МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ
УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
«БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»
БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ
«УТВЕРЖДАЮ»
Проректор
по научной работе БашГУ
В.П. Захаров
ОТЧЕТ
о научно-исследовательской работе
«Исследованиеэмбриотоксического действия
метилового эфира 2-бензимидазолилкарбаминовой кислоты (БМК, бавестин,
карбендазим) и его комплексного соединения с сульфатом меди,
БМК2·CuSO4»
Руководитель темы
Ответственный исполнитель
С.А. Башкатов
Л.А. Шарафутдинова
Уфа-2015
1
Введение
Изучение
репродуктивной
токсичности
–
влияния
лекарственныхсредств на генеративную функцию, развитие плода и
потомства – является обязательной частью доклинического изучения их
безопасности,поскольку по статистике до 80% женщин применяют какиелибо медикаменты во время беременности, и около 3% новорожденных
имеют родовые дефекты или аномалии развития. Этиология более чем
половиныврожденных дефектов у человека неизвестна. Определенную долю
в этойчасти составляют лекарственные препараты. Лекарственное
веществоможет обладать эмбриотоксическим действием, оказывая прямое
токсическое
действие
на
плод
после
проникновения
через
плацентарныйбарьер либо воздействуя на плаценту или материнский
организм. Эмбриотоксичность может проявляться как в повышении уровня
эмбриональной гибели (эмбриолетальное действие), так и в виде
анатомических,
гистологических,
цитологических,
биохимических,
нейрофизиологических отклонений от нормы (тератогенное действие),
проявляющихся доили после рождения. Эмбрио- и фетотоксичность могут
проявляться визменении массы тела, краниокаудального размера плода,
задержке оссификации скелета (общая задержка развития), увеличении
смертности.Могут наблюдаться различные отклонения в развитии потомства.
Выявление в эксперименте такого рода отдаленных эффектов лекарств
имеетбольшое практическое значение в антенатальной охране здоровья
детей.Изучение воздействия фармакологических веществ на отдельных
стадиях репродукции позволяет не только избежать отрицательных
моментов,связанных с длительным введением препаратов, но и приблизить
экспериментальные условия к клиническим.В связи с этим изучение
воздействия лекарственных средств на показатели репродуктивной функции
животных представляется актуальной задачей.
Цель работы – выявление возможных эмбриотоксических свойств
метилового эфира 2-бензимидазолилкарбаминовой кислоты (БМК, бавестин,
карбендазим) и его комплексного соединения с сульфатом меди,
БМК2·CuSO.
Материал и методы исследования
Работа выполнена в лаборатории оценки безопасности современных
материалов и технологийКафедры физиологии человека и зоологии
биологического факультета Федерального государственного бюджетного
образовательного учреждения высшего профессионального образования
«Башкирский государственный университет» и является разделом НИР
согласно договорана создание (передачу) научно-технической продукции
(№1013 от 5.12.2014). В исследованиях использованметиловый эфир 22
бензимидазолилкарбаминовой кислоты (БМК, бавестин, карбендазим) и его
комплексное соединение с сульфатом меди (БМК2·CuSO4).
Исследование
эмбриотоксических
свойств
БМК
и
БМК2·CuSO4проведено в соответствии с «Методическими указаниями по
изучению репродуктивной токсичности фармакологических веществ» [1].
Изучение эмбриональной токсичности были проведены на 30 самках
нелинейных белых крыс массой 170-210 г. Всех животных содержали в
одинаковых условиях вивария на стандартном сбалансированном рационе.В
течение двух эстральных циклов просматривали вагинальные мазки.
Отмечали стадии проэструс, эструс, диэструс и метаэструс (рис. 1-4).
Вечером подсаживали самцов из расчета 2 самца на 3 самки. Обнаружение в
вагинальных мазках сперматозоидов считали первым днем беременности
(рис. 5). Беременные самки крыс были разделены на 3 группы по 10
животных. Контрольная группа крыс – интактная. Исходя из того, что
карбендазим в дозе 20-80 мг/кг проявляет выраженное эмбриотоксическое
действие [2] животным Опытной группы 1 вводили перорально карбендазимв
дозе 40-80 мг/кг, а Опытной группы 2 -БМК2·CuSO4 в аналогичной
дозеежедневно с 1-го по 19-й день беременности.
На 20-й день беременности проводили эвтаназию животных с
последующим патологоанатомическим исследованием организма крыс и
плодов (рис. 6). Вскрывали брюшную полость (рис. 7-10), вырезали матку и в
чашке Петри с физиологическим раствором, вскрыв рога, подсчитывали
количество живых, мёртвых, резорбированных плодов, состояние плаценты и
эндометрия, отмечая места имплантации (рис. 11). В яичниках подсчитывали
количество жёлтых тел. Плоды подвергали наружному осмотру,
взвешиванию, определяли краниокаудальный размер (длину тела) (рис. 12),
пол плода. Устанавливали пред-ипостимплантационную смертность
эмбрионов, которые являлись показателем эмбриолетального действия
исследуемых веществ.
Для определения предимплантационной смертности находили разницу
между количеством желтых тел (желтое тело — corp. luteum, развивающееся в яичнике
после овуляции из клеток зернистого слоя — str. granulosum — и соединительнотканной оболочки
фолликула — теки фолликула — thecafolliculi; является железой внутренней секреции, выделяет
прогестерон) и количеством мест имплантаций и вычисляли, какую долю в
процентах составила эта цифра от числа желтых тел. Для определения
постимплантационной смертности вычисляли разность между количеством
мест имплантаций и количеством живых плодов и, вычисляли, какую долю в
процентах составила эта цифра от числа имплантаций. Для вычисления
общей эмбриональной смертности находили разность между числом желтых
тел беременности и количеством живых плодов и,определяли какую долю в
процентах составила эта цифра от числа желтых тел беременности.
После оценки жизнеспособности плодов, определения их массы,
проводили анализ внешних аномалий (подкожные кровоизлияния, отек
подкожной клетчатки) и пороков развития (искривления конечностей и
позвоночного столба, изменения глазных яблок, ушных раковин).
3
Математико-статистическую обработку данных производили с
использованием
лицензионного
пакета
прикладных
программ
«STATISTICA» v.7.0 (StatSoftInc., США). В модуле «Основные статистики»
(«BasicStatistics») по всем изученным количественным показателям были
подсчитаны следующие основные характеристики: выборочное среднее
(среднее арифметическое, Mean), стандартную ошибку среднего
(StandardErrorofMean) и стандартное отклонение (StandardDeviation).
Для всех выборок проводили анализ соответствия вида распределения
количественных признаков закону нормального распределения с помощью
критерия Шапиро-Уилка (Shapirо-Wilk’s W test). Поскольку распределение
признаков в группах являлось нормальным, сравнительный анализ групп
проводился с помощью параметрических методов (t-критерий Стьюдента).
Различия считали статистически значимыми при p < 0,05. Количественные
данные в таблице представлены в виде М ± m, где М – выборочное
среднее, m – стандартная ошибка средней.
Результаты исследования
В результате проведенного исследования установлено, что клиническое
состояние самок крысопытных групппри ежедневном пероральном введении
крысам в период беременности не отличалось от состояния животных
контрольной группы. Все животные поедали корм, адекватно реагировали на
тактильные, болевые, звуковые и световые раздражители. Состояние
кожного покрова и слизистых оболочек крыс из опытной группы визуально
не отличалось от таковых в контроле.
Нормальное течение беременности контрольной и опытных групп
животных
подтверждалось
еженедельнымвзвешиванием,
взятием
влагалищных мазков на 9-е и 10-е сутки беременности.
БМК2·CuSO4(Опыт 2) при пероральном введении беременным крысам с
1 по 19-дни беременности не влияет на динамику массы тела беременных
крыс и продолжительность беременности (табл. 1). Карбендазим же в
аналогичной дозе негативно влиял на прирост массы тела (Опыт 1). Так, если
ко 2-й неделе беременности крысы, получавшие БМК2·CuSO4прибавилив
среднем13,76 ±0,51 % по отношению к первоначальному весу, то крысы,
которым перорально вводили карбендазим - 5,45 ± 3,77 %.
Таблица 1
Динамика массы тела беременных крыс (+% к исходной)
Группы
1 неделя
2 неделя
3 неделя
n
животных
М±m
М±m
М±m
Контроль, %
10
5,42±2,02
13,59 ± 2,1
29,09 ± 2,8
Опыт 1
БМК
10
15,24±4,54
5,45 ± 3,77
20,4± 2,31
(карбендазим),%
Опыт 2
10
1,55±0,63
13,76 ±0,51
28,52 ± 0,9
БМК2·CuSO4,%
4
Таблица 2
Показатели эмбриотоксического действия БМК и БМК2·CuSO4при
пероральном введении крысам с 1 по 19 день беременности
Исследуемые показатели
Количество желтых тел на 1
крысу, шт
Количество мест имплантации
на 1 крысу, шт
Количество эмбрионов на 1
крысу, шт
Предимплантационная
смертность, %
Постимплантационная
смертность, %
Общая эмбриональная
смертность, %
Кранио-каудальный размер
плода, см
Масса плода, г
Группы животных
Опыт 1
Опыт 2
Контроль
БМК
БМК2·CuSO4
(карбендазим)
10,8±0,43
13,71±1,65
10,6±0,24
9,7 ± 1,33
9,6 ± 0,47
9,6±0,24
9,2±0,48
5,28 ± 0,91
9,2±0,48
10,19
29,97*
9,45
3,81
45,00*
4,44
13,61
61,48*
13,45
3,07 ± 0,03
3,16 ± 0,15
3,13±0,01
2,26 ± 0,05
2,36 ± 0,26
2,17 ± 0,05
Примечание: *- статистически значимые различия по сравнению с опытной
группой (p<0,05).
Результаты количественной оценки репродуктивной функции крыс и
состояния потомства в антенатальном периоде групп Контроль и Опыт 1 и 2
представлены в табл. 2.
На момент вскрытия все плоды во всех группах были живы.
Продолжительность беременности, количество живых плодов, масса их тела
и кранио – каудальный размер, количество желтых тел, мест имплантации у
беременных крыс при ежедневном пероральном введении БМК2·CuSO4не
отличались от соответствующих показателей у животных контрольной
группы (см. табл. 2).
По результатам, представленным в табл. 2 видно, что среднее
количество крысят в помете в группе Опыт 2соответствовало контрольной
группе (9,2±0,48 и 9,2±0,48 соответственно). Количество желтых тел из
расчета на одну самку в группе Опыт 2 было примерно на одном уровне и
соответствовало животным контрольной группы (10,6±0,24 и 10,8±0,43
соответственно). Количество мест имплантации из расчета на одну самку в
5
группе Опыт 2 также соответствовало контролю (9,6±0,24 и 9,7 ± 1,33
соответственно).
Предимплантационная гибель зародышей в группе Опыт 2
соответствовала контролю (9,45% и 10,19 % соответственно).
В группе Опыт 1 предимплантационная гибель зародышей была выше,
чем в контрольной группе на 19,78%.
Постимплантационная гибель зародышей в группе опыт 2
соответствовала контролю, а в группе Опыт 1 (БМК, карбендазим)была
существенно больше(p<0.05)и составила 45%, что на 41,19%выше
относительно контроля.
Таким образом, общая эмбриональная смертность зародышей в группе
Опыт 2 (БМК2·CuSO4) соответствовала контрольной группе и составила
13,45%, тогда как в группе Опыт 1 была достоверно выше (61,48%) чем в
контрольной группе (13,61%).
Установлено, что пероральное введение комплексного соединения
карбендазима с сульфатом меди(БМК2·CuSO4) беременным крысамне
оказывает эмбриотоксического действия: в группе Опыт 2 показатели
предимплантационной,
постимплантационной
смертности,
общая
эмбриональная смертность не отличалась от таковых группы Контроль.
Средняя масса живых эмбрионов у животных опытных групп не
отличалась от контроля. Кранио-каудальный размер плодов в опытных
группах 1 и 2 соответствует контролю.
70
60
50
40
Предимплантационная
смертность, %
30
Постимплантационная
смертность, %
20
Общая эмбриональная
смертность, %
10
0
Контроль
карбендазим
БМК2·CuSO4
6
Заключение
Изучение эмбриотоксического действия метилового эфира 2бензимидазолилкарбаминовой кислоты (БМК, бавестин, карбендазим) и его
комплексного соединения с сульфатом меди, БМК2·CuSO4 показало, что
БМК, бавестин, карбендазимв испытанной дозе при пероральном
поступлении беременным крысам с 1 по 19 день беременности отрицательно
влияет на динамику массы тела животных, повышает показатели пред- и
постимплантационнойсмертности, общей эмбриональной смертности, в то
время как его комплексное соединение БМК2·CuSO4 не вызывает
подобных эффектов.
Таким образом, из двух представленных соединений метиловый эфир
2-бензимидазолилкарбаминовой кислоты (БМК, бавестин, карбендазим)
обладает выраженным эмбриотоксическим действием.
Литература:
1.
Хабриев Р.У. Руководство по экспериментальному (доклиническому)
изучению новых фармакологических веществ. /Под ред.Р.У. Хабриева. 2-е
изд. перераб.и доп. –М.: Медицина, 2005
2.
Janardhan A., Sattur P.B., Sisodia. Teratogenicity od methyl
menzimidazolecarbomate in ratsand rabbits// Bull. Environ Contamin
Toxicol.1984. V 33, # 3 P. 257-263.
3.
Руководство по лабораторным животным и альтернативным моделям в
биомедицинских исследованиях/ под редакцией Н.Н. Каркищенко, С.В.
Грачева.
М.:
Профиль–2С,
2010,
358
с.
1000
экз.
http://www.scbmt.ru/mag/rukovodstvo.pdf
Руководитель темы,
д.б.н., профессор
С.А. Башкатов
Ответственный исполнитель,
к.б.н., доцент
Л.А.Шарафутдинова
7
Приложение
Рис 1. Стадия эстрального цикла - анэструс (в мазке преобладают слизь и лейкоциты).
Рис.2. Стадия эстрального цикла - проэструс (преобладают эпителиальные клетки).
8
Рис. 3. Стадия эстрального цикла - эструс (стадия течки, в которой преобладают
ороговевшие эпителиальные клетки).
Рис. 4. Стадия эстрального цикла - метэструс (обнаруживается наличие ороговевших
клеток и вновь появляющихся лейкоцитов).
9
Рис.5. Беременность (наличие сперматозоидов в мазке).
Рис
6. Эвтаназия животных.
10
Рис. 7-8. Процесс вскрытия брюшной полости крысы.
11
Рис.9.Процесс вскрытия брюшной полости крысы. В полости матки опытной
группы – эмбрионы.
Рис.10. Матка крысы контрольной группы с эмбрионами.
12
Рис. 11. Расположение эмбрионов в полости матки.
Рис.12. Определение кранио-каудального размера плода.
13
Рис. 13. Эмбрионы, плаценты крыс опытной группы (БМК-комплекс с
сульфатом меди).
14
Рис. 14. Эмбрион, плаценты (постимплантационная смертность) самки
контрольной группы ( БМК, карбендазим).
15