Ракова Н.Г. - Современная аллергодиагностика
advertisement
СОВРЕМЕННАЯ АЛЛЕРГОДИАГНОСТИКА кафедра клинической лабораторной диагностики РМАПО доцент Ракова Н.Г. Москва, 1 октября 2013г. Аллергия -- это реакция гиперчувствительности, вызываемая иммунными механизмами или -- специфическая повышенная чувствительность к антигенам (аллергенам) в результате неадекватной реакции иммунной системы Распространенность аллергических заболеваний Западная Европа 25 - 30% Отдельные экологически неблагоприятные регионы 50 - 60% Промышленные районы России 15 - 35% Заболеваемость среди детей в крупных промышленных городах 10 - 40% Распространенность аллергических заболеваний Аллергические риниты Атопический дерматит Аллергическая крапивница Аллергическая астма Аллергия на пищевые продукты 10 - 15% 10% 10% 5 - 10% 2% Потребность в диагностике аллергических состояний С заболеваниями, в патогенезе которых ведущую роль играют аллергические реакции, чаще встречаются не аллергологи, а врачи других специальностей (анестезиологи, пульмонологи). дерматологи, гастроэнтерологи, Классификация гиперчувствительности по определению Комиссии номенклатурного комитета EAACI 2001 г I тип – немедленного типа III тип – иммунокомплексный с участием коплемента Клиническая и лабораторная аллергодиагностика Задачи аллергодиагностики: –Дифференцирование аллергических состояний от симптоматически сходных заболеваний, др. видов гиперчувствительности, псевдоаллергических реакций. –Прогноз тяжести аллергического заболевания. –Выявление причинного аллергена. –Подбор аллергенов для специфической иммунотерапии. –Мониторинг и контроль результатов терапии и элиминационных мероприятий. Алгоритм аллергодиагностики: • • • 1. 2. 3. Анамнез, Методы in vivo (кожные тесты, провокационные пробы ) Лабораторные методы Определение IgE и Ig G антител Определение катионного белка эозинофилов (ЕСР) Клеточные тесты Клинические методы аллергодиагностики Кожное тестирование – основной метод специфической аллергодиагностики Аллерген воздействует на клетки кожи • Prick (укольный) тест • Скарификационные пробы • Внутрикожные пробы • Patch (аппликационный) тест Провокационные пробы Аллерген воздействует на клетки шокового органа • • • • Конъюктивальный тест Эндоназальный тест Ингаляционный тест Пищевой провокационный тест Лабораторные методы диагностики Преимущества использования тестов in vitro • Нет противопоказаний к обследованию • Не вызывают дополнительной сенсибилизации, нет риска анафилактических реакций • Нет возрастных ограничений, возможно проводить в самом раннем возрасте • Большое число тестируемых аллергенов • Использование сыворотки для исследования в любой лаборатории (тесты на расстоянии) Диагностика In vitro: • Общий IgE • Специфический IgE • Специфический IgG (IgG4) • Клеточные тесты • Катионный белок эозинофилов Количественное определение IgEантител • 1967 г - RAST (радиоаллергосорбентный тест) Pharmacia и модифицированные RAST – первое поколение тестов. - Полуколичественные ручные методы. Результаты в условных единицах и в соответствующих им классах от 1 до 5. • 1990-е годы - второе поколение тестов. - Результаты в ME/мл (1 МЕ=2,4 нг IgE). Калибраторы аттестованы по стандарту ВОЗ 75/502 общего IgE. Пороговое значение положительных концентраций – 0,35 МЕ/мл • 2000-е годы – третье поколение тестов. - Полностью автоматизированные, с повышенной чувствительностью, пороговое значение положительных концентраций - 0,1 МЕ/мл Принципы выявления IgE в иммунохимических наборах реагентов - аллергосорбентный тест - реверсивный аллергосорбентный тест («capture» метод) Аллергосорбентный тест Аллергены иммобилизованы на твердой фазе (лунка, бумажный диск, нитроцеллюлозная мембрана или нить) Меченое антитело к IgE Специфический IgE Аллерген Экспресс-тест ALFA (Allergy Lateral Flow Assay) Плашечный формат ИФА Недостатки аллергосорбентного варианта • Аллерген может быть экранирован от специфического IgE специфическими IgG, которых в сыворотке крови обычно намного больше. • Таким образом можно пропустить IgE-зависимый компонент заболевания. IgE IgG IgG IgG IgG IgE IgE IgG IgE IgG IgG G Ig IgG IgG IgE IgG IgG IgG Специфические антитела к IgE G Ig IgG IgG Недостатки аллергосорбентного варианта • Зависимость от носителя - при сорбции на твѐрдой фазе аллерген может изменить свою конформацию или др. свойства. В результате может возрасти фон, может снизится специфичность реакции, может увеличиться процент ложноотрицательных и, особенно, ложноположительных реакций Реверсивный аллергосорбентный тест («capture», REAST) - Используются жидкие биотинилированые аллергены - На твѐрдой фазе иммобилизованы антитела к IgE Меченый аллерген Специфический IgE Антитело к IgE Особенности реверсивных аллергосорбентных тест-систем -Емкость и другие свойства твердой фазы имеют меньшее значение; -Нет фиксированных панелей аллергенов – свободный выбор аллергенов в каждом анализе; -Облегчается постановка анализа на автоматах; - Количественный результат. “IgE-Аллергоскрин-ИФА-Бест” Схема проведения ИФА Преимущества реверсивных аллергосорбентных тест-систем • Возможность использования одной и той же стандартной формы аллергена для анализа любого класса аллергенспецифичных иммуноглобулинов (IgE, IgG, IgG4, IgM, IgA) • Гибкость в выборе аллергенов при постановке анализа • Широкий выбор (не менее 500) и доступность жидких биотинилированных аллергенов Особенности реверсивных аллергосорбентных тест-систем «Вектор-Бест» • Время анализа- 1 час 15 мин; • Включают полный комплект необходимых реагентов калибровочные образцы, контрольную сыворотку, содержащую аллергенспецифические IgE, и два контрольных аллергена; • Расход биотинилированных аллергенов -в 5-6 раз ниже; • Стоимость оптимального комплекта реагентов и стоимость аллергенов - более чем в 3 раза ниже Интерпретация результатов определения IgE-антител Повышен уровень общего IgE, но не обнаружены IgE-антитела • В исследование не вошли причинно-значимые аллергены, к которым вырабатываются специфические IgE • Латентная фаза • Неатопические состояния Ложноположительные результаты • Ложноположительные результаты м.б. из-за перекрѐстного реагирования аллергенов. • IgE-антитела нередко обнаруживаются у лиц без клинических проявлений гиперчувствительности к данному аллергену. Ложноотрицательные результаты • Количество свободно циркулирующих в кровотоке • • • • • • • • • IgE-антител ниже чувствительности используемой тест-системы. Не IgE-опосредованный механизм аллергии. Практически все IgE-антитела фиксированы на клетках. Несоответствие структуры аллергена in vitro, аллергену образующемуся в организме (лекарственные, пищевые аллергены) иммуносупрессия, вызванная глюкокортикоидами (или другими иммуносупрессирующими лекарствами). синдром хронической усталости, хронические инфекции, состояние иммунной недостаточности, вызванное, например, определѐнными химическими соединениями. болезни печени, связанные со снижением продукции белков болезни почек, которые приводят к потере белков с мочой Клеточные тесты Тесты выявляют повышенную чувствительность клеток-мишеней к воздействию аллергена IgE-зависимая дегрануляция и высвобождение медиаторов аллергии FcRI FcRI связывающий сайт Через несколько часов Немедленное высвобождение Содержимое гранул: Гистамин, TNF-, Протеазы, Гепарин Продукция цитокинов IL-4, IL-13, IL-5, Через несколько минут Лейкотриены, Простагландины Базофильные тесты - выявляют немедленную реакцию клеток • Реакция дегрануляции базофилов • Базофил активирующий тест • Тесты высвобождения медиаторов: гистамина, лейкотриенов Визуальный подсчет процента дегранулированных клеток после инкубации с аллергеном относительно контроля по окраске толлуидиновым синим. Цитометрическое определение процента дегранулированных клеток после инкубации их с аллергеном по экспрессии СD63 или CD203с. Количественное или процентное определение высвободившихся медиаторов из клеток после инкубации их с аллергеном. CAST (Cellular Antigen Stimulation Test) • • • Технология CAST (Cellular Antigen Stimulation Test), тест антигенной стимуляции клеток) основана на определении сульфидолейкотриенов (LTC4, LTD4, LTE4), секретируемых примированными IL-3 базофилами под действием аллергенов in vitro. Его также называют провокационным тестом in vitro. Метод патентован, авторы - проф. De Weck и д-р Sainte-Laudy. Благодаря синтезу сульфидолейкотриенов (sLT) de novo анализ CAST® обладает высочайшей специфичностью по сравнению с классическим тестом высвобождения гистамина. Протокол исследования включает три этапа: выделение популяции лимфоцитов из стабилизированной ЭДТА крови, стимуляция лимфоцитарной суспензии специфическими аллергенами и иммуноферментный анализ синтезированных базофилами во время стимуляции лейкотриенов. Тест высоко чувствителен и специфичен, особенно при лекарственной гиперчувствительности. Тесты функциональной активности лейкоцитов при действии аллергенов - выявляют позднюю фазу реакции клеток • Реакция торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ ) • Тесты высвобождения интерлейкинов Подсчѐт процента подавления миграции лейкоцитов крови при инкубации их с аллергеном относительно контроля по определению длины пробега лейкоцитов в капиллярах. Количественное определение продукции IL-4, IL-5, IL-13 при инкубации лейкоцитарной взвеси крови с аллергеном. Спасибо за внимание!
