изучение феофитинизации хлорофилла и его аналогов в связи

АКАДЕМИЯ НАУК СССР
ИНСТИТУТ БИОХИМИИ имени А. И. БАХА
l№9
На правах рукописи
Е. В. ПАКШИНА
ИЗУЧЕНИЕ ФЕОФИТИНИЗАЦИИ ХЛОРОФИЛЛА
И ЕГО АНАЛОГОВ В СВЯЗИ СО СТРУКТУРОЙ
И ФОТОХИМИЧЕСКИМИ СВОЙСТВАМИ
ПИГМЕНТОВ
Автореферат диссертации на соискание ученой степени
' кандидата биологических наук
Научный руководитель — член-корреспондент
Академии наук СССР, профессор А. А. Красновский
Мосва — 1965
АКАДЕМИЯ НАУК СССР
ИНСТИТУТ БИОХИМИИ имени А. Н. БАХА
На правах рукописи
Е. В. ПАКШИНЛ
ИЗУЧЕНИЕ ФЕОФИТИНИЗАЦИИ ХЛОРОФИЛЛА
И ЕГО АНАЛОГОВ В СВЯЗИ СО СТРУКТУРОЙ
И ФОТОХИМИЧЕСКИМИ.СВОЙСТВАМИ
ПИГМЕНТОВ
Автореферат диссертации на соискание ученой степени:
кандидата биологических наук
Научный руководитель — член-коррешондент
Академии наук СССР, профессор А. А. Краеновский
JSacKOEcercR «рд. А'еанааСеяызз.!
Мосва — 1965
Защита диссертации состоится в Институте биохимии
им. А. Н. Баха ЛН СССР M*J<Jjc<6 -А&А^Т^
. 1965 г.
Автореферат разослан
. uuUf'JiOU.
. 1965 г.
Просьба Ваши отзьшы и замечания присылать по адресу:
г. Москва, Лешшскии проспект 33, Институт, биохимии
им. А. Н. Баха АН СССР, Ученому секретарю.
ВВЕДЕНИЕ
Превращение хлорофилла в феофитин представляет со­
бой замещение центрального атома магния в молекуле пиг­
мента на два атома (водорода:
ХЛОРОФИЛЛ + 2Н *-* ФЕОФИТИН + Mg + +
Еще Вилыитеттер и Штоль (1919) нашли, что хлорофилл «а»
быстрее превращается в феофитин, чем хлорофилл «в». Ис­
следование этой реакции в растворе," проведенное в работах
Маккинея и Джослина (1938, 1940, 1941), а также Лам орт а
(1956) показали, что эта реакция следует первому порядку,
и что хлорофилл «а» реагирует в 8—9 раз быстрее, чем хло­
рофилл «в».
По вопросу о действии света на реакцию феофитпнизации
в литературе имеются разноречивые указания. Иоргенсен и
Кид (1916) отмечали, что при экспонировании на свету кол­
лоидных растворов хлорофилла в присутствии двуокиси угле­
рода о них образовывалось больше феофитнна, чем в неосвещавшихся растворах. Рабинович в своей монографии (1.951)
указал «а неопубликованные опыты, в которых наблюдалось.
ускоряющее действие света на феофитинизацию хлорофилла
в растворе при рН более 3. По данным Ламорта (1956), свет
не ускорял феофитинизацию IB водно-'бутаноловьгх растворах
хлорофилла. По данным Аронова и Мамашей (1943), фотоокисление не стимулирует феофитинизацию.
Известно, что реакция обратимого фотовосстановления
хлорофилла в водном пиридине аскорбиновой кислотой
(Красновский 1948) сопровождается потерей магния частью
молекул пигмента. Исследование кинетики этого процесса
(Баншгстер 1959—fl961) показало, что феофитин образуется
из восстановленной формы хлорофилла через стадию восста­
новленного феофитина..Хлорофилл, восстановленный в толуо­
ловом растворе фенилгидразином, при обратной реакции так­
же подвергается феофитинизации (Евстигнеев и Гаврилова
1953).
3
Действие света на феофитинизацию заслуживает особого
рассмотрения в плане связи этого шроцеоса с обратимыми
окислителыю-восстаноюительньгми превращениями пигмен­
тов, изучение которых является одним из путей, ведущих к
выяснению природы первичных реакций фотосинтеза.
Феофитин постоянно сопровождает хлорофилл и его ана­
логи при извлечении пигментов из фотосинтезирующих орга­
низмов. В заметных количествах он накапливается в них лишь
в особых условиях. Давно известно, что в листьях растений
феофитин образуется при старении, когда происходит наруше­
ние упорядоченной структуры хлорапластсш и связанное с
этим образование из хлорофилла различных продуктов де­
струкции.
В последнее время при изучении: бактериального фотосин­
теза появляются факты, говорящие о том, что феофитин мо­
жет присутствовать в молодых фотосинтезирующих организ­
мах и даже в особых случаях выполнять в них вместо бакте­
риохлорофилла роль поглощающего свет пигмента, передавая
энергию той небольшой части бактериохлорофилла, которая
непосредственно участвует в фотореакциях фотосинтеза. Так,
"по данным Клейтона (1963), при продолжительном экспони­
ровании на сильном свету в анаэробных условиях зелено-го­
лубых мутантов Rhodopseudomonas spheroides" основная мас­
са бактериохлорофилла последних превращалась в бактериофеофитин, причем световые реакции о выделенных из этих
«феофитинизированных» клеток хроматофорах сохраняли тот
же характер, что и в исходных бактериях. Кпхара и Френ­
кель (1963) изолировали из 'молодой культуры пурпурных
фотосинтезирующих бактерий частицы, содержащие бактериофеофитин и не содержащие бактериохлорофилла. Можно
думать, что и в хлоропластах постоянно присутствует неболь­
шое количество феофитина либо как продукт деструкции
хлорофилла в непрерывной цепи его обновления, а возможно
и как 'побочный продукт окислительно-восстановительных
превращений пигментов.
-'
Главные задачи работы сводились к следующему:
'1. Сравнительное исследование скорости феофитинизацин
хлорофилла «а», хлорофилла «в», их хлорофнллпдов, протохлорофилла, бактериохлорофилла и бактериовиридина в раз­
личных органических растворителях с целью установления
'связи этой реакции со структурой пигмента а также получе"ния данных, необходимых для последующего
исследования
'действия света на этот процесс. :
4
2. Исследование действия света на феофитинизацшо хло­
рофилла и его аналогов в органических растворителях, в
твердых пленках и адсорбатах. Изучение связи реакции феофитинизации с обратимыми окислнтельно-восстанов;ителыш:
ми превращениями и необратимым фотоокислительным раз­
рушением пигментов фотосинтезнругощих организмов.
3. Сравнение по скорости феофитиннзация хлорофилла
«а» и «в» в листьях и гомогенатах. Изучение действия света
на феофитинизащию в лиетьяьх, •гомогенатах и в суспензиях
фотосинтезирующих бактерий.
Л\ЕТОДИКА
Выделение пигментов. Хлорофилл «а» и хлорофилл .«в»
получали из листьев крапивы, следуя модифицированному в
нашей лаборатории методу Цшейле и Комар с конечной хроматографической очисткой на сахорозе. Протохлорофилл из­
влекали ацетоном из внутренних оболочек тыквенных семян,
предварительно очищенных от внешних оболочек и смочен­
ных водой, пигмент далее переводили в серный эфир и хроматохрафировали на сахарной колонке из смеси петролейного и
серного ефиров (7 : 3). Бактериохлорофнлл выделяли из
культуры Rhodopseudomonas palustris, экстрагировали пиг­
менты метиловым спиртом, переводя их далее в эфир и хроматографируя на сахорозе из смеси петролейного и серного
эфнров (7 : 3). Бактериовиридин выделяли из культуры зеленьих бактерий Chloropseudomonas ethylieum, извлекая аце­
тоном, переводя пипмент далее в серный эфир с конечной хро­
матографией на сахарозе из омеси серного и петролейного
эфиров (1 : !1). Хлорофиллиды «а» и «в» получали из соот­:
ветствующих хлорофиллов, для чего раствор пигмента в 65%
ацетоне встряхивали в течение 6 часов с ацетоновым препа­
ратом хлорофнллазы из листьев сахарной свеклы, получен­
ном в условиях, близких к описанным Холден (1961).
Измерение скорости феофитвдшзации осуществляли путем
измерения спектров (поглощения на спектрофотометре СФ-5 и
на регистрирующем спектрофотометре СФ-10. Запись спект­
ров обнаруживала четкое постоянство изобестичеокнх точек,
что позволяло судить об отсутствии в данном случае какихлибо побочных, отличных от феофитини'зации процессов. Ко­
личество образовавшегося феофнтина вычисляли либо на ос­
новании измерения падения оптической .плотности в характер­
ных максимумах поглощения походных пигментов либо по
5
росту оптической плотности в максимумах поглощения обра­
зующихся феофнтннов. Требуемая кислотность а водно-слиртозЫх, водно-аЦетоновЫх и водно-тирйднновых 'растворах
пигментов создавалась добавлением щавелевой или соляной
кислот. Значения рН растворов измерялись на потенциомет­
ре «ЛН-58» со стеклянным элеиародам. Пигменты обычно
брали в концентрации 1 X Ю~5 — 3 X 10~5 м/л. Изменение
концентрации пигмента а этО'М пределе не влияло на скорость
феофнтинизацни, которая зависила лишь от концентрации
кислоты.
|Пр,и выяснении влияния света «а реакцию феофнтиниза­
цни опыты проводили в трубках Туиберга, с тем, чтобы
избежать шобочного фотоокисления. Освещение '.производи­
ли |в термостатированной установке кинолампой 500 вт с
конденсором через красный светофильтр КС-Ш, или без
светофильтра.
-Потенциометрические "измерения проводила о пиридино­
вых растворах против каломельного элезсгрода с помощью
потенцио;метра ЛП-5, согласно cxeate,. принятой в нашей ла­
боратории (Евстигнеев, Гаврилова, 1953).
I. СРАВНЕНИЕ КИНЕТИКИ ФЕОФИТИНИЗАЦИИ
ХЛОРОФИЛЛА И ЕГО АНАЛОГОВ
В ОРГАНИЧЕСКИХ РАСТВОРИТЕЛЯХ
Исследовались хлорофилл «а», хлорофилл «в», •соответст­
вующие 'им безфитольные производные— хлорофиллиды,
непосредственный предшественник хлорофилла в бношнтеги'чеакон цепи •—протохлорофилл и пигменты фотосинтезаругащих бактерий бактериохлорофилл а бактериовириднн.
Мы надеялись связать наблюдаамые различия в скорости
феофитинизацин с известными! отличиями в строении моле­
кул названных пигментов: с наличном различных заместите­
лей в пиррольных ядрах, с различным уровнем восстановленности «полуизолированных» двойных связей у протохлорофилла, хлорофилла, бактериохлорофилла, с изменениями в
цижло'пентанавам кольце .молекулы, с присутствием в моле­
куле бактериоопридина фарнезола в отличат от фитола хло­
рофилла.
Скорости феофитинизации измеряли в .различных органи­
ческих растворителях: водном ацетоне, водном этиловом
спирте, водном пиридине, серном эфире, толуоле и петролейпом 1эфире.
G
В водно-спиртовых и водно-ацетоновых растворах изме­
рения скорости реакций проводили в диапазоне рН от 2 до 5
через интервалы 0,3- Кривые, выражающие кинетику превра­
щения хлорофилла и его аналогов в соответствующие феофитины при различных значениях рН приведены в диссерта­
ции. Они следуют первому порядку. На основании получен­
ных кривых нами были вычислены константы скорости реак­
ции для различных значений рН, также приводимые в дис­
сертации. Это позволило сравнить исследуемые пигменты по
скорости феофптинизации количественно, располагая их при
этом в определенной последовательности. Так, например, з
водно-ацетоновых
растворах . пигментов в присутствии
10"-3ад/л НС1 при 22° значения .констант скорости (к -1мин -1 )
были следующие: для-2 бактериовиридина —"2,8- Ю
, хло­
рофилла «а» — 3 - Ю —3, протохлорофилла —7,6- Ю - 3 и хло­
рофилла «в» — 3 - 10 . В водно-спиртовых растворах пит»
ментов при прочих равных условиях величины-1констант ско­
рости/были: - для
бактериовиридина — 2,3- 2• Ю , хлорофилла
2
«а» — 3 - Ю
,
протохлорофилла
— 1 - 1 0 , хлорофилла «в»
— '1,6-'Ю -3 . Сравнение показало, что наиболее быстро феофнтинизировался бактериовиридин, далее 'следовал хлоро­
филл «а», потом протохлорофилл; бактериохлорофилл по
скорости феофптинизации был близок к протохлорофнллу, и
медленнее всего магний замещался водородом в молекуле
хлорофилла «в». Константы скорости наиболее быстро феофитинизирующегося бактериовиридина и самого устойчиво­
го хлорофилла «в» отличаются на два порядка. Соотноше­
ния между константами скоростей реакций, исследованных
'пигментов при различных рН меняются, но установленная
последовательность пигментов по скорости феофитинизации
сохраняется.
•
Сравнение исследуемых пигментов по скорости феофнти'нвдации2 в серном эфире под действием щавелевой кислоты
(2Х|Ю- м/л) показало, что для прохождения реакции напо­
ловину в случае бактериовиридина требуется 15 минут, хло­
рофилла «а» 23 час, протохлорофилла и хлорофилла «в»
более 8 суток.
В водном пиридине в присутствии 2Х|10 -2 м/л щавелевой
кислоты установлена та же последовательность пигментов по
убыванию скорости феофитинизации. Так, время половинно­
го превращения бактериовиридина было 0,4 часа,- хлорофил­
ла «а» — 3 часа, протохлорофилла около 10 часов, хлоро­
филла «в» около 24 часов.
7
Хлорофиллиды «а» и «в», полученные нами из хлорофил­
лов i«a» и «.в», заметно не отличались от соответствующих
хлорофиллов по скорости феофитинизации в водном ацетоне.
По данным Шандерля (1962), специально сравнивавшего ки­
нетику феофитинизации хлорофиллов «а» и «в» с соответст­
вующими хлорофиллпдамл, константы последних превыша­
ют первые самое большее, в полтора раза. Эта величина зна­
чительно меньше тех, которыми отличаются друг от друга
члены установленного нами ряда пигментов.
Феофитинизация в неполярных растворителях — толуоле
и петролейном эфире — в присутствии
пальмитиновой кислоты
•Сам, установленный нами, факт феофитинизации пигмен­
тов в данных условиях представляет самостоятельный инте­
рес. В безводной среде (петролейный эфир) и в присутствии
пальмитиновой кислоты трудно представить существование
ионов водорода в концентрации, достаточной для осу­
ществления феофитинизации. Согласно Годневу (1947), ки• слоты типа пальмитиновой, могут своим карбоксилом всту­
пать в непосредственное взаимодействие с азотами пирроль
ных ядер молекулы хлорофилла. Можно думать, что наблю­
даемая нами феофитинизация в системе петролейный эфир
— пигмент — пальмитиновая кислота осуществляется при
обязательном контакте азота хлорофилла и карбоксила
пальмитиновой кислоты.
Изучая действие на исследуемую реакцию, лолярных до­
бавок, которые могли бы нарушить непосредственное взаи­
модействие пальмитиновой кислоты и хлорофилла, мы уста­
новили, что этиловый спирт и диоксан в концентрации
5 • 10—3,м/л заметно ннгнбироюали феофитинизацшо, а ингибирующее влияние пиридина проявлялось при концентрации
5« 10~*м/л. Следует отметить, что ни в спирте, ни в пириди­
не, ни в диоксане пальмитиновая кислота вообще не вызы­
вала феофитинизации хлорофилла.
Сравнение исследуемых пигментов по скорости феофити­
низации в неполярных безводных растворителях (петролей­
ный эфир, толуол) представляет, по нашему мнению, инте­
рес в 'связи с тем, что здесь исключается фактор сольвата­
ции пипмента молекулами растворителя, что позволяет свя­
зать различия в скорости феофитинизации пигментов только
с различиями в строении молекул пигментов. В описывае8
мых здесь системах мы наблюдали тот же, что и в случае
водных растворителей, ряд пигментов.
Так, в толуоловых
растворах в присутствии 3-10 _ 2 м/л пальмитиновой кислоты
время полупревращения пигментов в соответствующие фео•фитины было: для бактериовиридина — 4 мин., хлорофилла
«а» — 27 мин., протохлорофилла — 540 мин., бактериохлорофилла — 690 мин. и хлорофилла «в» — 1440 мин.
Обсуждение данных по кинетике феофитинизации
хлорофилла и его аналогов в связи с известными
структурными различиями исследованных пигментов
Современные представления о химическом строении ис­
следованных пигментов приведены в литературном обзоре
диссертации. Строение молекулы наиболее быстро феофитннизирующегося бактериовиридина нельзя .считать оконча­
тельно установленным. После серии работ Холта (1960—
1963) можно считать, что молекула бактериовиридина отли­
чается от молекулы хлорофилла «а» следующими особенно­
стями: 1) роль фитола, этерифицирующего молекулу хлоро­
филла выполняет здесь фарнезол, 2) вместо винильной груп­
пы во 2-ом положении первого пиррольного ядра имеется
гидроксиэтильная группа, 3) карбометокеильная группа,
имеющаяся при Сю в молекуле хлорофилла^ заменена в мо­
лекуле бактериовиридина на водород.
Учитывая наши данные rib сравнению скоростей феофи­
тинизации хлорофиллов и соответствующих хлорофиллидов.
а также данные, более детального (Шандерль и др., 1962) ис­
следования по влиянию замены фитола различными радика­
лами на скорость феофитинизации, можно.полагать, что на­
личие фарнезола в молекуле бактериовиридина не сказы­
вается существенно на скорости феофитинизации. Группа,
аналогичная заместителю при втором углеродном атоме
у бактериовиридина имеется и у бактериохлорофнлла, а
последний обменивает магний„на водород со значительно
меньшей скоростью. Логично предположить, что легкая атакуемость магния нонадш водорода в молекуле бактериови­
ридина определяется отсутствием карбометогасильной груп­
пы при десятом углеродном атоме.
Анализируя далее ряд исследуемых пигментов по убы­
вающей скорости феофитинизации (бактериовиридин, хлоро­
филл «а», протохлорофилл и бактериохлорофилл, хлоро­
филл |«в»), следует отметить отсутствие зависимости скоро9
сти 'феофнтннизации от. степени восстановленности «пол у изо­
лированных» двойных связей в молекуле 'пигмента. Возмож­
но, что симметричность а состоянии полуизолировапных свя­
зей (обе гидрированы—бактериохлорофилл или сбе [присутст­
вуют — протохлорофнлл) стабилизирует атом магния в этих
пипментах по сравнению с хлорофиллом «а». Очевидно, да­
лее, что наличие электроотрицательных заместителей в пиррольных ядрах (альдегидная группа во втором ппрролыюм
ядре- у хлорофилла «в» и ацетильная группа в первом ппр­
ролыюм ядре ба.ктерпохлорофилла) затрудняет реакцию об­
мена магния на ионы водорода. Наличие же подобного за­
местителя в первом пиррольном ядре бактериовлрнднна, оче­
видно перекрывается противоположным действием отсутст­
вия Сю карбометоксильпой группы щухлапентанонавого коль­
ца. Возможно влияние этих групп ипдукционно передается
по 1коныошро;ванной системе сопряжения, увеличивая проч­
ность связи магний-азот.
'Проведенное нами сравнение кинетики
феофитинизации
всех исследованных пигментов, давшее определенное - пред­
ставление о влиянии различий в строении молекул пипментоо
на прочность связи магний-азот, позволило нам получить
также результаты, необходимые для последующего исследо­
вания действия света на эту реакцию.
II. РЕАКЦИЯ ФОТОФЕОФИТИНИЗАЦИИ
II ОБРАТ1ШЫЕ ОКИСЛИТЕЛЬНОВОССТАНОВИТЕЛЬНЫЕ ФОТОХИМИЧЕСКИЕ
ПРЕВРАЩЕНИЯ
ПИГЛ\ЕНТОВ
ФОТОСИНТЕЗИРУЮЩИХ ОРГАНИЗМОВ
Описанию 'непосредственных результатов по действиюсвета на реакцию феофитинизации мы предпосылаем данные,
несколько расширяющие и дополняющие наши сведения от­
носительно обратимых окислительно-восстановительных пре­
вращений пигментов, условий стабилизации ф'отовосстановленных продуктов и способов обнаружения лабильных, про­
межуточных продуктов фотовосстановления.
Исследование обратимого фотовосстановления бактериоллорофилла и бактериовнридина мы предприняли в связи с
тем, 1что данные по фотохимическим свойствам этих пигмен­
тов являлись далеко не полными, по сравнению с детально
исследованными в лаборатории фотооиохи'мни нашего инсти­
тута окислительно-восстановительными превращениями хло10
рофялла. Бактериовиридин до нашей работы (1959) в таком
плане вообще не исследовался.
•Мы показали, что при фотовосстанавлении в пиридино­
вом растворе с использованием в качестве донора водорода
аскорбиновой кислоты бактериовиридин дает продукт вос­
становления, очень схожий с «красной» восстановленной
формой хлорофилла «а». Аналогичный продукт фотовосстановления, бактериовиридин давал и при использовании .в
качестве восстановителя сернистого натрия. Было показано
также, что бактериовиридин, подобно хлорофиллу, способен
сенсибилизировать реакции
фотохимического
переноса
водорода.
• *. •
В 1951 г. Краоновеким и Войновокой была обнаружена
возможность обратимого фотохнмичеакого восстановления и
окисления бактериохлорофилла и бактериофеофитина. Мы
обнаружили, что при освещении пиридинового раствора бак­
териохлорофилла в вакууме в присутствии сернистого нат­
рия образуется активный продукт фотовосстановления бактери'ахлорсфилла, имеющий максимум поглощения при
660 ммк, моментально регенерирующий в исходный пигмент
при впуске кислорода воздуха, и отличающийся от более
стабильных продуктов фотовосстановления бактериохлоро­
филла, не имеющих характерных максимумов поглощения в
видимой области спектра.
Исследуя потенциал платинового электрода пиридиновых
растворов хлорофилла «а», бактериохлорофилла и бактерновиридина в присутствии сернистого натрия, мы обнаружили,
что во всех случаях при освещении он изменяется в отрица­
тельную сторону приблизительно на 0,1 вольта. В темноте
за 1—2 минуты происходило обратное изменение потенциала.:
Вероятно, в данных условиях все пигменты образуют електродно-активные фотовосстановленные продукты одного типа.
Сернистый натрий является очень сильным восстановителем,
и отсутствие различий между пигментами в силе восприятия
электрона в данных условиях не исключает возможность та­
ких различий в других условиях, о чем будет говориться ни­
же в связи с изучением действия света на феофитииизацию
бактериохлорофилла.
Согласно представления1М, развиваемым в лаборатории
фотобиохимии нашего института, восстановленные фор/мы
хлорофилла и его аналогов могут быть ион-раднкалом -Х~ л
«•протоннзироваиными»
формами типа -ХН (один протон) и
-ХН + 2 (два протона). Сравнительная устойчивость «крас11
'
нон» формы хлорофилла и аналогичных ей форм других пиг­
ментов определяется образованием ассоциатов молекулы
лигмента, юоспринявшей электрон, at молекул среды — ос­
нования (пиридин), сочлененных 'посредством
'протона:
-Х-... H+...N<.
Изучение влияния условий кислотно-основного равновесия
на устойчивость восстановленных форм, показало, что добав­
ление сильных оснований к стабильным " восстановленным
формам приводит к мгновенной регенерации исходного пиг­
мента, что было объяснено надш, как результат разрушения
ассоциата согласно гипотетической схеме:
•X-...H+...N^+N,<-*-X-4-H^N,<+iM<
где N < символизирует собой основание — пиридин, в ко­
тором происходит восстановление, a N ' < более сильные, до­
бавляемые к реакционной смеси основания (пиперидин и
аммиак).
На примере гематолорфирнна нами было доказано, что п
разных условиях кислотности могут стабилизироваться раз­
ные взаи'молерекодящие друг в друга (восстановленные фор­
мы: одна, менее устойчивая, с максимумом поглощения при
650.ММК («основная») и другая, более устойчивая с макси­
мумом поглощения при» 740 мм к («кислая»).
Не улавливаемые спектрально лабильные фотовосстановленные формы, предшествующие образованию стабильных
продуктов или образующиеся в системах, где нет условий.
для стабилизации устойчивых продуктов фотовосстанавле1ГИЯ, исследуются различными другими способами, основан­
ными и а том, что они (эти формы), будучи радикалами, мо­
гут инициировать полимеризацию мономера, сенспбнлизнрованно восстанавливать добавляемые акцепторы электронов,
будучи электродно-активнымн, изменять 'потенциал 'Инертно­
го (платинового) электрода, помещенного в реагирующую
систему пигмент-донор электрона.
Основываясь ,на том известном факте (Красновский, Ев­
стигнеев, Баннистер), что «красная» восстановленная форма
хлорофилла теряет магний гораздо легче, чем 'исходный пиг­
мент, образуя при этом феофитин, нам казалось интересным
исследовать, не могут ли и лабильные, воспринявшие элект­
рон, восстановленные формы пигментов феофитинизироваться легче, чем исходные пигменты. Тогда накопление феофитина.могло бы быть, как бы индикатором быстрых обратимых
окислительно-восстановительных превращений пигментов, не
.
П
обнаруживаемых спектрально. В связи с этим мы предпри­
няли исследование феофитинизации стабильных фотовосстановленных форм пигментов и действия света па феофитшгазацшо пигментов, где ранее спектрально не удавалось обна­
ружить образование'фотовосстановленных форм пигмента.
Образование феофитина в пиридине, спирте
и ацетоне в присутствии аскорбиновой кислоты
Мы изучали влияние различного количества воды в пири­
дине на образование феофитина из красной восстановленной
формы хлорофилла «а» при одинаковом содержании аскор­
биновой кислоты (10- 2, м/л). При содержании в пиридине
меньше 1% воды из красной формы хлорофилла «а», регене­
рирует исходный плгмеагг и совсем не образуется феофитина.
При содержании 1—5%' воды в пиридине, хлорофилл регене­
рирует неполностью, при обратной реакции'образуется фео­
фитин с большей HCIII 'меньшей степени, в зависимости от ко­
личества воды. При 10% содержании воды в пиридине, крас­
ная восстановленная форма хлорофилла практически пол­
ностью превращается в феофитин. Можно думать, что стиму­
лирующее действие >воды на образование феофитина связано
с увеличением кислотности среды за счет возрастающей сте­
пени диссоциации аскорбиновой кислоты в водно-пиридино­
вом растворе. Эти данные согласуются с данными Баннистера (1959).
Мы обнаружили, что хлорофилл «в», восстановленный в
тех же условиях (пиридин-аскорбиновая кислота) при об­
ратной реакции также подвергается феофитинизации, причем
из восстановленной формы хлорофилла «в» регенерирует
исключительно феофитин даже при содержании воды менее
1%-.
Мы наблюдали далее образование феофитина в системе
хлорофилл-спирт-аскорбиновая кислота, после ее освеще­
ния в анаэробных условиях и последующего выдерживания
в темноте о присутствии воздуха. Фотопродукты, образую­
щиеся в данных условиях под действием света, не имеют
.каких-либо.[характерных максимумов поглощения в видимой
области спектра. Можно думать, что здесь мы имеем дело с
фотохимическим образованием восстановленной лейкоформы
хлорофилла «а», которая при обратной реакции дает фео­
фитин.
13
В ацетоновом растворе хлорофилла «а» в аналогичных ус­
ловиях так же, как и в спирте, происходит образование феоф игл на из бесцветных продуктов фотовоосгановлепия пиг­
мента.
Таким образом, нам удалось установить, что в спиртовых
и ацетоновых растворах хлорофилла, содержащих аскорби­
новую кислоту, input освещении « анаэробных условиях про­
исходит .образование восстановленных лейкоформ пигмента.
регенерирующих в феофитнн в обратной реакции. О характе­
ре указанных продуктов можно сказать, что они, также, как
и «красная» восстановленная форма хлорофилла «а», обра­
зующаяся в шгриди'не, являются относительно устойчивыми.
по всей вероятности «протопизированными» восстановленны­
ми формами пигмента.
В связи с тем, что стабильные .восстановленные формы
феофитиннзируются легче, чем исходный пит/мент, можно
считать, что изменения в молекуле хлорофилла, связанные с
фотовоесстановлением и конечным образованием названных
форм, 'приводят к ослаблению связи центрального атома маг­
ния с азотом шфрольных колеи.
Феофлтипизация пигментов в пиридиновых и спиртовых
растворах в присутствии соляной и щавелевой кислот
Отчетливое действие света на образование фсофптнна
было показано нами в системах питмеит-пиридин-ооляиая
кислота, пигмент-ииридш-щавелевая кислота, т. е. в систе­
мах, где ранее не удавалось обнаружить образование устой­
чивых ^продуктов фотовосстановления. Хлорофилл «а», хло­
рофилл «в» ,ц протохлорофилл при освещении в вакууме их
«одно-пиридиновых
(10% воды) растворов в присутствии
2- 10-2'М/л щавелевой кислоты менее чем за 10 мин. наполо­
вину превращались в соответствующие феофитины, время их
темповой феофнтлнизашш измерялось часами. Столь же от­
четливое ускоряющее действие света наблюдалось и при ис­
следовании феофптиннзации пиридинового
раствора бактериовиридина в 'присутствии 6«10 - 3 м/л щавелевой кислоты.
Обращает на себя внимание тот факт, что различия в
скорости темповой феофигшшзацнн, о которых говорилось в
первом разделе, нивелируются при фотофеофитнннзации.
Есть основания полагать, что механизм фотофеофитнннза­
ции пигментов в водно-пиридиновом растворе отличается от
механизма темповой фсофишннзацш. В пиридине . в силу
14
большого сродства молекул растворителя к протону, очевид­
но, существует конкуренция за него между молекулами лиг?4
меата и молекулами растворителя, вследствие чего'феофитн
лизацп'я в темноте идет крайне медленно. Мы предположили, что фотсфеофитшшзацня проходит
через стадию образования лабильных фотовосстановленных
форм хлорофилла, при этом роль донора электрона может
играть пиридин. Можно представить, что возбужденная мо­
лекула пигмента, приняв электрон, приобретает несравненно
большее сродство к протону. Если донором водорода в систе­
ме служит •аскорбиновая кислота, то телец ва «принятием
электрона происходит образование протошюировапных вос­
становленных форм, стабилизирующихся в комплексе аскор­
биновая кислота — пиридин-пигмент. Если донором служит
пиридин, то такой стабилизации, видимо, не 'происходит, хло­
рофилл принимает прежний уровень восстановленностн, от­
давая принятый иш электрон, а вошедшие в молекулу хлоро­
филла протоны, вначале, очевидно, связанные с пиррольными атомами азота, обладающими «вакантными*» парами
электронов, после перераспределения связей замещают атом
магния в' кольце. .
Спирт по сравнению с пиридином является более благо­
приятной средой для темповой феофнтшшзацт». Поэтому за­
ранее трудно было ожидать резкого различия в скорости об­
разования феофптпнов на свету н в темноте; ускоряющее
действие света в спирте надо было исследовать на фоне темпозой феофитннизации, что требовало более точных коли­
чественных измерений.
Нам удалось найти условия, когда в спирте наблюдалась
не менее отчетливое, чем в пиридине, ускоряющее действие
света >на'процесс образования феофитина шз хлорофилла «а».
В таблице Л приведены данные, иллюстрирующие стимули­
рующее действие света на исследуемую реакцию при различ­
ных концентрациях щавелевой кислоты и различном содер­
жавши воды.
Последовательно увеличивая кислотность среды, мы об­
наружили, (Что при достижении определенной концентрации
водородных ионов свет перестает действовать ускоряюще на
образование феофитина.
Так, при концентрации соляной ки­
слоты в спирте 4 • Ю - 4 м/л реакция феофнтшшзации хлоро­
филла «а» значительно ускоряется под действием света, в
случае же 2>1(Нм/л соляной кислоты процесс 'протекает с
одинаковой скоростью на свету и в темноте. Аналогичная ва15
виоимость фотофеофитигогзации от концентрации «онею водо­
рода была обнаружена нами у хлорофилла «с» и у бактерновиридина.
Таблица 1.
Превращение хлорофилла «а» в феофитин (в'/сза 15 мин)
в спиртовом растворе в присутствии щавелевой кислоты
ка свету и в темноте
зло-*
З.Ю-з
Количество к-ты м/л
0
10
0
Ю
Спет
60
90
14
-13
Темнота
15
10
0
15
Количество РОЛЫ %
Можно думать, что в спирте (как и в пиридине) в опре­
деленных условиях кислотности (рН> 3) имеет место образо­
вание феофитина из лабильных, короткоживущих, не обна­
руживаемых спектрально фотопродуктов, в дополнение к тем­
повой феофитинизации, протекающей независимо от действия
света. В условиях большой концентрации водородных июнов
( р Н < 3 ) , скорость процесса образования феофитина по
обычному «темповому» механизму превышает скорость фотофесфитннизации, поэтому и ускоряющее действие овета не
проявляется.
В таблице 2 приведено время полупревращения пигмен­
тов 'В соответствующие феоф'нтины и темноте и ма шету в ус­
ловиях благоприятных для 'проявления фотофеофитшпгзации.
Таблица 2.
Время полупревращения пигментов в феофитин при освещении
и в.темноте.
Время в минутах
Раство­
Щавелевая
ритель
к-та м/л
=о
6.10-3
бактерновнрщпн
gx:
2.10-2
хлорофилл а
.
-
хлорофилл в
С2
ч»5 си
Н (О С
16
Пигмент
протохлорофилл
свет
темнота
>60
13
180
12
600
10
1440
9
7.10—«
бактерновириднн
>60
ало-з
хлорофилл а
>6'.'
-
18
13
Явление фотофеофитинизации пигментов в спирте также
как и в пиридине, мы склонны сюязывать с 'реакцией обрати­
мого фотохимического (восстановления пигмента, в которой
гтлекулы полярного растворителя могли играть роль до­
норов электронов для возбужденной молекулы пигмента, что
согласуется с данными Арван н Глебовского (1961), пока­
завшие, ято пиридин может восстанавливать при юсвещенин
в вакууме тиазнновые красители. Предположение о возмож­
ной элсктронодонорной роли спирта согласуется с данными
по обнаружению 'методом З П Р свободных радикалов- спир­
та (Рихирева и др. 1964), возникающих при освещений! за­
мороженных растворов пигментов.
Исследование действия овета на феофитлнизацию бактериохлорофилла в спиртовых и пиридиновых растворах пока­
зало, что феофагтнн чсз этого (пигмента в темноте и ?прн осве­
щении образуется с одинаковой 'скоростью. Отсутствие фотофеофитинизации у бактер.иохлорофилла позволяет предполо­
жить, нто ни спирт, ни пиридин не являются для него подхо­
дящими донорами электронов; можно думать поэтому, что
сродство к электрону у (возбужденной молекулы бактериохлорофилла меньше, чем у хлорофилла. Это согласуется С
'
данными о различии фотосенснбнлизации хлорофиллом и
бактериохлорофиллом окислительно-'восстановительных ре­
акций (Кр ас н опеки й, (Войновская 1952) и о фотосенсибилизированных превращениях нипмептных пар (Евстигнеев,
Ганрилова 1961), показавших ;более низкий восстановитель­
ный потенциал (восстановленной фор,мы бактериохлорофилла
по сравнению с хлорофиллом.
Действие ингибиторов на фотофеофитинизацню
Если при фотофеофитинизации феофитин образуется из
лабильных (продуктов фотовоестановлешгя, то следовало ожи­
дать :шгг.И'бнравание исследуемой реакции в присутствии тор­
мозящих фотовосстановление соединений, к числу которых
относятся: полнены (каротин), поли'цикличекжпе •соединения
(тетрацен) и реагирующие с фотовосстановленными форма­
ми 'пигмента акцепторы электронов, .которыми являются,
например, метиловый 'красный, сафранин, рибофлавин. Было
исследовано
действие названных соединений в концентрации
от 5Х'Ш- 5 до Ю - 3 м/л на фотофеофитиннзацию хлорофилла
«а», хлорофилла «в» и протохлорофллла в пиридиновых рас­
творах. -Каротин практически полностью мнгнбирует фото-
i "Ш
:
феофнтинизацию в концентрации К)- 5 м/л, несколько менее
эффективно действовал иафтацен, «который полностью угне­
тал фото'феофитшшзгцшо и концентрации Л0~* м/л. Метилозый красный, сафранин и рибофлавин- 4заметно замедляли
фотофеофптинизацию о 'концентрации Ю :м/л и .(полностью
угнетали реакцию в концентрации Ю - 3 м/л. Было высказано
предположение, что обратимо .воспринимающий электрон
ингибитор приводит систему в исходное положение и стацио­
нарная концентрация восстановленной формы пигмента, (котооая склонна не замещению магния на-.водород), падает до
предела, определяемого скоростями слегающих цикл реак­
ций, и естественно, концентрацией ингибитора-акцептора
электрона.
Предполагая тождественность элементарных механизмов
фотофеофитпнизатпи IB спирте :и пиридина, мы игеследовали
действие (.метилового красного «на фотофеофитинизацию хло­
рофилла ««a» IB спирте и также обнаружили ннгибнрующее
•действие метилового красного на исследуемый процесс.
Ско­
рость феофитинизации '.на свету ,в присутствии Ю - 3 м/л мети­
лового 'красного практически .была равна скорости темповой
феофитинизации 'без •метилового красного. В специальных
•опытах мы показали, что метиловый .красный не влияет на
скорость тем новой феофитинизации хлорофилла «а» о спирте.
Феофитинизация хлорофилла в пиридине в присутствии
янтарной, фумаровой и яблочной кислот. Влияние аниона
кислоты на скорость процесса.
Исследуя феофнтинизацию в системе 'пипмент-лиридин• органическая кислота, мы установили, 'что ни янтарная, ни
фумаровая, ни яблонная кислоты не могут заменить щаве­
левую кислоту, ,в присутствии которой '.наблюдались такие от­
четливые эффекты фотофеофитшгизац'ии. Эти кислоты
даже
к сравнительно большой концентрации (8- Ш~2 м/л) не вы­
зывали феофитинизации «и в темноте, «ни при освещении.
Более того, добавляемые в спетому итагмент-лнриаин-соляная 'кислота, они «нгибировали фотофеофнтииизацию, тогда
как процесс темповой феофитинизации IB названные системах
в присутствии этик кислот шел .скорее.
Возможно, что в системе 'пигмент-лиридин-кислота осу­
ществляется (взаимодействия «между молекулами составных
компонентов системы с образованием комплекса, в пределах
которого и 'происходит передача заряда при фотофеофитинн18
заци-и. И ;при этом очень юажнымл являются не только электршшдонорные свои сто а ком-нонетов системы и степень дис­
социации 'кислот, но также етер-ическое 'соответствие их друг
другу.Взаимодействие 'между компонентами системы пигмент-пиридин-кислота может иметь влияние и на скорость темно­
той феофитннпзащш. Из -наших, а также из литературных
•данных известно, что анион кислоты ле влияет на скорость
фесфптинизации хлорофилла в ацетоновом и спиртовом ра­
створе, где скорость процесса зааисит лишь от концентрации
водородных ионов. Иную картину мы наблюдали в пиридине..
Так при исследовании темповой феофгяинизации бактериовпридина в .пиридиновом растворе было обнаружено, >что быст­
рее всего процесс шел в присутствии щавелевой кислоты,
медленнее — -соляной и еще медленнее — серной.
Феофитинизация и фотохимическое окисление пигментов
кислородом воздуха
Как уже указывалось выше, опыты по выяснению дейст­
вия света па фсофптшшзацшо мы .проводили в отсутствии
воздуха, чтобы избежать "окислительного разрушения пигмен­
тов. Вместе с тем представляет интерес вопрос, действует ли
необратимое окислительное разрушение пигментов на проч­
ность-связи магния с азотом в молекуле пигмента и не являет­
ся ли феофнпш непосредственным продуктом такого разру­
шения. . •
...
•
Мы исследовали этот вопрос на двух пигментах: хлоро­
филле «в» — наиболее устойчивом к окислению из всех ис­
следуемых пигментов и бактериовк'риднне — самом неустой­
чивом.
Водно-ацетоновые растворы хлорофилла «в» освещались
в присутствии воздуха, по мере фотоокнеления снимали спект­
ры поглощения, далее пигмент переводили! в серный эфир и
хроматографнровали на бумаге из смеси Годиева. В спектре
продукта окисления >в ацетоновом растворе обнаруживается
подъем поглощения и области 500—560 ммк, по без характер­
ных для феофитлпа максимумов при 505 и» 535 ммк. Выцвета­
ют основные максимумы поглощения («красный» и «синий»),
«плечо» при 440 ммк по мере окисления становится более яр­
ко выраженным. Если реакция фетсокнелеик'я проходила
полностью, то на хроматограмме обнаруживалась одна зона •
фиолетового оттенка в месте нанесения пигмента, если не пол19
костью, то две стопы: названная и расположенная свыше зона
непрореагировавшего хлорофилла «в». Феофитпиа при этом
не было обнаружено. Аналогичная картина наблюдалась и
при фотоокислении водно-ацетонового раствора хлорофилла
«в» в присутствии 2.10 - 3 IM/Л щавелавой 'кислоты. В темнота©*!
контроле за время опыта не происходит никаких спектраль­
ных изменений. При освещении происходят спектральные из­
менения такие же, к а к и три освещении щ огаутствии щавеле­
вой кислоты. При длительном стоянииm темноте ( > 1 2 часов)
н тот хлорофилл, который не освещался и тот, который остал­
ся «после фотоо.ки'сления, 'полностью феофитинизиравались.
Так что взятое количество щавелевой кислоты было достаточ­
ным для полной феофитинизации хлорофилла «в» и фотоокисление не ускорило этого процесса.
Мы не обнаружили феофитина и в продуктах фотоокисле­
ния бактериовиридина при освещении его в водно-ацетоновом
растворе с последующей хроматографией на бумаге в смеси
Годнева. Было отмечено, что продукт фотоокисления бакте­
риовиридина в серном эфире имел отчетливый максимум по­
глощения щш 855 ммк.
Таким образом, «и при фотоокислении хлорофилла «в», ли
при фотоокислении бактериовиридина м ы ле обнаружили об­
разования феофитина. Это согласуется с данными Маккинея
и Аронова (1943), по мнению которых феофитпшизация зависила лишь от кислотности и не зависила от освещения и при­
сутствия воздуха.
III. ФЕОФИТИНИЗАЦИЯ ПИГМЕНТОВ В ПЛЕНКАХ,
АДСОРБАТАХ, В ФОТОСИНТЕЗИРУЮЩИХ БАКТЕРИЯХ,
В ЛИСТЬЯХ И ГОМОГЕНАТАХ
Сравнение по скорости феофитинизации хлорофилла
«в» в листьях и гомогенатах
«а» и
Сравнивая по скорости феофитинизации" пигменты в орга­
нических растворителях, мы шмели дело с непосредственным
влиянием особенностей 'структуры молекул пигмента, наличия
в лих тех или иных группировок на исследуемую реакцию.
Представляло интерес выяснить, сохраняется ли различие по
скорости феофитинизации зелорофиллов «а» и «в», установлен­
ное в растворе, и в естественном 'состоянии связи, где молеку­
лы пигмента находятся во взаимодействии друг с другом, а
также с белками и липоидам».
. . .
20
Исследовались гомогонаты листьев фасоли, приготовлен­
ные на водопроводной воде. Гомогенаты подкисляли соляной
кислотой II после экспозиции нейтрализовали раствором едко­
го натра. Так как непосредственно по спектрам поглощения
гомогенатов было трудно судить о количестве образовавшихся
феофитннов, пигменты по истечении экспозиции экстрагиро­
вали. Для этого гомогенаты центрифугировали, добавляя к
ишм хлористый кальций для полноты осаждения, осадок раст­
воряли в ацетоне, и определенную часть ацетонового экстрак­
та разделял» методом (бумажной хроматографии из смеси —
петролейный эфир: этиловый спирт (20 : 1). После разделе­
ния та бумаге элюировали ацетоном зоны: а) хлорофилл
«в»-)-феофитин «в», 2) хлорофилл «а»-{-феофитин «а». Из­
мерение спектров поглощения элюатов после различных экс­
позиций показало, что не только в органических растворите­
лях, .по и в гомогонатах хлорофилл «в» феофитииизируется
значительно медленнее, чем хлорофилл «а». Так о присутст­
вии 0,1% НС1 при 10-минутной экспозиции! гомогената хлоро­
филл «а» почти полностью превращался в феофитин, а хлоро­
филл «в» при 2-х часовой экспозиции превращался в феофит ш менее чем на 50%.
Столь же резкое различие в скорости феофитшшзации
между хлорофиллами «а» и «в» мы наблюдали в листях фа­
соли и элодеи инфильтрируемых соляной кислотой с после­
дующей экстракцией и хроматографическим разделением пиг­
ментов.
Действие света на феофитинизацию хлорофилла и его
аналогов в пленках, в адсорбатах, в листьях и гомогенатах
В системах: пленка пигмента — кислота; адсорбированный
на бумаге питмент -*- кислота трудно было предвидеть обра­
зование лабильных фотопродуктов пигмента, что, как мы по­
лагаем, имело место аз спиртовых и пиридиновых растворах,
как результат взаимодействия возбужденных молекул пигмен­
та с молекулами растворителя. В связи с этим ;в данных мо­
делях можно было исследовать непосредственное действие
света на реакцию замещения магния иа водород, когда эта
реакция не связана с другими, отличными от феофитинизации, превращениями пигментов.
Исследовавшиеся пигменты адсорбировали на кругах
фильтровальной бумаги, погружая их оз концентрированные
растворы пигмента в эфире. Равномерно окрашенные круги
21
разрезал» на равные секторы. Последние опускали в трубку
Тунберга с кислотой. В одних опытах реакция феофитшшзацни 'проводилась в темноте, в других — при освещении крас­
ным светом. По истечении времени экспозиции сектор фильт­
ровальной бумаги с адсорбированным на нем пигментом вы­
нимали, промывали водой, пигмент элюировали определенным
объемом ацетона и и измеряли спектр поглощения на спектро­
фотометре СФ-10. Данная серия опытов 'показала, что свет
не ускоряет феофитишгзацню адсорбированных на бумаге
пигментов (хлорофилл а, хлорофилл в, бактериовириднн). В
случае протохлорофилла свет не только не ускорял феофитинизацшо, но было отмечено, что после освещения в элюате
фесфитина было даже меньше, чем в томновом контроле, что
как показали специальные эксперименты, объяснялось фоторазрушеписм образующегося етротофеофитипа. Подобного
эффекта не было обнаружеаю с другими пигментами. Это яв*
пение представляет самостоятельный интерес в плане сравни­
тельного исследования фотохимических свойств хлорофилла
и его аналогов в различных состояниях. Мы не обнаружили
ускоряющего действия света на феофитшшзацию и в пленках
бактериовнридина, погруженных в водный раствор кислоты.
При длительном освещении приготовленных на дистилли­
рованной воде гомогенатов листьев фасоли, как в присутствии
кислорода, так м в вакууме, нам тоже не удалось обнаружить
в ши образование .измеримого количества феофитина.
Мы исследовали действие света на феофит.ннизацию ннфильтрироваишых кислотой листьев элодеи и фасоли, варьи­
руя продолжительность освещения, проводя опыты в присут­
ствии кислорода :и в вакууме при строгом термостатировании.
По прошествии времени экспонирования листа с кислотой в
темноте и на свету, мы экстрагировали из него пигменты, до­
бавляя три этой процедуре мел для нейтрализации инфильт­
рированной в лист кислоты. Экстракт хроматографировали и
измеряли спектры поглощения элюатов зон: 1) хлорофилл
«а» -|-феофитин «а», 2) хлорофилл «в» -f- феофитин «в». Мы
установили, что продолжительное интенсивное освещение ин­
фильтрированных кислотой листьев сильным светом не приво­
дило к обнаружению в элюате из листа 'заметного количества
феофитина, отличтого от контроля, которым служил элюат из
неосвещенного листа.
Такое отсутствие эффекта ускоряющего действия света' на
феофитиннзацию в томогенате листа и в листе инфильтрнроватаюм кислотой, можно предположительно объяснить тем,
22
что in vivo не реализуется установленная нами в спиртовых и
пиридиновых растворах хлорофилла возможность молекул
пигмента давать активные фотопродукты, феофитивдизирующиеся с большей скоростью, чем исходный пигмент. Вместе с
тем возможно, 'что 'инфильтрируемая в лист кислота в силу
препятствий структурного характера не тступает в -контакт с
той частью молекул хлорофилла, которая непосредственно
участвует в фотопроцессах. Кроме того, если даже в листе
имеет место факт образования феофитина из лабильных про­
межуточных продуктов пигментов в цепи их окислителыновосстановнтельных превращений, что мы предполагали для
спиртозых п -пиридиновых растворов хлорофилла при .их ос­
вещении ,в присутствии ^соляной и щавелевой кислот, то этот
эффект может быть малым и не обнаруживаться используе­
мыми методами, связанными с необходимостью экстрагиро­
вать и разделять пигменты хроматографически.
Феофитинизация бактериовиридина в суспензиях
зеленых фотосинтезирующих бактерий
Известно, 'что бактерновиридин и ба'ктериохл'орофнлл•лиименты, «выполняющие в фотосинтезирующих бактериях
роль хлорофилла — находятся с бактериям и агрегированном,
упорядоченном состоянии. Бактерповиридин в растворе име:
ет красный 'максимум поглощения при 670 ммк, тогда как о
зеленых бактериях красный максимум поглощения находится
при 750 <MMiK. Этот сдвиг почти IB .100 ммк наблюдался нами
"при испарении эфирного раствора этого пигмента в вакууме.
Образующаяся при этом пленка пигмента имела главный
красный максимум при 730 ммк.
:В предварительной работе нами было показано, что при
длительном стоянии водно-глицериновой суспензии бактерий
при. комнатной температуре пли при нагревании: в течение
более короткого времени образуется («мономерная» форма
с максимумом поглощения при 670 ммк, являющаяся крайне
несветопрочной: при сильном освещении красным светом в
течение двух минут образовавшийся (при 670 ммк максимум
полностью выцветает.
Действие кислоты на суспензию зеленых бактерий вызы­
вало разрушение упорядоченной структуры бактериовириди­
на, сопровождающееся потерей магния молекулами пигмен­
та. При этом поглощение в красном максимуме при 750 ммк
уменьшалось -и соответственно увеличивалось поглощение
«мономерной» формы при 670 ммк. Gneicrp образующегося
23
феофитина соответствовал по положению основных максиму­
мов поглощения спектру пленки безмагниевого производного
бактериовнридина, получетной путем испарения эфирного
раствора 'пигмента на стекле. В отличии от «мономерной»
форшы водногляцеринооой суспензии, образовавшийся из
б акт ерновиридииа феофнтан был устойчив к выцветанию.
Интересно, что процесс образования феофитина шел с сохра­
нением нзобестических точек в семействе кривых, отражаю­
щих спектры поглощения по мере феофитинизацпи.
Мы .последовали действие света на скорость феофитинизации i6 актер но вир иди на при добавлении кислоты в водно-гли­
цериновые суспензии 'бактерий и в суспензии па культуральной среде. Освещение не приводило к ускорению процесса.
Выводы
1. Сравнительное изучение феофитшшзацин хлорофилла
л ого аналогов в растворах показало, что по скорости иссле­
дуемой реакции пигменты следуют убывающему ряду: бактериовиридин, хлорофилл «а», иротохлорофилл и бактериюхлорофилл. хлорофилл «в». Рассмотрение «вязи скорости
феофитинизации со структурой пигментов мы резюмируем
следующим образом: а) Наличие электроотрицательных за­
местителей в пиррольных ядрах и симметричность в степени
восстановленности полуизолированных связей С3—С4 и
С?—Са стабилизирует атом магния в молекуле пигмента.
б) Крайне быстро идущая феофитишизация 'бажтериовдаридина, И молекуле которого, по имеющимся данным, отсутствует
карбо'метакснль'ная труппа о положении Сю, говорит об осо­
бом стабилизирующем влиянии>последней на связь магний-.
азот IB 1молекуле пигмента, в) Наличие или отсутствие фитола
в (молекуле пигмента не влияет существенно «а скоростьфеофи-пнннзадеи.
2. В гомогенате из листьев фасоли и в листьях фасоли и
элодеи, инфильтрированных кислотой, хлорофилл «а» феофитишгаируется значительно скорее, чем (хлорофилл «в». Таким
образом, химическое различие в строении молекул хлорофил­
ла ,«а» и «в», обусловливающее более легкую атаку ем ость
магния молекулы хлорофилла кга» ионами водорода в органи­
ческих растворителях, сохраняется и при' феофитинизации
этих пигментов в естественном состоянии, когда молекулы
пигмента взаимодействуют друг с другом, а также с белками
и липоидами.
21
3. Исследование различных стабильных спектрально об­
наруживаемых продуктов фотово остановлен и я хлорофилла
показало, что они обменивают магнии на водород вначительно легче, чем исходный пигмент.
4. Обнаружено ускоряющее действие света на феофитиншацию хлорофилла «а», хлорофилла «.в», протохлорофилла и
бактериовпридина -в спиртовых и пиридиновых растворах в
присутствии соляной и щавелевой кислот m условиях, когда
не наблюдается .накопления устойчивых фотовосстановленных продуктов.
•5. Различия по скорости «темповой» феофитинизациш у *
хлорофилла «а», 'хлорофилла к<в» и (протохлорофилла ниве­
лируются при «фотофеофитинизацни». Высказано предполо­
жение, что «фотофеофитинизация», наблюдаемая нами в пи­
ридине HI спирте, идет по механизму, отличному от «темпо­
вой» феофитянизации и определяется образованием феофнтина из лабильных промежуточных продуктов обратимых
фотовосстанавнтёльных превращений пигментов, где донора­
ми электронов могли быть молекулы растворителей — спирт
и пиридин. Соединения, ингибирующие фотовосстановление
хлорофилла (каротин, нафтацен, метиловый красный, сафра­
нин, рибофлавин), инпгбируют и фотофеофитинизацию.
6. Ускоряющее действие света на феофитинизацшо не
наблюдается в условиях, когда этот процесс не связан с
предшествующими фотохимическими превращениями пигмен­
тов, что было показано при исследовании феофнтинизации
в пленках ш адсорбатах пигмента. При длительном освеще­
нии листьев, гомогенатов и суспензий фотосинтезирующих
бактерий в них не удалось обнаружить накопление феэфнтина.
7. Фотоокисление пигмента кислородом не связано с на­
коплением феофитина.
8. Феофитшшзация в зеленых фотосинтезирующих бакте­
риях при действии на них кислоты (ведет к изменению струк­
туры агрегированных форм и к спектральным сдвигам, со­
ответствующим образованию мономерной формы; свет не
влияет на скорость этого процесса.
9. Можно предполагать, что фотофеофитинизация в рас­
творах может быть 'индикатором не обнаруживаемых спект­
рально обратимых окислительно-восетановителыных превра­
щений пигментов, что необходимо учитывать при исследова­
нии окислительно-восстановительных превращений хлоро­
филла и его аналогов в различных модельных системах.
25
Материалы диссертации» опубликованы в следующих пе­
чатных работах:
1. Свойства фотовосстановленных 'форм хлорофилла, про­
тохлорофилла и гематопорфирина в связи с условиями кис­
лотно-основного равновесия. ДАН СССР 120, 581 (1958).
2. Фотохимические и спектральные свойства бактериови­
ридпна зеленых серных бактерий ДАН СССР 127, 913 (1959).
3. Обратимое фотовосстановление >бактериохлорофнлла и
его участие в процессах фотохимического переноса электрона.
ДАН СССР 135, 1258 (1960).
4. Сравнительное изучение образования феофнпшов из
хлорофилла и его аналогов в темноте и при освещении. ДАН
СССР 148, 935 (1963).
5. Исследование феофитипизации хлорофилла, бактериохлорофшла, бактериовиридпна, протохлорофилла и действие
света на эту реакцию. Биохимия 29, 1132 (1964).
6. Сравнительное изучение образования феофитинов из
хлорофилла л его аналогов. Тезисы докладов на Первом Все­
союзном биохимическом съезде. Январь 1964.
7. Действие света иг феофигинизацито хлорофилла w его
аналогов. Биохимия (в печати).
T - U 1 0 8 от 6/VIII-65 г.
Об'ем 1,75 п. л.
Тир, 150.
Типография «На боевом посту». Павлопская, 8.
Зак. 512Э: