Ультраструктурные особенности строения корневых клубеньков

УЛЬТРАСТРУКТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ
СТРОЕНИЯ КОРНЕВЫХ КЛУБЕНЬКОВ
СИМБИОТИЧЕСКИХ СУПЕРКЛУБЕНЬКОВЫХ
МУТАНТОВ ГОРОХА PISUM SATIVUM L.
Е.У.Болоболова, Н.В.Губанова, К.К.Сидорова
Лаборатория морфологии и функции клеточных структур
Институт цитологии и генетики СО РАН
630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 10
тел.: (3832) 33–39–33, факс: (3832) 33–12–78
еmail: elbol@bionet.nsc.ru
К числу биологических процессов , имеющих глобальное значение для гео- и
биосферы, относятся фотосинтез и азотфиксация. Единств енными организмами,
способными фиксиров ать азот из атмосферы, яв ляются прокариоты. Значительную
часть усв оенного азота обеспечив ают симбиозы бобов ых растений с бактериями
рода Rhizobium. Разв итие и функциониров ание симбиоза определяется геномами
растения, бактерии и услов иями окружающей среды. Фиксация азота происходит в
специальных органах на корнях растений, клубеньках. Клубеньки состоят из крупных
клеток, заполненных бактериями. Попадая в клетки клубенька, бактерии окружаются
мембраной растительного происхождения, назв анной перибактероидной мембраной
(ПБМ). ПБМ образует границу между партнерами симбиоза, через которую происходит обмен сигналами и метаболитами. В клетке клубенька бактерии дифференцируются, в несколько раз ув еличив аются в объеме. Бактерии, прошедшие дифференциров ку, назв аны бактероидами. Бактероиды с ПБМ назв аны симбиосомами.
Бактероиды синтезируют нитрогеназу, катализирующую в осстанов ление азота [1].
Эффектив ность фиксации азота в клубеньке зав исит от количеств а бактероидсодержащей ткани и от ее организации. Образов ание и разв итие азотфиксирующих
клубеньков , их морфология, размеры и число определяются генотипом растенияхозяина и услов иями произрастания. У бобов ых растений существ уют механизмы
ранней регуляции к лубенькообразов ания: контроль количеств а и размеров клубеньков (механизм авторегуляции клубенькообразов ания) и ингибиров ание фиксации
азота при наличии в среде нитратов (механизм азотного контроля). Группа мутаций
nod у гороха затрагив ает действ ие этих механизмов . Так как в о в ремя фиксации
азота бактерии используют большое количеств о фотосинтата, то при изменении количеств а образующихся клубеньков может происходить нарушение рав нов есия обмена метаболитами между растением и бактерией, что в св ою очередь может в лиять на строение бактероидсодержащей ткани клубенька.
В нашей работе мы изучали ультраструктуру бактероидсодержащей ткани
симбиотических мутантов гороха, относящихся к группе nod. Материал для исследов ания получен в секторе генетики мутаций и мутационного процесса, в озглав ляемом К.К.Сидоров ой. Растения в ыращив али в гидропонной теплице в одинаков ых
услов иях. Инокуляцию проростков растений пров одили одним в ысокоактив ным
штаммом бактерий Rhizobium leguminosarum 250а.
Были пров едены электронно-микроскопический и морфометрический анализы.
Для морфометрического анализа были в ыбраны следующие параметры: относительный объем (Vv) бактероидов , Vv перибактероидного пространств а (ПБП), Vv цитозоля растительной клетки. Данные параметры отражают представ ительств о обоих
партнеров симбиоза в клетке [2, 3].
В перв ом эксперименте в качеств е исходного материала были в зяты линии
Рамонский 77 и Рондо и их суперклубеньков ые мутанты: nod4, полученный из Рамонского 77 и nod3, полученный из Рондо. Оба мутанта образуют большое количество клубеньков мелкого и среднего размера, в 10 раз боль ше, чем у исходных линий, яв ляются устойчив ыми к полным дозам минерального азота. Суперклубеньков ые мутанты имеют природу моногенных рецессив ных мутаций с плейотропным
эффектом [4–6]. Растения были в ыращены на среде с полной дозой минерального
азота.
Электронно-микроскопический анализ в ыяв ил различия как между исходными
линиями и мутантами, так и между суперклубеньков ыми мутантами. Бактероидсодержащая ткань сорта Рамонский 77, образующего неактив ные клубеньки на полном азотном питании, характеризуется большим количеств ом бактероидов в нутри
ПБП, рас ширенным ПБП, наличием гранул запасного в еществ а (октибутирата) в цитоплазме бактероидов . Бактероидсодержащая ткань мутанта nod4, актив но фиксирующего азот на фоне полного азотного питания, отличается от исходного сорта небольшим количеств ом бактероидов в ПБП, меньшим Vv ПБП, большим Vv цитоплазмы растительной клетки (рисунок). При срав нении линии Рамонский 77 с мутантом nod4, дисперсионный анализ показал достов ерные различия по в сем параметрам, кроме Vv бактероидов (табл. 1).
Линия Рамонский 77
Мутант nod 4
Линия Рондо
Мутант nod 3
Рис. Ультраструктура бактероидсодержащей ткани клубеньков растений гороха линий Рамонский 77, Рондо, nod 4, nod 3. Ув. х10000. (1 – бактероид, 2 – перибактероидное пространство, 3 – цитоплазма растительной клетки).
Та б ли ц а 1
Результаты морфометрического анализа инфициров анных клеток
клубеньков растений гороха сорта Рамонский 77 и мутанта nod4
Линии
Рамонский 77
nod4
Vv
бактероидов
0,42±0,09
0,41±0,07
Vv ПБП
0,44±0,08
0,16±0,03∗
Vv
цитоплазмы
0,14±0,06
0,43±0,09∗
∗ Различия с исходной линией достоверны с вероятностью > 0,99.
Количеств о
бактероидов в ПБП
13,4±1,27
1,4±0,05∗
Бактероидсодержащая ткань клубеньков линии Рондо и мутанта nod3 представ лена двумя в идами бактероидов : крупные бактероиды с тонкодисперсной цитоплазмой, состав ляющие основ ную массу бактероидной ткани, и мелкие бактероиды,
по размеру срав нимые с бактериями, содержащие гранулы октибутирата в цитоплазме. Исходя из данных о строении эффектив ной бактероидсодержащей ткани,
можно предположить, что азотфиксация происходит только в крупных бактероидах
[3]. Морфометрическое срав нение линии Рондо и мутанта nod3 показало различие
по следующим параметрам: Vv малых бактероидов , Vv ПБП, Vv цитоплазмы растительной клетки. В ткани мутанта содержится больше компартментов , несущих малые бактероиды (табл. 2). Таким образом, в данном эксперименте при в ыращив ании
растений на среде с полной дозой нитратов у линии Рамонский 77 образов алась неэффектив ная бактероидсодержащая ткань, у мутанта nod4 образов алась эффектив ная бактероидсодержащая ткань. У линии Рондо и мутанта nod3 азотфиксирующая
ткань содержит дифференциров анные и недифференциров анные бактероиды, причем в ткани мутанта больше, чем у исходной линии недифференциров анных бактероидов . На основ е полученных данных можно сделать в ыв од, что у мутанта nod3
бактероидсодержащая ткань имеет менее эффектив ное строение, чем у исходного
сорта и у второго суперклубеньков ого мутанта nod4. Пов ышение уров ня азотфиксации у мутанта по срав нению с исходной линией может быть следств ием пов ышения
количеств а актив ных клубеньков [7].
Та б ли ц а 2
Результаты морфометрического анализа инфициров анных клеток
клубеньков растений гороха сорта Рондо и мутанта nod3
Линии
Рондо
nod3
Vv
больших
бактероидов
Vv
малых
бактероидов
0,35±0,09
0,31±0,2
0,05±0,02
0,11±0,06∗
Vv ПБП
Vv
цитоплазмы
Количеств о
больших
бактероидов в ПБП
0,19±0,05
0,33±0,07∗
0,41±0,1
0,25±0,07∗
1,05±0,004
1,00
Количество малых бактероидов
в ПБП
1,36±0,14
2,45±0,18∗
∗ Различия с исходной линией достоверны с вероятностью > 0,99.
В следующем эксперименте в качеств е исходного материала были использов аны линия Торсдаг и мутант nod3, в ыращенные на среде с полной дозой азота и
без азота. Линия Торсдаг отличается в ысоким уров нем фиксации азота и устойчив остью к нитратам. Она несет доминантный ген, назв анный Nod5, обеспечив ающий
стабильное клубенькообразов ание и устойчив ость к нитратам и не аллельный генам
nod3 и nod4 [8]. На основ е генетических исследов аний предположили, что у линии
Торсдаг и суперклубеньков ых мутантов nod3 и nod4 функционируют дв е незав исимые регуляторные системы, контролирующие клубенькообразов ание [9].
У линии Торсдаг и мутанта nod3, в ыращенных на среде с полной дозой азота и
без азота ультраструктура азотфиксирующей ткани в ыглядит сходно: крупные клетки заполнены большими округлыми бактероидами с тонкодисперсным св етлым матриксом. Каждый бактероид окружен плотноприлегающей ПБМ. Симбиосомы расположены среди неболь ших остров ков электронно-плотной цитоплазмы. Результаты
статистической обработки в ыяв или некоторые закономерности. У линии Торсдаг и
мутанта nod3, не чув ств ительных к нитратной подкормке, существ уют достов ерные
различия с в ероятностью 0,95% по большинству параметров у растений, в ыращенных на среде с азотом и без азота. У линии Торсдаг достов ерно различаются все
три параметра, у мутанта nod3 достов ерно различаются Vv бактероидов и Vv ПБП. У
растений линии Торсдаг, в ыращенных на среде без азота, Vv бактероидов немного
ниже, чем у растений, в ыращенных на среде с азотом. В результате такого уменьшения ув еличив ается доля, занимаемая ПБП и цитоплазмой клетки. Подобная закономерность наблюдается и у мутанта nod3 (табл. 3). Из литературных данных изв естно, что показатели нодуляции и азотфиксации сортов и линий гороха зав исят от
сроков посев а и услов ий среды [10]. При этом основ ные отличия между разными
сортами и линиями по этим показателям сохраняются. Было также показано, что услов ия в ыращив ания и сроки посев а в лияют на структуру азотфиксирующей ткани
[11]. Для эффектив ной фиксации азота, в ероятно, существ ует какое-то оптимальное
соотношение частей, занимаемых бактероидом, ПБП и цитоплазмой клетки, и этот
показатель, по-в идимому, может в арьиров ать в определенных пределах, не нару шая работы системы в целом. У линии Торсдаг и мутанта nod3, в ыращенных на среде с азотом и без азота, по в иду бактероидов можно предположить, что в клетках
клубенька идет актив ная фиксация азота. Соотношение объемов , занимаемых бактероидами, ПБП и цитоплазмой, в клетках растений, в ыращенных на среде без азота, представ ляется более благоприятным для работы системы в целом. Таким образом, мы установ или, что ультратруктура бактероидсодержащей ткани линии Торсдаг и суперклубеньков ого мутанта nod3, в ыращенных на среде с азотом и без азота, не имеет в идимых различий. Некоторые закономерности, в ыяв ленные в результате морфометрической обработки данных, св идетельствуют, что полные дозы азота в лияют на соотношение (представ ительств о) партнеров в клетках клубеньков линий, устойчивых к азоту, хотя и незначительно. Соотношение партнеров у растений,
в ыращенных на среде без азота, представ ляется более оптимальным для работы
симбиоза.
Та б ли ц а 3
Результаты морфометрического анализа инфициров анных клеток
клубеньков растений гороха линии Торсдаг и мутанта nod3, в ыращенных на среде
с полной и начальной дозой азотного питания
Линии
Торсдаг + азот
Торсдаг
nod3 + азот
nod3
Vv бактероидов
0,71±0,012
0,611±0,011∗
0,72±0,01
0,666±0,011∗
Vv ПБП
0,098±0,008
0,125±0,006∗
0,075±0,006
0,118±0,009∗
Vv цитозоля
0,192±0,009
0,264±0,012∗
0,206±0,008
0,216±0,009
∗ Различия показателей достоверны с вероятностью > 0,95.
Исходя из результатов , полученных в экспериментах, можно сделать выв од,
что мутации гороха группы nod, затрагив ающие ранние стадии образов ания азотфиксирующих клубеньков , оказыв ают в лияние на структуру бактероидсодержащей
ткани.
Список литературы
1. Mylona P., Pawlowski K., Bisseling T. Symbiotic nitrogen fixation // The Plant Cell.
1995. V. 7. P. 869–885.
2. Моржина Е.В., Борисова А.Ю., Куликова А.О., Лебский В.К. Ультраструктурный
анализ э ффектив ных и неэффектив ных клубеньков гороха // Цитология. 1991.
T. 33, № 3. C. 3–7.
3. Андреева И.Н., Козлова Г.И., Мандхан К., Измайлов С.Ф. Структурные особенности различающихся по эффектив ности азотфиксации клубеньков бобов ых // Физиология растений. 1992. Т. 39, № 2. C. 314–324.
4. Jacobsen E., Nijdan H.A. A mutant show ing efficient nodulation in the presence of
nitrate // Pisum New slett. 1983. V. 15. P. 31–32.
5. Jacobsen E. Further characterisation of mutant nod3, highly nodulating in the
presence of nitrate // Pisum Newslett. 1984. V. 16. P. 23–24.
6. Сидорова К.К., Ужинцева Л.П. Локализация мутантного гена nod4, контролирующего супернодуляцию у гороха // Докл. АН. 1994. Т. 336, № 6. С. 847–849.
7. Болоболова Е.У., Губанова Н.В., Байбородин С.И. и др. Ультраструктурные особенности строения корнев ых клубеньков симбиотических суперклубеньков ых мутантов гороха Pisum sativum L. // Цитология. 1998. T. 40, № 10. C. 844–848.
8. Сидорова К.К., Шумный В.К. Нов ый ген гороха (Pisum sativum L.) Nod5-nod5, контролирующий нодуляцию // Докл. АН. 1997. T. 353, № 5. C. 703–704.
9. Сидорова К.К., Шумный В.К. Исследов ание суперклубеньков ых мутантов гороха
(Pisum sativum L.) // Генетика. 1998. T. 34, № 10. C. 1452–1454.
10. Шумный В.К., Сидорова К.К., Клевенская И.Л. и др. Биологическая фиксация азота. Нов осибирск: Наука, Сиб. отд-ние, 1991. C. 64–95.
11. Newcomb W. Nodule morphogenesis and differentiation // Intern. Rev. Cytol. Suppl. 13,
Acad. Press, 1981. P. 247–297.