Председатель Ученого совета биолого

«УТВЕРЖДАЮ»
__________________________
Председатель Ученого совета
биолого-почвенного факультета СПбГУ
проф. И.А.Горлинский
ОТЧЕТ
докторанта Чекуновой Елены Михайловны
о работе над докторской диссертацией за 2007 год (3-й год докторантуры)
Тема исследования Генетический контроль ранних этапов биосинтеза хлорофилла у
зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii.
1. Фундаментальная научная проблема. Предмет исследования. Цели и задачи
Хлорофилл и его интермедиаты
фотосинтезирующих
организмов.
играют важную роль в функционировании
Хлорофиллы
тетрапирролов, общий путь биосинтеза
относятся
к
классу
природных
которых (Рис.) схематично может быть
представлен в виде трех последовательных процессов:
•
из глутамата синтезируется протопорфирин IX
(ПП)
– последний общий
предшественник в биосинтезе хлорофиллов и гема;
•
включение катиона Fe ++ в молекулу ПП ведет к образованию гема;
•
встраивание Mg2+
в молекулу ПП является первым специфическим этапом
синтеза хлорофилла.
К ранним этапам биосинтеза хлорофилла относят наименее изученные к
настоящему времени реакции конверсии протопорфирина IX (ПП) до протохлорофиллида
(ПХЛД). Они включают 4 ферментативные реакции, общие для всех фотосинтезирующих
организмов, как про- так и эукариот.
Встраивания Mg2+
в молекулу ПП с образованием магний-ПП осуществляет
фермент магний-хелатаза (МХ)– мультимерный комплекс, состоящий из 3-х субъединиц:
I, D и H. Помимо осуществления энзиматических функций, МХ играет ключевую роль в
регуляции процессов биосинтеза хлорофилла. Особая роль принадлежит ее большой (H)
субъединице, которая является компонентом сигнальной системы, обеспечивающей
1
2
Рис. Генетический контроль биосинтеза хлорофилла у зеленой
водоросли Chlamydomonas reinhardtii. 1 – ранние этапы биосинтеза
хлорофилла; 2 – поздние этапы биосинтеза хлорофилла.
Гены, контролирующие этапы биосинтеза обозначены заглавными
буквами, мутации, блокирующие отдельные этапы биосинтеза –
строчными буквами.
координированную регуляцию биосинтеза хлорофилла, как на метаболическом, так и на
генетическом уровне. Задача идентификации гена большой субъединицы МХ у
Chlamydomonas reinhardtii была поставлена перед автором.
2
Синтез хлорофилла у древнейших эубактерий осуществляется в темноте
(светонезависимо), а у высших растений – только при освещении (светозависимо)
Хламидомонада способна синтезировать хлорофилл и на свету,
и в темноте, что
позволяет изучать генетический контроль светонезависимого биосинтеза хлорофилла.
Идентификация
еще
неизвестных
генов
хламидомонады,
вовлеченных
в
светонезависимые процессы ранних этапов биосинтеза хлорофиллов, - задача, которую
автор также ставил перед собой.
Мутанты высших растений и зеленых водорослей, неспособные синтезировать
хлорофилл являются прекрасным объектом генетического и биохимического анализа
метаболических путей биосинтеза хлорофилла. Значительное количество таких мутантов
хламидомонады было изолировано и описано в период с 1954 по 1998 годы. Среди
штаммов, неспособных синтезировать хлорофилл в темноте, у хламидомонады были
выделены мутанты, накапливающие протопорфирин IX (ПП).
Эти мутанты и стали
предметом настоящего исследования.
2. Экспериментальный задел
2.1. Генетико-биохимическое изучение бесхлорофильных мутантов хламидомонады,
накапливающих протопорфирин IX.
В отделе генетики БиНИИ СПбГУ начиная с 1981 года, автор
исследования
бесхлорофильных
мутантов
хламидомонады,
ведет генетические
накапливающих
ПП.
Оказалось, что накопление ПП у этих мутантов обусловлено рецессивными мутациями в
двух ядерных генах: CHL1 и LTS3, представленных рядом аллелей /1,2/.
2.2. Идентификация гена CHLH, кодирующего большую субъединицу магнийхелатазы у Chlamydomonas reinhardtii.
Анализ пигментного состава клеток бесхлорофильных светочувствительных
мутантов
по гену CHL1 показал, что они накапливают только один интермедиат
биосинтеза хлорофилла – ПП – субстрат фермента МХ. /2/.. Крайне низкая активность
этого фермента у мутантов позволяла предположить, что ген CHL1 кодирует одну из
субъединиц МХ. Антитела к ним были использованы для Western blot анализа белков,
экстрагированных их клеток мутантов по гену CHL1: chl1 и brs1 и штаммов дикого типа.
Результаты показали отсутствие у мутантов только одного из трех анализируемых белков
– большой (H) субъединицы МХ. Таким образом, удалось установить, что ген CHL1
кодирует этот белок. Клонирование гена, кодирующего H субъединицу МХ проводили с
использованием разнообразных молекулярно-генетические методов (ПЦР, скринирование
кДНК и геномных библиотек, RACE систему обнаружения концевых участков кДНК и
3
др.). В результате удалось идентифицировать ген, который получил название CHLH, и
определить его интрон-экзонную структуру. Сиквенирование мутантных аллелей
показало, что мутации chl1 и brs-1 являются вставками (+1) в экзонах
9 и 10,
соответственно / 5/.
2.3. Изучение мутантов хламидомонады по гену LTS3
Штаммы,
предшественники
мутантные
по
ядерному
гену
LTS3,
в
темноте
накапливают
биосинтеза хлорофилла: ПП, Mg-ПП, Mg-ППМЭ и ПХЛД, а при
освещении - зеленеют. Мы показали, что аллельные мутации brc1 и lts3 в гене LTS3
приводят к блокированию ранних этапов биосинтеза хлорофилла в темноте, и
обусловливают дестабилизацию работы ферментов, синтезирующих ПХД из ПП, которые
утрачивают способность к регуляции светом. Генетический контроль этих процессов до
настоящего времени остается неисследованным.
2.4 Изучение экспрессии генов, контролирующих биосинтез хлорофилла.
Мы оценили экспрессию (на уровне транскрипции и трансляции) ядерных генов,
кодирующих ферменты ранних этапов синтеза хлорофилла, у мутантов, накапливающих
ПП, и штамма дикого типа.
У всех анализируемых штаммов наблюдалась световая
индукция транскрипция этих генов. Для мутантов по гену LTS3 показано снижение
уровня экспрессии генов, кодирующих субъединицы магний хелатазы, в условиях роста в
темноте.
2.5. Изучение ревертантов, полученных от мутантов по генам CHLH и LTS3.
У ревертантов, полученных на основе мутантов по генам: CHLH и LTS3, темновой
и световой синтез хлорофилла оказался восстановлен по-видимому за счет «включения» в
результате «супрессорных» мутаций альтернативных путей синтеза хлорофилла /7/. Мы
ставили перед собой задачу идентификации генов, контролирующих альтернативные
пути светозависимого и светонезависимого биосинтеза хлорофилла у хламидомонады.
2.6. Исследование мутантов с нарушенной регуляцией биосинтеза порфиринов.
На основе мутанта по гену CHLH получен штамм с избыточным накоплением
порфиринов. Оказалось, что повышение уровня порфиринов в клетках обусловлено
мутацией mod-u-25, локализованной в хлоропластном геноме хламидомонады /3,4/. Мы
полагаем, что ген, нарушенный этой мутацией, кодирует фактор, регулирующий
биосинтез хлорофилла в клетке. Идентификация этого гена значительно расширит наши
представления о генетической регуляции процесса биосинтеза хлорофилла в растительной
клетке.
4
Литература
1. Чекунова Е.М., Квитко К.В. Генетическое изучение мутантов хламидомонады, накапливающих
протопорфирин IX // Исследования по генетике. 1986. № 10. С. 104-112.
2. Шалыго Н.В., Чекунова Е.М., Чунаев А.С., Аверина Н.Г. Анализ состава порфиринов в мутантах
Chlamydomonas reinhardtii // Известия АН БССР. Сер. Биол. Наук. 1990. № 4. С. 53-57.
3. Чекунова Е.М., Шалыго Н.В., Яронская Е.Б., Аверина Н.Г., Чунаев А.С. Регуляция биосинтеза
предшественников хлорофилла в мутантах зеленой водоросли Сhlamydomonas reinhardtii // Биохимия. 1993.
Т. 58. № 9. С. 1430-1436.
4. Chekunova E.M., Yaronskaya E.B., Shalygo N.V., Averina N.G., Chunaev A.S. Regulatory mutation affecting
chlorophyll biosynthesis in Сhlamydomonas reinhardtii // Photosynthesis: from ligth to Biospere. Ed. Poul Mathis.
Klawer Academic Publishers. 1995. Vol. III. P. 921-924.
5. E.Chekunova, J.Papenbrock, V.Voronetskaya,
B.Grimm, C.F.Beck. Molecular characterization of
Chlamydomonas reinhardtii mutants defective in H subunit of Magnesium chelatase // Mol.Gen.Genet. 2001.
V.266. P.363-373.
6. E.Chekunova, V.Voronetskaya, B.Grimm, C.F. Beck. Characterization of a new gene required for lightindependent chlorophyll biosynthesis // Math.: X Intern. Conf. on Cell and Mol. Biol. of Chlamydomonas.
2002, (June 11-16). Vancouver, Canada.
7. Савельева Н.В., Чекунова Е.М. Супрессия мутаций в гене LTS3, контролирующем светонезависимый
синтез хлорофилла у Chlamydomonas reinhardtii // Вестник С.-Петербургского университета. Сер.3. 2005.
Вып.2. № 11.
3. Общий план исследовательских работ (2005 – 2007 г.)
3.1. Идентификация гена LTS3 Chlamydomonas reinhardtii
3.2. Генетическое изучение супрессии признака «отсутствие хлорофилла» у
бесхлорофилльных, накапливающих протопорфирин, мутантов хламидомонады.
3.3. Выяснение генетической природы мутации mod-u-25, нарушающей регуляцию
биосинтеза порфиринов у хламидомонады.
Работа выполняется в лаборатории генной и клеточной инженерии растений
кафедры генетики и селекции биолого-почвенного факультета СПбГУ.
4. Результаты экспериментальных исследований в 2007 году
В 2007 году продолжались научно-исследовательские работы по темам:
4.1 Идентификация гена Lts3, контролирующего светонезависимый (темновой)
биосинтез хлорофилла у хламидомонады.
Штаммы хламидомонады, мутантные по гену Lts3, в темноте накапливают
окрашенные интермедиаты ранних этапов биосинтеза хлорофилла: от протопорфирина
IX (ПП) до протохлорофиллида (ПХЛД), а при освещении - зеленеют. Проведен анализ
пигментного состава эти мутантов и активности ферментов, участвующих в биосинтезе
5
хлорофиллов.
Осуществлено
картирование
Chlamydomonas reinhardtii - он локализован
гена
Lts3
на
в правом плече I
генетической
карте
хромосомы (группы
сцепления) на расстоянии 31 сМ от центромеры. Биохимические и молекулярнобиологические исследования мутантов по гену Lts3 показали, что мутационные
нарушения этого гена приводят к блокированию светонезависимого синтеза хлорофилла и
дестабилизации работы ферментов ранних этапов биосинтеза хлорофилла (от ПП IX до
ПХД), которые утрачивают способность к регуляции светом.
Для
идентификации
гена
LTS3
была
выбрана
стратегия
«геномной
комплементации», применяемая в случаях, когда функции продукта исследуемого гена
неясны.
Методами трансформации в мутантные клетки вносятся фрагменты ДНК из
штаммов дикого типа (в виде геномной, кДНК или BAC- библиотек), и, далее, ведется
отбор трансформантов, имеющих
фенотип дикого типа (wt).
Фрагменты
wt ДНК,
встраивание которых приводит к восстановлению фенотипа wt (комплементации
исходной мутации), как правило, содержат искомый ген, который может быть далее
идентифицирован. Поскольку ранее мы картировали ген LTS3, то для его поиска имели
возможность использовать метод геномной комплементации в сочетании с позиционным
картированием. Был осуществлен анализ физических, генетических и молекулярных
маркеров, тесто сцепленных с локусом Lts3. На основе этого анализа были отобраны 26
клонов из библиотеки BAC-клонов хламидомонады (CUGI, USA), содержащие фрагменты
wt ДНК, суммарно перекрывающие область хромосомы I размером 1850 т.н.п., что
составляет примерно 15 сМ (в генетических единицах). Эти клоны были использованы
для трансформации мутантов по гену Lts3, имеющих желтую окраску при росте в темноте.
В результате были
получены трансформанты, имеющие фенотип
дикого типа -
способные зеленеть в темноте. Обнаружен участок геномной ДНК, размером 11 т.н.п,
который содержит аллель дикого типа гена lts3+. Нуклеотидная последовательность этого
фрагмента геномной ДНК доступна для анализа, также как и синтезируемые на ее основе
последовательности мРНК, (в результате реализации геномного проекта Chlamydomonas
reinhardtii). Таким образом, работа по идентификации гена LTS3 практически завершена.
Уточняется структура гена и ведется идентификация мутантных аллелей.
4.2. Генетический контроль альтернативных путей биосинтеза хлорофилла
На основе спонтанного ревертанта Brc8 генотипа: brc1,sup3, выделенного из культуры
штамма Brc1, мутантного по гену LTS3, получен инсерционный мутант Т8-3, имеющий
фенотип, характерный для мутантов по гену LTS3 – оранжевый в темноте, зеленеющий на
свету. Рекомбинационный и комплементационный анализ показали, что этот фенотип
6
обусловлен исходной мутацией brc1. При этом штамм оказался ацетат-зависимым утратил способность к фотоавтотрофному росту. Исходя из предположения, что у мутанта
Т8-3 инсерция разрушила ген-супрессор SUP3, обеспечивающего восстановление
темнового синтеза хлорофилла на фоне мутации в гене LTS3, мы идентифицировали
фланкирующие вставку последовательности ДНК, и осуществили их сиквенирование.
Обнаружено, что ген, разрушенный инсерцией, находится на расстоянии 5083 т.н.п от
гена LTS3, что составляет прим. 23 сМ. Эти данные соответствуют результатам
проведенного нами ранее гибридологического анализа, в соответствии с которыми
генетическое расстояние Lts3-Sup3 составляет 22,6 сМ (7). Таким образом, осуществлено
молекулярное картирование гена SUP3 в геноме хламидомонады. Генетическая природа
мутации sup3 и механизмы взаимодействия продуктов генов LTS3 и SUP3 в настоящее
время уточняются.
Проведено генетическое изучение супрессии мутаций в гене CHLH, блокирующих
светонезависимый (темновой) биосинтез хлорофилла. Оказалось, что фенотип 6-ти
независимо полученных ревертантов от мутантов chl1 и brs1 по гену CHLH, обусловлен
рецессивными мутациями в 2-х ядерных генах-супрессорах: SUP1 и SUP2, сцепленных с
CHLH. Расстояния этих генов до гена CHLH составляют, по данным тетрадного анализа,
26 сМ и менее 1,7 сМ, соответственно. Мутация sup1 рецессивна по отношению к аллели
дикого типа и не аллелоспецифична. Мутация sup2 - доминантна, и имеет собственное
фенотипическое проявление – обусловливает образование карликовых колоний.
Клонированный нами ген CHLH, кодирующий большую субъединицу магнийхелетазы – ключевого фермента биосинтеза хлорофилла,
методами молекулярного
картирования локализован в VII группе сцепления хламидомонады на расстоянии 5,6 сМ
от центромеры. Расстояние ген-центромер, полученное нами ранее по результатам
гибридологического анализа составляет 5,0 – 5,8 сМ, что служит подтверждением
высокой точности и эффективности методов классической генетики.
4.3.
Выяснение генетической природы мутации mod-u-25, нарушающей
регуляцию биосинтеза порфиринов у хламидомонады.
Проверка гипотезы о том, что локализованная в хлоропластном геноме мутация mod-u-25
является дупликацией одного из хлоропластного генов: trnE1 или trnE2, кодирующий
глутаминовые тРНК, не подтвердилась.
За отчетный период вышло 2 публикации, завершается подготовка обзорных статей:
«Современные
представления
о
генетике
биосинтеза
пигментов
хлорофиллов и каротиноидов», «Регуляторные взаимодействия
хлоропласта:
ядра и хлоропласта
7
фотосинтезирующей
«Эндосимбиотический
клетки:
перенос
генетический
генов
–
контроль
передача
регуляторных
генетической
процессов»,
информации
от
хлоропластов к ядру в эукариотической клетке. Как, когда, и почему»; а также, учебнометодических материалов по теме «Частная генетика хламидомонады – модельного
объекта генетики фотосинтеза».
Докторант
к.б.н. Е.М.Чекунова
Отчет заслушан и принят на заседании № __5_ кафедры генетики и селекции СанктПетербургского государственного университета от 31 октября 2007 г.
Заведующий кафедрой
генетики и селекции СПбГУ
академик РАН С.Г Инге-Вечтомов
8