М3В1 Техническая микробиология (МУ к лабораторным занятиям)

Министерство образования и науки Российской Федерации
Сибирский федеральный университет
ТЕХНИЧЕСКАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ
Методические указания к лабораторным занятиям
Красноярск
СФУ
2013
УДК
ББК
Т
Рецензенты:
Составитель С.В. Прудникова
Т
Техническая микробиология: Методические указания к лабораторным
занятиям [Текст] / сост. С.В. Прудникова. – Красноярск: Сиб. федер.
ун-т, 2013. – 18 с.
ISBN
Методические указания составлены в соответствии с учебным планом и
программой по дисциплине «Техническая микробиология». Пособие содержит
тематический план и содержание лабораторных занятий, контрольные вопросы;
представлены источники основной и дополнительной литературы в соответствии с темами
занятий. В пособие даны рекомендации для написания отчета по лабораторным работам.
Методические указания предназначены для студентов, обучающихся по направлению
«Биология», магистерская программа «Микробиология и биотехнология».
 С. В. Прудникова
 ФГАОУ ВПО «Сибирский федеральный
университет», 2013
2
СОДЕРЖАНИЕ
САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ
АНАЛИЗ
ПИЩЕВЫХ
ПРОДУКТОВ ........................................................................................................... 4
Работа 1. Бактериологический анализ молока и кисломолочных
продуктов.............................................................................................................. 5
Работа 2. Бактериологический анализ мяса и мясных продуктов ... 13
УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ ПО ДИСЦИПЛИНЕ .......... 17
3
САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПИЩЕВЫХ
ПРОДУКТОВ
Многие пищевые продукты являются благоприятной средой для
размножения микроорганизмов. Кроме того, технологические процессы
производства ряда продуктов питания (молочнокислые продукты, квас, пиво,
хлеб и пр.) предусматривают внесение и развитие специфической
микрофлоры, которая полезна, или по крайней мере не представляет
опасности для человека.
Обычно пищевые продукты подвергаются целому комплексу
исследований, которые направлены на установление соответствия того или
иного продукта существующему для него стандарту, определение
доброкачественности, отсутствия вредных и ядовитых веществ, степени
бактериальной обсемененности и наличия условно-патогенных и патогенных
микроорганизмов.
Установленные медико-биологическими требованиями и санитарными
нормами качества продовольственного сырья и пищевых продуктов
критерии безопасности включают определение следующих групп
микроорганизмов.
 Санитарно-показательные микроорганизмы. Определяют мезофильные
аэробные и факультативно анаэробные микроорганизмы (их число
выражают количеством колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 г или 1
см3 продукта) и «бактерии группы кишечной палочки» (БГКП).
 Потенциально-патогенные
микроорганизмы.
Определяют
коагулазоположительные Staphylococcus aureus, Bacillus cereus,
сульфитредуцирующие клостридии, бактерии рода Proteus, Pseudomonas
aeruginosa, Vibrio parahaemolyticus.
 Патогенные микроорганизмы, в том числе сальмонеллы, Listeria
monocytogenes.
 Показатели микробиологической стабильности продукта – включают
дрожжи, плесени и молочнокислые бактерии.
На результаты санитарно-микробиологических анализов могут
повлиять различные факторы, поэтому при проведении таких исследований
необходимо соблюдать следующие принципы: правильный отбор проб;
серийность проводимых анализов; применение только стандартных и
унифицированных методов исследования; использование комплекса тестов
(прямых и косвенных); проведение оценки объектов по совокупности
полученных результатов (с учетом результатов, полученных с помощью
органолептических, химических, физических и других методов).
Приводимые работы знакомят студентов с методами санитарной
микробиологии.
4
Цель работы – получение навыков проведения санитарнобактериологической экспертизы пищевых продуктов.
Материалы, оборудование, приборы, реактивы. Стерильные чашки
Петри;
стерильные
пробирки;
стерильные
пипетки;
петли
бактериологические; скальпель; ступка фарфоровая с пестиком; лупа; бумага
фильтровальная; вата; микроскопы; стекла предметные и покровные; весы;
микроскоп; термостаты на 25, 30 и 37 °С Стерильный 0,85%-й раствор NaCl
(или вода водопроводная стерильная); среды: Эндо, Кесслера (или КОДА),
МПА, Сабуро, желточно-солевой (или молочно-солевой) агар, солевой
бульон, среды Клиглера и Козера, селенитовый бульон, висмут-сульфит агар,
среда Вильсона-Блера, полужидкая среда с глюкозой, свежеприготовленный
раствор диметил-n-фенилендиамина; свежеприготовленный 3%-й раствор
КОН; раствор перекиси водорода (30 г/дм3); реактивы для окраски по Граму;
фуксин; 70%-й этанол; бумага индикаторная универсальная.
Работа 1. Бактериологический анализ молока и кисломолочных
продуктов
Молоко – хорошая среда для микроорганизмов. В нем содержатся
белки, небольшое количество пептона, свободные аминокислоты, молочный
жир, молочный сахар, витамины (A, D, Е, С, РР и группы В) и другие
соединения. При благоприятных температурных условиях микроорганизмы
бурно размножаются в молоке и ухудшают его качество.
Обсеменение молока микроорганизмами происходит при доении и
хранении. Бактерии попадают в молоко из вымени, с кожи животного,
посуды, оборудования, из корма, с рук и одежды доильщика, а при
стойловом содержании животных – из желудочно-кишечного тракта
(кишечная палочка, маслянокислые и гнилостные бактерии).
В выводные протоки вымени микроорганизмы проникают через
каналы сосков. Большая часть их погибает благодаря бактерицидным
свойствам ткани вымени. Жизнеспособными остаются наиболее стойкие
группы – микрококки, стрептококки. Вследствие неблагоприятных условий
содержания животных в вымя могут попадать и болезнетворные
микроорганизмы.
При соблюдении санитарных правил в молоке преобладают
микрококки,
молочнокислые
бактерии,
стрептококки
(кишечного
происхождения), сарцины и др. Загрязненное молоко содержит значительное
количество бактерий группы кишечной палочки, маслянокислых и
гнилостных.
Во время хранения изменяется количество содержащихся в молоке
бактерий и соотношение между отдельными их видами. Характер изменений
зависит от температуры, продолжительности хранения и первоначального
состава микрофлоры молока.
При микробиологическом анализе молока определяют общую
5
численность бактерий, учитываемых на агар-агаре с гидролизованным
молоком
или
на
МПА,
численность
санитарно-показательных
микроорганизмов и делают пробу на редуктазу.
Проба на редуктазу. В молоке содержатся различные ферменты, в том
числе редуктаза (анаэробная дегидрогеназа, передающая водород от
окисляемого субстрата любому ненасыщенному соединению, но
неспособная передать его кислороду воздуха). Редуктаза накапливается в
молоке главным образом при размножении в нем микроорганизмов. Поэтому
количество ее в молоке – показатель бактериальной обсемененности молока.
Обнаруживается редуктаза по обесцвечиванию красителей: метиленового
синего или резазурина.
При редуктазной пробе с метиленовым синим прибавляют реактив в
молоко, отчего оно окрашивается в синий цвет. Редуктаза восстанавливает
метиленовый синий, переводя его в бесцветную лейкоформу. Поэтому в
присутствии редуктазы молоко, окрашенное метиленовым синим,
обесцвечивается.
Свеженадоенное молоко восстанавливает метиленовый синий
медленно, с увеличением числа бактерий в молоке скорость восстановления
возрастает. По скорости восстановления в молоке метиленового синего
примерно определяют численность бактерий и степень загрязнения молока.
Однако строгой зависимости между числом бактерий в молоке и временем
обесцвечивания в нем метиленового синего нет, так как каждый вид
бактерий выделяет определенное, неодинаковое количество редуктазы.
Отбор пробы делают после тщательного перемешивания молока.
Стерильным черпаком отбирают 50 мл молока в стерильную посуду,
закрывают стерильной ватной пробкой и немедленно приступают к анализу.
В чистую пробирку наливают 1 мл раствора метиленового синего и 20
мл исследуемого молока, предварительно нагретого до 38-40 °С. После
перемешивания пробирку ставят в редуктазник или термостат при 38-40 °С
(указанная температура оптимальна для редуктазы) и наблюдают за
обесцвечиванием через 20 мин, 2 ч и 5,5 ч. Проба на редуктазу считается
законченной, когда наступает полное обесцвечивание молока. По времени
обесцвечивания выделяют молоко четырех классов (табл. 1).
Таблица 1.
обесцвечивания
Показатель
Определение
качества
молока
по
времени
3-й
30 мин – 2
ч
4-20
4-й
20 мин
Плохое
Очень
плохое
Класс
1-й
5,5 ч
Время
обесцвечивания, ч
Примерное количество
0,5
бактерий, млн. в мл
Качество молока
Хорошее
2-й
5,5 – 2 ч
0,5-4
Среднего
качества
6
20
его
Подготовка проб пищевых продуктов к исследованию. Перед
исследованием пробы вначале подготавливают навеску, которая должна
охарактеризовать всю исследуемую пробу. Навески продукта берут
стерильно из разных мест пробы — с поверхности и из глубины. Отбирают
навеску 10 г, взвешивая ее на весах, растирают в стерильной фарфоровой
ступке, постепенно добавляя 90 мл изотонического раствора хлорида натрия,
и оставляют при комнатной температуре на несколько минут. Затем
стерильной пипеткой с широким носиком отбирают взвесь для посевов и
разведений. Принимается, что 1 мл приготовленное взвеси содержит 0,1 г
исходного продукта.
Продукты жидкой консистенции засевают и разводят для посевов без
предварительной подготовки. Продукты, имеющие кислую реакцию (рН 4,06,0), перед исследованием нейтрализуют стерильным 10%-м раствором
двууглекислого натрия до слабощелочной реакции (рН 7,2-7,4). Реакцию
среды проверяют по универсальной индикаторной бумаге.
Для исследования на наличие сальмонелл из усредненной пробы
отбирается отдельная навеска массой 25 г.
Приготовление разведений пищевых продуктов для посева. Для
продуктов жидкой консистенции разведения готовят следующим образом:
отбирают стерильной пипеткой 1 мл продукта и вносят в пробирку,
содержащую 9 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия,
тщательно перемешивают. Полученное разведение подвергают таким же
образом дальнейшему разведению в необходимое количество раз (кратное
10). При исследовании плотных продуктов в качестве первого разведения
используют 10%-ю взвесь, полученную способом, описанным выше.
Определение общей обсемененности. Выбранные для посева
разведения вносят по 1 мл (каждого разведения) в стерильные чашки Петри,
после чего их заливают 10-15 мл расплавленного и осужденного до 45-50 °С
МПА, который тщательно, круговыми движениями перемешивают. Среде
дают застыть на строго горизонтальной поверхности. Посевы выращивают в
течение суток при 37 °С, после чего подсчитывают число выросших
колоний. Определяют общее количество бактерий в 1 мл или 1 г продукта.
Определение наличия плесеней и дрожжей. Выбранные для посева
разведения вносят по 1 мл (каждого разведения) в стерильные чашки Петри,
после чего их заливают 10-15 мл расплавленной и остуженной до 45-50 °С
среды Сабуро, которую тщательно, круговыми движениями перемешивают.
Среде дают застыть на строго горизонтальной поверхности. Посевы
выращивают в течение 5 сут при 25 °С, после чего подсчитывают число
выросших колоний. Определяют общее количество дрожжей и плесеневых
грибов в 1 мл или 1 г продукта.
Определение наличия БГКП. Для посева используется то количество
продукта, в котором в соответствии с установленными нормами
предусматривается отсутствие БГКП. Из выбранных разведений
исследуемых образцов продуктов берут по 1 мл и засевают в пробирки со
7
средой Кесслера (в двух повторностях). Засеянные пробирки инкубируют
при 37 °С 24 ч. При отсутствии признаков роста (газообразования или
изменения цвета среды) делают заключение о соответствии исследуемого
продукта нормативу. При наличии признаков роста производят высев на
среду Эндо. Посевы инкубируют 18-20 ч при 37 °С. При просмотре посевов
отмечают колонии, подозрительные или типичные для БГКП (образуют
красные, розовые, бледнорозовые колонии с металлическим блеском или без
него). Из них делают препараты живых и фиксированных клеток,
окрашивают по Граму, микроскопируют. Обнаружение грамотрицательных,
не образующих спор палочек с закругленными концами, свидетельствует о
возможном наличии БГКП. При необходимости проводят оксидазный тест и
высев на полужидкую среду с глюкозой, срезу Козера. БГКП
оксидазоотрицательны, большинство видов сбраживают глюкозу с
образованием органических кислот, некоторые виды также выделяют газ,
цитрат не утилизируют. Сопоставляя полученные данные, делают вывод о
наличии БГКП в исследуемом образце и качестве продукта (табл. 2).
Таблица 2. Определение качества молока по коли-титру
Показатель
Класс
1-й
2-й
3-й
4-й
-1
-2
-3
Коли-титр
10
10
10
10-4
Качество молока
Хорошее
Среднее
Плохое
Очень плохое
Определение наличия Salmonella. Определение сальмонелл проводят в
навеске продукта 25 г. Производят посев навески в 100 мл селенитового
бульона. Посев инкубируют 24 ч при 37 °С. Затем производят высев
истощающим штрихом на поверхность висмут-сульфит агара, инкубируют
24 ч при 37 °С. Изолированные колонии, характерные для бактерий рода
Salmonella (черные, с характерным металлическим блеском, с
прокрашиванием участка среды под колонией в черный цвет; некоторые
серовары образуют нежные светло-зеленые или крупные серовато-зеленые
колонии), пересевают на среду Клиглера штрихом по скошенной
поверхности и уколом в столбик. Посевы помещают на 12-16 ч в термостат с
температурой 37 °С. Все Salmonella сбраживают глюкозу с образованием
кислоты и газа, подавляющее большинство не сбраживают лактозу (кроме
представителей двух видов). Для дальнейшей предварительной
идентификации готовят препараты живых и фиксированных клеток,
окрашивают по Граму. К Salmonella относят палочки с закругленными
концами, в большинстве подвижные, не образующие спор и капсул,
грамотрицательные, оксидазоотрицательные.
Делают вывод о возможном наличии сальмонелл в исследуемом
образце. Подробно полная схема идентификации сальмонелл описана в
специальных руководствах по медицинской микробиологии.
Определение наличия Staphylococcus aureus. Из выбранных разведений
8
исследуемых образцов продуктов берут по 1 мл и засевают в пробирки с 5 мл
6,5%-го солевого бульона. Кроме того, основную 10%-ю взвесь продукта в
количестве 0,2 мл наносят на поверхность желточно-солевого или молочносолевого агара и тщательно растирают шпателем. Посевы инкубируют 18-20
ч при 37 °С. Чашки с плотными средами оставляют еще на сутки при
комнатной температуре (для проявления пигмента).
Просматривают посевы на плотных средах. Из подозрительных
колоний делают препараты, окрашивают по Граму. Проверяют наличие
каталазы. Staphylococcus aureus — неподвижные кокки, расположенные
одиночно,
парами
или
гроздьями.
Грамположительны,
каталазоположительны, обычно оксидазоотрицательны. Из пробирок с
солевым бульоном делают высев на желточно-солевой (колонии имеют
форму плоских дисков (диаметр 2-4 мм) белого, желтого, кремового,
лимонного, золотистого цвета с ровными краями; вокруг колоний
образуются радужное кольцо и зона помутнения среды) или молочносолевой агар (мутные, круглые, ровные, выпуклые колонии белого,
кремового, желтого или оранжевого цвета 2-4 мм в диаметре), проводят
предварительную идентификацию, как описано выше. Делают вывод о
возможном наличии Staphylococcus aureus в исследуемом образце. Полную
схему идентификации золотистого стафилококка можно найти в
специальных руководствах.
Определение наличия Proteus. Для выделения бактерий рода Proteus
производят посев по методу Шукевича: 0,5 мл взвеси продукта засевают в
конденсационную воду свежескошенного МПА. Посевы инкубируют 18-20 ч
при 37 °С. Если на скошенном МПА наблюдается вползающий нежный
вуалеобразный рост, сопровождающийся специфическим запахом, то из
верхнего края выросшей культуры готовят препараты, окрашивают по
Граму, выявляют подвижность. К Proteus относят прямые, подвижные
(иногда встречаются неподвижные формы, лишенные жгутиков) палочки с
закругленными концами, не образующие спор и капсул. Клетки склонны к
полиморфизму, наблюдаются кокковидные и нитевидные формы.
Грамотрицательны, каталазоположительны, оксидазоотрицательны. Делают
вывод о возможном наличии бактерий рода Proteus в исследуемом образце.
Определение наличия сульфитвосстанавливающих клостридий. Из
выбранных разведений исследуемых образцов продуктов берут по 1 мл и
засевают в пробирки с 9 мл расплавленной и охлажденной до 45 °С средой
Вильсона-Блера, тщательно перемешивают. Посевы инкубируют 18-20 ч при
37 °С. Появление в среде черных колоний указывает на присутствие
сульфитвосстанавливающих клостридий. Из подозрительных колоний
готовят препараты, окрашивают по Граму. Проверяют наличие каталазы с
помощью раствора перекиси водорода (30 г/дм 3). Делают вывод о
возможном наличии сульфитвосстанавливающих клостридий в исследуемом
образце.
9
Микробиологический анализ сыра. В основе сыроделия лежат
сложные биохимические процессы, основная роль в них принадлежит
молочнокислому и пропионовокислому брожению. Большое влияние на
качество готового продукта оказывает качество молока, и прежде всего
степень обсемененности его нежелательными микроорганизмами.
Свертывание молока (коагуляция казеина) проводят, заквашивая его
молочнокислыми бактериями и вводя сычужный фермент. Получаемые в
результате сыры называют сычужными. Сыры, в созревании которых
участвуют только молочнокислые бактерии, называют кисломолочными.
Наличие микроорганизмов в сыре может служить и причиной
различных его пороков. Раннее вспучивание сыров вследствие образования
большого количества газов (СО2 и Н2) вызывают бактерии группы кишечной
палочки в период, когда в сыре еще недоиспользована лактоза. Позднее
вспучивание вызывают масляно-кислые бактерии рода Clostridium,
сбраживающие молочную кислоту в масляную с выделением СО2 и Н2.
Изъязвление корки сыра могут вызывать плесневые грибы.
При
полном
анализе
сыра
количественное
определение
микроорганизмов выполняют методом посева измельченной и растертой при
подогреве до 45 °С пробы сыра на агар-агаре с гидролизованным молоком.
При изучении микрофлоры сыра можно также использовать метод
отпечатков, дающий представление о естественном расположении
микроорганизмов в сыре.
Задание
Провести
санитарно-бактериологический
анализ
молока,
кисломолочных продуктов и сыра, определить их качество, основываясь на
нормативных показателях.
1.
2.
План выполнения работы
Приготовить и просмотреть препараты микрофлоры молока и
кисломолочных продуктов (кефир, йогурт, снежок, ряженка, тан,
сметана и т.д.). Для этого на предметное стекло поместить каплю
сметаны, распределить ее тонким слоем, добавить смесь Никифорова (12 капли). Когда смесь испарится, окрасить препарат метиленовым
синим, промыть, хорошо просушить и промикроскопировать (рис. 1).
Подкрасить метиленовым синим. Рассмотреть представителей родов
Lactococcus, Lactobacillus, Bifidobacterium.
Приготовить и промископировать препараты-отпечатки сыра. Для этого
фламбированным ножом срезать то место, где будет взята проба. Затем
срезать тонкий кусочек сыра и плотно сдавить его между двумя сухими
чистыми предметными стеклами. Стекла осторожно разъединить и
удалить сыр. Полученный на стекле отпечаток просушить вдали от
пламени, зафиксировать смесью Никифорова и окрасить метиленовым
синим. При микроскопировании крупных сыров выявляются
10
палочковидные формы молочнокислых и пропионовокислых бактерий,
при микроскопировании мелких – молочнокислые стрептококки.
Рисунок 1 – Микрофлора йогурта. Окраска метиленовым синим,
увеличение ×1000
3.
Определить общую численность бактерий на МПА, титр кишечной
палочки на среде Эндо, количество S. аиreus на желточно-солевом
агаре, дрожжи и плесени на среде Сабуро и сделать пробу на редуктазу.
По результатам исследований сделать вывод о качестве продуктов в
соответствии с нормативами (табл. 3).
Таблица 3. Санитарно-бактериологические нормативы для молока и
некоторых молочных продуктов (СанПиН 2.3.2.560-96)
Продукт
1
Молоко сырое
(высший сорт)
Молоко
пастеризованное в
бутылках и пакетах:
гр. А
гр. Б
Молоко
пастеризованное:
во флягах
в цистернах
Микробное число –
допустимое
количество
микроорганизмов
(КОЕ в 1 мл/1 г),
не более
2
3×105
Масса продукта (г), в которой не
Другие
допускаются
показатели
БГКП
Патогенные, в
S.
том числе
аиreus
сальмонеллы
3
—
4
25
5
—
6
—
—
5×10 4
1×105
1,0
0,01
25
25
2×105
3×105
0,01
0,01
25
25
1,0
0,1
—
11
—
Продолжение таблицы 3
1
Сливки
пастеризованные в
бутылках и пакетах
Кисломолочные
напитки (кефир,
простокваша и пр.)
Ряженка
Сметана
Сметана с
термической
обработкой
Творог и творожные
изделия
Десерты сливочные
Молоко сгущенное с
сахаром
Какао и кофе со
сгущ. молоком
Сыры сычужные
твердые и мягкие
Сыр Российский
Сыры плавленые:
без наполнителей
с наполнителями
(овощи, грибы и
т.д.)
Мороженое
2
1×105
3
0,1
4
25
5
1,0
6
—
—
(наличие только
микрофлоры
закваски)
—
—
—
0,01
25
1,0
—
1,0
0,001
0,01
25
25
25
1,0
1,0
1,0
—
—
—
—
0,001
25
0,1
—
—
2,5 ×104
0,01
1,0
25
25
0,1
—
—
3,5×104
1,0
25
—
—
—
0,001
25
—
0,001
25
5×103
1×104
0,1
0,1
25
25
1×105
0,01
25
< 1000
—
КОЕ/г
< 500
—
КОЕ/г
—
Плесени,
дрожжи
< 50 < 50
<
100
<
100
(КОЕ/г)
1,0
—
Вопросы для самостоятельного контроля
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Какие показатели определяют при санитарно-бактериологическом
анализе молока и молочных продуктов?
Что такое БГКП?
Какие дифференциально-диагностические среды используют для
микробиологического анализа пищевых продуктов?
В чем сущность редуктазной пробы?
Какие виды молочнокислых кокков и палочек используют при
производстве продуктов питания?
Какие виды специфической и неспецифической микрофлоры могут
обнаруживаться в молоке?
12
Работа 2. Бактериологический анализ мяса и мясных продуктов
Мясо здорового скота практически можно считать свободным от
микроорганизмов. Мясо павших больных и переутомленных животных
содержит аэробные и анаэробные микроорганизмы.
Бактерии, попавшие на поверхность мяса, постепенно проникают в
глубь него. Скорость проникновения зависит от температуры и вида
микроорганизмов. В мясо, охлажденное до 2-4 °С, бактерии проникают через
30 дней на глубину примерно 1 см. Проникновению микроорганизмов
препятствует образующаяся в результате подсыхания корочка. При хорошей
корочке туша может храниться при 0 °С около восьми недель.
После убоя скота происходят изменения в мышечной ткани, наступает
период созревания мяса, характеризующийся сложными физикохимическими процессами, возникающими под влиянием ферментов. При
распаде гликогена в мышечной ткани накапливается молочная кислота, а в
результате распада АТФ – фосфорная кислота. Для завершения созревания
мяса требуется обычно несколько дней. Если мясо хранить при
температурах, благоприятных для развития микроорганизмов, в нем
начнутся микробиологические процессы.
Среди гнилостных микроорганизмов в мясе преобладают микрококки,
кишечная палочка, флуоресцирующие бактерии, споровые формы. Из
аэробных
бактерий
наиболее
сильнодействующими
гнилостными
микроорганизмами служат: Bacillus subtilis, В. mycoides, из факультативноанаэробных – Proteus vulgaris. Примерно через три-четыре дня в глубине
мяса начинают размножаться и анаэробы (Clostridium perfringens, С.
sporogenes и др.). В мясе клинически здоровых животных иногда
обнаруживают болезнетворные
микроорганизмы, которые
вызывают
мясные отравления (пищевые токсикоинфекции). Часть их содержится в
кишечнике животных и в момент убоя.
В случае убоя животных, больных сибирской язвой, туберкулезом,
бруцеллезом, рожей свиней и другими инфекционными заболеваниями,
микроорганизмы-возбудители, безусловно, содержатся в мясе. Условия убоя,
использование и выбраковка мяса больных животных регулируются
особыми ветеринарными правилами.
По степени свежести мясо подразделяют на доброкачественное, мясо
сомнительной свежести и мясо, непригодное в пищу.
Доброкачественное мясо имеет сухую корочку подсыхания бледнорозового или бледно-красного цвета. На разрезе оно плотное, эластичное,
ямка после надавливания быстро исчезает. Несвежее мясо покрыто плотной,
темно-красной или ослизненной корочкой. Консистенция его мягкая,
несколько дряблая, образующаяся при надавливании пальцем ямка не
заполняется. Запах неприятный, гнилостный. Такое мясо используют только
по указанию ветеринарно-санитарного надзора. Испорченное мясо с
ослизненной липкой поверхностью, на разрезе имеющее зеленый цвет,
13
дряблой, мажущейся консистенции, со слизистым жиром и прогорклым
запахом бракуют.
Экспресс-метод оценки качества мяса и мясных продуктов по
мазкам-отпечаткам. Для анализа берут два сорта мяса: свежее и несвежее.
На предметных стеклах делают по два мазка-отпечатка – один с
поверхностного, другой из глубинного слоя каждого сорта. Для
приготовления препарата-отпечатка из поверхностного слоя стерильными
ножницами вырезают кусочек (0,5-1 г) и прикладывают срезанной стороной
к поверхности обезжиренного, фламбированного предметного стекла.
Чтобы приготовить препараты-отпечатки из глубоких слоев,
поверхность мяса прижигают нагретым шпателем, стерильным ножом
делают надрез и также берут из глубины небольшой кусочек (0,5-1 г),
который прикладывают к стеклу. Препараты подсушивают на воздухе,
фиксируют смесью спирта с эфиром, окрашивают фуксином и микроскопируют, подсчитывая количество микроорганизмов в каждом поле зрения и
отмечая их форму.
Препарат-отпечаток свежего мяса окрашивается обычно плохо. Если
он получен из поверхностного слоя мяса, то в поле зрения встречаются
единичные палочки и кокки. В препаратах из глубоких слоев они или
отсутствуют, или встречаются не во всех полях зрения.
Препарат-отпечаток мяса сомнительной свежести окрашивается
удовлетворительно. При просмотре в каждом поле зрения обнаруживается
по нескольку десятков микробов. Особенно много их на препарате из
поверхностного слоя. Препарат-отпечаток мяса, непригодного в пищу,
окрашивается хорошо. В поле зрения на препаратах как из поверхностных,
так и из глубоких слоев встречается в среднем более 30 микробов с
преобладанием палочек. При разложении мяса кокки в отпечатках почти
отсутствуют, и все поле зрения усеяно палочками.
Определение анаэробной микрофлоры. Для выявления анаэробов
поверхность мяса двух сортов (свежее и несвежее) прижигают нагретым
шпателем, стерильным ножом делают надрез и берут из глубины по
небольшому кусочку. Соблюдая правила асептики, опускают их в пробирки с
расплавленным и предварительно охлажденным до 50 °С МПА. Вращая
пробирку между ладонями, следят, чтобы кусочек мяса осел на дно
пробирки.
Опытные пробирки с МПА, содержащие свежее и несвежее мясо,
помещают в термостат при 40 °С. После инкубирования посевов в
термостате в течение нескольких дней пробирки просматривают визуально.
Если мясо несвежее, на МПА развиваются газообразующие анаэробные
формы и в среде обнаруживаются разрывы агар-агара вследствие выделения
микроорганизмами газа. В пробирках со свежим мясом столбик МПА будет
плотным, не содержащим разрывов и трещин, так как газообразующие
анаэробные формы в нем не развиваются.
14
Задание
Провести санитарно-бактериологический анализ мяса и мясных
продуктов, определить их качество, основываясь на нормативных
показателях.
1.
2.
План выполнения работы
Приготовить и окрасить по Граму отпечатки мяса (свежего и
пролежавшего в течение суток в теплом помещении). Рассмотреть
морфологию бактерий в отпечатках. Определить соотношение палочек
и кокков в поле зрения. Дать оценку качеству исследованного мяса.
Провести санитарно-бактериологический анализ мяса и мясных
продуктов (колбаса, фарш и т.п.). Определить общую численность
бактерий на МПА, титр кишечной палочки на среде Эндо, количество S.
аиreus на желточно-солевом агаре, дрожжи и плесени на среде Сабуро.
По результатам исследований сделать вывод о качестве продуктов в
соответствии с нормативами (табл. 4).
Таблица 4. Некоторые санитарно-бактериологические нормативы для
мяса, колбасных изделий и мясных продуктов (СанПиН 2.3.2.560-96)
Продукт
Микробное число Масса продукта (г), в которой не
Другие
– допустимое
допускаются
показатели
количество
БГКП Патогенные, в S. аиreus
микроорганизмов
том числе
(КОЕ в 1 мл/1 г),
сальмонеллы
не более
Мясо замороженное
0,01
25
—
—
(все виды убойных
0,01
25
животных)
Мясо в отрубах
1×10 4
Телятина, свинина
5×105
куском
Фарш говяжий
5×10 6
0,0001
25
—
Колбасы с/к и с/к
—
0,1
25
1
Сульфитвосста
изделия из мяса
навливающие
убойных животных
клостридии в
0,01 г не доп.
Колбасы п/к
—
1,0
25
1,0
Сульфитвосста
навливающие
клостридии в
0,01 г не доп.
Колбасные изделия
1,0
25
1,0
Сульфитвосста
вареные:
1,0
25
1,0
навливающие
3
высший и первый
1×10
клостридии в
сорта
0,01 г не доп.
3
второй сорт
2,5×10
Птица охлажденная
1×105
—
25
—
—
и замороженная
15
Промежуточный контроль.
По результатам выполненных работ необходимо написать отчет. Отчет
должен включать следующие разделы:
 титульный лист, оформленный по стандарту СТО 4.2–07–2012;
 введение, в котором кратко формулируется основные принципы
санитарно-бактериологического анализа пищевых продуктов;
 цель и задачи работы;
 объекты исследований, где характеризуются анализируемые молочные
и мясные продукты (название, производитель, срок с момента
изготовления, условия хранения);
 методы исследований, используеме в работе;
 анализ полученных результатов;
 выводы о качестве исследованных продуктов.
1.
2.
3.
4.
5.
Вопросы для самостоятельного контроля
Из каких источников микроорганизмы попадают в мясо и
мясные продукты?
Как проводится экспресс-анализ мяса методом отпечатков?
Какие показатели используются для характеристики качества
мясных продуктов?
Какие виды анаэробных микроорганизмов представляют
наибольшую опасность при заражении продуктов питания?
Какие виды гнилостных аэробных бактерий развиваются в
мясных продуктах?
16
УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ ПО ДИСЦИПЛИНЕ
1.
2.
3.
Основная литература:
Загоскина, Н.В. Биотехнология: теория и практика: Учебное
пособие для вузов/ Н.В. Загоскина, Л.В. Назаренко, Е.А.
Калашникова, Е.А. Живухина; под ред. Н.В. Загоскиной, Л.В.
Назаренко. – М.: Издательство Оникс, 2009, - 496 с. – 1 экз. (на
кафедре биотехнологии)
Мудрецова-Висс, К. А. Микробиология, санитария и гигиена:
Учебник / К.А. Мудрецова-Висс, В.П. Дедюхина. - 4-e изд., испр. и
доп. - М.: ИД ФОРУМ: ИНФРА-М, 2010. - 400 с.
Рубина, Е. А. Микробиология, физиология питания, санитария:
Учебное пособие / Е.А. Рубина, В.Ф. Малыгина. - М.: Форум: НИЦ
Инфра-М, 2013. - 240 с.
Дополнительная литература
4. Жарикова, Г. Г. Микробиология продовольственных товаров.
Санитария и гигиена : учебник для студ. высш. учеб. заведений / Г.
Г. Жарикова. – М. : Academia, 2005. – 304 с.
5. Жарикова, Г. П. Микробиология, санитария и гигиена пищевых
производств: Практикум / Г. П. Жарикова, А.О. Козьмина. – М. :
Гелан, 2001. – 256 с.
6. Практикум по микробиологии : учебное пособие для студентов
вузов / М. А. Егорова, Л. М. Захарчук; под ред. А. И. Нетрусов. – М.
: Академия, 2005 . - 603 с.
7. Сазыкин, Ю. О. Биотехнология : учебное пособие для студ. высш.
учеб. заведений / Ю. О. Сазыкин, С. Н. Орехов, И. И. Чакалева; под
ред. А. В. Катлинского. - М. : Академия, 2006. – 256 с. – 20 экз.
8. Сорокин, Н. Д. Практические основы технической микробиологии :
учебное пособие. / Н. Д. Сорокин, В. Д. Некрасова, Е. Н.
Афанасова; Красноярский государственный университет. –
Красноярск : КрасГУ, 2003. – 103 с. – 122 экз.
9. Голубева, Л. В. Практикум по технологии молока и молочных
продуктов. Технология цельномолочных продуктов / Л. В.
Голубева, О. В. Богатова, Н. Г. Догарева. – С.-Пб.: Лань, 2012. –
384 с
10. Микробиологическая и молекулярно-генетическая оценка пищевой
продукции,
полученной
с
использованием
генетически
модифицированных микроорганизмов. МУ 2.3.2.1830-04. – М. :
Минздрав
России,
2004.
–
56
с.
Режим
доступа:
http://bestpravo.ru/rossijskoje/jd-pravo/e1r.htm (18.01.2012)
17
Учебное издание
Прудникова Светлана Владиславна
Техническая микробиология.
Методические указания к лабораторным занятиям
Редактор И.О. Фамилия
Корректор И.О.Фамилия
Компьютерная верстка: И.О.Фамилия
Подписано в печать (дата) 2013 г. Формат 60х84/16. (А5)
Бумага офсетная. Печать плоская.
Усл. печ. л. 1,3 (количество страниц/18). Уч.-изд. л. ? ?.
Тираж 100 экз. Заказ ????. (Дает РИО)
Редакционно-издательский отдел
Библиотечно-издательского комплекса
Сибирского федерального университета
660041, г. Красноярск, пр. Свободный, 79
Тел/факс (391) 244-82-31. E-mail rio@sfu-kras.ru
http://rio.sfu-kras.ru
Отпечатано Полиграфическим центром
Библиотечно-издательского комплекса
Сибирского федерального университета
660041, г. Красноярск, пр. Свободный, 82а
18