Исследование спермы - Global Fertility Academy
advertisement
Слайд 1 Исследование спермы Профессор Паула А. Наварро Элиза М. Феррейра Профессор Руи Ферриани Глава 5 Исследование спермы Авторы- профессор Паула А. Наварро, Элиза М. Феррейра, профессор Руи Ферриани Слайд 2 Цели По окончании этой главы студенты должны иметь представление об: − Исследовании спермы • • - Общее Исследование семенной жидкости Специальное Тест на гипоосмотическое набухание сперматозоидов Тест связывания сперматозоидов с блестящей оболочкой ооцита Тест на пенетрацию сперматозоидами яйцеклетки золотистого хомячка Тест контакта спермы с цервикальной слизью Тест на антиспермальные антитела Тест для оценки акросомной реакции Биохимические тесты Анализ на активные формы кислорода Анализ фрагментации ДНК сперматозоидов Для оценки качества семенной жидкости используется несколько лабораторных анализов, они могут быть разделены на две категории: общие и специальные. Широкое использование вспомогательных репродуктивных технологий, в особенности, интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ), ведет к снижению использования специальных лабораторных тестов. Общее исследование семенной жидкости считается самым распространенным анализом, однако оно, по сути, не является достаточным для оценки состояния спермы. К специальным тестам относятся: Тест на гипоосмотическое набухание сперматозоидов Тест связывания сперматозоидов с блестящей оболочкой ооцита Тест на пенетрацию сперматозоидами яйцеклетки золотистого хомячка Тест контакта спермы с цервикальной слизью Тест на антиспермальные антитела Тест для оценки акросомной реакции Биохимические тесты Анализ на активные формы кислорода Анализ фрагментации ДНК сперматозоидов Слайд 3 Исследование семенной жидкости Получение спермы Перед планируемым получением спермы для анализа пациенты должны воздерживаться от половых контактов в течение 2-7 дней Должны быть проанализированы две отдельные пробы Следует избегать использования лубрикантов и прерывания полового акта Лаборатория должна предоставить чистый, стерильный контейнер, который будет использоваться для забора спермы Образцы спермы, должны быть , в основном, получены ь путем мастурбации в отдельной комнате Семенная жидкость должна быть исследована в лаборатории в течение 1 часа после ее получения Исследование семенной жидкости должно выполняться через 2-7 дней воздержания от половых контактов. Согласно Rowe и Jeyendran, интервал времени между первым и вторым забором спермы должен составлять не менее 7 дней. Как показали Carlsen и соавт. в 2004 году, в связи с тем что дополнительный день воздержания может увеличить концентрацию сперматозоидов в эякуляте на 25% , продолжительность воздержания перед первым и вторым забором спермы должна быть одинаковой. Следует избегать использования лубрикантов, поскольку они могут затруднить оценку подвижности сперматозоидов. Также следует избегать прерывания полового акта, так как первая часть эякулята, содержащая наибольшее число сперматозоидов, может быть утрачена, что приведет к ошибочным результатам. Поскольку продолжительное хранение спермы может отрицательно сказаться на некоторых анализируемых показателях, образец должен быть исследован в лаборатории в течение 1 часа после получения. По данным Agarwal и соавт., подвижность сперматозоидов значительно снижается через 2 часа и продолжает снижаться с повышением содержания активных форм кислорода (АФК). Слайд 4 Исследование семенной жидкости Таблица 1. Клиническая значимость отклонений в основных макроскопических показателях при исследовании семенной жидкости Показатели Отклонения Клиническая значимость pH (оптимальное значение = 7,8) Кислая реакция: <6,5-7 Низкий объем и отсутствие свертывания указывают на врожденное отсутствие семявыносящего протока, обструкцию семявыносящего протока или частичную ретроградную эякуляцию Без свертывания Врожденное отсутствие семенных пузырьков Свертывание/разжижение (норма: свертывание/разжижение в течение 20 минут при увеличение времени температуре 37°С) разжижения Цвет Желтоватый цвет (нормальный: беловатоКрасноватосерый/перламутрово-белый) коричневый Вязкость (норма: образование тяжейв 4 мм) Объем (нормальный объем: 2-4 мл) > 6 мм Нет образования тяжей 0 (аспермия) <2 мл (гипоспермия) Слабая секреция предстательной железы Желтуха, каротинемия, лекарственные препараты и вторичная гематоспермия из-за уретрального кровотечения или воспаления семенных пузырьков. Для исключения других причин, таких как, опухоли мочеполовой системы, требуются дополнительные исследования. Имеет значение в сочетании с низкой подвижностью Ретроградная эякуляция потеря в процессе забора Частичная ретроградная эякуляция Короткая продолжительность воздержания от > 6 мл половых контактов Длительное половое воздержание Клиническая значимость отклонений в основных макроскопических показателях исследования семенной жидкости изучалась некоторыми авторами и может быть использована для интерпретации результатов анализа и подбора лечения. Кислая реакция среды может указывать на отсутствие семявыносящего протока, обструкцию семявыносящего протока или частичную ретроградную эякуляцию. Отклонения, такие как отсутствие свертывания или увеличение времени разжижение могут быть признаком врожденного отсутствия семенных пузырьков или недостаточной секреции предстательной железы. Ненормальный цвет (беловато-серый/перламутрово-белый) может быть следствием желтухи, каротинемии, действия лекарственных препаратов или вторичной гематоспермии из-за уретрального кровотечения или воспаления семенных пузырьков. Для исключения других причин, таких как, опухоли мочеполовой системы, требуются дополнительные исследования. Изменения вязкости с образованием тяжей длиной более 6 мм или без образования тяжей может быть следствием низкой подвижности сперматозоидов. Отклонения в объеме семенной жидкости, как, например, ее полное отсутствие (аспермия) могут быть результатом ретроградной эякуляции. Объем менее 2 мл (гипоспермия) может быть следствием потери в процессе забора, результатом ретроградной эякуляции или короткой продолжительности полового воздержания. Объемы более 6 мл могут наблюдаться при длительном половом воздержании. Слайд 5 Исследование семенной жидкости Таблица 2. Нормальные значения макроскопических и микроскопических показателей спермы Показатели семенной жидкости Объем pH Разжижение Вязкость Концентрация сперматозоидов Общее количество сперматозоидов Подвижность Нормальные величины ≥ 2,0 мл ≥ 7,2 ≤ 30 мин, полное Норма 6 ≥ 20 X10 сперматозоиды/мл 6 ≥ 40 X10 сперматозоиды/эякулят ≥ 50% линейное движение (категории «a» и «b») ≥ 25 % категории a Морфология Морфология (по строгим критериям Крюгера) Жизнеспособность Лейкоциты ≥30% (ВОЗ. 1999) ≥14 %0(Krüger и соавт., 1986) ≥75 % 6 ≤ 1.0 X 10 клетки/мл Исследование семенной жидкости является основой диагностики мужского бесплодия. Хотя этот анализ и не отражает функциональное состояние сперматозоидов, его необходимо проводить. Если в анализе спермы имеются отклонения, необходимо провести повторный анализ. Если имеется расхождение в 20% или более, требуется провести еще один анализ с интервалом не менее одного месяца. Несмотря на отсутствие точных параметров отличающих фертильных мужчин от бесплодных, морфология сперматозоидов является наилучшим фактором прогнозирования фертильности. Согласно Krüger и соавт., уровень успешности экстракорпорального оплодотворения коррелирует со строгими критериями Крюгера для оценки морфологии сперматозоидов. Наличие более чем одного показателя с отклонением от нормы значительно повышает риск наличия бесплодия. Слайд 6 Исследование семенной жидкости Ограничения общего исследования семенной жидкости В основном используется для оценки репродуктивного потенциала мужчины, но прямой корреляции нет Не существует единого мнения относительно нормальных показателей спермы, так как они постоянно пересматриваются в свете новых результатов исследований Рекомендуется проведение функционального исследования спермы для уточнения диагноза, обычно в случаях, когда показано искусственное оплодотворение и точная причина бесплодия не была установлена Исследование семенной жидкости в основном используется для оценки репродуктивного потенциала мужчины, но прямой корреляции нет. Клинические исследования показали, что нормальные результаты этого анализа не обязательно означают, что у сперматозоидов отсутствуют функциональные дефекты (идиопатическое бесплодие). Кроме того, беременность может наступить несмотря на отклонения в результатах этого анализа. По данным McLachlan и соавт., только в пятидесяти процентов случаев, однозначная причина бесплодия была установлена с помощью общего исследования семенной жидкости. Каждый отдельный показатель нельзя использовать для прогнозирования фертильности; они должны использоваться в сочетании с другими данными и с учетом клинической ситуации. Кроме того, на сегодняшний день не существует единого мнения относительно нормальных показателей спермы, так как они постоянно пересматриваются в свете новых результатов исследований. Для уточнения диагноза рекомендуется проведение функционального исследования спермы, обычно это необходимо в случаях, когда показано искусственное оплодотворение, а четкая причина бесплодия не была установлена. Слайд 7 Специальные тесты Тест на гипоосмотическое набухание сперматозоидов (HOST) Основывается на том, что у жизнеспособных сперматозоидов мембраны интактны Характеристики: набухание цитоплазмы и закручивание хвостов сперматозоидов Нормальные результаты теста: более чем у 60% сперматозоидов произошло набухание и закручивание хвостов Тест может быть полезен для отбора жизнеспособных сперматозоидов для использования в методе ИКСИ, особенно в случаях, когда имеются только неподвижные сперматозоиды Тест на гипоосмотическое набухание сперматозоидов (HOST) основывается на том, что у жизнеспособных сперматозоиды мембраны интактны. Обычно он используется для оценки жизнеспособности неподвижных сперматозоидов. Добавление в среду гипоосмотического раствора ведет к набуханию цитоплазмы и закручиванию хвостов сперматозоидов. Jeyendran и соавт. и Agarwal и соавт. показали, что сперматозоиды с поврежденными мембранами не набухают, так как не могут поддерживать осмотический градиент. Результат этого теста считается нормальным, если не менее чем у 60% сперматозоидов произошло набухание и закручивание хвостов. Данный тест может быть полезен для отбора жизнеспособных сперматозоидов для использования в методе ИКСИ, особенно в тех случаях, когда имеются только неподвижные сперматозоиды (Agarwal et al. in 2008). Слайд 8 Специальные тесты Тест связывания сперматозоидов с блестящей оболочкой ооцита (HZA) Зависит от наличия яйцеклеток человека, которые не удалось оплодотворить in vitro Сперматозоиды анализируются стандартными методами и отбираются методом всплытия Для проверки возможности связывания сперматозоида с неоплодотворенной яйцеклеткой используется сперма фертильного донора После инкубации ооциты отмывают в культуральной среде и оценивают количество сперматозоидов, связавшихся с/ проникших через блестящую оболочку и перивителлиновое пространство. Окончательный результат выражается индексом пенетрации (HZI), его значение считается нормальным, если оно выше или равно 35% ● HZI= Число, связавшихся сперматозоидов пациента Число, связавшихся сперматозоидов донора Несмотря на то, что интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида в настоящее время способна помочь большинству пациентов с невозможностью естественного оплодотворения, данный диагноз необходимо установить перед возможным проведением процедур экстракорпорального оплодотворения. В этом контексте, тест связывания сперматозоидов с блестящей оболочкой ооцита может быть полезным инструментом для выявления основных нарушений взаимодействия сперматозоидов с яйцеклеткой (Liu & Baker, 2000). Основными характеристиками этого теста являются: Зависит от наличия яйцеклеток человека, которые не удалось оплодотворить in vitro Каждую яйцеклетку разделяют на две части. Сперматозоиды анализируются стандартными методами и отбираются методом всплытия. Для проверки возможности связывания сперматозоида с неоплодотворенной яйцеклеткой используется сперма фертильного донора. После инкубации ооциты отмывают в культуральной среде и оценивают количество сперматозоидов, связавшихся с/ проникших через блестящую оболочку и перивителлиновое пространство. Окончательный результат выражается индексом пенетрации (HZI), его значение считается нормальным, если выше или равно 35%. HZI= Число, связавшихся сперматозоидов пациента Число, связавшихся сперматозоидов донора Слайд 9 Специальные тесты Тест на пенетрацию сперматозоидами яйцеклетки золотистого хомячка Определяет способность спермы пациента к капацитации и способность капацитированных сперматозоидов к акросомной реакции и слиянию с желточной оболочкой яйцеклетки Яйцеклетки хомячка без блестящей оболочки инкубируют со спермой пациента, подготовленной стандартными методами Результаты выражаются количеством ооцитов, в которые проникли сперматозоиды; число 5 или более считается нормальным Эта биопроба является трудоемкой, технически сложной и очень трудной для стандартизации, но она позволяет не использовать яйцеклетки человека С клинической точки зрения, результаты этого теста хорошо коррелируют с исходами как экстракорпорального оплодотворения (Soffer и соавт., 1992), так и естественной беременности (Atken и соавт., 1991) Тест на пенетрацию сперматозоидами яйцеклетки золотистого хомячка включает следующие аспекты: Определение способности спермы пациента к капацитации и способности капацитированных сперматозоидов к акросомной реакции и слиянию с желточной оболочкой яйцеклетки. Яйцеклетки хомячка без блестящей оболочки инкубируют со спермой пациента, подготовленной стандартными методами. Результаты выражаются количеством ооцитов, в которые проникли сперматозоиды; число 5 или более считается нормальным. Эта биопроба является трудоемкой, технически сложной и очень трудной для стандартизации. Согласно данным Soffer и соавт. и Aitken и соавт., с клинической точки зрения, результаты этого теста хорошо коррелировали с исходами как экстракорпорального оплодотворения, так и естественной беременности в долгосрочных проспективных исследованиях с участием пациентов с бесплодием неизвестной этиологии. Слайд 10 Специальные тесты Тест контакта спермы с цервикальной слизью (PCT) − Используется для выяснения роли цервикальной среды как возможной причины бесплодия Цервикальную слизь изучают через 2-8 часов после нормального полового акта Сперматозоиды с линейной подвижностью более 10-20 в поле зрения (при сильном увеличении) считаются нормальными − Сперма низкого качествас большой вероятностью покажет плохие результаты в этом тесте. PCT обычно не проводят у мужчин с плохими результатами анализа семенной жидкости − Тест контакта спермы с цервикальной слизью рекомендуется в следующих случаях: Высокая вязкость спермы Бесплодие неизвестной этиологии Низкий объем спермы с нормальным количеством сперматозоидов − Парам, с патологическими результатами данного теста можно рекомендовать переходить к внутриматочному оплодотворению (ВМО), так как последующие пробы вряд ли повлияют на подход к лечению Andersen и соавт., 2000 Тест контакта спермы с цервикальной слизью используется для уточнения влиянияцервикальной слизи на наличие бесплодия. Цервикальную слизь изучают через 2-8 часов после нормального полового акта. Сперматозоиды с линейной подвижностью более 1020в поле зрения сильным увеличением классифицируются как нормальные. Согласно Agarwal и соавт., точное время проведения теста крайне важно, так как цервикальная слизь тонкая и прозрачная непосредственно перед овуляцией. Способность сперматозоидов проникать через заменители слизи шейки, включая полимеры гиалуроновой кислоты, хорошо коррелирует с результатами прямых тестов контакта спермы с цервикальной слизью и показывает такую же зависимость от подвижности сперматозоидов. Как показал Aitken в 2006 году, эта способность сперматозоидов тесно связана с их способностью к оплодотворению яйцеклетки. Плохие результаты РСТ обычно наблюдаются при плохом качестве спермы, данная биопроба, как правило, не рекомендуется мужчинам с патологическими результатами исследования семенной жидкости. Парам, с патологическими результатами данного теста можно порекомендовать переходить к внутриматочному оплодотворению (ВМО), так как последующие пробы вряд ли повлияют на подход к лечению Руководство Американского общества репродуктивной медицины (ASRM, 2004) рекомендует проведение теста контакта спермы с цервикальной слизью в таких случаях: высокая вязкость спермы, бесплодие неясной этиологии, низкий объем спермы с нормальным количеством сперматозоидов. Слайд 11 Специальные тесты Тест на антиспермальные антитела (AСA) Чрезмерная агглютинация сперматозоидов или отклонения от нормальных результатов теста контакта спермы с цервикальной слизью могут указывать на присутствие AСA Антитела могут блокировать прохождение сперматозоидами цервикальной слизи или препятствовать их связыванию с и проникновению через zona pellucida Прямой тест на AСA выявляет иммуноглобулины, связанные со сперматозоидами, в основном, IgG, IgA и IgM Согласно стандартам ВОЗ (1992) нормальным результатом считается наличие менее 10% сперматозоидов со связанными частицами в реакции смешивания иммуноглобулинов или менее 20% в иммуногранулотесте Наличие антиспермальных антител можно предполагать на основании чрезмерной агглютинации сперматозоидов или отклонения от нормальных результатов теста контакта спермы с цервикальной слизью. Антитела могут блокировать прохождение сперматозоидами цервикальной слизи или препятствовать их связыванию с и проникновению через zona pellucida. Прямой тест на антиспермальные антитела выявляет иммуноглобулины, связанные со сперматозоидами, в основном, IgG, IgA и IgM. Согласно стандартам ВОЗ (1992) нормальным результатом считается наличие менее 10% сперматозоидов со связанными частицами в реакции смешивания иммуноглобулинов или менее 20% в иммуногранулотесте. Антигенный потенциал спермы может быть связан с тем, что сперматогенез начинается в период полового созревания, когда иммунная система способна реагировать на антигенную стимуляцию развитием иммунной реакции. Согласно Hassoun и соавт. и Clarke, антигенные потенциал у женщин проявляется в ответ на выраженную антигенную стимуляцию во время полового акта. Плотные контакты клеток Сертоли образуют барьер, который препятствует контакту клеток иммунной системы с гоноцитами, прошедшими мейоз. Однако, согласно Agarwal и соавт., определенные состояния, такие как перекрут яичка, вазэктомия или травма яичка могут нарушать этот барьер, приводя к развитию иммунного ответа против сперматозоидов, что проявляется наличием антиспермальных антител в семенной жидкости. Слайд 12 Специальные тесты Тест для оценки акросомной реакции Акросомная реакция запускается при контакте сперматозоида с zona pellucida и представляет собой экзоцитоз содержимого акросомы Протеолитические ферменты, высвобождаемые из акросомы, облегчают как проникновение через блестящую оболочку, так и изменение поверхности сперматозоида перед слиянием с яйцеклеткой В тесте применяют стандартные методики обработки спермы или добавляют ферменты и гормоны в питательную среду Состояние акросомы определяют с помощью просвечивающей электронной микроскопии (дорогостоящий метод) или флуоресцентной микроскопии Тест является очень трудоемким Акросомная реакция запускается при контакте сперматозоида с zona pellucida и представляет собой экзоцитоз содержимого акросомы. Протеолитические ферменты, высвобождаемые из акросомы, облегчают как проникновение через блестящую оболочку, так и модификацию поверхности сперматозоида перед слиянием с яйцеклеткой. В тесте к сперме применяют стандартные методики обработки или добавляют ферменты и гормоны в питательную среду, это приводит к высвобождению содержимого акросом. Оценку состояния акросомы осуществляют с помощью просвечивающей электронной микроскопии (этот метод достаточно дорогостоящий) или флуоресцентной микроскопии. Согласно Aitken и Agarwal и соавт., этот тест может быть полезен при наличии у сперматозоидов серьезных отклонений в морфологии головки или при бесплодии неясной этиологии с плохими результатами экстракорпорального оплодотворения. Слайд 13 Специальные тесты Акросомная реакция Прозрачная зона (Zona pellucida) Рецепторы белков Цитоплазматическая мембрана яйцеклетки ЦИТОПЛАЗМА ЯЙЦЕКЛЕТКИ Головка сперматозоида Митохондрии Ядро Актин Акросомная гранула Околожелточное пространство Лучистый венец Содержимое кортикальных гранул Кортикальные гранулы Акросомная реакция Слившаяся цитоплазматическая мембрана Тест для оценки акросомной реакции проводится со сперматозоидами, находящимися на этой стадии На рисунке выше показан механизм акросомной реакции. Она начинается, когда головка сперматозоида контактирует с zona pellucida, и включает высвобождение ферментов для пенетрации оболочек яйцеклетки и оплодотворения. Согласно Ferreira и соавт., слияние мембран сперматозоида и яйцеклетки приводит к высвобождению ионов кальция в цитоплазму яйцеклетки, что, в свою очередь, проводит к слиянию кортикальных гранул с мембраной яйцеклетки и высвобождению их содержимого во внеклеточное пространство. Ферменты кортикальных гранул разрушают рецепторы белков плазмалеммы, препятствуя прониктовению в яйцеклетку других сперматозоидов. Слайд 14 Специальные тесты Биохимические тесты - Быстрые, легко стандартизируемые и недорогие диагностические тесты Креатинкиназа: Повышенные уровни креатинкиназы связаны с увеличением частоты функциональных нарушений сперматозоидов и увеличением объема их цитоплазмы - Креатинкиназная активность измеряется специальными наборами для анализа и выражается в международных единицах на 108 сперматозоидов - Креатинкиназный тест может быть полезен в диагностике пациентов с варикоцеле, так как у таких больных часто отмечаются высокие уровни креатинкиназы - Оценка активности этого фермента может быть полезна при выборе тактики лечения − оперативного лечения варикоцеле или вспомогательных репродуктивных технологий Согласно Agarwal и соавт., биохимические критерии для анализа семенной жидкости разработаны в результате потребности в быстрых, недорогих и легко стандартизируемых диагностических тестах. Креатинкиназа − это фермент, участвующий в энергетическом обмене сперматозоидов, влияющий на выработку АТФ (Yeung и соавт., 1996 г.). Креатинкиназа − маркер зрелости сперматозоида, который коррелирует с его способностью к оплодотворению. Повышенные уровни креатинкиназы связаны с увеличением частоты функциональных нарушений сперматозоидов и увеличением объема их цитоплазмы. Креатинкиназная активность измеряется специальными наборами для анализа и выражается в международных единицах на 108 сперматозоидов. Креатинкиназный тест может быть полезен в диагностике пациентов с варикоцеле, так как у таких больных часто отмечаются высокие уровни креатинкиназы Хотя и не часто используется в клинической практике, по данным Hallak и соавт. оценка активности этого фермента может быть полезна при выборе тактики лечения − оперативного лечения варикоцеле или вспомогательных репродуктивных технологий. Слайд 15 Специальные тесты Активные формы кислорода (АФК) − окислительный стресс Предполагают, что окислительный стресс является важной причиной нарушения функции сперматозоидов Окислительный стресс − один из параметров, который можно оценить с помощью биохимических тестов В чрезмерных количествах, АФК препятствуют нормальному функционированию сперматозоида, индуцируя пероксидазное повреждение его цитоплазматической мембраны и нарушая мембрано-зависимые процессы Сперматозоиды человека особенно восприимчивы к окислительному стрессу из-за высокого содержания полиненасыщенных жирных кислот и ограниченных возможностей антиоксидантной защиты Оценка состояния перекисного окисления липидов, тесты систем антиоксидантной защиты и оценка уровня повреждения ДНК − это некоторые методы измерения окислительного стресса Предполагают, что окислительный стресс является важной причиной нарушения функции сперматозоидов. Уровень окислительного стресса − один из параметров, которые можно оценить с помощью биохимических тестов. В чрезмерных количествах, активные формы кислорода препятствуют нормальному функционированию сперматозоида, индуцируя пероксидазное повреждение его цитоплазматической мембраны и нарушая мембрано-зависимые процессы, такие как подвижность, акросомный экзоцитоз и слияние с цитолеммой яйцеклетки. Сперматозоиды человека особенно восприимчивы к окислительному стрессу из-за высокого содержания полиненасыщенных жирных кислот и ограниченных возможностей антиоксидантной защиты. Лейкоциты являются мощными генераторами активных форм кислорода и способны влиять на результаты теста, выполненного методом хемилюминесценции. Оценка состояния перекисного окисления липидов, уровня повреждения ядерной и митохондриальной ДНК и тесты систем антиоксидантной защиты, которые определяют степень защиты сперматозоидов и их плазмы от активных форм кислорода, − это некоторые методы измерения окислительного стресса. Перекисное окисление липидов характеризуется разрывом полиненасыщенных жирных кислот фосфолипидов клеточной мембраны, что приводит к потере гибкости мембраны, снижению активности ферментов и ионных каналов. Слайд 16 Специальные тесты Фрагментация ДНК Повреждение ДНК: положительная корреляция с плохими показателями спермы, лейкоцитоспермией и высоким уровнем активных форм кислорода. Многие исследования показывают, что фрагментация ДНК сперматозоидов может влиять на оплодотворение, качество эмбрионов, их развитие, достижение стадии бластоцисты, а также на частоту наступления беременности и частоту самопроизвольных абортов - Метод гель-электрофореза изолированных клеток (метод ДНК-комет) -Метод TUNEL Нормальные результаты анализа методом ДНК-комет варьируют от 80 до 95% Вероятность беременности у пары при проведении стандартного ЭКО в два раза выше, если индекс фрагментации ДНК метода TUNEL (DFI) составляет менее 30%. Повреждение ДНК взаимосвязано с плохими показателями спермы, например, низкой концентрацией сперматозоидов и их низкой подвижностью, лейкоцитоспермией и высоким уровнем активных форм кислорода. Согласно Agarwal и соавт., многофакторный процесс повреждения ДНК может быть результатом недостаточности протамина и мутаций, влияющих на упаковку ДНК или уплотнение хромосом в процессе сперматогенеза. По данным Aitken и соавт. и Agarwal и соавт., примерно у 8% субфертильных мужчин с нормальными показателями спермы отмечаются высокие уровни аномалий ДНК. Многие исследования показывают, что фрагментация ДНК сперматозоидов может влиять на оплодотворение, качество эмбрионов, их развитие, достижение стадии бластоцисты, а также на частоту наступления беременности и частоту самопроизвольных абортов. К прямым методам оценки повреждения ДНК относятся метод гель-электрофореза изолированных клеток (метод ДНК-комет) и методTdT-опосредованной метки dUTP-конца разрыва цепи ДНК (метод TUNEL). Нормальные результаты анализа методом ДНК-комет варьируют от 80 до 95%.Вероятность беременности у пары при проведении стандартного ЭКО в два раза выше, если индекс фрагментации ДНК метода TUNEL (DFI) составляет менее 30%. Слайд 17 Специальные тесты Непрямые методы оценки повреждений ДНК Определение целостности хроматина сперматозоидов ДНК-интеркалирующие красители (акридиновый оранжевый) В результатах анализов целостности хроматина сперматозоидов имеются значительные индивидуальные различия Уровень повреждения ДНК сперматозоидов эякулята или в придатке яичка выше, чем у сперматозоидов, находящихся в яичке, поэтому некоторые авторы у пациентов с высоким индексом фрагментации ДНК рекомендуют использовать для ИКСИ сперматозоиды яичек. Американское общество репродуктивной медицины (2006) выразило текущий взгляд на анализы целостности ДНК, указав, что на сегодняшний день недостаточно данных, чтобы рекомендовать тесты на повреждение ДНК всем пациентам с бесплодием. Подходы к решению этой проблемы еще должны доказать свою клиническую значимость К непрямым методам оценки повреждений ДНК относятся метод определения целостности хроматина сперматозоидов (определяет целостность хроматина) и метод с ДНКинтеркалирующими красителями (акридиновый оранжевый), который помогает отличить одно-и двухцепочечную ДНК. Согласно данным Практического комитета Американского общества репродуктивной медицины, нормальные результаты анализа на определение целостности хроматина сперматозоидов находятся в диапазоне от ≤ 60% до ≤ 73%. Однако в результатах этих анализов имеются значительные индивидуальные различия, что осложняет получение однозначных выводов. Уровень повреждения ДНК сперматозоидов эякулята или в придатке яичка выше, чем у сперматозоидов, находящихся в яичке. Некоторые авторы рекомендуют у пациентов с высоким индексом фрагментации ДНК использовать для ИКСИ сперматозоиды яичек. Американское общество репродуктивной медицины (2006) выразило текущий взгляд на анализы целостности ДНК, указав, что на сегодняшний день недостаточно данных, чтобы рекомендовать тесты на повреждения ДНК всем пациентам с бесплодием. Подходы к решению этой проблемы еще должны доказать свою клиническую значимость. Слайд 18 Функциональная оценка спермы Свертывание Объем Большой объем (> 6 мл) Низкий объем (<2 мл) Возможная ошибка при заборе образца - Повторите тест Несворачивающаяся сперма высокой вязкости Сбор мочи после эякуляции Нормальная концентрация сперматозоидов Тест после полового акта Изображение 1. Подход к диагностике и лечению бесплодия на основании общих характеристик спермы Этот алгоритм обобщает подходы к диагностике и лечению бесплодия на основании общих характеристик спермы. Если выявлены нарушения свертывания - или высокая вязкость спермы, необходимо провести тест после полового акта. При отклонениях от нормы объема семенной жидкости, например при большом объеме (более 6 мл) или малом объеме (менее 2 мл), также следует выполнить дальнгейшие исследования. Большой объем может указывать на ошибку при получении образца, поэтому может потребоваться получение нового. То же относится и к низкому объему спермы (менее 2 мл) − следует получитьновый образец. В этом случае, также рекомендуется забор мочи после эякуляции. Если концентрация сперматозоидов в пределах нормы, необходимо провести тест после полового акта. Слайд 19 Функциональная оценка спермы Свертывание Объем Агглютинация Значительное склеивание IgG-MAR/ Mar/IBT (-) или слабо + + SPA/ZPT Иммунологические факторы Дополнительные тесты не требуются SCI <5 SCI ≥ 5 Кортикостероиды ИКСИ ВМО/ЭКО Рисунок 2: lgG-MAR: реакция смешивания иммуноглобулинов; Mar/IBT: иммуногранулотест; SPA: анализ пенетрации сперматозоидов; ZPT тест zona pellucida; SCI: индекс капацитации сперматозоидов; ИКСИ: интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида; ВМО: внутриматочное осеменение; ЭКО: экстракорпоральное оплодотворение Диагноз бесплодия и показания для теста на акросомную реакцию основываются на рассмотренных ранее функциональныханализах спермы, которые представлены на этой схеме. Если присутствуют какие-либо нарушения свертывания, например чрезмерное склеивание, следует провести реакцию смешивания иммуноглобулинов (MAR-тест) или иммуногранулотест. Слабо положительный MAR-тест/иммуногранулотесту пациентов со слабо подвижными сперматозоидами исключает иммунологические причины, и не требует проведения дополнительных анализов. Положительные результаты могут потребовать терапии кортикостероидами или проведения теста связывания/перетрации сперматозоидами блестящей оболочки ооцита. Если индекс капацитации сперматозоидов ниже 5, может потребоваться терапия кортикостероидами или интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида. Если индекс капацитации сперматозоидов равен или выше 5, могут быть показаны внутриматочное или экстракорпоральное оплодотворение (другие характеристики сперматозоидов и влияющие факторы женского организма также должны быть изучены). Слайд 20 Выводы Общий анализ семенной жидкости не позволяет получить точную информацию о фертильности пациента: Нормальный анализ семенной жидкости не исключает наличия функциональных дефектов сперматозоидов Естественная беременность возможна при наличии отклонений в результатах анализа семенной жидкости Не существует единого мнения относительно нормальных показателей спермы, так как они постоянно пересматриваются в свете новых результатов исследований Рекомендуется использование функциональных тестов сперматозоидов для уточнения диагноза, обычно в случаях, когда показано искусственное оплодотворение и точная причина бесплодия не была установлена Отдельно взятые показатели нельзя использовать для прогнозирования фертильности без учета других факторов и клинической ситуации Общий анализ семенной жидкости не позволяет получить точную информацию о фертильности пациента: − нормальный анализ семенной жидкости не исключает наличия функциональных дефектов сперматозоидов − естественная беременность возможна при наличии отклонений в результатах анализа семенной жидкости Не существует единого мнения относительно нормальных показателей спермы, так как они постоянно пересматриваются в свете новых результатов исследований. Рекомендуется использование функциональных тестов сперматозоидов для уточнения диагноза, обычно в случаях, когда показано искусственное оплодотворение и точная причина бесплодия не была установлена. Каждый отдельный показатель (как общего анализа семенной жидкости, так и функциональных тестов сперматозоидов) нельзя использовать для прогнозирования фертильности; они должны использоваться в комбинации с другими данными и с учетом клинической ситуации. Слайд 21 Выводы (продолжение) Проведение теста контакта спермы с цервикальной слизью рекомендуется в таких случаях: высокая вязкость спермы, бесплодие неясной этиологии, низкий объем спермы с нормальным количеством сперматозоидов. Чрезмерная агглютинация сперматозоидов или ненормальные результаты теста контакта спермы с цервикальной слизью могут указывать на присутствие антиспермальных антител (AСA); в таком случае показано проведение теста на AСA Креатинкиназный тест может быть полезен в диагностике пациентов с варикоцеле и может быть полезен при выборе тактики лечения таких пациентов − оперативное лечение варикоцеле или вспомогательные репродуктивные технологии. Несмотря на то, что метод ИКСИ в настоящее время способен помочь большинству пациентов с бесплодием, , данный диагноз необходимо установить перед возможным проведением процедур экстракорпорального оплодотворения. Тест связывания сперматозоидов с блестящей оболочкой и тест на пенетрацию сперматозоидами яйцеклетки золотистого хомячка могут быть полезными для выявления основных нарушений взаимодействия сперматозоидов с яйцеклеткой. Проведение теста контакта спермы с цервикальной слизью рекомендуется в следующих случаях: высокая вязкость спермы, бесплодие неясной этиологии, низкий объем спермы с нормальным количеством сперматозоидов. Чрезмерная агглютинация сперматозоидов или отклонение от нормы результатов теста контакта спермы с цервикальной слизью могут указывать на присутствие антиспермальных антител; в таком случае показано проведение теста на AСA. Креатинкиназный тест может быть полезен в диагностике пациентов с варикоцеле и может быть полезен при выборе тактики лечения таких пациентов − оперативное лечение варикоцеле или вспомогательные репродуктивные технологии. Несмотря на то, что интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида в настоящее время способна помочь большинству пациентов с бесплодием, данный диагноз необходимо установить перед возможным проведением процедур экстракорпорального оплодотворения. Тест связывания сперматозоидов с блестящей оболочкой и тест на пенетрацию сперматозоидами яйцеклетки золотистого хомячка могут быть полезными для выявления основных нарушений взаимодействия сперматозоидов с яйцеклеткой. Слайд 22 1. Agarwal A, Bragais F M, Sabanegh E. Assessing sperm function. Urol Clin N Am. 2008;35:157–171. 2. Aitken RJ, Irvine DS, Wu FC. Prospective analysis of sperm-oocyte fusion and reactive oxygen species generation as criteria for the diagnosis of infertility. Am J Obstet Gynecol. 1991;164:542–551. 3. Aitken, RJ. Sperm function tests and fertility. Inter J Androl. 2006;29:69–75. 4. Andersen AG, Jensen TK, Carlsen E, et al. High frequency of suboptimal semen quality in an unselected population of young men. Hum Reprod. 2000;15(2):366–72. 5. Andrade-Rocha FT . Semen Analysis in Laboratory Practice: An Overview of Routine Tests. Journal of Clinical Laboratory Analysis 2003;17:247–258. 6. Carlsen E, Petersen JH, Andersson AM, et al. Effects of ejaculatory frequency and season on variations in semen quality. Fertil Steril. 2004;82(2):358–66. 7. Clarke GN. Etiology of sperm immunity in women. Fertil Steril. 2009;91(2):639-43. 8. Evenson D, Wixon R. Meta-analysis of sperm DNA fragmentation using the sperm chromatin structure assay. Reprod Biomed Online. 2006;12(4):466–72. 9. Ferreira EM, Vireque AA, Adona PR, et al. Cytoplasmic maturation of bovine oocytes: structural and biochemical modifications and acquisition of developmental competence.Theriogenology. 2009;71(5):836-48. 10. Gomez E, Irvine DS, Aitken RJ. Evaluation of a spectrophotometric assay for the measurement of malondialdehyde and 4- hydroxyalkenals in human spermatozoa: relationships with semen quality and sperm function. Inter J Androl. 1998;21:81–94. 11. Hallak J, Sharma RK, Pasqualotto FF, et al. Creatine kinase as an indicator of sperm quality and maturity in men with oligospermia. Urology. 2001;58(3):446-451. 12. Hassoun S, Drouet M, Le Sellin J, et al.Immunological causes of male infertility. Allerg Immunol. 1991;23(4):121-5-5. 13. Jeyendran RS. Sperm collection and processing methods: a practical guide. Cambridge (UK): Cambridge University Press. 2003; p. viii, 160. 14. Jones R, Mann T, Sherins RJ. Peroxidative breakdown of phospholipids in human spermatozoa: spermicidal effects of fatty acid peroxides and protective action of seminal plasma. Fertil Steril. 1979;31:531–537. 15. Kruger TF, Menkveld R, Stander FSH, et al. Sperm morphologic features as a prognostic factor in in vitro fertilization. Fertil Steril .1986;46:1118–23. 16. Lewis SEM, Aitken RJ Sperm DNA damage, fertilization and pregnancy. Cell Tissue Res. 2005;322(1):33-41. 17. Liu DY, Baker HWG. Defective sperm-zona pellucida interactions: a major cause of failure of clinical in-vitro fertilization. Hum Reprod. 2000;15(3):702-708. 18. McLachlan RI, Baker HW, Clarke GN, et al. Semen analysis: its place in modern reproductive medical practice. Pathology. 2003;35(1):25–33. 19. Rowe PJ. WHO manual for the standardized investigation, diagnosis, and management of the infertile male. Cambridge (UK): Cambridge University Press [for] World Health Organization. 2000. p. x, 91. 20. Sharma RK, Agarwal A. Role of reactive oxygen species in male infertility. Urology. 1996;48:835-50. 21. Soffer Y, Golan A, Herman A, et al. Prediction of in vitro fertilization outcome by sperm penetration assay with TEST-yolk buffer preincubation. Fertil Steril 1992;58:556–562. 22. World Health Organization. WHO laboratory manual for the examination of human semen and semen-cervical mucus interaction, 4th ed. New York: Cambridge University Press, 1999. 23. Yeung CH, Majumder GC, Rolf C, et al. The role of phosphocreatine kinase in the motility of human spermatozoa supported by different metabolic substrates. Mol Hum Reprod. 1996;2(8):591-596.
