Качаева Евгения Владимировна Митохондриальный АТФ
advertisement
На правах рукописи 0030583Б0 Качаева Евгения Владимировна Митохондриальный АТФчувствительный калиевый канал и его роль в адаптации организма к гипоксии 03.00.04 — биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Пущино - 2007 Работа вьшолнена в Пущинском государственном университете на базе Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН Научный руководитель Доктор биологических наук, профессор Миронова Г.Д Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Звягильская Р.А. доктор биологических наук, профессор Новоселова Е Г. Ведущая организация Институт физико-химической биологии им. А Н Белозерского при МГУ, г Москва Защита состоится ZA иаьа2007 г. в /4-~ часов на заседании Диссертационного совета Д 002.038.01 в Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142290 Московская обл., г. Пущино, ИБК РАН С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБК РАН Автореферат разослан «23 » склфыи^ Ученый секретарь Диссертационного совета Кандидат биологических наук 2007 г. Смолихина Т.И. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Митохондриальный АТФ-ингибируемый калиевый канал (митоКАТФ), осуществляющий вход калия в MX, был обнаружен методом пэтч-кламп во внутренней мембране MX в 1991 г [Inoue et al, 1991] Однако, еще в 1981 г в лаборатории проф Мироновой из MX мембраны был изолирован белок с м м 55 кДа, обладающий, при встраивании в бислойные липидные мембраны, свойствами данного канала Исследованы его биофизические свойства, механизмы его регуляции и физиологическая роль [Миронова и др, 1981, 1996 (I, II), Gngonev et al., 1999, Mironova et al, 1999, 2004]. Было показано, что выделенный белок-канал ингибируется физиологическими концентрациями АТФ [Paucek et al, 1992, Миронова и др., 1996 (I)] Интерес к исследованию митохондриального АТФ-чувствительного калиевого канала (МИТОКАТФ) В последнее время возрос, поскольку было установлено, что он, а именно его активация, играет ключевую роль в защите сердца от ишемии [Garhd et al, 1997, Vanden Hoek, 2000 и др ] Найден целый ряд синтетических активаторов митоКАТФ, являющихся потенциальными кардиопротекторами [Gross et al, 1992, Liu et al, 1998, Sato et al, 1998, Tsai et al, 2002] Недавно в нашей лаборатории был обнаружен эффективный природный метаболический активатор МИТОКДТФ уридин-5'-дифосфат (УДФ) [Негода А Е , 2001, Mironova et al, 2004] Кардиопротекторное действие УДФ до настоящего времени не было изучено Помимо важной роли МИТОКАТФ В защите миокарда от ишемических повреждений, некоторые исследователи предполагают его участие в формировании устойчивости организма к кислородному голоданию [Zhu et al, 2003] Однако прямых доказательств роли канала в адаптации организма к гипоксии до настоящего времени не получено, следовательно, данный феномен также требует дополнительных исследований Работа посвящена поиску новых путей кардиопротекции, так как, несмотря на большие усилия, направленные на лечение сердечно-сосудистых заболеваний, они все еще являются одной из первых причин смертности населения в мире Таким образом, актуальность поиска новых подходов к предупреждению и лечению этих заболеваний не вызывает сомнений В настоящее время большинство исследователей считает, что конечным эффектором кардиопротекции, вызванной прекондицией, является МИТОКАТФ [Yellon et al, 1998, Петрищев и др , 2001] Как уже упоминалось выше, физиологическая роль и параметры функционирования МИТОКАТФ достаточно хорошо изучены, однако, его структурная организация до сих пор остается неизвестной Изучение структуры МИТОКАТФ позволит исследовать функцию и регуляцию канала на молекулярном уровне Целью настоящей работы является изучение кардиопротекторного действия специфического активатора МИТОКАТФ, уридиндифосфата (УДФ) и исследование роли данного канала в формировании адаптации организма к гипоксии, а также выяснение структурной организации МИТОКАТФ канала 1 Задачи исследования 1 Изучить кардиопротекторное антиишемическое и антиаритмическое действие метаболических предшественников УДФ - уридина и УМФ на модели острого инфаркта миокарда у крыс 2 Исследовать параметры функционирования митоКАТФ у крыс с различной устойчивостью к гипоксии, а также у животных, адаптированных к недостатку кислорода 3 Определить гомологию структуры исследуемого белка с м м 55 кДа аминокислотным последовательностям известных белков 4 Получить специфические поликлональные антитела на белок-канал с м м 55 кДа, формирующий при встраивании в искусственные мембраны АТФ- ингибируемые К+ -каналы, 5. Провести ингибиторный анализ АТФ-чувствительного транспорта калия в нативных MX с использованием полученных антител (AT) с целью доказательства принадлежности белка с мм. 55 кДа к системе АТФзависимого транспорта К* в MX Научная новизна работы. В данной работе впервые изучено антиишемическое и антиаритмическое кардиопротекторное действие веществ уридинового ряда - природных активаторов митоКАТФ, на модели инфаркта миокарда Впервые также исследовались параметры функционирования МИТОКДТФ у крыс с различной устойчивостью к гипоксии, а также изучалась роль канала в формировании адаптации к кислородному голоданию у животных Проведено сравнение гомологии структуры МИТОКАТФ С аминокислотной последовательностью известных белков Научно-практическое значение работы. Представленная работа имеет научно-практическое значение, поскольку в работе обнаружено, что метаболический активатор митоКАТФ обладает выраженными антиишемическим и антиаритмическим свойством, то есть играет существенную роль в защите миокарда от ишемичесигх повреждений Результаты проведенных в работе исследований открывают перспективу разработки нового подхода к предотвращению и лечению инфаркта миокарда и различного рода аритмий с использованием предшественников природного активатора МИТОКАТФ, УДФ Изучение роли активации митоКАТФ при тренировке животных к кислородной недостаточности позволит в дальнейшем разработать пути повышения жизнеспособности организма в условиях гипоксии Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Международном конгрессе "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям" (Пущино, 2002 г), XXVIII Самарской областной студенческой научной конференции (Самара, 2002), XXXIII научной конференции студентов (Самара, 2002), международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2003), XV зимней международной молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2003), на X Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство Регуляторы 2 энергетического обмена Клинико-фармакологические аспекты» (Москва, 2003), на XVI зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2004), III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), International Conference "Biological motility" (Пущино, 2004), XVII зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2005), международной конференции «Рецепция и межклеточная сигнализация» (Пущино, 2005), IX Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века» (Пущино, 2005), VIII World Congress of the International Society for Adaptive Medicine (Moscow, 2006), VI International conference "Hypoxia m medicine" (Milan, Italy, 2006), международной конференции «Mitochondnal Physiology» (Austria, 2005) Публикации. По материалам диссертации опубликованы 23 печатные работы Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы Работа изложена на 121 странице, иллюстрирована 22 рисунками и 9 таблицами, список литературы состоит из 346 наименований МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Митохондрии выделяли из печени и сердца крыс линии Вистар (250 гр ) общепринятым методом дифференциального центрифугирования Среда выделения содержала 250 мМ сахарозы, 10 мМ Трис-НС1, 0 5 мМ ЭГТА, рН 7 4, в случае митохондрий сердца в среду добавлялось 0 01% протеазы и 1 % альбумина Выделение ^-транспортирующего белка из внутренней мембраны митохондрий печени и сердца крыс проводили методом водно-этанольной экстракции (Миронова и др, 1996) Очистка белка проводилась методом ионообменной хроматографии с использованием ДЭАЭ-целлюлозы в качестве носителя Для дополнительной очистки проводили повторную хроматографию активной фракции Для окончательной очистки белка до электрофоретически гомогенного состояния проводился нативныи электрофорез активной фракции с последующей экстракцией белка с геля Ион-транспортирующая активность изучалась путем измерения электрических характеристик БЛМ, модифицированной исследуемым белком в условиях фиксации потенциала с использованием операционного усилителя МАХ406, соединенного с компьютером IBM PC/AT286 для записи величины тока через мембрану Бислойная липидная мембрана формировалась методом Мюллера из раствора липидов 90% общих липидов мозга, 10% кардиолипина, растворенных в n-декане Суммарная концентрация липидов в n-декане составляла 20 мг/мл 3 Энергозависимый вход К+ в митохондрии определяли спектрофотометрическим методом по скорости набухания митохондрий в изотонической среде с КС1 в присутствии субстратов дыхания При работе по изучению влияния антител на АТФ-зависимый транспорт калия в митохондриях, использовалась гипотоническая среда Кинетику набухания регистрировали по изменению оптической плотности суспензии митохондрий при длине волны 520 нм при постоянном перемешивании и термостатировании при 30°С на спектрофотометре "Uvikon" (Италия) Концентрация MX белка в ячейке составляла 0 1 мг/мл Среда инкубации содержала 50 мМ КС1, 5 мМ HEPES, 5 мМ NaH 2 P0 4 , 5мМ янтарной кислоты или 0 1 М маната и 0 4 М глутамата, 0 5 мМ MgCl2, 0 1 мМ ЭГТА, 5 мкМ цитохрома С, 2 мкМ ротенона, 1 мкМ циклоспорина А, рН 7 2. Набухание инициировали добавлением MX Скорость набухания рассчитывалась по изменению светорассеяния за единицу времени АТФ-зависимый выход К* из митохондрий проводили с использованием ^-селективного электрода по содержанию и скорости выхода катиона из деэнергизованных митохондрий в присутствии разобщителя окислительного фосфоршшрования Кинетику выхода калия регистрировали с помощью оригинального электрометрического усилителя, который через контроллер L-153 соединен с компьютером IBM PC486 Измерения проводились при постоянном перемешивании и термостатировании при 26°С Концентрация митохондриального белка в ячейке составляла 1,5-2 мг/мл Среда инкубации содержала 0 3 М сахарозу, 3 мМ NaH 2 P0 4 , 10 мМ Трис-HCl, рН 7.4 Содержание калия в митохондриях оценивалось в присутствии тритона Х-100, что приводит к полному выходу калия из митохондрий При проведении ингибиторного анализа с использованием иммуноглобулинов, использовалась гипотоническая среда (0 15 М сахарозы) Следует подчеркнуть, что данный метод позволяет регистрировать обращение работы АТФ-зависимого калиевого канала с использованием разобщителя, что дает возможность определять работу канала независимо от энергетического состояния митохондрий Полярографическое определение параметров дыхания митохондрий проводили с помощью закрытого платинового электрода Кларка в кювете объемом 1 мл Концентрация белка в кювете составляла 1-2 мг/мл. Среда инкубации содержала 5 мМ Tns-HCl, 200 мМ сахарозы, 50 мМ КС1, 5 мМ NaH 2 P0 4 , 3 мкМ ротенона, рН 7 2 Эксперименты проводились в закрытой ячейке при постоянном перемешивании и термостатировании при температуре 26°С Для иммунохимических исследований МИТОКДТФ канала животных иммунизировали очищенным до электрофоретически гомогенного состояния белком с м м 55 кДа и получали поликлональные тканеспецифические антитела на этот белок Полученными антителами ингибировали АТФ-зависимый транспорт калия в митохондриях Электрофорез и иммуиоблотинг белка-канала с м.м. 55 кДа Проверку гомогенности очищенного белка с м м 55 кДа проводили с 4 помощью ДЙ^-ПААГ (10% гель) электрофореза с последующим переносом на нитроцеллюлозную мембрану Проверка специфичности полученных антител проводилась далее непрямым Вестерн-блот анализом [Towbm et al, 1979] Титр полученных антител определяли методом непрямого дот-анализа Иммуноглобулины G для ингибиторного анализа выделяли из полученной антисыворотки методом дробного высаливания, хроматографии и диализа (Китти, 1991) Ингибиторный анализ АТФ-зависимого транспорта К+ в митохондриях проводили анализируя скорости энергозависимого входа и ДНФ-индуцированного выхода калия из митохондрий Для улучшения проницаемости мембраны для иммуноглобулинов использовалась гипотоническая среда инкубации В качестве контроля использовалась преимунная сыворотка, а также сыворотка, содержащая специфические антитела на белок с м м 55 кДа, подвергнутая предварительно 5тиминутному кипячению Также определялось влияние антител на параметры дыхания и фосфорилирования MX MS-MALDI-TOF/TOF анализ (от англ Mass spectrometry/mass spectrometry-matnx assisted laser desorbtion/ionization — time of flight) Для анализа очищенный 55 кДа белок подвергали ферментативному гидролизу трипсином в денатурирующих условиях в геле. Для экстракции пептидной смеси после гидролиза проводили фингерпринтинг масс пептидов из геля ацетонитрилом/гидрокарбонатаммонием для анализа масс-спектрометрией Масс-спектральный анализ проводился на времяпролетном массспектрометре Ultraflex (Bruker, Daltonik) в режиме моноизотопической детекции 300-1800 Да Масс-спектры анализировались через базу данных MSDC и NCBI программой Mascot Работа выполнялась на базе ГУ Института физико-химической медицины им Ореховича, РАМН Модель экспериментального острого инфаркта миокарда. Работа выполнялась совместно с сотрудниками Института экспериментальной медицины, г. Санкт-Петербург Для работы использовались самцы крыс линии Вистар (250 г ), которым вводили уридин и УМФ, а также ингибиторы КАТФ каналов (глибенкламид и 5-гидроксидеканоат (5-ГД)) Животные были поделены на экспериментальные группы, в зависимости от вводимых им препаратов Схема инъекций препаратов представлена в таблице Инъекции препаратов выполнялись внутривенно У крыс проводилась окклюзия левой коронарной артерии (ЛКА) в течение 60 минут без последующей реперфузии [Selye et al, 1960] Исследуемые препараты (уридин и УМФ) вводили внутривенно в дозе 30 мг/кг веса животного за 5 минут до окклюзии ЛКА После выполнения эксперимента животные умерщвлялись 5 Таблица 1 Схема инъекций препаратов крысам с моделью острой ишемии миокарда Группы животных Вводимые препараты Уридин УМФ Глибенкламид 5-ГД I (контрольная группа) II III rv V VI VII VIII IX - + - + - + - + + - + + - + + + + + Анализ электрокардиограмм. Электрокардиограммы (ЭКГ) записывались при отведении II (ЕС1Т-03М2, Россия) при скорости движения бумаги 25 или 50 мм/с Чувствительность была настроена так, что 1 мВ = 1 0 мм отклонения ЭКГ регистрировалась до окклюзии, первые 30 минут окклюзии непрерывно и, затем, на 60-ой минуте после окклюзии Анализ ишемических нарушений. Амплитуду Т-волны измеряли на ЭКГ перед окклюзией, а затем через 3, 30 и 60 минут после окклюзии Зона ишемической альтерации (ЗИА) определялась с использованием метода определения активности гликоген фосфорилазы [Fredenks, 1993] Полученное значение выражали как индекс ишемической альтерации (ИИА) ИИА = £ЗИА/линейное увеличение2 массу сердца. Анализ нарушений ритма. Все нарушения ритма классифицируются в соответствии с конвенцией Ламбета [Walker et al, 1988] В работе измерялись время начала и длительность аритмии, количество экстрасистол (ЭС), частота возникновения и длительность тахикардии желудочков (ТЖ), а также длительность и частота возникновения фибрилляции желудочков (ФЖ) Все показатели измерялись в течение 30 минут постокклюзионного периода Параметры функционирования митоКАТФ канала у животных с различной резистентностью к гипоксии определяли при исследовании энергозависимого входа К1" в MX методом спектрофотометрии а также ДНФиндуцированного выхода ионов калия из митоходрий с помощью К*селективного электрода Кроме того, в работе изучались параметры сопряженного дыхания MX у животных каждой группы Отбор высоко- н ннзкоустойчивых крыс проводился с использованием барокамеры Группа высокоустойчивых (ВУ) животных выдерживала острую гипобарическую гипоксию, соответствующую подъему на высоту 11500 м, в течение 10-15 мин Низкоустойчивые (НУ) выдерживали эту высоту только в течение 1-1 5 мин [Лукьянова и д р , 1999, Лукьянова, Коробков, 1981] Интервальная гипоксическая тренировка проводилась методом прерывистой нормобарической гипоксии, при которой низкоустойчивые к 6 гипоксии животные помещались в специальную камеру, в которую подавался воздух с концентрацией кислорода в два раза ниже нормы (10% 0 2 ) на 10 минут 5 раз в день с 3-минутными интервалами Во время интервалов в камеру подавался воздух с нормальным содержанием кислорода Процедуру повторяли в течение 12 дней Для этого использовалась камера, сконструированная в научно-клинической лаборатории Hypoxia Medical Academy, Москва РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Изучение физиологической роли митоКАТФ канала при гипоксии. 1.1. Изучение кардиопротекторного действия активации митоКАТФ канала уридииовыми нуклеотидами на модели экспериментального острого инфаркта миокарда. Как было установлено ранее в нашей лаборатории [Mironova et al, 2004], УДФ является физиологическим активатором митоКАТФ Кардиопротекторное действие УДФ изучалось при введении животным т vivo его предшественников в клетке — уридина и УМФ, способных в отличие от самого УДФ, проникать через клеточную мембрану и фосфорилироваться в клетке до УДФ (Aussedat et al, 1984, Matsushita et al, 1970) В работе оценивались следующие ишемические нарушения 1) индекс ишемической альтерации (ИИА) миокарда, определяемый исходя го размера зоны ишемической альтерации гистохимическим методом, и 2) величина обменной волны Т, определяемая на ЭКГ Показано, что ИИА снижается при внутривенном введении уридина в 2 раза и УМФ почти в 3 5 раза (Рис 1А) Оба препарата также заметно снижают амплитуду Т-волны (Рис 1Б) Ингибиторы КАТФ каналов - глибенкламид (митохондриального и клеточного) и 5-ГД (митохондриального), блокируют положительное действие препаратов в обоих случаях (Рис 1) Способность специфического ингибитора МИТОКДТФ, 5-ГД, блокировать антиишемическое действие уридина и УМФ говорит о доминирующей роли МИТОКАТФ В защите миокарда от ишемических повреждений Т е защита миокарда от ишемических повреждений опосредуется, преимущественно, активацией митоКАТф В работе также исследовалось влияние уридина и УМФ на нарушения сердечного ритма При этом определялись такие параметры, как количество экстрасистол, частота возникновения и длительность желудочковой тахикардии и фибрилляция желудочков 7 i at o, | | 1 Г г* i • !' 1 f — fl | o , h Ишемия H 1"'M 1 i i ' 0J0- УМФ 5-ГД Гя&ГД Гяв5ГД Ги<Ы'Д УМФ Г-*5ТД A Рис. 1. Влияние уридина и УМФ, а также специфических ингибиторов КАТФ каналов на ИИ А миокарда и амплитуду Т-волны при ишемии миокарда. Установлено, что уридин в 4 раза, а УМФ почти в 6 раз сокращают количество экстрасистол (Рис. 2А). Кроме того, уридин в 4 раза, а УМФ в 9.4 раза снижают продолжительность желудочковой тахикардии (Рис. 2Б). Антиаритмический эффект уридина и УМФ блокировался, главным образом, глибенкламидом, в то время как 5-ГД оказывал менее выраженный эффект (Рис. 2). Следовательно, антиаритмическое действие уридиновых препаратов опосредовано активацией обоих каналов, но, в большей степени, активацией ЦИТОКАТФ- Фибрилляция является крайним проявлением нарушений ритма сердца, приводящим к гибели организма. Введение уридина в 4, а УМФ - в 10 раз снижает длительность фибрилляций (Рис. 3) и существенно уменьшает частоту возникновения фибрилляций, наблюдаемых при экспериментальном инфаркте миокарда. При этом ни глибенкламид, ни 5-ГД не блокируют действие уридиновых препаратов на длительность фибрилляций, но почти полностью снимают защитный эффект уридина и УМФ на частоту возникновения фибрилляций. Следовательно, антифибрилляторное действие уридина и УМФ опосредуется активацией митоКАТФ канала лишь частично. Из полученных данных следует, что предшественники природного активатора митоКАТФ канала в перспективе могут использоваться как лекарственные препараты. 8 1«B 450-J МО- 5 400- 1.300 i 2500 200Е 150 • 1 100| 50о Ншешя i:o 100 !! '] •'.••- , I i JL Урцднн— Глав <-ГД Гшб 5-ГД Рис. 2. Влияние уридина и УМФ на нарушения сердечного ритма. IT,-, JUL Рис. 3 Влияние уридина и УМФ на длительность фибрилляции желудочков. Ургапн - •г«ив j-гд • г«нб 5-гд работе были в также получены данные о том, что введение уридина и УМФ через 5 минут после окклюзии приводит к заметному кардиопротекторному эффекту, что позволяет говорить о перспективах использования данных препаратов не только для предупреждения, но и для лечения инфаркта миокарда. При этом, тот факт, что УДФ является метаболическим активатором канала, использование его производных в качестве лекарственных средств будет иметь ряд преимуществ, по сравнению с синтетическими аналогами, поскольку они не обладают отрицательными побочными эффектами, присущими синтетическим лекарственным препаратам. Кроме того, концентрацию УДФ в клетке можно регулировать. 1.2. Параметры функционирования митоКАТФ канала у крыс с различной резистентностью, а также у животных, адаптированных к гипоксии. Для изучения роли митоКАТФ канала в формировании устойчивости организма к кислородному голоданию, а также для понимания механизма кардиопротекторного действия активации канала, в работе была поставлена задача исследовать параметры дыхания, окислительного фосфорилирования и АТФ-зависимого транспорта К+ в MX печени и сердца крыс с различной устойчивостью к недостатку кислорода, а также у животных, адаптированных к гипоксии. 9 Показано, что скорость дыхания MX во всех метаболических состояниях у высоко устойчивых животных значительно ниже таковой у низко устойчивых (Рис. 4А). Причем время, за которое фосфорилируется определенное количество АДФ у высоко устойчивых животных даже снижено. Дыптельнып контроль Время фосфоргипров&ши Рис. 4. Скорость дыхания (А) и показатели фосфорилирования (Б) митохондрий сердца крыс с различной устойчивостью к гипоксии, а также у животных, адаптированных к гипоксии. Это свидетельствует об исходно большей экономичности процесса синтеза АТФ у высоко устойчивых животных. Адаптация низко устойчивых животных к гипоксии путем интервальной гипоксической тренировки, приводит к сопряжению дыхания, что, в свою очередь, выражается в снижении скорости дыхания (Рис. 4А), увеличении дыхательного контроля и сокращении времени, необходимого для фосфорилирования АТФ (Рис.4Б). В работе также определялись параметры АТФ-зависимого транспорта К* в MX крыс с различной резистентностью к гипоксии, а также у низкоусточивых крыс после их адаптации гипоксической тренировкой. Как следует из рисунка 5, скорость АТФ-зависимого транспорта К в MX определялась двумя методами (по входу (Рис. 5А) и выходу (Рис. 5Б) калия). У высокоустойчивых крыс скорость транспорта калия существенно выше, чем у низкоустойчивых. Гипоксическая тренировка приводит к увеличению скорости транспорта К" до уровня, сравнимого с аналогичными показателями высокорезистентных крыс (Рис. 5). 10 'i | l U - j ESS) Адаптированные i 09- Печень Сердце a Рис. 5. Скорость энергозависимого входа К + (А) и ДНФ-индуцированного выхода К + (Б) из митохондрий печени и сердца крыс с различной устойчивостью к гипоксии. Обращает на себя внимание тот факт, что концентрация калия в MX высокоустойчивых и, особенно, адаптированных к гипоксии крыс значительно ниже, чем у низкоустойчивых животных (Рис. 6). То есть объем MX у них не увеличен, а даже уменьшен, несмотря на увеличение скорости входа калия в MX. Следовательно, адаптация приводит, по-видимому, не только к интенсификации энергозависимого входа К*, но и к значительной активации К7Нч-обменника, который регулирует выход ионов калия из MX. С этой точки зрения снижение активности ЮТгГ-обменника может быть причиной высокоамплитудного набухания и следующего за ним повреждения MX при высокой степени ишемии. Сердце Рис. 6. Количество К + в митохондриях сердца крыс с различной резистентностью и адаптированных к гипоксии. Известно, что при гипоксии недостаток кислорода приводит к восстановлению переносчиков дыхательной цепи [Лукьянова, 2004]. 11 Восстановление переносчиков I и III комплексов цепи, приводит к увеличению образования активных форм кислорода (АФК) [Kaplan-Bresler, 1965, Ferrantietal, 2003] В норме MX превращают несколько процентов потребляемого кислорода в АФК [Lenaz et al, 2002], которые необходимы для функционирования дыхательной цепи [Kondrashova and Mironova, 1971], тогда как, повышенное образование АФК, наблюдаемое при гипоксии, служит основным повреждающим фактором [Starkov et al, 1997, Barger et al., 2002] Обнаруженная нами активация калиевого цикла, способствует слабому разобщению митохондрий и снижению мембранного потенциала Известно, что незначительное снижение мембранного потенциала (-13%) ведет к существенному уменьшению продукции АФК (до 80%) [Korshunov et al, 1997] С этими представлениями согласуются известные данные о том, что активация МИТОКАТФ канала сопровождается снижением концентрации АФК в клетке, способствуя сохранению уровня АТФ [Zweier et al, 1987, Pain et al, 2000]. Таким образом, обнаруженная нами активация калиевого цикла при адаптации к гипоксии и, следующее за этим снижением, образование АФК, может объяснить известную [Pearlstem et al, 2002, Li et al., 2002] защитную роль митоКАТФ канала при ишемии/реперфузии 2. Изучение структурной организации зависимого калиевого канала. 2.1. митохондриального АТФ- Определение структурной гомологии белка с м.м. 55 кДа аминокислотной последовательности известных белков методом MS-MALDI-TOF/TOF. Следующим этапом работы было изучение структуры белка с м м 55 кДа, а именно, определение гомологичное™ этой структуры последовательностям известных белков MS-MALDI-TOF/TOF анализом Показано, что белок с м м 55 кДа на 54% гомологичен белкупредшественнику, который, исходя из результатов анализа базы данных NCBI, является предшественником кальрегулина (Рис 7) Вероятно, белок с м м 55 кДа является конечным продуктом систем посттрансляционной модификации данного белка-предшественника Процент перекрывания аминокислотных последовательностей типичного кальрегулина печени крысы, с последовательностями 55 кДа белка также оказался достаточно большим Классический кальрегулин входит в состав семейства высококонсервативных белков с мм около 55 кДа, выделенных из ретикулума клеток печени, скелетной и гладкой мускулатуры, сердечной мышцы [Fhegel et a l , 1989] Белки этого семейства связывают ионы кальция, цинка, других металлов, а также сахара, связанные с УДФ, и другие нуклеотиди- и трифосфаты Ранее в нашей лаборатории было показано, что белок с м м 55 кДа также способен связывать кальций и сахара, что говорит о 12 вероятной функциональной кальрегулина. гомологии изучаемого 55 кДа белка и 1 MLLSVPLLLG l.LGLAAADPA IYFKEQFLlXi DAWTNRWVES KHKSDFGKFV 51 LSSGKFYGDQ EKDKGLQTSQ DARFYALSAR FEPFSNKGQT LVVQFTVKHE 101 ^NroCGGGYVKLI-'PGGI.DQK DMHGD'SEYNI MFGPDICGPG TKKVHVIFNY 151 KGKNVL1NKD IRCKDDEFTH LYILIVRP.DN TYEVKIDNSQ VESGSLEDDW 201 SFLPPKK1KD PDAAKPEDWD ERAK1DDPTD SKPEDWDKPE HIPDPDAKKP 251 EDWDEEMDGE WEPPVIQNPE Y.KGEWKPRQI DNPDYKGTWI HPEIDNPEYS 301 PDANIYAYDS FAVLGI.DLWQ VK.SGTIFDNF- 1JTNDEAYAE EFGNETWGVI 351 KAAEKQMKDK QDEEQRLKEE EEDKKRKEEE EAEDKI-DHDD RDEDEDEEDE 401 KEEDEEDATG QAKDEL Рис. 7. Аминокислотная последовательность предшественника кальрегулина. Участки структуры белка-предшественника, совпадающие с последовательностями, имеющимися в белке с м.м. 55 кДа, выделены серым цветом. В составе прекурсорного белка и кальрегулинов различных типов имеется характерная гидрофобная сигнальная последовательность из 17 аминокислотных остатков, MLLSVPLLLGLLGLAAA (1-17), посттрансляционно удаляемая протеолитическим расщеплением [Murthy et al., 1990], которая отсутствует в изучаемом нами белке. N-концевая последовательность с 17 по 27 аминокислотный остаток DPAIYFKE 55 кДа белка, структура которого была определена ранее в нашей лаборатории реакцией химической деградации по Эдману [неопубликованные данные] совпадает с N-концом кальрегулина, прошедшего стадии посттрансляционного созревания. Причем, необходимо заметить, что большая часть перекрывающейся последовательности приходится на Р-домен кальрегулина, способного связывать нуклеотиды. Также, в перекрывающуюся последовательность включены высоконсервативные остатки триптофана, характерные для кальрегулинов в данных сайтах первичной последовательности, и стерически идентично расположенные в первичной аминокислотной последовательности кальрегулина консервативные антипараллельные бета-листы, формирующие Р-домен [Schweizer et al., 1993]. Важно отметить, что С-конец прекурсорного белка, как и всех кальрегулинов, содержит сигнальную последовательность K.DEL, определяющую локализацию этих белков в ретикулюме [Schweizer et al., 1993], в то время как у изучаемого 55 кДа белка такой последовательности нет, что, вероятно, определяет локализацию исследуемого белка не в ретикулюме. Возможно, исследуемый нами белок, гомологичный кальрегулину, проходит альтернативные стадии пострансляционных модификаций и созревания при биосинтезе. Такая модификация, вероятно, 13 позволяет ему встраиваться во внутреннюю мембрану митохондрий беспрепятственно и без значительных потерь энтропии и внутренней энергии при смене гидрофильной среды на гидрофобную Не исключено также дополнительное стерическое и физико-химическое влияние на химические свойства и конформационную норму со стороны компонентов мембраны митохондрий Учитывая все вышесказанное, на данном этапе исследования структуры митоКАТФ, можно утверждать лишь, что белок с м м. 55 кДа является белком, обладающим высокой степенью структурной и функциональной гомологии с кальрегулином 2.2. Ингибиторный анализ активности митоКАТФ канала использованием антител, полученных на белок с м.м. 55 кДа. с Гомологичность белка с мм. 55 кДа кальрегулину вызвала необходимость доказательства принадлежности исследуемого белка к системе АТФ-ингибируемого транспорта калия в митохондриях. Поэтому следующей задачей работы является получение на данный белок поликлональных антител (AT) и проведение анализа их влияния на АТФзависимый транспорт калия в интактных MX. Электрофоретически чистый белок с м м 55 кДа при встраивании в искусственные мембраны формировал К+ канал, ингибируемый физиологическими концентрациями АТФ. На данный белок в работе были получены поликлональные антитела Анализ специфичности полученных антител методом Вестерн-блот показал, что они специфически связываются только с белком с м м 55 кДа, и не связываются ни с одним из белков суммарной митохондриальной фракции Этим же методом установлена тканеспецифичность AT, полученных на белок-канал с м м 55 кДа Для проведения ингибиторного анализа из полученной антисыворотки стандартным методом выделяли IgG В качестве контроля использовались IgG преимунной сыворотки и IgG антисыворотки, подвергнутые предварительно кипячению в течение 5 минут Из рисунка видно, что полученные в работе AT ингибируют как энергозависимый (Рис 8А), так и независящий от энергии АТФ- чувствительный транспорт калия в митохондриях (Рис 8Б), что показано двумя методами Следует отметить, что IgG контрольной сыворотки и IgG, инактивированные кипячением, не влияли на этот транспорт Кроме того, антитела, полученные на исследуемый белок, выделенный из MX печени крысы, не блокировали АТФ-чувствительный К+ транспорт в MX сердца крысы, при использовании обоих методов исследования, т к, они обладают тканеспецифичностью, о чем упоминалось выше 14 А Б ^Г / K^OITOtOOTMrlgG / 00 05 10 15 Концентрация IgG r мг/мг белка MX О 01 0.2 03 04 OS 0€ ОТ [IgG], мг/иг белка MX Рис 8. Ингибирование энергозависимого входа К* (А) и ДНФинидуцированного выхода (Б) ионов из MX печени крысы антителами на белок с м м. 55 кДа. Важно подчеркнуть, что полученные антитела не влияли на параметры дыхания и фосфорилированияМХ, что доказывает специфичность полученных антител именно к системе АТФ — чувствительного транспорта К+ в митохондриях, осуществляемого митоКАТФ (Рис. 9) 15 ОВ Рис 9. Действие антител к К^транспортирующему белку с мм 55 кДа, выделенному из MX печени крысы на сопряженное дыхание MX 1 - Контроль, 2 - 0,5 мг IgG/мг белка митохондрий 50 67 83 Мин Полученные результаты доказывают, что белок с м м 55 кДа действительно участвует в формировании АТФ-зависимого калиевого канала внутренней мембраны MX и, по всей видимости, согласно данным нашей лаборатории, является его канальной субъединицей [Mironova et al, 2004] 16 выводы. На основании полученных в работе результатов были сделаны следующие выводы 1 Показано, что при экспериментальном инфаркте миокарда уридин и УМФ, предшественники уридиндифосфата, - активатора МИТОКАТФ, снижают размеры зоны инфаркта миокарда более чем в 3 раза, участвуют в нормализации Т-волны и сердечного ритма, а именно, в 4-6 раз сокращают количество экстрасистол, в 5-10 раз снижают длительность желудочковой тахикардии и межжелудочковой фибрилляции 2 С использованием специфических ингибиторов цитоКАТФ и МИТОКАГФ каналов показано, что антиишемическое действие уридина обеспечивается, в основном, митохондриальным К АТ Ф каналом, а антиаритмическое цитоплазматическим 3 Антифибрилляторный эффект обоих препаратов, связан не только с активацией этих каналов но, по-видимому, опосредуется также и другими механизмами 4 Обнаруженное в работе кардиопротекторное действие уридина и УМФ позволяет говорить о перспективе использования этих веществ в качестве лекарственных препаратов для предупреждения и лечения инфаркта миокарда 5. Формирование устойчивости животных к недостатку кислорода, а также адаптация нормобарической гипоксической тренировкой низкоустойчивых животных сопровождается сопряжением дыхательной цепи, активацией митоКАТФ канала и КТН* - обменника 6 Показано, что белок с м м 55 кДа обладает высокой степенью структурной и функциональной гомологии с типичным представителем семейства кальрегулинов 7. В работе получены специфические поликлональные антитела на белок с м.м 55 кДа, формирующий при встраивании в искусственную мембрану АТФ-ингибируемые К+ каналы Ингибиторный анализ АТФчувствителыюго калиевого транспорта в интактных MX с использованием полученных антител показал, что белок с м м 55 кДа относится к системе АТФ-зависимого входа К+ митохондрий 17 СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ Статьи 1 Негода А Е , Качаева Е В , Миронова Г Д , Чайлахян Л.М. "Механизм регуляции митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала адениновыми нуклеотидами" Доклады Академии наук, Т400, №1, с. 1-4, 2005 2. Krilova I В., Kachaeva Е V., Rodionova О М , Evdokimova N R., Balrna М I., Mironova G D , Sapronov N S The Cardioprotective Effect of Uridine and Undine-5'-monophosphate, the Role of the Mitochondrial ATP-dependent Potassium Channel Experimental Gerontology, 2006,41(7) 697-703 3 Миронова Г Д , Качаева Е В , Копылов А.Т Митохондриальный АТФ-чувствительный калиевый канал I. Структура канала, механизм его функционирования и регуляция Вестник Российской Академии Медицинских наук, 2007, № 2, стр 44-50 4 Миронова Г Д , Качаева Е В , Крылова И Б , Родионова О М , Балина М.И, Евдокимова Н Р, Сапронов Н С Митохондриальный АТФчувствительный калиевый канал II Роль канала в защите сердца от ишемии Вестник Российской Академии Медицинских наук, 2007, № 2, стр 34-43 5 Mironova G D , Kachaeva E.V, Krilova LB , Rodionova О М , Sapronov N S ATP-dependent potassium channels of cell and mitochondrial membranestheir role m cardioprotection Hypoxia Medical Journal In press, 2007. Тезисы конференций: 1 Скарга Ю Ю , Негода А Е и др "Структура и регуляция митохондриального КДТФ канала". Сборник тезисов: "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям", 2002 г , стр 128 2 Качаева Е В. "Изучение митохондриального АТФ-чувствительного калиевого канала, реконструированного в бислойные липидные мембраны." Сборник тезисов XXVIII Самарской областной студенческой научной конференции, 2002, стр 120 3 Качаева Е В «Исследование параметров функционирования митохондриального АТФ-чувствительногокалиевого канала при реконструкции в БЛМ» Сборник тезисов XXXIII научной конференции студентов, г Самара, 2002 4 Качаева Е.В, Пиголев А Е и др " Зависимость активности митохондриального АТФ-чувствительного калиевого канала от типа ткани и воздействия температуры". Сборник тезисов международной конференции Рецепция и внутриклеточная сигнализация", г. Пущино, 2003, стр 245-247 5 Качаева Е В , Негода А Е и др "Активация АТФ-чувствительного калиевого канала внутренней мембраны митохондрий УДФ и ГДФ " Сборник тезисов XV зимней международной молодежной научной школы 18 «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», г. Москва, 2003, стр 41 6 Миронова Г Д , Скарга ЮЮ и др "Роль активаторов АТФзависимого калиевого канала митохондрий в предупреждении инфаркта миокарда " Статья в сборнике научных трудов- "Регуляторы энергетического обмена Клинико-фармакологические аспекты", стр 53-61, Томск, 2003. 7. Качаева Е В , Негода А Е , Миронова Г Д "Изменение активности митохондриального АТФ-чувствительного калиевого канала в зависимости от метаболического состояния животных и типа ткани " Сборник тезисов XVI зимней молодежной научной школы «перспективные направления физикохимической биологии и биотехнологии» 2004, стр 10. 8 Качаева Е В , Негода А Е , Миронова Г Д «Сравнение параметров АТФ-зависимого транспорта калия в митохондриях со свойствами выделенного и реконструированного в БЛМ АТФ-зависимого К+ канала» Сборник тезисов III Съезда биофизиков России, 2004 9 Negoda A.E, Kachaeva E V. et al "Mitochondrial KATP channel openers and their antiischemic and antiarrythmic action " Сборник тезисов: «Biological motility». 2004, p 51-53 10 Качаева Е В , Негода А Е., Миронова Г Д «Изучение АТФазной активности митохондриального АТФ-чувствительного каливого канала» Сборник тезисов XVII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», г Москва, 2005 11. Качаева Е В , Балина М.И, Негода А.Е , Миронова Г Д «Возрастные изменения активности митохондриального АТФ-чувствительного калиевого канала сердца крыс» Сборник тезисов международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», г Пущино, 2005 12 Негода А Е , Качаева Е В , Балина М И , Крылова И Б., Родионова О М , Сапронов Н.С, Миронова Г Д «Митохондриальный АТФчувствительный калиевый канал- структурная организация и роль в кардиопротекции» Сборник тезисов международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», г. Пущино, 2005 13 Балина М И , Качаева Е В , Негода А Е. «Изменение активности митохондриального АТФ-чувствительного калиевого канала в зависимости от метаболического состояния животных» Сборник тезисов 9 международной конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века», г Пущино, 2005. 14 Качаева Е В . «Специфическое ингибирование АТФ-зависимого К+ транспорта в интактных митохондриях поликлональными антителами, полученными на МИТОКАТФ канал (белок с м м. 55 кДа)» Сборник тезисов 9 международной конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века», г Пущино, 2005 15 Mironova G D., Krylova I В , Negoda A E , Rodionova О М , Kachaeva E.V, Evdokimova N P., Sapronov N S. The metabolic activators of mitochondrial ATP-dependent potassium channel and its role in cardioprotection International Congress "Mitochondrial physiology", Austria, p 95,2005 19 16 Kachaeva E V., Krilova I В , Rodionova О М., Sapronov N.S, Mironova G.D Effect of uridme nucleotides on adaptation of myocardium to ischemia VIII World Congress of The International Society for Adaptive Medicine (ISAM), p 149, 2006 17 SapronovNS, Krylova IB., Rodionova O M , Evdokimova N R , Kachaeva E.V, Mironova G D Comparative study on the cardoprotective properties of the uridme and uridme nucleotides II Russian-Chinese Conference on pharmacology, Perm, 2006 18. Mironova G D , Krylova I В , Rodionova О М , Kachaeva E.V, Sapronov N S , Tkachouk E N , Lukyanova L D The role of the mitochondrial ATPdependent potassium channel in adaptation to hypoxia International conference on Adaptive medicine Milano, Italy, 2006 20 Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ПД № 1-00007 от 25 09 2000 г Подписано в печать 05 04 07 Тираж 75 экз Уел п л 1,31 Печать авторефератов (095) 730-47-74, 778-45-60
