альтернативная in vitro токсикология: настоящее и
advertisement
НОВЫЙ АРМЯНСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ ЖУРНАЛ Том. 3 (2009), №.2, 49-57 www.ysmu.am ПБЗОРНЫЙ АЛЬТЕРНАТИВНАЯ IN VITRO ТОКСИКОЛОГИЯ: НАСТОЯЩЕЕ И БУДУЩЕЕ В АРМЕНИИ Гаспарян Г. Г О.1, 2, Григорян Р. Р М.2, Саркисян Н.К.2, Бабаян Н.С.1, 2, Погосян Д.А.1, 2, Оганесян Г. Г Г. Г 1, Арутюнян Р. Р М.1 1 Ереванский государственный университет, Ереван, Армения Реферат В обзоре рассмотрены принципы и основы альтернативной in vitro токсикологии. Коротко изложена концепция 3Rs (Refinement, Reduction, and Replacement). Рассмотрена законодательная и регуляторная база для перехода от исследований на животных к тестированию на экспериментальных клеточных системах in vitro ((клеточных клеточных культурах культурах). ). Обсуждаются преимущества и недостатки токсикологических тест-систем in vivo и in vitro. Изложена современная парадигма токсикологических исследований in vitro и стратегия их осуществления. Коротко описаны наиболее используемые ((в том числе утвержденные методы определения цито- и генотоксичности веществ in vitro. Приведены реденные) зультаты исследований авторов в области альтернативной in vitro токсикологии. Обсуждаются современное состояние и перспективы развития альтернативной in vitro токсикологии в Армении. Ключевые слова: обзор, токсикология, in vitro, альтернативные методы, Армения Термин «альтернативный» возник после публикации книги Рассела и Берча «Принципы гуманной экспериментальной методики» («The Principles of Humane Experimental Technique») [Russell W., W Burch R., 1959]. Согласно авторам, корректная организация эксперимента должна базироваться на усовершенствованных методах, которые снижают болевые и стрессовые воздействия, уменьшают число животных, необходимых для определенного теста, или заменяют их моделями, например, клеточными культурами in vitro. Концепция усовершенствования, уменьшения и замены (Refinement, Reduction, and Replacement) сейчас известна как «Three Rs» (3Rs) и методы, использующие эту концепцию, называются альтернативными [Balls M. et al., 1995b; Stephens M. et al., 2001]. Сильным стимулом для развития концепций 3Rs и альтернативного тестирования стало всемирное движение за права животных. Оно имеет целью предотвратить жестокость, плохое обращение с животными и их страдания, а также эксплуатацию животных для намерений человека (см.: The Universal Declaration of Animal Rights). Общественное мнение категорически возражает против лабораторного экспериментиАдрес для корреспонденции: Department of Genetics and Cytology, Biological Faculty, Yerevan State University 1 Alex Manoogian str., Yerevan 0025, Armenia Tel.: (37410) 635 119, 091-306 293 E-mail: gena@ysu.am. рования на животных. Осознание моральных обязательств общества перед животными, высокая социальная активность обществ защиты животных, проведение демонстраций против вивисекции вынудили правительственные органы и комиссии по стандартизации пересмотреть политику использования животных в науке и промышленности. Наша страна имеет очень короткую историю независимой социальной жизни и отечественное движение в защиту животных делает свои первые шаги в науке [Gasparyan Gasparyan G.. Gas Aroutiounian R., 2005] и образовании [Vardapetyan A., 2000;,2008]. Сейчас мы имеем шанс перестроить наши токсикологические исследования по международным стандартам и распространить принципы 3Rs в научном сообществе и среди населения Армении. Первой целью должно стать уменьшение числа экспериментов на животных при биомедицинском тестировании. В современных токсикологических исследованиях, как правило, воздерживаются от исследований на животных в основном благодаря развитию новейших молекулярных технологий и клеточных моделей. В последние годы был отмечен существенный прогресс в развитии и утверждении (валидации) 3Rs альтернатив для токсикологических тестов. Было разработано соглашение о процессе утверждения тест-процедур определения токсичности для достижения международного консенсуса как с научной общественностью, так и регулирующими ведом- 49 ¶²êä²ðÚ²Ü ¶. ¨ ³ÛÉáù / Üàð вÚÎ²Î²Ü ´ÄÞÎ²Î²Ü Ð²Ü¸ºê ствами [Abdulla E. et al., 1995]. Организация экономического сотрудничества и развития (OECD) [Balls M. et al., 1995a] и Межведомственный координационный комитет по утверждению альтернативных методов (ICCVAM) [Botham P. P et al., 1995] разработали и предложили критерии приемлемости методологий [см. также: Bruner L. et al., 1998; Purchase I. I et al., 1998]. Сегодня мы являемся свидетелями впечатляющего изменения парадигмы в токсикологии - времени, когда применение методов без использования животных становится господствующей тенденцией. Уже стало общепринятым использование in vitro тестов при оценке безопасности, разработке лекарств и новых продуктов. Согласно принципам Правительства США по использованию животных в научных исследованиях, тестировании и образовании [Interagency Research Animal Committee, 1985] и политике Министерства здравоохранения США по гуманному обращению и использованию лабораторных животных [Public H Health S Service Policy, 2002], до проведения тестиPolicy рования на животных должны использоваться in vitro тест-методы определения базальной цитотоксичности, где это приемлемо. Эти методы рассматриваются как часть взвешенного подхода для оценки стартовой дозы острой оральной токсичности препаратов при тестировании in vivo. Для некоторых видов веществ подобный подход уменьшит число используемых животных, а в некоторых ситуациях он может также уменьшить число животных, которые погибнут или будут забиты в процессе эксперимента. Некоторые крупные международные компании уже широко используют альтернативные методы. Столь влиятельная организация как Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) приветствует ограничение тестирования на животных [BioCentury, BioCentury, 2005]. В Европе тестирование косBioCentury метических средств на животных будет полностью запрещено в ближайшие два-три года [Explanatory Memorandum, 2004]. В 2007 г. г Национальный научный совет США (NRC) опубликовал доклад о будущем тестирования токсичности. В нем говорится, что настало время разработки новой токсикологической парадигмы, не основанной на использовании животных. Основное предложение доклада заключалось в переориентации тестирования на молекулярный уровень вместо наблюдения фенотипических реакций целого организма, перейти «от тестирования на целом животном на тестирование на клеточном уровне» [Toxicity Testing Testing, 2007]. Для подобных шагов есть очень серьезные основания. Несовершенство и ограничения тестирования на животных очевидны и понятны. Более 20 лет назад в докладе Королевского Об- 50 щества (UK) было сказано о недостатке, исходно присущем токсикологии in vivo, а именно, о проблеме видовой специфичности тестов: «... трудно быть уверенным, что животные модели правильно отражают взаимосвязи в организме человека» [Risk Assessment,1983 Assessment ]. Вот другие цитаты того же содержания: «... LD50 для животных имеет весьма маленькое значение для определения летальной дозы для человека» [Zbinden G., FluryRoversi M M., 1981]; «... если даже LD50 может быть измерена точно и воспроизводимо, то знание точного цифрового значения имеет малое практическое значение, так как трудно провести экстраполяцию от экспериментальных животных на человека» [Lorke D., 1983]. Традиционная токсикология in vivо трудоемка, она требует много времени и расхода большого количества тестируемого продукта. Тестирование на животных трудно адаптировать к современному направлению высокопроизводительных скрининговых технологий [Vanparys P., 2002], что в конечном счете создает препятствия на пути массового скрининга лекарств и химических веществ. Необходимо использовать новейшие научные инструменты для доказательства безопасности и эффективности новых продуктов в кратчайшие сроки, с большей надежностью и меньшими расходами [Critical Path, 2004]. Клетки in vitro являются средством, обеспечивающим дальнейшее развитие в этом направлении [Huang R. et al., 2008]. В настоящее время возможно культивировать широкий спектр клеток различных типов, в том числе из разных тканей и видов. Это очень удобно, так как создаются условия для определения орган- и видоспецифичной токсичности. Если же используются клетки человека, то минимизируются проблемы межвидовой экстраполяции [Drug Testing Testing, 2007]. Коротко говоря, преимущества тестов in vitro заключаются в том, что они быстры, недороги и позволяют исследовать специфические механизмы действия исследуемых агентов. В 1990 г. г Центр США по альтернативам для тестирования на животных (US Center for Alternatives to Animal Testing, CAAT) рекомендовал токсикологическую парадигму, парадигму которая в настоящее время стала рутинной [A Report of the CAAT, 1990]. Она состоит из следующих основCAAT ных позиций (Схема). В Армении явно существует проблема оценки риска и выявления биологической активности новых химических веществ, потенциальных лекарственных препаратов, пищевых добавок, загрязнителей окружающей среды и др. Число научных групп, выполняющих токсикологические исследования, очень невелико. Выполнима ли в нашей стране приведенная выше схема и если да, то в какой степени? Гаспарян Г Г. О. О и соавт. / Новый Армянский Медицинский Журнал Токсикологическая парадигма СААТ Сшема. 1. Анализ количественной зависимости структура-активность вещества и его семейства для прогнозирования биологической активности (QSAR) 2. Тестирование in vitro для оценки токсичности и видовой специфичности вещества (сравнение должно включать клетки человека) 3. Тестирование орган-специфической токсичности вещества in vitro 4. Ограниченное тестирование на животных (с минимальным количеством животных) для исследования метаболизма и фармакокинетики вещества 5. Исследования механизмов действия вещества in vitro и in vivo 1. Анализ количественной зависимости структура-активность вещества (QSAR). Химическая характеристика вещества может дать такие сведения, как физические и химические свойства молекулы, вероятные пути воздействия, возможные механизмы метаболизма и взаимодействия самого вещества и его метаболитов на клеточном уровне. Большая часть этой информации может быть получена с помощью различных компьютерных методов, в том числе моделей QSAR, которые прогнозируют биологическую активность на основании молекулярной структуры. В Армении QSAR-анализ используется в научной практике в Институте тонкой органической химии Научно-технологического центра органической фармацевтической химии. Результаты изучения взаимоотношения структуры и активности вновь синтезированных порфиринов были недавно опубликованы армянскими учеными [Tovmasyan A. et al., 2008]. 2a. Тестирование in vitro для оценки токсичности вещества. Наша объединенная группа, состоящая из сотрудников Ереванского государственного университета и Института молеку- лярной биологии НАН Армении, является единственной в Армении исследовательской группой, которая использует клеточные культуры в токсикологических целях. В настоящее время мы располагаем коллекцией из нескольких линий человеческих клеток, полученных из различных тканей (печень, кровь, почка, молочная железа, шейка матки, кость, мочевой пузырь, гипофиз и астроглиоцит). Мы культивируем нормальные клетки эмбрионов человека и крысы, а также куриного эмбриона. Цитотоксичность растворимых веществ и биосовместимость нерастворимых соединений (используемых в медицинских приборах и в качестве имплантатов) в нашей лаборатории определяется с помощью следующих методик (табл. 1). Цитотоксичность вещества рутинно оценивается в экспериментах доза/эффект (концентрация вещества/жизнеспособность клеток). Конечной целью всех тестов является определение значения IC50 (концентрация исследуемого соединения, вызывающая подавление жизнеспособности клеток на 50%). Полученные IC50 могут быть экстраполированы в значения LD50 51 ¶²êä²ðÚ²Ü ¶. ¨ ³ÛÉáù / Üàð вÚÎ²Î²Ü ´ÄÞÎ²Î²Ü Ð²Ü¸ºê Таблица 1 Методы анализа цитотоксичности и биосовместимости in vitro, используемые в Ереванском государственном университете Наименование тестов Поражаемые клеточные функции и структуры Ссылки Исключение витального красителя (трипанового синего) синего) Целостность клеточной мембраны Strober W., 1997 Проточная цитометрия Целостность клеточной мембраны Поглощение нейтрального красного (NR) MTT Биосовместимость, элюционный тест Ross D. et al., 1989; Flow Cytometry, 2000 Эндоцитоз и накопление витального красителя Test Method Protocol Protocol, 2003 (NR) в лизосомах клетки Mитохондрии итохондрии Mosmann T., 1983 Морфология клеточной культуры для острой токсичности соединения in vivo. С целью расчета стартовых доз для однократного перорального введения исследуемого соединения крысам используются следующие формулы регрессии (Wind M., 2008): log LD50 (ммоль (ммоль/ ммоль/кг /кг кг)) = 0,439 log IC50 (ммоль (ммоль/ ммоль/л /лл)) + 0,621, или log LD50 (мг (мг/ мг/кг /кг) = 0,372 log IC50 (мкг (мкг/ мкг/мл /мл) + 2,024 Зная значение LD50, можно определить к какому классу токсичности относится данное вещество (табл. 2). Что касается определения генотоксичности in vitro, то эти исследования представляют собой важный инструмент для выявления хроничеТаблица 2 Классификация токсических веществ (см.: A Guide to the GHS, 2006) Классы токсичности Значения LD50 I LD50 ≤ 5 мг/кг II 5 < LD50 ≤ 50 мг/кг III 50 < LD50 ≤ 300 мг/кг IV 300 < LD50 ≤ 2000 мг/кг ской опасности изучаемых химических веществ и прогнозирования их влияния на человека. Считается общепринятым, что с большой долей достоверности большая часть канцерогенов может быть определена с помощью серии in vitro и краткосрочных in vivo тестов на генотоксичность (Ashby J., 1991). Стратегия тестирования генотоксической активности включает ограниченное число хорошо известных тест-систем, многие из которых утверждены. Рекомендуется использовать подход, основанный на серии тестов, так как одиночными тестами невозможно выявить все генотоксические эффекты. Унифицированный подход для генотоксического те- 52 Wallin R., Arscott E., 1998 стирования фармацевтических препаратов изложен в ряде публикаций [Genotoxicity, Genotoxicity, 1997; Genotoxicity Muller L. et al., 1999; Genotoxicity Testing Testing, 2008]. Для изучения хронических эффектов (генотоксичности) веществ мы используем следующие методы (табл. 3). Серия вышеназванных методов была ранее использована нами для оценки генотоксичности новых порфиринов и их производных, а также известного противоракового препарата цисплатина (cis-DDP) [Hovhannisyan G. et al., 2004; 2005a; Arutyunyan R. et al., 2005a; Gasparyan G. et al., 2007]. Используемый набор методов (табл. 2-3) соответствует международным стандартам для предварительной оценки риска и токсичности веществ in vitro. 2б. Тесты in vitro для оценки видовой специфичности вещества. В эти тесты входит изучение цитотоксичности веществ на клетках, полученных из различных видов (желательно из одной и той же ткани), и сравнение полученных индексов токсичности (например, IC50). При сравнении обязательно должны быть использованы клетки человека. Таким путем можно выявить межвидовые различия в чувствительности клеток к исследуемому веществу веществу. Ранее мы использовали данный подход для исследования видоспецифической цитотоксической активности водного экстракта лечебного растения олеандра [Hovhannisyan N. et al., 2007]. Было показано, что этот экстракт токсичен для клеток человека (клеточные линии Jurkat, K-562, L-41 и HT-1080) и приматов (клеточная линия COS-7 зеленой африканской обезьяны), но не для клеток грызунов (клеточная линия PC-12 крысы) in vitro. Полученные результаты полностью соответствуют литературным данным, полученным ранее в экспериментах на животных [Pathak S. et al., 2004]. 3. In vitro тесты для оценки орган-специфической токсичности вещества. Если токсин воздействует на конкретную систему органов в Гаспарян Г Г. О. О и соавт. / Новый Армянский Медицинский Журнал Таблица 3 Методы анализа генотоксичности in vitro, используемые в Ереванском государственном университете Наименование тестов Поражаемые клеточные структуры и молекулы Конечная цель тестов Ссылки Индукция хромосомных аберраций Митотические хромосомы Наследуемые повреждения хромосом OECD Guidelines, Test № 473 Индукция микроядер Целостность ДНК в постмитотических клетках Наследуемые повреждения хромосом/ДНК Parry J., 1998 Проба «Comet assay» Повреждения ДНК (поправимые ( ?) Ранние (острые) повреждеTice R. et al., 2000 ния ДНК Тест Эймса Гены Генные мутации целом организме, то по тому же механизму он может не проявить токсический эффект в культуре клеток, полученных из иной от органа-мишени ткани. К примеру примеру, следует ожидать, что нейротоксин, действующий в организме животного по нейрорецепторно-опосредованному пути, по иному механизму проявит токсичность в клетках 3Т3 или NHK, полученных соответственно из фибробластов и кожи. Тестирование орган-специфической токсичности включает изучение цитотоксичности вещества на клетках человека, полученных из разных тканей. Например, нами было успешно установлено, что клетки крови (линия клеток К-562) более чувствительны к цитотоксическому действию новых Ag- и Zn-порфиринов, чем клетки, полученные из почки (клеточная линия Cos-7) и простаты (клеточная линия DU 145) [Gasparyan G. et al., 2007]. 4. Ограниченное тестирование на животных (минимальное количество животных) для исследования метаболизма и фармакокинетики вещества. Гибель клетки и животного может быть результатом одних и тех же процессов, таких как нарушение структуры или функции мембран, подавление деятельности митохондрий, нарушение белкового обмена и др. [Gennari A. et al., 2004]. В то же время недостатком систем in vitro является то, что в них отсутствуют пути и механизмы гомеостаза, функционирующие в организме животных. Помимо этого в in vitro моделях зачастую представлены острые или краткосрочные эффекты токсикантов, тогда как модели in vivo позволяют выявлять эффекты долгосрочной экспозиции и влияния биологической интеграции на уровне организма [Tiffany-Castiglioni E. et al., 1999]. Следует также отметить, что системы организма и клеточной культуры различаются между собой в том, как вещество доставляется в клетку и как оно распределяется, метаболизируется и выводится. После перорального введения токсин абсорбируется из желудочно-кишечного тракта, что предполагает его прохождение через мем- OECD Guidelines, Test № 471 браны. Затем токсин может метаболизироваться и выводиться. В системе клеточной культуры вещество должно пройти только через мембраны целевой клетки и клеточных органелл. Абсорбция и распределение другими клеточными системами не происходит. Экскреция из культуры клеток не осуществляется из-за отсутствия экскреторной системы. Между тем изучение ADME (Absorption, Distribution, Metabolism and Excretion – абсорбция, распределение, метаболизм и выведение) характеристик вещества исключительно важно, поскольку они являются ключевыми характеристиками в вопросах дальнейшего успеха или неудачи потенциального медицинского препарата. Поэтому тестирование in vitro должно сопровождаться экспериментами на животных. Результаты, полученные in vitro, должны использоваться в качестве прогностических для уменьшения числа как экспериментов in vivo, так и используемых животных. 5. Исследования механизмов действия вещества in vitro и in vivo. Экспериментальные клеточные системы in vitro имеют исключительную ценность для изучения механизмов действия. Они идеально подходят для исследования молекулярных, клеточных и физиологических механизмов химически индуцированной токсичности. Сейчас прилагаются большие усилия, направленные на использование систем in vitro для улучшения понимания механизмов активности токсикантов, а также на использование клеток и тканей человека для выявления токсических эффектов, специфичных именно для этого вида. Методы in vitro применяются нами для оценки скорости и различения некротической и апоптозной клеточной гибели (путем морфологического анализа клеток, гель-электрофореза ДНК и методом проточной цитометрии) [Hovhannisyan N. et al., 2007; Babayan N. et al., 2008]. Необходимо отметить, что количественно определить апоптоз in vivo почти невозможно по причине гетерогенности клеточных популяций 53 ¶²êä²ðÚ²Ü ¶. ¨ ³ÛÉáù / Üàð вÚÎ²Î²Ü ´ÄÞÎ²Î²Ü Ð²Ü¸ºê и короткого времени полужизни апоптозной клетки. Вместе с тем нами проведена оценка влияния веществ на скорость клеточной пролиферации и прохождения клетками клеточного цикла (методом проточной цитометрии) – это параметры, которые трудно измеримы на уровне организма. С помощью модифицированной бесклеточной версии «Сomet assay», в которой обработка ДНК производится после лизиса клеток [Kasamatsu T. et al., 1996], мы показали, что Сометаллопорфирин способен взаимодействовать непосредственно с ДНК независимо от других возможных цитотоксических эффектов [Arutyunyan R. et al., 2005 b; Hovhannisyan G. et al., 2005 a; a b]. Будущее альтернативной токсикологии in vitro предсказать несложно. Основным путем ее развития являются высокопроизводительные тесты на клетках и линиях клеток человека, которые будут постепенно вытеснять тесты на животных. Недостающие ферментные системы будут включаться в клетки-мишени путем генной инженерии [Kirkland D. et al., 2007]. В дальнейшем вещества будут оцениваться с помощью методов «целенаправленного тестирования», будут разработаны новые пути определения метаболитов в клетках in vitro, а не в организме животных. Новые модели доза-эффект главным образом будут основаны на in vitro методах, исследующих механизмы явлений, и экстраполированы на человека [Langley G., 2007]. Сегодня огромная созидательная энергия направлена на усовершенствование новых методов и техноло- гий с целью замены животных при идентификации опасности химических веществ и лекарств, оценке риска, в том числе при прогнозе ADME характеристик. Некоторые из этих новых инструментов основаны на использовании клеток, тканей и субклеточных компонентов человека, другие представляют собой «виртуальные» инструменты, использующие возможности современных компьютерных систем. Таким образом, есть основания утверждать, что альтернативная токсикология in vitro делает в нашей стране свои первые шаги. В Армении состояние инфраструктуры науки неудовлетворительное. Для ее развития необходимы и время, и инвестиции, в частности, для создания условий для токсикологических исследований in vivо и in vitro, отвечающих международным стандартам и требованиям надлежащей лабораторной практики (Good Laboratory Practice) [Seiler J., 2005], а также надлежащей практики культуры клеток (Good Cell Culture Practice) [Hartung T. et al., 2002]. Программа развития альтернативной токсикологии нам представляется более реалистичной и осуществимой. Предпосылки для продвижения в этом направлении уже имеются. В то же время армянским ученым предстоит сделать многое, чтобы на равных включиться в основное русло современной токсикологии. Л И Т Е РА Т У РА 1. A Guide to the Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals (GHS). Occupational Safety and Health Administration (OSHA) (US). Washington, 2006. URL: http://www.asha.gov/dsg/hazcom/ghs.html. 2. A Report of the CAAT Technical Workshop of June 13-15, 1990. URL: http://caat.jhsph.edu/ publications/tech_reports/4.htm 3. Abdulla E.M., Atterwill C., Campbell I.C. Workshop on in vitro neurotoxicity testing: the obstacles, the way forward. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 1995; 22: 277-280. 4. Arutyunyan R., Hovhannisyan G., Gasparyan G., Dalyan Ye., Margaryan K., Ghazaryan R., Haroutiunian S. Effects of new porphirins evaluated at the levels of purified DNA, cell and acellular experimental systems. International alumni seminar on “Biotechnology and Health”; 2005 Octo- 54 ber, 18-21; Yerevan, Armenia; 2005 a: 21-26. 5. Arutyunyan R., Rapp A., Greulich K.O., Hovhannisyan G., Haroutiunian S., Gebhart E. Fragility of telomeres after bleomycin and cisplatin combined treatment measured in human leukocytes. Exp. Oncol. 2005 b; 27 (1): 38-42. 6. Ashby J. Determination of the genotoxic status of a chemical. Mutat. Res. 1991; 248: 221–231. 7. Babayan N., Tovmasyan A., Gevorkyan A., Gasparyan G., Aroutiounian R. The cytotoxic action of new Ag-porphyrin as a potential chemotherapeutic agent. Korean J. Environ. Biol. 2008; 26: 115-120. 8. Balls M., Blaauboer B.J., Fentem J.H. Practical aspects of the validation of toxicity test procedures. The report and recommendations of the ECVAM Workshop 5. Altern. Lab. Anim. 1995 a; 23: 129-147. Гаспарян Г Г. О. О и соавт. / Новый Армянский Медицинский Журнал 9. Balls M., Goldberg A.M., Fentem J.H., Broadhead C.L., Burch R.L., Festing M.F.W., Frazier J.M., Hendriksen C.F.M., Jennings M., van der Kamp M.D.O. The Three Rs: the way forward. Altern. Lab. Anim. 1995 b; 23: 838-866. 10. BioCentury 2005. The Bernstein Report on Biobusiness, 2005 September, 5: A10-A12. 11. Botham P., Chamberlain M., Barret M.D., Curren R.D., Esdaile D.J., Gardner J.R., Gordon V.C., Hildebrand B., Lewis R.D., Liebsch M., Logemann P., Osborne R., Ponec M., Régnier éégnier J.-F., Steiling W., Walker A.P., Balls M. A prevalidation study on in vitro skin corrosivity testing. The Report and Recommendations of ECVAM Workshop 6. Altern. Lab. Anim. 1995; 23: 219-255. 12. Bruner L.H., Carr G.J., Curren R.D., Chamberlain M. Validation of alternative methods for toxicity testing. Environ. Health Perspect. 1998; 106 (2): 477-484. 13. Critical Path Opportunities Report. US Department of Health and Human Services. FDA US. 2004. URL: http://www.fda.gov/oc/initiatives/criticalpath/reports/opp_report.pdf 14. Drug Testing In Vitro: Breakthroughts and Trends in Cell Culture Technonogy. Marx U., Sanding V., editors. Weinheim: Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, 2007. 298p. 15. Explanatory Memorandum to the Cosmetic Products (Safety) (Amendment) (No.2) Regulations 2004, No. 2988. URL: http://www.opsi. gov.uk/si/em2004/uksiem_20042988_en.pdf 16. Flow Cytometry: A Practical Approach. Ormerod M.G., editor. 3th ed. Oxford: Oxford University Press, 2000. 276p. 17. Gasparyan G., Aroutiounian R. Armenia: achievements and problems in development of alternative approach in vitro. In: Proceedings of the 5th World Congress on Alternatives & Animal Use in the Life Sciences. 2005 August, 21–25, Berlin, Germany; 2005. P. 28. 18. Gasparyan G., Hovhannisyan G., Ghazaryan R., Sahakyan L., Tovmasyan A., Grigoryan R., Sarkissyan N., Haroutiunian S., Aroutiounian R. In vitro testing of cyto- and genotoxicity of new porphyrin water-soluble metal derivatives. Int. J. Toxicol. 2007; 26: 497-502. 19. Gennari A., van den Berghe C., Casati S., Castell J., Clemedson C., Coecke S., Colombo A., Curren R., Dal Negro G., Goldberg A., Gosmore C., Hartung T., Langezaal I., Lessigiarska I., Maas W., Mangelsdorf I., Parchment R., Prieto P., M Sintes J.R., Ryan M., Schmuck G., Stitzel K., Stokes W., Vericat J.A., Gribaldo L. Strategies to replace in vivo acute systemic toxicity testing. The report and recommendations of ECVAM Workshop 50. ECVAM Workshop 50. Altern. Lab. Anim. 2004; 32: 437-59. 20. Genotoxicity: A Standart Battery for Genotoxicity Testing of Pharmaceuticals. ICH Steering Committee. ICH Harmonised Tripartite Guideline. Recommended for Adoption at Step 4 of the ICH Process. International Conference on harmonisation of technical requirements for registration of pharmaceuticals for human use. 1997 July, 16-18; Brussels, Belgium. URL: http://www.pmda.go.jp/ich/s/s2b_98_7_9e.pdf 21. Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use. S2(R1). ICH Steering Committee. ICH Harmonised Tripartite Guideline. Recommended for Adoption at Step X of the ICH Process. International Conference on harmonisation of technical requirements for registration of pharmaceuticals for human use. Draft 2008 January, 28. URL: http://www.fda.gov/cder/Guidance/8256dft.pdf 22. Hartung T., Balls M., Bardouille C., Blanck O., Coecke S., Gstraunthaler G., Lewis D. Good Cell Culture Practice. ECVAM Good Cell Culture Practice Task Force Report 1. Altern. Lab. Anim. 2002; 30: 407-414. 23. Hovhannisyan G., Gasparyan G., Haroutiunian S., Dalyan Y., Margaryan K., Aroutiounian R. Comparative investigation of genotoxic activity of new porphyrin on the levels of purified DNA, cell and acellular experimental systems. The Second International Conference “Modern problems of genetics, radiobiology, radioecology and evolution” dedicated to N.W.Timofeeff-Ressovsky. 2005 September, 8-11; Yerevan, Armenia; 2005 a. P. 66. 24. Hovhannisyan G., Haroutiunian S., Margaryan K., Ghazaryan R., Aroutiounian R. DNA damage induced by new porphyrins of different chemical structure. Korean J. Environ. Biol.. 2005 b; 23 (4): 379-382. 25. Hovhannisyan G., Haroutunyan S., Arutyunyan R. Evaluation of cisplatin-DNA crosslinks formation with UV-C application by the alkaline Comet-assay. Exp. Oncol. 2004; 26 (3): 240-242. 55 ¶²êä²ðÚ²Ü ¶. ¨ ³ÛÉáù / Üàð вÚÎ²Î²Ü ´ÄÞÎ²Î²Ü Ð²Ü¸ºê 26. Hovhannisyan N.A., Mkrtumyan M.K., Gasparyan G.H. [Cytotoxic activity of extracts of Nerium oleander L. cell culture] [published in Russian]. J. Biotech. 2007; 5: 66-71. 27. Huang R., Southall N., Cho M.H., Xia M., Inglese J., Austin C.P. Characterization of diversity in toxicity mechanism using in vitro cytotoxicity assays in quantitative high throughput screening. Chem. Res. Toxicol. 2008; 21: 659-667. 36. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. Test No. 473: In vitro Mammalian Chromosome Aberration Test.URL:http://oberon.sourceoecd.org/vl=4675979/cl=30/nw=1/rpsv/ij/oecdjournals/ 1607310x/v1n4/s40/p1 37. Parry J.M. A proposal for a new OECD guideline for the in vitro micronucleus test. 1998. URL: http://www.swan.ac.uk/cget/ejgt/article MN UKEMS Protocol.htm. 28. Interagency Research Animal Committee (US). U.S. Government Principles for Utilization and Care of Vertebrate Animals Used in Testing, Research, and Training. Fed. Regist. 1985; 50 (97): ISO 10993. 38. Pathak S., Multani A.S., Narayan S., Kumar V., Newman R.A. Anvirzel, an extract of Nerium oleander, induces cell death in human but not murine cancer cells. Vet. Res. Commun.. 2004; 28: 609-616. 29. Kasamatsu T., Kohda K., Kawazoe Y. Comparison of chemically induced DNA breakage in cellular and subcellular systems using the comet assay. Mutat. Res. 1996; 369: 1–6. 39. Public Health Service Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals. Office of Laboratory Animal Welfare. Public Health Service (PHS) (US). Washington: National Institutes of Health, 2002. 30. Kirkland D., Pfuhler S., Tweats D., Aardema M., Corvi R., Darroudi F., Elhajouji A., Glatt H., Hastwell P., Hayashi M., Kasper P., Kirchner S., Lynch A., Marzin D., Maurici D., Meunier J.R., M Müller L., Nohynek G., Parry J., Parry E., Thybaud V., Tice R., van Benthem J., Vanparys P., White P. How to reduce false positive results when undertaking in vitro genotoxicity testing and thus avoid unnecessary follow-up animal tests: Report of an ECVAM Workshop. Mutat. Res. 2007; 628 (1): 31-55. 40. Purchase I.F.H., Botham P.A., Bruner L.H., Flint O.P., Frazier J.M., Stokes W.S. Workshop overview: Scientific and regulatory challenges for the reduction, refinement, and replacement of animals in toxicity testing. Toxicol. Sci. 1998; 43: 86-101. 41. Risk Assessment - Report of a Royal Society Study Group. The Royal Society. London: Publ. Royal Society, 1983. 31. Langley G. Replacing Animals in Absorption, Distribution, Metabolism & Excretion Studies. Alttox, Toxicity Testing Resource Center. 2007. URL: http://www.alttox.org/ttrc/toxicity-tests/pharmacokinetics-metabolism/wayforward/langley/ 42. Ross D.D., Joneckis C.C., Ordonez J.V., Sisk A.M., Wu R.K., Hamburger A.W., Nora R.E. Estimation of cell survival by flow cytometric quantification of fluorescein diacetate/propidium iodide viable cell number. Cancer Res. 1989; 49: 3776-3782. 32. Lorke D. A new approach to practical acute toxicity testing. Arch. Toxicol. 1983; 54: 275-287. 43. Russell W.M.S., Burch R.L. The Principles of Humane Experimental Technique. London, UK: Methuen & Co. Ltd, 1959p. 33. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods. 1983; 65: 55–63. 34. Muller L., Kikuchi Y., Probst G., Schechtman L., Shimada H., Sofuni T., Tweats D. ICH-harmonised guidances on genotoxicity testing of pharmaceuticals: evolution, reasoning and impact. Mutat. Res. 1999; 436: 195–225. 35. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. Test No. 471: Bacterial Reverse Mutation Test. URL:http://lysander.sourceoecd.org/vl=738137/cl=29/nw=1/rpsv/ij/oecdjournals/1607310x/v1n4/s39/p1 56 44. Seiler J.P. Good Laboratory Practice – the Why and the How (2nd Edition). Springer-Verlag Berlin Heidelberg, New York. 2005. 424p. 45. Stephens M.L., Goldberg A.M., Rowan A.N. The first forty years of the alternative approach: Refining, Reducing, and Replacing the use of laboratory animals. In: Salem D., Rowan A.N., editors. The State of the Animals. Washington: Humane Society Press, 2001. P.121-135. 46. Strober W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Curr. Protoc. Immunol. 1997; Appendix 3B. URL: http://www.scribd.com/doc/6909835/ Trypan-Blue-Exclusion-Test-of-Cell-Viabilit Trypan-Blue-Exclusion-Test-of-Cell-Viability Гаспарян Г Г. О. О и соавт. / Новый Армянский Медицинский Журнал 47. Test Method Protocol for the NRK Neutral Red Uptake Cytotoxicity Assay. NICEATM, ICCVAM, NIEHS, NIH. 2003. URL: http://iccvam. niehs.nih.gov/methods/invitro.htm 48. The Universal Declaration of Animal Rights. URL: www.uncaged.co.uk/declarat.htm. 49. Tice R.R., Agurell E., Anderson D., Burlinson B., Hartmann A., Kobayashi H., Miyamae Y., Rojas E., Ryu J.C., Sasaki Y.F. Single cell gel/ Comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing. Environ. Mol. Mutagen. 2000; 35: 206–221. 50. Tiffany-Castiglioni E., Ehrich M., Dees L., Costa L.G., Kodavanti P.R., Lasley S.M., Oortgiesen M., Durham H.D. Bridging the gap between in vitro and in vivo models for neurotoxicology. Toxicol. Sci. 1999; 51: 178-183. 51. Tovmasyan T A.G., Babayan N.S., Sahakyan L.A., Shahkhatuni A.G., Gasparyan G.H., Aroutiounian R.M., Ghazaryan R.K. Synthesis and in vitro anticancer activity of water-soluble cationic pyridylporphyrins and their metallocomplexes. J. Porphyrins Phthalocyanines. 2008; 12: 1100-1110. 52. Toxicity Testing in the 21 Century: A vision and a Strategy. Grossblatt N., Karalic-Loncarth evic M., editors. Washington: National Academy Press. 2007. 196p. 53. Vanparys P. ECVAM and pharmaceuticals. Altern. Lab. Anim. 2002; 30 (2): 221-223. 54. Vardapetyan A. [Humane Alternatives in the Biomedical Education and their Pedagogical Impact] [published in Armenian]. Pedagogical Thought. 2008; 4: 67-72. 55. Vardapetyan A. New Bioethical Forms of Educational Process in Universities of Armenia. In: Proceedings of the 14th Congress on Alternatives to Animal Testing. 2007 September, 28-30, Linz, Austria; ALTEX 2007; 3: 238. 56. Wallin R., Arscott E. A Practical Guide to ISO 10993-5: Cytotoxicity. URL: http://www.devicelink.com/mddi/archive/98/04/013.html 57. Wind M. Current ICCVAM Recommendations for the Use of In Vitro Test Methods to Estimate Acute Systemic Toxicity. Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing In Vitro Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity. 2008 February, 6-7; Maryland, US. URL: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/workshop-docs/present/Wind.pdf 58. Zbinden G., Flury-Roversi M. Significance of the LD50 test for the toxicological evaluation of chemical substances. Arch. Toxicol. 1981; 47: 77-99. 57
