Методика исследования

41
ТОКСИКОЛОГИЯ
ГИДРОБИОНТОВ
(Водная токсикология)
Министерство образования Российской Федерации
Ярославский государственный университет им. П.Г. Демидова
Кафедра физиологии человека и животных
ТОКСИКОЛОГИЯ
ГИДРОБИОНТОВ
(Водная токсикология)
Методическое руководство
Часть 2
Ярославль 2002
2
ББК Е 082.я73
Р 98
Составитель Е.В. Рябухина
Токсикология гидробионтов (Водная токсикология): Метод. руководство / Сост. Е.В. Рябухина; Яросл. гос. ун-т. Ярославль, Часть 2. 2002.
40 с.
Предназначено для студентов факультета биологии и экологии, изучающих дисциплину "Водная токсикология".
Рецензент - кафедра физиологии человека и животных Ярославского
государственного университета им. П.Г. Демидова
© Ярославский государственный
университет, 2002
© Рябухина Е.В., 2002
3
Тема 5. Хеморецепция веществ
гидробионтами
Контрольные вопросы
1. Роль хеморецепции в жизни животных.
2. Хеморецепция простейших.
3. Хеморецепция у моллюсков. Локализация хеморецепторов и их
специфичность.
4. Строение и работа осфардия прудовика. Реакция осфардия на химические вещества неорганической и органической природы.
5. Хеморецепция у насекомых, C- и L- хеморецепторные нейроны.
Относительный характер специфичности нейронов.
6. Феромоны. Использование феромонов в народном хозяйстве.
7. Вкусовая луковица позвоночных, ее строение.
8. Особенности вкуса у рыб. Небный орган, вкусовые рецепторы кожи.
9. Обонятельная сенсорная система позвоночных. Рецепторные клетки, особенности их строения.
10. Электрические реакции обонятельной выстилки и отдельных рецепторных нейронов.
Важнейшим физиологическим свойством любого рецептора является
чувствительность к адекватному стимулу. Уровень чувствительности
оценивается порогом возбуждения, т.е. минимальной величиной стимула, способной вызвать возбуждение. Величина порога обратна величине
возбудимости.
Химические агенты водной среды воспринимаются рыбами благодаря
наличию у них специфических хеморецепторов. Хеморецепция древнейшая и вместе с тем наименее изученная из всех видов рецепции форма взаимодействия организма с внешней средой. В настоящее время различают три вида химической рецепции у рыб: обоняние, вкус и так
называемое общее химическое чувство. Обоняние используется рыбами
преимущественно для восприятия нейтральных химических соединений,
играющих сигнальную роль; вкус - для восприятия пищевых метаболитов или веществ, нарушающих метаболизм; общехимическое чувство позволяет рыбам ориентироваться на градиент солености при миграциях.
Развитие у рыб высокочувствительных рецепторов для анализа химических раздражителей, способность воспринимать малые концентрации
4
растворенных веществ на значительном расстоянии определяются физико-химическими свойствами воды. Являясь полярным растворителем и
обладая большой плотностью, вода обеспечивает сохранение химического следа, имеющего сигнальное значение, в течение длительного времени. Такими сигналами могут быть неорганические и органические вещества, создающие определенный фон того или иного места обитания рыб,
формирующие запах "родных" рек, метаболиты, играющие роль феромонов, вещества опасности и другие. Значение этих сигналов в миграциях,
нерестовом, пищевом, оборонительном поведении рыб чрезвычайно велико.
Существуют различные методы регистрации обонятельных порогов
пахучих веществ (условные рефлексы, поведенческие реакции, электрическая активность). С их помощью удалось установить, что рыбы обладают исключительно высокой чувствительностью обонятельных рецепторов, в сотни раз превышающей чувствительность обонятельной
рецепции человека.
Необонятельная химическая рецепция рыб (вкус и общая химическая
чувствительность) так же высока, как и обонятельная. Рецепторный аппарат вкусовой системы рыб представлен вкусовыми почками, расположенными в слизистой оболочке ротовой полости, на жабрах и наружной
поверхности тела. Кроме того, восприятие химических раздражителей
осуществляется свободными нервными окончаниями тройничного, блуждающего и спинномозговых нервов.
Наружные вкусовые почки рыб высокочувствительны к различным
веществам. Например, вкусовая чувствительность у гольянов по отношению к глюкозе в 1,6 раза, к фруктозе в 2,5 раза, хинину в 24 раза, а к поваренной соли в 205 раз выше, чем у человека.
Лабораторная работа № 11
Избегание рыбами некоторых токсических веществ
Одним из многочисленных вредных влияний, оказываемых сточными
водами на водоем, является создание непроходимых химических барьеров на пути миграции рыб, так как многие виды рыб способны избегать
некоторые ядовитые вещества.
Экспериментально установлено, что форель, гольян, колюшка обладают хорошей способностью различать и избегать токсические растворы
свинца, причем в таких концентрациях, которые человек на вкус не
ощущает, а также сульфатные и сульфитные соединения, содержащиеся
в сточных водах бумажной промышленности, кислоты и щелочи. Обнаружена парадоксальная реакция рыб в отношении к различным концен-
5
трациям одного и того же вещества: рыбы могут избегать относительно
высокие концентрации токсического вещества и привлекаться относительно низкими.
По мнению некоторых исследователей, имеется группа веществ, в
растворах которых реакция избегания проявляется слабо или отсутствует. В первую очередь это относится к ядам, действующим преимущественно на нервную систему. Так, гольяны слабо избегают или вовсе не
способны избегать фенол, орто- и паракрезол, анилин в связи с тем, что
время, необходимое им для избегания растворов этих веществ, и время,
нарушающее такую способность, весьма близко, поэтому они не успевают выйти из токсичной зоны.
Физиологические механизмы реакции обнаружения и реакции избегания различны. В основе реакции обнаружения токсических веществ
лежит функциональная активность химического анализатора, объединяющего вкус, обоняние и общее химическое чувство. Поступающая информация анализируется в центральной нервной системе и передается в
локомоторный аппарат, функциональная активность которого лежит в
основе реакции избегания. Например, фенолы воспринимаются рыбами
при очень малых концентрациях (0,01 мг/л 0,0005 мг/л). Рыбы не способны избегать высокие концентрации этих веществ вследствие быстро
наступающей потери рефлекса равновесия и паралича (Jones J., 1964).
Другой, не менее важной причиной отсутствия у рыб в ряде случаев
реакции избегания на токсические вещества может быть блокада хеморецепторов (обонятельных рецепторов), механорецепторов боковой линии и поражение чувствительных клеток усиков рыб низкими концентрациями токсиканта (например, тяжелые металлы - 0,5 мг/л;
детергенты - менее 0,4 мг/л).
Огромный теоретический и практический интерес для водной токсикологии представляют исследования, посвященные поиску веществ, способных отпугивать рыб от загрязненных стоков промышленных предприятий, от гидротехнических сооружений, привлекать рыб в
рыбоподъемники и т.д. Установлено, что многие виды рыб способны обнаруживать и избегать такие токсические вещества, как пестициды,
нефть и дисперсанты нефти, тяжелые металлы. При этом выраженность
реакции избегания пропорциональна логарифму концентрации токсических веществ.
Для работы необходимо: прибор Джонса (см. рис. 1), мелкая рыбагуппи, карась, 1%-ные растворы азотнокислого свинца или сернокислого
цинка, сернокислой меди или аммиака, мерные цилиндры на 200 мл –
2 шт., мерные колбы на 200 мл – 4 шт., химические пипетки на 10 мл -
6
2 шт., аквариум с отстоянной и аэрированной водопроводной водой на
40 литров.
Задание: Установить "порог привлечения" и "порог отпугивания"
рыб, исследуя реакцию рыб на различные концентрации токсиканта.
Методика исследования
Опыты по определению величины "порога отпугивания" и "порога
привлечения" проводятся на мелкой рыбе (гуппи, карась) с помощью модифицированного прибора Джонса (рис. 1.):
Рис. 1. Схема прибора Джонса: 1 - цилиндрическая стеклянная камера
с резиновыми пробками, имеющими отверстия для стока воды; 2 - сосуд
с двухходовым краном объемом 3 литра для создания проточной системы
в камере; 3 - дозирующий сосуд для токсикантов объемом 200 мл с трехходовым краном, позволяющим пропускать токсикант через правую или левую половину камеры; 4 - шланги с винтовыми зажимами.
Величиной порога является наименьшее количество токсиканта наименьшей концентрации, пропущенного через камеру и вызывающего реакцию рыб.
7
В качестве "отпугивающих" веществ можно использовать азотнокислый свинец или сернокислый цинк. Реакцию "привлечения" могут вызывать слабые растворы аммиака и сернокислой меди.
Для работы стеклянную камеру (1) повернуть правой стороной вверх,
открыть пробку, заполнить камеру на 3/4 объема отстоянной водой из
аквариума и поместить в нее 3 – 5 рыбок. Пробку плотно закрыть и укрепить камеру на подставке в горизонтальном положении. Регулируя
винтовые зажимы (4), в том числе и на сливном шланге, создать в камере
слабую проточность воды, доливая воду в сосуд (2) по мере необходимости. В течение 10 - 15 минут наблюдать за поведением рыб, отмечая случайный характер их расположения в камере.
Приготовить по 100 мл рабочих растворов с концентрациями исследуемых веществ: 1 мг/л; 10 мг/л и 100 мг/л.
Заполнить дозирующий сосуд (3) раствором токсиканта необходимой
концентрации (начиная с малой - 1 мг/л) и медленно пропускать его через камеру со стороны сливного шланга (чтобы токсикант не распространялся по всему объему камеры). Отметить, какое количество вещества заданной концентрации вызывает ту или иную реакцию рыб.
Определить пороговые концентрации "привлечения" и "отпугивания".
Между каждыми исследованиями промывать аквариум отстоянной водой, создавая полную проточную систему!
Оформить протокол опыта. Сделать выводы.
Лабораторная работа № 12
Хеморецепция неорганических веществ рыбами
(по кардиореспираторной реакции рыб)
Основные физиологические функции организма зависят от внешних
условий. Дыхательная и сердечная активность у рыб меняется при добавлении в воду химических веществ.
Анализ литературы показывает, что гипервентиляция жабр, многократное повышение частоты "кашля", бради- или тахикардия, аритмии
внешнего дыхания и работы сердца относятся к наиболее ранним симптомам острого и сублетального отравления рыб фенолами, солями тяжелых металлов, детергентами и другими компонентами сточных вод.
Эти перестройки в активности кардиореспираторной системы чаще всего
неоспоримо свидетельствуют о непосредственном действии биологически опасных веществ на функциональное состояние тест-объектов и
прежде всего на хеморецепторный аппарат рыб. Латентный период реакций, скорость и пределы отклонений перечисленных показателей от
8
нормы зависят от видовой чувствительности животных, концентрации и
токсичности испытуемого вещества.
Поскольку вентиляция жабр и сердечная деятельность - достаточно лабильные и чувствительные характеристики функционального состояния организмов, предоставляется возможным экспрессное ориентировочное определение по их динамике действующих и безопасных для
рыб разбавлений сточной воды или концентраций ее отдельных компонентов. В этом отношении интерес представляют электрометрические,
непрямые, методы регистрации показателей активности кардиореспираторной системы, основанные, в частности, на дистантном отведении
электрокардиограммы (ЭКГ) и электропневмограммы (ЭПГ) у интактных
(неоперированных) рыб. При этом оценка степени токсичности среды
проводится по изменениям не одного, а нескольких показателей (частоты
дыхания, частоты сердечных сокращений, амплитуды ЭПГ, частоты
"кашля" и ритма работы кардиореспираторной системы).
Показано, что для летального действия токсикантов характерна ранняя и предельно максимальная гипервентиляция жабр и/или частоты
"кашля" на фоне выраженной дестабилизации сердечного ритма (в первый час контакта рыб с испытуемым веществом и за 2 - 5 суток до их гибели). При кратковременном воздействии малых концентраций токсических веществ характерная дестабилизация всех показателей ЭКГ и ЭПГ
менее выражена и растянута во времени, тогда как в чистой воде перечисленные показатели за идентичный период обследования не изменяются.
Для работы необходимо: "Элкар-2", рыба – 4 экз., экранированный
аквариум с боковыми электродами, микрокомпрессор, 1%-ный раствор
KmnO4, 10%-ный раствор KOH, 1%-ный раствор фенола, стеклянная палочка, мерная колба или стакан на 1 л – 1 шт., отстоянная вода, химические пипетки на 10 мл - 3 шт.
Задание: По результатам ЭКГ и ЭПГ выявить изменения дыхательной и сердечной активности рыб при воздействии химических веществ.
Методика исследования
Установка состоит из электрокардиографа и аквариума (рис. 2).
Качество отведения биопотенциалов зависит от надежности экранировки и заземления установки.
Включить "Элкар-2", дать прогреться 15 минут. Установить усиление
1 мВ/см. Кабель пациента "Элкар-2 " присоединить к клеммам аквариума
для регистрации в 1 отведении.
9
Рис. 2. Схема установки для исследования хеморецепторной реакции рыб на
присутствие в воде токсических веществ (по кардиореспираторным реакциям):
1 - термостатирующее устройство; 2 - экранированный аквариум;
3 - усилитель биопотенциалов; 4 - регистрирующее устройство;
5 - ячейка экспериментального контейнера и датчики, зафиксированные
возле головы и хвостового плавника рыбы.
В аквариум налить аэрированную отстоянную воду, быстро и осторожно пересадить в него контрольную рыбу (следует избегать длительного контакта рыбы с воздушной средой). После 5-минутной адаптации
рыбы к новым условиям произвести запись ЭКГ при скорости 10 мм/с
(ЭКГ рыбы регистрировать в свободном плавании (животное не обездвиживать и не фиксировать). Затем создать в аквариуме концентрацию
KOH 200 мг/л, осторожно вливая токсикант и перемешивая стеклянной
палочкой (не травмируя при этом животное). Повторить запись ЭКГ.
Для изучения влияния KmnO4 (или фенола) на организм рыбы взять
другое животное. Эксперимент проводить так же, как описано выше.
Концентрация KmnO4 в аквариуме (рабочая концентрация) – 60 мг/л.
По окончании записи "Элкар-2" выключить.
Образец записи, дистантно отведенных ЭПГ и ЭКГ представлен на
рис. 3.
В ЭКГ визуально дифференцируется преимущественно зубец R.
10
Амплитуда ЭПГ, в отличие от частоты, зависит не только от состояния организма, но и от множества других - внешних факторов, поэтому
оценка изменений ударного объема вентиляции жабр у рыб по синхронным изменениям амплитуды ЭПГ может быть только косвенной и относительной.
Форма отдельных импульсов ЭПГ отражает структуру дыхательного
цикла, которая состоит из фаз "вдоха", "выдоха" и периода покоя (рис.3).
При этом увеличение или уменьшение амплитуды ЭПГ сопряжено с
пропорциональным и однонаправленным изменением глубины дыхания,
т.е. ударного объема вентиляции жабр.
Определение биологической опасности действующих концентраций
токсикантов данным методом заключается в индивидуальной регистрации и в последующем сравнительном анализе средних значений характеристик ЭПГ и ЭКГ для рыб в нативной воде (в контроле) и в растворах
испытуемых сред. Протоколирование данных экспериментов необходимо производить индивидуально для каждого тест-объекта, каждую регистрацию обязательно заканчивать записью калибровочного сигнала
(рис. 3).
Рис. 3. Образец совмещенной электрографической записи ЭПГ и ЭКГ рыбы,
отведенных дистантно с электродов, расположенных возле головы и хвостового плавника тест-объекта: 1 - зубец R электрокардиограммы, 1...1 - сердечный цикл; 2 - потенциал, синхронизированный с дыхательным движением рыбы, 2...2 - дыхательный цикл; 3 - потенциал, синхронизированный с
"кашлевым" движением респираторного аппарата рыбы; 4 - калибровочный
сигнал, равный 50 мкВ; 5...5 - отметка времени длительностью в 1 сек.
Помимо приборной регистрации ЭПГ возможен и визуальный подсчет частоты дыхания и кашля, а также относительный анализ ритма
вентиляции жабр и ее "глубины" по принципу больше или меньше по
сравнению с контролем.
Результаты расчетов средних арифметических значений показателей
у контрольной и опытных рыб представить в виде таблицы.
Сравнить полученные результаты. Оформить протокол опыта. Сделать выводы.
11
Лабораторная работа № 13
Хеморецепция веществ кожей лягушки
(по изменению частоты дыхания)
Частота дыхания у лягушки изменяется в широких пределах при воздействии различных факторов, в том числе и антропогенных (химические вещества, загрязняющие окружающую среду). По частоте дыхательных движений лягушки можно судить о реакции организма
животного на различные внешние воздействия.
Для работы необходимо: лягушка, препаровальная дощечка с булавками, бинт, почкообразный тазик, универсальный штатив с фотопреобразователем и серфинкой, блок питания, регистратор Н-338, глазной скальпель, вата, пипетки глазные - 3 шт., резиновая груша с глазной пипеткой,
отстоянная вода, растворы фенола (50 мг/л), гидрохинона и резорцина
(10 мг/л).
Задание: Изучить влияние химических веществ на дыхательную
функцию лягушки при орошении передней лапки животного растворами
токсикантов.
Методика исследования
Установка для графической регистрации дыхательных движений лягушки включает в себя препаровальную доску, где фиксируется животное, универсальный штатив с фотопреобразователем, к рычажку Энгельмана которого на нити подвешивается серфин, закрепляющийся на коже
диафрагмы рта лягушки. Фотопреобразователь соединяется с самописцем, на котором (на диаграммной ленте) регистрируются движения диафрагмы рта лягушки при дыхании.
С целью обездвиживания у лягушки производится поперечная перерезка спинного мозга на уровне 4 - 5-го сегментов. Она осуществляется
без наркоза уколом тонкого скальпеля в позвоночник животного на
0,5 см выше тазового сочленения (перед процедурой у лягушки фиксируются бинтом передние и задние лапки). На место укола накладывается
ватный тампон для предотвращения кровотечения. Тщательность перерезки контролируется отсутствием рефлексов с задних конечностей на
передние.
Лягушку зафиксировать бинтом так, чтобы свободной оставалась
только одна передняя лапка. Булавками на препаровальной доске закрепить животное за бинт спинкой книзу. Препаровальная доска должна находиться в эмалированном лотке (для слива стекающей жидкости). Регу-
12
лируя высоту фотопреобразователя на универсальном штативе серфином, захватить диафрагму рта. Регулятором усиления блока питания и
самописца установить необходимую амплитуду регистрируемых дыхательных движений (амплитуда отклонения пера примерно 15 - 20 мм), а
также найти оптимальную скорость движения диаграммной ленты самописца.
В течение 1 – 2 минут записывать на самописце исходные дыхательные движения диафрагмы (контроль), орошая открытую поверхность
кожи лягушки отстоянной водой. Затем (не прерывая запись) на свободную от бинта переднюю лапку животного глазной пипеткой нанести раствор одного из исследуемых веществ (сделав пометку на диаграммной
ленте) и в течение следующих 2 - 3-х минут регистрировать на самописце дыхательные движения. Повторить эксперимент с другим токсикантом, предварительно промыв лапку большим количеством отстоянной
воды и записав повторно исходный (контрольный) ритм дыхания.
1. Провести регистрацию дыхательных движений лягушки под влиянием химических веществ (фенол 50 мг/л, гидрохинон, резорцин
10 мг/л).
2. По записи на диаграммной ленте рассчитать среднюю частоту
(дых.движ/мин) и среднюю амплитуду (в мм) дыхательных движений лягушки на 5 - 10-ти см диаграммной ленты в контроле и после воздействия химических веществ.
3. Оформить протокол опыта. Сделать выводы.
Тема 6. Влияние токсических веществ
на поведенческие реакции гидробионтов
Контрольные вопросы
1. Классификация поведенческих реакций по разным критериям.
2. Ориентирующие движения. Виды кинезов и таксисов.
3. Влияние химических веществ на простые и сложные формы
поведения разных животных.
4. Влияние химических веществ на условно-рефлекторную деятельность.
13
Для оценки повреждающего эффекта токсических веществ используются различные поведенческие реакции гидробионтов: общая двигательная активность, характер плавания, пищевое, оборонительное, половое
поведение и выбор водными животными температурного оптимума.
Поведенческие реакции служат четкими показателями действия сублетальных концентраций токсикантов. Например, в сублетальных концентрациях поверхностно-активных веществ у морских беспозвоночных
изменяется прежде всего поведение: у моллюсков - нарушается способность зарываться в грунт, выпускать биссусные нити, закрывать створки
раковин. Наблюдается подавление отрицательной фотореакции у хирономид и некоторых водных клещей при действии сублетальных концентраций фенола. В эффективных концентрациях гексахлорана у Limnaea
stagnalis (прудовик большой) резко падает частота спариваний, из чего
следует, что вымирание моллюсков может происходить не в результате
отдаленного действия гексахлорана на репродуктивную функцию, а
вследствие непосредственного подавления половых рефлексов животных.
Изменения в поведении водных животных не только демонстративные показатели отравления, но и первоначальные признаки нарушения
жизнедеятельности, поэтому поведение может использоваться как оперативный чувствительный тест на токсичность водной среды.
Лабораторная работа № 14
Влияние токсических веществ
на поведение медицинской пиявки
Пиявка Hirudo medicinalis - эндемик Палеарктики. В России пиявка
повсеместно распространена в южной половине европейской части страны и на Кавказе. Преимущественно она обитает во рвах, болотах, прудах,
небольших, медленно текущих реках, которые не пересыхают летом и не
промерзают до дна зимой.
В искусственных условиях (при 18 - 22ºС зимой и 24 - 27ºС летом)
пиявка размножается в любое время года и откладывает коконы через 6 –
8 месяцев. Цикл развития от яйца до яйца завершается через 1,5 года в
лабораторных условиях, а в природе - примерно через 3 года.
Естественное состояние пиявки - состояние покоя (статичное состояние). Смена естественного статичного состояния пиявок (которое всегда
наступает у них при помещении в чашки Петри, наполовину заполненные чистой водой) на динамичное (ползание, плавание, "шагание") воз-
14
никает при внесении загрязненной, например металлами, воды. Токсичность воды можно определить уже в первые 15 – 20 минут контакта животных с токсикантом. Ионы металлов оказывают раздражающее действие на пиявок, а дальнейшее пребывание животных в токсиканте всегда
ведет к развитию у них интоксикации через несколько часов или суток
или заканчивается гибелью.
При отравлении полихлорпиненом первый признак интоксикации подворачивание передних сегментов животного под брюшную сторону.
Спустя несколько часов развиваются судороги, затем следуют неподвижность и смерть. В растворах хлорофоса первый симптом подворачивание задних сегментов, скручивание их в спираль. Постепенно происходит закручивание в тугую спираль всего тела животного так, что
движения прекращаются. Затем пиявка выпрямляется, открывается глотка, происходит заглатывание воды. Животное значительно увеличивает
свой объем и вес. Перед смертью вытягивается, вес падает.
В растворе фенола после беспорядочной двигательной активности и
нарушения координации движений животное на продолжительное время
прикрепляется присосками к стенке сосуда и повисает в виде петли. Затем пиявка падает на дно, у нее развиваются судороги и на теле появляются характерные перетяжки.
Такие наблюдения позволяют в приближенной степени судить о характере и специфике действия того или иного вредного соединения, направлять исследователя на изучение конкретных функций, ответственных за развитие патологического процесса, классифицировать
отравления. Таким образом, специфичность симптомов отравления, проявляющаяся в изменении поведения животного в исследуемых растворах, может быть использована для разработки биотестов по определению
различных классов токсикантов.
Для работы необходимо: 7 сосудов емкостью 200 мл с крышками,
растворы: фенола (1%-ный), ФОС (1%-ный), медного купороса (1%ный); отстоянная вода, пинцет, пиявки - 7 экз.
Задание: Определить характерные поведенческие реакции и время
отравления пиявок токсическими веществами различных концентраций.
Методика исследования
Сосуды емкостью 200 мл заполнить до краев растворами фенола
(100 мг/л и 50 мг/л), ФОС (500 мг/л и 150 мг/л), медного купороса
(50 мг/л и 10 мг/л) и поместить в них по 1-му экземпляру медицинских
пиявок, закрыть крышками, чтобы предотвратить бегство животных.
15
Один сосуд заполнить чистой водой и поместить в него контрольную пиявку.
На протяжении всего занятия вести наблюдение за поведением, описать характерные симптомы для каждого из исследуемых веществ и время их возникновения в разных концентрациях.
Оформить протокол опыта. Сделать выводы.
Лабораторная работа № 15
Влияние химических веществ на фильтрацию воды
пресноводными двустворчатыми моллюсками
Двустворчатые моллюски в связи с особым строением их тела относятся к специализированной группе животных, приспособленных к питанию при помощи довольно совершенного отфильтровывающего и сортирующего аппарата, состоящего из ресничного механизма жабр и
околоротовых лопастей.
Ресничный аппарат жабр способствует разделению пищевых частиц
по размерам и направляет пищевую массу в пищевые бороздки и далее к
ротовым лопастям. Ротовые лопасти снабжены рядами поперечных бороздок с ресничками, двигаясь к которым пищевая масса попадает в ротовое отверстие, а более крупные частицы, не пригодные для питания,
попадают на мантию. Ресничками мантийных краев частицы собираются
к основанию выводного сифона; по мере продвижения они склеиваются,
уплотняются и в виде так называемых псевдофекалий выбрасываются
наружу. На этом принципе работы организма моллюска и основан применяемый в данной работе механизм осветления воды.
Однако от изменения химического состава среды зависит способность двустворчатых моллюсков менять периодичность и продолжительность фильтрационной активности. Также моллюски могут периодизависимости
от
чески
закрывать
створки
раковин
и
в
трудноучитываемых эндогенных факторов, связанных с периодичностью
обменных процессов. На реакцию моллюсков, кроме токсикантов, оказывает влияние ряд факторов внешней среды. Наиболее существенные из
них - температура воды, содержание растворенного кислорода, активная
реакция и количество взвешенных веществ. Оптимальные параметры
тестируемой воды находятся в следующих пределах: температура 12 25ºС; содержание растворенного кислорода - не ниже 4 мг О2/л; рН в
пределах от 7,0 до 8,5; содержание взвешенных веществ не более 3 мг/л.
Исследованиями установлено, что при благоприятных условиях количество особей с закрытыми створками не превышает 35% от их общего
числа. В связи с этим показателем токсичности среды (наличия в воде
16
ионов меди, кадмия, цинка, ртути, свинца, органических соединений
ПАВ, формальдегида, аммиака, n-нитрофенола, ß-нафтола, активного
хлора и ряда других соединений) может являться увеличение относительного числа моллюсков с закрытыми створками до 70% и более. Таким образом, результатом внезапного изменения условий среды является
закрытие створок и отсутствие активной фильтрации у моллюсков, что
приводит к снижению очищения воды от взвешенных частиц.
Для работы необходимо: ФЭК, кюветы № 10 – 2 шт., 4 сосуда на
1 литр (промаркированных: 1 - небиологическое оседание (без моллюска), 2 - контроль (без токсиканта), 3 и 4 - по названию исследуемых веществ), 4 навески тонкодисперсного мела по 300 мг, 3 моллюска, стеклянная палочка с резиновым наконечником, стеклянная трубка d=10 мм, фильтровальная бумага, дистиллированная вода для промывки
кювет, отстоянная вода, растворы исследуемых веществ: фенол (1%ный), СМС (синтетическое моющее средство) (10%-ный).
Задание: Установить зависимость изменения скорости фильтрации
воды двустворчатыми моллюсками от вида токсиканта.
Методика исследования
Включить ФЭК, прогрев до начала работы 30 минут. Заполнить сосуды отстоянной водопроводной водой до метки 1 л. Приготовить взвесь
тонкодисперсного мела для каждого сосуда в концентрации 300 мг/л.
Определить первоначальную мутность раствора в каждом сосуде (концентрация мела во взвеси по показаниям ФЭК будет отличаться от навески в 300 мг/л, т.к. наиболее крупные частицы мела быстро оседают на
дно). Для этого, тщательно перемешав взвесь в сосуде, отобрать в кювету пробу воды из центральной части сосуда с помощью стеклянной трубки и проколориметрировать ее на ФЭКе (Ео). Записать показания в таблицу.
В сосудах 3 и 4 создать рабочие концентрации исследуемых веществ – фенол – 50 мг/л, СМС – 250 мг/л. Заново перемешав взвесь во
всех сосудах (нельзя дать взвеси осесть до начала опыта), опустить по
одному моллюску в сосуды 2, 3, 4. Первый сосуд оставить без моллюска
для определения небиологического оседания взвеси. Время экспозиции –
1 час. После часовой экспозиции определить Еt в каждом сосуде. По калибровочному графику установить Со и Сt.
17
E
100┤
95
90
85
80 ┤
75 ┤
70 ┤
65 ┤
└──┴──┴──┴──┴──┴──┴──┴──┴──┴──┴──┴──┴─────
─
50
100
150
200
250
300
мг/л
Рис. 4. Калибровочный график для определения концентрации мела
во взвеси: по оси абсцисс - концентрация мела в мг/л;
по оси ординат - оптическая плотность.
Рассчитать скорость фильтрации воды по формуле Виллиамсена:
F = V ( ln Co - ln Ct - 7l 0),
t
где F - объем воды, профильтрованной моллюсками в единицу времени (скорость фильтрации (мл/ч), V - объем воды в сосуде (1000 мл),
Co - начальная (в момент времени t1) концентрация взвеси (мг/л), Ct - конечная (в момент времени t2) концентрация взвеси (мг/л), t - продолжительность опыта в часах, ë - поправка на небиологическое оседание в сосуде № 1, равная разности логарифмов концентраций в моменты времени
t1 и t2 в сосуде без моллюска, деленная на время t
Оформить результаты по предлагаемому образцу:
№ сосуда
t
F
Показания ФЭК, перерасчет
λ
(мл/ч)
Ео
Co
Et
│Ct │lnC lnCt │ │час
мг/л
мг/л o│
1 небиологическое оседание
1ч
││2 контроль
│3 опыт
│4 опыт
└───────────┴───┴────┴───┴────┴────┴─────┴
────┴────┴──────────┘
18
Полученные результаты представить в виде гистограммы, где отразить зависимость изменения скорости фильтрации воды двустворчатыми
моллюсками от вида токсиканта. В ходе эксперимента отмечать изменения в двигательной активности моллюсков во всех сосудах.
Сделать выводы.
Тема 7. Реакция гидробионтов
на электрический ток как показатель
токсического воздействия
Контрольные вопросы
1. Электрическое раздражение и распространение возбуждения.
2. Законы возбуждения. Зависимость пороговой силы стимула от его
длительности. Понятия: порог раздражения, реобаза, полезное время,
хронаксия.
3. Хронаксиметрия.
4. Электрорецепторы.
5. Электронаркоз.
6. Электрические поля антропогенного происхождения.
7. Влияние электрических полей постоянного тока на водную среду и
ихтиофауну.
8. Влияние электрических полей переменного тока на водную среду и
ихтиофауну.
9. Влияние электрических полей импульсного тока на водную среду и
ихтиофауну.
Водная среда помимо других своих особенностей обладает еще одним важным свойством - электропроводностью. Это свойство обеспечивается концентрацией в воде свободных ионов, несущих электрические
заряды обоих знаков, что позволяет рассматривать естественную водную
среду как проводник второго рода. Поэтому трудно назвать какое-либо
физическое явление, которое не сопровождалось бы возникновением в
водной среде электрического поля.
По способности воспринимать и использовать в своей жизнедеятельности электрические поля водные животные разделяются на две группы.
У большинства рыб - неэлектрочувствительные виды - реакции на
электрическое поле появляются при градиентах потенциала более
19
1 мВ/см. Эти реакции носят, как правило, непроизвольный характер и не
связаны с наличием специфических электрорецепторов.
У электрочувствительных первичноводных позвоночных (пластиножаберных, ганоидных, сомообразных, многих костистых рыб, а
также круглоротых и некоторых амфибий) поведенческие реакции возникают при напряженностях электрического поля более 0,01 –
100 мкВ/см, что связано с наличием в составе органов боковой линии
специализированных электрорецепторных образований (ампулированные и бугорковые), чувствительных к действию электромагнитных колебаний.
Высокая электрическая чувствительность ампул Лоренцини позволяет хрящевым и некоторым другим рыбам воспринимать электрические
поля как биологического (поля, создаваемые пищевыми объектами,
хищниками, особями своего вида - низкочастотные (0 – 10 Гц) электросигналы), так и физического (поля, вызываемые течением воды в магнитном поле Земли, волнением рек и морей, циклонами, магнитными бурями и т.д., сопровождающиеся быстро распространяющимся на
расстояние до 500 – 1000 км электромагнитным излучением от 6 до 8 Гц)
происхождения.
Экспериментальные исследования показали, что электрорецепторы
являются типичными датчиками напряжения и воспринимают разность
потенциалов между порой или кожей и базальной поверхностью рецепторного эпителия. Приложенная к рецепторному эпителию разность потенциалов воздействует на электрорецепторные клетки и, изменяя поляризацию их мембран, приводит к сдвигам секреции медиатора.
Основным интегративным звеном электросенсорной информации у рыб
являются структуры среднего мозга.
В последние годы актуальной является проблема влияния электрических полей антропогенного происхождения на водные экосистемы. В отдельных случаях уровни напряженности в воде этих электрических полей достигают пороговых значений первичной реакции рыб (т.е. 10 –
100 мВ/см).
Электрические свойства тканей живого организма в электромагнитных полях существенно изменяются с изменением частоты последнего. В
целом, с ростом частоты диэлектрическая проницаемость тканей падает,
а проводимость растет. Реакция организма в электрическом поле зависит
от направления тока и ориентации животного в пространстве.
При действии сильных электрических полей у большинства водных
животных можно выделить несколько типичных стадий поведения: первичная пороговая реакция, возбуждение, анодная реакция и электрический наркоз (шоковая реакция). Примерно по такой же схеме, описанной
Н.Е. Введенским, оказывает свое действие возрастающий электрический
20
ток на любой нервно-мышечный препарат. Это свидетельствует, что поведенческие реакции животных на сильные электрические поля в конечном итоге основаны на деятельности элементарных нервно-мышечных
элементов.
При действии электрических полей антропогенного происхождения
на водную среду в последней, в локальной форме нарушается естественный электромагнитный фон, соотношение напряженности электрического и магнитного полей в воде (в данной среде оба эти поля тесно связаны). Указанные эффекты в свою очередь создают негативные
последствия для жизни водных организмов, в особенности рыб, которые
обладают значительной электрочувствительностью.
Лабораторная работа № 16
Реакция медицинской пиявки на электрический ток
как показатель токсического воздействия
Кроме поведенческих реакций, для оценки токсичности среды очень
показательными являются реакции гидробионтов на воздействие электрического тока.
Для работы необходимо: УЭИ-1, миллиамперметр, экспериментальная камера, пипетки на 1 – 5 мл, стеклянные сосуды емкостью 200 мл с
крышками, секундомер, растворы токсикантов: фенола (1%-ный), ФОС
(1%-ный), медного купороса (1%-ный); отстоянная вода, пинцет, медицинские пиявки - 7 экз.
Задание: Пронаблюдать за поведением медицинской пиявки в растворах различных веществ. Выявить различия в симптомах отравления
животных. Установить порог электронаркоза и время электронаркоза у
пиявки в контроле (интактное животное) и при воздействии токсических
веществ.
Методика исследования
За 20 минут до начала опыта рассадить по 1-му экземпляру пиявок в
сосуды, наполовину заполненные отстоянной водопроводной водой.
Удостовериться, что все особи находятся в естественном состоянии покоя (статичном). Затем воду из сосудов с подопытными и контрольными
животными слить. Контрольных пиявок вновь залить чистой отстоянной
водой, а подопытных - рабочими растворами токсикантов (фенол
(100 мг/л и 50 мг/л), ФОС (500 мг/л и 150 мг/л), медный купорос (10 мг/л
и 1 мг/л).
21
В результате такой процедуры из-за механического воздействия все
пиявки сначала приходят в состояние движения. Через 3 – 5 минут производят первую визуальную регистрацию наличия или отсутствия у каждой особи статичного состояния. У подопытных пиявок оно наступает
гораздо позднее или совсем не наступает. В дальнейшем проявляются
характерные признаки отравления. В отдельных случаях растворы могут
оказаться настолько токсичными, что пиявки покидают его и выползают
на крышку, где могут принять статичную позу. Такую реакцию следует
рассматривать как динамичную.
Для оценки токсичности растворов исследуемых веществ по реакции
пиявок на электрический ток необходимо собрать установку, как показано на рис. 5.
2
1
3
│ ├───────┤ ├──┘ │ ││
Рис. 5. Схема установки для изучения реакции гидробионтов на электрический ток при интоксикации: 1 - источник постоянного тока УЭИ-1;
2 - измерительный прибор (миллиамперметр); 3 - экспериментальная камера с электродами.
Включить УЭИ-1, прогреть 15 минут. В экспериментальную камеру,
заполненную водой, поместить медицинскую пиявку (сначала контрольную). Плавно поворачивая ручку "ТОК ПАЦИЕНТА", расположенную
на передней панели УЭИ-1, добиться конвульсивных движений тела животного (первичная реакция на ток). По шкале миллиамперметра определить величину тока, который вызывает данную реакцию. Увеличивая силу тока, добиться полного обездвиживания животного (порог
электронаркоза). Зафиксировать показания тока на миллиамперметре.
Выключить ток. Отметить время (животное может находиться в электронаркозе около 30 секунд) и определить продолжительность восстановления подвижности (время электронаркоза). Таким же образом определить
порог и время электронаркоза у подопытных животных. Повторить опыт
после одночасовой выдержки животных в растворах токсикантов, сравнить с аналогичными показателями у контрольной особи после часовой
экспозиции в чистой воде.
Оформить протокол. Сделать выводы.
22
Лабораторная работа № 17
Реакция парамеций на электрический ток
как показатель токсического воздействия
Метод гальванотаксической реакции парамеций основан на способности подвижных микроорганизмов перемещаться в направлении одного
из полюсов электрического тока после замыкания цепи, где и концентрируются через некоторое время. В отсутствие поля электрического тока движение микроорганизмов носит хаотический характер, и они распределены в жидкости произвольно.
Для работы необходимо: бинокулярный микроскоп МБС-9, источник питания УЭИ-1, камера для изучения гальванотаксиса, глазные пипетки, капилляр для отбора инфузорий, пипетка на 5 мл, культура парамеций (равноресничная инфузория Paramecium caudatum), растворы
медного купороса (CuSO4•5H2O - 0,1 мг/л) и ФОС (0,1 мг/л).
Задание: Определить порог гальванотаксиса у парамеций после воздействия растворов медного купороса и ФОС.
Методика исследования
Установка для изучения гальванотаксиса парамеций состоит из источника питания УЭИ-1, миллиамперметра и камеры с электродами для
парамеций (схему установки см. в работе № 16).
Включить УЭИ-1, прогреть 15 минут. На столик микроскопа поместить камеру с природной водой, заведомо нетоксичной, и парамециями
(10 клеток). Оптический контроль за клетками производить при 8 - 24кратном увеличении. Клетки парамеции имеют размеры порядка
200х40 мкм и покрыты продольными рядами мелких ресничек, благодаря
которым парамеции плавают со скоростью до 2,5 мм/с. Для снижения
скорости передвижения клеток и удобства наблюдения в камеру ввести
тонкий слой ваты. Поворачивая ручку "ТОК ПАЦИЕНТА", довести ток
до такой величины, при которой наступает заметное изменение в поведении инфузорий, т.е. появляется направленное движение. Определить
порог гальванотаксиса, который измеряется по направленному движению 3 – 5 инфузорий к одному из полюсов. Величину подведенного к
камере постоянного тока измерить с помощью миллиамперметра, подключенного к УЭИ-1.
Заменить контрольный раствор в камере на раствор токсиканта и повторно произвести измерения.
Оформить протокол опыта. Сделать выводы.
23
Лабораторная работа № 18
Реобаза и хронаксия как показатели
токсического воздействия
Величины реобазы и хронаксии являются количественными показателями функционального состояния возбудимых систем.
Минимальная сила тока (или напряжение), способная вызвать возбуждение, названа Лапиком (1909) реобазой. Наименьшее время, в течение
которого должен действовать раздражающий стимул, называют полезным временем.
Определение полезного времени практически трудно, так как величина реобазы непрерывно претерпевает небольшие колебания, отражающие
колебания функционального состояния мембраны в покое. По этой причине Лапик предложил измерять другую, условную, величину, названную им хронаксией.
Хронаксией называют наименьшее время, в течение которого электрический ток, равный удвоенной реобазе, должен действовать на ткань,
чтобы вызвать возбуждение. Полезное время и хронаксия характеризуют
скорость возникновения возбуждения при действии раздражителя.
Эти показатели широко используются в физиологии, общей токсикологии, клинической практике. Путем измерения хронаксии мышцы можно установить наличие повреждения волокон двигательного нерва. Порог раздражения и хронаксия нервных волокон ниже, чем мышечных.
Поэтому при раздражении мышцы возбуждение прежде возникает в терминалях нервных волокон и от них уже передается мышечным волокнам.
Из этого следует, что при функциональном повреждении нервных волокон или синапсов фактически изменяется и время возбуждения с нерва
на мышцу, т.е. изменяется хронаксия, и тогда приложенный к мышце
стимул выявляет хронаксию мышечных волокон, которая имеет большую продолжительность.
В водной токсикологии использование реобазы и хронаксии как показателей токсического воздействия было предложено студенткой
Е.Э. Ходжаевой и доцентом В.М. Волковым (кафедра физиологии человека и животных Ярославского государственного университета им.
П.Г. Демидова, 1987).
Для работы необходимо: Емкости с отстоянной водой на 1 л 4 шт,
сачок для отлова рыбы, здоровая рыба, рыба, затравленная химическими
веществами в течение 24 часов (СuSO4•5Н2О - 0,8 мг/л, ZnSO4 - 8,0 мг/л,
фенол – 30 мг/л), аквариум с электродами, стимулятор ЭСЛ-2.
24
Задание: Определить реобазу и хронаксию контрольной (интактной)
и опытных (затравленных растворами химических веществ) рыб по реакции на электрическое раздражение.
Методика исследования
Для проведения эксперимента здоровую (интактную) рыбу поместить
в аквариум, на стенках которого укреплены пластиночные свинцовые
электроды, соединенные с выходом стимулятора ЭСЛ-2. Установить
стимулятор на генерацию одиночных импульсов от выносной кнопки
(пусковой режим). Ручкой и позиционным переключателем выставить
длительность стимула 50 – 100 мс, амплитуду (напряжение) импульса на 0 V. Постепенно увеличивая амплитуду импульса (пользуясь ручкой и
позиционным переключателем напряжения), кнопкой подавать одиночные импульсы на электроды аквариума, наблюдая за поведением рыбы.
Раздражения следует подавать с интервалом не менее 5 секунд. При достижении пороговой величины тока (реобазы) в ответ на одиночные импульсы появятся слабые вздрагивания лучей плавников рыбы. Дальнейшее повышение напряжения вызывает ответную реакцию и в других
органах или повышенную двигательную активность животного. При появлении пороговых реакций следует отметить амплитуду тока в вольтах.
Это и будет реобаза.
Для определения хронаксии увеличить амплитуду раздражающего
тока в два раза, а длительность импульса уменьшить до нуля. Затем, подавая выносной кнопкой отдельные импульсы (напряжением в две реобазы), постепенно увеличивать длительность стимула. При появлении
пороговой реакции животного на раздражение стимулом в две реобазы,
отмечают по шкале прибора длительность этого стимула - хронаксию.
Повторить опыт на рыбе, выдержанной в течение 24 часов в растворах сульфата меди (0,8 мг/л), сульфата цинка (8,0 мг/л) и фенола
(30,0 мг/л), сопоставить с показателями здоровой рыбы.
Оформить протокол. Сделать выводы.
25
Тема 8. Влияние токсических веществ
на вегетативные функции гидробионтов
Контрольные вопросы
1. Строение меланоцитов. Виды пигментных клеток чешуи рыб.
2. Особенности регуляции меланоцитов и других пигментных клеток
разных видов рыб.
3. Влияние химических веществ - компонентов промстоков - на окраску рыб.
4. Реснички, их виды. Значение ресничек для различных животных.
5. Ультраструктура ресничек. Характеристики их движений.
6. Механизм движения ресничек. Энергия движения.
7. Влияние различных факторов среды на движение ресничек.
Лабораторная работа № 19
Влияние химических веществ
на меланоциты чешуи рыб
Приспособительные изменения окраски кожи головоногих моллюсков, ракообразных, рыб, амфибий и рептилий достигаются путем передвижения залегающих в коже зернышек пигмента цитоплазмой пигментных клеток (хроматофор). Различают следующие хроматофоры:
меланофоры (содержат пигментные зерна черного цвета), эритрофоры
(красного цвета), ксантофоры (желтого цвета) и гуанофоры, или иридоциты (не имеют пигментных зерен, содержат вещество кристаллической
структуры - гуанин, благодаря которому рыба приобретает металлический блеск и серебритсую окраску). Из хроматофоров только меланофоры имеют нервные окончания.
Форма хроматофоров отличается значительным разнообразием, однако наиболее распространена звездчатая и дисковидная или близкая к ним
(например, ветвистая). В отношении химической стойкости черный пигмент (меланин) является самым стойким.
Функция пигментных клеток в основном сводится к расширению, занятию наибольшего пространства (экспансия), и к сокращению, занятию
наименьшего пространства (контракция). Пигментные зерна находятся в
плазме. Когда сокращается плазма, уменьшаясь в объеме, пигментные
26
зерна в плазме концентрируются. Благодаря этому большая часть поверхности клетки освобождается от данного пигмента и в результате этого уменьшается яркость цвета.
При экспансии плазма клетки растекается по большей поверхности, а
вместе с ней распределятся по большей поверхности и пигментные зерна. Как правило, меланофоры хорошо видны в состоянии экспансии, когда пигмент растекается по всем отросткам клетки, четко обрисовывая ее
форму. И наоборот, плохо или даже совсем не видна форма клетки, когда
плазма находится в состоянии контракции и пигментные зерна сильно
скучились в центральной области клетки.
Чем же вызывается экспансия и контракция пигментных клеток?
Причиной этого могут быть как внутренние факторы (физиологическое состояние клетки, организма), так и некоторые факторы внешней
среды. Внутренние факторы действуют наиболее постоянно и длительно
и связаны с самыми важными биологическими и физиологическими состояниями организма.
Меланофоры имеют двойную иннервацию (симпатическую и парасимпатическую) (Giersberg, 1930, 1932). Такие вещества, как эрготамин и
никотин, тормозят симпатический нерв, а адреналин возбуждает. При
возбуждении парасимпатического нерва пилокарпином, xoлином, физостигмином наступает экспансия меланофоров.
В отличие от меланофоров ксантофоры и эритрофоры не имеют иннервации. Следовательно, нервная система может оказать непосредственное влияние только на меланофоры. Наряду с нервной регуляцией в
организме существует гормональная, последней подчинены как эритрофоры и ксантофоры, так и меланофоры. Например, гормон надпочечника – адреналин - вызывает контракцию пигментных клеток в концентрации 1•10-9. Его антагонист питуитрин вызывает экспансию. Ряд веществ
могут заменить как адреналин (аскорбиновая кислота, пирокатехин, тимол и др.), так и питуитрин (алкалоиды: никотин, пилокарпин, атропин,
ацетилхолин, физостигмин и др.; кислоты жирного ряда: лауриновая,
пальмитиновая и др.).
Кроме внутренних факторов на функцию пигментных клеток оказывают влияние и факторы внешней среды, которые также способствуют
изменению окраски рыбы. Появление темных или светлых тонов, яркая
или бледная окраска - все это может произойти в течение короткого срока - от нескольких секунд до несколькиих часов. Экспансия или контракция хроматофоров сменяются при воздействии различных факторов на
пигментную клетку или непосредственно, или через нервную систему.
Различные токсиканты, попадающие в водоем, могут вызвать расширение или сужение пигментных пятен в клетках. Например, при отравлении солями натрия тело рыбы окрашивается в темный цвет. При отрав-
27
лении солями калия отмечается светлое окрашивание кожи. Сужение
пигментных пятен в клетках вызывают соли кальция, бария и др., расширение пигментных пятен - щавелевокислые и лимоннокислые соли натрия, NH4OH и др.
В результате отравления рыб фенолами окраска тела часто бывает
светлая, но при этом голова и спинка темные.
Для работы необходимо: карп или карась, физиологический раствор
для рыб, предметное стекло с лункой, покровное стекло, микроскоп, окуляр - микрометр, пастеровские пипетки, резиновая груша d=30 мм,
фильтровальная бумага, пинцет, растворы адреналина (1:100 000), ацетилхолина (1:500 000), ФОС (250 мг/л) и фенола (50 мг/л).
Задание: Изучить воздействие гормональных препаратов и токсических веществ на меланофоры чешуи карася (карпа). Объяснить, каким
образом токсические вещества, попадающие в водоем, могут изменять
окраску рыб и какое значение это имеет для диагностики отравления
гидробионтов.
Методика исследования
У карася взять из спинной части тела чешуйку. Поместить ее в капельку физиологического раствора для рыб на предметное стекло в лунку. Закрыть чешуйку покровным стеклом. Под микроскопом рассмотреть
пигментные пятна. С помощью окуляр-микрометра измерить диаметр
основного пигментного пятна (тела) и длину одного из отростков. Сделать 2 – 3 повторных измерения через каждые 5 минут. Зарисовать меланоциты, учитывая пропорции тела и отростков пигментной клетки.
Затем пастеровской пипеткой набрать раствор адреналина в разведении 1:100000 и, не сдвигая чешуйку с места, заменить физраствор на раствор адреналина следующим образом: нанести каплю раствора исследуемого вещества на границу покровного стекла, а с противоположной
стороны стекла приложить фильтровальную бумагу и убрать излишки
физраствора. Наблюдая за изменениями формы меланофора, произвести
повторные измерения размеров тела и отростков. После этого промыть
чешуйку физиологическим раствором до возвращения пигментных клеток в исходное состояние. Повторить эксперимент с другими веществами: ацетилхолином, ФОС и фенолом.
Составить таблицу изменения диаметра пигментного пятна при воздействии исследуемых веществ. Проанализировать результаты. Оформить протокол опыта. Сделать выводы.
Цена деления окуляр-микрометра х 15 - 0,023 мм.
28
Лабораторная работа № 20
Влияние токсических веществ на движение ресничек
мерцательного эпителия пищевода лягушки
Клетками мерцательного эпителия выстлана поверхность дыхательных, пищеварительных и половых путей разных животных. Движение
ресничек мерцательного эпителия обеспечивает перемещение жидкости
и твердых частиц в соответствующем направлении. Гребное движение
осуществляется распрямленной ресничкой, а возвратное согнутой, чем и
достигается одностороннее перемещение среды относительно закрепленной клетки. Ресничные движения - достаточно сложный процесс,
сходный с механизмом мышечных сокращений, и осуществляется специальными сократительными белками с АТФазной активностью. Кроме источника энергии, АТФ здесь, как и в мышце, играет роль пластификатора, так как в отсутствие АТФ реснички застывают в одном положении.
Существенную роль в движениях ресничек играют ионы Mg2+ и Ca2+.
При росте концентрации Са2+ в среде происходит остановка движения
ресничек.
Важной чертой работы мерцательных эпителиев является согласованность, координированность движения ресничек в пласте клеток - метахрональные волны, что делает гребные движения ресничек высокоэффективными. Механизм этой координации сложен и недостаточно
изучен. По-видимому, он основывается на клеточных взаимодействиях.
Также на мерцательную активность влияют нейромедиаторы (ацетилхолин, адреналин и т.д.). Их действие осуществляется через изменение
кальциевой проницаемости клеток эпителия.
Для работы необходимо: препаровальная дощечка, булавки, препаровальный набор, нитки, кусочки древесного угля, секундомер, линейка,
фильтровальная бумага, раствор Рингера, растворы фенола (50 мг/л) и
ФОС (250 мг/л).
Задание: Изучить влияние растворов фенола и ФОС на мерцательную активность ресничек эпителия пищевода лягушки.
Методика исследования
Лягушку обездвижить разрушением головного и спинного мозга и закрепить на препаровальной дощечке спинкой вниз. Ввести тупую браншу ножниц в полость рта и рассечь по средней линии через все слои тканей нижнюю челюсть и пищевод до входа в желудок. Расправить и
слегка растянуть пищевод, края разреза зафиксировать на дощечке бу-
29
лавками. Смочить поверхность пищевода раствором Рингера (контроль).
Регистрацию движения ресничек производить визуально. Для этого нитками наметить верхнюю (у нижней границы глазного яблока) и нижнюю
(у входа в желудок) границы отрезка пищевода длиной 10 мм и поместить у верхней границы крупинку древесного угля. Следить за движением угля по мерцательному эпителию и отметить по секундомеру время, в
течение которого будет достигнута нижняя граница. Зная пройденное
расстояние, рассчитать линейную скорость передвижения частиц мерцательным эпителием пищевода.
Повторить измерение скорости движения уголька после смачивания
поверхности пищевода раствором ФОС, а затем раствором фенола, отмыв перед этим поверхность эпителия от ФОС раствором Рингера. Излишки жидкости осторожно (не касаясь слизистого эпителия) удалять
фильтровальной бумагой. Сравнить полученные данные с контрольными.
Оформить протокол опыта. Сделать выводы.
Тема 9. Действие токсических веществ на синаптическую передачу
Контрольные вопросы
1. Медиаторы химических синапсов у различных видов животных.
2. Механизм передачи возбуждения в химическом синапсе.
3. Химические вещества, нарушающие передачу в нервно-мышечном
синапсе. Конкурентные и деполяризующие блокаторы.
4. Особенности передачи возбуждения в синапсах автономной нервной системы.
5. Блокаторы холино- и адренорецепторов автономной нервной системы.
30
Лабораторная работа № 21
Влияние химических веществ на передачу
возбуждения в нервно-мышечном синапсе
Вещества, которые вызывают снижение тонуса поперечно-полосатых
мышц вплоть до их полного паралича, называют миорелаксантами. В
зависимости от дозы таких веществ можно наблюдать различные степени эффекта - от незначительного понижения двигательной активности до
полного расслабления всех мышц и остановки дыхания.
Исходя из локализации действия миорелаксантов, их принято подразделять на 2 группы:
1. Миорелаксанты периферического действия, или курареподобные
средства (d-тубокурарин-хлорид, диплацин, декаметоний, дитилин и др.).
2. Миорелаксанты центрального действия, или мианезиноподобные
средства (мианезин, мепробамат, зоксазоламин и др.).
Курареподобные средства характеризуются тем, что они блокируют
нервно-мышечную передачу, в то время как мианезиноподобные препараты снижают мышечный тонус вследствие нарушения проведения в
центральной нервной системе. На нервно-мышечные синапсы центральные миорелаксанты в терапевтических дозах не действуют.
Кураре представляет собой смесь сгущенных экстрактов из южноамериканских растений видов Strychnos и Chondodendron; с давних пор
применяется местным населением в качестве яда для стрел. Ранение отравленной стрелой вызывает обездвиживание животного или смерть в
результате асфиксии, обусловленной прекращением сокращений дыхательной мускулатуры.
Клод Бернар в середине 19 столетия установил, что обездвиживание
животных ядами кураре происходит в результате прекращения передачи
возбуждения с двигательных нервов на мышцы. В настоящее время это
действие кураре рассматривают как результат блокирования нхолинорецепторов скелетных мышц. Это лишает рецепторы возможности взаимодействовать с ацетилхолином (медиатором нервного возбуждения), образующимся в окончании двигательных нервов.
В 1935 г. было установлено, что основное действующее вещество яда
кураре - d-тубокурарин. В качестве мышечных релаксантов применяют
также синтетические соединения, алкалоиды и их производные. Большинство курареподобных средств относятся к четвертичным аммониевым соединениям и делятся по механизму действия на две основные
группы:
31
А. Недеполяризующие (антидеполяризующие, конкурентные) миорелаксанты (d-тубокурарин, диплацин, квалидил и др.), являющиеся антагонистами ацетилхолина; они парализуют нервно-мышечную передачу
вследствие блокады ими (вместо ацетилхолина) холинорецепторов в синапсе и исключают деполяризацию концевой пластинки и возбуждение
мышечного волокна.
Б. Деполяризующие миорелаксанты (дитилин - синоним листенон) вызывают мышечное расслабление, оказывая холиномиметическое действие (подобное ацетилхолину), сопровождающееся стойкой деполяризацией, т.е. действуют подобно избыточному количеству ацетилхолина,
что также нарушает проведение возбуждения с нерва на мышцу.
Для работы необходимо: лягушка, стеклянный колпак, препаровальный набор, вата, шприц, раствор Рингера, раствор диплацина (или квалидила, дитилина), стимулятор ЭСЛ-2, электроды, лигатура.
Задание: Убедиться, что миорелаксанты периферического действия
расслабляют скелетную мускулатуру путем нарушения проведения возбуждения именно в нервно-мышечных синапсах. Объяснить механизм их
действия.
Методика исследования
Лягушку обездвижить пеленанием в марлевую салфетку. При этом
одна задняя конечность должна оставаться свободной. Произвести разрез
кожи на дорзальной поверхности бедра, стеклянным крючком выделить
седалищный нерв. Под нерв подвести толстую шелковую лигатуру. С
помощью этой лигатуры туго перетянуть все мягкие ткани бедра (за исключением седалищного нерва - нерв не должен быть поврежден). Таким
образом с помощью этой лигатуры исключается кровообращение в конечности (необходимо следить, чтобы на нерв не попала слизь). Произвести раздражение седалищного нерва электрическим током (напряжение или амплитуда 5 В, длительность стимула 1 мс). Убедиться в
наличии сокращения мышц конечности. Обернуть обнаженные мышцы и
нерв ватой, смоченной раствором Рингера, для предотвращения пересыхания тканей.
Лягушку освободить от марлевой салфетки, с помощью шприца в
подкожный лимфатический мешок брюшка ввести 0,3 мл раствора листенона (диплацина или квалидила) и поместить животное под стеклянный колпак или воронку. После наступления полного обездвиживания
(10 – 15 мин) отпрепарировать седалищный нерв на другой конечности и
произвести повторные раздражения одного и другого седалищных нервов.
По результатам наблюдений сделать выводы.
32
Лабораторная работа № 22
Влияние химических веществ
на передачу возбуждения в синапсах
автономной нервной системы
Большинство органов, иннервированных вегетативной нервной системой, подчинено обоим ее отделам - симпатическому и парасимпатическому. На многие органы симпатический и парасимпатический отделы
оказывают противоположное влияние, т.е. являются функциональными
антагонистами. При возбуждении симпатической нервной системы (или
при раздражении симпатического нерва, или при введении адреналина)
усиливается и учащается сердечная деятельность, при возбуждении парасимпатической системы (или при раздражении блуждающего нерва
(вагуса), или при введении ацетилхолина), наоборот, тормозится работа
сердца.
АТРОПИН - алкалоид. Антихолинергическое (холинолитическое, холиноблокирующее) средство, блокирующее преимущественно периферические холинореактивные системы - антагонист холинорецепторов.
Способность атропина связываться с холинорецепторами объясняется
наличием в его структуре фрагмента, роднящего его с молекулой эндогенного лиганда - ацетилхолина. Блокируя М-холинорецепторы, он делает их нечувствительными к ацетилхолину, образующемуся в области
окончаний постганглионарных парасимпатических (холинергических)
нервов. Эффекты действия атропина противоположны поэтому эффектам, наблюдающимся при возбуждении парасимпатических нервов. Введение атропина в организм сопровождается учащением сердечных сокращений (вследствие уменьшения тормозящего действия на сердце
блуждающего нерва).
Атропин является эффективным антидотом при отравлениях холиномиметическими и антихолинэстеразными веществами, в том числе ФОС.
Для работы необходимо: лягушка, препаровальный набор, стимулятор с электродами, фотопреобразователь с блоком питания, самописец H338, шприц, ампула с раствором атропина, маленькая пробирка.
Задание: Экспериментальным путем подтвердить исчезновение эффекта раздражения парасимпатического нерва под влиянием атропина.
Методика исследования
У лягушки разрушить центральную нервную систему, широко
вскрыть грудобрюшную полость, ввести в пищевод пробирку и произве-
33
сти препаровку вагосимпатического нерва (см. метод. руководство для
студентов 3 курса).
Наладить графическую регистрацию сокращений сердца. Не прерывая регистрации, произвести кратковременное раздражение (амплитуда 5 В, длительность - 5 мс, частота раздражения - 40 Гц) периферического
отрезка блуждающего нерва. При получении четкого ответа продолжать
регистрацию в течение 3 - 5 минут, затем остановить самописец и ввести
лягушке в лимфатический мешок 0,3 мл раствора атропина сульфата. Через 10 минут, в течение которых необходимо периодически орошать
сердце раствором Рингера, повторить запись сердечных сокращений при
раздражении блуждающего нерва электрическим током. Проанализировать и объяснить полученные результаты. Отрезки диаграммной ленты с
записью кардиограммы вклеить в протокол опыта. Сделать выводы.
Тема 10. Токсикологические исследования
на зеленых одноклеточных водорослях
Контрольные вопросы
1. Виды зеленых водорослей, наиболее часто используемых в токсикологических исследованиях. Их систематика.
2. Основные показатели (тест-показатели), по которым устанавливается токсичность веществ для водорослей.
3. Альгициды и их применение в народном хозяйстве. Основные
группы альгицидов.
Лабораторная работа № 23
Влияние химических веществ на численность
клеток зеленых протококковых водорослей
При изучении токсичности сточных вод и их отдельных компонентов
чувствительными показателями оказываются ответные реакции живых
систем, вызванные изменением условий окружающей среды.
Использование зеленых водорослей в токсикологических экспериментах в качестве тест-объекта становится необходимым, поскольку им
принадлежит ведущая роль в синтезе органического вещества в водоемах, а также в процессах формирования качества природных вод, направление которых может заметно меняться в присутствии загрязняющих веществ. Зеленые протококковые водоросли достаточно
34
чувствительны к присутствию в воде нефтепродуктов, тяжелых металлов, хлор и фосфорорганических пестицидов, ПАВ.
Основным критерием токсичности при действии химических веществ
на водоросли считается изменение численности водорослевых клеток на
25% и более.
Водорослевые клетки характеризуются постоянством морфофизиологических признаков, что облегчает учет дегенерированных форм, возникающих под влиянием некоторых токсикантов. Характерными цитологическими изменениями являются уменьшение размеров водорослей или,
напротив, появление в культуре "гигантских" клеток, многоклеточных
конгломератов, в частности, при внесении в среду некоторых соединений
тяжелых металлов.
Для работы необходимо: контрольная культура Scenedesmus
quadricauda в фазе логарифмического роста (8 – 10 дней), культура водорослей после 3-суточной экспозиции в растворах медного купороса (альгицида) (0,01 мг/л), азотнокислого свинца (0,01 мг/л) и фенола
(0,01 мг/л), микроскоп (окуляр 15, объектив 8), камера Горяева, покровные стекла, глазная пипетка с оттянутым кончиком.
Задание: Произвести подсчет клеток водорослей в контрольной культуре и после 3-суточной экспозиции в растворах медного купороса, азотнокислого свинца и фенола. Отметить наличие дегенерированных форм
водорослевых клеток.
Методика исследования
Притереть покровное стекло к боковым площадкам камеры Горяева
так, чтобы появились кольца Ньютона. Тщательно взболтать культуру
водорослей в колбе.
С помощью пипеток заполнить двумя исследуемыми культурами (например - контрольная культура и затравленная медным купоросом) соответственно верхнюю и нижнюю части камеры Горяева. Для этой цели
навесную каплю поднести к краю покровного стекла, в силу капиллярности жидкость заполнит камеру (после заполнения камеру нельзя наклонять). Поместить камеру на столик микроскопа. Подсчитать количество
клеток в 25-ти больших квадратах сетки, при этом можно считать в любых квадратах: разделенных на малые, разделенных вертикальными или
горизонтальными линиями и не разделенных вообще.
Подсчитать клетки в разных частях камеры, затем, произвести перерасчет на 1 см3 по формуле:
x = m 5. 0 10 54 0,
35
где x - общее количество клеток в 1 см3,
m - количество клеток (сумма ) в 25-ти больших квадратах.
Повторить эксперимент с культурами, затравленными азотнокислым
свинцом и фенолом. Количество клеток выразить в млн. на 1 мл (млн/мл)
или в млрд. на 1 литр (млрд/л). Проанализировать полученные данные,
отметить наличие в культурах дегенерированных форм водорослевых
клеток.
Оформить протокол. Сделать выводы.
Лабораторная работа № 24
Определение соотношения живых и мертвых клеток
водорослей после воздействия на культуру
токсических веществ
Метод люминесцентной микроскопии (Горюнова, 1956) основан на
способности некоторых соединений, входящих в состав живых организмов, светиться при облучении их ультрафиолетовыми или короткими сине-фиолетовыми лучами. Свет люминесценции имеет большую длину
волны, чем возбуждающий. В силу этого при освещении объекта невидимыми ультрафиолетовыми или короткими сине-фиолетовыми лучами
получают более длинноволновое свечение объекта, обнаруживаемое глазом, т.е. видимое свечение.
Естественными люминесцирующими веществами растительной клетки являются хлорофилл, порфирин, фикоэритрин, а также клетчатка,
пектин, хитин. Диффузное распределение пигмента, специфичное для
клеток водорослей, вызывает свечение самих клеток.
Пигментный состав, а значит, и спектральные характеристики одноклеточных водорослей в большой степени зависят от условий обитания.
Клетки в различных стадиях жизненного цикла имеют разнообразную
гамму световых переходов, в основном по следующим фазам: яркокрасные, тускло-бордовые или розово-красные, оранжево-розовые, голубовато-зеленые, оливково-зеленые.
Яркое пурпурно-красное свечение характерно для хлорофиллсодержащих высокожизнеспособных клеток: клетки находятся в активном состоянии, интенсивно делятся или готовятся к делению (логарифмическая
фаза роста).
Красное свечение меньшей яркости характерно для клеток в стационарной фазе роста. Тускло-красным цветом светятся старые клетки с ослабленной жизненной активностью. Оранжево-красный оттенок свече-
36
ния имеют отмирающие клетки, угнетенные влиянием какого-либо фактора, а бледно-оранжевое свечение имеют клетки с очень низким уровнем жизненной активности, но еще живые.
Голубовато-зеленое и оливково-зеленое свечение характерно для
мертвых клеток. В стадии интенсивного роста мертвые клетки в культуре
отсутствуют, что может быть связано с их быстрым лизисом.
Ранжируя клетки по свечению, можно установить время воздействия
токсиканта на водоросли, степень и скорость отмирания, поскольку лизис клеток происходит с определенной скоростью для каждого вида водорослей и в значительной мере зависит от влияния различных веществ,
попадающих в воду. Степень токсического влияния на водоросли зависит от времени взаимодействия водорослей с токсикантом и от накопления последнего клетками.
Процент соотношения живых и мертвых клеток можно также определить на окрашенных препаратах при обычном микроскопировании. Для
Scenedesmus quadricauda обычно используют метиленовую синь и нейтральный красный.
Для работы необходимо: культура Scenedesmus quadricauda в фазе
логарифмического роста (через 5 – 10 суток после посева, начальная
плотность культуры должна быть в пределах от 1,5 до 2,01 млн.кл. в
1 мл) (контроль), культура, предварительно обработанная альгицидом
(медный купорос - 0,01 мг/л) (4-суточная экспозиция), световой микроскоп, предметные и покровные стекла, 0,1% раствор нейтрального красного в воде и метиленового синего в фосфатном буфере.
Задание: Исследовать при световом микроскопировании влияние
раствора медного купороса на состояние культуры водорослей по количеству живых и мертвых клеток. Сравнить с количеством живых и мертвых клеток в контрольной культуре.
Методика исследования
Для определения взять 1 мл суспензии водорослей (для микроскопии
приготовить суспензию таким образом, чтобы на предметном стекле
численность клеток не превышала 30 – 50 экз. в поле зрения; более плотные пробы необходимо перед просмотром разбавить), к которой добавить 1 мл метиленового синего на фосфатном буфере и 1 мл нейтрального красного в разведении 1:5000. Растворы красителей и суспензии
водорослей тщательно перемешать и микроскопировать через 20 минут.
Для этого на предметное стекло нанести каплю суспензии водорослей и
накрыть покровным стеклом. При одновременной окраске метиленовая
37
синь окрашивает мертвые клетки в синий цвет, у живых клеток происходит витальное окрашивание нейтральным красным в розовый цвет. Определение живых и мертвых клеток также можно производить по характерным морфологическим изменениям, возникающим под влиянием
загрязняющих веществ. К числу признаков мертвой клетки относятся:
альбинизация, лизис, появление уродливых форм и т.д.
Подсчитать число живых и мертвых клеток в нескольких (не менее
10) полях зрения. Соотношение живых и мертвых клеток выразить в
процентах от общей численности клеток или в млн на мл.
Снижение численности живых клеток водорослей более чем на 25%
указывает на проявляющийся токсический эффект исследуемого вещества. Если в процессе микроскопирования обнаруживаются характерные
морфологические изменения клеток водорослей, то их желательно зарисовать.
Оформить протокол. Сделать выводы.
38
Содержание
Тема 5. ХЕМОРЕЦЕПЦИЯ ВЕЩЕСТВ ГИДРОБИОНТАМИ.............................. 3
Лабораторная работа № 11 Избегание рыбами некоторых токсических
веществ ..................................................................................................... 4
Лабораторная работа № 12 Хеморецепция неорганических веществ
рыбами (по кардиореспираторной реакции рыб) ................................... 7
Лабораторная работа № 13 Хеморецепция веществ кожей лягушки (по
изменению частоты дыхания) ............................................................... 11
Тема 6. ВЛИЯНИЕ ТОКСИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ
НА ПОВЕДЕНЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ ГИДРОБИОНТОВ ........................ 12
Лабораторная работа № 14 Влияние токсических веществ на поведение
медицинской пиявки .............................................................................. 13
Лабораторная работа № 15 Влияние химических веществ
на фильтрацию воды пресноводными двустворчатыми
моллюсками............................................................................................ 15
ТЕМА 7. РЕАКЦИЯ ГИДРОБИОНТОВ НА ЭЛЕКТРИЧЕСКИЙ ТОК
КАК ПОКАЗАТЕЛЬ ТОКСИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ ..................... 18
Лабораторная работа № 16 Реакция медицинской пиявки
на электрический ток как показатель токсического воздействия ....... 20
Лабораторная работа № 17 Реакция парамеций на электрический ток
как показатель токсического воздействия ............................................ 22
Лабораторная работа № 18 Реобаза и хронаксия как показатели
токсического воздействия...................................................................... 23
Тема 8. ВЛИЯНИЕ ТОКСИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ НА ВЕГЕТАТИВНЫЕ
ФУНКЦИИ ГИДРОБИОНТОВ ................................................................. 25
Лабораторная работа № 19 Влияние химических веществ
на меланоциты чешуи рыб..................................................................... 25
Лабораторная работа № 20 Влияние токсических веществ на движение
ресничек мерцательного эпителия пищевода
лягушки................................................................................................... 28
Тема 9. ДЕЙСТВИЕ ТОКСИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ
НА СИНАПТИЧЕСКУЮ ПЕРЕДАЧУ ..................................................... 29
Лабораторная работа № 21 Влияние химических веществ на передачу
возбуждения в нервно-мышечном синапсе .......................................... 30
Лаб
39
ораторная работа № 22 Влияние химических веществ на передачу
возбуждения в синапсах
автономной нервной системы ............................................................... 32
Тема 10. ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ НА ЗЕЛЕНЫХ
ОДНОКЛЕТОЧНЫХ ВОДОРОСЛЯХ ...................................................... 33
Лабораторная работа № 23 Влияние химических веществ на
численность клеток зеленых протококковых водорослей ................... 33
Лабораторная работа № 24 Определение соотношения живых и
мертвых клеток водорослей после воздействия на культуру
токсических веществ.............................................................................. 35
Составитель Рябухина Елена Валерьевна
Токсикология гидробионтов
(водная токсикология)
Часть 2
Редактор, корректор А.А. Аладьева
Компьютерная верстка С.И. Савинской
Подписано в печать 13.06.2002 г. Формат 60х84/16.
Бумага тип. Усл. печ. л. 2,32. Уч.-изд. л. 2,0.
Тираж 100 экз. Заказ .
Оригинал-макет подготовлен
в редакционно-издательском отделе ЯрГУ.
Ярославский государственный университет.
150000 Ярославль, ул. Советская, 14.