инокуляция, накопление и идентификация вируса картофеля pvy
advertisement
С.Сейфуллин атындағы Қазақ агротехникалық университетінің Ғылым жаршысы / Вестник науки Казахского агротехнического университета им. С.Сейфуллина. – 2012. №4 (75). – С.31-36 ИНОКУЛЯЦИЯ, НАКОПЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВИРУСА КАРТОФЕЛЯ PVY В ТЕСТ-РАСТЕНИЯХ Nicotiana tabacum и Nicotiana bentamiana Хасанов В. Т., Муранец А. П., Оразбаева Г.К. , Букаев А.А. Аннотация В статье представлены результаты исследований по отработке оптимальных параметров инокуляции, накопления и идентификации вируса картофеля в тест-растениях Nicotiana tabacum и Nicotiana bentamiana. Более восприимчивым тест-растением был Nicotiana tabacum (сорт Самсун). Заражение PVY вирусом у данного вида табака отмечалось на всех этапах тестирования. У растений Nicotiana bentamiana накопление PVY вируса отмечалось на 15-е сутки. Ключевые слова: вирус картофеля PVY; тест-растения; Nicotiana tabacum; Nicotiana bentamiana, инокуляция, иммуноферментный анализ (ИФА). Вирусные болезни - самые опасные болезни картофеля. Симптомами вирусных заболеваний могут быть скручивание листьев, их пожелтение (часто пятнами), общее угнетение растения. Симптомы могут сильно изменяться в зависимости от сорта, штамма (или смеси) вирусов и условий выращивания. Иногда ботва вообще не имеет признаков поражения, но наблюдается сильное снижение урожая. Наиболее опасным считается вирус полосчатой и морщинистой мозаики - PVY. Поражение данным вирусом вызывает потери урожая 50% и более, в зависимости от сорта и условий культивирования [1, 2]. Массовый мониторинг зараженности посадочного материала картофеля вирусами возможен при использовании простых, надежных и высокочувствительных лабораторных методов для широкого круга вирусов растений. Одним из таких надёжных методов диагностики является иммунохроматографические экспресс-тесты, позволяющие достоверно, в течение 10-15 минут, без использования специального лабораторного оборудования, определять в соке растений картофеля наличие вируса [3]. Разработка методов иммуноферментной диагностики и внедрение их в практику требует решения целого ряда проблем, связанных с выделением высокоочищенных препаратов вирусов (антигенов), получением больших количеств специфических антител, отработкой эффективных методов мечения антител ферментами и оптимизацией условий проведения анализа. Вирусные препараты, которые используются при иммунизации животных для получения антител, применяемых в иммунодиагностике, должны удовлетворять целому ряду требований. Основные из них следующие: максимальное сохранение антигенных свойств, отсутствие загрязнения другими вирусами и компонентами растений-накопителей. Наличие высококачественных препаратов вирусов обеспечивает получение специфических антител (в сыворотке иммунизированных животных), специфических к тому или иному антигену [4]. Многие из растений реагируют на вирусы системным заражением, то есть вирус свободно передвигается по всему растению, вызывая видимые симптомы. Таким индикатором на вирусы PVY служит, например, табак Nicotiana tabacum. При заражении соком больных PVY вирусом растений картофеля молодых растений табака, через 15-25 дней на листьях табака появляется резкое посветление жилок в случае наличия Y-вируса [5, с.27]. К растениям, обладающим сверхчувствительностью, способными быть индикаторами, относятся также гибрид Аквила х Solanum demissum (A-6) – Y, S. chacoense (TЕ-1) и некоторые другие растения [4]. Целью наших исследований была инокуляция, накопление и идентификация PVY вируса в тест-растениях Nicotiana tabacum и Nicotiana bentamiana. Методы исследований Инокуляцию, накопление, выделение и очистку вирусов картофеля проводили в научно-образовательном инновационном центре агробиологических исследований АО«Каз АТУ им. С. Сейфуллина», в соответствии со стандартной методикой [5, с.72]. В качестве накопителя Y-вируса картофеля использовали растения Nicotiana tabacum сорта Самсун и Nicotiana bentamiana. Тест-растения выращивали из семян на торфогрунте «Живая земля» в смеси с торфогрунтом в соотношении 1:1 (рисунок 1). Рисунок 1 - Растения табака Nicotiana tabacum (сорт Самсун) и Nicotiana bentamiana после пикировки Для получения инфекционного сока при инокуляции тест-растений использовали инфицированные вирусом PVY пробирочные растения табака сорта Samsun, картофеля сорта Черри. Пробирочные растения размножали методом черенкования in vitro и культивировали на жидкой безгормональной питательной среде на минеральной основе по Мурасиге и Скуга, включающей 2% сахарозы при 5-10 тыс. лк., температуре 20-25 °С, относительной влажности воздуха 60-70%, 16-часовом фотопериоде. Мелко нарезанные растения растирали в ступке с добавлением буфера для проб и конъюгатов (из расчета: на 0,1 г растительной ткани – 1 мл буфера) и карборунда, затем из растертой массы отжимали сок через двойной слой марли и втирали его в лист здорового растения в фазе 2-4 листьев ватным тампоном или шпателем, обернутым тонким слоем ваты (рисунок 2). Рисунок 2 - Этапы инокуляции Nicotiana tabacum cорта Самсун вирусом PVY Инокулированное растение затеняли на сутки, после чего оно содержалось на рассеянном свету. Растения картофеля и табака тестировали методом двойного наслоения антител («сэндвич-вариант» ИФА) по стандартной методике [6, 7]. Результаты ИФА учитывали с помощью спектрофотометра с Результаты исследований В целях изучения эффективности инокуляции и накопления вируса картофеля PVY для приготовления инфекционного сока использовались больные растения с четкими симптомами заболеваний. Зараженность исходных растений подтверждалась с помощью «сэндвич–варианта» ИФА (таблица 1). Для инокуляции были также использованы поражённые вирусом PVY растения картофеля сорта Blue Sweden. Неудачными оказались вертикальным потоком света (ASYS Expert 96, Австрия) при длине волны 490 нм. При проведении анализа применялись диагностические наборы для определения вирусов картофеля ГНУ Всероссийский НИИ картофельного хозяйства им. А.Г. Лорха РАСХН (п. Коренево). попытки заразить растения табака как традиционным методом втирания сока, от зараженного растения в листовую поверхность с помощью карборунда, так и введением сока растений картофеля с высокой концентрацией вируса шприцом в главную и боковые жилки листьев табака. Аналогичные результаты были получены и при инокуляции тест-растений инфекционным соком сортообразца Ditta №2. Таблица 1 - Зараженность растений табака и картофеля вирусом PVY, отобранные для инокуляции тест-растений N п/п Вирус Сортообразец, зараженный вирусом 1 PVY 2 PVY Оптическая плотность в ИФА,нм Образец Растения картофеля сорта 1,322 Blue Sсhweden, выращиваемое в лабораторных условиях Растения картофеля сорта 1,015 Ditta №2, выращиваемое в лабораторных условиях Positive 1,446 Negative 0,012 1,131 0,032 0,974 0,016 0,974 0,016 1,485 0,003 Продолжение таблицы 1 3 PVY 4 PVY 5 PVY Растения картофеля 0,826 Nicoti-ana bentamiana №31, выращиваемое в лабораторных условиях Пробирочное растение 0,564 Nicotiana tabacum сорта Сaмсун Пробирочное растение 1,608 картофеля сорта Сherie Использование инфекционного сока пробирочных растений картофеля Nicotiana tabacum сорта Самсун (ранее введен в культуру), а также сока растения картофеля Nicotiana bentamiana №31, выращиваемое в лабораторных условиях дало положительные результаты (таблица 2). Всего была предпринята попытка инокулировать 94 растения 2-х видов табака: 50/50%. Результаты, представленные в таблице 2, свидетельствуют о том, что положительная реакция была выявлена у девяти растений табака. Следует отметить, что растения Nicotiana tabacum сорта Самсун оказались более восприимчивыми к заражению PVY (начало заражения – 7-е сутки) в отличие от Nicotiana bentamiana, у которого заражение начиналось несколько позднее – на 15-е сутки. Примерно у 10% заражённых растений наблюдалось пожелтение жилок, и отмечались некрозы тканей листьев. Полученные результаты исследований по инокуляции растений Nicotiana tabacum сорта Самсун соответствуют данным Гнутовой Р.В., в которых показано, что вирус PVY имеет максимальную концентрацию при инокуляции растений на 15 день, затем его концентрация снижается и на 60-е сутки практически не улавливается гомологичной антисывороткой [8]. В литературе также имеются аналогичные сведения об обнаружении вируса методами ИФА и капельной агглютинации уже на 10-14 сутки после заражения растений табака сорта Самсун NN инфекционным соком, содержащим YBK-0-1Л, полученным из штаммовых растений табака. Максимальное накопление вируса при этом установлено через 14-20 дней после заражения [9]. Таблица 2 - Результаты тестирования заражённых растений табака вирусом картофеля PVY № Вирус Растение, сорт линии PVY 10 PVY 31 PVY 36 PVY 37 PVY 38 PVY Nicotiana bentamiana Nicotiana bentamiana Nicotiana bentamiana Nicotiana bentamiana Nicotiana tabacum, сорт Самсун Значения оптической плотности ИФА после заражения, нм на 7-е сутки на 15-е на 25-е сутки сутки 0,008 0,826 1,335 0,019 0,826 0,526 0,110 0,248 0,221 0,418 0,927 0,784 0,003 1,313 0,767 0,571 1,211 0,936 0,497 1,070 0,977 Продолжение таблицы 2 42 43 PVY PVY Nicotiana tabacum, Самсун Nicotiana tabacum, сорт сорт в - PVY Самсун Nicotiana tabacum, Самсун Nicotiana tabacum, Самсун Positive - PVY Negative 44 PVY 1000 PVY 0,102 0,751 0,232 0,180 0,412 0,343 0,865 1,021 0,912 0,019 0,023 0,021 сорт сорт В наших исследованиях у Nicotiana tabacum сорта Самсун содержание инфекции отмечалось на всех этапах тестирования: с 7-х по 25-е сутки. Недолговременное присутствие (15-е сутки) вирусной инфекции у Nicotiana bentamiana отчетливо видно на примере линии Выводы Новизна проведённых исследований заключается в получении препаратов вирусов (антигенов), которые будут использоваться для создания новых отечественных иммунохроматографических экспресс-тестов. Изложенный материал и полученные результаты исследований свидетельствуют, что фаза активного синтеза вирусного белка и накопление PVY вирусов в тест-растениях Nicotiana tabacum происходит на 7-е сутки, а в тест-растениях Nicotiana bentamiana позднее, на 15-е сутки. В результате исследований установлено, что более восприимчивым к вирусу PVY был Nicotiana tabacum сорта Самсун. №31, парараллельно используемой ранее для инокуляции других растений табака. Таким образом, проведена инокуляция растений табака, идентифицированы изучаемые вирусы картофеля для последующего получения очищенного вирусного препарата. Содержание инфекции у данного вида табака отмечалось на всех этапах тестирования: с 7-х по 25-е сутки. Недолговременное присутствие (15-е сутки) вирусной инфекции наблюдалось у Nicotiana bentamiana. В процессе эксперимента наиболее эффективная инокуляция тест-растений установлена при использовании инфекционного сока пробирочных растений картофеля сорта Сherie, у которых оптическая плотность в ИФА составляла 1,606 нм. Список литературы 1. Болезни картофеля / К.В. Попкова, Ю.И. Шнейдер и др. - М.: Колос,1980. – 304 с. 2. Бобкова А.Ф., Чирков С.Н. Применение иммуноферментного анализа для диагностики вирусных заболеваний картофеля: Обзор // Сельскохозяйственная биология. – 1983. – №5. – С. 32-35. 3. Кравченко Д.В., Усков A.И., Варицев Ю.А. Диагностика вирусов картофеля методом иммунохроматографии на тест-полосках / Информационный бюллетень. - № 6. – 2011. – C. 34-36. 4. [Электрон. ресурс]. http://agrosbornik.ru/agrosbornik4.html (дата обращения: 16.11.2012). 5. Блоцкая Ж.В. Методы селекции картофеля на устойчивость к вирусным болезням. – Минск, 1984. – 94 с. 6. Инструкция по применению иммуноферментного диагностического набора для определения вирусов картофеля. – Коренево, 2010. – 8 с. 7. Контроль качества и сертификация семенного картофеля: Практическое руководство. – М.: ФГНУ Росинформагротех, 2003. – С. 157-174. 8. Гнутова Р.В. Серология и иммунохимия вирусов растений.. – М.: Наука, 1993. – 301 с. 9. Штамм Y–вируса картофеля для получения антигена, используемого при производстве иммуноферментного диагностикума / Ю.А. Варицев, Л.И. Егорова, Г.П. Варицева и др. // Патент Российской Федерации. – №2068882. – опубл. 10.11.1996. Түйін PVY-ның тазаланған вирустық препаратын алу үшiн темекі өсiмдiгінiң әр түрлi түрлерiнде - Nicotiana Tabacum және Nicotiana вentamiana картоптың зерттеліп отырған вирусының инокуляциясы, жинақталуы және теңестiрілу жұмыстары жүргiзiлдi. Нәтижесінде жүргізілген зерттеу жұмыстары PVY-ның вирусына сезімтал Самсунның Nicotiana tabacum сорты болатыны анықталды. Темекінің осы түрінің құрамындағы инфекция тестілеудің барлық кезеңдерiнде байқалды: 7-шiден 25-ке дейiнгі тәулікте. Темекінің Nicotiana bentamiana түрінде вирустық инфекция (15-ші тәуліктегі) ұзақ сақталмайтындығы байқалды. Зерттеу үрдісінде тест-өсімдіктерінің анағұрлым тиімді инокуляциясына картоптың Сherie сорты пробиркалық өсімдігінің инфекциялық шырынын қолданған кезде қол жеткізілді, оның оптикалық тығыздығы ИФТ-да 1,606 нм тең. Summary To obtain a highly purified virus preparation PVY was inoculated, collected and identified the virus in different types of potatoes tobacco plant: Nicotiana Tabacum and Nicotiana Bentamiana. It was found that Nicotiana tabacum Samsun varieties more susceptible to the virus PVY. Infection with this type of tobacco was noted at all stages of testing: from the 7th to 25th day. Presence of too short duration (15 days) of viral infection was observed in Nicotiana bentamiana. During the experiment, the most effective inoculation test plant installed by using test-tube infection juice potato varieties Сherie. The optical density of samples in the ELISA was 1,606 nm.
