine R. 2002. Control of feedforward dendritic inhibition by NMDA receptor-dependent spike timing in hippocampal interneurons. J Neurosci. 22 (13), 5462-72. 394. Jung M.W., Qin Y., McNaughton B.L., Barnes C.A. 1998. Firing characteristics of deep layer neurons in prefrontal cortex in rats performing spatial working memory tasks. Cereb Cortex. 8 (5), 437-50. 262 395. Simons D.J. 1978. Response properties of vibrissa units in rat SI somatosensory neocortex. J Neurophysiol. 41 (3), 798-820. 396. Simons D.J., Carvell G.E. 1989. Thalamocortical response transformation in the rat vibrissa/barrel system. J Neurophysiol. 61 (2), 311-30. 397. Swadlow H.A. 1989. Efferent neurons and suspected interneurons in S-1 vibrissa cortex of the awake rabbit: receptive fields and axonal properties. J Neurophysiol. 62 (1), 288-308. 398. Galarreta M., Hestrin S. 2001. Spike transmission and synchrony detection in networks of GABAergic interneurons. Science. 292 (5525), 2295-9. 399. Beierlein M., Gibson J.R., Connors B.W. 2003. Two dynamically distinct inhibitory networks in layer 4 of the neocortex. J Neurophysiol. 90 (5), 29873000. 400. Thomson A.M. 1997. Activity-dependent properties of synaptic transmission at two classes of connections made by rat neocortical pyramidal axons in vitro. Journal of Physiology-London. 502 (1), 131-147. 401. Gonzalez-Burgos G., Krimer L.S., Urban N.N., Barrionuevo G., Lewis D.A. 2004. Synaptic efficacy during repetitive activation of excitatory inputs in primate dorsolateral prefrontal cortex. Cereb Cortex. 14 (5), 530-42. 402. Gonzalez-Burgos G., Barrionuevo G. 2001. Voltage-gated sodium channels shape subthreshold EPSPs in layer 5 pyramidal neurons from rat prefrontal cortex. J Neurophysiol. 86 (4), 1671-84. 403. Stuart G., Sakmann B. 1995. Amplification of EPSPs by axosomatic sodium channels in neocortical pyramidal neurons. Neuron. 15 (5), 1065-76. 404. Desai N.S., Rutherford L.C., Turrigiano G.G. 1999. Plasticity in the intrinsic excitability of cortical pyramidal neurons. Nat Neurosci. 2 (6), 515-20. 405. Turrigiano G.G., Nelson S.B. 2000. Hebb and homeostasis in neuronal plasticity. Curr Opin Neurobiol. 10 (3), 358-64. 406. Turrigiano G.G., Nelson S.B. 2004. Homeostatic plasticity in the developing nervous system. Nat Rev Neurosci. 5 (2), 97-107. 407. Buhl E.H., Tamas G., Szilagyi T., Stricker C., Paulsen O., Somogyi P. 1997. Effect, number and location of synapses made by single pyramidal cells onto aspiny interneurones of cat visual cortex. J Physiol. 500 ( Pt 3), 689-713. 408. Edwards F.A. 1995. Anatomy and electrophysiology of fast central synapses lead to a structural model for long-term potentiation. Physiol Rev. 75 (4), 759-87. 263 409. Gil Z., Connors B.W., Amitai Y. 1999. Efficacy of thalamocortical and intracortical synaptic connections: quanta, innervation, and reliability. Neuron. 23 (2), 385-97. 410. Gulyas A.I., Miles R., Sik A., Toth K., Tamamaki N., Freund T.F. 1993. Hippocampal pyramidal cells excite inhibitory neurons through a single release site. Nature. 366 (6456), 683-7. 411. Allen C., Stevens C.F. 1994. An evaluation of causes for unreliability of synaptic transmission. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (22), 10380-3. 412. Dobrunz L.E., Stevens C.F. 1997. Heterogeneity of release probability, facilitation, and depletion at central synapses. Neuron. 18 (6), 995-1008. 413. Henze D.A., Wittner L., Buzsaki G. 2002. Single granule cells reliably discharge targets in the hippocampal CA3 network in vivo. Nat Neurosci. 5 (8), 790-5. 414. Cash S., Yuste R. 1998. Input summation by cultured pyramidal neurons is linear and position-independent. J Neurosci. 18 (1), 10-5. 415. Urban N.N., Barrionuevo G. 1998. Active summation of excitatory postsynaptic potentials in hippocampal CA3 pyramidal neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (19), 11450-5. 416. Traynelis S.F., Wollmuth L.P., McBain C.J., Menniti F.S., Vance K.M., Ogden K.K., Hansen K.B., Yuan H., Myers S.J., Dingledine R. 2010. Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function. Pharmacol Rev. 62 (3), 405-96. 417. Cull-Candy S., Kelly L., Farrant M. 2006. Regulation of Ca2+-permeable AMPA receptors: synaptic plasticity and beyond. Curr Opin Neurobiol. 16 (3), 288-97. 418. Isaac J.T., Ashby M.C., McBain C.J. 2007. The role of the GluR2 subunit in AMPA receptor function and synaptic plasticity. Neuron. 54 (6), 859-71. 419. Buldakova S.L., Vorobjev V.S., Sharonova I.N., Samoilova M.V., Magazanik L.G. 1999. Characterization of AMPA receptor populations in rat brain cells by the use of subunit-specific open channel blocking drug, IEM-1460. Brain Res. 846 (1), 52-8. 420. Geiger J.R., Melcher T., Koh D.S., Sakmann B., Seeburg P.H., Jonas P., Monyer H. 1995. Relative abundance of subunit mRNAs determines gating and Ca2+ permeability of AMPA receptors in principal neurons and interneurons in rat CNS. Neuron. 15 (1), 193-204. 421. McBain C.J., Dingledine R. 1993. Heterogeneity of synaptic glutamate receptors on CA3 stratum radiatum interneurones of rat hippocampus. J Physiol. 462, 37392. 264 422. Swanson G.T., Kamboj S.K., Cull-Candy S.G. 1997. Single-channel properties of recombinant AMPA receptors depend on RNA editing, splice variation, and subunit composition. J Neurosci. 17 (1), 58-69. 423. Koh D.S., Geiger J.R., Jonas P., Sakmann B. 1995. Ca(2+)-permeable AMPA and NMDA receptor channels in basket cells of rat hippocampal dentate gyrus. J Physiol. 485 ( Pt 2), 383-402. 424. Hestrin S. 1993. Different glutamate receptor channels mediate fast excitatory synaptic currents in inhibitory and excitatory cortical neurons. Neuron. 11 (6), 1083-91. 425. Geiger J.R., Lubke J., Roth A., Frotscher M., Jonas P. 1997. Submillisecond AMPA receptor-mediated signaling at a principal neuron-interneuron synapse. Neuron. 18 (6), 1009-23. 426. Cruikshank S.J., Lewis T.J., Connors B.W. 2007. Synaptic basis for intense thalamocortical activation of feedforward inhibitory cells in neocortex. Nat Neurosci. 10 (4), 462-8. 427. Gao W.J., Wang Y., Goldman-Rakic P.S. 2003. Dopamine modulation of perisomatic and peridendritic inhibition in prefrontal cortex. J Neurosci. 23 (5), 1622-30. 428. Markram H., Lubke J., Frotscher M., Sakmann B. 1997. Regulation of synaptic efficacy by coincidence of postsynaptic APs and EPSPs. Science. 275 (5297), 213-5. 429. Angulo M.C., Rossier J., Audinat E. 1999. Postsynaptic glutamate receptors and integrative properties of fast-spiking interneurons in the rat neocortex. J Neurophysiol. 82 (3), 1295-302. 430. Goldman-Rakic P.S. 1996. Memory: recording experience in cells and circuits: diversity in memory research. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (24), 13435-7. 431. Wang X.J., Tegner J., Constantinidis C., Goldman-Rakic P.S. 2004. Division of labor among distinct subtypes of inhibitory neurons in a cortical microcircuit of working memory. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (5), 1368-73. 432. Durstewitz D., Seamans J.K., Sejnowski T.J. 2000. Dopamine-mediated stabilization of delay-period activity in a network model of prefrontal cortex. J Neurophysiol. 83 (3), 1733-50. 433. Seamans J.K., Nogueira L., Lavin A. 2003. Synaptic basis of persistent activity in prefrontal cortex in vivo and in organotypic cultures. Cereb Cortex. 13 (11), 1242-50. 434. Tanaka S. 1999. Architecture and dynamics of the primate prefrontal cortical circuit for spatial working memory. Neural Netw. 12 (7-8), 1007-1020. 265 435. Bock D.D., Lee W.C., Kerlin A.M., Andermann M.L., Hood G., Wetzel A.W., Yurgenson S., Soucy E.R., Kim H.S., Reid R.C. 2011. Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons. Nature. 471 (7337), 177-82. 436. Chittajallu R., Isaac J.T. 2010. Emergence of cortical inhibition by coordinated sensory-driven plasticity at distinct synaptic loci. Nat Neurosci. 13 (10), 1240-8. 437. Helmstaedter M., Staiger J.F., Sakmann B., Feldmeyer D. 2008. Efficient recruitment of layer 2/3 interneurons by layer 4 input in single columns of rat somatosensory cortex. J Neurosci. 28 (33), 8273-84. 438. Otsuka T., Kawaguchi Y. 2009. Cortical inhibitory cell types differentially form intralaminar and interlaminar subnetworks with excitatory neurons. J Neurosci. 29 (34), 10533-40. 439. Tamas G., Buhl E.H., Somogyi P. 1997. Massive autaptic self-innervation of GABAergic neurons in cat visual cortex. J Neurosci. 17 (16), 6352-64. 440. Thomson A.M., West D.C., Wang Y., Bannister A.P. 2002. Synaptic connections and small circuits involving excitatory and inhibitory neurones in layers 2 to 5 of adult rat and cat neocortex: triple intracellular recordings and biocytin-labelling in vitro. Cereb. Cortex. 12, 936-953. 441. Yuan K., Shih J.Y., Winer J.A., Schreiner C.E. 2011. Functional networks of parvalbumin-immunoreactive neurons in cat auditory cortex. J Neurosci. 31 (37), 13333-42. 442. Gonzalez-Burgos G., Krimer L.S., Povysheva N.V., Barrionuevo G., Lewis D.A. 2005. Functional properties of fast spiking interneurons and their synaptic connections with pyramidal cells in primate dorsolateral prefrontal cortex. J Neurophysiol. 93 (2), 942-53. 443. Ali A.B., Nelson C. 2006. Distinct Ca2+ channels mediate transmitter release at excitatory synapses displaying different dynamic properties in rat neocortex. Cereb Cortex. 16 (3), 386-93. 444. Feldmeyer D., Lubke J., Sakmann B. 2006. Efficacy and connectivity of intracolumnar pairs of layer 2/3 pyramidal cells in the barrel cortex of juvenile rats. J Physiol. 575 (Pt 2), 583-602. 445. Evans R.M., Zamponi G.W. 2006. Presynaptic Ca2+ channels--integration centers for neuronal signaling pathways. Trends Neurosci. 29 (11), 617-24. 446. Reid C.A., Bekkers J.M., Clements J.D. 2003. Presynaptic Ca2+ channels: a functional patchwork. Trends Neurosci. 26 (12), 683-7. 447. Poncer J.C., McKinney R.A., Gahwiler B.H., Thompson S.M. 1997. Either N- or P-type calcium channels mediate GABA release at distinct hippocampal inhibitory synapses. Neuron. 18 (3), 463-72. 266 448. Wu L.G., Westenbroek R.E., Borst J.G., Catterall W.A., Sakmann B. 1999. Calcium channel types with distinct presynaptic localization couple differentially to transmitter release in single calyx-type synapses. J Neurosci. 19 (2), 726-36. 449. Colecraft H.M., Patil P.G., Yue D.T. 2000. Differential occurrence of reluctant openings in G-protein-inhibited N- and P/Q-type calcium channels. J Gen Physiol. 115 (2), 175-92. 450. Currie K.P., Fox A.P. 1997. Comparison of N- and P/Q-type voltage-gated calcium channel current inhibition. J Neurosci. 17 (12), 4570-9. 451. Sabatini B.L., Regehr W.G. 1999. Timing of synaptic transmission. Annu Rev Physiol. 61, 521-42. 452. Adams M.E. 2004. Agatoxins: ion channel specific toxins from the American funnel web spider, Agelenopsis aperta. Toxicon. 43 (5), 509-25. 453. Adams M.E., Bindokas V.P., Hasegawa L., Venema V.J. 1990. Omegaagatoxins: novel calcium channel antagonists of two subtypes from funnel web spider (Agelenopsis aperta) venom. J Biol Chem. 265 (2), 861-7. 454. Olivera B.M., Cruz L.J. 2001. Conotoxins, in retrospect. Toxicon. 39 (1), 7-14. 455. Olivera B.M., Miljanich G.P., Ramachandran J., Adams M.E. 1994. Calcium channel diversity and neurotransmitter release: the omega-conotoxins and omega-agatoxins. Annu Rev Biochem. 63, 823-67. 456. Bollmann J.H., Sakmann B. 2005. Control of synaptic strength and timing by the release-site Ca2+ signal. Nat Neurosci. 8 (4), 426-34. 457. Thomson A.M., West D.C., Wang Y., Bannister A.P. 2002. Synaptic connections and small circuits involving excitatory and inhibitory neurons in layers 2-5 of adult rat and cat neocortex: triple intracellular recordings and biocytin labelling in vitro. Cereb Cortex. 12 (9), 936-53. 458. Zucker R.S., Regehr W.G. 2002. Short-term synaptic plasticity. Annu Rev Physiol. 64, 355-405. 459. Rozov A., Burnashev N., Sakmann B., Neher E. 2001. Transmitter release modulation by intracellular Ca2+ buffers in facilitating and depressing nerve terminals of pyramidal cells in layer 2/3 of the rat neocortex indicates a target cell-specific difference in presynaptic calcium dynamics. J Physiol. 531 (Pt 3), 807-26. 460. Atzori M., Lei S., Evans D.I., Kanold P.O., Phillips-Tansey E., McIntyre O., McBain C.J. 2001. Differential synaptic processing separates stationary from transient inputs to the auditory cortex. Nat Neurosci. 4 (12), 1230-7. 267 461. Thomson A.M. 2000. Molecular frequency filters at central synapses. Prog Neurobiol. 62 (2), 159-96. 462. Bremaud A., West D.C., Thomson A.M. 2007. Binomial parameters differ across neocortical layers and with different classes of connections in adult rat and cat neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (35), 14134-9. 463. Gulyas A.I., Megias M., Emri Z., Freund T.F. 1999. Total number and ratio of excitatory and inhibitory synapses converging onto single interneurons of different types in the CA1 area of the rat hippocampus. J Neurosci. 19 (22), 10082-97. 464. Tamas G., Buhl E.H., Somogyi P. 1997. Fast IPSPs elicited via multiple synaptic release sites by different types of GABAergic neurone in the cat visual cortex. J Physiol. 500 ( Pt 3), 715-38. 465. Kisvarday Z.F., Toth E., Rausch M., Eysel U.T. 1997. Orientation-specific relationship between populations of excitatory and inhibitory lateral connections in the visual cortex of the cat. Cereb Cortex. 7 (7), 605-18. 466. Brunel N., Wang X.J. 2003. What determines the frequency of fast network oscillations with irregular neural discharges? I. Synaptic dynamics and excitation-inhibition balance. J Neurophysiol. 90 (1), 415-30. 467. Otani S., Daniel H., Roisin M.P., Crepel F. 2003. Dopaminergic modulation of long-term synaptic plasticity in rat prefrontal neurons. Cereb Cortex. 13 (11), 1251-6. 468. Zilberter M., Holmgren C., Shemer I., Silberberg G., Grillner S., Harkany T., Zilberter Y. 2009. Input specificity and dependence of spike timing-dependent plasticity on preceding postsynaptic activity at unitary connections between neocortical layer 2/3 pyramidal cells. Cereb Cortex. 19 (10), 2308-20. 469. Kirkwood A., Dudek S.M., Gold J.T., Aizenman C.D., Bear M.F. 1993. Common forms of synaptic plasticity in the hippocampus and neocortex in vitro. Science. 260 (5113), 1518-21. 470. Hebb D.O. 1949. The Organization of Behavior. New York: Wiley. 471. Bi G.Q., Poo M.M. 1998. Synaptic modifications in cultured hippocampal neurons: dependence on spike timing, synaptic strength, and postsynaptic cell type. J Neurosci. 18 (24), 10464-72. 472. Feldman D.E. 2000. Timing-Based LTP and LTD at Vertical Inputs to Layer II/III Pyramidal Cells in Rat Barrel Cortex. Neuron. 27 (1), 45-56. 473. Froemke R.C., Dan Y. 2002. Spike-timing-dependent synaptic modification induced by natural spike trains. Nature. 416 (6879), 433-8. 268 474. Sjostrom P.J., Rancz E.A., Roth A., Hausser M. 2008. Dendritic excitability and synaptic plasticity. Physiol Rev. 88 (2), 769-840. 475. Kampa B.M., Letzkus J.J., Stuart G.J. 2006. Requirement of dendritic calcium spikes for induction of spike-timing-dependent synaptic plasticity. J Physiol. 574 (Pt 1), 283-90. 476. Nevian T., Sakmann B. 2006. Spine Ca2+ signaling in spike-timing-dependent plasticity. J Neurosci. 26 (43), 11001-13. 477. Sjostrom P.J., Turrigiano G.G., Nelson S.B. 2001. Rate, timing, and cooperativity jointly determine cortical synaptic plasticity. Neuron. 32 (6), 114964. 478. Abbott L.F., Nelson S.B. 2000. Synaptic plasticity: taming the beast. Nat Neurosci. 3 Suppl, 1178-83. 479. Couey J.J., Meredith R.M., Spijker S., Poorthuis R.B., Smit A.B., Brussaard A.B., Mansvelder H.D. 2007. Distributed network actions by nicotine increase the threshold for spike-timing-dependent plasticity in prefrontal cortex. Neuron. 54 (1), 73-87. 480. Lin Y.W., Min M.Y., Chiu T.H., Yang H.W. 2003. Enhancement of associative long-term potentiation by activation of beta-adrenergic receptors at CA1 synapses in rat hippocampal slices. J Neurosci. 23 (10), 4173-81. 481. Seol G.H., Ziburkus J., Huang S., Song L., Kim I.T., Takamiya K., Huganir R.L., Lee H.K., Kirkwood A. 2007. Neuromodulators control the polarity of spiketiming-dependent synaptic plasticity. Neuron. 55 (6), 919-29. 482. Xu T.X., Yao W.D. 2010. D1 and D2 dopamine receptors in separate circuits cooperate to drive associative long-term potentiation in the prefrontal cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (37), 16366-71. 483. Rodriguez-Moreno A., Paulsen O. 2008. Spike timing-dependent long-term depression requires presynaptic NMDA receptors. Nat Neurosci. 11 (7), 744-5. 484. Sjostrom P.J., Turrigiano G.G., Nelson S.B. 2003. Neocortical LTD via coincident activation of presynaptic NMDA and cannabinoid receptors. Neuron. 39 (4), 641-54. 485. Froemke R.C., Poo M.M., Dan Y. 2005. Spike-timing-dependent synaptic plasticity depends on dendritic location. Nature. 434 (7030), 221-5. 486. Letzkus J.J., Kampa B.M., Stuart G.J. 2006. Learning rules for spike timingdependent plasticity depend on dendritic synapse location. J Neurosci. 26 (41), 10420-9. 269 487. Sjostrom P.J., Hausser M. 2006. A cooperative switch determines the sign of synaptic plasticity in distal dendrites of neocortical pyramidal neurons. Neuron. 51 (2), 227-38. 488. Malinow R., Tsien R.W. 1990. Presynaptic enhancement shown by whole-cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346 (6280), 177-80. 489. Lancaster B., Hu H., Ramakers G.M.J., Storm J.F. 2001. Interaction between synaptic excitation and slow afterhyperpolarization current in rat hippocampal pyramidal cells. The Journal of Physiology. 536 (3), 809-823. 490. Le Ray D., Fernandez De Sevilla D., Belen Porto A., Fuenzalida M., Buno W. 2004. Heterosynaptic metaplastic regulation of synaptic efficacy in CA1 pyramidal neurons of rat hippocampus. Hippocampus. 14 (8), 1011-25. 491. Sah P. 1996. Ca(2+)-activated K+ currents in neurones: types, physiological roles and modulation. Trends Neurosci. 19 (4), 150-4. 492. Fuenzalida M., Fernandez de Sevilla D., Buno W. 2007. Changes of the EPSP waveform regulate the temporal window for spike-timing-dependent plasticity. J Neurosci. 27 (44), 11940-8. 493. Fernandez de Sevilla D., Fuenzalida M., Porto Pazos A.B., Buno W. 2007. Selective shunting of the NMDA EPSP component by the slow afterhyperpolarization in rat CA1 pyramidal neurons. J Neurophysiol. 97 (5), 3242-55. 494. Shah M.M., Javadzadeh-Tabatabaie M., Benton D.C., Ganellin C.R., Haylett D.G. 2006. Enhancement of hippocampal pyramidal cell excitability by the novel selective slow-afterhyperpolarization channel blocker 3(triphenylmethylaminomethyl)pyridine (UCL2077). Mol Pharmacol. 70 (5), 1494-502. 495. McCormick D.A., Wang Z., Huguenard J. 1993. Neurotransmitter control of neocortical neuronal activity and excitability. Cereb Cortex. 3 (5), 387-98. 496. Nicoll R.A. 1988. The coupling of neurotransmitter receptors to ion channels in the brain. Science. 241 (4865), 545-51. 497. Satake T., Mitani H., Nakagome K., Kaneko K. 2008. Individual and additive effects of neuromodulators on the slow components of afterhyperpolarization currents in layer V pyramidal cells of the rat medial prefrontal cortex. Brain Res. 1229, 47-60. 498. Dasari S., Gulledge A.T. 2011. M1 and M4 receptors modulate hippocampal pyramidal neurons. J Neurophysiol. 105 (2), 779-92. 270 499. Gulledge A.T., Bucci D.J., Zhang S.S., Matsui M., Yeh H.H. 2009. M1 receptors mediate cholinergic modulation of excitability in neocortical pyramidal neurons. J Neurosci. 29 (31), 9888-902. 500. Krause M., Offermanns S., Stocker M., Pedarzani P. 2002. Functional Specificity of GО±q and GО±11 in the Cholinergic and Glutamatergic Modulation of Potassium Currents and Excitability in Hippocampal Neurons. The Journal of Neuroscience. 22 (3), 666-673. 501. Krause M., Pedarzani P. 2000. A protein phosphatase is involved in the cholinergic suppression of the Ca(2+)-activated K(+) current sI(AHP) in hippocampal pyramidal neurons. Neuropharmacology. 39 (7), 1274-83. 502. Rouse S.T., Hamilton S.E., Potter L.T., Nathanson N.M., Conn P.J. 2000. Muscarinic-induced modulation of potassium conductances is unchanged in mouse hippocampal pyramidal cells that lack functional M1 receptors. Neurosci Lett. 278 (1-2), 61-4. 503. Yan H.D., Villalobos C., Andrade R. 2009. TRPC Channels Mediate a Muscarinic Receptor-Induced Afterdepolarization in Cerebral Cortex. J Neurosci. 29 (32), 10038-46. 504. Ji X.H., Cao X.H., Zhang C.L., Feng Z.J., Zhang X.H., Ma L., Li B.M. 2008. Pre- and postsynaptic beta-adrenergic activation enhances excitatory synaptic transmission in layer V/VI pyramidal neurons of the medial prefrontal cortex of rats. Cereb Cortex. 18 (7), 1506-20. 505. Berretta N., Jones R.S. 1996. Tonic facilitation of glutamate release by presynaptic N-methyl-D-aspartate autoreceptors in the entorhinal cortex. Neuroscience. 75 (2), 339-44. 506. Brasier D.J., Feldman D.E. 2008. Synapse-specific expression of functional presynaptic NMDA receptors in rat somatosensory cortex. J Neurosci. 28 (9), 2199-211. 507. Corlew R., Wang Y., Ghermazien H., Erisir A., Philpot B.D. 2007. Developmental switch in the contribution of presynaptic and postsynaptic NMDA receptors to long-term depression. J Neurosci. 27 (37), 9835-45. 508. Li Y.H., Han T.Z. 2007. Glycine binding sites of presynaptic NMDA receptors may tonically regulate glutamate release in the rat visual cortex. J Neurophysiol. 97 (1), 817-23. 509. Li Y.H., Han T.Z., Meng K. 2008. Tonic facilitation of glutamate release by glycine binding sites on presynaptic NR2B-containing NMDA autoreceptors in the rat visual cortex. Neurosci Lett. 432 (3), 212-6. 271 510. Bender V.A., Bender K.J., Brasier D.J., Feldman D.E. 2006. Two coincidence detectors for spike timing-dependent plasticity in somatosensory cortex. J Neurosci. 26 (16), 4166-77. 511. Heifets B.D., Castillo P.E. 2009. Endocannabinoid signaling and long-term synaptic plasticity. Annu Rev Physiol. 71, 283-306. 512. Tzounopoulos T., Rubio M.E., Keen J.E., Trussell L.O. 2007. Coactivation of pre- and postsynaptic signaling mechanisms determines cell-specific spiketiming-dependent plasticity. Neuron. 54 (2), 291-301. 513. Herkenham M., Lynn A.B., Johnson M.R., Melvin L.S., de Costa B.R., Rice K.C. 1991. Characterization and localization of cannabinoid receptors in rat brain: a quantitative in vitro autoradiographic study. J Neurosci. 11 (2), 563-83. 514. Eggan S.M., Stoyak S.R., Verrico C.D., Lewis D.A. 2010. Cannabinoid CB1 receptor immunoreactivity in the prefrontal cortex: Comparison of schizophrenia and major depressive disorder. Neuropsychopharmacology. 35 (10), 2060-71. 515. Lafourcade M., Elezgarai I., Mato S., Bakiri Y., Grandes P., Manzoni O.J. 2007. Molecular components and functions of the endocannabinoid system in mouse prefrontal cortex. PLoS One. 2 (8), e709. 516. Sah P., Faber E.S. 2002. Channels underlying neuronal calcium-activated potassium currents. Prog Neurobiol. 66 (5), 345-53. 517. Lima P.A., Marrion N.V. 2007. Mechanisms underlying activation of the slow AHP in rat hippocampal neurons. Brain Res. 1150, 74-82. 518. Sah P., Bekkers J.M. 1996. Apical dendritic location of slow afterhyperpolarization current in hippocampal pyramidal neurons: implications for the integration of long-term potentiation. J Neurosci. 16 (15), 4537-42. 519. Andreasen M., Lambert J.D. 1995. The excitability of CA1 pyramidal cell dendrites is modulated by a local Ca(2+)-dependent K(+)-conductance. Brain Res. 698 (1-2), 193-203. 520. Bekkers J.M. 2000. Distribution of slow AHP channels on hippocampal CA1 pyramidal neurons. J Neurophysiol. 83 (3), 1756-9. 521. Gulledge A.T., Kampa B.M., Stuart G.J. 2005. Synaptic integration in dendritic trees. J Neurobiol. 64 (1), 75-90. 522. Caporale N., Dan Y. 2008. Spike timing-dependent plasticity: a Hebbian learning rule. Annu Rev Neurosci. 31 (1), 25-46. 523. Hoffman D.A., Johnston D. 1999. Neuromodulation of dendritic action potentials. J Neurophysiol. 81 (1), 408-11. 272 524. Johnston D., Hoffman D.A., Colbert C.M., Magee J.C. 1999. Regulation of backpropagating action potentials in hippocampal neurons. Curr Opin Neurobiol. 9 (3), 288-92. 525. Steinberg L. 2005. Cognitive and affective development in adolescence. Trends Cogn Sci. 9 (2), 69-74. 526. Anderson S.A., Classey J.D., Conde F., Lund J.S., Lewis D.A. 1995. Synchronous development of pyramidal neuron dendritic spines and parvalbumin-immunoreactive chandelier neuron axon terminals in layer III of monkey prefrontal cortex. Neuroscience. 67 (1), 7-22. 527. Giedd J.N., Blumenthal J., Jeffries N.O., Castellanos F.X., Liu H., Zijdenbos A., Paus T., Evans A.C., Rapoport J.L. 1999. Brain development during childhood and adolescence: a longitudinal MRI study. Nat Neurosci. 2 (10), 861-3. 528. Gogtay N., Giedd J.N., Lusk L., Hayashi K.M., Greenstein D., Vaituzis A.C., Nugent T.F., 3rd, Herman D.H., Clasen L.S., Toga A.W., Rapoport J.L., Thompson P.M. 2004. Dynamic mapping of human cortical development during childhood through early adulthood. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (21), 8174-9. 529. Luna B., Garver K.E., Urban T.A., Lazar N.A., Sweeney J.A. 2004. Maturation of cognitive processes from late childhood to adulthood. Child Dev. 75 (5), 135772. 530. Crone E.A., Wendelken C., Donohue S., van Leijenhorst L., Bunge S.A. 2006. Neurocognitive development of the ability to manipulate information in working memory. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (24), 9315-20. 531. Goldman P.S., Alexander G.E. 1977. Maturation of prefrontal cortex in the monkey revealed by local reversible cryogenic depression. Nature. 267 (5612), 613-5. 532. Mirnics K., Middleton F.A., Lewis D.A., Levitt P. 2001. Analysis of complex brain disorders with gene expression microarrays: schizophrenia as a disease of the synapse. Trends Neurosci. 24 (8), 479-86. 533. Owen M.J., O'Donovan M.C., Harrison P.J. 2005. Schizophrenia: a genetic disorder of the synapse? BMJ. 330 (7484), 158-9. 534. Katz L.C., Shatz C.J. 1996. Synaptic activity and the construction of cortical circuits. Science. 274 (5290), 1133-8. 535. Waites C.L., Craig A.M., Garner C.C. 2005. Mechanisms of vertebrate synaptogenesis. Annu Rev Neurosci. 28, 251-74. 536. Le Be J.V., Markram H. 2006. Spontaneous and evoked synaptic rewiring in the neonatal neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (35), 13214-9. 273 537. Zuo Y., Lin A., Chang P., Gan W.B. 2005. Development of long-term dendritic spine stability in diverse regions of cerebral cortex. Neuron. 46 (2), 181-9. 538. Woo T.U., Pucak M.L., Kye C.H., Matus C.V., Lewis D.A. 1997. Peripubertal refinement of the intrinsic and associational circuitry in monkey prefrontal cortex. Neuroscience. 80 (4), 1149-58. 539. Malinow R., Malenka R.C. 2002. AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Annu Rev Neurosci. 25, 103-26. 540. Liao D., Scannevin R.H., Huganir R. 2001. Activation of silent synapses by rapid activity-dependent synaptic recruitment of AMPA receptors. J Neurosci. 21 (16), 6008-17. 541. Zhu J.J., Malinow R. 2002. Acute versus chronic NMDA receptor blockade and synaptic AMPA receptor delivery. Nat Neurosci. 5 (6), 513-4. 542. Lu W., Constantine-Paton M. 2004. Eye opening rapidly induces synaptic potentiation and refinement. Neuron. 43 (2), 237-49. 543. Mierau S.B., Meredith R.M., Upton A.L., Paulsen O. 2004. Dissociation of experience-dependent and -independent changes in excitatory synaptic transmission during development of barrel cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (43), 15518-23. 544. Rumpel S., Hatt H., Gottmann K. 1998. Silent synapses in the developing rat visual cortex: evidence for postsynaptic expression of synaptic plasticity. J Neurosci. 18 (21), 8863-74. 545. Rumpel S., Kattenstroth G., Gottmann K. 2004. Silent synapses in the immature visual cortex: layer-specific developmental regulation. J Neurophysiol. 91 (2), 1097-101. 546. Flint A.C., Maisch U.S., Weishaupt J.H., Kriegstein A.R., Monyer H. 1997. NR2A subunit expression shortens NMDA receptor synaptic currents in developing neocortex. J Neurosci. 17 (7), 2469-76. 547. Cathala L., Holderith N.B., Nusser Z., DiGregorio D.A., Cull-Candy S.G. 2005. Changes in synaptic structure underlie the developmental speeding of AMPA receptor-mediated EPSCs. Nat Neurosci. 8 (10), 1310-8. 548. Diamond J.S. 2005. Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development. J Neurosci. 25 (11), 2906-16. 549. Koike-Tani M., Saitoh N., Takahashi T. 2005. Mechanisms underlying developmental speeding in AMPA-EPSC decay time at the calyx of Held. J Neurosci. 25 (1), 199-207. 274 550. Takahashi T. 2005. Postsynaptic receptor mechanisms underlying developmental speeding of synaptic transmission. Neurosci Res. 53 (3), 229-40. 551. Lester R.A., Clements J.D., Westbrook G.L., Jahr C.E. 1990. Channel kinetics determine the time course of NMDA receptor-mediated synaptic currents. Nature. 346 (6284), 565-7. 552. Lozovaya N.A., Grebenyuk S.E., Tsintsadze T., Feng B., Monaghan D.T., Krishtal O.A. 2004. Extrasynaptic NR2B and NR2D subunits of NMDA receptors shape 'superslow' afterburst EPSC in rat hippocampus. J Physiol. 558 (Pt 2), 451-63. 553. Thomas C.G., Miller A.J., Westbrook G.L. 2006. Synaptic and extrasynaptic NMDA receptor NR2 subunits in cultured hippocampal neurons. J Neurophysiol. 95 (3), 1727-34. 554. Lozovaya N.A., Kopanitsa M.V., Boychuk Y.A., Krishtal O.A. 1999. Enhancement of glutamate release uncovers spillover-mediated transmission by N-methyl-D-aspartate receptors in the rat hippocampus. Neuroscience. 91 (4), 1321-30. 555. Arnth-Jensen N., Jabaudon D., Scanziani M. 2002. Cooperation between independent hippocampal synapses is controlled by glutamate uptake. Nat Neurosci. 5 (4), 325-31. 556. Carmignoto G., Vicini S. 1992. Activity-dependent decrease in NMDA receptor responses during development of the visual cortex. Science. 258 (5084), 100711. 557. Erisir A., Harris J.L. 2003. Decline of the critical period of visual plasticity is concurrent with the reduction of NR2B subunit of the synaptic NMDA receptor in layer 4. J Neurosci. 23 (12), 5208-18. 558. Liu X.B., Murray K.D., Jones E.G. 2004. Switching of NMDA receptor 2A and 2B subunits at thalamic and cortical synapses during early postnatal development. J Neurosci. 24 (40), 8885-95. 559. Monyer H., Burnashev N., Laurie D.J., Sakmann B., Seeburg P.H. 1994. Developmental and regional expression in the rat brain and functional properties of four NMDA receptors. Neuron. 12 (3), 529-40. 560. Sheng M., Cummings J., Roldan L.A., Jan Y.N., Jan L.Y. 1994. Changing subunit composition of heteromeric NMDA receptors during development of rat cortex. Nature. 368 (6467), 144-7. 561. Fu Z., Logan S.M., Vicini S. 2005. Deletion of the NR2A subunit prevents developmental changes of NMDA-mEPSCs in cultured mouse cerebellar granule neurones. J Physiol. 563 (Pt 3), 867-81. 275 562. Dingledine R., Borges K., Bowie D., Traynelis S.F. 1999. The glutamate receptor ion channels. Pharmacol Rev. 51 (1), 7-61. 563. Montgomery J.M., Pavlidis P., Madison D.V. 2001. Pair recordings reveal allsilent synaptic connections and the postsynaptic expression of long-term potentiation. Neuron. 29 (3), 691-701. 564. Yanagisawa T., Tsumoto T., Kimura F. 2004. Transiently higher release probability during critical period at thalamocortical synapses in the mouse barrel cortex: relevance to differential short-term plasticity of AMPA and NMDA EPSCs and possible involvement of silent synapses. Eur J Neurosci. 20 (11), 3006-18. 565. Bolshakov V.Y., Siegelbaum S.A. 1995. Regulation of hippocampal transmitter release during development and long-term potentiation. Science. 269 (5231), 1730-4. 566. Kumar S.S., Huguenard J.R. 2001. Properties of excitatory synaptic connections mediated by the corpus callosum in the developing rat neocortex. J Neurophysiol. 86 (6), 2973-85. 567. Wasling P., Hanse E., Gustafsson B. 2004. Developmental changes in release properties of the CA3-CA1 glutamate synapse in rat hippocampus. J Neurophysiol. 92 (5), 2714-24. 568. Zhang Z.W. 2004. Maturation of layer V pyramidal neurons in the rat prefrontal cortex: intrinsic properties and synaptic function. J Neurophysiol. 91 (3), 117182. 569. Huettner J.E., Bean B.P. 1988. Block of N-methyl-D-aspartate-activated current by the anticonvulsant MK-801: selective binding to open channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (4), 1307-11. 570. Rosenmund C., Clements J.D., Westbrook G.L. 1993. Nonuniform probability of glutamate release at a hippocampal synapse. Science. 262 (5134), 754-7. 571. Hessler N.A., Shirke A.M., Malinow R. 1993. The probability of transmitter release at a mammalian central synapse. Nature. 366 (6455), 569-72. 572. Chen N., Luo T., Raymond L.A. 1999. Subtype-dependence of NMDA receptor channel open probability. J Neurosci. 19 (16), 6844-54. 573. Durand G.M., Kovalchuk Y., Konnerth A. 1996. Long-term potentiation and functional synapse induction in developing hippocampus. Nature. 381 (6577), 71-5. 574. Wu G., Malinow R., Cline H.T. 1996. Maturation of a central glutamatergic synapse. Science. 274 (5289), 972-6. 276 575. Isaac J.T., Crair M.C., Nicoll R.A., Malenka R.C. 1997. Silent synapses during development of thalamocortical inputs. Neuron. 18 (2), 269-80. 576. Franks K.M., Isaacson J.S. 2005. Synapse-specific downregulation of NMDA receptors by early experience: a critical period for plasticity of sensory input to olfactory cortex. Neuron. 47 (1), 101-14. 577. Groc L., Gustafsson B., Hanse E. 2006. AMPA signalling in nascent glutamatergic synapses: there and not there! Trends Neurosci. 29 (3), 132-9. 578. Nakayama K., Kiyosue K., Taguchi T. 2005. Diminished neuronal activity increases neuron-neuron connectivity underlying silent synapse formation and the rapid conversion of silent to functional synapses. J Neurosci. 25 (16), 404051. 579. Barria A., Malinow R. 2005. NMDA receptor subunit composition controls synaptic plasticity by regulating binding to CaMKII. Neuron. 48 (2), 289-301. 580. Scherzer C.R., Landwehrmeyer G.B., Kerner J.A., Counihan T.J., Kosinski C.M., Standaert D.G., Daggett L.P., Velicelebi G., Penney J.B., Young A.B. 1998. Expression of N-methyl-D-aspartate receptor subunit mRNAs in the human brain: hippocampus and cortex. J Comp Neurol. 390 (1), 75-90. 581. Zuo Y., Yang G., Kwon E., Gan W.B. 2005. Long-term sensory deprivation prevents dendritic spine loss in primary somatosensory cortex. Nature. 436 (7048), 261-5. 582. Clancy B., Darlington R.B., Finlay B.L. 2001. Translating developmental time across mammalian species. Neuroscience. 105 (1), 7-17. 583. Grutzendler J., Kasthuri N., Gan W.B. 2002. Long-term dendritic spine stability in the adult cortex. Nature. 420 (6917), 812-6. 584. Trachtenberg J.T., Chen B.E., Knott G.W., Feng G., Sanes J.R., Welker E., Svoboda K. 2002. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-94. 585. Holtmaat A., Wilbrecht L., Knott G.W., Welker E., Svoboda K. 2006. Experience-dependent and cell-type-specific spine growth in the neocortex. Nature. 441 (7096), 979-83. 586. Knott G.W., Holtmaat A., Wilbrecht L., Welker E., Svoboda K. 2006. Spine growth precedes synapse formation in the adult neocortex in vivo. Nat Neurosci. 9 (9), 1117-24. 587. Stettler D.D., Yamahachi H., Li W., Denk W., Gilbert C.D. 2006. Axons and synaptic boutons are highly dynamic in adult visual cortex. Neuron. 49 (6), 87787. 277 588. Katz L.C., Crowley J.C. 2002. Development of cortical circuits: lessons from ocular dominance columns. Nat Rev Neurosci. 3 (1), 34-42. 589. LeVay S., Wiesel T.N., Hubel D.H. 1980. The development of ocular dominance columns in normal and visually deprived monkeys. J Comp Neurol. 191 (1), 151. 590. Horton J.C., Hocking D.R. 1997. Timing of the critical period for plasticity of ocular dominance columns in macaque striate cortex. J Neurosci. 17 (10), 3684709. 278
