ЗНАЧЕНИЕ ИНДИКАЦИИ ДНК ПАРВОВИРУСА В19 В
advertisement
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ «КИРОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕМАТОЛОГИИ И ПЕРЕЛИВАНИЯ КРОВИ ФЕДЕРАЛЬНОГО МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО АГЕНТСТВА» На правах рукописи Попцов Александр Леонидович ЗНАЧЕНИЕ ИНДИКАЦИИ ДНК ПАРВОВИРУСА В19 В ОБЕСПЕЧЕНИИ ИНФЕКЦИОННОЙ БЕЗОПАСНОСТИ ПЛАЗМЫ ДЛЯ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ 14.01.21 – Гематология и переливание крови ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель кандидат медицинских наук И.В. Парамонов Киров - 2015 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ...................................................................................................................... 4 ГЛАВА 1 ОБЕСПЕЧЕНИЕ ИНФЕКЦИОННОЙ БЕЗОПАСНОСТИ ПЛАЗМЫ ДЛЯ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ В ОТНОШЕНИИ ПАРВОВИРУСА В19 НА СОВРЕМЕННОМ ЭТАПЕ (обзор литературы) ......................................................... 10 1.1 Современное представление о возбудителе ..................................................... 10 1.2. Эпидемиологическое значение возбудителя для службы крови ................... 16 1.3. Инфекционная безопасность плазмы для фракционирования ....................... 19 1.4. Методы диагностики B19V ................................................................................ 23 1.4.1. Методы выявления возбудителя..................................................................... 23 1.4.2. Методы выявления генома возбудителя........................................................ 23 1.4.3. Методы выявления антител и антигена возбудителя ................................... 24 1.4.4. Методы диагностики, используемые в службе крови .................................. 26 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ...................................................................... 29 2.1. Исследуемый материал....................................................................................... 29 2.2. Молекулярно-биологический метод ................................................................. 29 2.3. Верификация методики выявления и количественного определения ДНК B19V в образцах плазмы для фракционирования................................................... 30 2.4. Выявление антител к В19V ................................................................................ 33 2.5. Статистическая обработка результатов ............................................................ 33 ГЛАВА 3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНФЕКЦИОННОЙ ЗНАЧИМОСТИ ДНК В19V ..... 34 3.1. Верификация методики выявления и количественного определения ДНК В19V методом ПЦР в плазме для фракционирования с помощью тест-системы cobas TaqScreen DPX Test .......................................................................................... 34 3.2. Выявление ДНК В19V у доноров плазмы для фракционирования ............... 39 3.3. Определение процента образцов плазмы для фракционирования с высокой концентрацией ДНК B19V ........................................................................................ 43 3.3.1.Связь высокой вирусной нагрузки в плазме для фракционирования с выработкой антител к B19V ...................................................................................... 44 3.3.2.Связь выявления высокой вирусной нагрузки B19V в плазме для фракционирования с возрастом, полом доноров, регионом их проживания, а также фактором сезонности ...................................................................................... 45 3 ГЛАВА 4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ТЕСТИРОВАНИЯ ПЛАЗМЫ ДЛЯ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ НА НАЛИЧИЕ ДНК В19V .................................... 50 4.1. Оценка риска контаминации производственных пулов.................................. 50 4.2. Клинико-экономическое обоснование внедрения в практику тестирования плазмы для фракционирования на наличие ДНК В19V ........................................ 53 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ............................................................................................................. 61 ВЫВОДЫ ....................................................................................................................... 68 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ....................................................................... 70 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ........................................................................................... 71 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ............................................................................................. 72 Приложение 1 ................................................................................................................ 87 4 ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования В настоящее время при совершенствовании оказания специализированной медицинской помощи лечебно-профилактическими учреждениями Российской Федерации наблюдается повышенная потребность в препаратах крови, которая усугубляется низкими объемами отечественного производства, дороговизной импортных препаратов, а также недостатком качественного и безопасного сырья для их производства - плазмы для фракционирования [20, 22, 23]. В стране достигнуты значительные успехи в обеспечении безопасности плазмы для фракционирования гемотрансмиссивных заболеваний в отношении (вирусов основных гепатитов В возбудителей и С, вируса иммунодефицита человека 1 и 2 типа, возбудителя сифилиса): проводится эпидемический мониторинг, разработан и законодательно утвержден алгоритм лабораторного обследования доноров и донорской крови (плазмы) на маркеры данных инфекций [17]. Вместе с тем, в отношении ряда вирусов, передающихся гемотрансмиссивным путем и представляющих угрозу в плане контаминации сырья для производства препаратов крови, задача не решена. Так, на современном этапе развития службы крови представляет научный интерес определение эпидемиологической значимости парвовируса В19 (B19V) при донорстве плазмы для фракционирования на территории Российской Федерации. Актуальность изучения обусловлена биологическими свойствами возбудителя. Основными клетками-мишенями B19V являются эритробласты. В зависимости от состояния организма человека B19V способен вызывать различные по тяжести заболевания, начиная от инфекционной эритемы у детей и заканчивая тяжелыми формами апластической анемии, фульминантным гепатитом у лиц с иммунодефицитами [1, 6, 25]. Отмечается повсеместная распространенность вируса, а также высокая восприимчивость всех возрастных групп к данному возбудителю. Так, установлено, что к 70-летнему возрасту до 60- 5 70 % населения имеют антитела к B19V [113] и, следовательно, перенесли парвовирусную инфекцию. Для возбудителя характерен гемотрансмиссивный путь передачи инфекции. При этом наиболее значимым фактором передачи являются препараты крови, в особенности препараты плазменных факторов свертывания крови VIII и IX. Показано, что 56 – 100 % партий препаратов фактора VIII, произведенных в Европе и США в период с 1993 по 1998 гг., были контаминированы ДНК B19V [61]. Это обусловлено высокой устойчивостью возбудителя к процедурам вирусинактивации. Кроме того, при острой фазе инфицирования, которая в 25 % случаев протекает бессимптомно, B19V может присутствовать в крови в очень высокой концентрации – до 1013 МЕ (международных единиц)/мл [6, 113, 130]. Таким образом, в процессе производства препаратов крови будет достаточно одного контейнера с плазмой для фракционирования, содержащей ДНК B19V в такой высокой концентрации, чтобы контаминировать весь производственный пул, который может включать до нескольких тысяч контейнеров с плазмой. Поэтому практический интерес представляет определение процента выявления плазмы для фракционирования с высокой вирусной нагрузкой B19V - ведущего фактора контаминации сырья для производства препаратов крови [34, 39]. Основной группой риска при реализации гемотрансмиссивного пути передачи парвовирусной инфекции являются пациенты гематологических стационаров как основные получатели препаратов. Уровень распространенности B19V по данным ГНЦ, в этой группе составляет 3,2 %, при этом основная доля инфицирования приходится на больных с острыми лейкозами [31]. В настоящее время в Европе и США на законодательном уровне принято положение об обязательном тестировании плазмы для фракционирования на наличие ДНК B19V методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), как профилактическая мера, направленная на снижение риска контаминации препаратов крови данным возбудителем. При этом концентрация ДНК B19V в производственном пуле не должна превышать 104 МЕ/мл [59, 89, 103]. 6 Предъявляются требования и к выбору тест-систем. Они должны в обязательном порядке определять все три генотипа возбудителя [35]. Степень разработанности темы Многоцентровые исследования, проведенные в США, Германии и ряде других стран мира, показали, что частота выявления ДНК B19V в популяции доноров составляет 0,55 – 1,9 % [26, 31, 47, 67, 69, 72, 80, 111, 117]. При этом процент выявления образцов плазмы для фракционирования с высоким уровнем виремии B19V среди общего числа исследованных находится на уровне 0,0010,006 [73, 74, 110]. Вопрос выявления возбудителя в Российской Федерации практически не изучен [26, 31]. На сегодняшний день полностью отсутствуют данные по частоте выявления ДНК B19V среди доноров плазмы для фракционирования, неизвестен процент обнаружения ДНК B19V клинически значимого уровня в образцах плазмы для фракционирования. Вместе с тем, создание отечественных современных предприятий по производству препаратов крови [15] определяет злободневность установления данных показателей и вызывает практический интерес к разработке и обоснованию алгоритма рутинного исследования на наличие ДНК B19V больших объемов донорской плазмы, направляемой на фракционирование. Цель исследования Установить значимость тестирования плазмы для фракционирования на наличие и количественное определение ДНК B19V для повышения инфекционной безопасности сырья, используемого в производстве препаратов крови. Задачи исследования 1. Определить частоту выявления ДНК B19V среди доноров плазмы для фракционирования. 2. Определить процент образцов c высокой концентрацией ДНК B19V (106 МЕ/мл и более) среди общего числа исследованных образцов плазмы для фракционирования. 7 3. Оценить взаимосвязь выявления высокой вирусной нагрузки B19V у доноров плазмы для фракционирования с полом, возрастом, местом проживания, а также фактором сезонности. 4. Разработать алгоритм исследования плазмы для фракционирования на наличие ДНК B19V и определить его экономическую эффективность. Новизна исследования Впервые в Российской Федерации определена частота выявления ДНК B19V среди доноров плазмы для фракционирования и установлен процент образцов c высокой концентрацией ДНК B19V (106 МЕ/мл и более) среди общего числа исследованных образцов плазмы для фракционирования, как ведущего фактора возможной контаминации производственных пулов при выпуске препаратов крови. Проведена оценка выявляемости высокой вирусной нагрузки B19V у доноров плазмы для фракционирования с полом, возрастом, местом проживания, а также фактором сезонности. Впервые определен риск возможной контаминации производственных пулов плазмой для фракционирования с высокой концентрацией ДНК B19V. Теоретическое и практическое значение исследования Предложена контаминации математическая модель производственных пулов расчета риска образцами возможной плазмы для фракционирования с высокой вирусной нагрузкой B19V. Разработан алгоритм исследования плазмы для фракционирования на наличие и количественное определение ДНК B19V с помощью тест-системы cobas TaqScreen DPX Test в пулах из 96 образцов. Определены критерий выбраковки и тактика в отношении доноров плазмы для фракционирования. Показана лабораторно-экономическая эффективность алгоритма в исследовании больших объемов плазмы для фракционирования. Личный вклад автора Автор принимал непосредственное участие в проведении исследований по изучению эпидемиологической значимости B19V при заготовке плазмы для 8 фракционирования. Автором лично проведена статистическая обработка и анализ полученных данных. При непосредственном участии автора разработан и внедрен в практику алгоритм исследования плазмы для фракционирования на наличие ДНК B19V с помощью тест-системы cobas TaqScreen DPX Test в пулах из 96 образцов. Методология и методы исследования В работе использованы общенаучные методы: анализ (проспективный и ретроспективный), синтез (сравнительно-сопоставительный), частно-научные методы (лабораторные методы исследования), методы вариационной статистики. Основные положения, выносимые на защиту 1. Выявляемость высокой концентрации ДНК B19V (106 МЕ/мл и более) в плазме для фракционирования, заготовленной от российских доноров, составляет 0,003 %, что представляет угрозу контаминации от 0,8 до 25 % производственных пулов. 2. Тестирование плазмы для фракционирования на наличие ДНК В19V в пулах из 96 образцов тест-системой cobas TaqScreen DPX Test с целью отбора проб с высокой концентрацией ДНК возбудителя исключает риск критической контаминации производственных пулов (концентрация ДНК В19V более 104 МЕ/мл). Внедрение в практику Разработанный алгоритм тестирования плазмы для фракционирования внедрен в практику работы лаборатории контроля качества (ЛКК) ФГБУ РМНПЦ «Росплазма» ФМБА России, а также включен в пусковой регламент на производство субстанции «Плазма для фракционирования» ПУР 13691313-01-12 (согласован в установленном порядке ФГУ «ГИКиМП» 18.02.2013; утвержден и введен в действие генеральным директором ФГБУ РМНПЦ «Росплазма» ФМБА России 19.02.2013). Апробация работы Материалы работы были доложены: 9 − на VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика 2014», Москва, 2014; − на международным III Всероссийской участием научно-практической «Инфекции и инфекционная конференции с безопасность в гематологии и службе крови», С-Петербург, 2014. Публикации По теме диссертационной работы опубликовано 7 печатных работ, из них 5 в журналах, включенных в перечень ВАК РФ. Объем и структура работы Диссертация изложена на 87 страницах машинописного текста на русском языке, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы, содержащего 131 литературный источник, из них 31 отечественный и 100 иностранных. Работа содержит 7 рисунков и 18 таблиц. Работа выполнена на базе ЛКК ФГБУ РМНПЦ «Росплазма» ФМБА России (генеральный директор – С.В. Тхай) при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований в рамках научного проекта № 14-04-31292 «Исследование факторов биобезопасности препаратов крови». 10 ГЛАВА 1 ОБЕСПЕЧЕНИЕ ИНФЕКЦИОННОЙ БЕЗОПАСНОСТИ ПЛАЗМЫ ДЛЯ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ В ОТНОШЕНИИ ПАРВОВИРУСА В19 НА СОВРЕМЕННОМ ЭТАПЕ (обзор литературы) 1.1 Современное представление о возбудителе B19V был открыт австралийским вирусологом Ивонн Кассарт в Лондоне в 1975 году при изучении сывороток «здоровых» доноров, которые при проведении исследований на поверхностный антиген вируса гепатита (HBsAg) проявляли необычную гемаглютинационную активность [51]. Вирус относится к семейству Parvoviridae, подсемейству Parvovirinae, роду Erythrovirus [121]. B19V является безоболочечным вирусом икосаэдрической симметрии. Размер вирусной частицы составляет 18 – 26 нм в диаметре (рисунок 1) [62, 113, 130]. Рисунок 1 - Вирусные частицы B19V в образце сыворотки крови [113]. Вирион состоит из 60 копий капсидного белка и включает одноцепочечную молекулу ДНК положительной или отрицательной полярности [130]. Отсутствие липидной оболочки делает вирус устойчивым во внешней среде. Он хорошо выдерживает замораживание, нагревание до 60 °С в течение одного часа [12]. Геном B19V имеет длину 5596 п.н. и состоит из кодирующей последовательности (4830 п.н.), ограниченной справа и слева терминальными последовательностями по 383 п.н. каждая [100]. Долгое время считалось, что геном B19V консервативен в плане возможной изменчивости. Но проведенный филогенетический анализ 11 изолятов B19V позволил установить уникальную область генома вируса - NS1VP1u, состоящую из 858 п.н., и дал основание к выделению трех генотипов вируса [131]. У генотипа 3 возбудителя выделяют два подтипа. В настоящее время генотип 1 представлен штаммом pvbaua [115], генотип 2 – штаммами LaLi [64] и A6 [98], генотип 3а – штаммом V9 [97] и генотип 3b – штаммом D91.1 [112]. Капсид B19V представлен двумя структурными белками, VP1 и VP2, которые кодируются 3’- концевой половиной генома [12, 62, 113, 130]. Основным структурным белком является VP2, на долю которого приходится до 95 – 96 % от всего белка капсида [100]. Данный белок имеет молекулярную массу 58 кДа и кодируется последовательностью с 3125 по 4786 п.н. генома B19V [113, 130]. На другой структурный белок, VP1, приходятся остальные 4 – 5 % капсида. Он отличается от VP2 большей молекулярной массой (84 кДа) и удлиненной на 227 аминокислот рамкой считывания, которая располагается с 2444 по 4786 п.н. В настоящее время выделено несколько неструктурных белков. Основной неструктурный белок, NS1, имеет молекулярную массу 77 кДа и кодируется последовательностью от 435 до 2448 п.н. генома B19V [130, 131]. Предполагается, что NS1 способен связывать ДНК с однонитевыми разрывами, обладает АТФподобной, транскрипционной и хеликазной активностью, а также выраженной цитотоксичностью [113]. Белок NS1 содержит нуклеоизидтрифосфат - связывающий домен, который необходим для различных биологических функций вируса. Мутации в этом домене вызывают потерю цитотоксической активности вируса. Кроме белка NS1, выделены и другие неструктурные белки: два белка с молекулярной массой 11 кДа и один - 7,5 кДа [113, 131]. О биологической функции данных протеинов в настоящее время пока ничего неизвестно. Однако установлено, что ген белка с молекулярной массой 11 кДа необходим для репликации B19V в культуре клеток [131]. B19V в процессе своего жизненного цикла проходит ряд последовательных этапов: связывание вируса с рецептором клетки хозяина, проникновение вируса в клетку хозяина посредством эндоцитоза, транслокацию ДНК вируса в ядро клетки хозяина, репликацию ДНК, транскрипцию ДНК, трансляцию белков, сборку 12 капсида и упаковку генома вируса, высвобождение зрелых вирионов, сопровождаемое лизисом клеток хозяина (рисунок 2). Рисунок 2 - Схема жизненного цикла B19V [62]: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Уже Связывание вируса с рецептором клетки Проникновение в клетку (эндоцитоз) Декапсидация вируса и транслокация ДНК вируса в ядро клетки Репликация ДНК вируса Транскрипция ДНК вируса Трансляция вирусных белков Сборка и накопление вирионов Высвобождение зрелых вирионов из клетки хозяина, сопровождаемое ее лизисом. при открытии вируса была выявлена его агглютинационная способность в отношении эритроцитов человека [51]. Позднее был обнаружен в крови специфический гемагглютинин отвечающий за связь с B19V. моноклональных антител в антиген группы Р (глобозид) [41], Избыток Р-антигена либо наличие анти-Ркультуре клеток может защитить клетки- предшественники эритропоэза от заражения B19V [41]. Кроме того, лица, у которых генетически отсутствует P-антиген (1 из 200 тыс. человек), устойчивы к заражению B19V [44]. Р-антиген экспрессируется в клетках–предшественниках эритропоэза, что соответствует наблюдаемому тропизму вируса [113]. Цитопатический эффект, вызываемый B19V при инфицировании клетокпредшественников эритропоэза, как в естественных условиях, так и в условиях 13 эксперимента, проявляется в образовании гигантских пронормобластов (рисунок 3) [130]. Рисунок 3 - Гигантские пронормобласты [62]. B19V распространен по всему миру. В большинстве выделенных проб обнаруживается вирус генотипа 1 [37]. Генотип 2 выявляется спорадически в Европе, США и Южной Америке [81, 109, 119]. Изучение биоптатов кожи показало, что генотип 2 был широко распространен в Финляндии до 40 годов XX века. Около 40 % позитивных проб на ДНК B19V содержат вирус генотипа 2. Тем не менее, этот генотип в биоптатах от молодых пациентов (1975 года рождения и младше) обнаруживается крайне редко [99]. Генотип 3 в основном выявляется в Северной и Западной Африке [47], а также во Франции [130]. На территории Российской Федерации обнаруживается В19V генотипа 1 [27]. По данным проведенных исследований показано, что выявляемость антител с возрастом нарастает: IgG обнаруживаются у 2 - 20 % детей в возрасте от 1 до 5 лет, у 15 – 60 % детей и подростков в возрасте от 6 до 19 лет, у 30 – 60 % взрослого населения и у более, чем 85 % людей пожилого возраста [1, 6, 12, 53, 106, 113, 130]. Для возбудителя характерна сезонность инфицирования. В регионе с умеренным климатом (Европа) заражение B19V в основном приходится на конец зимы – весну. Эпидемические вспышки возникают с определенной цикличностью, каждые 3 – 4 года [12, 113, 130]. 14 B19V может передаваться воздушно-капельным, трансфузионным и трансплацентарным путем [1, 6, 12, 130]. Описаны случаи внутрибольничной передачи инфекции [77, 88]. Кроме того, возможно заражение сотрудников лабораторий, работающих с нативным вирусом [116]. Сведения о развитии инфекционного процесса и иммунном ответе организма были получены при изучении случаев, как экспериментального заражения добровольцев, так и естественного инфицирования B19V (рисунок 4). Рисунок 4 - Течение инфекции, вызванной B19V [62]. В течение первых 7 дней после инфицирования идет активная репликация вируса в клетках-мишенях с последующим выходом вирионов в кровь. При этом ДНК B19V обнаруживается в высокой концентрации (до 1013 МЕ/мл). С развитием гуморального ответа содержание вируса в крови быстро падает до концентрации менее 106 геном-эквивалента/мл. Возбудитель может обнаруживаться и в последующие месяцы (в среднем до 12 месяцев). При обследовании доноров в Японии низкая концентрация ДНК B19V наблюдалась до 3 лет после заражения [86]. Через неделю после интраназального введения B19V 15 здоровым взрослым добровольцам возбудитель начинает обнаруживаться в крови и отделяемом слизистой носоглотки. Клинически начинает появляться следующая симптоматика: ощущение дискомфорта, миалгия, кожный зуд, повышение температуры тела. Лабораторно через 10 - 12 дней после инфицирования в крови появляются специфические иммуноглобулины класса М (IgM), на этот же период приходится пик вирусной нагрузки. IgM обычно сохраняется в крови до трех месяцев, но иногда может обнаруживаться в образцах сыворотки крови в течение длительного времени [50]. В отдельных случаях, в исследуемых образцах обнаруживаются специфические иммуноглобулины класса А (IgA). Вероятно, они участвуют в естественной защите против воздушно-капельной инфекции [54]. Специфические иммуноглобулины класса G (IgG) начинают появляться примерно через две недели после инфицирования и, предположительно, сохраняются на протяжении жизни, защищая от повторных заражений иммунокомпетентных лиц [49]. При виремии количество ретикулоцитов падает до неопределяемого уровня и восстанавливается спустя 7-10 дней. Это приводит к временному снижению уровня эритроцитов и гемоглобина в крови. Клинически незначительная лимфопения (пониженное содержание лимфоцитов в крови), нейтропения (уменьшенное содержание нейтрофильных гранулоцитов в крови) и тромбоцитопения (пониженное содержание тромбоцитов в крови) возникают 610 дней спустя после инфицирования. Все гематологические показатели могут демонстрировать кратковременные отклонения, предшествующие стабилизации на преинкубационном уровне. Наблюдаемая иногда нейтропения, по-видимому, не имеет клинического значения [130]. У здоровых, инфицированных B19V людей, преобладает гуморальный иммунный ответ [62]. Ранний иммунный ответ, представленный антителами IgM, направлен против VP2 вируса, тогда как для зрелого иммунного ответа характерно повышенное сродство антител IgG к VP1 в качестве основной цели, несмотря на его меньшую представленность на поверхности вириона [54]. Клеточный иммунитет против B19V обусловлен классическим Th1 ответом на 16 вирус, опосредованным СD4+ клетками, узнающими вирусные эпитопы в комплексе с антигенами гистосовместимости класса II [60]. В зависимости от состояния иммунной системы человека B19V вызывает различные по тяжести заболевания. Бессимптомная форма наблюдается в 25% случаев инфицирования взрослых и до 50 % случаев - детей [114, 120]. При заражении здоровых людей самыми частыми нозологическими формами парвовирусной инфекции являются инфекционная эритема у детей [6, 12, 62, 130] и артропатии у взрослых [62, 130]. Заражение B19V беременных может привести, особенно в первом и втором триместрах, к водянке плода, спонтанным абортам или внутриутробной гибели плода [2, 13]. При имеющейся сопутствующей патологии вирус, в значительной мере, утяжеляет состояние больных. B19V может стать причиной хронической анемии у пациентов с ослабленным иммунитетом, не способных вырабатывать нейтрализующие антитела [130]. У больных гемолитической анемией, инфицированных возбудителем, приводит к развитию транзиторного апластического криза [6, 56]. Также имеются данные, указывающие на то, что B19V может приводить к фульминантному гепатиту у лиц с иммунодефицитами [1, 32]. Редкими формами парвовирусной инфекции являются васкулит, гломерулонефрит и миокардит [62]. 1.2. Эпидемиологическое значение возбудителя для службы крови Распространенность B19V в популяции доноров соответствует уровню распространенности возбудителя в популяции населения в целом. Распространенность вируса по странам Европы несколько различается. В скандинавских странах (преимущественно в Финляндии) распространенность B19V выше, чем в других европейских странах [92]. Уровень обнаружения вируса генотипов 2 и 3 в популяции доноров в настоящее время представляется весьма низким. При исследовании образцов, взятых с 2005 по 2007 год, генотип 2 был обнаружен только в одной из 232 исследованных единиц плазмы с высокой концентрацией ДНК B19V [76]. Распространенность генотипа 3 в настоящее время в европейской популяции также невелика. 17 Учитывая, что частота выявления антител к B19V в популяции 18 – 30-летних доноров составляет около 60 %, то всегда имеется риск возможного забора крови или ее компонентов у первично инфицированных лиц. На основании документированной доли инфицирования женщин B19V, можно оценить, что до 0,5 – 1 % доноров в год будут вновь инфицированы данным возбудителем [43, 123]. В настоящее время для учреждений службы крови и производителей плазмы для фракционирования в эпидемиологическом плане более важным является наблюдение за показателем выявления ДНК B19V в популяциях доноров. Объясняется это особенностями инфицирования вирусом (см. более подробно п.1.1 настоящей главы). Частота выявления ДНК B19V среди доноров крови разных стран варьирует в пределах от 0,55 до 1,90 % (таблица 1). Таблица 1 - Частота выявления ДНК B19V среди доноров крови в разных странах № Страна Число обследованных доноров Из них, имеющих ДНК B19V Абс. % Ссылка Год публикации 1 Великобритания 1000 9 0,90 [47] 2004 2 Гана 1000 13 1,30 [47] 2004 3 ЮАР 360 2 0,55 [47] 2004 4 США 5020 44 0,90 [72] 2007 5 Россия 1000 10 1,00 [26] 2010 6 Китай 3957 23 0,55 [69] 2011 7 Россия 1521 27 1,90 [31] 2012 Прямое сравнение результатов данных эпидемиологических исследований затруднительно, потому что чувствительность методов исследования различается. Кроме того, на конечный результат могут повлиять сезонные и локальные вспышки парвовирусной инфекции. 18 Принимая во внимание частоту выявления ДНК B19V среди доноров [26, 31, 47, 67, 69, 72, 80, 111, 117], а также уровень еще неинфицированных лиц в популяции населения, заражение через компоненты или препараты крови встречается относительно часто [37, 65]. Однако сообщения о данных случаях публикуются крайне редко. Вероятно, что заражение B19V через продукты крови почти никогда не обнаруживается, так как сопровождается неспецифическими клиническими симптомами по типу гриппоподобной инфекции. Анемия, или тромбоцитопения, или лейкопения, так или иначе, исчезают после переливания продуктов крови. Косвенным подтверждением инфицирования B19V является то, что встречаемость антител к возбудителю выше среди пациентов, получавших факторы свертывания крови, чем в контрольной группе [101]. Аналогичные данные были получены и при сравнении групп, получавших и не получавших препараты крови: IgG к B19V выявлялись в 1,7 раза чаще в группе получавших препараты крови [118]. Кроме того, следует учитывать уровень вирусной нагрузки в единице трансфузии (компоненте или препарате крови). В ретроспективном исследовании, проведенном в США [71], были определены 24 случая из 12529 протестированных донаций, когда компоненты крови, позитивные по ДНК B19V, переливались восприимчивым реципиентам. Все донации были с низкой вирусной нагрузкой (ДНК B19V < 106 МЕ/мл) и содержали вирус - специфичный IgG. Во всех случаях не было заражения (сероконверсии) реципиента. Аналогичные данные были получены в исследовании, проведенном в Германии [101]. Описана передача B19V посредством объединенной (пулированной) плазмы, обработанной сольвент/детергентом (SD – плазма) [42]. Хотя пулированная плазма содержит сравнительно постоянный уровень специфичных антител к B19V (около 40 МЕ/мл) [110], тем не менее, он не является достаточным, чтобы нейтрализовать полностью высокую вирусную нагрузку парвовируса. Показано, что высокая концентрация ДНК B19V (106 МЕ/мл и более), независимо от имеющегося уровня нейтрализующих антител (IgG- антитела к B19V) в плазме, делает процесс нейтрализации возбудителя, как 19 правило, не эффективным, а образующиеся иммунные комплексы нестабильными, что приводит к инфекционности таких доз плазмы [39]. В исследовании, проведенном в США, было показано, что передача парвовирусной инфекции посредством SD – плазмы возможна при концентрации ДНК B19V более 107 геном-эквивалента/мл. Концентрация в 103,5 геном-эквивалента/мл не приводила к передаче возбудителя [42]. В связи с этим FDA и Европейский директорат по качеству лекарственных средств (ЕДКЛС) установили предельную концентрацию ДНК B19V в отношении производственных пулов плазмы для фракционирования на уровне не более чем 104 МЕ/мл [59, 89]. Таким образом, определение уровня выявления высокой вирусной нагрузки B19V в продуктах крови, в частности, в плазме для фракционирования, имеет практический интерес для производственной трансфузиологии. В недавно опубликованных работах зарубежных авторов [73, 74, 110] высокая концентрация ДНК B19V выявлена в образцах плазмы на уровне 0,001 – 0,006 % от всего числа исследованных. Аналогичный показатель в Российской Федерации до настоящего времени не определен. 1.3. Инфекционная безопасность плазмы для фракционирования Основным сырьем для производства препаратов крови является плазма для фракционирования. Она представляет собой жидкую часть крови, отделенную от форменных элементов центрифугированием или методом афереза в присутствии антикоагулянта, полученную от здоровых доноров и предназначенную для объединения в производственный пул [29, 90]. Важным критерием качества плазмы для фракционирования является ее безопасность. В настоящее время выделяют несколько уровней инфекционной безопасности [55, 57, 58, 104, 128]. В каждой стране должна быть разработана национальная политика и стратегия обеспечения качества гемотрансфузий, а также созданы законодательные структуры, регулирующие процессы заготовки, тестирования, переработки, хранения и транспортировки плазмы, полученной от доноров, в том числе, в отношении плазмы для фракционирования [127]. 20 В качестве одной из мер для обеспечения инфекционной безопасности препаратов крови при их производстве широко применяется инактивация вирусов. Этот технологический прием может быть введен в процесс производства на разных его этапах, а в ряде случаев, даже после разлива и укупорки готовых лекарственных форм [45, 85, 104]. Cовременный технологический процесс производства препаратов крови из плазмы для фракционирования должен включать, как минимум, одну эффективную стадию инактивации безоболочечных вирусов. В соответствии с рекомендациями ВОЗ и Европейского агентства по оценке медицинских продуктов, стадия считается эффективной, если она обеспечивает инактивацию вирусов в log10 4 и более раз [55, 126]. В настоящее время выделяют следующие методы вирусинактивации: прогревание плазмы (обработка сухим теплом), пастеризация, нанофильтрация, обработка методом «растворитель (сольвент)/детергент» (смесь трибутилфосфата с холатом натрия), обработка каприловой кислотой или каприлатом натрия, экспозиция при низком значении рН (от 4,0 до 4,25 для иммуноглобулинов, от 4,0 до 5,0 для других препаратов), обработка гидролитическими ферментами (пепсином, папаином) [7, 9, 28, 79, 126, 127]. Также в последнее время, кроме лицензированных методов, появились новые походы с применением рибофлавина, псоралена, фотосенсибилизирующих веществ, аминокислот. Но их применение в производстве препаратов крови сдерживается недостаточными данными о возможном негативном воздействии на качество и клиническую переносимость препаратов [8, 68]. Однако эффективность их применения в отношении профилактики парвовирусной инфекции при производстве препаратов крови недостаточна. В настоящее время задокументированы случаи передачи реципиентам B19V посредством переливания препаратов крови, которые были произведены с использованием технологии вирусинактивации (таблица 2). 21 Таблица 2 - Случаи инфицирования B19V, связанные с переливанием препаратов крови [34] Продукт Фактор IX Процедуры инактивации вирусов Пастеризация Пациент (пол, возраст в годах) Ж, 39 М, 11 М, 20 Фактор VIII Сольвентдетергент М, 11 Фактор VIII Пастеризация М, 33 Фактор VIII СольвентМ, 11 детергент или пастеризация Фактор IX Сольвентдетергент Ж, 31 Фактор VIII Сольвентдетергент Сухое тепло М, 7 Препарат FEIBA Автоклавирование М,1 Фактор VIII Сольвентдетергент М, 47 Фибриновый клей Ж, случая (35-42) Основное заболевание Симптоматика Гемофилия В Экзантема, артралгия (носительница) после инфузии Гемофилия В Экзантема, артралгия после инфузии Гемофилия В Экзантема, лихорадка после инфузии Гемофилия А Гипопластическая анемия Гемофилия А, Гепатомегалия нестероидная (увеличение печени), иммуносупрессия панцитопения, высокая лихорадка, экзантема Гемофилия А, Лихорадка, стероидная сомноленция, иммуносупрессия спутанность сознания, панцитопения, цитолиз в печени Гемофилия В Лихорадка, экзантема, (носительница) артралгия, лимфаденопатия Гемофилия А Апластический криз 3 Карцинома цервикального канала, карцинома придатка, миома Гемофилия А Гемофилия А Лихорадка, лейкопения, эритробластопения бессимптомно Лихорадка, артралгия Кроме того, не все методы вирусинактивации применимы для обработки производственных пулов. В частности, метод облучения видимым светом плазмы, обработанной метиленовым синим, эффективно снижает вирусную нагрузку до log10 5 и более МЕ/мл от первоначальной концентрации [7], но одобрен ВОЗ 22 только для использования в отношении обработки одной дозы плазмы [126]. Кроме того, данный метод невозможно использовать при производстве лабильных препаратов крови. Показано снижение в исходном сырье в среднем на 25 % биологической активности факторов свертывания при обработке метиленовым синим в концентрации 300 мкг/л и двустороннем облучении в режиме 50000 люкс в течение одного часа [7]. Доказана чувствительность B19V к пастеризации (10 часов при температуре 60 °С), сухому пару, экспозиции при рН 4 (метод используется при производстве иммуноглобулинов) и ограниченная эффективность в отношении вируса при использовании нанофильтрации [9, 79, 94, 126, 127]. Для парвовируса свиней (экспериментальная модель B19V) показана эффективность метода облучения ультрафиолетом плазмы, обработанной рибофлавином, что может свидетельствовать об эффективности данного метода в отношении возбудителя. Но в то же время облучение ультрафиолетом плазмы, обработанной псораленом, не оказывает влияние на исходную концентрацию парвовируса свиней в исследуемом материале [94]. Зафиксированные случаи передачи парвовирусной инфекции через плазму, обработанную сольвент/детергентом, показали эффективность данного метода в отношении B19V только в случае низкой концентрации возбудителя в исходном сырье [82]. Таким образом, в связи с биологическими свойствами вируса, возможности применения вирусинактивации при производстве препаратов крови имеют на практике незначительную эффективность в случае попадания в производственный пул дозы плазмы с высокой концентрацией ДНК B19V. При выпуске лабильных препаратов крови ситуция усугубляется технологическими особенностями, ограничивающими выбор методов виусинактивации в отношении возбудителя, поэтому значение приобретает диагностика B19V, как профилактическая мера, направленная на обеспечение производства препаратов крови. инфекционной безопасности сырья для 23 1.4. Методы диагностики B19V 1.4.1. Методы выявления возбудителя Данную группу методов можно условно разделить на две подгруппы. К первой относятся методы диагностики, направленные на выявление самого B19V. Сюда относятся электронная микроскопия и ее различные модификации [62, 130]. Данные методы имеют ряд недостатков. Во-первых, идентификация B19V затруднительна из-за малых размеров вирусных частиц. Во-вторых, данные методы имеют малую диагностическую чувствительность, т.к. могут выявлять только образцы с высоким уровнем виремии. В-третьих, эти методы совершенно неприменимы в службе крови. Ко второй подгруппе относится цитологический метод. Он основан на цитопатологическом действии вируса на эритроидные клетки организма хозяина с образованием гигантских пронормобластов [62]. Данный метод имеет вспомогательное значение в клинической практике. Обнаружение гигантских пронормобластов в пунктате костного мозга или мазке периферической крови хотя и указывает на наличие B19V, но не является единственным критерием для установки диагноза. Эти клетки часто отсутствуют у пациентов с хроническими инфекциями, в частности при наличии ВИЧ-инфекции. Кроме того, данный метод абсолютно неприменим для использования в службе крови. 1.4.2. Методы выявления генома возбудителя Различные молекулярно-биологические методы диагностики надежно выявляют ДНК B19V. Кроме того, создание количественных методов позволяет определить концентрацию генома вируса в исследуемом материале. К ним относятся прямая гибридизация, обычно в формате слот-блот или дот-блот, а также полимеразная цепная реакция (ПЦР), как правило, в режиме реального времени. Для метода прямой гибридизации используют полноразмерную или клонированную вирусную ДНК, меченую Р32, дигоксигенином или биотином [33, 91]. Предел обнаружения при использовании метода гибридизации составляет примерно 105 геном-эквивалентов/мл. Неоспоримым преимуществом данного 24 метода диагностики является возможность определения конкретного генотипа вируса. Более чувствительным молекулярно-биологическим методом диагностики является ПЦР, которая позволяет выявлять ДНК B19V в образцах крови и биоптатах тканей, хотя при этом существует вероятность ложноположительных реакций [39, 49, 74]. Создание международного стандарта Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) ДНК B19V позволило в значительной мере стандартизировать и унифицировать методику проведения исследования [36], а также официально утвердить соотношение единиц измерения, которые используются в разных лабораториях. Соотношение между международными единицами (МЕ) и геном-эквивалентом установлено от 1 : 0,6 до 1 : 0,8 [108]. Выявление в исследуемых образцах высокой концентрации ДНК B19V (более 106 МЕ/мл) указывает на острый инфекционный процесс. В то время как низкий уровень вирусной нагрузки (ДНК B19V менее 104 МЕ/мл) – на хроническую инфекцию или острую инфекцию в более поздней фазе развития. Однако было показано, что ДНК B19V может обнаруживаться в течение длительного времени в сыворотке крови, а в определенных тканях (коже, печени) может определяться пожизненно [48, 83, 84]. Таким образом, использование при диагностике парвовирусной инфекции только результатов молекулярно-биологических методов исследования не может свидетельствовать об остроте инфекционного процесса. 1.4.3. Методы выявления антител и антигена возбудителя Диагностика B19V у иммунокомпетентных лиц с инфекционной эритемой или артропатией осуществляется путем выявления специфических антител. В связи с неспособностью B19V эффективно воспроизводиться в культуральных системах, вирусные капсиды изначально были выделены из сывороток с высокой концентрацией вируса и использовались для тестов на антитела [34]. Антиген B19V может быть экспрессирован в бактериях, в клеточных линиях [34, 38], и синтезирован в виде коротких пептидов. Однако в настоящее время большинство 25 антигенов для промышленных целей производится на клеточных линиях насекомых с рекомбинантным бакуловирусом [78]. Тесты на IgM достоверно определяют текущую или недавнюю инфекцию у иммунокомпетентных лиц [12, 26, 130]. Таким образом, у более 85% пациентов с инфекционной эритемой или апластическим кризисом, вызванным B19V, в течение 2-3 месяцев после инфицирования определяются антитела класса IgM [84]. Тесты, основанные на непрямом методе обнаружения IgM, менее пригодны для диагностирования из-за низкой специфичности и чувствительности. IgG обычно появляются спустя 2 недели после инфицирования и сохраняются всю жизнь. Титры IgG как правило падают со временем [62, 130]. Важность выявления NS1-специфичного иммуноглобулина G постоянно обсуждается и оспаривается, поскольку этот иммуноглобулин, предположительно, связан с характером заболевания [122]. Сообщается, что NS1специфичный иммуноглобулин G чаще обнаруживается у пациентов с артритом или хронической инфекцией B19V [70, 122]. Большинство исследователей полагают, что независимо от характера заболевания, NS1-специфичный IgG проявляется поздно (>6 недель), и поэтому тест на антитела против NS1 может быть использован для того, чтобы исключить острую инфекцию у пациентов с неясной серологией [87, 122]. Вирусная частица B19V обладает гемагглютинирующей активностью [51]. В связи с этим был разработан тест, основанный на методе пассивной гемагглютинации, для выявления антигена [63, 107]. Использование данного метода ограничено только образцами с высоким уровнем виремии (примерно 108 – 109 геном-эквивалентов/мл). Также результат теста будет отрицателен, если в крови имеются антитела к B19V. Следовательно, гемагглютинационный тест подходит для обнаружения высоковиремичных образцов в фазе серологического окна. 26 1.4.4. Методы диагностики, используемые в службе крови Обследование доноров или компонентов крови, предназначенных для клинического применения, на наличие B19V в настоящее время не предписано нормативными документами. Плазма для фракционирования, предназначенная для производства объединенной вирус – инактивированной плазмы или анти-Dиммуноглобулина, должна быть протестированы на наличие ДНК B19V методом ПЦР, при этом концентрация ДНК в производственном пуле не должна быть выше 104 МЕ/мл [89]. Тестированием на обнаружение вирус-специфичных антител к парвовирусу (IgG) может быть охвачена доля иммунных доноров. Отвод доноров при обнаружении IgG от донации крайне нежелателен потому, что плазма таких доноров с высокой вероятностью не заразна и может быть использована в качестве сырья для производства иммуноглобулина. Теоретически можно использовать тест на выявление антител на этапе карантинизации для выявления образцов плазмы, содержащих возбудитель. На практике, однако, разрабатываются [25, 30, 75] и применяются [47, 67, 69, 73, 75, 80, 93] чаще тестсистемы для выявления ДНК B19V. В отдельных случаях, из-за крайне высокой концентрации ДНК B19V в отдельном образце плазмы, важны эффективные меры во избежание перекрестного загрязнения. В случае получения положительного результата для протестированного мини-пула, отдельный образец плазмы с высоким уровнем виремии B19V может быть определен посредством дальнейшего исследования. Внедрение стандарта ВОЗ для ДНК B19V в последние годы значительно улучшило сопоставимость NAT-результатов [36, 108]. Так как генотипы 2 и 3 были отнесены к B19V, и показали аналогичную патогенность [38], Европейский директорат по качеству лекарственных средств (ЕДКЛС) потребовал, чтобы эти редкие генотипы также определялись методом ПЦР [35, 36]. Гемагглютинационный тест был проверен в банках крови Японии и Германии [63, 107, 124]. Принципиально он подходит для определения образцов плазмы с высоким уровнем виремии B19V, его чувствительность ограничена 27 концентрацией возбудителя > 108 геном-эквивалента/мл. Даже небольшое количество антител ведет к подавлению гемагглютинации, поэтому образцы с антителами и/или концентрацией ДНК B19V менее 108 геном-эквивалента/мл не обнаруживаются.. Кроме того, была описана передача B19V через SD-плазму, содержащую ДНК возбудителя в концентрации 107 геном-эквивалента/мл [52]. Отсюда существует некая неоднозначность: определяет ли гемагглютинационный тест фактически все контаминированные образцы плазмы. В настоящее время в большинстве учреждений гемагглютинационному тесту. службы В крови последние годы предпочитают проводится ПЦР испытание улучшенного ИФА-теста для определения антигена вируса. Этот тест показывает меньшую интерференцию специфических антител к B19V, чувствительность также ограничена > 108 геном-эквивалента/мл. Антиген-тест должен обнаруживать все три генотипа [50]. Таким образом, только отдельные образцы плазмы, а не мини-пулы, могут быть проверены этим методом. Особая роль в обеспечении профилактики парвовирусной инфекции принадлежит тестированию плазмы, предназначенной для дальнейшего фракционирования и используемой в производстве препаратов крови (плазмы для фракционирования), на наличие ДНК B19V. Принимая во внимание, что отдельные образцы плазмы могут содержать ДНК B19V в концентрации до 1013 геном-эквивалента/мл, то контаминация такой плазмой производственного пула, обычно включающего от 1000 до 10000 донаций [19], приведет к вирусной нагрузке пула в 109 – 1010 геном-эквивалента/мл. Исследование пулов плазмы, у которых исходный материал не был протестирован на B19V, показало, что 60 % всех пулов плазмы содержали ДНК B19V и из них 35 % в высокой концентрации (106 – 108 геном-эквивалента/мл) [125]. Высокое вирусное загрязнение не удаляется обычными методами очистки белков, какие применяются для препаратов плазмы. Контаминация B19V была показана посредством выявления ДНК B19V в препаратах плазмы (факторы свертывания крови, иммуноглобулин, альбумин) [34, 84, 125]. Самый высокий уровень контаминации был определен в препаратах свертывания крови: 56-100 % 28 от проверенных партий препаратов содержали ДНК парвовируса с максимальными значениями до 107 геном-эквивалента/мл. Максимальный уровень контаминации иммуноглобулина (до 104 геном-эквивалента/мл) и альбумина (до 103 геном-эквивалента/мл) был ниже за счет дополнительных стадий очистки [34, 84]. В связи с этим тестирование исходного материала (плазмы для фракционирования) и конечных продуктов было введено многими производителями вначале на добровольной основе [103], а затем принято к исполнению в обязательном порядке регуляторными органами США [59] и Европы [89]. В настоящее время Российская Федерация относится к числу стран, где тестирование на ДНК B19V не осуществляется. Кроме того, работ посвященных изучению распространенности B19V как среди населения в целом, так и среди доноров в частности, крайне мало [26, 31]. Вместе с тем создание крупного современного производства препаратов крови [15] требует решения этой задачи. При этом используемая методика выявления и количественного определения ДНК В19V методом ПЦР должна в обязательном порядке пройти процедуру верификации в соответствии с требованиями нормативной документации [4, 18]. 29 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1. В качестве полученную Исследуемый материал исследуемого методом материала автоматического использовали плазмафереза. плазму Отбор крови, образцов осуществляли в одноразовые вакуумные пробирки (Sarstedt, Германия) в объеме 4 мл непосредственно в плазмоцентрах, сразу же после заготовки плазмы. Отобранные образцы замораживали и при температуре минус 18 °С доставляли в лабораторию. Перед проведением исследования образцы размораживали и центрифугировали при 2000 g в течение 10 минут. Объектом исследования стали 288128 образцов плазмы для фракционирования, заготовленной в период с января 2012 года по декабрь 2014 года от 27610 доноров ФГБУ РМНПЦ «Росплазма» ФМБА России, проживающих на территориях ряда субъектов Приволжского и Северо-Западного Федеральных округов Российской Федерации. 2.2. Молекулярно-биологический метод Исследование образцов проводили методом ПЦР в режиме реального времени с помощью коммерческого набора реагентов cobas TaqScreen DPX Test (далее по тексту – тест DPX) (Roche Diagnostics, США), предназначенного для выявления и количественного определения ДНК B19V и выявления РНК вируса гепатита А, согласно инструкции производителя [105]. Для проведения ПЦР в режиме реального времени использовали автоматизированный комплекс cobas s201 (Roche Diagnostics, Швейцария), включающий в себя раскапывающую станцию для формирования пулов Hamilton MICROLAB STAR IVD Pippetor, прибор для пробоподготовки и выделения нуклеиновых кислот cobas AmpliPrep и автоматический анализатор cobas TaqMan. Образцы тестировали в мини-пулах, состоящих из 96 образцов. Контроль качества проводился для каждой постановки. В качестве контрольного материала применяли набор контролей cobas TaqScreen DPX Control Kit (Roche Diagnostics, США), который включает в себя отрицательный контроль DPX (-)C, двойной 30 положительный контроль DPX D (+)C (положительный контроль на РНК вируса гепатита А, содержащий неинфекционную, синтетическую РНК и положительный контроль на ДНК B19V, содержащий неинфекционную синтетическую ДНК в диапазоне концентраций 1,21 х 102 – 1,21 х 103 МЕ/мл) и положительный контроль на B19V DPX H(+)C, содержащий неинфекционную, синтетическую ДНК в диапазоне концентраций 2,43 х 105 – 2,42 х 106 МЕ/мл. Автоматизированное формирование мини-пулов и раскапывание контрольного материала проводили с помощью раскапывающей станции Hamilton MICROLAB STAR IVD Pippetor. Выделение нуклеиновых кислот из исследуемоего материала осуществляли в автоматизированном режиме на приборе для пробоподготовки и выделения нуклеиновых кислот cobas AmpliPrep с лизирующего реагента и стеклянных магнитных частиц, входящих в состав теста DPX. Автоматизированную амплификацию и количественную детекцию ДНК B19V проводили на анализаторе cobas TaqMan с помощью реагента MasterMix, входящего в состав теста DPX. Для определения содержания ДНК B19V в образцах исследование проводилось по следующему алгоритму. В случае обнаружения мини-пулов, содержащих ДНК B19V, тестирование образцов повторяли в мини-пулах из 12 образцов (суб-пулы), а затем образцы из суб-пулов, в которых была выявлена ДНК возбудителя, исследовали в режиме индивидуального тестирования. 2.3. Верификация методики выявления и количественного определения ДНК B19V в образцах плазмы для фракционирования Провели верификацию методики выявления и количественного определения ДНК В19V в плазме для фракционирования с помощью теста DPX путем оценки следующих аналитических характеристик: аналитическая чувствительность, воспроизводимость, точность, возможность определения всех генотипов возбудителя, робастность и перекрестное заражение. В качестве критериев приемлимости использовали показатели, установленные производителем [105]. 31 Аналитическую чувствительность теста DPX для ДНК B19V оценивали путем установления предела определения (LOD) при уровне доверительной вероятности 95 % (95 % LOD). Определение 95 % LOD проводили путем исследования разведений 2-го Международного стандарта ВОЗ ДНК B19V для исследований методом ПЦР, код NIBSC 99/802 (Международный стандарт), который подготовили к работе согласно инструкции по применению [96]. Затем приготовили серийные десятикратные разведения в степени 0,5 (100,5) Международного стандарта, получив образцы, содержащие ДНК B19V от 100 до 0,1 МЕ/мл. В качестве разбавителя использовали пулированную плазму человека, которая содержала антикоагулянт ACD-A и не содержала маркеры гемотрансмиссивных инфекций (поверхностный антиген ВГВ, антитела к ВГС, антитела к Tr. pallidum, антиген ВИЧ-1, антитела к ВИЧ-1/ВИЧ-2, нуклеиновые кислоты ВГА, ВГВ, ВГС, ВИЧ-1/ВИЧ-2, B19V). По 8 образцов каждого уровня ДНК B19V исследовали с помощью теста DPX на протяжении 3 дней. Таким образом, количество исследованных образцов для каждого уровня концентрации в ходе исследования составило по 24 образца. Для оценки воспроизводимости тестировали образцы, полученные путем разведений Международного стандарта до уровня концентрации ДНК B19V log10 4,0 МЕ/мл, по 8 образцов в течение 3 дней. Точность теста DPX определяли на уровне концентрации log10 4,0 МЕ/мл (уровень принятия решения). Исследовали 40 образцов, содержащих ДНК B19V в концентрации log10 4,0 МЕ/мл и полученные путем разведения Международного стандарта. Тестирование проводили на протяжении 5 дней, т.е. по 8 образцов в день. Для проверки возможности определения всех генотипов возбудителя использовали 1-ю Международную Референсную панель ВОЗ генотипов В19V для ПЦР исследований (код NIBSC 09/110), содержащую образцы всех трех генотипов B19V, и образец плазмы, не содержащий ДНК B19V. Образцы панели разморозили и исследовали с помощью теста DPX. 32 Для оценки робастности использовали образцы с признаками гемолиза и хилеза, содержащие и не содержащие ДНК B19V. Для приготовления гемолизированных образцов использовали пулированную плазму человека, которая не содержала маркеры гемотрансмиссивных инфекций (поверхностный антиген ВГВ, антитела к ВГС, антитела к Tr. pallidum, антиген ВИЧ-1, антитела к ВИЧ-1/ВИЧ-2, нуклеиновые кислоты ВГА, ВГВ, ВГС, ВИЧ-1/ВИЧ-2, B19V). К аликвотам плазмы добавляли лизированную цельную кровь для получения окончательных концентраций 1; 2.5; 5; 10 и 20 % (об/об). Затем к части полученных гемолизированных образцов добавляли материал, содержащий ДНК B19V, доводя до конечного уровня 45 МЕ/мл. Для этой цели использовали свежеприготовленные разведения Международного стандарта. В результате было приготовлено в общей сложности по двум группам 30 гемолизированных образцов, которые затем исследовали с помощью теста DPX. Аналогично были сформированы две группы образцов с хилезом (уровень триглицеридов выше 11,3 ммоль/л): не содержащие и содержащие ДНК B19V на уровне 45 МЕ/мл. Изза сложности отбора плазмы с хилезом общее число образцов по двум группам составило 10, которые далее исследовали с помощью теста DPX. Для оценки перекрестного заражения в одну постановку включали 8 образцов плазмы, не содержащей ДНК B19V, и 8 образцов плазмы, содержащей ДНК B19V на уровне 106 МЕ/мл. Исследование проводили на протяжении двух рабочих дней. Суммарно исследовали 16 отрицательных и 16 положительных образцов плазмы. На завершающем этапе оценки данной методики проверяли практическое удобство примения теста DPX по показателю «процент невалидных результатов». За невалидный принимали результат исследования, который требовал проведения лабораторного исследования повторно вследствие сбоев в работе оборудования, программного обеспечения аналитического комплекса или наличия критических отклонений при проведении методики исследования образцов плазмы для фракционирования на наличие ДНК B19V. 33 2.4. Выявление антител к В19V Исследование образцов проводили методом иммуноферментного анализа с помощью коммерческого набора реагентов «SERION ELISA classic Parvovirus B19 IgG» (Virion/Serion, Германия) в соответствии с инструкцией производителя [66]. Далее измеряли оптическую плотность в лунках при длине волны 405 нм в течение 60 минут против бланка по субстрату. Референтная длина волны в диапазоне 620 – 690 нм. Определение концентрации антител проводили по методу логистической логарифмической модели с 4 параметрами (4PL). 2.5. Статистическую Статистическая обработка результатов обработку полученных данных проводили с использованием методов описательной статистики. Статистическое вычисление 95 % LOD проводили методом максимального правдоподобия (probit анализ) с использованием STATISTICA 6.0 for Windows. Установление взаимосвязей выявления высокой вирусной нагрузки В19V с полом, возрастом доноров, регионом проживания, а также фактором сезонности проводили с помощью корреляционого анализа методом Спирмена. О статистической значимости различий судили по показателю р < 0,05. 34 ГЛАВА 3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНФЕКЦИОННОЙ ЗНАЧИМОСТИ ДНК В19V 3.1. Верификация методики выявления и количественного определения ДНК В19V методом ПЦР в плазме для фракционирования с помощью тест-системы cobas TaqScreen DPX Test Первый этап настоящего исследования предусматривал выбор тест-системы для выявления и количественного определения ДНК В19V с последующим ее использованием в методике исследования образцов плазмы для фракционирования на выявление и количественное определение ДНК В19V методом ПЦР. При этом учитывали, наряду с аналитическими характеристиками тест-систем, международные отраслевые требования [35, 103], а также пользовательские свойства, позволяющие применять выбранную тест-систему для обследования больших объемов плазмы для фракционирования. Исходя из вышесказанного, установили следующие критерии выбора тестсистемы для выявления и количественного определения ДНК В19V: 1. Тип исследуемого материала – тест-система должна позволять использовать в качестве исследуемого материала плазму для фракционирования. 2. Высокая аналитическая чувствительность тест-системы, позволяющая проводить обследование плазмы в мини-пулах, включающих от 96 образцов. 3. Возможность тест-системы выявлять все три генотипа В19V с определением вирусной нагрузки [35, 103]. 4. Коммерческая доступность – тест-система должна быть зарегистрирована в установленном порядке для клинического применения на территории Российской Федерации. При анализе рынка подобрали следующие тест-системы: «РеалБест ДНК Parvovirus B19» (Вектор Бест, РФ), «ДНК Parvovirus B19» (НПФ ДНКТехнология, РФ), «Амплисенс Parvovirus B19-FL» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, РФ) и cobas TaqScreen DPX Test (Roche Molecular Systems, США). 35 Провели сравнительную оценку характеристик тест-систем на основе данных, заявленных производителями (таблица 3). Таблица 3 – Результаты сравнительной оценки характеристик тест-систем Название Критерий РеалБест ДНК Parvovirus B19 ДНК Parvovirus B19 Амплисенс Parvovirus B19-FL cobas TaqScreen DPX Test Да Исследуемый материал – плазма для фракционирования НД НД Может быть использован для образцов донорской крови, очищенных продуктов крови Аналитическая чувствительность, МЕ/мл НД НД 360 11,48 Размер мини-пула НД НД Не более 10 образцов 96 или 480 образцов Нет Нет Да Да НД НД НД Да Да Да [24] [105] Количественное определение ДНК В19V Выявление трех генотипов B19V Нет (только Нет (только для научных для научных исследований) исследований) Коммерческая доступность Источник [3] [5] Примечание: НД – нет данных. По итогам проведенного анализа выбрали тест DPX, как отвечающий критериям выбора, для предполагаемого в дальнейшем использования в методике исследования образцов плазмы для фракционирования для выявления и количественного определения ДНК В19V методом ПЦР. На втором этапе настоящего исследования провели процедуру верификации методики в соответствии с требованиями действующей нормативной документации [4, 18]. Оценку аналитических характеристик проводили путем сравнения с критериями приемлемости, заявленными производителем теста [105]. Аналитическую чувствительность оценивали по показателю LOD с использованием Международного стандарта ДНК B19V (таблица 4). 36 Таблица 4 – Результаты оценки 95 % LOD для B19V Лаборатория ДНК B19V, МЕ/мл Нижнее Верхнее 95 % LOD значение ДИ значение ДИ Немецкий красный крест, Хаген, ФРГ Финский красный крест, Хельсинки, Финляндия Сангвин, Амстердам, Нидерланды Источник 18,28 10,97 41,36 [75] 15,26 9,63 34,44 [75] 22,85 14,69 46,89 [75] ЛКК, Киров, Россия 21,83 14,29 45,24 Roche, США 11,48 10,56 12,91 Настоящее исследование [105] Установленное нижнее значение доверительного интервала (ДИ) показателя аналитической чувствительности примерно в 2 раза ниже уровня, заявленного Roche и приведенного в инструкции к тест-системе. Это объясняется особенностями дизайна настоящего исследования: меньшей выборкой (по 24 образца) и большим шагом разведения ДНК B19V (около 3,16 раза). Для сравнения, в исследовании Roche используется по 189 образцов каждого уровня ДНК B19V, а шаг разведения в 2 раза меньше [105]. подтверждается лабораториях, сравнениями при показателей соблюдении LOD, Данное объяснение полученными аналогичного дизайна в разных исследования. Установленный в ходе настоящего исследования показатель соотносится с ранее полученными данными и входит в диапазон от 11,48 до 22,85 МЕ/мл [75, 105]. Результаты оценки воспроизводимости представлены в таблице 5. Таблица 5 - Оценка воспроизводимости теста DPX на уровне концентрации ДНК В19V log10 4,0 МЕ/мл Количество образцов Среднее, log10 МЕ/мл СО, log10 МЕ/мл CV, % Немецкий красный крест, Финский красный крест, Сангвин (суммарно по трем лабораториям) 96 4,15 0,06 1,45 ЛКК, Киров, Россия 24 4,09 0,05 1,22 Roche, США 178 3,87 0,182 1,22 Лаборатория Источник [75] Настоящее исследование [105] 37 При исследовании 24 образцов, содержащих ДНК В19V в концентрации log10 4,0 МЕ/мл (104 МЕ/мл), среднее значение составило log10 4,09 МЕ/мл (95 % ДИ log10 4,07 - log10 4,12 МЕ/мл) со стандартным отклонением (СО) log10 0,05 МЕ/мл (коэффициент вариации (СV) 1,22 %), что показывает высокую воспроизводимость теста. Полученные показатели с учетом размера выборки соответствуют результатам ранее проведенных исследований [75, 105]. При исследовании 40 образцов, содержащих ДНК В19V в концентрации log10 4,00 МЕ/мл, среднее значение составило log10 4,07 (СО = 0,071) МЕ/мл (таблица 6). Таблица 6 - Оценка точности теста DPX на уровне концентрации ДНК В19V log10 4,0 МЕ/мл Лаборатория Количество образцов Среднее, log10 МЕ/мл СО, log10 МЕ/мл 95 % ДИ, log10 МЕ/мл Источник Немецкий красный крест, Финский красный крест, Сангвин (суммарные показатели по трем лабораториям) 144 4,04 0,043 3,99 – 4,09 [75] ЛКК, Киров, Россия 40 4,07 0,071 4,00 – 4,14 Настоящее исследование Таким образом, 95 % ДИ составил диапазон от log10 4,00 до log10 4,14 МЕ/мл, включающий заданную концентрацию (log10 4,00 МЕ/мл) с незначимым отклонением log10 0,07 МЕ/мл, что доказывает высокую точность при выполнении исследований образцов плазмы для фракционирования с целью выявления и количественного определения ДНК B19V. Результаты тестирования Международной референсной панели с помощью теста DPX показали правильность выявления и количественного определения всех трех генотипов В19V, а также оценки контрольного образца (отрицательной плазмы), входящих в состав панели, в условиях ЛКК ФГБУ РМНПЦ «Росплазма» ФМБА России (таблица 7). 38 Таблица 7 - Результаты исследования Международной референсной панели Лаборатория Генотип 1 Немецкий красный крест, Хаген, ФРГ Финский красный крест, Хельсинки, Финляндия Сангвин, Амстердам, Нидерланды ЛКК, Киров, Россия Референсное значение (95 % ДИ) панели ДНК B19V, log10 МЕ/мл Отрицательная Генотип 2 Генотип 3 плазма Источник 5,83 5,62 5,61 - [75] 5,92 5,60 5,60 - [75] 5,85 5,80 5,73 - [75] 5,68 5,56 5,50 - Настоящее исследование 5,61 – 6,32 5,43 – 6,52 5,21 – 6,54 - [95] Полученные результаты доказали соответствие теста DPX международным отраслевым требованиям к тест-системам для выявления и количественного определения ДНК B19V [35, 103]. При исследовании 30 образцов плазмы, содержащих ДНК В19V и имеющих уровень гемолиза до 20 % (об/об), были получены положительные результаты, а при исследовании 30 гемолизированных образцов, не содержащих ДНК В19V, отрицательные результаты. Аналогичные данные получены при исследовании двух групп по 10 образцов, имеющих признаки хилеза. В совокупности, это показывает достаточную робастность теста DPX, заявленную производителем [105], что доказывает возможность на практике проводить исследование образцов плазмы для фракционирования, в том числе имеющих признаки гемолиза до 20 % (об/об) и/или хилеза, без влияния на конечный результат исследования. По результатам проведенной верификации случаи перекрестного заражения отсутствовали, что доказывает надежность методики, исключающую возможность контаминации образцов плазмы для фракционирования в процессе проведения исследования и, как следствие, снижает риск получения ложноположительных результатов. 39 Результаты оценки рутинного применения теста DPX в методике выявления и количественного определения ДНК B19V в плазме для фракционирования представлены в таблице 8. Таблица 8 - Результаты сравнительной оценки рутинного применения теста DPX Немецкий красный крест, Хаген, Германия [93] ЛКК, Киров, Россия [настоящее исследование] 48 240 48 (100 %) 239 (100 %) Общее число результатов, из них: 870 2142 валидные 864 1909 6 233 99,3 89,1 Показатель Общее число постановок из них валидных невалидные Процент валидных результатов Все невалидные результаты (10,9 % от общего числа полученных результатов) связаны с ошибками в работе оборудования. Отсутствие невалидных результатов, связанных с реагентами, подтверждают результаты ранее проведенного исследования [93]. Высокий процент невалидных результатов, полученный в нашем исследовании, объясняется, прежде всего, большим объемом выборки и более продолжительным периодом наблюдения. Итак, полученные результаты соответствуют критериям приемлемости [105] и соотносятся с данными, полученными ранее в ведущих лабораториях мира [75], что свидетельствует об успешном проведении верификации методики исследования образцов плазмы для фракционирования для выявления и количественного определения ДНК В19V методом ПЦР. доказали возможность использования данной методики Таким образом, в алгоритме лабораторного исследования больших объемов плазмы, направляемой на фракционирование. 3.2. Выявление ДНК В19V у доноров плазмы для фракционирования Исследовали 16841 образец плазмы, заготовленной в период с января 2012 по апрель 2012 года от 6154 доноров плазмы для фракционирования, 40 проживающих на территории ряда субъектов Российской Федерации. В 42 образцах плазмы, заготовленной от 34 доноров, была выявлена ДНК В19V на уровне от 7,82 х 101 до 6,56 х 105 МЕ/мл (медиана 3,97 х 102 МЕ/мл). Для оценки количественных результатов область значений концентрации ДНК В19V, выявленной среди доноров плазмы для фракционирования, разбили на три диапазона: − диапазон А включал значения концентрации ДНК возбудителя менее 104 МЕ/мл; − диапазон В – от 104 до 106 МЕ/мл; − диапазон С – 106 и более МЕ/мл (таблица 9). Таблица 9 – Частота выявления ДНК В19V среди доноров плазмы для фракционирования Количество обследован ных доноров, абс. 6154 Доноры, у которых выявлена ДНК В19V в диапазоне, абс. Доноры, у которых выявлена ДНК В19V в диапазоне, % Всего А В С Всего А В С 34 27 7 0 0,55 0,44 0,11 - ДНК В19V в целом выявили у 0,55 % (34/6154) доноров плазмы для фракционирования от числа всех обследованных. Из них, у 79 % (27/34) доноров выявлена низкая вирусная нагрузка возбудителя (ДНК В19V менее 104 МЕ/мл). И только у 21 % (7/34) доноров ДНК В19V обнаруживалась на уровне 104 – 106 МЕ/мл. Доноров плазмы для фракционирования с концентрацией ДНК В19V равной или более 106 МЕ/мл выявлено не было, что объясняется, прежде всего, малым периодом наблюдения. Во-вторых, по-видимому, оказали влияние на конечный результат сезонные колебания выявления ДНК В19V [62, 73, 130]. Провели анализ данных по выявлению ДНК В19V среди доноров плазмы для фракционирования в зависимости от региона проживания (таблица 10). 41 Таблица 10 – Частота выявления ДНК В19V среди доноров плазмы для фракционирования в зависимости от региона проживания Субъект РФ Количество доноров, абс. Кировская область Костромская область Нижегородская область Республика Марий Эл Республика Татарстан Республика Чувашия Всего Доноры, у которых выявлена ДНК В19V, абс. < 104 > 104 Всего МЕ/мл МЕ/мл Доноры, у которых выявлена ДНК В19V, % < 104 > 104 Всего МЕ/мл МЕ/мл 5145 14 13 1 0,27 0,25 0,02 176 2 2 - 1,14 1,14 - 182 4 4 - 2,20 2,20 - 153 6 4 2 3,92 2,61 1,31 402 6 3 3 1,50 0,75 0,75 96 2 1 1 2,10 1,05 1,05 6154 34 27 7 0,55 0,44 0,11 Из представленных в таблице 10 данных видно, что частота выявления ДНК В19V среди доноров плазмы для фракционирования в зависимости от региона проживания составила от 0,27 до 3,92 %. Разница в полученных результатах может объясняться, прежде всего, вариацией количества обследованных доноров, проживающих на определенных территориях. Так, в случае сравнения числа обследованных доноров по Кировской области и республике Чувашия отличие доходит до 53,5 раз. Тем самым каждый новый случай выявления ДНК В19V у донора плазмы для фракционирования на малом объеме выборки в значительной мере влияет на конечный результат, приводя к различию уровня выявляемости ДНК В19V до 14,5 раз. Вместе с тем, в случае оценки сопоставимых по размеру выборок отмечается различие данного показателя в зависимости от региона проживания доноров плазмы для фракционирования. Например, частота выявления ДНК В19V среди доноров плазмы для фракционирования, проживающих в Нижегородской области, выше в 1,9 раза, чем среди доноров Костромской области. Определенная в настоящем исследовании частота выявления ДНК В19V среди доноров плазмы для фракционирования сопоставима с аналогичным 42 показателем (0,55 – 1,90 %) для популяций доноров крови разных стран мира (таблица 11). Таблица 11 – Сравнительный анализ данных по частоте выявления ДНК В19V среди доноров разных стран Регион Количество обследованных доноров, абс. Доноры, у которых выявлена ДНК В19V, абс. Доноры, у которых выявлена ДНК В19V, % 6154 34 0,55 1521 29 1,90 3957 23 0,58 Великобритания [47] 1000 9 0,90 Гана [47] 1000 13 1,30 Южная Африка [47] 360 2 0,55 Российская Федерация [настоящее исследование] Российская Федерация [31] Китай [69] Вместе с тем, обращает на себя внимание более низкая частота выявления в Российской Федерации ДНК В19V среди доноров плазмы для фракционирования по сравнению с донорами крови [31], что может объясняться следующими причинами. Во-первых, выборка доноров в ранее проведенном исследовании невелика, а именно в 4 раза ниже по сравнению с настоящим исследованием. Поэтому выявление в данной работе каждого нового положительного образца значительно влияет на конечный результат. Во-вторых, авторы ранее проведенного исследования отмечают факт обнаружения локального повышения уровня инфицированности В19V, что необходимо учитывать при анализе популяционных данных [31]. В-третьих, по-видимому, следует также учитывать сезонные колебания выявления ДНК В19V [62, 130]. Если в ранее проведенном исследовании период наблюдения приходился на ноябрь – декабрь [31], то в настоящем исследовании оценивался другой период: январь – апрель. Таким образом, показано, что частота выявления ДНК В19V среди российских доноров плазмы для фракционирования составила 0,55 %. Установленный показатель соответствует уровню в других странах мира, что подтверждает повсеместный характер распространения парвовирусной инфекции 43 [31, 47, 69, 113, 130] и делает актуальной для Российской Федерации проблему обеспечения инфекционной безопасности плазмы для фракционирования в отношении В19V. 3.3. Определение процента образцов плазмы для фракционирования с высокой концентрацией ДНК B19V Из общего числа исследованных образцов плазмы для фракционирования в девяти выявили высокую концентрацию ДНК В19V (106 МЕ/мл и более). При этом диапазон значений ДНК В19V составил от 3,81 х 106 МЕ/мл до 7,21 х 109 МЕ/мл (медиана 9,34 х 106 МЕ/мл). Результаты скрининга приведены в таблице 12. Таблица 12 – Выявляемость высокой концентрации ДНК В19V (> 106 МЕ/мл) в образцах плазмы для фракционирования Год Количество образцов, абс. 2012 96134 Образцы, в которых выявлена ДНК В19V > 106 МЕ/мл, абс. 2 Образцы, в которых выявлена ДНК В19V > 106 МЕ/мл, % 0,002 2013 95398 2 0,002 2014 96596 5 0,005 Всего 288128 9 0,003 Полученные нами данные по выявляемости образцов с высокой вирусной нагрузкой В19V (0,002 - 0,005 %) при заготовке плазмы для фракционирования в Российской Федерации сопоставимы с результатами ранее проведенных исследований. По данным зарубежных авторов, процент образцов плазмы для фракционирования с концентрацией ДНК B19V 106 МЕ/мл и более составляет 0,006 [73, 74]. Обращает на себя внимание подъем в 2,5 раза выявления образцов с высокой концентрацией ДНК В19V в 2014 году по сравнению с аналогичным показателем 2012 – 2013 гг., что, вероятно, связано с подъемом заболеваемости парвовирусной инфекции, для которой характерны вспышки с цикличностью в 3 4 года [130]. 44 Таким образом, за весь период наблюдения процент образцов плазмы для фракционирования с высокой концентрацией ДНК В19V (106 МЕ/мл и более) составил в среднем 0,003. Определенный показатель имеет важное эпидемиологическое значение для предприятий по заготовке и переработке плазмы, т.к. именно высокий уровень вирусной нагрузки B19 и определяет инфекционность плазмы для фракционирования в плане возможной контаминации производственных пулов [26, 39, 73, 103]. 3.3.1. Связь высокой вирусной нагрузки в плазме для фракционирования с выработкой антител к B19V Образцы плазмы для фракционирования (n=9), содержащие ДНК В19V клинически значимой концентрации (106 МЕ/мл и более), исследовали методом ИФА на присутствие антител (иммуноглобулинов классов G и M). В восьми из девяти образцов антитела к В19V не были обнаружены. В одном образце выявили только IgG – антитела на уровне 7,5 МЕ/мл. Полученные результаты, вероятно, связаны с образованием иммунных комплексов, препятствующих обнаружению антител методом ИФА [40]. Кроме того, высокая вирусная нагрузка B19V, независимо от имеющегося уровня антител к B19V в плазме, делает процесс нейтрализации возбудителя, как правило, неэффективным, а образующиеся иммунные комплексы нестабильными, что приводит к инфекционности такой плазмы [39]. Показано, что высокие титры специфических антител, содержащиеся в компоненте или препарате крови, не защищают от инфицирования серонегативных реципиентов при уровне вирусной нагрузки более 108 копий/мл [52]. С учетом этого, результаты настоящего исследования свидетельствуют о низкой диагностической значимости метода ИФА для оценки образцов плазмы с высокой вирусной нагрузкой возбудителя и косвенно подтверждают значимость исследования плазмы для фракционирования на наличие ДНК B19V. 45 3.3.2. Связь выявления выявлени высокой вирусной нагрузки B B19V в плазме для фракционирования с возрастом, возрастом полом доноров доноров, регионом их проживания проживания, а также фактором сезонности Для обработки демографических данных (пол пол, возраст возраст) доноров ов плазмы для фракционирования использовали данные медицинской информационной системы «ИС ИС Плазмоцентр Плазмоцентр». При этом от каждого донора получили или информированное добровольное согласие на обработку персональных данных (Приложение Приложение 1). Возрастной состав доноров плазмы плаз для фракционирования представлен на рисунке 5. 6000 5885 5415 5406 5000 4538 4460 4077 4000 3904 3858 3488 18 - 27 лет 28 - 37 лет 3000 2703 2778 2417 38 -47 лет 2000 48 - 57 лет 58 лет и старше 1000 563 492 410 0 2012 г. 2013 г. 2014 г. Рисунок 5 – Возрастной состав доноров плазмы для фракционирования. фракционирования Основной процент доноров плазмы для фракционирования пришелся Основной пришелся на возрастную группу 18 – 27 лет и составил составил 31,59 – 34,26.. При этом по остальным возрастным группам отметили отметили стойкое снижение их числа числа:: максимальное значение во второй возрастной группе (28 ( – 37 лет), лет минимальное - в пятой возрастной группе (58 лет и старше). старше В динамике наблюда наблюдалось лось увеличение количества оличества доноров в третьей – пятой возрастной группах группах, что объясняется заготовк заготовкой плазмы для фракционирования в плазмоцентрах ФГБУ РМНПЦ 46 «Росплазма Росплазма» ФМБА России преимущественно от кадровых доноров и, как следствие естественным механизмом следствие, механизмо старения донорских ресурсов ресурсов. Распределение доноров в зависимости от пола представлено на рисунке 6. 10000 9000 8000 9328 9279 8450 8148 7832 7357 7000 6000 5000 Мужчины 4000 Женщины 3000 2000 1000 0 2012 г. 2013 г. 2014 г. Рисунок 6 – Распределение доноров плазмы для фракционирования в зависимости от пола пола. В динамике распределение доноров плазмы для фракционирования составило для мужчин 53,4 – 54,2 %, для женщин – 45,8 – 46,5 %, что позволяет говорить о приблизительно равном соотношении полов доноров за весь период наблюдения Это в свою очередь характеризует наблюдения. характеризует оптимальный состав выборки доноров плазмы для фракционирования для последующей статистической обработки данных с целью оценки взаимосвязи выявления высокой вирусной нагрузки с полом донора. донора Основная масса обследованных доноров плазмы для фракционирования в зависимости от региона проживания пришлась при на Кировскую область (таблица аблица 13). 47 Таблица 13 – Распределение доноров плазмы для фракционирования в зависимости от региона проживания Год 2012 2013 2014 Респ. Марий Эл 913 970 1051 Респ. Татарстан Респ. Чувашия Кировская обл. Костромская обл. Нижегородская обл. Всего 3035 3314 3736 730 737 631 8761 9472 8881 1017 1371 1202 1351 1612 1610 15807 17746 17111 Это объясняется организационными причинами - размещением в данном субъекте РФ девяти из 15 плазмоцентров ФГБУ РМНПЦ «Росплазма» ФМБА России. Вместе с тем, в динамике отметили сокращение доли доноров, проживающих в Кировской области, от общего числа доноров плазмы для фракционирования с 55,42 % в 2012 году до 51,90 % в 2014 году за счет увеличения числа доноров в других субъектах РФ. Сформированный за трехлетний период наблюдения объем выборки (9 доноров плазмы для фракционирования с высоким уровнем виремии В19V) представлен в таблице 14. Таблица 14 – Доноры плазмы для фракционирования с высокой концентрацией ДНК B19V (106 МЕ/мл и более) Номер образца Дата отбора ДНК B19V, МЕ/мл Данные донора 216000081761 356000011753 216000056733 216000056734 24.12.2013 20.05.2013 02.05.2012 02.05.2012 7.21E+09 3.81E+06 8.38E+06 7.07E+06 Номер в базе данных 16.21.0609146 21.35.0005290 16.21.0589603 16.21.0589605 426000031670 13.05.2014 1.22E+07 44.42.0341915 19 816000042392 05.05.2014 1.39E+07 43.81.0219247 54 816000041078 216000087487 216000101656 04.03.2014 31.03.2014 11.12.2014 9.34E+06 8.06E+06 1.49E+09 43.81.0235259 16.21.0989690 16.21.1012660 30 20 19 Возраст пол 20 29 19 19 м ж м ж м ж ж м м Субъект проживания Татарстан Чувашия Татарстан Татарстан Костромская обл. Кировская обл. Кировская обл. Татарстан Татарстан Высокая вирусная нагрузка возбудителя выявлена в основном у доноров первой возрастной группы (18 – 27 лет). На неё пришлось 66,7 % (6/9) от всех 48 выявленных доноров с высоким уровнем виремии В19V. Распределение по остальным возрастным группам следующее: 22,2 % (2/9) доноры 28 – 37 лет (вторая возрастная группа) и один донор в возрасте 54 лет (четвертая возрастная группа). Полученные результаты объясняются особенностями эпидемиологии возбудителя: восприимчивостью к инфицированию всех возрастных групп, но с пиком заболеваемости в детском и юношеском возрасте и постепенным снижением в старших возрастных группах [12, 62, 130]. При статистической обработке данных коэффициент Спирмена (ρ) равен минус 0,775. Функциональная связь между признаками обратная, сила связи по шкале Чеддока высокая. Зависимость признаков статистически незначима (р > 0,05). Связи выявления высокой концентрации ДНК В19V с полом доноров установлено не было. У мужчин- и женщин-доноров высокая виремия В19V выявлялась в равной мере. Полученные результаты соответствуют данным зарубежных исследователей [73]. В зависимости от региона проживания доноров плазмы для фракционирования высокая концентрация ДНК B19V чаще всего выявлялась у доноров республики Татарстан – в 55,5 % случаев (5/9). Кроме того, высокая виремия В19V была обнаружена у доноров Кировской области (2/9), республики Чувашия (1/9) и Костромской области (1/9). При статистической обработке данных коэффициент Спирмена (ρ) равен минус 0,914. Функциональная связь между признаками обратная, сила связи по шкале Чеддока весьма высокая. Зависимость признаков статистически незначима (р > 0,05). Полученные данные следует принять во внимание при планировании заготовки плазмы для фракционирования на данных территориях. С учетом фактора сезонности доноры плазмы для фракционирования с высокой концентрацией ДНК В19V наиболее часто выявлялись весной - 77,8% (7/9) доноров от общего числа выявленных доноров, с пиком в мае – 55,6% (5/9) доноров. При статистической обработке данных коэффициент Спирмена (ρ) равен минус 0,650. Функциональная связь между признаками обратная, сила связи по 49 шкале Чеддока заметная. Зависимость признаков статистически значима (р < 0,05). Полученные результаты соответствуют данным зарубежных авторов [73]. Таким образом, результаты исследования показывают, что у доноров плазмы для фракционирования, независимо от пола, в возрасте от 18 до 27 лет высокая концентрация ДНК B19V (106 МЕ/мл и более) в образцах плазмы может обнаруживаться значительно чаще, чем в старших возрастных группах. При этом высокий уровень виремии B19V будет выявляться чаще весной, с пиком в мае. 50 ГЛАВА 4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ТЕСТИРОВАНИЯ ПЛАЗМЫ ДЛЯ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ НА НАЛИЧИЕ ДНК В19V 4.1. Оценка риска контаминации производственных пулов Процент образцов плазмы для фракционирования с высокой вирусной нагрузкой В19V (таблица 12) использовали для оценки риска возможной контаминации производственных пулов в математической модели, специально разработанной для выполнения этой задачи. Исходное количество контейнеров с плазмой для фракционирования приняли за 1000000. Расчет риска проводили в несколько этапов: 1. Определили количество контейнеров с плазмой для фракционирования, входящее в объем производственного пула. При этом за предполагаемый объем производственного пула приняли 5000 л плазмы, как отвечающий требованиям современного производства препаратов крови, основанном на принципе крупномасштабного фракционирования плазмы [15, 19]. Объем плазмы для фракционирования, содержащейся в одном контейнере, установили на уровне 0,6 л в соответствии с требованием отечественного законодательства по максимальному объему одной плазмодачи [17]. Расчет проводили по формуле: П К (1), где: – количество контейнеров с плазмой для фракционирования П – объем производственного пула К – объем плазмы для фракционирования в 1 контейнере. Количество контейнеров с плазмой для фракционирования (n) составило 8333 ед. на производственный пул. Таким образом, для заготовки данного количества контейнеров с плазмой для фракционирования с целью последующего формирования производственного пула объемом 5000 л необходимо провести 8333 плазмодачи. При этом число сформированных производственных пулов (b), 51 учитывая исходное число контейнеров c плазмой для фракционирования в математической модели, составит 120. 2. Рассчитали частоту выявления образцов плазмы для фракционирования, содержащих высокую вирусную нагрузку возбудителя, исходя из ранее установленных показателей 2012 – 2014 гг. (таблица 12) и международных отраслевых требований [102]. Расчет проводили в соответствии с общепринятой методикой [11] по следующей формуле: Ч х 1000000 (2), где: Ч – частота выявления образцов плазмы для фракционирования, содержащих высокую концентрацию ДНК В19V 106 МЕ/мл и более, на 1000000 донаций; х – количество образцов плазмы для фракционирования, в которых выявлена ДНК В19V клинически значимой концентрации (106 МЕ/мл и более); - количество исследованных образцов плазмы для фракционирования за год; 1000000 –коэффициент для расчета частоты выявления высокой концентрации ДНК В19V на 1000000 донаций. Частота выявления образцов плазмы для фракционирования, содержащих высокую вирусную нагрузку возбудителя, в 2012 году составила 20,8 на 1000000 донаций, в 2013 году – 21,0 на 1000000 донаций и в 2014 г. – 51,8 на 1000000 донаций. В среднем частота выявления за период наблюдения равнялась 31,2 на 1000000 донаций. Исходя из рассчитанных показателей, установлено, что на каждый 1000000 донаций будет приходиться в среднем 31,2 (20,8 - 51,8) контейнеров с плазмой для фракционирования (а), содержащей критический уровень вирусной нагрузки В19V. 3. Определили риск (R) возможной контаминации производственного пула плазмой для фракционирования, содержащей высокую вирусную нагрузку возбудителя, согласно общепринятой методике расчета [11] с учетом поправочного коэффициента. Введением данного коэффициента учитывали вероятность попадания контейнеров с контаминированной плазмой в 52 производственный пул: от благоприятного для производства варианта распределения (все контейнеры с контаминированной плазмой попадают в один производственный пул) до негативного (равномерное распределение по одному контейнеру с контаминированной плазмой в каждый производственный пул). Рассчет проводили по формуле: · (3), где: – риск возможной контаминации производственного пула плазмой для фракционирования с высокой концентрацией ДНК В19V, %; – количество контейнеров с плазмой для фракционирования, в которой выявлена ДНК В19V клинически значимой концентрации (106 МЕ/мл и более); – число сформированных производственных пулов плазмы для фракционирования, объемом 5000 л; – поправочный коэффициент, равный в случае благоприятного для производства варианта распределения k = 1/a, в случае негативного варианта k =1. Вычислили максимальный (Rmax), средний (Rср) и минимальный (Rmin) риски возможной контаминации производственного пула плазмой для фракционирования с высокой концентрацией ДНК В19V (106 МЕ/мл и более), учитывая определенные ранее частоты выявления образцов плазмы для фракционирования с высокой вирусной нагрузкой возбудителя. Результаты оценки риска представлены в таблице 15. Таблица 15 - Риск контаминации производственного пула плазмой для фракционирования с концентрацией ДНК В19V 106 МЕ/мл и более Число Количество Максимальный Средний риск Минимальный контейнеров производственных риск контаминации риск плазмы с пулов по 5000 л контаминации производственных контаминации ДНК В19V (b) производственных пулов (Rср) производственных пулов (Rmax) пулов (Rmin) 31,2 (20,8 – 120 0,8 – 43 % 0,8 – 25 % 0,8 – 17 % 51,2) 53 Полученные результаты свидетельствуют об увеличении риска возможной контаминации производственных пулов в 2,5 раза с повышением частоты выявления образцов плазмы для фракционирования с высокой вирусной нагрузкой (ДНК В19V 106 МЕ/мл и более) за отчетный период. В среднем риск составил 0,8 – 25 %, что автоматически может привести к контаминации до 25 % выпускаемых препаратов крови. Полученные результаты соотносятся с ранее проведенными исследованиями. Установлено, что без должных профилактических мер до 56 – 100 % партий препаратов фактора VIII будут контаминированы ДНК B19V [61]. Таким образом, результаты настоящего исследования указывают на необходимость принятия действенных мер, направленных на предотвращение контаминации В19V производственных пулов. Прежде всего - это внедрение в практику алгоритма тестирования сырья с целью исключения из процесса производства плазмы для фракционирования с высокой концентрацией ДНК В19V. 4.2. Клинико-экономическое обоснование внедрения в практику тестирования плазмы для фракционирования на наличие ДНК В19V В соответствие с требованиями отечественного законодательства [16, 17] в настоящее время тестирование плазмы для фракционирования методом ПЦР проводится только в отношении нуклеиновых кислот ВГВ, ВГС, ВИЧ-1 и ВИЧ-2 в режиме мини-пулов. На международном уровне с начала 2000-х годов в качестве действенной профилактической меры, обеспечивающей повышение безопасности сырья для производства препаратов крови, введено тестирование плазмы для фракционирования на наличие ДНК В19V. Главной задачей данного тестирования является выявление и последующее исключение из технологической цепочки доз плазмы для фракционирования с высокой вирусной нагрузкой В19V, при попадании которых в производственный пул, может быть превышена критическая концентрация - 104 МЕ/мл [59, 89, 103]. Зарубежные 54 переработчики плазмы выполняют тестирование сырья на наличие ДНК В19V в мини-пулах пулах, состоящих из 96-512 пулах 512 индивидуальных образцов [73, 74]. ]. Алгоритм тестирования плазмы для фракционирования на наличие ДНК B19V должен определяться, определяться исходя из аналитических характеристик используемой тест-системы тест системы, размера производственного пула и статистических данных отражающих частоту выявления образцов плазмы данных, плазмы, контаминированной контаминированн В19V,, при заготовке сырья от определенной популяции доноров. доноров Кроме того, того применяемая тест-система тест система должна выявлять все три генотипа возбудителя и обеспечивать определение вирусной нагрузки [35]. ]. Ранее при проведении верификации методики методики выявления и количественного определения ДНК В19V V в плазме для фракционирования было показано, показано что тест DPX удовлетворяет перечисленным выше условиям и может использоваться в алгоритме лабораторного исследования больших объемов плазмы, плазмы направляемой на фракционирование (рисунок рисунок 7) 7). В частности, частности установленная становленная аналитическая чувствительность теста DPX (95 % LOD)) для ДНК В19V составил составилаа 21,83 МЕ/мл МЕ (95 % ДИ 14,29 – 45,24 МЕ МЕ/мл мл), что гарантирует эффективное выявление доз плазмы с вирусной нагрузкой 102 и более ее МЕ/мл. МЕ Шаг 1 • Первичная постановка в пулах из 96 образцов • При положительном результате переход к шагу 2 Шаг 2 • Исследование промежуточных пулов по 12 образцов • При положительном результате переход к шагу 3 Шаг 3 • Исследование в режиме индивидуального тестирования • Получение окончательного результата Рисунок 7 – Алгоритм тестирования плазмы для фракционирования на наличие ДНК В19V В 55 Тестирование на наличие ДНК В19V согласно выработанному алгоритму проводили на втором этапе лабораторного обследования плазмы для фракционирования, после проведения исследования на наличие нуклеиновых кислот ВГВ, ВГС и ВИЧ-1, ВИЧ-2. В качестве исследуемого материала использовали остаточный объем образца плазмы для фракционирования, отбираемой в одноразовую пластиковую пробирку из заготовленного контейнера непосредственно в плазмоцентре, до этапа заморозки (исходный объем отбираемого материала составляет 4 мл). Критерием выбраковки явилось обнаружение в исследуемом образце плазмы для фракционирования ДНК В19V на уровне 106 МЕ/мл и более. Это с учетом мини-пула из 96 образцов позволяет исключить возможность попадания плазмы с высокой вирусной нагрузкой в производство и, как следствие, обеспечивает соблюдение международного требования по уровню виремии В19V в производственном пуле не более 104 МЕ/мл. Наблюдение за донорами в динамике показало снижение концентрации ДНК В19V при контрольном обследовании (при следующем обращении донора в плазмоцентр) ниже порогового значения во всех случаях, за исключением одного, когда донор не явился для повторного обследования (таблица 16). Таблица 16 – Результаты повторного исследования образцов плазмы для фракционирования с высокой концентрацией ДНК В19V Номер образца 216000056733 216000056734 356000011753 216000081761 816000041078 216000087487 816000042392 426000031670 216000101656 Исходная концентрация Дата отбора ДНК B19V, МЕ/мл 02.05.2012 02.05.2012 20.05.2013 24.12.2013 04.03.2014 31.03.2014 05.05.2014 13.05.2014 11.12.2014 8,38 х 106 7,07 х 106 3,81 х 106 7,21 х 109 9,34 х 106 8,06 х 106 1,39 х 107 1,22 х 107 1,49 х 109 Номер донора в базе данных 16.21.0589603 16.21.0589605 21.35.0005290 16.21.0609146 43.81.0235256 16.21.0989690 43.81.0219247 44.42.0341915 16.21.1012660 Результат Длительность контрольного случай – исследования контроль, (ДНК B19V, дней МЕ/мл) 30 7,15 х 102 105 не выявлено 3 28 1,11 х 10 2 22 3,14 х 10 3 15 3,21 х 10 64 не выявлено 3 14 4,96 х 10 2 21 8,51 х 10 нет данных нет данных 56 Полученные результаты подтверждают то, что для острой парвовирусной инфекции характерна короткая фаза активной репликации (в среднем не более 7 – 14 дней), которая сопровождается высокой виремией [130]. Одновременно это свидетельствует и об отсутствии необходимости даже во временном отводе доноров плазмы для фракционирования, в случае выявления у них ДНК В19V в концентрации 106 МЕ/мл и более. Для оценки экономической эффективности выбрали методологический подход «анализ выгоды стоимости» [10]. Целью данного подхода является определение размера выгоды от внедрения лабораторного исследования. Первоначально определили затраты на проведение исследования на наличие ДНК В19V в плазме для фракционирования, т.е. себестоимость. В нашей стране себестоимость лабораторного исследования рассчитывается в соответствии с нормативной документацией [14] по формуле: S = V + Aм +Э +М + П (4), где: S – себестоимость исследования V – оплата труда Aм - амортизационные отчисления на оборудование Э – эксплуатационные расходы на содержание оборудования и инвентаря М - материальные затраты (затраты на реактивы, лабораторное стекло, пластмассовые изделия и т.д.) П – прочие расходы. С учетом того, что исследование плазмы для фракционирования на наличие ДНК В19V проводится на одном и том же лабораторном оборудовании (аналитическом комплексе cobas s201), тем же персоналом, что и тестирование на наличие нуклеиновых кислот ВГВ, ВГС, ВИЧ-1 и ВИЧ-2, при расчете себестоимости анализа учитывали только прямые расходы, т.е. стоимость реагентов и расходных материалов, а также официально прогнозируемый уровень инфляции в 5,5 % (индекс - дефлятор 1,055) [21]. В итоге расчет проводили по модифицированной формуле: 57 S = (М1 + М2 +М3 + … + Мi) * 1,055 (5), где: S – себестоимость исследования Мi – материальные затраты (суммарные затраты на i-количество реактивов, пластмассовых изделий и т.п.) 1,055 – индекс – дефлятор. Себестоимость исследования одного образца плазмы для фракционирования на наличие ДНК В19V в мини-пулах из 96 образцов в ценах по состоянию на конец 2014 года составила 111,42 руб. (таблица 17). Таблица 17 - Себестоимость исследования на наличие ДНК В19V в плазме для фракционирования (на 1 образец плазмы для фракционирования) Наименование Тест DPX Набор контролей Промывающий буфер Устройство для пробоподготовки SPU Пробирки для образцов входные К-наконечники К-пробирки Наконечники CO-RE с фильтром 1 мл Плашка архивная ИТОГО Тест DPX Ед. изм. Норма расхода на 1 образец Цена за ед. изм., руб. Себестоимость руб. С учетом дефлятора, руб. тест 0.02 2 745.04 54.90 57.92 компл. л 0.002 0.002 11 358.76 4 438.82 22.72 8.88 23.97 9.37 шт. 0.02 175.30 3.51 3.70 шт. 0.02 61.25 1.23 1.30 шт. шт. 0.02 0.02 17.88 48.15 0.36 0.96 0.38 1.01 шт. 1 12.39 12.39 13.07 шт. 0.01 66.27 0.66 105.61 0.70 111.42 имеет достаточные аналитические характеристики (чувствительность при выявлении ДНК B19V составляет менее 102 МЕ/мл), поэтому теоретически возможно применение этого теста и с большим количеством образцов в мини-пуле (до 480) без увеличения риска пропуска образцов плазмы с высокой концентрацией ДНК В19V [105]. Для оценки экономической целесообразности использования мини-пулов большего объема был сделан сравнительный анализ расхода теста DPX (на него приходится 52 % от себестоимости исследования) при использовании пулов из 58 96 и 480 индивидуальных доз плазмы. Результаты расчета, выполненные с учетом технологических особенностей применяемого лабораторного оборудования, приведены для анализа 960 образцов, в числе которых содержится один образец с концентрацией ДНК В19V 106 МЕ/мл или более (таблица 18). Таблица 18 - Анализ расхода теста DPX при исследовании 960 образцов плазмы для фракционирования на наличие ДНК В19V при использовании мини-пулов разной размерности Первичная постановка Выявление 1 образца с ДНК В19V 106 МЕ/мл или более Мини-пул 96 образцов Расход теста DPX Тип и на 1 на 1 количество постано образец пулов вку 10 первичных 13 пулов по 96 0,014 тестов образцов 8 промежуточных 11 пулов по 12 тестов образцов 12 образцов (режим 15 0,04 единичного тестов тестирования) Мини-пул 480 образцов Расход теста DPX Тип и количество на 1 на 1 пулов постано образец вку 2 первичных пула по 480 образцов 5 тестов 10 промежуточных пулов по 48 образцов 13 тестов 8 вторичных пулов по 6 образцов 11 тестов 6 образцов (режим единичного тестирования) 9 тестов 39 тестов ИТОГО 0,005 0,04 38 тестов Из данных, представленных в таблице 18, видно, что в случае отсутствия в исследуемой группе образцов плазмы с высокой концентрацией парвовируса, при исследовании мини-пулов из 480 образцов расход теста DPX снижается в 2,8 раза по сравнению с мини-пулом из 96 образцов. В случае выявления хотя бы одной контаминированной пробы расход теста DPX одинаков. Кроме этого, при расшифровке первично-реактивного мини-пула из 480 образцов увеличивается расход других материалов, прежде всего, контрольных материалов, на которые приходится 21,5 % от себестоимости исследования. Полученные данные о частоте выявления образцов плазмы для фракционирования с высокой концентрацией ДНК В19V (в среднем 31,2 образца 59 на 1000000 донаций или 1 : 32051), позволяют сделать заключение о том, что при использовании мини-пулов из 480 образцов первично-реактивные пулы будут встречаться с частотой около 1 : 67. При такой частоте использование мини-пула из 480 образцов представляется перспективным, но требует углубленного анализа и обязательной верификации методики. Исходя из установленной себестоимости исследования индивидуальной дозы плазмы (контейнера плазмы для фракционирования) на наличие ДНК B19V (таблица 18), можно оценить затраты, необходимые для тестирования производственного пула, состоящего из 5000 л (или 8333 контейнеров плазмы). При себестоимости исследования одного образца плазмы (т.е. контейнера плазмы для фракционирования), равного 111,42 руб., стоимость исследования производственного пула составит 928463 руб. Если плановая мощность предприятия составляет, например, 600 000 л плазмы в год, то обследовать необходимо как минимум 120 производственных пулов. В этом случае общие затраты составят более 111 млн. рублей. Для оценки доли этих затрат в общей стоимости сырья для фракционирования можно исходить из средней стоимости 1 л плазмы для фракционирования на международном рынке, которая составляет около 100€ [46] или 7000 руб. (при курсе 1€ = 70 руб). В этом случае производственный пул из 5000 л плазмы будет стоить ориентировочно 35 млн. рублей, а 120 таких пулов – 4200 млн. рублей. Соответственно, дополнительные прямые затраты на выявление возбудителя в этих объемах плазмы составят около 2,6% от общей стоимости сырья. Учитывая то, что риск критической контаминации B19V производственных пулов плазмы для фракционирования в среднем может достигать 25 % (таблица 15), эти затраты представляются экономически оправданными. Предлагаемый алгоритм исследования плазмы для фракционирования с помощью теста DPX позволяет одновременно проводить лабораторный контроль сырья и в отношении вируса гепатита А. Ранее нами был описан клинически подтвержденный случай выявления РНК вируса гепатита А у донора плазмы для 60 фракционирования. При этом затраты на обследование плазмы для фракционирования в отношении вируса гепатита А равны нулю, что еще раз подчеркивает экономическую эффективность предлагаемого нами алгоритма. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что алгоритм исследования на наличие ДНК В19V больших объемов плазмы для фракционирования с использованием теста DPX в режиме мини-пулов, состоящих из 96 образцов, позволяет гарантированно предотвратить критическую контаминацию В19V производственных пулов сырья и является экономически целесообразным. Выполненные исследования показали принципиальную возможность использования указанного теста в формате мини-пулов, состоящих из 480 образцов плазмы. Указанный подход может существенно (в 2,8 раза) снизить прямые затраты на данный вид исследования. 61 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Потребность лечебно-профилактических учреждений в препаратах крови имеет в последнее время тенденцию к увеличению, что в свою очередь, сопровождается недостатком качественного и безопасного сырья для их производства - плазмы для фракционирования [20, 22, 23]. Открытие в последнее время ряда вирусов, передающихся гемотрансмиссивным путем, стало серьезным испытанием для производителей препаратов крови на основе человеческой плазмы. Среди открытых возбудителей особое положение занимает B19V. Отмечается повсеместная распространенность вируса, а также высокая восприимчивость всех возрастных групп к данному возбудителю. Установлено, что к 70-летнему возрасту 60-70 % населения имеют антитела к B19V [6, 113]. Благодаря особенностям строения, вирус поражает в основном эритробласты, нарушая их дифференцировку после инфицирования, что в конечном итоге приводит к снижению количества эритроцитов в кровенном русле, и как следствие, к развитию различных клинических форм заболевания, начиная от инфекционной эритемы у детей и заканчивая тяжелыми формами апластической анемии, фульминантным гепатитом у лиц с иммунодефицитами [6, 62, 113, 130]. В трансфузиологической практике наиболее значимым фактором передачи возбудителя являются препараты крови на основе человеческой плазмы, в особенности препараты плазменных факторов свертывания крови VIII и IX. Показано, что 56 – 100 % партий препаратов фактора VIII, произведенных в Европе и США в период с 1993 по 1998 гг., были контаминированы ДНК В19V [61]. Объясняется это, с одной стороны, безоболочечной структурой вируса [62, 113, 130], что в значительной мере повышает устойчивость к процедурам вирусинактивации (в частности, к стерилизующей фильтрации), а с другой стороны, технологическими особенностями производства данных препаратов крови, ограничивающими в значительной мере выбор процедур, снижающих вирусную нагрузку В19V. 62 С начала 2000-х годов в качестве профилактической меры, обеспечивающей повышение безопасности сырья для производства препаратов крови, на отраслевом международном уровне введено добровольное тестирование плазмы для фракционирования на наличие ДНК В19V [103]. Основной целью данного исследования является ограничение вирусной нагрузки производственного пула не выше определенного уровня. Так, на территории Евросоюза с 2004 года законодательно установлено, что в отношении сырья для производства вирусинактивированной пулированной человеческой плазмы концентрация ДНК В19V не должна превышать 104 МЕ/мл [89]. Считается, что при большей вирусной нагрузке возбудитель может ускользать от методов вирусинактивации, используемых при фракционировании плазмы. Аналогичное требование на сегодняшний день имеется и в США [59]. Кроме того, ряд банков крови Австрии, Германии, США и ряда других стран осуществляют тестирование донорской крови на ДНК В19V [69, 72, 111]. После введения обязательного тестирования было установлено, что чатота выявления ДНК возбудителя среди обследованных доноров в разных странах составляет 0,55 – 1,9 % [26, 31, 47, 67, 69, 72, 80, 111, 117]. Процент образцов плазмы для фракционирования с высокой концентрацией ДНК B19V среди общего числа исследованных находится на уровне 0,001-0,006 [73, 74, 110]. Вопрос выявляемости возбудителя в Российской Федерации практически не изучен [26, 31]. Вместе с тем, создание отечественного современного производства препаратов крови [15] делает данную задачу чрезвычайно актуальной. В связи с этим целью настоящего исследования стало установление значимости тестирования плазмы для фракционирования на наличие и количественное определение ДНК B19V для повышения инфекционной безопасности сырья, используемого в производстве препаратов крови, прежде всего, с точки зрения обоснования алгоритма исследования больших объемов донорской плазмы, направляемой на фракционирование. Объектом исследования стали 288128 образцов плазмы для фракционирования, заготовленной методом автоматического плазмафереза, в 63 период с января 2012 года по декабрь 2014 года от 27610 доноров, проживающих на территории ряда субъектов Приволжского и Северо-Западного Федеральных округов Российской Федерации. Отбор образцов осуществляли в одноразовые вакуумные пробирки в объеме 4 мл непосредственно в плазмоцентрах, сразу же после заготовки плазмы. Отобранные образцы замораживали и при температуре минус 18 °С доставляли в лабораторию. Перед проведением исследования образцы размораживали и центрифугировали при 2000 g в течение 10 минут. Исследование образцов проводили методом ПЦР в режиме реального времени с помощью коммерческого теста DPX (Roche Diagnostics, США), предназначенного для количественного определения ДНК B19V и качественного выделения РНК вируса гепатита А, согласно инструкции производителя [105]. Для проведения ПЦР в режиме реального времени использовали автоматизированный комплекс cobas s201 (Roche Diagnostics, Швейцария), включающий в себя раскапывающую станцию для формирования пулов Hamilton MICROLAB STAR IVD Pippetor, прибор для пробоподготовки и выделения нуклеиновых кислот cobas AmpliPrep и автоматический анализатор cobas TaqMan. Образцы тестировали в мини-пулах, состоящих из 96 проб. Каждая постановка сопровождалась контролем качества исследований. Для определения концентрации ДНК B19V в положительных образцах исследование проводилось по следующему алгоритму. В случае обнаружения мини-пулов, содержащих ДНК B19V, тестирование образцов повторяли в мини-пулах из 12 образцов (суб-пулы), а затем образцы из положительных суб-пулов исследовали в режиме индивидуального тестирования. Исследование образцов с целью выявления и количественного определения антител к B19V проводили методом иммуноферментного анализа с помощью коммерческого набора реагентов «SERION ELISA classic Parvovirus B19 IgG/IgM» (Virion/Serion, Германия) в соответствии с инструкцией производителя [66]. В рамках верификации методики выявления и количественного определения ДНК B19V в плазме для фракционирования с помощью теста DPX провели оценку следующих характеристик: аналитической чувствительности, 64 точности, воспроизводимости, робастности, возможности выявления всех генотипов возбудителя и устойчивости к возможности перекрестного заражения. Полученные результаты соответствовали критериям приемлимости – показателям, заявленным производителем теста. Тем самым установлено, что данная методика может быть использована для решения поставленных задач. В частности, показатель аналитической чувствительности (LOD) на уровне 21,83 МЕ/мл (95 % ДИ 14,29 – 45,24 МЕ/мл) доказал возможность тестирования плазмы для фракционирования в мини-пулах из 96 образцов, исключая риск пропуска проб плазмы с критическим уровнем вирусной нагрузки В19V. Собственные исследования показали, что проблема обеспечения инфекционной безопасности плазмы для фракционирования в отношении В19V актуальна для Российской Федерации. Частота выявления ДНК В19V среди российских доноров плазмы для фракционирования составил 0,55%, что коррелирует с данными ранее проведенных исследований [26, 31, 47, 67, 69, 72, 80, 111, 117]. При этом в эпидемиологическом плане наиболее важным показателем является процент образцов плазмы для фракционирования с высокой вирусной нагрузкой (ДНК В19V 106 МЕ/мл и более), определяющей инфекционную опасность в плане риска контаминации производственных пулов при выпуске препаратов крови [39, 61, 73]. По результатам исследований, данный показатель в 2012 – 2014гг. находился в среднем на уровне 0,003 % (диапазон 0,002 – 0,005 %), что соответсвует данным зарубежных исследователей [73]. При исследовании образцов плазмы для фракционирования с высокой вирузной нагрузкой только в одном из девяти образцов обнаружили IgG – антитела к В19V на уровне 7,5 МЕ/мл, что, вероятно, связано с образованием иммунных комплексов, препятствующих их обнаружению методом ИФА [40]. Ранее показано, что высокая вирусная нагрузка (ДНК B19V 106 МЕ/мл и более), независимо от имеющегося уровня нейтрализующих антител (IgG-антитела к B19V) в плазме, делает процесс нейтрализации возбудителя, как правило, не эффективным, а образующиеся иммунные комплексы нестабильными, что приводит к инфекционности образцов плазмы [39]. С учетом этого, полученные 65 результаты подтверждают важность выявления образцов плазмы для фракционирования с высокой вирусной нагрузкой В19V методом ПЦР. При оценке взаимосвязи высокой вирусной нагрузки возбудителя с возрастом донора плазмы для фракционирования установили, что ДНК В19V в критическом уровне (106 МЕ/мл и более) выявлялась чаще в возрасте от 18 до 27 лет (66,7 % от всех выявленных образцов). В то же время взаимосвязь с полом донора отсутствует: образцы плазмы для фракционирования с высоким уровнем виремии В19V, заготовленной от доноров-женщин и доноров-мужчин, обнаруживались в равной мере. С учетом фактора сезонности 77,8 % от всех выявленных образцов плазмы с высокой вирусной нагрузкой В19V пришлось на весенний период, с пиком выявления в мае месяце (до 55,6 % от всех обнаруженных образцов). Полученные результаты объясняются эпидемиологическими особенностями возбудителя [62, 113, 130] и соотносятся с данными зарубежных исследователей [73]. В зависимости от региона проживания образцы с высокой концентрацией ДНК В19V выявлялись в 55,6 % случаев у доноров плазмы для фракционирования республики Татарстан, несколько реже - у доноров Кировской области (22,2 %), республики Чувашия и Костромской области (по 11,1 %). Полученные результаты следует принимать во внимание при планировании работы по заготовке плазмы для фракционирования в данных субъектах Российской Федерации. С целью оценки риска возможной контаминации производственных пулов плазмой для фракционирования с высоким уровнем вирусной нагрузки В19V разработали математическую модель, основанную на классической методике расчета риска [11] и модифицированную путем добавления в формулу поправочного коэффициента. Это позволило математически учесть вероятность попадания контаминированной производственный пул: от плазмы благоприятного для для фракционирования производства в варианта распределения (все контаминированные дозы попадают в один производственный пул) до негативного (по 1 контаминированной дозе в производственный пул). Вычислили максимальный (Rmax), средний (Rср) и минимальный (Rmin) риски 66 контаминации производственного пула плазмой для фракционирования с концентрацией ДНК В19V 106 МЕ/мл и более, учитывая определенные ранее частоты выявления ДНК В19V. В среднем риск составил 0,8 – 25 %, что автоматически может привести к контаминации до 25 % выпускаемых препаратов крови. Это соотносится с ранее проведенными исследованиями [61]. Результаты настоящего исследования указывают на необходимость принятия действенных мер, направленных на предотвращение контаминации В19V производственных пулов. Прежде всего - это разработка и внедрение в практику отечественных производителей тестирования сырья с целью исключения из процесса производства плазмы для фракционирования с высокой концентрацией ДНК В19V. Для выполнения этой задачи разработали алгоритм тестирования плазмы для фракционирования на выявление и количественное определение ДНК B19V с помощью теста DPX в мини-пулах из 96 образцов. При его разработке исходили из международных отраслевых требований [35], аналитических характеристик используемой тест-системы, размера производственного пула и данных, отражающих частоту встречаемости плазмы с высокой вирусной нагрузкой В19V, при заготовке сырья от определенной популяции доноров. Критерием выбраковки определили обнаружение в исследуемом образце плазмы для фракционирования ДНК В19V на уровне 106 МЕ/мл и более. Это с учетом мини-пула из 96 образцов позволяет исключить возможность попадания плазмы с высокой вирусной нагрузкой в производство и, как следствие, обеспечивает соблюдение международных требований по уровню виремии В19V в производственном пуле не более 104 МЕ/мл [59, 89, 103]. Результаты наблюдения за донорами в динамике показали снижение уровня ДНК В19V при контрольном обследовании ниже порогового значения, что доказывает отсутствие необходимости в отводе доноров, от которых была заготовлена плазма для фракционирования с высоким уровнем вирусной нагрузки. Экономическую эффективность разработанного алгоритма оценивали с помощью методологического подхода «анализ выгоды стоимости» [10]. 67 Проведенный анализ показал, что прямые затраты внедрения алгоритма в практику предприятия по фракционированию плазмы с плановой мощностью 600 000 л плазмы в год составят 111 млн. рублей в ценах на конец 2014 года или около 2,6 % от общей стоимости сырья – плазмы для фракционирования. Принимая во внимание, что установленный риск возможной контаминации производственных пулов плазмой с концентрацией ДНК В19V 106 МЕ/мл и более составил 0,8 – 25 %, данные затраты представляются экономически оправданными. Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют о том, что алгоритм исследования на наличие ДНК В19V больших объемов плазмы для фракционирования с использованием теста DPX в режиме мини-пулов, состоящих из 96 образцов, контаминацию целесообразным. позволяет гарантированно предотвратить критическую В19V производственных пулов и является экономически Собственные исследования показали принципиальную возможность использования указанного теста в формате мини-пулов, состоящих из 480 образцов плазмы. Указанный подход может в 2,8 раза снизить прямые затраты на данный вид исследования. 68 ВЫВОДЫ 1. Частота выявления ДНК В19V среди российских доноров плазмы для фракционирования составила 0,55 %. 2. Определен процент образцов плазмы для фракционирования с высокой вирусной нагрузкой В19V (106 МЕ/мл и более), представляющей основную инфекционную опасность в отношении возможной контаминации производственных пулов, среди общего число исследованных образцов. В Российской Федерации данный показатель составил в среднем 0,003 %. Высокая концентрация ДНК В19V выявляется у доноров плазмы для фракционирования чаще весной, с пиком в мае (р < 0,05). Сила связи выявления высокой вирусной нагрузки В19V с полом, возрастом доноров, а также регионом проживания высокая, но статистически незначима, что объясняется эпидемиологией возбудителя. 3. Предложена математическая модель расчета риска возможной контаминации производственных пулов плазмой для фракционирования с вирусной нагрузкой В19V 106 МЕ/мл и более, учитывающая возможное распределение данной плазмы по пулам. Риск возможной контаминации производственных пулов определен в среднем на уровне 0,8 – 25 %. 4. Оптимальной методикой для разработки алгоритма тестирования больших объемов плазмы для фракционирования на В19V по результатам проведенной верификации признана методика выявления и количественного определения ДНК В19V в плазме для фракционирования методом ПЦР в режиме реального времени с помощью теста DPX в пулах из 96 образцов. 5. Разработан алгоритм исследования плазмы для фракционирования на выявление и количественное определение ДНК В19V с помощью теста DPX в пулах из 96 образцов. Установлен критерий выбраковки – это выявление образцов с высокой концентрацией ДНК В19V106 МЕ/мл и более. Определена тактика в отношении донора плазмы для фракционирования, которая не предусматривает отвода от донорства. 69 6. Прямые затраты внедрения в практику алгоритма исследования плазмы для фракционирования на выявление и количественное определение ДНК В19V с помощью теста DPX в пулах из 96 образцов составят около 2,6 % от стоимости сырья, что с учетом установленного риска возможной контаминации производственных пулов представляется экономически оправданным. 70 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. В целях обеспечения инфекционной безопасности плазмы для фракционирования в отношении В19V предлагается внедрение в практику отечественной службы крови алгоритма исследования образцов плазмы для фракционирования на наличие ДНК В19V с целью исключения из производственной цепочки плазмы с высоким уровнем виремии. 2. Для применения на практике алгоритма исследования на наличие ДНК В19V больших объемов плазмы для фракционирования может быть рекомендована методика выявления и количественного определения ДНК В19V методом ПЦР в режиме реального времени с помощью тест-системы cobas TaqScreen DPX Test в мини-пулах из 96 образцов. 71 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВГА – вирус гепатита А ВГВ – вирус гепатита В ВГС – вирус гепатита С ВИЧ – вирус иммунодефицита человека ВОЗ – Всемирная Организация Здравоохранения ДИ – доверительный интервал ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота ЕДКЛС – Европейский Директорат по контролю качества лекарственных средств ЛКК – лаборатория контроля качества МЕ – международные единицы мкм – микрометр мл - миллилитр нм - нанометр п.н. – пара нуклеотидов ПЦР – полимеразная цепная реакция B19V – парвовирус В19 HBsAg – поверхностный антиген вируса гепатита В ICTV – International Committee on Taxonomy of Viruses (Международный комитет по таксономии вирусов) IgG – иммуноглобулин класса G IgM – иммуноглобулин класса М LOD – limit of detection (предел определения) NS1 – неструктурный белок B19V PPTA – Plasma Protein Therapeutics Association (Ассоциация переработчиков плазмы) SD – плазма – плазма, обработанная сольвент/детергентом VP1 – структурный белок 1-го типа B19V VP2 - структурный белок 2-го типа B19V 72 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Антипова, А.Ю. Распространение парвовирусной инфекции в Северо- Западном Федеральном округе России [Текст] / А.Ю. Антипова, И.Н. Лаврентьева, М.А. Бичурина [и др.] // Журнал инфектологии. – 2011. – Т.3. – № 4. – С. 44-48. 2. Башмакова, М.А. Парвовирусная инфекция В19 при беременности. Свойства вируса, клиническая картина заболевания, патогенез, диагностика [Текст] / М.А. Башмакова, А.М. Савичева // Пренатальная диагностика. – 2005. – №2. – С. 94-96. 3. Вектор-Бест. Инструкция по применению. Набор реагентов для выявления ДНК Parvovirus B19 методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени [Текст] / Вектор-Бест // Новосибирск: Вектор-Бест, 2013. – 16 с. 4. ГОСТ Р 52249-2009 Правила производства и контроля качества лекарственных средств [Текст]. – М: Стандартинформ, 2009. – 246 с. 5. ДНК-Технология. Инструкция по применению набора реагентов для определения ДНК Parvovirus B19 методом полимеразной цепной реакции [Текст] / ДНК-Технология // Москва: ДНК-Технология, 2013. – 10 с. 6. Дудина, К.Р. Парвовирусная В19-инфекция и ее клинические проявления [Текст] / К.Р. Дудина, О.О. Знойко, Н.Д. Ющук // Терапевтический архив. – 2007. – № 11. – С. 75-78. 7. Жибурт, Е.Б. Инактивация вирусов в дозе плазмы для переливания [Текст] / Е.Б. Жибурт // Трансфузиология. – 2007. – №3-4. – С.40-46. 8. Зубкова Н.В. Биотехнологические аспекты эффективной и безопасной переработки донорской плазмы: проблемы и перспективы [Текст] / Н.В. Зубкова // Биопрепараты. – 2014. - №1. – С. 4-10. 9. Зубкова, Н.В. Сольвент-детергентный метод инактивации вирусов в технологии производства иммуноглобулинов (обзор литературы) [Текст] / Н.В. Зубкова // Гематологияи трансфузиология. – 2010. – №2. – С.39-44. 73 10. Кишкун, А.А. Лабораторные информационные системы и экономические аспекты деятельности лаборатории [Текст] / А.А. Кишкун, А.Л. Гузовский // М: Лабора, 2007. – 256с. 11. Ланг, Т.А. Как описывать статистику в медицине. Аннотированное руководство для авторов, редакторов и рецензентов [Текст] / Т.А. Ланг, М. Сесик; пер. с англ. под ред. В.П. Леонова. – М.: Практическая медицина, 2011. – 480 с. 12. Лушнова, И.В. Парвовирусная В19 инфекция [Текст] / И.В. Лушнова // Педиатр. – 2010. – № 2. – С. 115-118. 13. Некрасова, Е.С. Анемия, вызванная инфекционным поражением плода: обзор литературы и описание клинических наблюдений [Текст] / Е.С. Некрасова, Е.С. Синьковская // Пренатальная диагностика. – 2010. – №2. – С. 130-138. 14. О состоянии и мерах по совершенствованию лабораторного обеспечения диагностики и лечения пациентов в учреждениях Российской Федерации [Электронный ресурс]: приказ Минздрава РФ № 380 от 25.12.1997 // Здравоохранение. – 1998. – № 6-9. – Сведения доступны также в информ.правовой системе «Консультант плюс». 15. О строительстве в г. Кирове завода по производству препаратов крови [Электронный ресурс] : распоряжение Правительства РФ № 516-Р от 23.04.2003 // Собр. Законодательства Рос. Федерации. – 2004. – 03 мая (№ 18). – С. 1778. – Сведения также доступны в информ.-правовой системе «Консультант плюс». 16. Об утверждении общих фармакопейных статей и фармакопейных статей [Электронный ресурс]: приказ Минздрава России № 768 от 21.11.2014 // Сведения доступны в информ-правовой системе «Консультант плюс». 17. Об утверждении порядка медицинского обследования донора крови и ее компонентов [Электронный ресурс]: приказ Минздрава России № 364 от 14.09.2001 (в ред. приказов Минздравсоцразвития РФ № 175н от 16.04.2008 и № 261н от 06.06.2008) // Сведения доступны в информ-правовой системе «Консультант плюс». 74 18. Об утверждении Правил организации производства и контроля качества лекарственных средств [Электронный ресурс]: приказ Минпромторга России № 916 от 14.06.2013 // Российская газета (специальный выпуск). – 2013. – 8 июня (№ 252/1) - Сведения также доступны в информ-правовой системе «Консультант плюс». 19. Оприщенко, С.А. Лечебные препараты крови в современной медицине [Текст] / С.А. Оприщенко, В.В. Захаров, В.М. Русанов – М: Медпрактика, 2011. – 252 с. 20. Оприщенко, С.А. Международные регулирующие документы и стандарты службы крови и проивзодства препаратов плазмы [Текст] / С.А. Оприщенко, В.В. Захаров, В.М. Русанов. – М: Медпрактика-М, 2008. – 416 с. 21. Прогноз социально-экономического развития Российской Федерации на 2015 год и на плановый период 2016 – 2017 годов (разработан Минэкономразвития Российской Федерации) [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://economy.gov.ru/minec/activity/sections/macro/prognoz/201409261. 22. Русанов, В.М. Эффективность использования донорской плазмы в службе крови России [Текст] / В.М. Русанов // Вестник службы крови России. – 2009. – № 2. – С. 3-6. 23. Тхай, С.В. Пути решения проблемы обеспечения российского производства препаратов крови плазмой для фракционирования [Текст] / С.В. Тхай, В.В. Захаров, В.М. Русанов // Вестник службы крови России. – 2012. – № 1. – С. 44-48. 24. ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора. Инструкция по применению набора реагентов для выявления и количественного определения ДНК Parvovirus B19 в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «АмплиСенс Parvovirus B19-FL» [Текст] / ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора // Москва: ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, 2013. – 27 с. 25. Февралева, И.С. Мультиплексная диагностика вирусов гепатитов В, С и парвовируса В19 у больных, получающих множественные гемотрансфузии 75 [Текст] / И.С. Февралева, О.А. Глинщикова, Т.В. Макарик [и др.] // Гематология и трансфузиология. – 2008. – № 4. – С. 54-56. 26. Филатова, E.В. Выявление маркеров парвовируса В19 в образцах крови доноров [Текст] / Е.В. Филатова, Н.В. Зубкова, Н.А. Новикова [и др.] // Журн. Микробиол. – 2010. – №5. – С. 67-70. 27. Филатова, Е.В. Биохимические и молекулярно-генетические исследования парвовируса В19 при оценке безопасности препаратов альбумина и иммуноглобулина: автореф. дис. … канд. биол. наук: 03.01.04 / Филатова Екатерина Викторовна. – М., 2013. – 25 с. 28. Филатова, Е.В. Оценка безопасности производства препаратов альбумина в отношении парвовируса В19 [Текст] / Е.В. Филатова, Н.В. Зубкова, Т.В. Короткова, С.А. Гальговская // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. – 2012. – №1. – С. 96-99. 29. ФС 42-0091-02. Плазма для фракционирования [Текст]: [утв. Минздравом России. Ввод. впервые 27 сен. 2002г.]. – М: Стандартинформ. – 2002. – 9 с. 30. Шипулина, О.Ю. Разработка тест-системы на основе ПЦР в реальном времени для выявления ДНК парвовируса В19 и ее апробация на контрольной панели QCMD и клиническом материале [Текст] / О.Ю. Шипулина, Э.А.Кузнецова, Г.А. Шипулин // Молекулярная диагностика инфекционных болезней: Материалы Международной науч.-практ. конф. Минск, 17-18 мая 2007. – Минск,2007. – С. 30-31. 31. Элижбаева, М.А. Выявление парвовируса В19 в крови российских доноров [Текст] / М.А. Элижбаева, И.С. Февралева, О.А. Глинщикова [и др.] // Гематология и трансфузиология. – 2011. – № 2. – С. 10-13. 32. Abe, K. Characterization of erythrovirus B19 genomes isolated in liver tissues from patients with fulminant hepatitis and biliary atresia who underwent liver transplantation [Текст] / K. Abe, T. Kiuchi, K. Tanaka [et al.] // Int. J. Med. Sci. – 2007. – № 2. – P. 105-109. 76 33. Anderson, M.J. Diagnosis of human parvovirus infection by dot-blot hybridization using cloned viral DNA [Текст] / M.J. Anderson, S.E. Jones, A.C. Minson // J. Med. Virol. – 1985. – №2. – P. 163-172. 34. Anonymous, Parvovirus B19 [Текст] / Anonymous // Bundesgesundhitsblatt – Gesundheitsforschung – Gesundheitsschutz. – 2010. - №9. – P. 944-956. 35. Baylis, S.A. Evaluation of different assays for the detection of parvovirus B19 DNA in human plasma [Текст] / S.A. Baylis, N. Shah, P.D. Minor // J.Virol. Methods. – 2004. Vol.121 – P. 7-16. 36. Baylis, S.A. Standartization of nucleic acid amplification technique (NAT)-based assays for different genotypes of parvoviruses B19: a meeting summary [Текст] / S.A. Baylis // Vox Sang. – 2008. – Vol.94. – P. 74-80. 37. Blümel, J. Parvovirus B19 – revised [Текст] / J. Blümel, R. Burger, C. Drosten [et al.] // Transfus. Med. Hemother. – 2010. – Vol.37. – P. 339-350. 38. Blumel, J. Characterization of parvovirus B19 genotype 2 in KU812Ep6 cells [Текст] / J. Blumel, A.M. Eis-Hubinger, A. Stuhler [et al.] // J. Virol. – 2005. – Vol.79. – P. 14197-14206. 39. Bonvicini, F. Molecular testing for detection of in vitro infectivity of plasma pools contamined with B19 virus [Текст] / F. Bonvicini, G. Gallinella, M. Gricca [et al.] // J. Med. Virol. – 2004. Vol. 74. – P. 272-276. 40. Bredl, S. False-negative serology in patient with acute parvovirus B19 infection [Текст] / S. Bredl, A. Plentz, J.J. Wenzel [et al.] // J. Clin. Virol. – 2011. – Vol. 51. – P. 115 – 120. 41. Brown, K.E. Erythrocyte P antigen: cellular receptor for B19 parvovirus [Текст] / K.E. Brown, S.M. Anderson, N.S. Young // Science. – 1993. – №5130. – P. 114-117. 42. Brown, K.E. Parvovirus B19: implications for transfusion medicine. Summary of a workshop [Текст] / K.E. Braun, N.S. Young, B.M. Alving [et al.] // Transfusion. – 2001. – №1. – P. 130-135. 43. Brown, K.E. Parvoviruses and blood transfusion [Текст] / K.E. Brown, P. Simmonds // Transfusion. – 2007. – Vol.47. – P. 1745-1750. 77 44. Brown, K.E. Resistance to parvovirus B19 infection-due to lack of virus receptor (erythrocyte P antigen) [Текст] / K.E. Brown, J.R. Hibbs, G. Gallinella [et al.] // New Engl. J. Med. – 1994. – №17. – P. 1192—1196. 45. Burnouf, T. Modern plasma fractionation [Текст] / T. Burnouf // Transfus. Med. Rev. – 2007. – Vol. 21. – P. 101-117. 46. Burnouf, T. Plasma proteins: unique biopharmaceuticals-unique economics [Текст] / T. Burnouf // Pharmaceutic Policy Law. – 2005–2006. – Vol.7. – P. 209–218. 47. Candotti, D. Identification and characterization of persistent human erythrovirus infection in blood donor samples [Текст] / D. Candotti, N. Etiz, A. Parsyan [et al.] // J. Virol. – 2004. – № 22. – P. 12169-12178. 48. Compston, L.I. Multiplex real-time PCR for the detection and quantification of latent and persistent viral genomes in cellular or plasma blood fractions [Текст] / L.I. Compston, F. Sarkobie, C. Li [et al.] // J. Virol. Methods. – 2008. – №1. – P. 47-54. 49. Corcoran, A. Advances in the biology, diagnosis and host-pathogen interactions of parvovirus B19 [Текст] / A. Corcoran, S. Doyle // J. Med. Microbiol. – 2004. – Vol.53. – P. 459-475. 50. Corcoran, A. Improved detection of acute parvovirus B19 infection by immunoglobulin M EIA in combination with a novel antigen EIA [Текст] / A. Corcoran, S. Kerr, G. Elliot [et al.] // Vox Sang. – 2007. – Vol.93. – P. 216-222. 51. Cossart, Y.E. Parvovirus-like particles in human sera [Текст] / Y.E. Cossart, A.M. Field, B. Cant [et al.] // Lancet. – 1975. – № 7898. – P. 72-73. 52. Doyle, S. The immune response to parvovirus B19 exposure in previously seronegative and seropositive individuals [Текст] / S. Doyle, A. Corcoran // J. Infect. – 2006. – Vol.194. – P. 154-158. 53. Enders, M. Current epidemiological aspects of human parvovirus B19 infection during pregnancy and childhood in te western part of Germany [Текст] / M. Enders, A. Weidner, G. Enders // Epidemiol. Infect. – 2007. – Vol.135. – P. 563-569. 54. Erdman, D.D. Human parvovirus B19 specific IgG, IgA, and IgM antibodies and DNA in serum specimens from persons with erythema infectiosum [Текст] / D.D. Erdman, M.J. Usher, C. Tsou [et al.] // J. Med. Virol. – 1991. – №2. – P. 110-115. 78 55. European Medicines Agency, Guidance on plasma-derivated medicinal products [Электронный ресурс] // EMA/CHMP/BWP/706271/2010. European Medicines – Agency. – Режим 2010. – доступа: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/documentlibrary/Scientificguideline. 56. Exindari, M. Epidemiological and clinical characteristics of human parvovirus B19 infections during 2006-2009 in Northern Greece [Текст] / Hippokratia. – 2011. – №15. – P. 157-160. 57. Farrugia, A. Globalization and blood safety [Текст] / A. Farrugia // Blood Rev. – 2009. – Vol.23. – P. 123-128. 58. Farshid, M. Viral safety of plasma-derivated products [Текст] / M. Farshid // J. Pharm. Sci. Technol. – 2011. Vol.65. – P. 737-753. 59. Food and Drug Administration, U.S. Departament of Health and Human Services Guidance for Indastry. Nucleic acid testing to reduce the possible risk of human parvovirus B19 transmission by plasma-derived products [Электронный ресурс]. / FDA: U.S. Departament of Health and Human Services // Режим доступа: http://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformati on/Guidances/default.html. 60. Franssila, R. T helper cell-mediated in vitro responses of recently and remotely infected, subjects to a candidate recombinant, vaccine for human parvovirus B19 [Текст] / R. Fransilla, K. Hokynar, K. Hedman // J. Infect. Dis. 2001. – №5. – P. 805809. 61. Geng, Y. Parvovirus B19 in Factor VIII concetrates: effects of manufacturing procedures and B19 screening by nucleic acid testing [Текст] / Y. Geng, C-G. Wu, S.P. Bhattaacharyya [et al.] // Transfusion. – 2007. – Vol.47. – P. 883-889. 62. Heegaard, E.D. Human parvovirus B19 [Текст] / E.D. Heegaard, K.E. Brown // Clin. Microbiol. Rev. – 2002. – №7. – P. 485-505. 63. Hitzler, W.E. Prevalence of human parvovirus B19 in blood donors as determined by a haemagglutination assay and verified by the polymerase chain reaction [Текст] / W.E. Hitzler, S. Runkel // Vox Sang. – 2002. – Vol.82. – P. 18-23. 79 64. Hokynar, K. A new parvovirus genotype persistent in human skin [Текст] / K. Hokynar, M. Soderlund-Venermo, M. Pesonen [et al.] // Virology. – 2002. – Vol.302. – P. 224-228. 65. Hourfar, М.К. Recipients potentially infected with parvovirus B19 by red blood cell products [Текст] / M.K. Hourfar, U. Mayr-Wohlfart, A. Themann [et al.] // Transfusion. – 2011. – №1. – P. 129-136. 66. Institut Virion/Serion GmbH, Инструкция по применению набора SERION ELISA classic Parvovirus B19 IgG; V.15.13/04-1. [Текст] / Institut Virion/Serion GmbH // Вюрцбург: Institut Virion/Serion GmbH, 2013. – 22 с. 67. Juhl, D. Parvovirus B19 infections and blood counts in blood donors [Текст] / D. Juhl, D. Steppat, S. Görg, H. Hennig // Transfus. Med. Hemother. – 2014. – Vol.41. – P. 52-59. 68. Katsuyama, Y. Butyrol-arginine as a potent virus inactivation agent [Текст] / Y. Katsuyama, H. Yamasaki, K. Tsujimoto // J. Pharm. – 2008. – Vol.361. – P. 92-98. 69. Ke, L. The prevalence of human parvovirus B19 DNA and antibodies in blood donors from four Chinese blood centers [Текст] / L. Ke, M. He [et al.] // Transfusion. – 2011. – Vol.51. – P.1909-1918. 70. Kerr, J.R. Antibodies to parvovirus B19 non-structural protein are associated with chronic but not acute arthritis following B19 infection [Текст] / J.R. Kerr, V.S. Cunniffe // Rheumatology (Oxford). – 2000. – №8. – P. 903-908. 71. Kleinman, S.H. A linked donor-recipient study to evaluate parvovirus В19 transmission by blood component transfusion [Текст] / S.H. Kleimann, S.A. Glynn, TH. Lee [et al.] // Blood. – 2009. – №17. – P. 3677-3683. 72. Kleinman, S.H. Prevalence and quantitation of parvovirus B19 DNA levels in blood donors with a sensitive polymerase chain reaction screening assay [Текст] / S.H. Kleimann, S.A. Glynn, T-H. Lee [et al.] // Transfusion. – 2007. – № 10. – P. 1756— 1764. 73. Kooistra, K. Epidemiology of high-level parvovirus B19 viraemia among Dutch blood donors 2003-2009[Текст] / K. Kooistra, H.J. Mesman, M. De Waal [et al.] // Vox Sanguinis. – 2011. – Vol. 100 – P. 261-266. 80 74. Kopellman, M.H. Real-time polymerase chain reaction detection of parvovirus B19 DNA in blood donation using a commercial and an in-house assay [Текст] / M.H. Kopellman, P. Van Swieten, H.T.M. Cuijpers // Transfusion. – 2011. – Vol. 51 – P. 1346-1354. 75. Koppelman, M.H. Multicenter evaluation of a commercial multiplex polymymerase chain reaction test for screening plasma donations for parvovirus B19 DNA and hepatitis A virus RNA [Текст] / M.H. Koppelman, H.T. Cuijpers, S. Wessberg [et al.] // Transfusion. – 2012. – Vol.52. – P. 1498-1508. 76. Koppelman, M.H. Parvovirus B19 genotypes 1 and 2 detection with real-time polymerase chain reaction assays [Текст] / M.H. Koppelman, I.G. Rood, J.F. Fryer [et al.] // Vox Sang. – 2007. – Vol.93. – P. 208-215. 77. Koziol, D. Nosocomial human parvovirus В19 infection: lack of transmission from a chronically infected patient to hospital staff [Текст] / D. Koziol, G. Kurtzman, J. Ayub [et al.] // Infect. Control. Hosp. Epidemiol. – 1992. – №6. – P. 343-348. 78. Kоеk, W.С. А synthetic parvovirus B19 capsid protein can replace viral antigen in antibody-capture enzyme immunoassays [Текст] / W.C. Koek // J. Virol. Methods. – 1995. – №1. – P. 67-82. 79. Lebing, W. Properties a new intravenous immunoglobulin (IGIV-C, 10%) produced by virus inactivation with caprylate and column chromatography [Текст] / W. Lebing, K.M. Remington, C. Schreiner, H.I. Paul // Vox Sang. – 2003. – Vol.84. – P. 332-338. 80. Lėvican, J. Parvovirus B19 among blood donors from three hospitals in Santiago, Chile [Текст] / J. Lėvican, M. Torres, N. Gaggero [et al.] // Rev. Med. Chil. – 2011. – Vol.139. – P. 143-149. 81. Liefeldt, D. Reccurent high level parvovirus B19/genotype 2 viremia in a renal transplantant recipient analyzed by real-time PCR for simultaneous detection of genotypes 1 to 3 [Текст] / D. Liefeldt, A. Plentz, B. Klempa [et al.] // J. Med. Virol. – 2005. – Vol.75. – P. 161-169. 81 82. Liumbruno, G.M. Solvent/detergent plasma: pharmaceutical characteristics and clinical experience [Текст] / G.M. Liumbruno, M. Franchini // Thromb Thrombolysis. – 2015. – Vol.39. – P. 118-128. 83. Lunardi, C. Human parvovirus B19 infection and autoimmunity [Текст] / C. Lunardi, E. Tinazzi, C. Bason [et al.] // Autoimmun. Rev. - 2008. – № 2. – P. 116-120. 84. Marano, G. Human parvovirus B19 and blood products safety: a tale of twenty years of improvents [Текст] / G. Marano, S. Vaglio, S. Pupella [et al.] // Blood Transfus. – 2015. –Vol.13. – P. 184-196. 85. Martin, T.D. IGIV: contents, properties and methods of industrial productionevolving closer to a more physiologic product [Текст] / T.D. Martin // Int. Immunopharmacol. – 2006. – Vol.6. – P. 517-522. 86. Matsukura, H. Persistent infection by human parvovirus B19 in qualified blood donors [Текст] / H. Matsukura, S. Shibata, Y. Tani [et al.] // Transfusion. – 2008. – Vol.48. – P. 1036-1037. 87. Mitchell, L.A. Lymphocyte recognition of human parvovirus В19 non-structural (NS1) protein: associations with occurrence of acute and chronic arthropathy? [Текст] / L.A. Mitchell, R. Leong, K.A. Rosenke // J. Med. Microbiol. – 2001. – №7. – P. 627635. 88. Miyamoto, K. Outbreak of human parvovirus В19 in hospital workers [Текст] / K. Miyamoto, M. Ogami, Y. Takahashi [et al.] // J. Hosp. Infect. – 2000. – №3. – P. 238241. 89. Monograph of human plasma (pooled and treated for virus inactivation) [Текст] / Strasburg: European Pharmacopeia 7th Edition. – 2010. – 07/2010 – 1646. 90. Monograph of human plasma for fractionation [Текст] - Strasburg: European Pharmacopeia 7th Edition. – 2010. – 07/2010 – 0853. 91. Mori, J. Dot blot hybridization assay of B19 virus DNA in clinical specimens [Текст] / J. Mori, A.M. Field, J.P. Cohen [et al.] // J. Clin. Microbiol. – 1989. – №35. – P. 459-464. 92. Mossong, J. Parvovirus B19 infection in five European countries: seroepidemiology, force of infection and maternal risk of infection [Текст] / J. 82 Mossong, N. Hens, V. Friederichs [et al.] // Epidemiol. Infect. – 2008. – Vol.136. – P. 1059-1068. 93. Müller, M.M. Evaluation of two, commercial, multi-dye, nucleic acid amplification technology tests, for HBV/HCV/HIV-1/HIV-2 and plasma for further manufacture [Текст] / M.M. Müller, M.I.G. Fraile, M.K. Hourfar [et al.] // Vox Sanquinis. – 2013. – Vol.104. – P. 19-29. 94. Mundt, J.M. Chemical and biological mechanisms of pathogen reduction technologies [Текст] / J.M. Mundt, L. Rouse, J. van den Bossche, R.P. Goodrich // Photochem. Photobiol. – 2014. – Vol.90. – P.957-964. 95. National Institute for Biological Standarts and Control, IFU 1st WHO International Reference Panel Parvovirus B19 Genotypes for NAT based assays NIBSC code: 09/110; version 1.0. [Текст] / National Institute for Biological Standarts and Control // Potters Bar (Hertfordshire): NIBSC, 2013 – 2 с. 96. National Institute for Biological Standarts and Control, IFU 2nd WHO International Standart for Parvovirus B19 DNA for Nucleic Acid Amplification (NAT) Assay NIBSC Code: 99/802; version 2.0. [Текст] / National Institute for Biological Standarts and Control // Potters Bar (Hertfordshire): NIBSC, 2013. – 2 с. 97. Nguyen, Q.T. Detection of an erythrovirus sequence distinct from B19 in a child with acute anemia [Текст] / Q.T. Nguyen, C. Sifer, V. Schneider [et al.] // Lancet. – 1998. – Vol.352. – P. 1524. 98. Nguyen, Q.T. Identification and characterization of a second novel human erythrovirus variant, A6 [Текст] / Q.T. Nguyen, S. Wong, E.D. Heegaard E.D. [et al.] // Virology. – 2002. – Vol.301. – P. 374-380. 99. Norja, P. Bioportfolio: lifelong persistence of variant and prototypic erythrovirus DNA genomes in human tissue [Текст] / P. Norja, K. Hokynar, L.M. Aaltonen [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2006. – Vol.103. – P. 7450-7453. 100. Norya, P. Parvovirus transmission by blood products – a for cause for concern? [Текст] / P. Norya, R. Lassila, M.Makris // B.J.Haematol. – 2012. – Vol.159. – P. 385393. 83 101. Plentz, A. Exposure of hematologic patient to parvovirus B19 as a contaminant of blood cell preparations and blood products [Текст] / A. Plentz, J. Hahn, A. Knoll [et al.] // Transfusion. – 2005. – Vol.45. – P. 1811-1815. 102. PPTA IQPP Viral Marker Standart ver.4.1. [Электронный ресурс] // PPTA. – 2009. – Режим доступа: http://www.pptaglobal.org/images/IQPP_ViralMarker_V4_1.pdf. 103. PPTA QSEAL NAT Testing Standart ver.2.0 [Электронный ресурс] // PPTA. – 2013. – Режим доступа: http://www.pptaglobal.org/images/qseal/NATTestingV2.pdf. 104. Radocevich, M. Intravenous immunoglobulin G: trends in production methods, quality control andqulity assurance [Текст] / M. Radocevich, T. Burnouf // Vox Sang. – 2010. – Vol.98. – P.12-28. 105. Roche Molecular Systems, Inc. IFU cobas TaqScreen DPX test for use on the cobas s201 system; version 3.0. [Текст] / Roche Molecular Systems, Inc. // Branchburg (NJ): Roche Molecular Systems., 2013. – 32 с. 106. Röhrer, C. Seroprevalence of parvovirus B19 in the Germany [Текст] / C. Röhrer, B. Gärtner, A. Sauerbrei [et al.] // Epidemiol. Infect. – 2008. – Vol.136. – P. 1564-1575. 107. Sakata, H. Efficiency of donor screening for human parvovirus B19 by the receptor-mediated hemagglutination assay method [Текст] / H. Sakata, H. Ihara, S. Sato [et al.] // Vox Sang. – 1999. – Vol.77. – P. 197-203. 108. Saldanha, J. Establishment of the first World Health Organization International Standard for human parvovirus B19 DNA nucleic acid amplification techniques [Текст] / J. Saldanha, N. Lelie, M.W. Yu [et al.] // Vox Sang. – 2002. – Vol.82. – P. 24-31. 109. Sanabanl, S. Sequence variability of human erythroviruses present in bone marrowof Brazilian patients with various parvovirus B19-related hematological symptoms [Текст] / S. Sanabanl, W.K. Neto, J. Pereira [et al.] // J. Clin. Microbiol. – 2006. – Vol.44. – P. 604-606. 110. Schmidt, I. Parvovirus B19 DNA in plasma pools and plasma derivates [Текст] / I. Schmidt, J. Blümel, H. Seitz [et al.] // Vox Sang. – 2001. – Vol. 81. – P. 228-235. 84 111. Schmidt, M. Blood donor screening for parvovirus B19 in Germany and Austria [Текст] / M. Schmidt, A. Themann, C. Drexler [et al.] // Transfusion. – 2007. – № 10. – P. 1775-1782. 112. Servant, A. Genetic diversitywithin human erythroviruses: identification of three genotypes [Текст] // A. Servant, S. Laperche, F. Lallemand [et al.] // J.Virol. – 2002. – Vol.76. – P. 9124-9134. 113. Servant-Delmas A. Advances in human B19 erytrovirus biology [Текст] / A. Servant-Delmas, J.J. Lefrere, F. Morinet, S. Pillet // J. Virol. – 2010. – Vol.84. – P. 9658 – 9665. 114. Servey, J.T. Clinical presentations of parvovirus B19 infection [Текст] / J.T. Servey, B.V. Reamy, J. Hodge // Am. Fam. Fhysician. 2007. – Vol.75. – P. 373-377. 115. Shade, R.O. Nucleotide sequence and genome organization of human parvovirus B19 isolated from the serum of a child; during aplastic crisis [Текст] / R.O. Shade, M.C. Blundell, S.F. Cotmore [et al.] // J. Virol. – 1986. – №3. – P. 921-936. 116. Shiraishi, H. Laboratory infection with human parvovirus B19 [Текст] / H. Shiraishi, T. Sasaki, M. Nakamura [et al.] // J. Infect. – 1991. – №3. – P. 308-310. 117. Slavov, S.N. Molecular and phylogenetic analyses of human Parvovirus B19 isolated from Brazilian patients with sickle cells disease and β-thalassemia major and healthy blood donors [Текст] / S.N. Slavov, S.K. Haddad, A.C. Silva-Pinto [et al.] // J. Med. Virol. – 2012. – Vol.84. – P. 1652-1665. 118. Soucie, J.M. Evidence for the continued transmission of parvovirus B19 in patients with bleeding disorders treated within plasma-derivated factor concentrates [Текст] / J.M.Soucie, P.E. Monahan, R. Kulkarni [et al.] // Transfusion. – 2013. – Vol.53. – P.1143-1144. 119. Toan, N.L. Phylogenetic analysis of human parvovirus B19, indicating two subgroups of genotype 1 in Vietnamese patients [Текст] / N.L. Toan, A. Duechting, P.G. Kremsner [et al.] // J. Gen. Virol. – 2006. – Vol.86. – P. 2941-2949. 120. Van Beers-Tas, M.H. Pathogenesis of parvovirus infections in children [Текст] / M.H. van Beers-Tas, J. Heidema // Virol. Mycol. – 2013. – №2. – P. 1. 85 121. Virus Taxonomy: 2009 Release (9th Report) [Электронный ресурс] // International Committee on Taxonomy of Viruses. – 2009. – 9th Report. – Режим доступа: http://www.ictvonline.org/virusTaxonomy.asp?version=2009. 122. von Poblotzki, A. Antibodies to parvovirus В19 NS-1 protein in infected individuals [Текст] / A. von Poblotzki, A. Gigler, B. Lang [et al.] // J. Gen. Virol. – 1995. – Vol.76. – P. 519-527. 123. Vyse, A.J. The burden of parvovirus B19 infection in women of childbearing age in England and Wales [Текст] / A.J. Vyse, N.J. Andrews, L.M. Hesketh [et al.] // Epidemiol. Infect. – 2007. – № 8. – P. 1354-1362. 124. Wakamatsu, C. Screening of blood donors for human parvovirus B19 and characterization of the results [Текст] / C. Wakamatsu, F. Takakura, E. Kojima [et al.] // Vox Sang. – 1999. – №1. – P. 14-21. 125. Weimer, T. High-titer screening PCR: a successful strategy for reducing the parvovirus B19 load in plasma pools for fractionation [Текст] / T. Weimer, S. Streichert, C. Watson [et al.] // Transfusion. – 2001. – Vol.41. – P. 1500-1504. 126. WHO, Guidance Document on Viral Inactivation and Removal Procedure Intended to Assure the Viral Safety of Blood Plasma Products. WHO Technical Report. Series №924. Annex A [Электронный ресурс] // WHO. – 2004. – Режим доступа: http://www.who.int/bloodproducts/publications/WHO_TRS_924_A4.pdf. 127. WHO, Recommendation for the production, control and regulation of human plasma for fractionation. Fifty-sixth Report [Электронный ресурс] // WHO. – 2007. – Режим доступа: http: www.who.int/biologicals/expert_committee/Full%20Text%20TRS941.pdf. 128. WHO, Screening donated blood for transfusion-transmissible infection. WHO Recommendation [Электронный ресурс] // WHO. – 2010. – Режим доступа: http:// www.who.int/bloodsafety/ScreeningDonatedBloodforTransfusion.pdf. 129. Wu, C.G. Parvovirus B19 transmission by a high-purity factor VIII concentrate [Текст] / C.G. Wu, B. Mason, J. Jong [et al.] // Transfusion. – 2005. – Vol.45. – P. 1003-1010. 86 130. Young N.S. Parvovirus B19 [Текст] / N.S. Young, K.E. Brown // N. Engl. J. Med. – 2004. Vol.350. – P. 586-597. 131. Zhi, N. Molecular and functional analyses of a human parvovirus B19 infectious clone demonstrates essential roles for NS1, VP1, and the 11-kilodalton protein in virus replication and infectivity [Текст] / N. Zhi, I.P. Mills, J. Lu [et al.] // J. Virol. – 2006. – Vol.80. – P. 5941-5950. 87 Приложение 1 ФГБУ РМНПЦ «Росплазма» ФМБА России Б-П04-41 Согласие донора Я ________________________________________________ паспорт серия ________ номер __________________________________выдан___________________________________________ ___________________________________ согласен, что перед каждой сдачей плазмы крови человека должен пройти медицинское обследование, в том числе сдать анализ крови, и с тем, что при положительных результатах серологического исследования и исследования методом ПЦР_____ ФГБУ РМНПЦ «Росплазма» ФМБА России, ____________________________________ (наименование организации) (наименование филиала) направляет эти данные (информацию, составляющую врачебную тайну) в органы, осуществляющие государственный санитарно-эпидемиологический надзор, в организации, оказывающие медицинскую помощь при инфекционных заболеваниях, выявленных при серологическом исследовании, организации, осуществляющие деятельность в сфере обращения донорской крови и (или) её компонентов. В целях решения вопроса о допуске или отводе от донорства я доверяю указанной организации право запрашивать и получать информацию, составляющую врачебную тайну о состоянии моего здоровья или персональные данные, в организациях здравоохранения, органах исполнительной власти и других организациях. Я даю свое согласие на обработку получение из иных источников, распространение сторонним получателям в рамках действующего законодательства моих персональных данных: фамилия, имя, отчество; число, месяц и год рождения; место рождения; профессия; место работы; национальность; домашний адрес, телефон, e-mail; сведения о состоянии моего здоровья уполномоченным(ми) лицам(ами) ФГБУ «РМНПЦ «Росплазма» ФМБА России с целью: заготовки, переработки, транспортировки, хранения и обеспечения безопасности донорской крови и ее компонентов способом автоматизированной и неавтоматизированной обработки на срок 30 лет. ________________ ________________________ «___» __________20 _______ г. роспись расшифровка
