Современные технологии работы с миРНК
advertisement
Современные технологии работы с миРНК Технологии пробоподготовки и анализа Решения QIAGEN для новейших исследований миРНК Открытие миРНК (микроРНК) и признание ее важной роли в регуляции экспрессии генов привели к возрастанию интереса к идентификации миРНК. Для поддержки исследований в этой области QIAGEN обеспечивает инновационные технологии для очистки, обнаружения и функционального анализа миРНК. Профилирование миРНК Очистка Количественное определение Анализ данных Количественное определение экспрессии многочисленных миРНК в определенном типе клеток или тканей при некоторых определенных условиях дает профиль миРНК и профиль экспрессии миРНК. Профили миРНК могут использоваться для выяснения роли миРНК в регуляторных метаболических путях или при нарушениях регуляции миРНК при заболеваниях. QIAGEN предлагает миРНК-наборы miRNeasy and PAXgene® для очистки миРНК, а также наборы реагентов miScript PCR System и miScript Primer Assay Sets для профилирования миРНК. miScript PCR Controls дает возможность стандартизации результатов экспериментов по профилированию миРНК. Примеры, часто задаваемые вопросы и публикации по профилированию миРНК вы можете найти на сайте www.qiagen.com/miRNAprofiling. Исследование биогенеза и регуляции миРНК Очистка Количественное определение зрелой миРНК Количественное определение предшественника миРНК Анализ данных Многие исследовательские проекты сфокусированы на изучении механизмов биогенеза и путях регуляции миРНК. Профилирование зрелых миРНК и предшественников миРНК с использованием наборов реагентов miScript PCR System может привести к важным открытиям метаболических путей на этапах от транскрипции до созревания. Функциональный анализ миРНК Трансфекция имитатором/ингибитором Очистка Анализ фенотипов Очистка Количественный анализ Анализ данных При изучении роли определенной миРНК экспериментальные стратегии могут включать трансфекцию имитатором миРНК, приводящую к снижению количества миРНК-мРНК-мишени, или трансфекцию ингибитором, приводящую к возрастанию экспрессии миРНК-мРНК-мишени. Трансфекция имитатором или ингибитором может сопровождаться анализом интересующего фенотипа или анализом экспрессии интересующей миРНК. Эти эксперименты дают информацию о мишенях и функциональной роли различных миРНК в клетке. QIAGEN предоставляет все необходимое для исследований функциональной активности миРНК, включая имитаторы и ингибиторы миРНК miScript, реактив для трансфекции HiPerFect® , наборы для очистки миРНК и ПЦР-систему miScript PCR System. Примеры, часто задаваемые вопросы и публикации по функциональному анализу миРНК вы можете найти на сайте www.qiagen.com/miRNAfunction. Исследование вирусных миРНК Выяснение роли и регуляции вирусных миРНК могло бы способствовать развитию новых направлений терапии вирусных заболеваний. Компания QIAGEN предлагает праймеры miScript Primer Assays, имитаторы miScript miRNA Mimics и ингибиторы miScript miRNA для каждой вирусной миРНК, приведенной в базе данных miRBase. Синтез миРНК, не приведенных в базе данных miRBase, возможен по заказу. 2 www.interlabservice.ru Метаболический путь миРНК Трансфекция имитаторами Трансфекция ингибиторами Имитаторы ведут себя, как эндогенная миРНК Ингибиторы могут связываться с миРНК, препятствуя процессингу, воздействуя на биогенез или препятствуя перемещению из ядра. мРНК мРНК мРНК не транслируется мРНК транслируется в белок Nucleus - Ядро Gene - Ген Pri-miRNA – Прай-миРНК Pre-miRNA – Пре-миРНК Dicer - Дайсер Вначале миРНК транскрибируются в ядре в виде длинных первичных миРНК (прай-миРНК). Далее они преобразуются в предшественников миРНк (пре-миРНК) ядерным микропроцессорным комплексом (дс-РНКспецифичная рибонуклеаза Drosha и DGCR8). Затем пре-миРНК переносятся в цитозоль Экспортином-5. Дайсер и TRBP перерабатывают пре-миРНК в зрелые миРНК размером примерно 22 нуклеотида, которые затем встраиваются в РНК-индуцируемый сайленсинг-комплекс (RISC). Когда RISC идентифицирует комплементарную или частично комплементарную мРНК-мишень, он ингибирует экспрессию гена подавлением трансляции или распадом мРНК. Функции имитаторов миРНК: имитаторы миРНК ведут себя, как эндогенная миРНК. Следовательно, трансфекция имитатором миРНК. приводит к дальнейшему снижению уровня белка. Функции ингибиторов миРНК: трансфекция ингибитором миРНК приводит к росту уровня белка. Ингибиторы миРНК подавляют ее функционирование посредством нескольких возможных механизмов, включающих связывание со зрелой миРНК, интерференцию биогенеза мРНК, подавление преобразования предшественников миРНК или препятствование переносу из ядра. Интернет-ресурсы, посвященные миРНК Полезные ссылки об исследовании миРНК включают: Обзор продуктов, статей и применения миРНК — www.qiagen.com/miRNA Веб-портал GeneGlobe® — www.qiagen.com/GeneGlobe Ресурс о профилировании миРНК — www.qiagen.com/miRNAprofiling Ресурс об экспериментах с имитаторами/ингибиторами миРНК — www.qiagen.com/miRNAfunction Синтез продуктов миРНК по заказу — www.qiagen.com/miDesign Протоколы трансфекции имитаторами или ингибиторами миРНК — www.qiagen.com/TransFect Указания по использованию контролей миРНК — www.qiagen.com/miRNAcontrols Технологии пробоподготовки и анализа 3 Очистка миРНК Очистка миРНК QIAGEN предлагает наборы miRNeasy и PAXgene miRNA для очистки тотальной РНК, включая миРНК Таблица 1. Наборы для очистки миРНК Тип пробы Клетки* и ткани Набор miRNeasy Mini Kit Срезы тканей, фиксированные формалином и залитые парафином Ткани, фиксированные и стабилизированные в PAXgene Tissue Containers †‡ , miRNeasy 96 Kit § miRNeasy FFPE Kit PAXgene Tissue miRNA Kit Кровь животных, стабилизированная в пробирках для крови животных RNAprotect Animal Blood Tubes miRNeasy Protect Animal Blood Kit Человеческая кровь, стабилизированная в PAXgene Blood RNA Tubes PAXgene Blood miRNA Kit Человеческая сыворотка и плазма QIAamp® Circulating Nucleic Acid Kit * Дополнительный протокол для очистки миРНК из клеток с использованием RNeasy® Plus Mini Kit и RNeasy MinElute® Cleanup Kit имеется на www.qiagen.com/RNeasyPlusResources. † Автоматизируется на QIAcube® (подробнее см. на www.qiagen.com/products/Automation/QIAcube.aspx) ‡ Разработанный пользователями протокол очистки миРНК из сыворотки или плазмы с использованием miRNeasy Mini Kit имеется на www.qiagen.com/miRNeasyMiniResources. § Автоматизируется на BioRobot ® Universal System. Наборы miRNeasy Для эффективной очистки миРНК из тканей и клеток, крови, или фиксированных формалином и залитых парафином тканей Эффективная очистка миРНК Эффективное обогащение миРНК и других малых РНК в отдельной фракции Получение РНК высокой очистки, пригодной для проведения любых дальнейших исследований Очистка тотальной РНК или обогащение миРНК Наборы miRNeasy дают возможность очистки тотальной РНК, включая РНК длиной приблизительно 18 и более нуклеотидов (н). В качестве альтернативы, фракция, обогащенная миРНК (<~200 н) и фракция тотальной РНК (>~200 н) из всех типов тканей, за исключением тканей, фиксированных формалином и залитых парафином, могут очищаться раздельно. РНК, очищенная с использованием наборов miRNeasy подходит для использования в дальнейшей работе, например, нозерн-блоттинг, количественный анализ, ОТ-ПЦР в реальном времени. Обогащение малых РНК может обеспечить лучшие результаты для некоторых методов, таких, как анализ с использованием микрочипов. Для тканей и клеток мини-набор miRNeasy Mini Kit дает низкий выход очистки РНК с использованием колонок для центрифугирования, а набор miRNeasy 96 используется для очистки с высоким выходом в 96-луночном формате. Для тканей, фиксированных формалином и залитых парафином, набор miRNeasy FFPE предотвращает модификацию РНК формальдегидом и высвобождает РНК из срезов тканей, исключая в дальнейшем деградацию РНК. Для крови набор miRNeasy Protect Animal Blood Kit очищает РНК из крови животных, собранной в пробирки RNAprotect Animal Blood Tubes, содержащие реагент, предохраняющий профили мРНК и миРНК. 4 www.interlabservice.ru miRNA purification Очистка миРНК miRNA purification miRNA purification Эффективная очистка из тканей и клеток Наборы miRNeasy эффективно очищают РНК из тканей и клеток даже при использовании малых количеств исходного материала. РНК может очищаться из различных тканей и клеток, включая плохо лизируемые. Очистка тотальной РНК, включая миРНК, позволяет провести прямое сравнение уровней экспрессии миРНК с уровнями экспрессии референтных генов или любых других интересующих миРНК (Рис. 1). РНК высокой степени очистки РНК, приготовленная с использованием наборов miRNeasy имеет высокую очистку и готова к дальнейшему применению с использованием чувствительных методов. Работа с использованием набора miRNeasy устраняет возможность загрязнения солями или фенолом, которые могут мешать дальнейшему анализу (Рис. 2). В дополнение к более высокой очистке, наборы miRNeasy обеспечивают лучший выход по сравнению с альтернативными методами очистки миРНК, такими, как использование реактивов на основе фенола (Рис. 2В). Даже при работе со срезами, фиксированными формалином и залитыми парафином, использование набора miRNeasy FFPE обеспечивает высокий выход РНК и хорошую работу (Рис. 3). Рис. 1. Эффективная совместная очистка из широкого спектра тканей. Тотальная РНК, включая миРНК, очищалась из образцов тканей крыс (навески по 25 мг), стабилизированных RNAlater® с использованием набора miRNeasy 96. Очищенная РНК использовалась в качестве матрицы в количественном анализе методом ОТ ПЦР в реальном времени для определения миРНК miR-16 и мРНК большего размера гена PGK1. Результаты показывают успешное обнаружение как мРНК PGK1 (большая РНК), так и miR-16 (малая РНК) из одних и тех же элюатов. Cell number – Количество клеток Liver - Печень Spleen – Селезенка Thymus - Тимус Kidney - Почка Brain - Мозг Heart - Сердце Intestine - Кишечник Lung - Легкое Muscle - Мышца Pancreas – Поджелудочная железа 1 0. 8 miRNeasy Фенольный реактив Фенольный реактив OD 0. 6 0. 4 Средний выход, мкг 7 0. 2 miRNeasy ткань, фиксированная формалином и залитая парафином Поставщик A 6 5 4 3 2 1 0 0 -0.2 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 27 Печень miRNeasy ткань, фиксированная формалином и залитая парафином Поставщик A 26 miR-16 среднее CT Рис. 2. Набор miRNeasy работает лучше фенольного реактива. Суммарная РНК, включающая миРНК, очищалась из клеток линии Jurkat c использованием miRNeasy Mini Kit или фенольного реактива от Поставщика I. После очистки миРНК из 1 x 106 клеток, спектры поглощения показывали максимум оптической плотности 260 нм для РНК, очищенной с использованием набора miRNeasy. Напротив, когда для очистки РНК использовали фенольный реактив, максимум оптической плотности был выше 260 нм, что указывало на примесь фенола. Кроме того, показания OD230 были выше для РНК, приготовленной с использованием фенольного реактива, указывая на загрязнение солями. Очищенная РНК использовалась в качестве матрицы в количественном ОТ-ПЦР в реальном времени для миРНК miR-16. Результаты показали, что значения С после очистки с помощью набора miRNeasy были ниже, указывая на то, что было очищено большее количество миРНК. миРНК успешно очищалась даже из 1 x 102 клеток с использованием набора miRNeasy. Напротив, миРНК не обнаруживалась после 40 циклов ПЦР из 1 x 102 клеток, если для очистки использовался фенольный реактив. Легкие 25 24 23 22 21 20 QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit Недавно проведенные исследования показали, что сывороточные миРНК могут служить потенциальными биомаркерами для выявления различных видов рака и других заболеваний, таких, как диабет. Используя РНК, выделенную из сыворотки или плазмы, была показана уникальная экспрессия миРНК для нескольких видов рака. QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit дает возможность выделения тотальной РНК из плазмы или сыворотки. Последующее количественное определение миРНК может выполняться с использованием ПЦР-системы miScript. Легкое Печень Рис. 3. Более высокий выход и лучшая действенность при работе со срезами, фиксированными формалином и залитыми парафином. РНК очищалась из фиксированных формалином и залитых парафином срезов указанных тканей крыс, используя набор miRNeasy FFPE Kit или аналогичный набор от Поставщика А Выходы РНК определялись измерением спектра поглощения при 260 нм. Очищенная РНК использовалась в качестве матрицы при количественном определении миРНК miR-16 в ОТ-ПЦР в реальном времени с применением ПЦР-системы miScript. В результате было показано, что значения Сt были ниже после очистки с использованием набора miRNeasy FFPE Kit, что указывает на то, что очистилось большее количество миРНК, чем при использовании набора от Поставщика А. Технологии пробоподготовки и анализа 5 Очистка миРНК Наборы PAXgene miRNA Для очистки миРНК и тотальной РНК из тканей или цельной крови Интегрированные системы для сбора, стабилизации и очистки Эффективная очистка миРНК и тотальной РНК Высококачественная миРНК из тканей с сохраненной морфологией или из крови Система миРНК — PAXgene Tissue — инновационная технология фиксации тканей и очистки миРНК Контейнеры PAXgene Tissue в сочетании с набором PAXgene Tissue miRNA Kit дают возможность фиксации и хранения образцов тканей, которые могут быть залиты парафином и использованы для исследований патологий и последующей очистки суммарной РНК, включая миРНК, из одних и тех же проб. Эта инновационная система позволяет обходиться без формальдегидных фиксаторов, которые формируют поперечные сшивки нуклеиновых кислот и могут привести к их распаду и препятствовать применению чувствительных методов для дальнейшей работы с ними. Как молекулярные, так и традиционные патологические тесты могут выполняться на одном образце. Система миРНК — PAXgene Blood — интегрированные сбор, стабилизация и очистка миРНК из образцов крови человека миРНК-система PAXgene Blood состоит из РНК-пробирок PAXgene Blood (есть в базе данных,кат. № 762165) для сбора, стабилизации и транспортировки крови и миРНК-набора PAXgene Blood miRNA Kit для очистки суммарной РНК, включая миРНК. Очистка может производиться вручную с использованием микроцентрифуги или автоматически на QIAcube. Набор обеспечивает полную подготовку для проведения молекулярного анализа – сбор и стабилизацию – вплоть до очистки высококачественной тотальной РНК, включая миРНК (Рис. 4). A 27 miScript Primer Assay hsa-mir 30b 27 PAXgene Blood miRNA Kit PAXgene Blood RNA Kit 25 25 23 23 21 21 CT CT B miScript Primer Assay hsa-mir 16 19 19 17 17 15 PAXgene Blood miRNA Kit PAXgene Blood RNA Kit 15 Донор 7 Донор 8 Донор 9 Донор 10 Среднее Донор 7 Донор 8 Донор 9 Донор 10 Среднее Рис. 4. Анализ очищенной миРНКhsa-mirthe с помощью ПЦР-системы miScript. Кровь собиралась в пробирки PAXgeneBlood RNA Tubes и хранилась в течении 24 часов при комнатной температуре. РНК очищалась с использованием набора PAXgene Blood miRNA Kit или PAXgene Blood RNA Kit. миРНК анализировались с использованием ПЦР-системы miScript PCR System с праймерами miScript Primer Assay для: mir-16 человека или mir-30b человека. Меньшие значения Ct для РНК, очищенной с использованием набора PAXgene Blood miRNA Kit указывают на более высокое содержание этих типов миРНК, 6 6 www.interlabservice.ru Количественный анализ миРНК ПЦР-система miScript PCR System Для обнаружения сотен миРНК при проведении одной реакции синтеза кДНК с применением ПЦР в реальном времени на основе SYBR® Green Чувствительное, специфичное количественное определение множества миРНК из одной кДНК Количественное определение зрелой миРНК, миРНК-предшественника и других малых РНК из одной и той же кДНК Гибкие форматы планшетов и объемы для миРНК-специфичного анализа Самостоятельная разработка анализа для миРНК, не приведенных в базе miRBase Количественное определение миРНК с применением ПЦР-системы miScript PCR System ПЦР-система miScript является трехкомпонентной системой, которая охватывает все этапы преобразования РНК в кДНК, а также применяется для детекции миРНК с использованием метода ПЦР в реальном времени с флуоресцентным красителем SYBR Green. ПЦР-система miScript может также использоваться для обнаружения миРНК-предшественника, других малых РНК, таких, как snoРНК, piРНК, а также мРНК. ПЦР-система miScript PCR включает следующие компоненты: Набор для проведения обратной транскрипции miScript Reverse Transcription Kit Набор дает возможность простого одноэтапного синтеза кДНК. Одна реакция синтеза кДНК может использоваться для обнаружения сотен различных РНК (мРНК, малых РНК или миРНК). Набор miScript SYBR Green PCR Kit Набор включает мастер-микс для ПЦР и универсальный miScript праймер, который позволяет обнаруживать миРНК в сочетании с miScript Primer Assay miScript Primer Assay или miScript Precursor Assay miScript Primer Assay является миРНК-специфичным прямым праймером, разработанным для выявления зрелой миРНК с использованием новейшей информации из базы данных miRBase. Для обнаружения предшественников миРНК может также использоваться miScript Precursor Assay. Набор miScript для обратной транскрипции (Reverse Transcription Kit) Набор miScript для обратной транскрипции включает смесь miScript Reverse Transcriptase Mix и буфер miScript RT Buffer для проведения обратной транскрипции. Смесь miScript для обратной транскрипции представляет собой усовершенствованную смесь ферментов, которая включает поли(А) полимеразу и обратную транскриптазу. Буфер miScript был разработан специально для использования со смесью miScript для обратной транскрипции, чтобы обеспечить максимальную активность обоих ферментов. Она включает Mg2+, dNTP, олиго-дТ-праймеры и случайные праймеры. В отличие от мРНК, миРНК в природе не бывают полиаденилированными. В ходе этапа обратной транскрипции миРНК полиаденилируются поли(А) полимеразой. Параллельно, обратная транскриптаза превращает миРНК и мРНК в кДНК. Параллельные реакции делают превращение миРНК в кДНК очень быстрым и простым, так что процесс может происходить в одной пробирке. Олиго-дТ-праймеры имеют универсальную метку на 5’-конце, которая позволяет проводить этап ПЦР в реальном времени (Рис. 5). Технологии пробоподготовки и анализа 7 Количественный анализ миРНК Рис. 5. Принцип работы miScript. Количественное определение с применением ПЦР-системы. ПЦР-системы miScript состоит из этапа обратной транскрипции, за которым следует ПЦР в реальном времени. mRNA – мРНК 1st PCR cycle – 1-й цикл ПЦР miRNA – миРНК Subsequent PCR cycles – последующие циклы ПЦР Random primer – Случайный праймер forward primer – прямой праймер Oligo dT primer with universal tag – Олиго дТ-праймер с универсальной меткой reverse primer – обратный праймер Reverse transcription – обратная транскрипция Polyadenylation - Полиаденилирование cDNA - кДНК Набор для ПЦР miScript SYBR Green Набор для ПЦР miScript SYBR Green включает мастер-микс для ПЦР QuantiTect® SYBR Green и праймер miScript Universal Primer, специфичный для универсальной метки-последовательности на 5’-конце кДНК. кДНК служит матрицей для ПЦР-анализа в реальном времени с использованием miScript Universal праймер вместе с миРНК-специфичным праймером (miScript Primer Assay). Одной реакции синтеза кДНК достаточно, чтобы проверить сотни различных миРНК с помощью ПЦР в реальном времени, используя различные miScript Primer Assays, которые дают возможность всеобъемлющего профилирования экспрессии известных миРНК. Кроме того, кДНК может использоваться для выявления различных типов РНК с применением разных праймеров на этапе ПЦР в реальном времени (Рис. 6). Рис. 6. Этапы количественного определения типов РНК с использованием ПЦР-системы miScrip. Очищенная РНК обратно транскрибируется, и получившаяся в результате кДНК используется для основанной на SYBR Green ПЦР в реальном времени. Для количественного определения мРНК ПЦР производится с применением QuantiTect Primer Assay. Для количественного определения зрелой миРНК ПЦР производится с использованием miScript Primer Assay и miScript Universal Primer. Для количественного определения предшественников миРНК в ПЦР применяется miScript Precursor Assay. Для определения количества других малых РНК для амплификации используется miScript Primer Assay (от GeneGlobe или произведенный по отдельному заказу miScript Primer Assay), а также miScript Universal Primer. 8 Ткань/клетки Набор miRNeasy Тотальная РНК Набор для обратной транскрипции miScript кДНК Набор для ПЦР miScript SYBR Green мРНК QuantiTect Primer Assays Зрелые миРНК Пре-миРНК miScript Primer Assays miScript Precursor Assays www.interlabservice.ru Другие некодирующие РНК Некодирующие РНК-специфичные miScript Primer Assays Количественное определение миРНК miScript Primer тест Пре-миРНК зрелая миРНК miScript Precursor тест 30 25 20 15 mir-18a let-7 a -1 let-7 a -2 let-7 a -3 let-7 b let-7 f-1 mir-20a mir-27a mir-30a mir-98 mir-221 mir-224 mir-30c-2 mir-24-2 mir-181a-2 mir-103-2 S N O RA U6B miScript Primer Assay — это единичный миРНК-специфичный праймер, который используется в сочетании с ПЦР-набором miScript SYBR Green для ПЦР зрелой миРНК в реальном времени с использованием детекции с помощью SYBR Green. ПЦР-набор miScript SYBR Green включает универсальный праймер miScript, который необходим для успешной амплификации в сочетании с miScript Primer Assay. miScript Primer Assays для миРНК человека, мыши, крысы и вирусов, snРНК и snoРНК можно приобрести онлайн на веб-портале QIAGEN GeneGlobe (www.qiagen. com/GeneGlobe). Имеющиеся в продаже форматы включают пробирки, 96-луночные планшеты, 384-луночные планшеты и наборы. Mean CT 35 Рис. 7. Выявление зрелой миРНК и предшественников миРНК. РНК очищена из образцов клеток HeLa S3 с использованием набора miRNeasy, далее проводили количественный анализ уровня зрелой миРНК или предшественников миРНК с использованием метода ПЦР в реальном времени с использованием системы miScript PCR System. miScript Primer Assays использовали для количественного определения предшественников миРНК. Для стандартизации использовали miScript Primer Assays для RNU6B and SNORA73A. ПЦР в реальном времени проводили с использованием амплификатора Rotor-Gene Q. Mean CT 25 G H G H 25 M PremiRNA miR-7-1 miR-7-2 miR-7-3 bp 125 100 75 50 25 ПреОжидаемый Локализация Expected Expected Chromosomal миРНК в хромасоме size (bp) size (bp)размер location miR-7-1 76 9 9 76 76 miR-7-2 55 15 15 55 55 miR-7-3 77 19 19 77 77 Pr em Pr iRe- 7m 1 Pr iR-7 eM mi -2 at Rur 7e m 3 iR -7 SN U OR 6 B A7 3A 15 -7 -3 m m G H bp 125 100 75 50 20 iR 2 -7 - m 30 iR B iR A -7 -1 Выявление предшественников миРНК производится с использованием miScript Precursor Assay вместо miScript Primer Assay. Каждый miScript Precursor Assay состоит из прямого и обратного праймеров, специфичных для миРНКпредшественника. miScript Precursor Assays применяются в сочетании с ПЦР-набором miScript SYBR Green. Универсальный праймер miScript, поставляемый в ПЦР-наборе miScript SYBR Green, не используется для амплификации предшественников миРНК. miScript Precursor Assays можно приобрести онлайн на веб-портале QIAGEzGeneGlobe (www.qiagen.com/GeneGlobe). Выявление миРНК-предшественника делает возможным исследование биогенеза, регуляции и функционирования миРНК. Данные, приведенные на Рис. 7, показывают, что относительные уровни зрелой миРНК и предшественников миРНК варьируют у различных миРНК. Кроме того, зрелые миРНК могут при различных условиях экспрессироваться из разных миРНКпредшественников (Рис. 8). Рис. 8. Три возможных миРНК-предшественника одной зрелой миРНК. Три миРНК-предшественника, полученные из 3 отдельных участков хромосом, могут образовывать зрелую mir-7. РНК очищалась из клеток HeLa S3 с использованием мини-набора miRNeasy и переводилась в кДНК с использованием набора miScript для обратной транскрипции. Геномная ДНК человека использовалась с ПЦР-системой miScript для количественного анализа с помощью ПЦР в реальном времени 3-ех РНК-предшественников (применялись соответствующие miScript Precursor Assays) или зрелой miR-7 (применяя miScript Primer Assay и miScript Universal Primer). ПЦР в реальном времени проводили на приборе Rotor-Gene® Q. Для стандартизации использовали miScript Primer Assays для RNU6B и SNORA73A. Только один из 3 предшественников миРНК (miR-7-1) экспрессировался при этих условиях. Продукты ПЦР нужного размера амплифицировались из геномной ДНК (3), показывая, что miScript Precursor Assays амплифицировал верно. Когда в качестве матрицы использовалась кДНК, обнаруживались только продукты ПЦР miR-7-1, показывая, что при данных экспериментальных условиях экспрессируется только предшественник миРНК. Технологии пробоподготовки и анализа 9 Количественное определение миРНК Чувствительное, специфичное обнаружение миРНК 34 miR15 Линейная (miR15) Среднее CT 29 24 19 14 1 2 3 4 5 Запись числа копий миРНК 6 Рис. 9. Точное обнаружение в количествах всего лишь от 10 копий миРНК. Синтетическая miR-15 использовалась для генерирования кДНК с применением набора для обратной транскрипции miScript Reverse Transcription. ПЦР в реальном времени проводили с применением ПЦР-системы miScript для ряда разведений от 10 до 106 копий кДНК. ПЦР в реальном времени проводили на амплификаторе Rotor-Gene Q. Конечные значения CT линейно снижались с возрастанием числа копий миРНК, показывая чувствительное выявление в широком спектре концентраций матрицы. Таблица 2. Изоформы семейства Let-7 у человека При использовании ПЦР-системы miScript для реакции синтеза кДНК зависимость практически линейна, таким образом ПЦР-система обеспечивает чувствительное, точное количественное определение при последующей ПЦР в реальном времени. ПЦР-система miScript, используемая в сочетании с амплификатором Rotor-Gene Q, обеспечивает успешное обнаружение очень небольших количеств миРНК — от 10 копий миРНК (Рис. 9). Существование многочисленных изоформ миРНК существенно осложняет количественный анализ миРНК. Праймеры miScript Primer Assays высокоспецифичны и способны различать изоформы, как показано на примере семейства Let-7. Восемь изоформ человеческих Let-7 с различным составом и длиной нуклеотидной последовательности использовались в этих экспериментах (Let-7a– Let-7i, Таблица 2). В большинстве случаев перекрестная реактивность была очень низкой и недостоверной (Таблица 3). Там, где наблюдалась перекрестная реактивность, она имела низкие уровни (например, ~6% для праймера Let-7a miScript Primer Assay с кДНК Let-7f). Эти результаты показывают, что miScript Primer Assays специфичны по отношениию к изоформам. Таблица 3. Специфичность miScript Primer Assays Последовательности miRNA Let-7a UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU Let-7b UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU Let-7c UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU Let-7d AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGU• Let-7e UGAGGUAGGAGGUUGUAUAGU• Let-7f UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU Let-7g UGAGGUAGUAGUUUGUACAGU• Let-7i UGAGGUAGUAGUUUGUGCUGU• Относительное выявление (в % от полного совпадения) кДНК, примененные в ПЦР Let-7a Эти сиквенсы показывают изоформы Let-7. Замены оснований показаны красным и подчеркнуты. Изменения длины указаны красной точкой. Использованный miScript Primer Assay Let-7a Let-7b Let-7c Let-7d Let-7e Let-7f Let-7g Let-7i 100.00 0.00 0.29 0.33 2.44 0.01 0.00 0.00 Let-7b 0.00 100.00 1.68 0.00 0.00 0.01 0.00 0.00 Let-7c 0.27 0.14 100.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 Let-7d 4.11 0.00 0.03 100.00 0.01 0.00 0.00 0.00 Let-7e 1.23 0.00 0.01 0.01 100.00 0.00 0.00 0.00 Let-7f 5.77 0.00 0.00 0.00 0.00 100.00 0.00 0.00 Let-7g 0.01 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 100.00 0.00 Let-7i 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 100.00 Синтетические миРНК каждой изоформы Let-7 (a–i) применялись в реакциях синтеза кДНК, выполненных с помощью набора miScript для обратной транскрипции. Аликвота конечной кДНК использовалась в качестве матрицы в реакциях ПЦР в реальном времени с miScript Primer Assay для каждой изоформы и с ПЦР-набором miScript SYBR Green. Процент относительного выявления вычислялся с использованием различий между значениями С, полученными от несовпадающих miScript Primer Assays и таковыми от точно совпадающих miScript Primer Assays (% относительного выявления = 2 -–∆СТ x 100). Стабильность и высокое качество выполнения ПЦР в реальном времени с помощью Rotor-Gene Q Прибор QIAGEN для ПЦР в реальном времени — Rotor-Gene Q — обладает множеством особенностей для обеспечения отличной работы и надежных результатов, которых требует исследование миРНК. Вместе с ПЦР-системой miScript, Rotor-Gene Q дает возможность поточного количественного анализа миРНК и широкого спектра приложений ПЦР. Подробнее о Rotor-Gene Q см. на сайте www.qiagen.com/Products/Rotor-GeneQ.aspx. 10 www.interlabservice.ru Количественное определение миРНК ПЦР-контроли miScript При стандартизации результатов ПЦР в реальном времени для количественного определения миРНК у человека, мыши и крысы Эффективны у человека, мыши и крысы Высокая эффективность амплификации — около 100% Постоянные уровни экспрессии у широкого спектра клеток и тканей Легко заказать через GeneGlobe Уверенность в ваших результатах Для точных и воспроизводимых результатов количественного определения миРНК с помощью ПЦР в реальном времени необходимо стандартизовать количество миРНКмишени с использованием подходящих внутренних референтных РНК. Это называется относительным количественным определением. ПЦР-контроли miScript являются праймерами, дающими возможность стандартизации результатов ПЦР в реальном времени при исследовании количества миРНК с использованием ПЦР-системы miScript PCR (Рис. 10). Имеются ПЦР-контроли miScript для нескольких малых ядрышковых РНК и малых ядерных РНК (snoРНК и snРНК). Эти контроли разработаны с учетом гомологий последовательностей у человека, мыши и крысы, так что один и тот же контроль может использоваться для всех 3 видов. A Ткани человека 30 SCARNA17 SNORD25 RNU6B SNORA73A RNU5A RNU1 Mean CT 25 20 15 10 Br ai He n Ki ar t dn ey Liv e Lu r Ov ng a Sp r y le en Te Th stis y Ad mu ip s Bl ose ad de Es Cer r Sm op v al ha ix l in gu te s st in Co e Sk l P el r on et os al ta m te u Pl scl ac e e Th nta y Tr roid ac h He ea la S3 Ju rk at 5 B Ткани мыши 30 Mean CT 25 20 15 10 C us ym le Th tic n le e Te s y Sp ar Ov ng Lu er Liv t ey dn Ki ar He yo br Em Br ai n 5 Ткани крысы 30 25 20 15 10 us Th ym le tic Te s Sp le e n y ar Ov ng Lu er Liv ey dn Ki t ar He br Em ai n yo 5 Br Mean CT Brain - Мозг Heart – Сердце Kidney - Почка Liver – Печень Lung - Легкое Ovary – Яичник Spleen – Селезенка Testa – Тестикулы Thymus – Тимус Adipose – Жировая ткань Bladder – Мочевой пузырь Cervix – Шейка матки Esophagus – Пищевод Small intestina – Тонкая кишка Colon – Толстая кишка Prostate - Простата Skeletal muscle – Скелетная мышца Placenta – Плацента Thyroid – Щитовидная железа Trachea – Трахея Thymus – Тимус Embryo – Эмбрион Рис. 10. Постоянные уровни экспрессии РНК, выбранных мишенями для ПЦР-контролей QIAGEN miScript. Тотальную РНК из различных тканей человека, а также клеток HeLa S3 и Jurkat, различных тканей мыши, различных тканей крысы преобразовывали в кДНК, после чего производилсь ПЦР в реальном времени с использованием ПЦР-системы miScript и каждого из указанных ПЦР-контролей miScript (для обратной транскрипции использовался 1 мкг тотальной РНК, а для ПЦР использовались 0,5 нг кДНК). Значения CT показывают, что уровни экспрессии каждой РНК очень близки в различных типах тканей и клеток. Технологии пробоподготовки и анализа 11 Функциональные исследования миРНК Имитаторы и ингибиторы миРНК miScript Для исследований функционирования и генной регуляции миРНК: Готовый к трансфекции имитаторы ведут себя, как эндогенные зрелые миРНК Готовые к трансфекции ингибиторы подавляют функционирование эндогенной миРНК Имеются в наличии для всех миРНК человека, мыши, крысы и вирусов в текущей miRBase Гибкий выбор форматов, масштабов и степеней миРНК, не приведенные в базе данных miRBase, могут быть синтезированы по заказу Функциональные исследования миРНК l co nt ro l Ne g. ic im M Ne im g. ic co nt ro tro l co n M M Ne im g. ic co n g. ic M Un im tra ns fe c tro l te d A Ne Рис. 11. Сравнимое снижение экспрессии эндогенными миРНК и имитатором миРНК. miR-1 не экспрессируется эндогенно в клетках HeLa S3. miR-16 экспрессируется в клетках HeLa S3 на высоких уровнях. Клетки HeLa S3 (6 x 104 клеток на лунку) трансфицировались конструктом с люциферазным репортером, имеющим сайт связывания miR-1 на 3’НТР; трансфицировались конструктом с люциферазным репортером, имеющим сайт связывания miR-1 на 3’НТР и имитатором miR-1 или трансфицировались конструктом с люциферазным репортером, имеющим сайт связывания miR-16 на 3’НТР. Спустя двадцать четыре часа измерялась активность люциферазы. Имитатор miR-1 показал примерно такое же снижение люциферазной активности, что и эндогенный miR-16. Имитаторы миРНК miScript являются синтетическими двунитевыми РНК, которые напоминают встречающиеся в природе миРНК после трансфекции в клетки. Ингибиторы миРНК miScript синтетические однонитевые химически модифицированные РНК, которые специфически ингибируют функционирование миРНК после трансфекции в клетки. Трансфекция имитаторами или ингибиторами, сопровождающаяся в дальнейшем экспрессией генов или анализом фенотипов, производится для выяснения мишеней и роли конкретных миРНК. Сниженная экспрессия гена после трансфекции имитатором или возросшая экспрессия после трансфекции ингибитором доказывает, что исследуемая миРНК участвует в регуляции этого гена (см. схему на стр. 3). Обычно такие эксперименты включают трансфекцию имитатором или ингибитором или котрансфекцию конструктом вектора, несущим сайт, связывающий миРНК, сопряженный с геном-репортером. Последующий анализ может включать измерения показателей репортера ПЦР в реальном времени, анализ с использованием микрочипов, или анализ белков. За примерами, часто задаваемыми вопросами и публикациями по функциональному анализу миРНК обращайтесь на www.qiagen.com/miRNAfunction. 55 – 55 – 72 h 96 h l nt g. Ne M im ic co nt co Ne g. ic im M Ne ro l ro l tro g. co n ic im M g. co n Ne ic im M tra ns fe tro l ct e d B 250– 130– 55 – 24 h 12 48 h 24 h Un Рис. 12. Снижение уровня белка после трансфекции имитатором miScript miR-1. PDCD4 and HDAC4 являются мишенями miR-1. Клетки HeLa S3 трансфицировались 2нМ miR-1 или siРНК AllStars Negative Control в качестве отрицательного контроля с использованием реагента для трансфекции HiPerFect. Спустя 24, 48, 72 и 96 часов уровни белков PDCD4 и HDAC4 анализировались вестерн-блоттингом (верхние полосы). Тубулин также анализировался в качестве внутреннего контроля (нижние полосы). PDCD4 во всех точках по времени показал снижение уровня белка в пробах, трансфицированных имитатором miScript miR-1. У HDAC4, спустя 24 часа не наблюдалось никаких изменений. Однако через 48, 72 и 96 часов уровень белка в пробах, трансфицированных имитатором miScript miR-1 снизился. 48 h www.interlabservice.ru 72 h 96 h Функциональные исследования миРНК Имитаторы миРНК действуют аналогично эндогенным зрелым миРНК Имитаторы миРНК miScript вызывают снижение экспрессии генов подобно наблюдаемому у эндогенных миРНК (Рис. 11). Снижение генной экспрессии опосредовано на уровне трансляции (Рис. 12). Экспрессия генов эффективно ингибируется на время до 72 часов после трансфекции (данные не приведены). Reporter without miRNA binding site – Репортер без сайта связывания миРНК Reporter with miRNA binding site – Репортер с сайтом связывания миРНК Normalized RLU – Стандартизовано, относительные единицы люминесценции Ингибиторы миРНК miScript эффективно ингибируют эндогенную миРНК Ингибиторы миРНК miScript разработаны и модифицированы для обеспечения эффективного подавления функций эндогенной миРНК (Рис. 13). ПЦР-анализ в реальном времени выявил достоверное снижение уровня миРНК после трансфекции ингибитором миРНК miScript (Рис. 14). Эксперименты по динамике ингибирования во времени показывают, что ингибиторы миРНК miScript эффективно действуют в течение по крайней мере 96 часов после трансфекции (данные не приведены). Трансфекция имитаторами и ингибиторами Технологии трансфекции QIAGEN обеспечивают высокую эффективность трансфекции и низкую цитотоксичность. Они включают: Реактив для трансфекции НiPerFect для трансфекции имитаторами и ингибиторами Реактив для трансфекции Аttractene для котрансфекции имитаторами ингибиторы и плазмидную ДНК Указания по трансфекции, протоколы и рекомендованные контроли (www.qiagen.com/miRNAfunction and www.qiagen.com/TransFect) Рис. 13. Ингибитор миРНК miScript противодействует индуцированному миРНК сайленсингу. Клетки HeLa S3 экспрессируют miR-16 на высоком уровне и не экспрессируют miR-1. Клетки HeLa S3 (6 x 104 клеток на лунку) котрансфицировались конструктом с сайтами связывания miR-16 на 3’ НТР и люциферазным репортером вместе с ингибитором miR-16. Ингибитор miR-16 в эксперименте использовался в разных концентрациях, чтобы оценить оптимальную концентрацию ингибитора, необходимую для получения ингибиторного эффекта. Кроме того, клетки трансфицировались только ингибитором miR-1 в качестве контроля. Люциферазный конструкт без сайта связывания миРНК (дикий тип) трансфицировался в качестве положительного контроля. Повышение экспрессии люциферазы вслед за трансфекцией ингибитором miR-16 указывало, что он не позволяет miR-16 снижать экспрессию репортерного гена. A B Отрицат. контроль miScript Inhibitor Планшеты и наборы miScript Чтобы обеспечить гибкость в экспериментах по профилированию и скринингу, у QIAGEN имеются miScript Primer Assays, имитаторы миРНК miScript и ингибиторы миРНК miScript в широком спектре форматов, включая пробирки, 96-луночные или 384-луночные планшеты. Для проектов по профилированию, охватывающих все миРНК человека, мыши или крысы в базе данных miRBase, QIAGEN поставляет miScript Primer Assay Sets в 96-луночных или 384-луночных планшетах. Списки интересующих миРНК и подробности расположения в лунках плашек имеются на www.qiagen.com/products/miRNA/miScriptSystem.aspx. Рис. 14. Трансфекция ингибитором миРНК miScript снижает уровень эндогенной миРНК. Клетки HeLa S3 (6 x 104 клеток на лунку) трансфицировались с использованием реагента для трансфекции HiPerFect с ингибитором миРНК miScript miR-16 или отрицательным контролем. Уровни эндогенного miR-16 оценивались количественно с помощью ПЦР в реальном времени с использованием ПЦР-системы miScript. U6B использовался в качестве референтной РНК для стандартизации данных, а уровни miR-16 выражались в виде значений 2–∆ ∆СТ по отношению к уровням miR-16 в нетрансфицированных клетках. Трансфекция ингибитором miScript miR-16 сильно снижала количество обнаруживаемой эндогенной miR-16. Графики амплификации показывали существенное снижение уровня обнаруживаемой miR-16 как результат трансфекции ингибитором miR-16. Анализ кривых диссоциации (вставка) отражает специфичность выявления с помощью ПЦР в реальном времени с применением ПЦР-системы miScript P. Технологии пробоподготовки и анализа 13 Таблица 4. Планшеты и наборы, необходимые для работы Продукт Форматt Масштаб миРНК-мишени miScript Primer Assay Plate 96-луночный; 384-луночный 20 реакций (96- луночный; 384-луночный); 100 реакций (96-луночный) Выбранные миРНК (заказанные или ранее разработанные) Human miScript Assay Set 96- луночный; 384-луночный 20 реакций (96- луночный; 384-луночный); 100 реакций (96-луночный) Все миРНК человека в miRBase Mouse miScript Assay Set 96- луночный; 384-луночный 20 реакций (96- луночный; 384-луночный); 100 реакций (96-луночный) Все миРНК мыши miRBase Rat miScript Assay Set 96- луночный; 384-луночный 20 реакций (96- луночный; 384-луночный); 100 реакций (96-луночный) Все миРНК крысы miRBase miScript miRNA Mimic Plate 96- луночный; 384-луночный 1 нмоль (96-луночный; 384-луночный); 5 нмоль (96-луночный) Выбранные миРНК (заказанные или ранее разработанные) miScript miRNA Inhibitor Plate 96- луночный; 384-луночный 1 нмоль (96-луночный; 384-луночный); 5 нмоль (96-луночный) Выбранные миРНК (заказанные или ранее разработанные) Изготавливаемые по заказу продукты miScript, отвечающие вашим потребностям В продаже имеются miScript Primer Assays, имитаторы миРНК miScript miRNA и ингибиторы миРНК miScript для каждой миРНК человека, мыши, крысы и вирусов в текущей версии базы данных miRBase. Если интересующей миРНК нет в базе данных miRBase, имитатор, ингибитор или образец могут быть синтезированы по заказу. Информация на сайте www.qiagen.com/miDesig. Веб-портал GeneGlobe Веб-портал QIAGEN’s GeneGlobe – ваш ресурс для заказа продуктов миРНК. Enter search terms – введите условия поиска Enter miRNA name (Введите название миРНК) Enter species (Введите вид) Click “Search” Нажмите «Поиск» Click “View products” Select product (Выберите продукт) 14 www.interlabservice.ru Click “Add to Cart” Нажмите «Добавить в корзину» Информация для заказов Продукт miRNeasy Mini Kit (50) Состав Колонки, пластик и реактивы для 50 выделений № по каталогу 217004 miRNeasy 96 Kit (4) Колонки, пластик и реактивы для 4 x 96 выделений 217061 miRNeasy FFPE Kit (50) Колонки, пластик и реактивы для 50 выделений 217404 Набор для крови животных miRNeasy Protect Animal Blood Kit (50) Колонки, пластик и реактивы для 50 выделений 217304 Пробирки для крови животных RNAprotect Animal Blood Tubes (50 x 100 мкл) 50 пробирок для 100 мкл образцов крови животных 76544 Пробирки для крови животных RNAprotect Animal Blood Tubes (50 x 500 мкл) 50 пробирок для 500 мкл образцов крови животных 76554 Набор PAXgene Tissue miRNA Kit (50) Колонки, пластик и реактивы для 50 выделений 766134 PAXgene Tissue Containers (10) 10 контейнеров для сбора, фиксации и стабилизации 10 проб 765112 PAXgene Blood miRNA Kit (50) Колонки, пластик и реактивы для 50 выделений 763134 QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (50) Колонки, пластик и реактивы для 50 выделений 55114 miScript Reverse Transcription Kit (10) Реактивы для 10 ОТ-реакций 218060 miScript SYBR Green PCR Kit (200) Реактивы для 200 ПЦР в реальном времени миРНК-с 218073 miScript Primer Assay (100) миРНК-специфический праймер на 100 определений miScript Precursor Assay (100) Исходная специфичная пара праймеров на 100 определений miScript miRNA Mimic Имитатор 1 нмоль или 5 нмоль, степень очистки - cell-culture–grade или 20 nmol, степень очистки animal-grade miScript miRNA Inhibitor Ингибитор культуры клеток 1 нмоль или 5 нмоль или ингибитор для образцов из животных 20 nmol (с возможностью фосфотиоатной модификации) Новейшую информацию по лицензированию и продукт-специфичных предупреждений об отказе от ответственности вы можете найти в соответствующих пособиях и пользовательских инструкциях. Пособия и пользовательские инструкции к наборам QIAGEN имеются на сайте www.qiagen.com, или могут быть заказаны в Технической службе QIAGEN, или у вашего местного дистрибьютора. Узнайте больше об исследовательских технологиях миРНК на www.qiagen.com/miRNA! Технологии пробоподготовки и анализа 15 ООО «ИнтерЛабСервис» официальный дистрибьютор продукции QIAGEN в России Россия, 119021, г. Москва, Олсуфьевский пер, д. 8, стр. 1 тел.: (495) 664 2884, факс: (495) 664 2889 e-mail: QIAGEN@interlabservice.ru www.interlabservice.ru Технологии пробоподготовки и анализа
