РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ВЫСШЕЙ НЕРВНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ И НЕЙРОФИЗИОЛОГИИ на правах рукописи

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК
ИНСТИТУТ ВЫСШЕЙ НЕРВНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ И
НЕЙРОФИЗИОЛОГИИ
на правах рукописи
УДК 577.352
Павлова Татьяна Васильевна
ПЕНТИЛЕНТЕТРАЗОЛОВЫЙ КИНДЛИНГ У КРЫС: ВЛИЯНИЕ НА
ОБУЧЕНИЕ, НЕИРОДЕГЕНЕРАЦИЯ И МЕХАНИЗМЫ ГИБЕЛИ НЕЙРОНОВ В
ГИППОКАМПЕ
03.00.13 - физиология человека и животных
Автореферат диссертахши на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва 2006
Работа выполнена в Лаборатории функциональной биохимии nqiBHOft
системы (зав. лаб. - докт. биол. наук, профессор Н. В. Гуляева) Института
высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН (директор - докт.
биол. наук, профессор П.М. Балабан)
Научный руководитель:
Доктор биологических наук, профессор Н. В. Гуляева
Официальные оппоненты:
Доктор биологических наук А. С. Базян
Доктор биологических наук, профессор С. А. Чепурнов
Ведущая организация:
НИИ нормальной физиологии им. П.К. Анохина РАМН
Защита диссертации состоится фОЛН-Сйр^Я,
^2006 года в /У' -"часов
на заседании Диссертационного совета'Д-003.10.01 при Институте высшей
нервной деятельности и нейрофизиологии Российской академии наук
по адресу: 117485, г. Москва, ул. Бутлерова, 5а.
С диссертшщей можно ознакомиться в библиотеке ИВНД и НФ РАН.
Автореферат разослан "В
"Л ^^саоАЯ
2005 года
Ученый се1фетарь специализированного совета
Доктор биологических наук
.
^Аи''^
О.Хг1Соштоянц
^ А к т у а л ь н о с т ь проблемы
Эпилепсия
является
одним из
наиболее
распространенных
заболеваний
нервной системы, а её лечение является актуальной медико-социальной задачей.
Заболеваемость эпилепсией составляет 50-70/100000 человек, распространенность
5-10/1000 человек. Это заболевание сопровождается значительными социальньПк1И
трудностями, моральными и физическими страданиями больного и членов его
семьи. Эпилепсия является одним из приоритетов Всемирной
Организации
Здравоохранения, проводящей глобальную кампанию "Эпилепсия - из тени".
Проявления эпилепсии разнообразны: от кратковременного нарушения сознания
до
тяжелых
конвульсий.
Она
характеризуется
повторными
приступами,
являющимися симптомами дисфункции мозга. Н е менее одного припадка в
течение жизни переносят 5 % населения, у 20-30 % больных эпилепсия является
пожизненной. Многие больные эпилепсией испытывают серьезные социальные
проблемы, которые часто обусловлены нарушением когнитивной функции при
этом состоянии. Можно полагать, что нарушение функционирования мозга при
эпилепсии обусловлено не только дисфункцией отдельных групп нейронов, но и
их гибелью.
Несмотря
на
то,
что
эпилепсия
не
относится
к
собственно
нейродегенеративным заболеваниям, нейродегенерация при многих ее формах
считается доказанной (Duncan, 2002). Поэтому чрезвычайно актуальной задачей
является исследование механизмов нейродегенерации при эпилепсии. Решение
этой задачи необходимо для поиска путей предотвращения гибели нейронов и
возможной коррекции дисфункции мозга у больных эпилепсией.
Одним из наиболее удобных экспериментальных приёмов для исследования
механизмов изменений, связанных с эпилепсией, является пентилентетразоловый
киндлинг
(PTZK)
нарушения,
височной
судороги,
в
доли
(McNamara,
определенной
у
человека.
нарушается
1985),
поскольку
степени аналогичные
У
экспериментальных
поведение,
при
таковым
наблюдаются
при
животных
повреждаются
экспериментальных подтверждений гибели не)
этом
эпилепсии
развиваются
нейроны.
Однако
опов при P I Z K . немного. РоЫе et
РОС. НАЦИОНАЛЬН \к
ВИБЛИОТЕКЛ.
\
СП«те|М|ург
•Э 5»|^1щг7
"Jl j
4
al. (1997) и Franke and Kittner (2001) показали, что P T Z K может
вызывать
умеренную дегенерацию нейронов в гиппокампе. Механизм гибели нейронов при
этом неясен. Однако
при амигдалярном
электрическом
киндлинге
удалось
установить, что гибель некоторых нейронов в гиппокампе может происходить по
апоптотическому пути (Zhang et al., 1997). В последние годы появляются данные о
том, что в нейронах может происходить активация аберрантного клеточного
цикла, приводящая в конечном итоге к нейродегенерации. Так, например, при
эпилепсии височной доли у человека была обнаружена экспрессия нейронального
циклина В 1 в гиппокампе (Nagy and Esiri, 1998). Поскольку P T Z K является
общепринятой моделью этой формы эпилепсии, представлялось вероятным, что
гибель
нейронов
при
PTZK
также
происходит
с
вовлечением
активации
клеточного цикла.
Неоднократно предпринимались попьггки установить количественную связь
между
силой
клонико-тонических
судорог,
вызванных
различными
воздействиями, и гибелью нервных клеток в гиппокампе. В некоторых случаях,
например, при использовании повторяющегося электрошока, такая связь была
обнаружена (Зарубенко и соавт., 2004). В то же время при введении каината такой
связи выявлено не было (Berger et al, 1989), несмотря на наличие корреляции
между силой судорог и рядом показателей окислительного стресса и апоптоза в
гиппокампе (Stepanichev et al., 2000). Важно отметить, что до сих пор многие
исследователи считают эпилепсию с конвульсивными проявлениями значительно
более эффективной в отношении повреждений в селективно чувствительных
отделах мозга (в
частности, амигдале и гиппокампе), чем эпилепсию
без
конвульсий, например типа абсанс (Wong, 2003).
Ц е л ь работы и основные задачи исследования
Основной
целью
работы
было
комплексное
исследование
влияния
пентилентетразолового киндлинга на процессы обучения и памяти, развитие
нейродегенерации,
а
также
исследование
механизмов
гибели
нейронов
в
гиппокампе. Кроме того, целью работы было выявление соотношения вызванной
пентилентетразолом конвульсивной активности с одной стороны и процессами
5
возбуждения в гиппокампе и гибелью нейронов с другой стороны. Для этого были
поставлены следующие задачи:
1.
Изучить влияние пентилентетразолового киндлинга на способность к
обучению условным реакциям пассивного и активного избегания у крыс.
2.
Провести
патоморфологическое
исследование
гиппокампа
при
пентилентетразоловом киндлинге.
3.
Исследовать
возможное
участие
окислительного
стресса
в
гибели
нейронов.
4.
Исследовать возможное участие апоптоза в гибели нейронов.
5.
Исследовать возможное участие аберрантного клеточного цикла в гибели
нейронов.
6.
Изучить
соотношение
пентилентетразолового
между
киндлинга
вьфаженностью
и
степенью
конвульсий
после
нейродегенеративных
изменений.
7.
Изучить
соотношение
между
выраженностью
конвульсий
после
пентилентетразолового киндлинга и эпилептической активностью мозга.
Научная новизна
В работе впервые проведено комплексное исследование влияния PTZK на
процессы обучения и памяти, развитие нейродегенерации, а также механизмов
гибели нейронов в гиппокампе. Кроме того, впервые исследовано соотношение
между
степенью выраженности конвульсивной активности при PTZK
и
паттернами электроэнцефолограммы в гиппокампе, а также гибелью нейронов.
Впервые выявлено, что PTZK
сопровождается накоплением продуктов,
реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, я снижением уровня восстановленных
тиолов в гиппокампе крыс.
Впервые продемонстрировано участие аберрантного клеточного цикла как
возможного механизма гибели нейронов в гиппокампе крыс после PTZK. Кроме
того, показано отсутствие апоптотических ядер в гиппокампе крыс после PTZK.
Впервые
было
проведено
сравнительное
исследование
крыс
Вистар,
6
разделенных на «чувствительных» и «толерантных» к конвульсиям, вызванным
P T Z K , и установлено, что гибель нейронов и окислительный стресс в гппокампе
этих животных не зависят от выраженности конвульсий (нейродегенерацию и
окислительный стресс наблюдали и у «толерантных» животных).
Впервые
продемонстрирована
судорожная
активность
на
ЭЭГ
у
«толерантных» к конвульсиям крыс. На основе исследований механизма развития
P T Z K у этих животных предложена новая модель для исследования эпилепсии
неконвульсивного типа.
Теоретическая ценность и п р а к т и ч е с к а я значимость
В работе систематически исследованы патологические процессы в гиппокампе
при экспериментальном моделировании на крысах эпилепсии височной доли.
Выявлены
ключевые
молекулярные
механизмы,
сопровождающие
нейродегенерацию в данной модели эпилепсии. Морфологически показаны зоны
гиппокампа, наиболее чувствительные к
эпилепсии.
Показано,
что
повреждению
нейродегенеративные
при данной модели
изменения
в
гиппокампе
сопрювождаются окислительным стрессом, при этом гибель нейронов не является
апоптотической. Более того, нейродегенерация тесно связана с экспрессией
циклина
В1
-
маркера
G2
фазы
клеточного
цикла.
Полученные
нами
свидетельства вовлечения белков клеточного цикла в гибель нейронов при
эпилепсии позволили предположить новый механизм связанных с эпилепсией
нейродегенеративных изменений в Ц Н С . Выявлены основные механизмы гибели
нейронов при P T Z K , которые позволяют предполагать общность путей гибели
нейронов при нейродегенеративных заболеваниях и эпилепсии.
Показано, что и у «толерантных» к конвульсиям животных также происходят
нейродегенерация и окислительный стресс в гиппокампе, и поэтому наиболее
вероятной причиной этих изменений является именно судорожная активность в
мозге животных. Чрезвычайно важен для понимания соотношения конвульсий и
нейродегенерации тот факт, что гибель нейронов не зависит от выраженности
конвульсий.
7
Понимание механизмов нейродегенерации при эпилепсии позволит более
эффективно искать пути патогенетически обоснованного предотвращения гибели
нейронов и возможной коррекции дисфункции мозга у больных. Популяцию
крыс, подвергнутых P T Z K , можно использовать и как модель конвульсивньк
судорог
(«чувствительные»),
(«толерантные»).
и
Использование
как
такой
модель
неконвульсивной
модели
может
дать
эпилепсии
существенные
преимущества в сравнительном изучении различных нарушений и их механизмов
при конвульсивной и неконвульсивной эпилепсии.
П о л о ж е н и я , в ы н о с и м ы е на защиту
1. Пентилентетразоловый киндлинг сопровождается изменением способности
к
обучению
условной
реакции
активного
избегания,
окислительным
стрессом и нейродегенерацией в гиппокампе.
2. Гибель нейронов не зависит от выраженности конвульсий, не является
апоптотической и сопровождается экспрессией циклина В 1 , маркера фазы
G 2 клеточного цикла.
3. Животные
без
выраженных
конвульсий
после
пентилентетразолового
киндлинга демонстрируют генерализованную эпилептическую активность в
Э Э Г , отличную по основным характеристикам от таковой у конвульсивных
животных.
Апробация работы
Основные результаты работы были доложены (и опубликованы тезисы) на
научных
конференциях
молодых
ученых
Института
высшей
деятельности и нейрофизиологии (Москва, 2002, 2003, 2004, 2005), Ш
Биохимического
симпозиуме
общества
«Стресс
и
(Санкт-Петербург,
экстремальные
2002),
состояния»
I
нервной
съезде
международном
(Феодосия,
2002),
международном симпозиуме «4th International Symposium on Experimental and
Clinical Neurobiology» (Верхние Татры, Словакия, 2003), научной конференции
«Опыт интеграции научных исследований НИИ-ВУЗ-Клиника» (Москва, 2002,
2004), X V I
зимней молодежной научной школе «Перспективные направления
физико-химической
биологии
и
8
биотехнологии»
(Москва,
2004),
8-й
Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология наука X X I века» (Москва, 2004), X I X съезде физиологического общества им. И.П.
Павлова (Екатеринбург, 2004), 20-м съезде Международного нейрохимического
общества совместно с Европейским нейрохимическим обществом (Иннсбрук,
Австрия, 2005), 35-м ежегодном съезде Общества Нейронаук США (Вашингтон,
2005) и апробированы на совместном семинаре Лаборатории функциональной
биохимии нервной системы и Лаборатории нейрохимических
механизмов
условного рефлекса ИВНДиНФ Р А Н (Москва, 2005).
Объем и структура диссертации
Диссертация содержит следующие основные разделы: введение, обзор данных
литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований и их
обсуждение, заключение, выводы и библиографический указатель, включающий
работы на русском (13) и иностранных языках (274). Диссертация изложена на
137 страницах машинописного текста и содержит 2 схемы и 24 рисунка.
Методы исследования
В работе использовано 168 крыс-самцов линии Wistar, массой 250-350 г. Крыс
содержали по пять особей в пластмассовых клетках в условии вивария при
искусственном световом режиме (день 8:00-20:00) и свободном доступе к воде и
пище.
Выработку киндлинга осуществляли путем внутрибрюшинного введения
пентилентетразола (PTZ) в субконвульсивной дозе 40 мг/кг, 3 раза в неделю.
Контрольным крысам вводили изотонический раствор NaCl (1 мл/кг) в том же
режиме. После каждого введения поведение животных наблюдали в течение 20
мин и конвульсивные проявления судорожной активности оценивали по шкале
Racine (1972): стадия О - отсутствие реакции; стадия 1 - замирание, лицевые
автоматизмы, подергивание ушей и вибрисс; стадия 2 - конвульсивные волны,
распространяющиеся вдоль оси туловища; стадия 3 - миоклонические судороги
со вставанием; стадия 4 - клонические конвульсии с потерей позы; стадия 5 -
9
повторные сильные клонико-тонические или летальные судороги и для более
детальной оценки поведенческих реакций были введены стадии: 0-1, 1-2, 2-3, 3-4
- модификация Franke and Kittner (2001).
Для оценки когнитивных способностей у животных использовали обучение
условным реакциям пассивного (УРПИ) и активного избегания (УРАИ). У Р П И
вырабатывали на основе однократного электрокожного подкрепления (Bures et al.,
1983). У Р А И вырабатывали в челночной камере по стандартной методике (на
основе сочетания безусловного (удар током) и условного (свет) раздражителя).
Для биохимических исследований крыс декапитировали в разные сроки после
окончания PTZK. Подготовку ткани мозга к биохимическому анализу проводрши
по методу, описанному ранее (Gulyaeva et al., 1996). Для морфологических
исследований мозг фиксировали методом интракардиальной перфузии, в качестве
фиксатора использовали 4%-ый нейтральный параформальдегид или смесь
формалин: уксусная кислота: этанол в соотношении 2:1:7 (Stepanichev et al., 2000).
Определение продуктов свободнорадикального окисления, реагирующих с 2тиобарбитуровой кислотой (ТБК-АП) проводили по методу Ohkawa et al (1972).
Содержание
восстановленных
белковых
и
небелковых
тиолов
(фракция
небелковых тиолов в мозге - преимущественно глутатион (Ohkawa et al, 1979))
определяли спектрофотометрическим методом с использованием 5,5'-дитиобис(2-нитробензойной кислоты) (Sedlak and Lindsay, 1968). Концентрацию белка
оценивали по методу Bradford (1976) с использованием красителя Кумасси
голубого.
Патоморфологическое исследование проводили на парафиновьк срезах,
которые окрашивали в соответствии со стандартными методиками: для оценки
морфологического состояния нейронов и подсчета их плотности применяли
окраску по Нисслю крезилвиолетом; для оценки необратимости изменений в
поврежденньк нейронах использовали окраску ванадиево кислым фуксином; для
выявления апоптотических ядер использовали процедуру TUNEL
(мечение
высвобождающихся при деградации ДНК З'-ОН концов); для выявления белков
маркеров
клеточного
цикла использовали имм^ногистохимические
методы
10
окраски с применением специфических антител для каждого из белков (циклин
D 1 , циклин В 1 , P C N A , cdk2, cdk4). Количественный анализ плотности нейронов
проводили на срезах, окрашенных по Нисслю, в поле С А 1 гиппокампа на
протяжении полоски в 450мкм (х400), в поле С А З - в рамке 450x350 мкм (х400),
в поле С А 4 - полностью (х400), а в зубчатой фасции ( З Ф ) - в трех случайно
выбранных полях длиной ЗООмкм (х400), расположенных в верхней и нижней
ветвях З Ф , как описано ранее (Stepanichev et al., 2004).
Судорожную
активность
в
мозге
крыс
после
PTZK
регистрировали
электроэнцефалографически. Запись производили с электродов, вживленных в
затылочную кору, гиппокамп и шейные мышцы (референтный - в лобную кость).
Статистическую обработку и анализ результатов проводили при помоцщ
пакета
программ
"Statistica
for
Windows".
Использовали
адекватные
поставленным задачам параметрические и непараметрические тесты. Данные
представлены в виде M ± S E M , если не указано иначе.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Нарушение способности к обучению у животных после P T Z K
Во
многих
исследованиях
на модели P T Z K
было
показано
нарушение
когнитивных функций у животных. В данной работе также выявлено изменение
способности к обучению в тесте на выработку У Р А И у крыс после развития
P T Z K . К а к видно из рис. 1, хроническое введение P T Z приводило к нарастанию
судорожной активности, уже
после 4-й инъекции средняя
стадия
судорог
достоверно отличалась от таковой после 1-й инъекции P T Z .
4 ,
^ 2
| l
О
О
,
0 1
I
* -
. • t
* *
* .
2 3 4 5 6 7 8 9
* {
t
t
'
Рис. 1. Развитие PTZK.
14-я инъекция сделана через 10 дней после
13-й для проверки сохранности судорожной
готовности, п=12.
Отличия от средней стадии судорог после 1й инъекции PTZ: * - р<0.05 (тест
Вилкоксона).
10 11 12 1314
Число инъекций PTZ
11
Нарушений обучения животных У Р П И после P T Z K не происходило (рис. 2).
Щ
200
If
150
ct о
О
X .
Рис. 2. Обучение У Р П И после PTZK.
Контроль
PTZK
Контроль: п=12; PTZK: п=12.
а. 9
100
=2
>.
■S
2 i
^^
50
^ m
(D
с;
0
Т(0)
1(24)
При обучении У Р А И число избеганий в группе животных после P T Z K не
отличалось от такового в контрольной группе (рис. З А ) . Однако выявлено, что
внутри группы животных после P T Z K число избеганий находилось в обратной
корреляционной зависимости от средней стадии судорог после 2-х последних
инъекций P T Z (R=-0.61, р=0.035, тест Спирмана) (рис. ЗБ). Кроме того, как видно
из рис. З В , число межсигнальных реакций у крыс после P T Z K было увелргаено (к
3-й сессии достоверно - на 46 % ) в сравнении с контрольными, что косвенно
можег свидетельствовать о более низкой эффективности обучения у этих крыс.
А
Контроль
PTZK
30
25
3 20 ^
ш
i15^
1 10
§
1 сессия
2 сессия
3 сессия
5
1 сессия
2 сессия
3 сессия
Рис. 3. Влияние P T Z K на обучение УРАИ.
А - Число избеганий; Б - Корреляция между средней стадией судорог после 2-х последних
инъекций PTZ (ось абсцисс) и числом избеганий за 1 сессию обучения (ось ординат); В - Число
межсигнальных реакций. Контроль: п=12; PTZK: п=12
Отличия от группы контрольных животных: ♦ - р<0.05 (тест Манна-Уитни).
12
Таким образом, PTZK изменял способность крыс к обучению УРАИ, причем
характер изменений зависел от степени судорожной активности. Можно
предположить, что такие изменения опосредованы, в частности, гибелью
нейронов в специфических областях мозга.
2. Гибель нейронов и окислительный стресс в гиппокампе животных после
PTZK.
Морфологическое
исследование
показало,
что
число
неповрежденных
нейронов (светлоокрашенные с прозрачными округлыми ядрами) снижалось во
всех отделах гиппокампа крыс после PTZK: в СА! на 11%), САЗ на 10%>, СА4 на
13% и ЗФ на 8%, в сравнении с контрольными животными (рис. 4А). При этом в
гиппокампе
животных,
подвергнутых
PTZK
повсеместно
присутствовали
нейроны с измененными морфологическими признаками (сжатые, уродливой
формы нейроны с гиперхромно окрашенным ядром). Число таких нейронов было
Bbmie в СА1 в 13 раз, СА4 в 9.5 раз и ЗФ в 3.5 раза, в сравнении с контролем (рис.
4Б).
200
S
1
I
Контроль
PTZK
150
100
1
S 2
50
с
о
СА1
САЗ
СА4
ЗФ
-I О
СА1 САЗ
СА4
ф
s
Рис. 4. Влияние P T Z K на число неповрежденных
и поврежденных нейронов в гиппокампе
крыс.
А - число неповрежденных нейронов, Б - число поврежденньк нейронов в полях СА1, САЗ,
СА4 и ЗФ гиппокампа контрольных и животных после PTZK. Контроль п=12; PTZK" п=12
Отличия от группы контрольных животных' * - р<0.05, ** - р< 0.01, * - р<0.1 (тест МаннаУитни).
13
Одним из факторов, опосредующих повреждающие эффекты P T Z K , является
окислительный стресс (Rauca et al, 1999). Уровень Т Б К - А П , а также содержание
восстановленных белковых и небелковых тиолов в мозге являются надежными
маркерами окислительного стресса. К а к видно из рис 5, содержание Т Б К - А П
достоверно увеличивалось на 8 0 % , а уровень белковых тиолов достоверно
снижался на 2 3 % в гиппокампе крыс после P T Z K , что свидетельствует об
интенсификации в нем окислительных процессов.
Таким образом, P T Z K приводит к структурным изменениям в гиппокампе,
которые сопровождаются окислительным стрессом.
А
S 100 1
с;
<u
*
f^'^'fe
:
, .
^
' -. \
. , •
80
s
"i 60
о
s
■
I 40
2
^^ШШ
i
'^ШШЩ
SWMiM
20
Xa.
°
Контроль
PTZK
•- n
Рис. 5. Влияние P T Z K на показатели окислительного стресса в гиппокампе крыс.
А - содержание ТБК-АП, Б - уровень белковых тиолов (SH-rpynn). Контроль п=6; PTZK: п=7
Отличия от группы контрольных животных: * - р<0.05 (тест Манна-Уитии).
Контроль
3.
ОТ
PTZK
Механизм гибели нейронов в гиппокампе к р ы с после P T Z K
Механизм
гибели
нейронов
при P T Z K
до сих пор остается неясным.
Морфологическое исследование гиппокампа, проведенное в настоящей работе, не
выявило
наличия
некротических
нейронов.
Окраска
TUNEL,
выявляющая
апоптотические ядра, также не позволила обнаружить нейроны, гибнующие по
апоптотическому
пути.
В
последнее
время
показано,
что
при
некоторых
нейропатолсгических состояниях, в терминально дифференцированных нейронах
перед их гибелью может происходить активация клеточного цикла. Поскольку в
результате P T Z K происходит гибель нейронов в гиппокампе, м ы предположили,
что этот процесс может быть опосредован аберрантньпл клеточным циклом.
В
нейронах, характеризуемых как поврежденные (рис. 6 А , Б ) , выявлено
позитивное окрашивание для циклина В 1 - маркера фазы G2 клеточного цикла
14
(рис. 6 в , Г ) . Экспрессии других маркеров клеточного цикла - D 1 , P C N A , cdk2 и
cdk4 не обнаружено. Наши результаты совпадают с данными, полученными Nagy
and Esiri (1998) на образцах биопсии мозга пациентов с эпилепсией височной
доли.
ft
*i
Рис. 6. Повреждения
нейронов
и
экспрессия циклина
В1 в
гиппокампе
крыс после PTZK.
Микрофотографии
поля СА1 гиппокампа
контрольной
крысы
(Л, В) и животного
после PTZK (Ь, Г)
Срезы
окрашены
ванадиево
кислым
фуксином (А, Б) и на
i^,€\
ЦИКЛИНВ1 ( В , Г ) .
Поврежденные нейроны - сжатые, треугольной формы с пшерхромно окрашенным ядром
(толстые стрелки); неповрежденные - светло-окрашенные, с прозрачным округлым ядром
(тонкие стрелки). Позитивное окрашивание на циклин В1 в поврежденных нейронах (белые
стрелки). Подобные изменения наблюдали и в других отделах гиппокампа. Линейка - 50 мкм.
4. Нейродегенерация
и
окислительный
стресс
в
гиппокампе
крыс,
толерантных к P T Z K .
В
популяции
чувствительности
существует
значительная
особей к проконвульсивным
разница
в
индивидуальной
воздействиям. Так, по мере
развития P T Z K одни животные показывают выраженные клонико-тонические
судороги
(«чувствительные»
крысы
-
ЧК),
максимальные
же
проявления
судорожной активности у других выглядят как кратковременные замирания,
сопровождающиеся лицевыми автоматизмами («толерантные»
крысы - Т К ) .
Обычно этих крыс исключают из эксперимента, однако, известно, что даже
однократное введение P T Z в подпороговой дозе приводит к появлению спайкволновых комплексов в электроэнцефалограмме (Marescaux et al., 1984). Задача
этой части работы состояла в исследовании соотношения между выраженностью
конвульсий после P T Z K у Ч К и Т К и степенью нейродегенеративных изменений в
гиппокампе.
15
Из рис. 7 видно, что хроническое введение PTZ приводило к постепенному
нарастанию конвульсивной активности у ЧК, проявлявшемуся в появлении
миоклонизмов, их учащению, клонических судорогах передних конечностей, с
подъемом на задние лапы. Начиная с 3-4-й инъекции PTZ, выделялись ТК, у
которых не происходило заметного усиления конвульсивных проявлений, а
средняя сила судорог у ТК оставалась близкой к первоначальному уровню
(начиная с 4-й инъекции была достоверно ниже, чем у ЧК).
Рис. 7. Развитие P T Z K у Ч К
иТК
Начиная с 4-й инъекции
средняя стадия судорог у 'ГК
достоверно ниже таковой у
Ч К . Ч К : п=34; Т К : п=33. (* р<0.05; тест Манна-Уитпи).
1 2 3 4 5 в 7 8 9 10 11 12 13 14 16 16 17 18 19 20 2122
Число инъекций PTZ
Из данных, представленных на рис. 8А, Б, видно, что после завершения PTZK
в гиппокампе как ЧК, так и ТК обнаруживается нейродегенерация.
R
250
X
X
70П
>
фs
5
Контроль
ЧК
ТК
14 ^
J]
1
1Ь0
1ПП
о
ф
X
о
h
S
Т
Ё.
т
о
с
50
и
о
СА1
САЗ
СА4
ЗФ
5
ULii
САЗ
СА1
СА4
ЗФ
Рис. 8. Влияние P T Z K на число неповрежденных и поврежденных нейронов в гиппокампе
Ч К и ТК.
А - число нормальных нейронов, Б - число поврежденных нейронов в полях С А 1 , С А З , СА4 и
З Ф гиппокампа контрольных животных, а также Ч К и Т К . Контроль: п=6; Ч К : п=7; Т К : п=6.
Отличия от группы контрольных животных: * - р<0.05, *- р<0.1 (тест Манна-Уитни)
16
Как видно из рис. 9, уровень небелковых тиолов (глутатиона) после PTZK был
достоверно снижен как в гиппокампе Ч К (на 14%), так и у ТК (на 7%), что
свидетельствует об окислительном стрессе в гиппокампе крыс обеих ipynn.
Таким образом, «толерантные» к развитию конвульсивных судорог при PTZK
крысы
демонстрируют
сопровождающие
нейродегенеративные
окислительный
стресс,
изменения
сходные
с
в
гиппокампе,
таковыми
у
«чувствительных» 1фыс.
g
Рис. 9. Влияние P T Z K на уровень
восстановленного
глутатиона
в
гиппокампе Ч К и Т К .
Отличия от группы контрольных
животных: * - р<0.05, ** - р<0.01 (тест
Манна-Уитни). Контроль: п=13; ЧК: п=4;
ТК: п=8.
0,20
Контроль
5. Судорожная активность на электроэнцефалограмме у толерантных к
P T Z K крыс.
У чувствительных к PTZK крыс хроническое введение подпороговой дозы
PTZ приводит к прогрессирующей интенсификации судорожной активности,
включая
как
её
электроэнцефалографическую,
так
и
конвульсивную
составляющие (Ito et al, 1977). Как было упомянуто выше, среди животных,
подвергнутых PTZK, выделяется группа, не демонстрирующая выраженной
конвульсивной
составляющей
(клонико-тонической
стадии
судорог)
на
протяжении всего периода киндлинга - «толерантные» крысы (ТК). Тем не менее,
у ТК при отсутствии выраженной конвульсивной активности мы выявили
нейродегенерацию и окислительный стресс в гиппокампе. Известно, что даже при
однократном введении PTZ в подпороговой дозе, не вызывающей конвульсий,
наблюдают появление спайк-волновых комплексов в электроэнцефалограмме
(Abbasova et al., 2004; Marescaux et al., 1984). В этой части работы мы исследовали
электроэнцефалографическую
17
активность
в
мозге
«чувствительных»
и
«толерантных» крыс после PTZK.
Введение подпороговой дозы PTZ (challenge), по окончании PTZK вызвало
характерные изменения электрической активности в мозге Ч К и ТК. Сразу после
инъекции PTZ, но до появления конвульсий у ЧК, в обеих группах наблюдали
короткие (2-3 с) генерализованные судорожные разряды (СР) частотой 5-7 Гц
(рис. 10). Однако СР у Ч К имели ярко выраженный первый пик, встречались в
Э Э Г чаще, чем у ТК, а амплитуда СР составляла 800-900 мкВ, тогда как у ТК 400-500 мкВ.
Кюпроль r/^/<VlV*flA4*'H?4^i^,^tjjV^
ЧК
\
ТК
|.A*JWv*^^yM^VV/^^
1с
300 мкВ
Рис. 10. Паттерн Э Э Г у Ч К и Т К после инъекции PTZ в период отсутствия конвульсий.
Канал записи «Лобная кость-гнппокамп».
У Т К на протяжении всего периода записи Э Э Г наблюдались короткие СР с
частотой 7-8 Гц, которые сопровождались кратковременными замираниями, у Ч К
по мере развития конвульсий наблюдали изменение паттерна ЭЭГ, характерное
для каждой достигнутой стадии судорог (рис. 11). Клонические судороги
сопровождались высокоамплитудными полиспайками частотой 2-4 Гц, которые
перемежались
изолированными
спайк-волновыми
разрядами
(рис.
ИВ).
Тоническая фаза судорог сопровождалась полиспайками высокой амплитуды и
частоты, которые чередовались периодами сглаживания Э Э Г (рис. ИГ).
18
^|YWW
OmMW^ifwyv*
300 MKB
Рис. 11. Паттерны Э Э Г у Ч К после инъекции PTZ, в период конвульсий.
А - паттерн Э Э Г у Ч К до последней инъекщ1и PTZ (challenge), через 7 дней после завершения
PTZK; Б - паттерн Э Э Г при конвульсивных волнах, распространяющихся вдоль оси туловища;
В - паттерн ЭЭГ при миоклопических судорогах со вставанием; Г - паттерн Э Э Г при
клонических конвульсиях с потерей позы. Канал записи «Лобная кость-гиппокамп».
Как видно из рис. 12А судорожная активность в Э Э Г Т К появлялась в среднем
на 45 с раньше, чем у ЧК. Число СР за весь период записи Э Э Г у Т К было
снижено на 60 % (рис. 12Б) в сравнении с Ч К .
Средняя длительность СР за весь период записи Э Э Г у Ч К и Т К не
различалась, однако суммарная длительность СР
за первые 45 мин была
достоверно меньше у ТК, в сравнении с Ч К (рис. 12 В, Г).
19
500
400
Q.
О
300
200
100
0
1
U
-.3,0
"
В
U.
2,5
и ^ 100
л «5
2 2,0
л
g
0.5 i
& 0.0
ВО
^
g
(К X
40
X
К) ю
S
0>
9
>ч
■я
0
ьS 1
2
I 1,0
I
S
X
I 1,5
к
«п
ол f
(0
[Ш
ЧК
о
?
*~
Ч
fiO
?0
15
30
45
во
75
90
Я после PTZ инъекции, мин
Рис. 12. Сравнение основных свойств СР у Ч К и ТК.
А - латентный период СР; Б - число СР; В - Средняя длительность СР; Г - Суммарная
длительность СР, ■sa каждые последующие 15 мин от момента инъекции PTZ ЧК: п=17; ТК: п=3
Различия между Ч К и ТК: * - р<0.05, *- р<0.1 (тест Манна-Уитни). Med [Q25-Q75].
Как видно из рис. 13, пик мощности частот у Т К был ярко выражен и
приходился на 7.2 Гц, тогда как у Ч К такого пика нет. Такое распределение
мощности частот в Э Э Г
(7-9 Гц) характерно для судорог типа абсанс,
моделируемых однократным введением PTZ в низких дозах (Чепурнов и соавт.,
2005). Таким образом, при PTZK выявлена эпилептическая активность в ЭЭГ,
независимо
от
чувствительности
животных
к
характеристики этой активности различались у Ч К и ТК.
конвульсиям,
однако
20
6
7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Ч а с т о т а , Гц
Рис. 13. Распределение мощности частот у ЧК и ТК.
До недавнего времени считалось, что генерализованная неконвульсивная
судорожная
активность
(абсанс-эпилепсия)
не
вызывает
значительных
структурных изменений в ЦНС, в отличие от конвульсивной эпилепсии. Однако
появляется все больше фактов, свидетельствующих о том, что судороги типа
абсанс обладают повреждающим действием, поскольку у пациентов с абсанс
эпилепсией встречаются нарушения когнитивных функщ1Й (Pavone et al, 2001).
Часто эпилепсия типа абсанс может переходить в конвульсивную эпилепсию с
генерализованными тонико-клоническими судорогами (Bouma et al, 1996). Это
позволяет предположить, что судорожной активности в мозге, без конвульсивной
составляющей, достаточно для провощ1рования структурно-функциональных
изменений в ЦНС. Действительно, мы показали, что, несмотря на отсутствие
конвульсивного поведения у ТК, у них выявлена судорожная активность в мозге,
и именно она представляется наиболее вероятной причиной окислительного
стресса, который, в свою очередь, приводит к гибели нейронов в гиппокампе у
ТК. Конечно, при PTZK нельзя исключить участия эксайтотоксичности, вызванной
введением PTZ, в гибели нейронов гиппокампа. Однако, гибель нейронов
продолжается и через 10 недель после окончания PTZK (Franke and Kittner, 2001). Это
может указывать на то, что причиной гибели нейронов в этой модели является не
только, и не столько гипервозбуждение и непосредственное «эксайтотоксичноское»
действие PTZ, а скорее иные, связанные с киндлингом механизмы (например,
окислительный стресс и/или активация аберрантного клеточного цикла).
21
Заключение
Таким образом, при моделировании эпилепсии у крыс путем PTZK выявлено
изменение поведения в тесте УРАИ, тем более выраженное, чем более
выраженными
были
конвульсии.
Изменение
когнитивных
способностей
наблюдают как при эпилепсии у человека (особенно при судорожной активности
с сильной «моторной» составляющей) (Halgren et al, 1991), так и при
моделировании эпилепсии различными способами на животных (Beldhuis et al,
1992; Becker et al, 1995). Такие нарушения поведения после судорог могут
свидетельствовать о структурно-функциональных перестройках, а возможно и
гибели нейронов в ответственных за обучение отделах мозга (например,
гиппокампе) человека и животных.
Нами выявлена гибель нейронов в гиппокампе крыс после PTZK, как одном из
наиболее чувствительных к судорогам отделе. Считают, что при моделировании
эпилептических судорог с использованием широкого спектра эпилептогенных
факторов паттерн гибели нейронов в гиппокампе животных сходен с таковым при
эпилепсии у человека (Mello et al, 1993, Sutula et al, 1988). Несмотря на различия
специфическргх эффектов этих факторов на нейроны, все эти факторы обладают
способностью вызывать судорожную активность. В связи с этим предполагают,
что именно судорожная активность, а не прямое токсическое действие каждого из
эпилептогенных факторов вызывает повреждения нейронов (рис. 14).
Общим молекулярным механизмом, участвующим в гибели нейронов при всех
патологических
состояниях,
является
окислительный
стресс.
В
данном
исследовании на модели PTZK выявлен окислительный стресс в гиппокампе, где
и
происходят
основные нейродегенеративные
изменения. При судорогах,
вызванных PTZK, к окислительному стрессу могут привести как прямое
токсическое действие PTZ и опосредующая его эксайтотоксичность, так и
процессы, индуцируемые судорожной активностью (рис. 14). Однако известно,
что, во-первых, период полураспада PTZ в мозге грызунов составляет 2.5-3.8 ч, а
гибель нейронов наблюдают и через полгода после окончания PTZK (Franke and
Kittner, 2001); во-вторых, как упоминалось выше, паттерн нейродегенеративных
22
изменений не зависит от типа факторов, вызывающих эпилептические судороги.
Исходя из этих двух фактов, можно предположить, что окислительный стресс и
последующая нейродегенерация, видимо, не являются следствиями прямого
токсического эффекта P T Z , и скорее связаны с вызванной P T Z K судорожной
активностью в мозге.
Описано много молекулярных механизмов, вовлеченных в нейродегенерацию,
но основные сценарии гибели клеток немногочисленны: некроз, апоптоз или, как
недавно было показано, активация аберрантного клеточного цикла (Негшр et al.,
2004). В данной работе на модели P T Z K не выявлено апоптотической гибели
нейронов. Однако экспрессия маркера G2 фазы клеточного цикла, циклина В 1 , в
гиппокампе крыс после P T Z K , позволяет предположить, что гибель нейронов в
этой модели эпилепсии связана с активацией аберрантного клеточного цикла.
Этот результат, полученный в настоящей работе, открывает новое направление в
исследовании механизма нейродегенерации при эпилепсии.
Впервые показана гибель нейронов и окислительный стресс в гиппокампе
животных, не демонстрирующих конвульсивную активность при P T Z K . Ранее не
были исследованы причины таких изменений, поскольку этих животных просто
исключали из эксперимента, как не выработавших P T Z K . Однако исследование
ЭЭГ
выявило эпилептическую
активность
в мозге таких
неконвульсивных
животных. Остается открытым вопрос о том, может ли судорожная активность в
мозге, не выходящая на уровень моторной судорожной активности, вызывать
гибель нейронов у неконвульсивных животных. Этот вопрос тем более важен, что
неконвульсивные формы эпилепсии до сих пор считают менее «повреждающими»
для мозга, чем конвульсивные формы (Wong, 2003). Исходя из имеющихся
данных,
конвульсивную
активность
сопровождают
относительно
более
выраженные судорожные разряды (например, с более высокой амплитудой,
частотой). Такие судорожные разряды с большей эффективностью вовлекают
удаленные нейронные сети, которые могут запускать моторные судороги. Однако
неясно,
достаточно
ли
судорожной
активности
в
мозге,
наблюдаемой
у
«толерантных» крыс, для инициации механизмов гибели. Вопрос о том, какие
23
именно
факторы
инициируют
гибель
нейронов
у
«толерантных»
и
«чувствительных» крыс, а также являются ли эти механизмы общими для этих
групп животных, требует дальнейших исследований.
Поврезвдающий фактор
(Генетическая предрасположенность; травма; ишемия; конвульсанты;
различные патологические перестройки, включая гибель нейронов)
т
"Недостаток торможения"
( А к т и в а ц и я глутаматных рецепторов)
(Депрессия Г А М К рецепторов)
'^Избыток возбуяздения"
J
Судорожная активность в мозге
Прямая токсичность
Эксайтотоксичность
1
Долговременные
адаптивные структурнофункциовальяые
перестройки
(Период полураспада
P T Z в мозге грызунов 2.5-3.8 ч)
(Кратковременные
эффекты - 1-4 ч после
судорожных разрядов)
(Длш^льные эффекты месящл, годы)
Окислительный стресс, повреяздение
митохондрий, деградация Д Н К
Гибель нейронов
(Апоптоз? Некроз? Активация аберрантного
клеточного цикла?)
Рис. 14. Ф а к т о р ы , приводящие к гибели нейронов при эпилепсии.
Наиболее вероятные пути повреждения для судорожной активности без конвульсивной
составляющей - 1, с конвульсивной составляющей - 2. По-видимому, оба пути в той или
иной степени имеют место при конвульсивной и неконвульсивной судорожной активности.
Схема составлена по данным литературы и результатам собственных исследований.
24
Выводы
1. Пентилентетразоловый киндлинг вызывает изменение поведения у крыс в
тесте условной реакции активного избегания, но не условной реакции
пассивного
избегания.
При
избегания
наблюдается
обучении
условной
модификация
реакции
поведения,
активного
в
частности,
увеличивается число межсигнальных реакций на 4 6 % .
2. У
крыс, подвергнутых
пентилентетразоловому
киндлингу,
происходит
накопление в гиппокампе продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой
кислотой (на 80%) и снижение содержания белковых тиолов на 23 % .
3. Пентилентетразоловый
гиппокампе
крыс.
киндлинг
Плотность
вызывает
нейродегенерацию
неповрежденных
нейронов
в
достоверно
снижается в поле С А 1 на 1 1 % , в поле С А 4 на 1 3 % и в зубчатой фасции на
8%. При этом число поврежденных нейронов достоверно увеличивается в
поле С А 1 в 13 раз, в поле С А 4 в 9.5 раз и зубчатой фасции в 3.5 раза.
4. После пентилентетразолового киндлинга в гибнущих нейронах гиппокампа
не обнаружено маркеров апоптоза (TUNEL-позитивньтх
ядер), однако
выявлена экспрессия циклина В 1 , маркера G2 фазы клеточного цикла.
5. Предполагается,
нейродегенерация
что
при
опосредованная
окислительным
пентилентетразоловом
киндлинге
стрессом
идет
не
по
апоптотическому пути, но связана с активацией аберрантного клеточного
цикла.
6. При
разделении
популяции
на
крыс
пентилентетразоловому
киндлингу
активности
что,
показано,
нейродегенерация
проявляются
и
у
с
по
разной чувствительностью
параметрам
«толерантных»
окислительный
генерализованные
стресс
в
конвульсивной
крыс
происходят
гиппокампе,
судорожные
к
а
также
разряды
в
различаются
у
электроэнцефалограмме, как и у «чувствительных».
7. Электроэнцефалографические
«чувствительных»
и
характеристики
«толерантных»
крыс.
У
«толерантных»
число
25
судорожных разрядов после инъекции пентилентетразола на 60 % меньше,
чем у «чувствительных», и судорожные разряды появляются раньше на 45
с. Суммарная длительность судорожных разрядов за первые 45 мин после
инъекции пентилентетразола у «толерантных» крыс ниже на 6 8 % , хотя
«чувствительные» и «толерантные» крысы не различаются по средней
длительности судорожных разрядов. Пик мощности частот у «толерантных»
приходится на 7.2 Г ц , тогда как у «чувствительных» пик не выражен ярко.
8. Поскольку
при
нейродегенерация
пентилентетразоловом
в
электроэнцефалограмме,
проявлению
гиппокампе
независимо
конвульсий,
пентилентетразоловому
и
киндлинге
эпилептическая
от чувствительности
популяцию
крыс,
киндлингу, можно использовать
выявлена
активность
животных
в
к
подвергнутых
и как модель
конвульсивных судорог («чувствительные»), и как модель неконвульсивной
эпилепсии («толерантные»).
26
Список опубликованных статей по теме диссертации
1. Т . В . Павлова, А.А. Яковлев, A . M . Менджерицкий, М . Ю . Степан1гчев, Н.В.
Гуляева. Пентилентетразоловый киндлинг вызывает окислительный стресс
в мозге крыс // Нейрохимия. 2002. № 2 , с. 123-126.
2. Т . В . Павлова, А . А . Яковлев, A . M . Менджерицкий, М . Ю . Степаничев, Н.В.
Гуляева. Пентилентетразоловый киндлинг вызывает активацию каспазы-3 в
мозге крыс // Журнал высшей нервной деятельности им. И.П. Павлова.
2003. Т. 53 № 1 . с. 110-ПЗ. (T.V. Pavlova, А.А. Yakovlev, M.Y. Stepanichev,
A.M.
Mendzheritskii, N.V.
Gulyaeva. Pentylenetetrazole
kindling
induces
activation of caspase-3 in the rat brain // Neurosci. Behav. Physiol. 2004. V. 34.
№ 1 . P. 45-47.)
3. A.A. Яковлев, Д.И. Перегуд, Т.В. Павлова, Н.В. Гуляева. Эффекты острого
введения
пентилентетразола
и
пентилентетразолового
киндохинга:
окислительный стресс и активность NO-синтазы в мозге // Нейрохимия.
2004.Т. 2 1 . № 1 . с . 58-67.
4. Т.В. Павлова, А.А. Яковлев, М . Ю . Степаничев, Н.В. Гуляева.
Пентилентетразоловый киндлинг у крыс: связана ли нейродегенерация с
проявлениями судорожной активности? //Российский физиологический
журнал им. И . М . Сеченова. 2005 Т. 91. №7. с. 764-775 (T.V. Pavlova, А.А.
lakovlev, M.Iu. Stepanichev, N.V. Guliaeva. Pentylenetetrazole kindling in rats:
whether neurodegeneration is associated with manifestations of seizure activity?
// Ross Fiziol Z h I m I M Sechenova. 2005. V . 9 1 . № 7. P. 764-775.)
5. T.V. Pavlova, M . Y u . Stepanichev, N.V. Gulyaeva. Pentylenetetrazole kindling
induces neuronal cyclin B l
expression in rat hippocampus // Neuroscience
Letters. 2006. V . 34. № 1-2. P. 45-47.
Павлова Татьяна
Васильевна
ПЕНТИЛЕНТЕТРАЗОЛОВЫЙ КИНДЛИНГ У КРЫС ВЛИЯНИЕ НА ОБУЧЕНИЕ, НЕЙРОДЕГЕНЕРАЦИЯ И
МЕХАНИЗМЫ ГИБЕЛИ НЕЙРОНОВ В ГИППОКАМПЕ
Отпечатано в типографии ООО «Гипрософт»
г. Москва, Ленинский пр-т, д.37А
"Ивраж 70 экз.
^ ^
»• - '90
(■^