Методы анализа генов
advertisement
25.03.2015 Методы анализа генов Экспрессия генов ДНК мРНК Белок Признак 5’-ATTGCAAGATTACCATGT-3’ Кодогенная цепь 3’-TAACGTTCTAATGGTACA-5’ Антикодогенная цепь Транскрипция мРНК 5’-AUUGCAAGAUUACCAUGU-3’ Трансляция Leu – Ala – Arg – Leu – Pro – Cys Полипептид Созревание Нормальный признак Экспрессия генов mutДНК mutмРНК патБелок патПризнак 5’-ATTACAAGATTACCATGT-3’ мутация G4→A 3’-TAATGTTCTAATGGTACA-5’ Транскрипция 5’-AUUACAAGAUUACCAUGU-3’ mutмРНК Трансляция Leu – Thr – Arg – Leu – Pro – Cys anполипептид Патологический признак 1 25.03.2015 Что необходимо знать из предыдущих курсов и тем? 1. Способы выделения ДНК и РНК из клеток человека 2. Методы получения интересующих фрагментов ДНК: - Рестрикция на фрагменты - кДНК 3. Разделение фрагментов путем электрофореза 4. Методы выявления фрагментов ДНК, имеющих микроскопические размеры 5. Принципы клонирования ДНК - Денатурация ДНК - Репликация 6 . Гибридизация нуклеиновых кислот (ДНК/ДНК, ДНК/РНК) 2 25.03.2015 Анализ генов ДНК Секвенирование РНК Белки Метод Нозерна Метод Вестерна ПЦР RT–PCR Секвенирование М. Саузерна Гибридизация in situ Анализ функции Гибридизация in situ Гистохимический анализ Принципы манипулирования нуклеиновыми кислотами • специфическая рестрикция ДНК с целью получения интересующего фрагмента • идентификация фрагментов ДНК или РНК с помощью специальных зондов, комплементарных искомому участку • идентификация нормальных и патологических генов путем ПЦР – специфическая реакция отбора праймеров, комплементарных гену/участку гена • визуализация необходимого фрагмента по результатам электрофореза и специфического маркирования ДНК/РНК с использованием компьютерных программ чтения и анализа результатов • комплексная интерпретация результатов в зависимости от использованного метода Секвенирование ДНК Установление нуклеотидной последовательности •Позволяет выявить любой тип мутаций •Особенно часто используется для сканирования мутаций в небольших генах •В настоящее время используется автоматизированный метод секвенирования 3 25.03.2015 Автоматизированный вариант метода ПЦР Полимеразная Цепная Реакция Основные принципы ПЦР: • Многократная полуконсервативная репликация • Наличие специфичного праймера • Гибридизация ДНК-мишени с праймером – Термическая денатурация ДНК • Цикличная смена температуры: – Денатурация – Ренатурация – Синтез Что необходимо для ПЦР? - Исследуемая ДНК - Специфические праймеры - Taq-полимераза - dNTP - Установка для регулируемой смены температуры 4 25.03.2015 Этапы ПЦР A. Подготовка реактивов и пробы B. 30-35 циклов репликации C. Анализ результатов ПЦР - электрофорез - окраска - интерпретация результатов Выделение ДНК Клонирование Подготовка компонентов фрагмента Электрофорез Окраска и визуализация Интерпретация результатов Преимущества ПЦР • Быстрота • Относительная дешевизна • Минимальные количества ДНК • Безопасность • Простота интерпретации Недостатки ПЦР • Необходимо знать последовательность нуклеотидов в фрагменте ДНК • Необходимо иметь искусственные специфические праймеры 5 25.03.2015 Применение ПЦР •Выявление делеций/инсерций нуклеотидов •Выявление точечных мутаций •Анализ экспрессии генов (RT-PCR) •Геномная дактилоскопия •Диагностика патогенов •Определение уровня инфицированности (количеств. ПЦР)) Точная и быстрая диагностика моногенных болезней Выявление предрасположенности к общим болезням Анализ родства Быстрая и точная диагностика инфекционных болезней и степени инфицированности пациента Гетерозигота Нормальная последовательность Мутантная гомозигота Нормальная гомозигота Определение вставок / делеций Нормальный фрагмент Мутантная последовательность (del) Электрофорез продуктов ПЦР Укороченный фрагмент Heterozygote Гетерозигота Нормальная последовательность Мутантная гомозигота homozygote Mutant Нормальная гомозигота Normal homozygote Определение точечных мутаций Амплификация возможна Мутантная последовательность Электрофорез продуктов ПЦР Амплификация невозможна 6 25.03.2015 Электрофорез продуктов ПЦР Инфицированный Здоровый Концентрация 4 Концентрация 3 Концентрация 2 Концентрация 1 Инфицированный Контроль Здоровый Определение инфекций Электрофорез продуктов ПЦР Установление отцовства (родства) 7 25.03.2015 Молекулярная гибридизация • Основана на способности одноцепочечных молекул нуклеиновых кислот образовывать двухцепочечные гибриды на основе комплементарности оснований. • Для идентификации искомых участков используют молекулярные зонды, меченые радиоактивным изотопом. • В качестве зонда используют одноцепочечный фрагмент нуклеиновой кислоты с известной последовательностью нуклеотидов. Метод Саузерна • Основан на ПДРФ • Гибридизация с мечеными зондами • Перенос фрагментов рестрикции на твердую основу (нитроцеллюлозный фильтр) Метод Саузерна Выделение ДНК Денатурация и перенос на фильтр Рестрикция ДНК Электрофорез Гибридизация Радиоавтография Визуализация и интерпретация результатов 8 25.03.2015 Применение метода Саузерна • Выявление крупных инсерций/делеций • Выявление мутаций на уровне сайтов рестрикции • Геномная дактилоскопия ПДРФ Анализ генотипа при помощи ПДРФ Нормальная аллель - 3 СР Мутантная аллель – 2 СР C (mm) B (Nm) A (NN) Электрофорез РФ Рестриктные фрагменты геномной ДНК разделенные при помощи электрофореза. Выделенные полосы – сателлитная ДНК Результаты Southern-blot полученные при помощи авторадиографии. 9 25.03.2015 Преимущества метода Саузерна •Высокая точность •Не требуется знания последовательности ДНК •Не требуются искусственные праймеры Недостатки метода Саузерна • Необходимо знание рестрикционной карты для данного фрагмента • Необходимо большое количество материала для анализа • Метод продолжителен и состоит из нескольких этапов • Необходимы радиоактивные изотопы • Дороговизна метода Клетки Метод Northern-blot Выделение РНК •Выделение РНК из необходимой ткани •Электрофорез РНК в условия денатурации Электрофорез РНК •Перенос РНК на мембрану •Гибридизация с меченным зондом в условиях денатурации рРНК •Авторадиография Эти полосы видны всегда Блоттинг, гибридизация, авторадиография Полоса выявленная при помощи авторадиографии Метод Northern-blot Выделение РНК Электрофорез РНК Гибридизация Перенос РНК на мембрану Авторадиографи яи Визуализация интерпретация результатов 10 25.03.2015 Использование метода Northern-blot •Определение экспрессии генов в данной ткани, в данных условиях •Определения варианта сплайсинга •Определение уровня экспрессии Ткань 4 Ткань 3 Ткань 2 Ткань 1 •Определение рибовирусов Определение уровня экспрессии и варианта сплайсинга 11 25.03.2015 Секвенирование ДНК Определение последовательности нуклеотидов Химический метод (Maxam-Gilbert, 1973) Метод дидеокси (Sanger, 1975) Автоматический метод (с использование флуоресцентных нуклеотидов) 5’-ATTACAAGATTACCATGT-3’ кодогенная цепь 3’-TAATGTTCTAATGGTACA-5’ матрица 3’-TAATGTTCTAATGGTACA-5’ 5’-ATTAC-3’ 3’-TAATGTTCTAATGGTACA-5’ 5’-ATTACA-3’ 3’-TAATGTTCTAATGGTACA-5’ 5’-ATTACAA-3’ 3’-TAATGTTCTAATGGTACA-5’ 5’-ATTACAAG-3’ 3’-TAATGTTCTAATGGTACA-5’ 5’-ATTACAAGA-3’ 5’-ATTA -- меченный праймер P32 для ДНК-полимеразы A, T, C, T – dNTP (2’-dNTP) для синтеза цепей A, T, C, T – ddNTP (2’,3’-dNTP) для остановки синтеза 3’-TAATGTTCTAATGGTACA-5’ 5’-ATTACAAGAT-3’ 3’-TAATGTTCTAATGGTACA-5’ 5’-ATTACAAGATT-3’ Метод дидеокси •Ферментативный синтез ДНК •Использование нуклеотидов dNTP и ddNTP •Остановка синтеза при включении ddNTP 12 25.03.2015 5’-ATTACA-3’ 5’-ATTACAA-3’ A 5’-ATTACAAGA-3’ 5’-ATTACAAGATTA-3’ 5’-ATTACAAGATTACCA-3’ A T C 5’-ATTACAAGAT-3’ T G - 5’-ATTACAAGATT-3’ 5’-ATTACAAGATTACCAT-3’ 5’-ATTACAAGATTACCATGT-3’ G 5’-ATTACAAG-3’ 5’-ATTACAAGATTACCATG-3’ 5’-ATTAC-3’ C + 5’-ATTACAAGATTAC-3’ 5’-ATTACAAGATTACC-3’ 5’-ATTACAAGATTACCATGT-3’ Метод дидеокси •Выделение ДНК •Денатурация ДНК •Синтез меченных 32P фрагментов в присутствии dNTP и ddNTP •Электрофорез в условиях денатурации •Обнаружение фрагментов при помощи авторадиографии - (+) 5' TAAATGGCTA.......3'(-) + 13 25.03.2015 Прямые и косвенные методы ДНК-диагностики Прямые методы Косвенные методы преимущества недостатки преимущества недостатки Возможны при сомнительном диагнозе Требуют знания структуры гена Не требуют знания гена и мутации в нем Требуют уверенности в клиническом диагнозе Возможны при мультилокусном заболевании Не всегда информативны Информативны для большинства семей Применимы только для монолокусных заболеваний Возможна беспробандная диагностика Обязателен семейный анализ Прямые и косвенные методы идентификации гена Прямые методы • Изолирование ДНК пациента и секвенирование участка хромосомы • ПЦР с использованием праймеров, специфических к каждому типу из известных мутаций данного гена • ПДРФ с использованием ФР, специфичных последовательности гена и выявление мутаций, затрагивающих сайты рестрикции • FISH с применением зондов, специфичных данному гену • Анализ мРНК и/или белка Непрямые методы • ПЦР с использованием праймеров, специфичных к микро- и минисателлитам, распложенных вблизи данного гена • ПДРФ Применение методов анализа генов в медицине Анализ ДНК: Выявление генных мутаций → точная диагностика генных болезней (пренатальная, постнатальная предсимптоматическая); Идентификация индивидуального полиморфизма → выявление предрасположенности к ряду болезней; Идентификация индивидуального полиморфизма → геномная дактилоскопия (анализ родства); Выявление чужой ДНК (бактериальной, вирусной) → диагностика инфекционных болезней и степени инфицированности. Анализ мРНК: Анализ экспрессии ткане-специфических генов; Оценка уровня экспрессии генов 14 25.03.2015 Генетический скрининг обследование популяционных групп для идентификации в них людей с: повышенным риском определенного заболевания, носительства гена, вызывающего повышенный риск, предрасположенности к ряду заболеваний. Сопровождается обследованием для подтверждения диагноза. !!! Доступные и точные методы анализа Бесплатный и обязательный скрининг Доступность своевременного и эффективного лечения Генетический мониторинг - регулярное периодическое исследование на доказательство генетических нарушений Недостаток – выявляет уже имеющиеся нарушения и не способствует их предупреждению Генетическое тестирование - анализ состояния отдельного гена. Генетический тест может установить: а) специфический диагноз болезни б) возможность проявления (досимптоматическая диагностика) болезни в) наличие генетической предрасположденности 15 25.03.2015 Генетический паспорт– документ, содержащий информацию о генетическом коде человека. Информационные источники • • • • www.nhgri.gih.gov www.sanger.ac.uk www.medgen.genetics.utah.edu www.genome.wi.mit.edu DNA Art 16
