Пособие по цитогенетике

Министерство образования и науки Российской Федерации
Федеральное государственное бюджетное образовательное
учреждение высшего профессионального образования
«Кемеровский государственный университет»
Кафедра генетики
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт
экологии человека Сибирского отделения Российской академии наук
Лаборатория цитогенетики
В. И. Минина
ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ
ИЗУЧЕНИЯ МАТЕРИАЛЬНЫХ ОСНОВ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ НА
КЛЕТОЧНОМ УРОВНЕ
Электронное учебное пособие
(тексто-графические учебные материалы)
Издатель:
Кемеровский государственный университет
650043, г. Кемерово, ул. Красная, 6
Кемерово 2014
© В.И.Минина, 2014
© Кемеровский государственный университет, 2014
© ИЭЧ СО РАН, 2014
ISBN 978-5-8353-1617-5
Об издании: 1, 2, 3
УДК 575
ББК 52.5
М 11
Издается по решению
Редакционно-издательского совета КемГУ
Рецензенты:
Кафедра генетики университета
д-р биол. наук, профессор О. А. Неверова;
зав. медико-генетической консультацией
Кемеровской областной клинической больницы С. Л. Нерсесян
Автор (составитель):
Минина Варвара Ивановна – доцент кафедры генетики КемГУ, зав. лабораторией цитогенетики ИЭЧ СО РАН
М 11
Минина, В.И. Теоретические и практические аспекты изучения материальных
основ наследственности на клеточном уровне: электронное учебное пособие
(тексто-графические учебные материалы) [Электронный ресурс] / В.И.Минина;
Кемеровский государственный университет. – Текстовое электронное издание
(Объем 18,8 Мб). – Кемерово: КемГУ, 2014. – 1 электрон. опт. диск (СD-ROM). –
Систем. требования: Intel Pentium (или аналогичный процессор других производителей), 500 МГц; 512 Мб оперативной памяти; видеокарта SVGA, 1280x1024
High Color (32 bit); 5 Мб свободного дискового пространства; операц. система
Windows ХР и выше; Adobe Reader. – Загл. с экрана. – Номер гос. регистрации в
ФГУП
НТЦ
«Информрегистр»
______________
свид. № _______ от __.____.201__.
ISBN 978-5-8353-1617-5
Издание разработано по дисциплине «Большой практикум» (раздел Цитогенетика) в
соответствии с Федеральным образовательным стандартом высшего образования по
направлению подготовки 06.03.01 Биология (уровень бакалавриата).
В данной работе представлены как теоретические, так и практические аспекты изучения генома на клеточном уровне. Дается представление о цитогенетике как современной, динамически развивающейся науке. Рассмотрено устройство и принцип работы современного светового микроскопа. Приведен обзор основных цитологических и цитогенетических методов изучения ядра и хромосом (анализ ядрышек, микроядер, полового
хроматина, подготовка препаратов хромосом, кариотипирование, анализ хромосомных
аберраций, различные виды окрашивания хромосом). Учебное пособие предназначено для
студентов направления подготовки 06.03.01 Биология, а также может быть полезно для
магистров, аспирантов, молодых ученых.
© В.И.Минина, 2014
© Кемеровский государственный унверситет, 2014
© ИЭЧ СО РАН, 2014
2
Текстовое электронное издание
Минимальные системные требования:
Компьютер: Intel Pentium (или аналогичный процессор других производителей), 500 МГц; 512 Мб оперативной памяти; 5 Мб на жестком
диске; видеокарта SVGA, 1280x1024 High Color (32 bit); привод
CD-ROM
Операционная система: Windows ХР и выше
Программное обеспечение: Adobe Reader
Номер государственной регистрации электронного издания
_______________.
© В.И. Минина, 2014
© Кемеровский государственный университет, 2014
© ИЭЧ СО РАН, 2014
3
ПРЕДИСЛОВИЕ
Данное пособие разработано на основе комплекса методик, собранных и
апробированных кафедрой генетики Кемеровского государственного университета в ходе преподавания предмета «Цитогенетика» (раздела Большого
практикума) студентам очной и заочной форм обучения биологического факультета.
В результате изучения данной дисциплины студент приобретает ряд компетенций:
 знает основы цитогенетики, цитогистохимии и физиологии клетки;
владеет методами микроскопии, цитогенетическими, гистологическими, цитохимическими методами изучения клеток (специальные компетенции СК-2);
 владеет современными методами исследований в молекулярной и клеточной биологии и умеет их применять в научно-исследовательской
практике (СК-6).
 использует в познавательной и профессиональной деятельности базовые знания в области математики и естественных наук, применяет методы математического анализа и моделирования, теоретического и экспериментального исследования (ОК-6).
В пособии охарактеризованы основные принципы световой микроскопии,
предложен для освоения ряд цитологических и цитогенетических методов. К
цитологическим методам относятся работы по выявлению полового хроматина, ядрышка, определению митотического индекса. К цитогенетическим
методикам – подготовка препаратов хромосом из клеток растительных и животных тканей, из клеток периферической крови человека, кариотипирование, анализ хромосомных аберраций, дифференциальное окрашивание хромосом. Приобретение практических навыков работы в данной области пред-
4
полагает знание основ генетики, цитологии, химии, физики и ряда их специальных разделов.
Выполнение экспериментальных работ оптимально на базе научноисследовательской лаборатории, оснащенной всем необходимым оборудованием (различные виды микроскопов, ламинарный шкаф, термостаты, центрифуги и т. д.). Естественно, что все этапы выполнения методик, работа с
оборудованием и реактивами, должны выполняться под контролем преподавателя, с соблюдением требований техники безопасности.
При составлении учебного пособия
использовалась обширная отече-
ственная и зарубежная литература, однако, в списке приведены только те литературные источники, которые рекомендуются студентам при подготовке к
занятиям.
Данное издание не претендует на охват всех направлений современной
цитогенетики (например, не рассматриваются методы работы с политенными
хромосомами, хромосомами типа ламповых щеток, мейотическими хромосомами – эти темы очень обширны и требуют отдельного рассмотрения). Однако, учитывая практически полное отсутствие учебных пособий по практической цитогенетике, представленный материал может оказать существенную
помощь при проведении практикумов по данному разделу генетики в вузах.
5
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ


















5-АУ – 5-аминоурацил
БДУ – бромдезоксиуридин
К-митоз – колхициновый митоз
СХО – сестринские хроматидные обмены
ХА – хромосомные аберрации
ФГА – фитогемагглютитин
ЯОР – ядрышкообразующие районы хромосом
AgЯОР – ядрышкообразующие районы, окрашенные нитратом серебра
Gh –гетерохроматин
CISS – гибридизация (chromosomal in situ suppression hybridization) –
метод FISH с супрессией гибридизации
CGH (Comparative genomic hybridization) – сравнительная геномная гибридизация
FISH – флуоресцентная in situ гибридизация диспергированных повторов
mFISH – многоцветная FISH
SKY (spectral karyotyping) – спектральное кариотипирование
RxFISH – метод многоцветного бэндинга хромосом
SINEs – (short interspersed nuclear elements короткие) короткие диспергированные ДНК-повторы
LINEs – (long interspersed nuclear elements) – длинные диспергированные ДНК-повторы
SAR – scaffold attachment regions – участки ДНК, связанные со скаффолдом
6
Глава 1. ВВЕДЕНИЕ В ЦИТОГЕНЕТИКУ
1.1.Предмет и история развития цитогенетики
Цитогенетика – это наука, которая изучает материальные основы
наследственности и изменчивости организмов на клеточном уровне, а
именно строение и функции хромосом, а также компонентов клеточного
ядра. Современный цитогенетический анализ имеет широкий спектр решаемых проблем, как в биологии, так и в медицине. Это и тестирование генотоксических воздействий (например, эффекты радиационных, химических
или биологических мутагенов) и пренатальная диагностика (при подозрении на хромосомную болезнь), и дифференциальная диагностика онкозаболеваний (включая последующий выбор стратегии лечения, оценку его эффективности и прогноз). Показанием для проведения цитогенетического
анализа и выявления хромосомной патологии может стать задержка умственного и/или физического развития ребенка, подозрение на хромосомную болезнь по симптоматике больного (синдром), нарушение репродуктивной функции неясного генеза (бесплодный брак, первичная аменорея).
Первые самые ранние наблюдения хромосом начались с экспериментальных работ Э. Страсбургера и В. Флемминга в конце 70-х гг. XIX века. В
1880 году в делящихся клетках роговицы глаза человека Флемминг обнаружил и описал 22–28 хроматиновых тел (точно сколько их было тогда установить не удалось). Сам термин «хромо-сома» впервые был введен В. Вальдейером в 1888 году и в дословном переводе означает «окрашивающееся тельце». То, что именно хромосомы являются материальными носителями менделевских факторов наследственности доказали В. Сэттон и Т. Бовери в
1903–1904 гг. В последующие годы хромосомы были обнаружены и описаны
у множества живых объектов. Это стало возможным благодаря совершенствованию оборудования, в первую очередь, микроскопов и методик приготовления хромосомных препаратов. В развитии микроскопических методов
7
Дарлингтон и Ла Кур (1980) выделяют несколько наиболее важных. Это создание:

водоиммерсионных объективов (1850 г.);

осветителя для микроскопа (1873 г., Э. Аббе – ведущий конструктор фирмы Карл Цейсс);
 масляно-иммерсионного объектива (1878 г., Э. Аббе);

апохроматического объектива (1886 г.)
К началу XX века было завершено создание оптического микроскопа,
позволяющего достигнуть увеличения более 1000 раз и хорошего разрешения (0,2 мкм). В последующие годы были созданы широкопольные объективы. Разработаны методы и приборная база для фазово-контрастной, флуоресцентной и электронной микроскопии. Появились компьютерные системы
анализа микроизображений.
Параллельно с этим разрабатывались новые
методики приготовления
хромосомных препаратов. Долгое время хромосомы изучали на тканевых
срезах. Такие препараты содержали в основном фрагментарные митозы, хромосомы накладывались, переплетались, образуя клубки, плохо поддающиеся
анализу. Эти трудности удалось преодолеть с помощью технологий, основанных на использовании суспензионных культур клеток (человека и животных) или приготовлении давленых препаратов (растения). При правильном
раскапывании клеток суспензии на стекло можно получить хороший разброс
хромосом на достаточное для идентификации расстояние. Дополнительно
стали использовать ферменты, разрущающие протеины – трипсин, гиалуронидазу или коллагеназу – с целью дезинтеграции образцов тканей и получения суспензии, состоящей из отдельных клеток. Были подобраны и внедрены
в практику цитогенетических исследований фиксаторы (консервирующие
жидкости) и красители, совершенствование которых продолжается до сих
пор.
8
Параллельно с этим изучали нетипичные хромосомы: политенные хромосомы слюнных желез личинок двукрылых (Chironomus) – описал Бальбиани в
1881 году, хромосомы типа ламповых щеток – обнаружил Флемминг, исследуя ооциты аксолотля. В течение последующих 50–70 лет в основном совершенствовались лишь методики выделения таких хромосом из ядер.
Т. Х. Моргана и его школа внесли огромный вклад в развитие цитогенетики. Была установлена связь учения о хромосомах с менделевской генетикой.
Представления о линейном расположении генов, об их сцеплении и кроссинговере позволили предсказывать многочисленные явления. Картина внутреннего строения хромосом, предложенная Морганом, стала одним из главных
обобщений биологии, превратилась в неопровержимый факт, подтвержденный всем развитием генетики.
В 20–30-е гг. XX века прогресс хромосомного анализа определялся в основном изучением растительных объектов, сравнительная кариология растений резко опережала сравнительную кариологию животных. Этим она обязана трудам С. Г. Навашина, Т. Сакамуры и Г. А. Левицкого.
Наиболее интересные данные и теоретические выводы в этой области
принадлежат С.Г. Навашину и его школе. В 1912 году на заседании Императорской академии наук России С. Г. Навашин сделал сообщение, которое
стало впоследствии знаменитым, «О диморфизме ядер в соматических клетках у Galtonia candicans» (семейство Liliaceae). На данном растительном объекте С. Г. Навашин впервые обнаружил наличие мельчайших постоянных
придатков, присоединенных «ниточками» к двум хромосомам. Именно эти
придатки и были названы Навашиным спутниками («satellites»). С. Г. Навашин показал, что эти тельца являются постоянной составной частью двух из
четырех хромосом, т. к. при делении ядра они «расщепляются вместе с
остальным телом хромосомы». Именно С. Г. Навашин впервые показал возможность различать хромосомы по особенностям их строения. А в 1916 году
в юбилейном сборнике, посвященном К. А. Тимирязеву, вышла в свет работа
С. Г. Навашина о внешних признаках внутренней организации хромосом
9
(Навашин, 1916). Объектами исследования были хромосомы лилейных (рода
Fritillaria и рода Galtonia). Большое значение в кариосистематике растений
сыграли также труды другого классика науки в области цитогенетики Г. А.
Левицкого (одного из наиболее выдающихся учеников академика С. Г.
Навашина). Г. Л. Левицкий – автор первого русского руководства по цитогенетике «Материальные основы наследственности» (Левицкий, 1924), по которому учились в 20–30-х годах ХХ века. В 1931 году вышла в свет его работа «Морфология хромосом», в которой он предложил новую методику фиксации и окраски для выяснения особенностей строения хромосом культурных растений (ржи, ячменя, гороха, пшеницы, сахарной свеклы) и некоторых
классических в цитологическом отношении растений (Najas, Muscari).
Г. Л. Левицкий ввел термин и развил учение о кариотипе (Левицкий, 1931), а
термин «идиограмма» предложен его учителем С. Г. Навашиным (Навашин,
1921). Под «идиограммой» Навашин обозначил «совокупность метафазных
хромосом в качестве элементов символа вида».
В развитии цитогенетики человека принято выделять несколько этапов:
темная эра, гипотоническая эра, трисомная эра, эра хромосомной сегментации (Hsu, 1979).
"Темная эра". Этот этап длился с 1923 года по 1952. В 1923 году при изучении тестикул трех душевнобольных было установлено, что диплоидное
число хромосом у человека обоих полов равно 48, а система половых хромосом у женщин представлена хромосомами ХХ и у мужчин – ХУ (Painter,
1923). Следует отметить, что в этот период способы получения препаратов
хромосом были еще далеки от идеала, и поэтому ошибочное представление о
количестве хромосом держалось достаточно долго.
"Гипотоническая эра". Этот этап начался с 1952 года, когда Hsu поместил
клетки в гипотонический раствор и получил препараты с хорошим разбросом митотических хромосом. Используя этот важный методический прием, в
1956 году шведские ученые Tjio и Levan при изучении культур фибробластов
легкого эмбрионов человека, а вскоре и англичане Ford и Hamerton при изу10
чении сперматоцитов тестикулирующей ткани установили, что диплоидное
число хромосом у человека равно 46. Это открытие стимулировало бурное
развитие цитогенетики человека в последующие годы.
"Трисомная эра". С 1959 года начинается «трисомная эра» развития цитогенетики, когда были опубликованы первые результаты изучения фибробластов кожи от 9 детей с болезнью Дауна (Lejene et al., 1959). Во всех клетках
была обнаружена добавочная 21 хромосома. В том же году появилось сообщение о цитогенетических находках при синдроме Шерешевского-Тернера
(Ford [et al.], 1959) и при синдроме Клайнфельтера (Jacobs, Strong, 1959). В
1960г. Patau и Edwards описали две новые аутосомные трисомии, идентифицированные как трисомии 13 и 18 хромосом. Nowell и Hangerford описали
филадельфийскую хромосому при хроническом миелолейкозе, которая явилась исторически первой хромосомной аномалией, обнаруженной при определенном типе рака.
В 1959–1960гг. были созданы новые методики получения метафазных
хромосом in vitro из культуры лейкоцитов периферической крови, стимулированных ФГА (Nowel, Hangerford, Moorhead).
В 1963 году французская группа исследователей под руководством Лежена (Lejeune [et al.], 1963) описали первый синдром, связанный с изменением структуры хромосом. Это был синдром 5р- или синдром кошачьего крика.
На Денверской конференции (1960) была принята Международная система цитогенетической номенклатуры хромосом человека, обеспечившая международную стандартизацию исследований хромосом еще на начальных стадиях становления цитогенетики человека. Согласно Денверской классификации все хромосомы человека были подразделены на 7 групп от А до G, в зависимости от размеров и положения центромеры. Однако при таком подходе
индентифицировать каждую хромосому все-таки было невозможно.
"Эра хромосомной сегментации". В 1970 году шведский исследователь
Kaspersson открыл дифференциальную окраску хромосом. Он использовал
для анализа хромосом человека флуоресцентный микроскоп, который обыч11
но использовался для анализа хромосом растений. Он увидел, что интенсивность окраски хромосомы неодинакова вдоль ее длины. Эта работа внесла
неоценимый вклад в развитие цитогенетики. Анализ бендов (полос) позволил идентифицировать все хромосомы человека. За этим открытием стали
появляться многочисленные разработки дифференциальной окраски хромосом с использованием флуоресцентных красителей или красителя Гимза
(Drets and Shaw, 1971). Позднее бэндинг профазных хромосом сделал возможным определение точного хромосомного сегмента, в котором произошло
хромосомное нарушение (Yunis,1976).
В 1969 году двумя независимыми группами исследователей (John [et al.],
1969; Pardue, Gall, 1969) был разработан метод in situ гибридизации, который
позволил выявлять специфические последовательности нуклеиновых кислот
на морфологически сохраненных метафазных хромосомах, интерфазных ядрах или срезах тканей. В сочетании с различными методами детекции (авторадиографии или иммунохимии) гибридизация in situ позволяет проводить
идентификацию индивидуальных хромосом или отдельных генов, включая
особенности генной экспрессии на молекулярном уровне – уровне ДНК и
РНК.
Появилась возможность изучения репродукции хромосом и сестринских
хроматидных обменов (СХО) с помощью бромированных предшественников
ДНК. При этом хроматиды одной хромосомы окрашиваются по-разному
(Latt,1973). В нашей стране разработкой и внедрением этого метода занимались отечественные исследователи А.Ф. Захаров и сотрудники Института медицинской генетики АМН. Изучение действия химических и радиационных
агентов на хромосомы человека стало обязательным компонентов тестсистем, используемых для проверки влияния факторов внешней среды на
мутагенность. Большой вклад в изучение проблем мутагенеза внесли работы
академика РАМН Н.П.Бочкова, под руководством которого была создана
крупнейшая в стране база данных, содержащая информацию об уровне хромосомных аберраций у жителей различных регионов России.
12
1.2. Световая микроскопия в цитогенетике
Современная цитогенетика включает в себя целый арсенал методов, позволяющих анализировать хромосомы: микроскопию (проходящего света,
люминtсцентную, инвертированную, конфокальную и др.), микроманипуляцию и микродиссекцию хромосом, разнообразные методы молекулярной
биологии (например, гибридизация in situ; создание ДНК-зондов и их применение для анализа маркерных хромосом). Ключевую роль в многообразии
методов цитогенетики играет использование микроскопической техники. От
качества микроскопии во многом зависит успех цитогенетических исследований, поэтому необходимо уметь правильно пользоваться микроскопом,
знать его основные характеристики и возможности. Не менее важно уметь
документировать изучаемый материал, что позволяет наиболее полно сохранить изучаемый материал.
В практической цитогенетике обычно используют микроскопы, дающие
максимально полезное увеличение
в 1000–1600 раз. Необходимость столь
большого увеличения диктуется малыми размерами изучаемых объектов – до
десятых долей микрометра. В настоящее время микроскопы на рынок оборудования поставляют множество фирм. Основные из них это: CARL ZEISS (Германия), NICON (Япония), МAX BINO, TOPIC (Бельгия), MICROS (Австрия) и др.
На рис. 1 представлен микроскоп Axioskop 2 plus (Zeiss), оснащенный галогеновой и ртутной лампами, позволяющий проводить исследования, как в проходящем свете, так и в свете люминесценции. Из отечественных микроскопов
пригодных для цитогенетического анализа можно назвать МИКМЕД (БИОЛАМ), МБР-1 и МБР-2 (микроскопы биологические рабочие), МБИ–1 и МБИ15 (микроскоп биологический исследовательский), ЛЮМАМ (специализированный люминесцентный микроскоп). Все эти микроскопы несколько различаются по своим характеристикам, техническому устройству и возможностям,
однако имеют общую принципиальную схему строения.
13
Рис. 1. Современный исследовательский микроскоп – Axioskop 2 plus (Zeiss)
Основные узлы микроскопа. Основание служит опорой микроскопа и
несет всю конструкцию штатива (рис. 2). В основании микроскопа находится
также гнездо для зеркала или встроенный осветитель. Тубусодержатель служит для крепления тубуса микроскопа. В штатив встроены механизмы для
грубого (макромеханизм, макровинт) и тонкого (микромеханизм, микровинт)
вертикального перемещения предметного столика или тубусодержателя; револьверные устройства крепления объективов и светоделительных элементов, кронштейн для крепления предметного столика; предметный столик,
служащий для размещения препаратов и горизонтального их перемещения;
узел для крепления и вертикального перемещения конденсора и светофильтров. Все эти части относят к механическим узлам микроскопа. Они поддерживают основные оптические узлы в рабочем состоянии и обеспечивают
управление подвижными элементами с требуемой точностью.
14
Рис. 2. Штатив микроскопа
Предметный столик микроскопа позволяет устанавливать препарат в
определенное положение (рис. 3). В зависимости типа конструкции выделяют
подвижные и неподвижные предметные столики.
Рис. 3. Предметный столик с препаратоводителем
Неподвижные столики обычно применяются в самых простых моделях
прямых биологических микроскопов: в микроскопах – игрушках, школьных
и учебных моделях. Движение объекта при этом осуществляется пользовате15
лем вручную, и объект может быть закреплен с помощью двух подпружиненных лапок с клеммами. Для инвертированных биологических микроскопов неподвижные столики являются основными, и это связано с особенностью работы, прежде всего, из-за применения специальной посуды нестандартных габаритов, а также для ускорения процесса наблюдения, требующего ручного перемещения этой посуды. Обычно эти столы имеют нестандартные габариты и приспособлены для крепления микроманипуляторов, а также
препаратоводителей со специальными вкладышами для перемещения чашек,
планшет или обычных предметных стекол.
Подвижные столики могут быть координатными, поворотными и вращающимися. Координатные предметные столики осуществляют координатное
перемещение объекта по двум осям X-Y с помощью единой рукоятки (сдвоенной – коаксиальной) вручную или от электродвигателя (обычно шагового).
Последние носят название «сканирующие столики». Управление ими может
осуществляться с помощью джойстика от стационарного устройства управления (контроллера) или с помощью специальной программы от компьютера.
Столы этого типа обязательно имеют координатную шкалу и нониус, указывающие точность перемещения в горизонтальной плоскости по осям X и Y.
Препаратоводитель (рис. 3) обычно имеет крестообразную форму и снабжен нониусами – шкалами для установления координат изучаемого объекта
на препарате. Нулевая точка для вспомогательной шкалы (более короткой)
показывает число целых единиц на основной шкале. Число же дробных единиц основной шкалы определяется подсчетом числа штрихов на вспомогательной шкале от нулевой точки до первого штриха, совпадающего со штрихом основной шкалы (так подсчитывают десятые доли).
Поворотные предметные столики обеспечивают поворот координатного
стола на некий угол (обычно не более 240°) при этом принцип координатного
перемещения препарата не меняется. Вращающиеся предметные столики
предназначены для специальных поляризационных микроскопов и снабжены
вращающимся диском. Диск имеет маркировку по окружности через 1° . Два
16
нониуса, закрепленные на неподвижной части столика, обеспечивают отсчет
углов поворота с определенной точностью. Специальный стопорный винт
обеспечивает фиксацию вращающегося диска предметного столика из любого
установленного положения через каждые 30°–45° (для разных фирм угол фиксации свой). На вращающийся столик в поляризационных микроскопах проходящего света устанавливается специальный препаратоводитель с раздельными рукоятками управлениями, однако крепление объектов может осуществляться и с помощью пружинящих лапок. Обозначения подобных столов
обычно имеет маркировку «Pol», что означает – для поляризационных исследований. В последнее время появились технологии микроскопических исследований, предполагающие применение 72 и 96-луночных планшетов, а также чашек Петри не только на инвертированных микроскопах, но и на прямых
биологических микроскопах. В зависимости от этого меняются габаритные
размеры столов, что связано с установкой соответствующих держателей посуды.
Фокусировка, как правило, осуществляется путем вертикального перемещения предметного столика вдоль неподвижного тубусодержателя. Это
позволяет установить на тубусодержатель различные насадки (микрофото-,
видеокамера и т. п.). В некоторых конструкциях микроскопов, предназначенных для работы с микроманипулятором, фокусировка осуществляется
вертикальным перемещением тубусодержателя при неподвижном предметном столике.
Грубая фокусировка (регулировка) осуществляется большой по диаметру рукояткой. Минимальная величина перемещения составляет 1 мм за один
оборот. При этом грубая фокусировка является рабочей для увеличения
микроскопа не более 400х (увеличение объектива не более 40х), что связано
с глубиной резкости объектива, для остальных увеличений – это «черновое»
движение. Обычно грубая фокусировка предназначена для установки стан-
17
дартизованной величины, постоянной для всех увеличений объективов, так
называемой высоты объектива.
Точная фокусировка (регулировка) осуществляется парой небольших
рукояток, которые обычно за один оборот придвигают стол или объектив к
объекту на 0,01–0,05 мм. Величина перемещения за один оборот зависит от
конструктивных особенностей микроскопов различных фирм. Точная фокусировка является рабочей для объективов с увеличением от х40 и больше.
Как правило, на одну из рукояток точной фокусировки наносится шкала,
которая позволяет контролировать вертикальное перемещение микроскопа.
Современные исследовательские и универсальные микроскопы имеют
устройство «автоматической настройки на резкость» – автофокус. В этом случае при переключении револьверной головки и установки объектива в рабочее положение вначале происходит автоматический подвод объектива к объекту, затем реверсное движение в пределах глубины резкости объектива и,
наконец, установка его в плоскости наилучшего видения.
Узел крепления объективов. Существует несколько типов крепления
объективов в микроскопе:
♦ ввинчивание объектива непосредственно в штатив;
♦ крепление объективов с помощью специального безрезьбового
устройства (направляющей), так называемые «салазки»;
♦ использование револьверного устройства с несколькими гнездами.
В настоящее время самым распространенным типом крепления объективов
является револьверное устройство (рис. 4).
18
Рис. 4. Револьвер со сменными объективами
Узел крепления объективов в виде револьверного устройства
выполня-
ет следующие функции: смену увеличения в микроскопе за счет вращения
головки, в каждое гнездо которой ввинчивается объектив определенного
увеличения; фиксированную установку объектива в рабочее положение; гарантированное центрирование оптической оси объектива относительно оптической оси микроскопа; поддержание парфокальности (это условие сохранения единой плоскости резкого видения («фокуса») для всех объективов).
Порядок следования объективов должен строго соблюдаться по принципу,
от меньшего увеличения к большему, при этом движение револьверной головки осуществляется по часовой стрелке.
Узел крепления и перемещения конденсора. Узел крепления конденсора
расположен под предметным столиком и имеет вид кронштейна с гнездом.
Узел предназначен для установки конденсора, его фиксации и центрировки,
то есть перемещения в горизонтальной плоскости перпендикулярно оптической оси микроскопа. Узел имеет направляющую для фокусировочного движения (перемещения) конденсора по вертикали вдоль оптической оси. Конденсор жестко крепится с помощью стопорного винта, который предотвращает выпадение конденсора и обеспечивает его центрированное положение в
процессе работы. Центрировочные винты при конденсоре обеспечивают совмещение осветительного пучка от источника света и оптической оси микро19
скопа (настройка освещения по Келеру). Фокусировка (настройка по высоте)
конденсора осуществляется с помощью ручки на кронштейне и, также как
центрировка, влияет на работу всего микроскопа.
ОПТИЧЕСКИЙ УЗЕЛ. Основной частью микроскопа является его оптический узел. Он состоит из осветительной системы (конденсора, зеркала
или лампы), объективов и окуляров. Все эти части оптического узла располагаются на тубусе микроскопа и занимают строго центрированное фиксированное положение.
Объективы – это многолинзовые системы, являющиеся наиболее важной и
дорогой частью оптического узла микроскопа. Обычно объективы состоят
из стекол групп крона, флинта, фторфосфатных стекол, а также флюорита
(рис. 5).
.
.
Рис. 5. Оптико-механическая конструкция объектива для микроэлектроники:
DUV 150х/0.90 для УФ области 248 нм, фирмы Leica (иллюстрация О. В. Егорова, 2006)
Функцией объектива является построение изображения. Объектив строит
геометрически подобное объекту увеличенное изображение с обратным расположением частей по отношению к препарату, при этом объектив выявляет
20
подробности недоступные глазу человека, иначе говоря «разрешает» структуру объекта. Объективы имеют четкую классификацию (табл. 1), которая
характеризует их как с технической, так и с экономической точки зрения.
Таблица 1
Классификация современных объективов по основным признакам
(О. В. Егорова, 2006)
А. Выходные параметры
Б. Качество изображения
(тип оптической коррекции)
Увеличение
Ахроматизация
Числовая апертура
Кривизна поля
Рабочее расстояние
Хроматические аберрации
Линейное поле
Рабочая область спектра
В. Конструктивные параметры
Длина тубуса
Высота
Коррекция на толщину покровного стекла Отношение к иммерсии
Д.Конструкторскотехнологические особенности
Г. Конструктивные
Пружинящая оправа
Методы исследования и контрастирования
Оптические среды
Коррекционные кольца
Ирисовая диафрагма
Формообразование оптических поверхностей
В основе данной классификации лежат такие признаки как: выходные параметры, качество изображения (тип оптической коррекции), конструктивные
параметры, конструктивные особенности и конструкторско-технологические
особенности.
Основные характеристики объектива – это разрешающая способность,
увеличение и фокусное расстояние. Разрешающая способность (d) – это ве21
личина наименьшего диаметра частиц или наименьшее расстояние между
двумя линиями, которые можно раздельно видеть в микроскоп.
Она зависит от так называемой числовой (или нумерической) апертуры
объектива (NA) и длины волны света, применяемого при освещении объекта
():
d=/2NA
NA – характеризует собирательную способность объектива и определяется по формуле
NA=n x sin,
где n – показатель преломления среды между фронтальной линзой объектива
и покровным стеклом препарата,
 – половина апертурного угла конуса лучей, выходящего из точки объекта и ограниченного входящим зрачком объектива.
Угловая апертура объектива – это максимальный угол (AOB), под которым
могут попадать в объектив лучи, прошедшие через препарат (рис. 6).
Рис. 6. Схема хода лучей в оптическом узле микроскопа
Так как показатель преломления воздуха = 1 , то апертура у сухих объективов
равняется значению синуса угла (например, если  =40, то sin40=0,64, следовательно, NA=0,64).
22
Чем выше значение NA , тем лучше разрешающая способность у данного
объектива. По сравнению с сухими объективами большей разрешающей способностью обладают иммерсионные объективы, т. к. коэффициент преломление жидкости больше, чем воздуха. Например, показатель преломления
кедрового масла близок к 1,52, поэтому при его применении создается гомогенная система, уменьшается рассеяние лучей и увеличивается четкость
изображения. Значение нумерической апертуры является постоянным для
данного объектива и указывается на его оправе наряду с его увеличением
Объектив малого увеличения имеет большое поле зрения и максимальное
рабочее расстояние, поэтому исследование препарата, как правило, начинают
с малого увеличения, постепенно переходя на большее.
К недостаткам объективов относят различные аберрации линз, которые
могут быть трех типов:
- хроматические, которые могут вызываться тем, что фиолетовая часть
спектра преломляется сильнее, чем красная, поэтому изображение, созданное лучами одной длины волны не совпадает с изображением, созданным лучами другой длины волны, в результате изображение объекта получается окрашенными;
- сферические аберрации возникают из-за того, что лучи, проходящие
через разные участки линз, преломляются по-разному и не собираются в
одну точку; эта аберрация делает изображение нерезким
- кривизна поля – при этом нет возможности видеть одновременно резкое
изображение объектов в центре и на краях поля зрения.
Различные объективы в той или иной мере исправляют отдельные типы
аберраций. В зависимости от того, какие они имеют дополнительные обозначения: ахроматы, апохроматы, планохроматы и др. Так, у ахроматов исправлена хроматическая аберрация для двух длин волн (красного и фиолетового цветов). Апохроматы исправляют аберрации уже для трех длин волн и,
соответственно, имеют намного лучшее качество изображения. Планохрома-
23
ты и планапохроматы дают плоское поле зрения и используются при микрофотосъемке.
Окуляры. В построении изображения участвует лишь объектив, функции
же окуляра заключаются лишь в растягивании изображения. Фактически
окуляр строит мнимое изображение объекта, увеличивает его, не выявляя при
этом новых подробностей строения. Окуляры состоят из двух групп линз:
глазной – ближайшей к глазу, и полевой – ближайшей к плоскости изображения. В зависимости от кратности увеличения на окулярах проставляются
обозначения х5, х7, х10, х12,5, х16 и др. Современная маркировка окуляров
предусматривает, кроме указания увеличения окуляра, размер видимого поля
изображения (линейное поле в мм), например, 10х/18, 16х/16. Маркировка
наносится на фронтальную (переднюю) часть окуляра. Также маркируются
дополнительные сведения: работа в очках (символ в виде очков) или «foc.» –
фокусировочный (передвижной) элемент внутри окуляра для наводки на резкость изображения сетки окуляра, а также тип оптической коррекции (PL,
WPL). Разные окуляры предусмотрены для работы с разными объективами.
Так, например, окуляры Гюйгенса применяют совместно с ахроматами малых
и средних увеличений и планохроматами малых увеличений. Если на окуляре
стоит обозначение К, то это, так называемый, компенсационный окуляр, который используется с апохроматами, планохроматами и ахроматами больших
увеличений. Существуют также. так называемые, гомали, которые исправляют кривизну изображения и применяются только в фотографии в видимой
области спектра. Окуляры могут быть с небольшим выносом выходного
зрачка (5–7 мм от поверхности глазной линзы) и с вынесенным зрачком для
работы в очках и без них (более 15 мм от поверхности глазной линзы).
Существуют различные взаимозаменяемые конструкции участка тубуса,
несущего окуляры (прямой и наклонный) и различающиеся по количеству
окуляров
(окулярные
насадки):
монокулярные – с одним окуляром, для наблюдения одним глазом;
бинокулярные – с двумя окулярами, для одновременного наблюдения
24
двумя глазами, которые могут различаться по конструкции в зависимости от
модели микроскопа;
тринокулярные – с двумя окулярами и проекционным выходом, позволяющие одновременно с визуальным наблюдением двумя глазами, проецировать изображение препарата соответствующей оптикой на фото- или кинопленку, мишень телевизионной камеры или другой приемник изображения
(рис. 7).
Монокулярный
Бинокулярные наклон-
Тринокуляр с
наклонный тубус
ные
фото/видеокамерой
тубусы
Рис. 7. Виды тубусов, несущих объективы
Общее увеличение микроскопа складывается из умножения кратности
увеличений объектива и окуляра. Например, если используется объектив х90
и окуляр х10, то общее увеличение составит х900. В некоторых микроскопах
помимо окуляра и объектива в оптическую систему включаются еще дополнительные линзы, дающие небольшое увеличение. В этих случаях общее
увеличение микроскопа складывается из увеличения объектива, окуляра и
дополнительной линзы.
25
Полезное увеличение микроскопа зависит от нумерической апертуры объектива и не должно превышать 1000 х NA. Поэтому если используется объектив на х90, имеющий апертуру 1,25, то максимальное полезное увеличение
составит не более1250. Разделив его на 90, получим увеличение для окуляра
не более х13, то есть в данном случае целесообразно пользоваться окулярами х10 или х12, а использование более сильных окуляров только ухудшит
качество изображения.
Конденсор. В оптический узел микроскопа помимо объектива и окуляра
входит осветительная система, включающая конденсор. Конденсор состоит
из нескольких линз, вмонтированных в металлическую оправу, закрепляемую особым винтом в гильзе держателя. По существу конденсор представляет светосильный, короткофокусный объектив (в ряде случаев вместо конденсора используют объектив такой же апертуры, как и объектив, с которым
ведется наблюдение, зажимая его в особое центрируемое приспособление,
которое вставляют в гильзу конденсодержателя). Конденсор с ирисовой диафрагмой располагается, как правило, под рабочим столиком микроскопа.
Существует несколько типов конденсоров в зависимости от метода микроскопирования: конденсор светлого поля, конденсор темного поля, конденсор
для фазового контраста (рис. 8).
Конденсор светлого поля
Конденсор
темного поля
Рис. 8. Различные типы конденсоров
26
Раскрытие апертурной диафрагмы конденсора микроскопа существенно
влияет на качество изображения (рис. 9).
1
2
3
Рис. 9. Влияние раскрытия апертурной диафрагмы конденсора микроскопа на качество изображения:
1. Недостаточно контрастное изображение в результате слишком большого раскрытия апертурной диафрагмы конденсора.
2. Четкое изображение. Нормальное раскрытие апертурной диафрагмы.
3. Нечеткое изображение. Дифракционные ободки в результате недостаточного раскрытия апертурной диафрагмы конденсора.
При работе с микроскопом используют различные светофильтры, назначение которых заключается в дополнительном контрастировании объектов.
Так, например, для повышения контрастности объекта необходимо применять фильтры дополняющего цвета к окраске самого объекта. Для красных
структур обычно применяют зеленый фильтр, для синих – желтый. На практике цитогенетики чаще всего используют зеленый фильтр, т. к. зеленый цвет
наименее утомителен для глаз.
В современных микроскопах используют электрические осветители. Они
состоят из корпуса с патроном для лампы точечного источника света: патрон
крепится в корпусе микроскопа и соединяется с трансформатором.
27
Для максимального использования оптических возможностей микроскопа проводят установку рационального освещения по принципу Келлера. Этот
принцип заключается в том, что апертура (иначе говоря, действующее отверстие оптической системы) коллектора осветителя, апертура конденсора и
апертура объектива должны быть равны между собой.
Техника световой микроскопии позволяет проводить исследования с использованием разных методов:
 работа в светлом поле (проходящем или отраженном свете);
 работа по методу темного поля. Объект освещают только краевыми лучами конуса света, идущего через конденсор. В поле микроскопа на
темном поле видны светлые изображения мелких деталей. У крупных
деталей видны только светлые края, которые рассеивают освещающие
лучи. Метод предусматривает использование специальных конденсоров (например, ОИ-13);
 метод фазового контраста – основан на введение сдвигающих фазу
пластинок в оптическую систему микроскопа, которое позволяет преобразовать фазовые различия объекта в амплитудные и определить
различия в интенсивности поглощения структурами объекта, обладающего разными показателями преломления. При этом неокрашенные
объекты (например, хромосомы) кажутся такими темными, как будто
они интенсивно окрашены;
 метод интерференционной микроскопии. С помощью введенной в микроскоп специальной интерферометрической системы в результате сложения интерферирующих пучков получается контрастное изображение объекта. Метод используется для выявления неокрашенных структур, кроме того он позволяет определять сухую массу живых клеток,
определить толщину и объем клетки, а также концентрацию в ней
твердых веществ и воды;
 метод УФ-микроскопии;
 метод инфракрасной микроскопии;
28
 метод люминесцентной микроскопии, который предусматривает анализ
структур окрашенных флюоресцирующими красителями.
В связи с развитием методов молекулярной цитогенетики особенно бурно
развивается метод люминесцентной микроскопии. В связи с этим рассмотрим подробнее устройство и принципы работы люминесцентного
микроскопа.
1.3. Люминесцентная микроскопия в цитогенетике
В настоящее время люминесцентный микроскоп уже вышел из разряда
экзотических приборов. Эта модель стала рутинной и входит в модельный ряд
всех групп микроскопов. По сравнению с обычной световой микроскопией
проходящего света люминесцентная микроскопия обладает целым рядом
преимуществ: цветное свечение, высокая степень контрастности светящихся
объектов, возможность исследования прозрачных и непрозрачных объектов,
обнаружение не только отдельных хромосом, но и их фрагментов, в том числе, отдельных генов.
В основе люминесцентных методов исследования
лежит обработка
препарата специальными реактивами – флюорохромами. Эти вещества обладают способностью на короткое время поглощать свет, а затем испускать его,
правда, в другой длине волны, превышая длину волны поглощаемого света возбуждения на 20–50 нм (закон Стокса: длина волны фотолюминесценции больше,
чем длина волны возбуждающего света).
Различные флуорохромы (маркеры) обладают в зависимости от вида совершено определенными спектрами поглощения, зависящими от внутреннего
строения флуоресцирующих молекул, а иногда и от их окружения. Поглощается не каждый фотон облучающего света, а лишь некоторая его часть.
Кроме того, не все захваченные фотоны снова излучают свет. Благодаря этому
при поглощении, например, зеленого света молекулы флуорохрома способны
испускать желтый свет (табл. 2).
29
Таблица 2
Спектры поглощения и эмиссии (испускания) объектов
Поглощение
Эмиссия
синий свет
зеленый свет
зеленый свет
желтый свет
желтый свет
краснооранжевый свет
Конструкция люминесцентного микроскопа отличается от микроскопа
проходящего света наличием осветителя отраженного света, расположенного над объективами, и дополнительных узлов, в том числе специальных
блоков со светофильтрами и светоделительной полупрозрачной пластинкой,
которые расположены между осветителем отраженного света и объективами
(рис.10).
Рис. 10. Конструкция люминесцентного микроскопа:
1 – Источник света
2 – Теплозащитный фильтр
30
3 – запирающая задвижка
4 – полевая диафрагма
5 – возбуждающий фильтр
6 – дихроичный светоделитель
7 – объектив
8 – препарат
9 – эмиссионный фильтр
10 – тубусная линза
11 – окуляр
Для работы в свете люминесценции обычно используют ртутные лампы. В отечественных моделях применяют: ДРШ 250,
ДРШ 250-3, ДРШ100,
НВО 100 W/2; в зарубежных – HBO 50W, НВО 100 W, НВО 150 W (рис.11).
Рис. 11. Ртутные лампы люминесцентных микроскопов
Реже применяют ксеноновые лампы высокого и сверхвысокого давления или
диодные осветители. Лампы имеют специфичное светящееся тело. В кварцевую
колбу вплавлены два электрода. В зоне горения содержится небольшое количество ртути. За счет разрядов определенной мощности высокого напряжения
между электродами возникает электрическая световая дуга, которая и поддерживается в «горящем» состоянии. Лампа излучает чрезвычайно интенсив31
ный свет, содержащий значительную долю УФ-излучения. Излучаемая световая
энергия концентрируется при определенных длинах волн, так называемых «линиях ртути» (приложение, рис. 1) Большим преимуществом таких линейчатых излучателей является чередование интенсивных линий и мало интенсивных спектральных полос, которые необходимы при создании условий для наблюдения в
свете люминесценции. Важно, что возбуждение осуществляется с помощью одной «линии», а свечение в силу смещения Стокса наблюдается при длине волны, в которой лампа испускает мало интенсивный свет.
Галогеновые лампы в качестве источников света не пригодны для люминесцентной микроскопии из-за того, что металлическая нить накаливания преобразует большую часть потребленной электроэнергии в красный или невидимый инфракрасный свет. При этом лампа имеет непрерывный спектр излучения в широком спектральном диапазоне, который не пригоден для возбуждения
и наблюдения особенно слабосветящихся объектов. Тем не менее современные
люминесцентные микроскопы оснащаются, наряду со ртутными, галогеновыми лампами, чтобы иметь возможность проводить работы как в свете люминесценции, так и в проходящем свете.
Блок светофильтров в люминесцентном микроскопе конструктивно представляет собой куб, в котором закреплены:
 со стороны источника света – возбуждающий светофильтр;
 под углом 45° – светоделительная полупрозрачная пластина;
 со стороны наблюдательной системы – запирающий светофильтр
(приложение, рис. 2).
Все три элемента блока являются сменными. Свойство пластины и светофильтров определяется применяемым флуорохромом и ожидаемым цветом видимой люминесценции. Одним из важнейших узлов люминесцентного микроскопа является полупрозрачная светоделительная пластина (полупрозрачное
зеркало), выполненная на высоком технологическом уровне. Иногда подобная пластина может иметь до 40 слоев пленки-покрытия для выделения необ32
ходимой длины волны. Светоделительная полупрозрачная пластина обладает
следующими свойствами
 как зеркало служит для излома и направления светового потока от источника света через конденсор-объектив на объект;
 как пластинка служит для пропускания света от объекта, прошедшего через
объектив, для формирования изображения;
 кроме того, полупрозрачная пластина (полупрозрачное зеркало) осуществляет
разделение
светового
потока
по
спектру.
В современных люминесцентных микроскопах световой поток от ртутной лампы попадает на полупрозрачное зеркало, которое отражает его и
направляет его в объектив. Объектив, работая как конденсор, освещает объект. Свет, отраженный от объекта, попадает обратно в объектив, проходит
через него, затем через полупрозрачное зеркало, которое пропускает 100 %
отраженного света, и создает изображение в плоскости изображения (приложение, рис. 2). Важно то, что при этом мы не видим те элементы объекта, которые не светятся под воздействием светового потока определенной длины
волны, и, даже если они светятся, но их светящееся изображение не проходит
через запирающий светофильтр («отрезается»). В связи с этим, особое значение при проведении FISH приобретают спектральные характеристики, используемых флюорохромов.
Люминесцентные объективы технологически выполняются из оптических сред (стекла и клея), не вносящих собственной люминесценции в изображение. В противном случае они вносят в изображение дополнительную фоновую засветку, уменьшая тем самым интенсивность свечения объекта и превращая фон, вместо черного, например, в зеленоватый или коричневатый. Ясно, что в таком случае вместо яркого зеленого свечения объекта будет видно
слабое свечение или свечение с желтоватым оттенком. Для получения большего выхода люминесценции объективы стараются сделать с большими числовыми апертурами (10x0,40; 40x0,75, 100x1,40) с упрощением оптических схем.
33
Возбужденное в препарате флуоресцентное излучение распространяется по
всем направлениям. Задача объектива – «собрать» как можно больше такого
излучения, однако при низкой числовой апертуре подобный эффект незначителен. Иммерсионное масло должно быть специальным, не люминесцирующим.
Люминесцентная микроскопия в цитогенетике стала применяться в связи с
внедрением методов дифференциального окрашивания хромосом с использованием флюоресцентных красителей (акрихин, атебрин, акрихин-иприн,
акрихин-пропил и другие), но особенно широкое распространение она получила после разработки методов FISH. При этом изображение хромосом приобрели небывалую яркость и контрастность, появилась возможность изучать
сложные хромосомные перестройки и маркерные хромосомы неизвестного
происхождения, и даже выявлять присутствие отдельных аллелей генов
непосредственно на хромосомных препаратах (приложение, рис. 3–9). В связи с этим метод FISH занимает все большее место в клинической генетике,
дополняя методы традиционной цитогенетики. Метод FISH можно применять для диагностики анеуплоидий в интерфазных ядрах, благодаря чему
стала интенсивно развиваться
интерфазная цитогенетика. Данный метод
прост, экономичен и занимает всего несколько часов.
34
1.4. Правила работы с микроскопом
В нерабочем состоянии микроскоп должен быть закрыт чехлом. Постоянно следует следить за чистотой рабочего места и объективов. После работы
иммерсионные объективы следует протирать ватой или кусочком марли,
смоченной эфиром или спиртом (избегая обильного смачивания спиртом, т.к.
можно нарушить целостность системы линз) Работать макро- и микровинтами следует плавно, без рывков. Просматривают препараты на малых или
средних увеличениях и лишь для найденной структуры включают иммерсионный объектив. Необходимо следить, чтобы предметный столик не слишком далеко перемещался вверх, т. к. в таком случае препарат слишком сильно
давит на конец объектива и может повредить фронтальную линзу. Вся фронтальная оптика с высоким коэффициентом увеличения расположена в подпружиненной гильзе. При прикосновении она отходит немного обратно
наверх, но имеющийся в распоряжении отрезок короткий, поэтому вращать
микровинт и настраивать резкость при использовании иммерсионных объективов нужно очень осторожно.
Документация цитогенетического материала производится с помощью рисунков, микрофотографирования или микровидеосъёмки. Рисунок выполняется на листе бумаги, в правом верхнем углу которого содержится краткий
паспорт: ФИО исследователя, дата исследования, номер микроскопа и его
название, номер препарата и координаты метафазной пластинки. Рисунок
метафазной пластинки выполняют схематически с соблюдением имеющейся
размерности, взаимного расположения и центромерного индекса хромосом.
После проведения идентификации хромосомы ее номер (группу) проставляют возле центромеры). Обязательно подсчитывается число хромосом в метафазной пластинке и это число проставляется в паспорте рисунка. Более точную документацию проводят с помощью микрофото (или видео-)съемки.
35
Глава 2. ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
ИНТЕРФАЗНОГО ЯДРА
Уже на протяжении более 100 лет ядро клетки
привлекает пристальное внимание специалистов,
поскольку именно в ядре клетки сосредоточены
основные регуляторные системы, благодаря которым
поддерживается вся совокупность механизмов,
призванных обеспечивать жизнедеятельность как
отдельных клеток, так и всего многоклеточного организма
И. Н. Ильинских «Инфекционная кариопатология», 2005
Говоря о клеточном ядре, мы имеем в виду собственно ядра эукариотических клеток. Их ядра построены сложным образом и резко отличаются от
«ядерных образований», нуклеоидов прокариотических организмов. Сам
термин «ядро» впервые был применен Броуном в 1833 году для обозначения
шаровидных постоянных структур в клетках растений. Позднее такую структуру описали во всех клетках высших организмов.
При исследованиях клеточного ядра используют целый арсенал методов: химических, физических, иммунохимических и других. Свой вклад в эти
исследования привносит и цитогенетика. Предметом анализа является морфоформа и количество ядер, гетерохроматин и эухроматин, половой хроматин, ядрышки. Изучают закономерности и условия формирования, так называемых, микроядер. С развитием конфокальной микроскопии стало возможным изучать архитектуру ядра, включая анализ взаиморасположения хромосом и отдельных генов во всем объеме ядра в норме или патологии (например, при различных видах рака, наследственных болезней или при генотоксических воздействиях).
36
В условиях действия инфекционных или токсических агентов наряду с
аномалиями митоза на цитологических препаратах регистрируются разнообразные изменения морфологии ядра (рис. 12), которые сами становятся объектом цитогенетических исследований.
Благодаря развитию методов in situ гибридизации, особым направлением в
современной цитогенетике стало исследование числа и локализации отдельных хромосом (или их участков) на территории интерфазного ядра. Такой
подход позволяет сократить время исследования и проанализировать значительно большее число клеток при диагностике хромосомной или генной патологии, т. к. отпадает необходимость в длительном культивировании клеток
для накопления митозов, и в тоже время позволяет получать результаты хорошо сопоставимые с анализом метафазных хромосом (приложение, рис. 5–
6).
37
Рис. 12. Формы кариологической и хромосомной патологии
в ФГА-стимулированных лимфоцитах крови человека
(иллюстрация: И. Н. Ильинских с соавт., 2005)
38
2.1. Выявление полового хроматина
Одной из первый структур ядра, привлёкших внимание цитогенетиков,
стал половой хроматин. Он выявляется в соматических клетках женщин в
виде небольшой хорошо окрашиваемой структуры округлой формы размером
0,8–1,1 мкм, находящейся возле ядерной мембраны, которую называют также
тельцем Барра (рис. 13). Половой гетерохроматин – это одна из
Х-
хромосом, находящаяся в неактивном (суперспирализованном) состоянии.
Рис. 13. Тельце Барра в ядре клетки слизистой оболочки полости рта
здоровой женщины
Известно, что фенотипически пол определяется у человека наличием Ухромосомы, а не количеством Х -хромосом. Если в кариотипе зиготы присутствует хотя бы одна У-хромосома, то по фенотипу формируется мужчина. Количество телец Барра в клетках всегда на одно меньше, чем число Ххромосом. То есть только одна Х-хромосома в соматических клетках человека (и мужчины, и женщины) всегда находится в активном состоянии. Инактивация второй Х-хромосомы у женщин в виде полового хроматина служит
механизмом компенсации различий в дозе генов, не оказывающих влияния
39
на развитие половых признаков и признаков сцепленных с Х-хромосомой.
Этот же механизм оказался фактором, благоприятствующим носителям Ххромосомых анеуплоидий. Какое бы количество Х-хромосом они не несли,
генетически активна только одна. Поэтому по количеству телец Барра в соматических клетках можно диагностировать патологическую форму дисбаланса по половым хромосомам. Например, у женщин с кариотипом 47 ХХХ
обнаруживаются 2 тельца Барра, а с кариотипом 45 ХО – не обнаруживается
ни одного.
2.2. Выявление ядрышек
Практически во всех живых клетках эукариотических организмов в ядре
видно одно или несколько телец, сильно преломляющих свет – это ядрышки
(рис. 14).
Рис. 14. Ядрышки в ядрах ФГА-стимулированных лимфоцитов периферической крови человека (окрашены нитратом серебра)
Ядрышко – это уникальная клеточная органелла с богатой историей, которая была открыта в 1781 Фонтаной (Fontana, 1781), который обнаружил ядрышки в слизи угря и сообщил об этом в своем трактате о яде гадюки. Яд40
рышко – это место, где происходит транскрипция рибосомной РНК, процессинг пре-рРНК и сборка рибосомных субъединиц (Hadjiolov, 1985; Olson [et
al.], 2005).
Ядрышко – это динамичная структура, которая собирается вокруг кластера рРНК генных повторов в течение поздней телофазы, сохраняется в течение интерфазы и затем распадается, так как клетка вступает в митоз (Lam,
2005).
Подобно всем другим ядерным структурам, ядрышко не имеет собственной мембраны. Это не самостоятельная структура или органоид. Ядрышко
является производным хромосомы, одним из её локусов, активно функционирующим в интерфазе.
В ядрышках выделяют следующие основные структурные элементы:
1. Фибриллярные центры (ФЦ);
2. Плотный фибриллярный компонент (ПФК), содержащий большое количество предшественников рРНК и некоторые ДНК;
3. Гранулярный компонент (ГК), который представляет собой прерибосомы;
4. Ядрышковые «вакуоли» или ядрышковые щели;
5. Около- и внутриядрышковый конденсированный хроматин.
ФЦ – это структуры, соответствующие ядрышкообразующим районам
(ЯОР) хромосом (Goessens, 1984; Hadjiolov, 1985). В толще ФЦ расположена
рибосомная ДНК (рДНК), неактивная в отношении синтеза рРНК, тогда как
процессы транскрипции происходят на поверхности ФЦ. Кроме рДНК в составе ФЦ обнаружены также кислый белок С23 и РНК-полимераза I. Таким
образом, ФЦ
представляют собой аргирофильные электронопрозрачные
структуры, которые обычно частично или полностью окружены слоем электронно-плотного ПФК, что в совокупности называют фибриллярным комплексом (ФК) (Zatsepina [et al.], 1988).
ФЦ и ПФК обогащены негистоновыми аргентофильными белками, способными восстанавливать серебро в водных растворах нитрата серебра, «ам41
миачного серебра» и при этом окрашиваться (Hernandez-Verdun, 1986; Сабанеева,1989). Окраска регистрируется по отложению металлического серебра.
ГК представляет периферический слой, состоящей из предшественников рибосом. Здесь происходит созревание рРНК.
Гранулы и фибриллярная часть ядрышка состоят из рибонуклеопротеидов (РНП) (Monneron, Bernhard, 1969). Это было доказано на основании того, что гранулы и фибриллы ядрышка окрашиваются также, как рибосомы
цитоплазмы, тогда как основной и околоядрышковый хроматин остаётся неокрашенным.
Гранулярный компонент в виде РНП-частиц представляет рибосомы на
разных этапах созревания. Гранулярная часть ядрышка соответствует локализации собственно рРНК, а фибриллярная – её высокомолекулярным предшественникам. Если подавить синтез рРНК актиномицином D или другими
агентами, то происходит чёткая сегрегация фибриллярной и гранулярной частей ядрышка, причём, помимо фибриллярной и гранулярной зон, можно
различать околоядрышковый хроматин и аморфную белковую зону, содержащую ФЦ, который соответствует организатору ядрышка. Термический
шок, т. е. прогревание клеток до 420С, также вызывает подавление синтеза
РНК в ядрышке и уменьшение доли или полное исчезновение гранулярной
зоны.
Ядрышковые вакуоли представляют собой светлые зоны внутри ядрышка,
материал которых по структуре не отличается от содержимого нуклеоплазмы. Высказано предположение, что ядрышковые вакуоли в клетках животных и растений служат для накопления, процессинга и транспорта рРНК
(Chouinard, 1971; Feldmann, Torrey, 1977; Goessens, 1984).
Еще с конца XIX века ядрышки изучали с использованием основных красителей (пиранин желтый, гематоксилин и др.). Серьёзные исследования ядрышкового аппарата при помощи солей серебра получили широкое распространение после того как был предложен метод окрашивания азотнокислым
42
серебром активных ядрышковых организаторов (Goodpasture, Bloom, 1975;
Bloom, Goodpasture, 1976; Milller. [et al.], 1976; Olert. [et al.], 1979). Данный
метод удобен и адекватен в отношении оценки активности ЯОР хромосом
(Hubbell, [et al.], 1979; Ploton, [et al.], 1986).
Основными Ag-белками ядрышка является группа белков с молекулярной
массой от 37 000 до 195 000 (Lischwe [et al.], 1979, 1981; Williams [et al.],
1982; Smetana, [et al.], 1984). Среди них идентифицированы белки нуклеолин
(Белок С23),
нуматрин (Белок В23), РНК-полимераза-I. Фибриллярный
центр ядрышка содержат ассоциированный с ядрышком хроматин, несущий
рибосомные гены. РНК-полимераза-I, катализирующая транскрипцию рибосомных генов, выявляется не только в фибриллярной зоне, обычно считающейся местом синтеза и начала созревания предшественников рРНК, и в близи ФЦ, но и в самих ФЦ, т. е. в областях ядрышковых организаторов.
Форма, размер и количество ядрышек в клетке зависит от функциональной активности клетки и уровня ее пролиферации (Hozar and Fakar, 2006).
Ядрышки обычно имеют округлую форму, однако она может заметно изменяться в зависимости от вида ткани и активности клеток в биосинтезе белка.
Было установлено, что размер AgNOR тем больше, чем быстрее клетка делится. Размер AgNOR является маркером скорости клеточного цикла (Jacquet
[et al.], 2001). В клетках, активно синтезирующих белок (особенно в раковых), ядрышки увеличены в размере и нередко имеют необычную форму.
Напротив, в ядрах, малоактивных в транскрипции (например, в зрелых лимфоцитах), ядрышки бедны гранулярным и фибриллярным компонентами и
часто имеют кольцевидную форму, образованную плотным хроматином с
сердцевиной, содержащей ядрышковый организатор. Однако уже через час
после их активации ФГА в них исчезают блоки конденсированного хроматина, происходит фрагментация ФЦ и появляются тяжи фибриллярного и гранулярного компонентов ядрышка, сопровождаемые транскрипцией рДНК.
43
Обычно в ядре встречается одно, два или несколько ядрышек, однако в
некоторых случаях их число может возрастать до нескольких сотен. Так, в
ооцитах на стадии пахитены образуется очень много ядрышек, распределяемых по всему ядру. В каждом из таких ядрышек синтезируется рРНК и образуются предшественники рибосом. Такое огромное нарастание синтеза рРНК
происходит за счёт не столько повышения интенсивности синтеза на матрице
рДНК, сколько за счет увеличения числа (амплификации) рибосомных генов
в клетке (Збарский, 1988). При этом происходит очень активная транскрипция рибосомных генов. Таким образом, число ядрышек на ядро зависит от
генного баланса клетки (Lewis and John, 1963). Клетки с одним ядрышком
считаются нормальными, тогда как с 2 и более имеют тенденцию к развитию
патологии, например рака. В некоторых нормальных клетках были найдены
точки в ядрышках, и увеличение этих точек связано с тенденцией к развитию
рака (Romao-Correa, 2005).
Ряд исследователей предлагают использовать размер и количество ядрышек как прогностический фактор в отношении вероятности развития рака.
Для высокопролиферирующих клеток рака необходимо возрастание количества рибосом, что наглядно отражается в виде увеличения числа и размера
ядрышек (Donmez-Altunta, 2005).
2.3. Выявление микроядер
Микроядра – это ядерные структуры, которые впервые были обнаружены в эритроцитах и до настоящего времени обозначаются в этих клетках как
тельца Жолли (рис. 15).
44
Рис. 15. Микроядро в клетке буккального эпителия (показано стрелкой)
Микроядра в основном образуются из хромосомного материала, лишенного центромеры в процессе образования аберраций хромосом и поэтому отставшего на стадии анафазы от общего числа расходящихся хромосом. В ходе митоза этот материал попадает лишь в одну из дочерних клеток и формирует одно или несколько мелких ядер, так называемых микроядер.
Микроядра состоят, главным образом из ацентрических фрагментов, что
было показано с помощью измерения содержания ДНК. Они могут быть образованы и целой хромосомой в результате нерасхождения, вызванного дефектом веретена деления.
Размеры микроядер могут варьировать в зависимости от количества в них
ДНК. По размерам микроядер можно судить об изменениях, произошедших
в хромосомном наборе клеток. Образование крупных микроядер (диаметром
2–3 мкм) тесно связано с геномными нарушениями (нарушение веретена де45
ления), а появление клеток с мелкими микроядрами вызвано нарушениями в
структуре хромосом (структурные аберрации).
Микроядра можно наблюдать в любой пролиферирующей ткани. Частота
встречаемости клеток с микроядрами обычно соответствует распределению
Пуассона. В основном уровень микроядер является стабильной величиной
для клеток определенной ткани. Так, в лимфоцитах периферической крови
человека он колеблется от 8 до 12 на 1000 клеток, в эритроцитах крови человека – от 0,25 до 0,01 на 1000 клеток, в клетках слизистой ротовой полости –
0,07–0,2 на 100 клеток (Shmid, 1976; Stich, Sorra, Vainio, 1982; Mecrgor, 1987).
Учет микроядер для изучения цитогенетических изменений проводят в
различных клетках человека, но чаще для этой цели используют лимфоциты
в периферической крови, эритроциты, клетки костного мозга.
В исследовательской практике широко применяется микроядерный тест с
цитохалазином В. Он основан на анализе тех же типов генетических повреждений, что и оценка хромосомных повреждений и обладает достоинствами
как метафазного, так и ана-телофазного анализов. В соответствии с международным протоколом, разработанным для использования этого теста на ФГАстимулированных лимфоцитах крови человека, цитохалазин В вводится на 44
часу от начала культивирования клеток и присутствует в культуре в течение
28 часов до начала фиксации. Поэтому, в зависимости от продолжительности
клеточного цикла в каждой культуре всегда можно обнаружить набор клеточных фракций с различным числом ядер. Метод стандартно применяется
для определения микроядер в двуядерных клетках.
В настоящее время накоплено достаточно сведений о релевантности его
использования при оценке генетических эффектов радиации, пестицидов, лекарственной и радиотерапии, тяжелых металлов и их солей, органических генотоксических соединений, космической радиации и других воздействий.
Имеются сведения о более гладком, чем в тесте на индукцию хромосомных
аберраций, характере дозовой кривой, который проявлялся как в эксперимен46
тах in vitro, так и при радиотерапии. По данным, полученным при проведении этого теста, формируется международная база данных для оценки возможности прогноза развития опухолевых заболеваний у людей с высоким
уровнем микроядер в двуядерных клетках.
2.4. Определение размеров микроскопических объектов
Существует достаточно много способов определения размеров микроскопических объектов, начиная с использования окуляр-микрометра и заканчивая анализом цифровых изображений. Рассмотрим некоторые из используемых приборов и методов.
Микропланиметр состоит из линзы с двумя перпендикулярными нитями,
вмонтированной в тубус микроскопа и соединенной посредством стержня
планиметром. Проектируемые на микроскопическое изображение перпендикулярные нити манипулируются таким образом, чтобы место их пересечения
покрыло какую-либо точку на контуре ядра. Линзу можно смещать посредством движений планиметра; точку пересечения перпендикулярных нитей
перемещают по контуру ядра и в результате получают величину площади ядра, очерченной планиметром.
Пантограф выполняет операцию, как бы промежуточную между прямыми измерениями и микропроекционными приёмами. Вместо планиметра
движется плечо самописца, наносящего очертание ядра на расположенную
вне микроскопа бумагу. Оба диаметра и площадь можно измерить на бумаге.
Недостаток метода состоит в том, что осуществление измерений требует
длительного времени.
Микропроекционные методы заключаются в проектировании микроскопического изображения и измерения площади ядра на проектируемом
47
изображении. Для получения проекции используются зеркалом или призмой.
Определение размеров проектируемого изображения производиться непосредственно или косвенно. В первом случае измерения ведутся непосредственно на полученном изображении. При использовании косвенного метода,
очертание ядер наносятся на бумагу, после чего можно без затруднения вычислить площадь и объём ядра. Оба метода имеют свои преимущества и недостатки. Косвенный метод имеет то преимущество, что изображение ядра
остаётся зафиксированным в рисунке, поэтому вычисления можно повторить когда угодно. Однако такой способ работы отнимает много времени и
чреват ошибками, вносимыми самой зарисовкой. Прямой метод требует дорогостоящей аппаратуры, но представляет важное преимущество в связи с
возможностью автоматизации.
Важную роль играет увеличение, при котором производятся измерения.
При небольшом увеличении ошибка измерения, действительно, велика. С
другой стороны, при чрезмерно сильном увеличении происходит размывание
очертаний ядра, что порождает ошибки в оценки размеров.
Вследствие неоднородности материала на препаратах, полная автоматизация операций измерения практически неосуществима. Гораздо легче решается вопрос об использовании электронно-вычислительных машин для обработки результатов количественных определений. В данной области уже созданы приборы, работающие более или менее эффективно. Из них можно
упомянуть следующие:
Регистратор Эйхнера со шкалированной фольгой. В этом приборе используется фольга, на которой насечены в виде шкалы крестообразные знаки
разной величины, соответствующие размерным классам лог-объёмов ядер и
проектируемые на микроскопические изображение. Измеряемое ядро совмещают с ближайшим по размеру крестом. Работа по этому методу сравнительно медлительна, а оценка не слишком точна.
Регистрирующий микропланиметр (Caspersson)
48
Работа прибора основывается на угловом смещении ручного планиметра, которое – через посредство соответствующего устройства – воздействует на
силу тока в электрической цепи, обслуживающей регистрирующее звено.
Изменения силы тока вызывают отклонение плеча самописца, суммирующиеся в виде кривой.
Анализатор частиц позволяет проводить измерения на фотографическом
негативе микроскопического изображения. Негатив освещается снизу, причём диаметр светового пучка можно регулировать с помощью диафрагмы.
Подлежащие измерению ядро ставиться на пути светового пучка и путём манипулирования диафрагмой совмещается диаметр пучка с диаметром ядра.
При работе сданным прибором, форма ядер подразумевается шарообразной.
Диафрагма подключена к вычислительному устройству, которое автоматически регистрирует величину поверхности; одновременно осуществляется автоматическая классификация значений размеров ядер.
Прибор для полуавтоматической микропроекции (Palkovits и Csapo) проектирует уменьшенное изображение снизу вверх на матовое стекло. Увеличение проекционного устройства составляет *3000. Диаметры измеряют линейкой. С помощью составленных таблиц можно сразу найти лог-объём ядра.
Прибор снабжён ещё и вычислительным устройством, которое разбивает
объём ядер на разряды, выдавая также суммарное число измеренных ядер и
распределение величины ядер в виде кариограмм.
Сканирующие методы заключаются в разложении объекта на параллельные
полосы, причём суммарная длина полос соответствует величине объекта. Интегрирующее устройство определяет величину частиц по длинам волн и производит разбиение на классы. Из приборов, используется принцип сканирования, например интерференционный микроскоп и универсальный микроспектрофотометр.
Окуляр-микрометры в простейшем случае представляет собой стеклянную пластинку, на которую нанесена шкала, разделенная на 50 частей, или
49
сетка. Стеклянная пластинка со шкалой или сеткой помещается на диафрагму
окуляра, глазная линза которого может перемещаться по вертикали для точной фокусировки на шкалу.
Кроме того, существуют винтовые окуляр-
микрометры, в которых, помимо шкалы имеется перекрестие и биштрих, перемещающийся вдоль шкалы с помощью градуированного барабана. Винтовой окуляр-микрометр позволяет производить более точные прецизионные
измерения (рис. 16).
«линейка»
«сетка»
Винтовой окуляр-микрометр
Рис. 16. Окуляр-микрометры
Для измерения размеров объекта необходимо предварительно определить
цену деления окуляр-микрометра при данной комбинации объектива и окуляра. С этой целью на предметный столик микроскопа помещают объектмикрометр и определяют: скольким делениям объект-микрометра соответствует определенное количество делений окуляр-микрометра.
Объект-микрометр для проходящего света (ОМП) представляет собой
металлическую пластинку с отверстием в центре, в котором помещена стеклянная пластинка с измерительной шкалой длиной 1 мм, разделенной на 100
частей (рис. 17). Цена 1 деления объект-микрометра, таким образом, – 10
мкм.
50
Рис. 17. Объект-микрометр
Цена деления окуляр-микрометра определяется по следующей формуле:
, где
Lок – цена деления окуляр-микрометра,
nоб – количество делений объект-микрометра,
Lоб – цена деления объект-микрометра,
nок – количество делений окуляр-микрометра, соответствующее n делений
объект-микрометра (nоб).
В случае, если микроскоп оснащен фото(видео)-выходом, то появляется возможность проводить измерения
на цифровых изображениях объектов. В
этом случае необходимо использовать соответствующее программное обеспечение и знать соотношение между реальными и цифровыми размерами
объектов.
51
ГЛАВА 3. ИЗУЧЕНИЕ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА
И ИЗМЕНЕНИЯ ХРОМОСОМ В МИТОЗЕ
При проведении цитогенетических исследований часто необходимо учитывать уровень пролиферативной активности изучаемых клеток, учитывать
изменение морфологии хромосом в разные периоды клеточного цикла. Поэтому следует вспомнить об основных фазах клеточного цикла. Клетка
находится либо в состоянии покоя (интерфаза), либо делится. Период от одного деления до другого называется клеточный цикл (приложение, рис. 8).
3.1. ИНТЕРФАЗА
C цитологической точки зрения интерфазу относят к стадии покоящегося
ядра, т. к. в это время отсутствует физическое перемещение хромосом.
Наоборот, с точки зрения биохимии интерфаза является наиболее активной
стадией клеточного цикла, т. к. именно в это время в клетке осуществляются
основные метаболические превращения.
Наиболее важное событие в интерфазе – репликация ДНК. Интерфаза в
недиффирецированных клетках, сопровождающаяся репликацией ДНК
называется
автоситетической.
гетероситетическая
Существует
интерфаза,
которая
также
понятие
характерна
для
дифференцированных клеток. В этих случаях происходит синтез различных
специфических соединений, а синтез ДНК подавлен.
В настоящее время с помощью ряда методов, в которых используют
колхицин, радиоактивные изотопы, радиоавтографию установлено, что на
протяжении
интефазы
в
клетке
протекают
важнейшие
процессы
метаболизма, сменяющие друг друга в строгой последовательности. В
соответствии с этим интерфазу подразделяют на 3 периода: G1, в течение
которого в клетке происходит накопление продуктов, необходимых для
52
репликации хромосом, удвоения центриолей и построения митотического
аппарата деления. Период G1 по времени наиболее длительный и лабильный:
у разных организмов он может длится от 10–18 часов до нескольких суток.
Период синтеза ДНК – S –период продолжается 6–10 часов. В течение
этого времени происходит редупликация ДНК и основных белков хромосом
– гистонов.
Период
G2
осуществляются
–постсинтетический.
подготовительные
В
течение
процессы
для
этого
периода
формирования
ахроматического аппарата деления клетки и накопление необходимого для
деления энергетического резерва.
3.2. МИТОЗ
Профаза. Начало профазы связано с увеличением размеров ядра и появлением в нем отчетливо различимых хромосомных нитей. С самого начала
профазы хромосомы представляют собой двойные нити, однако заметить это
можно лишь к концу профазы, когда хромосомы укорачиваются и утолщаются за счет их спирализации. Ядрышко в профазе видно довольно отчетливо.
Для профазы характерно появление специфической цитоплазматической
структуры – клеточного центра или центриолей. Редупликация центриолей
происходит еще в интерфазе, в профазе же удвоенные центриоли отходят
друг от друга к противоположным полюсам клетки. Между полюсами развивается система нитей митотического веретена – центральное или первичное
веретено.
Конец профазы иногда выделяют в особую стадию – прометафазу,
связанную с разрушением оболочки ядра и с началом движение хромосом к
экваториальной плоскости веретена.
Метафаза. В период метафазы все хромосомы расположены между полюсами в экваториальной плоскости. Укорочение (спирализация) хромосом
53
достигает в это время максимума: в среднем, размеры метафазных хромосом
уменьшаются по сравнению с профазными в 20–25 раз. На стадии метафазы
хромосомы, состоящие из двух хроматид, соединены с клеточными центрами
нитями веретена, прикрепленными к центромерному району (кинетохору).
Отчетливо выявляющаяся морфология хромосом позволяет использовать метафазные хромосомы для оптимального кариотипирования.
Анафаза. Стадия анафазы начинается делением центромеры, которая
до этого времени объединяла хроматиды. Деление происходит одновременно
во всех хромосомах. Дочерние центромеры расходятся и хроматиды отделяются друг от друга, начиная передвигаться к полюсам. С этого момента сестринские хроматиды называются сестринскими хромосомами.
После разъединения сестринские хромосомы двигаются к полюсам под
действием сокращения нитей ахроматинового веретена. Скорость движения
их при этом для клеток разных объектов варьирует в пределах от 0,2 до 5
мкм в мин.
Телофаза. В телофазе завершается перемещение дочерних наборов
хромосом к полюсам. Формируются оболочки ядер дочерних клеток, в каждом из ядер образуются новые ядрышки. Одновременно происходит деспирализация хромосом; в конце телофазы хромосомы максимально удлиняются.
3.3. Определение длительности периодов митотического цикла
Среди методов, позволяющих определять длительность периодов митотического цикла, наиболее простыми являются метод учета относительной
частоты встречаемости клеток на отдельных стадиях цикла, а также метод,
основанный на учете времени появления так называемых К-митозов – колхициновый метод. Более точными являются метод учета времени появления
различных хромосомных перестроек, а также метод с применением Н3-
54
тимидина
в качестве предшественника ДНК. Последний метод получил
наибольшее распространение.
Использование специфического предшественника ДНК
Н 3-
тимидина позволяет избирательно метить клетки в периоде синтеза ДНК и
прослеживать судьбу меченых клеток и отдельных хромосом в нескольких
генерациях. Метод основан на том, что в организме млекопитающих Н3тимидин циркулирует около 1 часа. За это время он включается в ядра только
тех клеток, которые находятся в S-периоде. При исследовании клеток, фиксируемых через определённые интервалы времени после введения тимидина,
можно видеть, что сначала вступают в митоз клетки, не имеющие радиоактивной метки, – это те клетки, которые закончили синтез ДНК до введения в
организм Н3-тимидина, т. е. находились в фазе G2. Затем начинают делиться
клетки, ядра которых содержат тритиевую метку – клетки, которые во время
циркуляции тимидина находились в фазе S. Наконец появляются клетки, которые также не содержат метки – это клетки, находившиеся в фазе G1. Если
отложить на оси ординат процент меченых митозов, а на оси абсцисс время,
то получиться многовершинный график, одна вершина которого отражает
первое деление клеток, которые находились в фазе S в период циркуляции
тимидина, следующая вершина будет отвечать второму делению этих же
клеток и т. д.
Очень удобны для одновременного наблюдения различных фаз митоза
препараты клеток в корешках лука, которые широко используются в различных цитологических практикумах (рис.18).
Чтобы выяснить уровень митотической активности, а также наибольший процент клеток, находящихся в определенной стадии митотического
цикла, вычисляют соотношение клеток, находящихся в митозе, к общему
числу клеток исследуемой ткани, т. е. определяют митотический индекс.
Этот индекс может говорить об отсутствии угнетения в процессе деления
клеток. Митотический индекс определяют делением числа клеток в состоя55
нии митоза на общее число учтенных клеток и выражают в промилле (о/ 00)тысячных долях целого.
Рис. 18. Кариокинез в корешке лука:
1 – интеркинез, 2 – профаза (плотный клубок), 3 – профаза (рыхлый клубок), 4 – метафаза
5 – ахроматиновое веретено, 6 – анафаза, 7 – телофаза
(иллюстрация: И. В. Алмазов, Л. С. Сутулов, 1978)
56
ГЛАВА 4. ПОДГОТОВКА И АНАЛИЗ ПРЕПАРАТОВ
ХРОМОСОМ
4.1. Строение хромосом
Хромосомы – это нуклеопротеиновые тела, в которых хранится, передается потомству и реализуется наследственная информация. В настоящее время
выделяют два основных типа хромосом, отличающихся по структурной организации: первый тип - у прокариот в нуклеоиде и в клеточных органеллах
эукариот; второй тип – хромосомы эукариот, имеющие разную морфологию
в интерфазе и при делении клеток.
В большинстве клеток хромосомы можно увидеть лишь во время относительно короткого отрезка времени, связанного с делением клетки. Конечно,
есть немало исключений. У некоторых видов нашли огромные хромосомы,
видимые во время интерфазы, когда в обычных клетках хромосома остается
невидимой и активно работает. Эти исключительные хромосомы оказались
конгломератом более 1000 копий исходной хромосомы. Самые известные
примеры таких гигантов – политенные хромосомы Drosophila melanogaster и
Chironomus tummy. Политенные хромосомы долго рассматривали как непревзойденную модель интерфазной хромосомы (рис. 19).
Молекулярная организация хромосом
Молекулярно каждая хромосома клетки является сложно организованной
структурой. Хромосома человека, например, содержит, в среднем, около 130
миллионов п. н., однако содержание ДНК варьирует в разных хромосомах от
50 до 260 миллионов п. н.
57
Общее количество ДНК в соматической клетке составляет 6,4х109 пар оснований, следовательно, гаплоидный набор состоит из 3,2х109 пар нуклеотидов. Основное количество ДНК сосредоточено в хромосомах (99,5 %).
Рис. 19. Политенные хромосомы Chironomus tentans (a) и Drosophila virilis (б)
(иллюстрация: И. Ф. Жимулёв, 2003)
Внехромосомная часть генома – это ДНК митохондрий. Совсем небольшое количество составляют отдельные кольцевые молекулы ДНК в ядре и
цитоплазме. Структурные классы ДНК представлены на схеме (рис. 19).
Сателлитная ДНК образована большими участками тандемно повторяющихся последовательностей различной сложности. Повторы ДНК этого типа не транскрибируются и расположены преимущественно в участках гетерохроматина – в центромерных участках всех хромосом и районах вторичных перетяжек. Имеется два основных типа сателлитных ДНК – «классические» сателлиты и альфа-сателлиты.
58
«Классические» или «простые» сателлитные ДНК содержат сотни тысяч
«коротких» повторов трех похожих типов (сателлит 1, 2, 3). Например, сателлит 2 и 3 содержат тандемные повторы АТССС с различными вариациями. В геноме человека эти типы ДНК формируют гетерохроматиновые
участки следующих
Геном человека
Митохондриальная ДНК
(0,5 %)
Ядерная ДНК
(99,5 %)
В составе генов (25–30 %)
Кодирующие последовательности (уникальные)
10 %
Вне генов 75–65 %
Некодирующие
последова-
тельности (уникальные)
90 %
Средние
(умеренные)
повторы
Минисателлиты
Тандемные повторы различной длины и повторности
Диспергированные по геному ретротранспозоны
Тандемные
повторы
Сателлитная ДНК
Гены рРНК
последова-
тельности
Длинные повторы
Множественные
копии генов
Повторяющиеся
Микросателлиты
Динуклеотидные
повторы
SINEs
Aluповторы
Рис. 20. Структурные классы ДНК генома человека
59
LINEs
L1-повторы
хромосом – 1, 9, 16 (вторичные перетяжки, короткие плечи акроцентрических
хромосом, длинное плечо хромосомы У.
Альфа-сателлиты (или альфоидные ДНК) формируют основую массу ДНК
центромерного гетерохроматина, составляя 3–5 % ДНК в каждой хромосоме.
Альфоидная ДНК образована тандемно повторяющимися единицами длиной
171 п. н., число копий которых в разных хромосомах варьирует от нескольких десяток до нескольких тысяч.
Минисателлитные ДНК состоят из среднего размера (20–70 п. н.) тандемно повторяющихся единиц ДНК (до 1000 повторов длиной до 20 тыс. п.
н.) диспергированных среди различных участков геномной ДНК. Часто эти
типы повторов располагаются вблизи теломерных участков хромосом.
Обычно они не транскрибируются. К этим повторам относятся гипервариабельные минисателлитные ДНК, находящие применение для идентификации
личности (ДНК-фингерпринт). К минисателлитам относятся также теломерные тандемные повторы ТТАGGG, общей длиной 10–15 тыс. п. н.
Микросателлитные ДНК представлены короткими тандемными повторами 1–4 п. н., диспергированными по геному. Мононуклеотидные повторы
(А или Т) очень распространены, образуют до 0.3 % генома человека. Динуклеотидные повторы СА (или ТG) высокополиморфны и формируют до
0,5 % генома. Тринуклеотидные или четырехнуклеотидные повторы относительно редки, но часто высокополиморфны и находят применение в разработке полиморфных маркеров для молекулярно-генетических исследований.
SINEs (short interspersed nuclear elements) – короткие диспергированные
ДНК-повторы относятся к так называемому семейству Alu-повторов. Длина
Alu-повторов составляет около 280 п. н. и они обычно фланкированы короткими прямыми повторами длиной 6–18 п. н. Эти повторы встречаются примерно через каждые 3 тысячи п. н., число их составляет до одного миллиона
на геном. Alu-повторы диспергированы среди геномной ДНК эухроматина и
60
расположены на хромосомах в светло окрашенных участках при использовании G-метода окрашивания хромосом (или в R-позитив-ных участках).
LINEs – long interspersed nuclear elements относятся к так называемому
семейству L1 или Kpn повторов. Усредненная последовательность L1 повтора имеет длину 6,1 тысяч п. н. Число этих повторов составляет более 100000
на геном. В противоположность Alu-повторам LINEs расположены, в основном в G-окрашенных участках хромосом.
Был описан феномен присутствия двух типов хроматина – эух-роматина
и гетерохроматина. Нуклеотидная последовательность молекулы ДНК эухроматиновой части генома человека практически полностью расшифрована.
Установлено, что эухроматин состоит из однокопийных последовательностей
ДНК и содержит большую часть структурных генов. В эухроматине выделено несколько фракций ДНК длиной около 300 тыс. п. н., названных изохорами. Изохоры отличаются по процентному содержанию GC-пар: L –легкие
изохоры с низким содержанием GC-пар; H1, Н2, Н3 – тяжелые изохоры, богатые GC-парами. Изохоры распределены в хромосомах неслучайным образом. Так, легкие изохоры преимущественно локализованы в G-сегментах
хромосом, в то время как тяжелые изохоры – в основном в R-сегментах, при
этом плотность распределения тяжелого изохора Н3 в сегментах хромосом
примерно пропорциональна количеству содержащихся в них генов.
Гетерохроматин, в свою очередь, подразделяется на структурный (или
конститутивный) и факультативный. Структурный гетерохроматин образует постоянные структурные элементы в парах гомологичных хромосом и
располагается, в основном, в прицентромерных районах и дистальном отделе длинного плеча Y- хромосомы. Структурный гетерохроматин состоит
из сателлитной ДНК I–III классов (с длиной повторяющейся последовательности 1–20 п. н.), а также из сателлитной ДНК ,  и -типов (с длиной отдельного повтора 170 п. н., 68 п. н., 220 п.н. соответственно. Сателлитные
61
повторы имеют различную обогащенность АТ- и GC-парами оснований и
специфично распределены по хромосомам.
Термин «факультативный гетерохроматин» относится к гетерохроматизированному эухроматину, который присутствует не в обеих, а в одной из
двух гомологичных хромосом. Если конститутивному гетерохроматину присуще неизменное, стабильное конденсированное состояние, то факультативный гетерохроматин свойственен какой-либо определенной стадии развития
или типу клеток. Классическим примером
факультативного gh является
функционально неактивная Х-хромосома. Факультативный gh содержит различные классы сателлитной ДНК, обогащен протяженными повторяющимися последовательностями типа LINE, которые способствуют конденсации
хроматина.
Центромера хромосом содержат особые типы повторяющихся ДНК, а
также специфические «центромерные» белки, обеспечивающие сегрегацию
хромосом в ходе митотического и мейотического
типов деления клеток.
Так, у результаты полного секвенирования генома дрожжей S. cerevisiae показали наличие в центромерных районах всех 16 хромосом консервативных
доменов CDEI, CDEII, CDEIII. Хотя все центромеры имеют одну и ту же
функцию и центромерные районы очень похожим образом устроены, все же
последовательность нуклеотидов в них не полностью идентична. Элемент
CDEI имеет 7 консервативных нуклеотидов ТСАСАТG. Элемент CDEII –
это фрагмент из 76–86 пн (число нуклеотидов в разных хромосомах разное).
Элемент CDEIII состоит из 25 п. н., из которых последовательность –G-----G---CCGAA-------- присутствует во всех 16 хромосомах. Центромерные последовательности определены для ряда других организмов.Они оказались отличным от тех, что были идентифицированы у S. cerevisiae. Таким образом,
несмотря на то, что функция у центромер одна и та же у всех живых организмов, не существует единой последовательности ДНК, ответственной за
выполнение этой функции.
62
Центромера играет фундаментальную роль в движении хромосом к полюсам деления. Обычно центромерный участок представлены в компактной интенсивно окрашивающейся метафазной хромосоме неокрашивающимся
участком – первичной перетяжкой между двумя плечами хромосом (локализованная центромера). У некоторых видов растений и животных существуют
полицентрические хромосомы и хромосомы с диффузными центромерами (у
ожики Luzula purpurea, скорпиона, у некоторых представителей полужесткокрылых насекомых, а также у аскарид A.megalocephala в клетках зародышего пути). Нити веретена прикрепляются к этим хромосомам по всей их поверхности, и в анафазе дочерние хромосомы отходят к полюсам параллельно
одна другой в виде прямых палочек. После действия рентгеновских лучей
эти хромосомы распадаются на фрагменты, каждый из которых имеет центромерный район и функционирует как нормальная хромосома.
Участок центромеры содержит кинетохор
– обособленную структуру,
контактирующую с центромерным районом, к которому прикрепляются микротрубочки – нити митотического веретена. Сформированный кинетохор
представляет собой трёхслойную пластину, состоящую из внутреннего слоя
толщиной 40–60 нм, светлоокрашенного среднего слоя 25–30 нм толщиной и
внешнего слоя 40-60 нм. Внутренние слои кинетохорной пластины располагаются рядом с хроматиновыми тяжами и взаимодействуют с центромерным
хроматином. Тонкие хроматиновые нити проходят сквозь средние слои и
оказывается, связаны с внутренним и внешними слоями. Микротрубочки,
связанные с кинетохором, заканчиваются во внешнем слое и редко протягиваются до среднего и внутреннего слоев. Помимо микротрубочек, внешние
слои содержат «пушистую поверхность», или корону, состоящую из фибрилл, которые формируют петли наподобие ламповых щеток. В конце митоза
кинетохор, как специализированная структура исчезает.
Теломеры хромосом являются специализированными структурами, содержащими особые типы ДНК и белки, которые образуют концевые участки
63
хромосом. Теломеры имеют несколько функций: поддержание структурной
целостности хромосомы; обеспечение полной репликации концевых участков хромосомы; поддержание трехмерной организации хромосом в интерфазном ядре. Теломеры эукариот содержат похожие, но не полностью идентичные, тандемно повторяющиеся последовательности ДНК, например,
TTAGGG (человек), TTTAGGG (Arabidopsis), TTGGGG (Paramecium).
В
процессе клеточных делений соматических клеток теломеры постепенно
укорачиваются. Причиной такого укорачивания считают концевую недорепликацию, возникающую из-за невозможности образования крайнего РНКпраймера при репликации 3'-конца ДНК (Оловников A. M., 1972).
Хромосомы в интерфазном ядре
В не делящихся
клетках хромосомы деспирализованы и занимают
свои, строго определенные территории в ядре. Современные технологии
трёхмерной микроскопии позволяют рассмотреть хромосому в интерфазном
ядре и получить информацию о локализации в нем сразу всех хромосом человека. Для этого широко применяют гибридизацию in situ (FISH) ДНК индивидуальных хромосом, меченной флуоресцентными красителями, с ДНК
интерфазного ядра. Затем с помощью лазерного сканирующего микроскопа
получают серию оптических срезов ядра, на которых зарегистрированы интересующие исследователя сигналы (приложение, рис. 8). Такие оптические
срезы можно рассматривать отдельно, использовать для создания ортогональных проекций или для реконструкции трехмерной организации клеточного ядра. В последние годы еще одной координатой в исследованиях интерфазного ядра стало время. Результаты поиска в интернете по словам 4Dmicroscopy (3D time-lapse microscopy) демонстрируют наглядные доказательства прогресса в этом направлении. То, что совсем недавно казалось абсо-
64
лютно невозможным, сегодня – передовой край исследований, а завтра превратится, вероятно, в рутину лабораторных будней.
Сегодня описать строение интерфазного ядра нельзя без использования
таких понятий, как хромосомная территория и межхроматиновое пространство. Было установлено, что из хромосомных территорий в межхроматиновое
пространство выходят гигантские петли ДНК. В их составе присутствуют гены, которые должны активно работать в клетке. Они и уходят за пределы
хромосомной территории, потому что именно там условия для их работы
идеальны. В межхроматиновом пространстве расположены целые комплексы
молекул, обеспечивающих синтез информационной РНК и ее дальнейшие
преобразования. Есть еще одно преимущество для такого синтеза в межхроматиновом пространстве. Оно не только место локализации фабрик синтеза
РНК, но и магистральный путепровод, позволяющий генным продуктам
быстро добраться до оболочки ядра, а затем через ядерную пору перейти в
цитоплазму для участия в производстве белка.
Помимо гигантских петель, выходящих в межхроматиновое пространство, есть и другие районы хромосом, материал которых расположен на периферии их территорий и представляет собой относительно слабо конденсированный хроматин. В них также содержатся функционально активные гены,
по крайней мере, имеющие шанс быть активными, так как они доступны для
полимераз. Конечно, нахождение в этих районах не обеспечивает включение
гена, оно лишь делает его доступным для включения. Была высказана гипотеза, согласно которой при дифференцировке клеток формируется необходимый вариант пространственной организации хромосомных территорий: он
определяет спектр генов, которые могут быть допущены к работе, чья активность управляется другими, привычными для молекулярного биолога механизмами (Рубцов Н. Б., 2007).
Хромосомы эукариотических клеток могут находиться в двух альтернативных состояниях: рабочем (частично или полностью деконденсирован65
ном), а также в максимально конденсированном, компактном, метаболически
неактивном транспортном состоянии, предназначенном для того, чтобы во
время деления без структурных нарушений перенести и точно распределить
огромные по длине молекулы ДНК между двумя дочерними клетками.
Диплоидная клетка человека содержит около двух метров молекул
ДНК, и, естественно, вызывает изумление, сложность упаковки таких огромных молекул на ограниченной территории ядра.
Упаковка ДНК в хромосомах
Процесс компактизации ДНК проходит через несколько структурных
уровней (рис. 21). Элементарной дискретной единицей упаковки хроматина
является нуклеосома. Нуклеосомные гистоны (Н2А, Н2В, Н3 и Н4) по две
молекулы каждого типа образуют белковую глобулу, вокруг которой в 1,75
оборота наматывается молекула ДНК размером 146 н. п. и длиной около 68
нм. Образующаяся нуклеосома представляет собой элементарную единицу
хроматина, имеет диаметр около 10 нм и вес около100 кДа. Между собой
нуклеосомы связаны друг с другом линкерными отрезками ДНК длиной
около 20 нм и в среднем повторяются через каждые 20 нуклеотидов. Такая
структура напоминает «бусы на нитке». Общее количество нуклеосом в диплоидной клетке человека достигает 3 Х 107, что обеспечивает компактизацию ДНК с коэффициентом, равным 6–7.
66
Рис. 21. Схема различных уровней компактизации хроматина и размеры хромосомных фибрилл:
а) иллюстрация: Ченцов, 1996,
б) иллюстрация: Russel, 1986
Точно неизвестно, сохраняется ли нуклеосомная укладка, когда ген
начинает транскрибироваться. В неделящемя ядре, где гены активно работают, нуклеосомы расположены достаточно строго в определенных точках в
промоторной области. Присутствие нуклеосом вместо факторов транскрипции в области промотора подавляет активность генов. Белки нуклеосом – гистоны конкурируют с факторами транскрипции за участки свободной от белков ДНК. Такие участки могут образовываться в клетке сразу после репликации ДНК. Если гены успеют образовать нуклеосомные структуры в условиях,
когда концентрация факторов транскрипции недостаточна, то ген оказывается неактивным. Напротив, при достаточной концентрации факторов они
67
успешно конкурируют с гистонами и в области промотора образуют специфичную структуру, примыкая к РНК-полимеразе. В то же время гистоны не
сходят полностью с ДНК даже в активно транскрибируемом хроматине. В
некоторых генах, например, в блоках рибосомной 18S и 28S РНК, нуклеосомная укладка исчезает полностью – примерно на 85 %. С другой стороны,
транскрипционные комплексы мини-хромосом, вируса SV-40, выделенные
из инфицированных клеток, содержат нормальный набор гистонов и имеют
нуклеосомную структуру, однако интенсивность транскрипции у этого вируса существенно ниже, чем в генах рРНК. Совокупность современных данных
свидетельствует о том, что транскрибируемые гены содержат нуклеосомы с
той же частотой, что и нетранскрибируемые. Другими словами гены не подвергаются серьёзной структурной реорганизации в ходе транскрипции. Однако в области инициации транскрипции структурные изменения хроматина
все-таки обнаружены. В этих участках ДНК не организована в нуклеосомные
структуры и потому примерно в 100 раз более чувствительна к действию
ДНК-аз.
Более плотная упаковка ДНК связана с образованием нуклеофибрилл
диаметром 30 нм, представляющих собой упорядоченную структуру, стабилизируемую гистом Н1, присоединяющимся к линкерным участкам ДНК. В
результате этого процесса нуклеосомы стягиваются вместе, образуя повторяющиеся спиральные витки с шагом около 10 нм, где на 1виток спирали
приходится 6–7 нуклеосом. Подобный способ обеспечивает сорокократную
компактизацию ДНК, уменьшая длину средней хромосомы приблизительно
до 1 мм. Второй уровень упаковки ДНК иначе называют нуклеомерным
уровнем, подразумевая под нуклеомером объединение 6 нуклеосом в одну
глобулу, а ряд сближенных нуклеомеров образует 30-нм фибриллу ДНП. Согласно другой гипотезе, второй уровень компактизации связан с образованием структуры типа соленоида.
68
Все последующие уровни компактизации ДНК происходят при участии негистоновых белков, которые специфически взаимодействуют с определенными последовательностями молекул ДНК. В результате такого взаимодействия формируются большие петли (домены), отходящие под углом от
основной белковой оси хромосомы и являющиеся третьим уровнем структурной организации хроматина (хромомерный уровень, петлевой домен,
розетка).
Подобная петельная укладка является общим принципом организации
хроматина от про- до эукариот, что не только обеспечивает репликацию, но
и организует функциональные единицы хромосом – репликоны. На хромосому эукариотической клетки приходится в среднем 2000 таких петельных доменов, каждый из которых содержит от 20 000 до 100 000 пар нуклотидов,
что соответствует 0,5 мкм фибриллы диаметром 30 нм. В результате поперечный размер хроматина увеличивается до 300 нм, а достигаемый коэффициент компактизации ДНК приближается к 680.
Четвертый уровень – хромонемный: хромомеры сближаются и образуют толстые (0,1–0,2 мкм) нити, которые можно наблюдать уже в световой
микроскоп. Характер упаковки этой нити в теле хроматиды ещё недостаточно выяснен: возможна спиральная укладка, но не исключено и образование
ею еще одного уровня петлевых структур.
Во время митоза происходит дальнейшая суперспирализация хроматина, заключающаяся в укладке отрезков из 18–20 петлевых доменов вокруг
осевого элемента хромосомы, в состав которого входят около 20 белков негистоновой природы, сходных с белками интерфазного ядерного матрикса. В
результате образуются витки, увеличивающие поперечный размер хроматина
до 700 нм и ведущие к формированию наиболее высокого уровня укладки
ДНК – образованию хроматид с коэффициентом компактизации 12Х10 4. Из
двух хроматид, содержащих
дочерние молекулы ДНК (удвоение предше-
69
ствует делению клетки), образуется метафазная хромосома, имеющая длину
около 5000 нм и ширину 1400 нм.
Большим шагом в моделировании структуры хромосом оказалась изучение хроматина после удаления гистонов из хромосом обработкой 2М NaCl.
В таких случаях удаляются все гистоны и значительная часть негистоновых
белков. После такой обработки на месте метафазной хромосомы остается
остов (скаффолд) из негистоновых белков, из которого выходят петлеобразные нити ДНК длиной 10–30 нм (рис. 22).
Рис. 22. Латеральный петли ДНК (1) и осевые комроненты – скаффолд (2)
метафазной хромосомы после полного удаления гистонов (иллюстрация:
Therman, Susman, 1993)
Участки ДНК, связанные со скаффолдом названы SAR (scaffold attachment
regions). В интерфазном ядре такие петли связаны с нитчато-сетчатым белковым образованием, расположенным внутри ядерной оболочки называемым
ядерным матриксом. В последнее время получены данные о том, что скаф-
70
фолды могут представлять собой артефакт, получившийся в результате монтажа и высушивания дегистонизированных хромосом на подложке. Действительно в теле хромосомы есть негистоновые белковые «скрепки», сшивающие основания боковых петель ДНК, но они разбросаны рыхло по объему хромосомы.
4.2. Морфология хромосом.
Кариотип
Размеры метафазных хромосом у различных организмов варьируют в
широких пределах от 0,2 до 50 мкм. Самые большие хромосомы – у прямокрылых насекомых и амфибий, а самые маленькие – у грибов и водорослей.
У человека размер самой крупной хромосомы (№ 1) – около 10 мкм, а самые
мелкие (№ 21, № 22) –порядка 1,5 мкм. Размер хромосом варьирует в различных тканях и может изменяться в зависимости от внешних
условий.
Пониженная
температура,
длительное
действие
колхицина
приводит к укорочению хромосом.
Набор хромосом – это совокупность всех хромосом в клетке. Различают два вида наборов хромосом: набор гаметический (n) – в зрелых половых
клетках и зиготический (2n) – в соматических. Каждый вид обладает постоянным числом хромосом, зафиксированным в эволюции вида (рис. 23). У человека – 46 хромосом в зиготическом наборе. Кариотип человека представлен на рис. 24.
71
Рис. 23. Диплоидное число хромосом различных видов животных и растений
(иллюстрация: Ф. Айала, Дж. Кайгер, 1987)
72
Рис. 24. Морфология равномерно окрашенных хромосом человека – метафазная пластинка и раскладка хромосом мужчины 46,ХУ
(Иллюстрация: А. Ф. Захаров и др., 1982)
73
Выделяют 3 основных морфологических типа хромосом (рис. 25).
Акроцентрические хромосомы – палочкообразные хромосомы с одним
длинным и одним очень коротким плечом. Долгое время допускалось существование телоцентрических хромосом с концевым положением центромеры.
Детальными цитологическими исследованиями удалось установить, что в
любом случае, в норме, присутствует маленькое короткое плечо. Телоцентрические хромосомы могут возникать путем разрыва по центромерному
району двух плеч хромосомы. Однако такие хромосомы очень нестабильны и
формируют так называемые изохромосомы – оба плеча одинаковой длины и
генетически гомологичны друг другу.
Структурными компонентами коротких плеч пяти акроцентрических
хромосом в кариотипе человека являются спутники и спутничные нити. Варьирующая в широких пределах величина спутников, длина и толщина спутничных нитей приводят к выраженному гетероморфизму гомологов хромосом групп D и G. Спутники представлены сатДНК. Спутничные нити (вторичные перетяжки) являются ядрышкообразующими районами и обозначаются AgNOR-блоками. Каждая акроцентрическая хромосома несет различное
число рибосомных генов и содержит разное число активно транскрибируемых единиц, что наряду особенностями спутников и спутничных нитей лежит в основе структурно-функционального полморфизма индивидуальных
ядрышковых организаторов.
Метацентрические хромосомы имеют плечи равной длины.
Субметацентрические хромосомы имеют плечи, немного отличающиеся по длине.
74
спутники
р
Сen
Вторичная
перетяжка
q
1
2
3
Рис. 25. Схема морфологических типов хромосом:
1 – метацентрическая хромосома
2 – субметацентрическая хромосома
3 – акроцентрическая хромосома
сen – первичная перетяжка
p – короткое плечо
q – длинное плечо
Согласно Международной классификации (Денвер, 1960), у человека
выделяют 7 групп аутосом хромосом (рис. 24) от А до G.
Группа A – три пары крупных метацентрических хромосомы 1–3;
Группа В – две пары крупных субметацентрических хромосомы 4–5;
Группа С – семь пар субметаценрических хромосом 6–12;
Группа D – три пары акроцентрических хромосом 13–15;
Группа Е – одна пара метацентрических хромосом (16) и две субметацентрических 17–18;
Группа F – две пары метацентрических хромосом 19–20;
Группа G – две пары акроцентрических хромосом 21–22.
Кроме того,
в
хромосомный
набор
входят
половые хромосомы. Х-
хромосома по размеру близка к группе С, У-хромосома по форме и размеру
близка к хромосомам группы G.
75
4.3. Общая характеристика подготовки препаратов хромосом
Получение препаратов хромосом основано на использовании клеток, которые
интенсивно делятся. В зависимости от особенностей материала методы приготовления хромосомных препаратов подразделяются на две категории.
1. Прямые методы применяются при исследовании тканей, обладающих высокой митотической активностью (костный мозг,
лимфатические узлы, любые эмбриональные ткани на ранних
стадиях развития), а также при исследовании мейотических
хромосом.
2. Непрямые методы включают получение препаратов хромосом из любой ткани после стимулирования пролиферации
клеток в условиях in vitro. Тип культуры (монослой или суспензия) и длительность культивирования (от нескольких часов
до нескольких недель) определяется типом клеток.
В зависимости от фазы клеточного цикла проводят исследования хромосом в интерфазных ядрах, изучают профазные хромосомы (сперматоциты на
стадии пахитены), прометафазные хромосомы (высокий уровень разрешения
позволяет анализировать микроперестройки хромосом), метафазные хромосомы (ФГА-стимулиро-ванных лимфоцитов, клеток костного мозга, фибробластов кожи, эмбриональных и экстраэмбиональных тканей), изучают
стадию анафазы – телофазы (для регистрации специфического воздействия
различных мутагенов).
Для остановки деления клеток на стадии метафазы применяют колхицин
или колцемид – реагенты, вызывающие разрушение нитей веретена деления.
Для накопления достаточного количества метафаз достаточно 1,5–3 часа взаимодействия с колхицином. Полученный материал затем фиксируют. Чаще
всего используют фиксатор Кларка, состоящий из этилового спирта и ледяной уксусной кислоты. Полученную суспензию раскапывают на чистые
76
охлажденные предметные стекла, которые затем высушивают над пламенем
спиртовки. Полученные препараты зашифровывают. Для дополнительного
контрастирования клеток используют различные красители: краситель Гимза,
гематоксилин Эрлиха и другие.
Широко применяются в цитогенетических исследованиях хромосомы
растительных клеток. Для анализа используют временные или постоянные
препараты, приготовленные из растительных тканей с интенсивным клеточным делением. Чаще всего используется меристематическая зона первичных
или вторичных корешков, либо зона роста листьев.
Предварительная обработка растений заключается в накоплении максимального числа клеток на стадии метафазы митоза. Обработка включает в себя два основных этапа: 1. Парасинхронизация клеток (например, с помощью
ингибитора синтеза ДНК типа 5-ами-ноурацила). В результате действия 5-АУ
резко замедляется прохождение клетками S-фазы. Поэтому, если растения
обработать 5-АУ в течение времени, соответствующего времени клеточного
цикла, то практически все делящиеся клетки будут находиться в стадии синтеза ДНК. После снятия блокирующего действия 5-АУ (т. е. после отмыва
тканей от 5-АУ) клетки синхронно вступают в стадию G2 и в последующие
стадии митоза. 2. На втором этапе клетки обрабатывают веществами, блокирующими веретено деления (колхицин, колцемид). В результате происходит
накопление клеток на стадии метафазы.
Для изучения кариотипов мелких млекопитающих, как правило, используют клетки костного мозга. Существуют несколько методов приготовления
препаратов клеток костного мозга для проведения кариотипирования.
Наиболее успешно применяется метод Форда, который основан на введении
животному раствора колхицина определенной концентрации, взятии костного мозга, кратковременном его инкубировании в гипотоническом растворе,
фиксации и последующем раскапывании клеточной суспензии на предметные стекла. Кариотип лабораторной крысы представлен на рис.26.
77
Для изучения хромосом человека в клетках разных типов тканей применяются различные методики, как прямые (например, при изучении клеток
костного мозга), так и непрямые, связанные с длительным культивированием
клеток. Наиболее широко используется полумикрометод культивирования
лимфоцитов периферической крови человека [Hungеrfоrd Р. F., 1965]. В данном методе клетки крови помещаются в питательную среду, обогащенную
эмбриональной сывороткой крупного рогатого скота и ФГА (фитогемагглютинин - вытяжка из бобовых, способная стимулировать к делению клетки
крови, преимущественно, лимфоциты). Культивирование продолжается 48
или 72 часа при 37о С. После чего на 1,5-2 ч вводится колхицин, далее проводится гипотоническая обработка клеток и фиксация. Данные метод позволяет получать препараты хромосом высокого качества, достаточного для их
дальнейшего количественного анализа (рис.24).
78
Рис. 26. Схема стандартного кариотипа лабораторной крысы Rattus
norvegicus (иллюстрация: Дыбан, 1978)
79
4.4. Хромосомные аберрации
Большинство диплоидных организмов содержат два гаплоидных набора хромосом. Однако достаточно часто наблюдается изменчивость по числу
и структуре хромосом. Такие изменения, в отличие от генных мутаций,
называются хромосомными мутациями или хромосомными аберрациями.
Хромосомные аномалии подразделяют на геномные и структурные. Первые
связаны с изменением числа хромосом, а вторые – их структуры.
Геномные мутации
Изменения числа хромосом могут быть связаны:
1) с изменением числа гаплоидных наборов хромосом (полиплоидия);
2) с изменением числа отдельных хромосом (анеуплоидия);
3) с изменением числа хромосом, связанным с появлением в кариотипе сверхкомплектых или В-хромосом.
Если в клетках имеется одна или более добавочных хромосом или же
отсутствует одна или несколько хромосом, то имеет место так называемая
анеуплоидия. Она может быть представлена следующими видами мутаций:
– трисомия (2n+1) – наличие дополнительной гомологичной
хромосомы. Наиболее известные примеры эффектов трисомий у
человека – это болезни Дауна (+21), Патау (+13), Эдвардса
(+18). Известны случаи множественных трисомий, обусловленные сочетанием трисомий по нескольким хромосома (2n+1+1);
– полисомия (крайне редкая для аутосом форма анеуплоидии) –
увеличение числа в пределах одной пары гомологичных хромосом, характерна для системы половых хромосом, например,
трисомия половых хромосом- 47,ХХХ, тетрасомия 48,ХХХХ,
пентасомия – 49,ХХХХХ, дисомия У-хромосомы – 47,ХУ;
80
– моносомия (2n-1) – отсутствие одной из гомологичных хромосом. Моносомия по аутосомам является летальной. Организмы
с кариотипом 45,ХО демонстрируют фенотип синдрома Шерешевского-Тернера;
– нуллисомия – (2n-2) – отсутствие обеих гомологичных хромосом. Обычно отсутствие обоих гомологов приводит в гибели
соматических клеток, поэтому при стандартном кариотипировании нуллисомия практически не встречается.
Добавочные или В-хромосомы. У ряда видов наряду с хромосомами
основного набора обнаружены добавочные, сверх комплектных хромосомы (В-хромосомы). Впервые они были описаны в 1908 году. Вхромосомы обнаружены у 510 видов двудольных растений и у 1007 видов однодольных. Из 263 видов животных, у которых найдены Вхромосомы, более 40 % составляют насекомые. Число В-хромосом у
разных особей сильно варьирует, в большинстве случаев встречается
1–2 хромосомы, редко до 6, иногда их число доходит до 12.
В-хромосомы имеют ряд особенностей:
o они могут присутствовать или отсутствовать в пределах вида;
o число В-хромосом может варьировать в разных клетках и тканях одного организма;
o В-хромосомы не наследуются по Менделю;
o генетический эффект В-хромосом имеет полигенную структуру (при малом числе они фенотипически не проявляются);
o В-хромосомы изменяют ядерный фенотип, влияя на активность генов, клеточный цикл и на поведение основных хромосом набора;
o у 60% видов В-хромосомы являются полностью гетерохроматиновыми, а у других видов в В-хромосомах могут встречаться и эухроматиновые блоки.
81
По мнению многих ученых, В-хромосомы возникли из А-хромосом: 1) в результате гибридизации разных видов; 2) в результате нерасхождения некоторых А-хромосом и возникновения трисомии.
Обычно диплоидные клетки – эуплоидные, т. е. содержат два полных
набора хромосом. Полиплоидные клетки имеет более двух гаплоидных
наборов: три – триплоидные, четыре – тетраплоидные и т.д. Полиплоидия
вызывает глубокие и разносторонние изменения признаков и свойств организма. Полиплоидные клетки, как правило, значительно крупнее гаплоидных, что часто приводит к увеличению отдельных органов и самих полиплоидных организмов. Например, у растений увеличиваются цветки, листья,
плоды, пыльцевые зерна. Полиплоидия сыграла значительную роль в эволюции растительного мира. Многие культурные растения представлены полиплоидами, например, пшеница, томаты, картофель, хлопчатник.
У животных связь между полиплоидией и размерами сложнее, но и здесь
нередко наблюдается такая зависимость. У полиплоидов изменяются физиологические процессы, возрастает энергия жизнедеятельности и повышается
изменчивость.
У человека изменения числа хромосом на уровне гаплоидного набора
ограничиваются триплоидией (3n=69), которые могут иметь отцовское или
материнское происхождение. При этом кариотип 69, ХУУ летален, в то время как триплоидия 69,ХХХ вполне совместима с живорождением.
Если геномная мутация присутствует во всех клетках организма, её называют истинной или полной формой. Если мутация определяется только в
отдельных клетках, то говорят о мозаицизме хромосом или мозаичной форме гетероплоидии.
Однородительская дисомия – недавно описанный у человека тип хромосомных аномалий. В этом случае кариотип представлен нормальным диплоидным числом хромосом, однако одна пара гомологов представлена
хромосомами только одного из родителей (только материскими –updmat или
82
только отцовскими – uptpat). При этом возможна ситуация, когда в кариотипе присутствуют оба гомолога от одного родителя – гетеродисомия, либо
удвоенной оказывается одна из гомологичных хромосом – изодисомия.
Структурные хромосомные перестройки
Все хромосомные аберрации, регистрируемые на стадии метафазы, в
зависимости от времени вовлечения хромосомы в перестройку, разделяют на
два класса: хромосомные и хроматидные. Хромосомные перестройки возникают в стадии G1, когда хромосома реагирует как однонитчатая структура.
Как правило, в метафазе они выглядят как парные аберрации. Аберрации
хроматидного типа отражают повреждение хромосомы на стадии её двух нитей, т. е. в фазе S и G2. Поэтому они проявляются в метафазе в виде одиночных фрагментов.
Аберрации хромосомного типа
Цитологически можно различить 7 видов хромосомных аберраций (рис.
27).
1. Ацентрические фрагменты (терминальные делеции) –представляют
собой спаренные хроматиды, которые располагаются параллельно друг другу, но не имеют центромеры.
2. Малые фрагменты (интерстициальные, изодиаметрические делеции)
спаренные хроматиды меньшего размера, чем ацентрические фрагменты,
имеющие характерный вид спаренных хроматиновых шариков.
3. Ацентрические кольца – спаренные хроматиды в форме кольца, не
содержащие центромеры. Различия между малыми фрагментами и кольцами
часто бывают произвольными, так как они основаны лишь на длине не достигающего интерстициального участка хромосомы.
4. Центрические кольца – спаренные хроматиды в виде кольца, имеющие центромеру.
83
Рис. 27. Схема основных видов хромосомных аберраций:
(иллюстрация: А. Ф. Захаров, 1982)
А – ацентрические фрагменты;
Б – малые фрагменты;
В – ацентрические кольца;
Г– центрические кольца;
Д – перицентрические инверсии;
Е – симметричные межхромосомные обмены (реципрокные транслокации);
Ж – ассиметричные межхромосомные обмены (дицентрические хромосомы, полицентрические хромосомы)
84
5. Перицентрические инверсии – результат инверсии сегмента, содержащего одну центромеру, с последующим его включением в ту же хромосому.
6. Симметричные межхромосомные обмены (реципрокные транслокации) – аберрации, возникающие в результате взаимного обмена между двумя
хромосомами дистальными ацентрическими участками.
7. Асимметричные межхромосомные обмены (дицентрические, полицентрические аберрации). Возникают в результате обмена между двумя или
не скольким хромосомами, происходят таким образом, что проксимальные
участки хромосом соединяются, образуя дицентрическую или полицентрическую структуру с сопутствующим ацентрическим пробелом.
Аберрации хроматидного типа представлены на рисунке 28.
Одиночные фрагменты (хроматидные разрывы). В основе образования
этих аберраций находится повреждение одной хроматиды. Хроматидные
фрагменты, малоудалённые от места повреждения, приходится довольно часто дифференцировать от так называемых ахроматических пробелов, представляющих собой неокрашенные участки хромосом (участки локальной
деспирализации хромосом). Согласно наиболее строгим критериям, о фрагментах говорят в трёх ситуациях: когда фрагмент сдвинут под углом, по
длине, перевёрнут или сдвинут по оси. Величина неокрашенного участка не
является доказательством фрагментации.
Обмены хроматидного происхождения крайне многообразны. Они могут быть между хроматидами одной хромосомы, двух и более хромосом.
Кроме того, различают полные и неполные, симметричные и асимметричные
обмены. Всё это создаёт возможность образования большого числа форм обменов. Структура обмена зависит от величины обмениваемых участков, гомологичности хромосом, идентичности плеч, симметричности и полноты
(реципрокности) обмена.
85
Рис. 28. Схема основных видов хроматидных аберраций
(иллюстрация: А. Ф. Захаров, 1982)
Согласно другой классификации, аберрации хромосом можно классифицировать на межхромосомные и внутрихромосомные перестройки.
Межхромосомные перестройки. К межхромосомным перестройкам
относятся транслокации, т. е. перемещение генетического материала между
хромосомами. Транслокации подразделяются на следующие типы:
– реципрокные транслокации (rcp) – взаимный обмен, т. е. обмен фрагментами между двумя (реже – тремя или более) негомологичными хромосомами – не сопровождаются изменениями числа хромосом – не сопровождаются изменением
числа хромосом и дисбалансом генетического материала;
86
– нереципрокные транслокации – обмен хромосомными фрагментами, обычно приводящий к несбалансированному кариотипу;
– робертсоновские транслокации (rob) или центрические слияния хромосом – воссоединение плеч двух акроцентрических
хромосом в околоцентромерных районах. При этом число
хромосом в кариотипе уменьшается на одну, так как обычно
одна из центромер и короткие плечи двух акроцентриков с
локализованными в них ядрышкообразующими районами
утрачиваются.
Наконец, в качестве варианта межхромосомых перестроек можно рассматривать инсерцию (ins) – перемещение фрагмента одной хромосомы
внутрь другой.
Внутрихромосомные перестройки представлены несколькими типами:
– пробелы (g) (ахроматические или неокрашенные области) и
разрывы могут быть хромосомными и хроматидными;
– делеция (del) – утрата части хромосомы (концевые и интерстициальные);
– дупликация (dup) – удвоение части хромосомы;
– инверсия (inv) – переворот фрагмента хромосомы на 180о, не
включающего область центромеры (парацентрическая инверсия), или с вовлечением центромеры (перицентрическая инверсия);
– изохромосома (i) – метацентрическая (моно- и дицентрическая
idic) хромосома с генетически идентичными плечами (то есть
удвоенными только длинными или короткими плечами);
87
– кольцевые хромосомы (r) – представляют собой одиночные,
реже – двойные замкнутые кольца с одной или двумя центромерами (моно- и дицентрическими, соответственно);
– хромосомными фрагментами (fr) и маркерными хромосомами
(mar) обозначают сверхчисленные производные хромосом:
мелкие ацентрические (ace) (т. е. не содержащие центромеру) или содержащие 1–2 центромеры. Маркерные хромосомы могут быть результатом как внутри-, так и межхромосомных перестроек. Для их идентификации используются
различные цитогенетические методы. Особенно информативными являются различные варианты FISH.
Учет уровня хромосомных аберраций (ХА) у здоровых доноров используется как для оценки спонтанного мутагенеза, так и для анализа генотоксических эффектов воздействия различных мутагенов естественного и антропогенного происхождения. Для оценки индивидуального уровня ХА наиболее
адекватным является проведение анализа в 1000 метафазных пластинок. Однако при проведении групповых (популяционных) оценок часто бывает достаточно проанализировать 200–300 клеток. Уровень ХА рассчитывается как
процент клеток, содержащих аберрации.
Анализ хромосомных нарушений получил большое распространение в
практике медико-генетического консультирования, в диагностике онкологических заболеваний, в генетико-эпидемиологи-ческих исследованиях. Для
широкого спектра болезней отмечены специфические числовые или структурные аномалии, которые используются в диагностических и прогностических целях.
Например, обнаружение
в кариотипе дополнительной 21 хромосомы
служит маркером синдрома Дауна, дополнительной 18 – синдрома Эдвардса.
Выявление делеции короткого плеча 5 хромосомы указывает на синдром
«кошачьего крика». Обнаружение специфической «филадельфийской» хро88
мосомы, возникающей в результате транслокации между 9 и 22 хромосомами, позволяет точно установить диагноз – миелоцитарный лейкоз (рис. 29).
Рис. 29. Хромосомный набор женщины, несущий филадельфийскую хромосому t(9; 22)
Хромосомные аберрации обнаруживаются не только у больных, но и у
здоровых доноров (со значительно меньшей частотой). Повреждения хромосом возникают спонтанно (в силу эндогенных причин), либо в результате
воздействия мутагенов: физических (излучения, радиация), химических, биологических (например, вирусов).
89
В качестве мутагенных для человека факторов рассматривают: радиацию,
различные химические, в том числе и лекарственные препараты (антифолиевые препараты, цитостатики), эндогенные
факторы (аутоиммунный тиреоидит и диабет), стресс, инфекционные агенты.
С химическими мутагенами человек чаще всего сталкивается в производственных условиях, при утечке токсичных соединений с хранилищ, в результате аварий. Воздействие радиации испытали
на себе ликвидаторы аварии
на Чернобыльской АЭС, жители регионов, над которыми проходило радиоактивное облако, жители территорий, на которых проводились испытания
ядерного оружия. Специфическим маркером лучевого воздействия является
появление дицентрических и кольцевых хромосом. Биологические (инфекционные) агенты вызывают значительное повышение уровня аберрантных метафаз в период эпидемий или при вакцинации населения.
Рассмотрим принципы учета хромосомных аберраций на стадии метафазы
и общие рекомендации к нему.
 При проведении анализа возможны два подхода к учету хромосомных
аберраций:
с кариотипированием метафазной пластинки и без кариоти-
пирования. Первый подход наиболее точен, но он трудоёмок и может
быть применен в специальных исследованиях (например, при изучении
распределения повреждений по группам хромосом, по длине отдельных
хромосом). Второй подход наиболее употребителен, применяется, например, при оценке мутагенности факторов внешней среды. Для точного анализа ХА необходимо учитывать следующие требования к исследуемым
клеткам (Бочков Н. П., 1971):
 все хромосомы должны быть хорошо прокрашены и равномерно разбросаны;
 не допускается наличие нескольких случайных хромосом в поле зрения;
90
 не допускается наличие в метафазных пластинках хромосом, вошедших в анафазу, т. к. их трудно отдиффиренцировать от парных фрагментов;
 не допускается анализ метафазных пластинок с большим количеством
наложений хромосом, особенно продольных, т. к. в таких случаях
можно определить большее количество обменных аберраций, чем
имеется в действительности;
 из-за технических манипуляций возможны потери хромосом в пластинке. Обычно при учете ХА допускается анализ клеток с числом
хромосом от 44 до 47.
Данные цитогенетических исследований заносят в специальные бланкипротоколы, где отмечают число хромосом, общее число проанализированных
клеток, число клеток с аберрациями, общее число аберраций, а также зарисовки аберраций и их координаты.
91
ГЛАВА 5. ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЕ ОКРАШИВАНИЕ
ХРОМОСОМ
5.1. Основные принципы и виды дифференциального
окрашивания
Современные цитогенетические методы позволяют идентифицировать
по морфологии все пары хромосом на препарате, выявлять гетерохроматиновые участки, сестринские хроматидные обмены, оценивать индивидуальную
геномную дозу рибосомных генов и др. Достигается это сравнительно простыми температурно-солевыми воздействиями на фиксированные хромосомы. Важнейшими красителями для анализа дифференциации хромосом по
длине являются краситель Гимза и флуорохромы. Краситель Гимза представляет собой сложную смесь трех красок: метиленового синего, азура и
эозина, являющихся трициклическими соединениями без боковых цепей.
Анализ процесса окрашивания показал, что компоненты красителя связываются исключительно с ДНК хромосомы. В процессе рутинного окрашивания
препаратов хромосом 3–5%-ным раствором красителя Гимза получают равномерно окрашенные хромосомы. Для достижения дифференциального
окрашивания хромосом вдоль их длины используют предобработку препаратов раствором трипсина или же проводят окрашивание свежеприготовленных
препаратов (или хранившихся при комнатной температуре не более 10 дней).
G-окраска позволяет выявлять структурную неоднородность хромосом вдоль
их длины, дает возможность идентифицировать хромосомы и их отдельные
сегменты (рис. 30).
92
Рис. 30. Схематическое изображение (слева) и морфология хромосом, дифференциально окрашенных по G-методу (справа), с различной степенью конденсации (иллюстрация: С. Г. Ворсанова с соавт., 2006)
Каждой паре хромосом присущ свой определенный рисунок-banding
(чередование светлых и темных полос). В мелких хромосомах рисунок образуется единичными сегментами, в крупных хромосомах сегментов много.
Общее для нормального хромосомного набора число окрашенных и неокрашенных сегментов в метафазе составляет 400. В прометафазных хромосомах
оно увеличивается до 850 и более.
Индивидуальная совокупность сегментов, отличающихся по ширине и
интенсивности окрашивания, образует цитологическую карту хромосом. На
международных совещаниях по номенклатуре в цитогенетике была разработана и введена в практику система
обозначения сегментов нормальных хромосом и хромосом, подвергшихся
структурным изменениям. Цитологические карты имели исключительное
93
значение для развития медицинской генетики человека, т. к. их стандартизация позволила проводить описание хромосом с указанием точного места локализации каких-либо хромосомных нарушений при различных наследственных болезнях.
Рисунок хромосом при R-окраске противоположен рисунку G-окраски,
что делает его незаменимым для анализа некоторых типов аберраций, особенно для идентификации ломкой Х-хромосомы. Метод состоит в предварительной инкубации препаратов в фосфатном буфере Соренсена в условиях
контролируемой температуры 85–87ОС. Температуру и время инкубации
необходимо подбирать для каждой партии препаратов эмпирически. Режим
термической обработки, рН среды, концентрация ионов, продолжительность
инкубации имеет большое значение при данном методе. Вариантом
R-
окраски является Т-окраска. При этом варианте окрашиваются теломерные
сегменты хромосом, которые образованы многократно повторенными (несколько тысяч раз) простыми фрагментами ТТАGGG.
Для получения Q-окраски (метод QFQ) используют акрихин и его производные (атебрин, акрихин-иприн, акрихин-пропил). При исследовании
окрашенных хромосом с помощью флюоресцентного микроскопа по длине
хромосомы выявляются сегменты разной степени флюоресцентного свечения. Локализация и степень этого свечения в индивидуальных хромосомах
достаточно стабильна. В отечественных лабораториях этот метод чаще всего
используют при анализе У-хроматина в ядрах буккального эпителия. Значительно превосходит акрихин по яркости флуорохром Hoechst 33258 (метод
QFH), который в сочетании с контрастированием актиномицином D дает
очень четкую и стабильную картину дифференциальной окраски, пригодной
для широкого применения в клинической цитогенетике.
Таким образом, используя данные методы возможно выявление индивидуального рисунка плеч каждой хромосом. Выявляющиеся участки обозначаются в зависимости от типа окраски G, Q, R-сегментами, а поперечная
94
исчерченность хромосом соответственно G, Q, R-рисунком. Q и G- рисунки
идентичны, а R (reverse) им комплементарен. G+-сегменты богаты ATнуклеотидами и содержат сравнительно мало генов. Преимущественно в этих
участках находятся гены, отвечающие за тканевую дифференцировку клеток.
R-сегменты обогащены GC- парами оснований ДНК. В них сосредоточено
основное число генов, в том числе важнейшие гены «домашнего хозяйства».
Аg-метод окраски предназначен для выявления ядрышкообразующих
районов (ЯОР) хромосом, которые были активны в предшествующей митозу
интерфазе. ЯОР у человека расположены в коротких плечах 13, 14, 15, 21, 22
пар хромосом и представлены кластерами рибосомных генов (рис. 31).
Рис. 31. Ядрышкообразующие районы хромосом человека
95
Общее число копий рибосомных генов в геноме человека составляет
около 400, соответственно в каждом из десяти ЯОР хромосом содержится
около 40 повторяющихся кластеров. Эти кластеры расположены по акроцентрическим хромосомам весьма неравномерно. Более того, уровень экспрессии отдельных ЯОР может не соответствовать количеству содержащихся в
них рибосомных генов. Эти различия в числе р-генов и их функциональной
активности определяют межхромосомный полиморфизм ЯОР. Установлено,
что рисунок окрашивания ЯОР ионами серебра наследуется в поколениях как
независимый менделирующий признак. Было предложено рассматривать 10
полиморфных AgЯОР как характеристический признак кариотипа индивида
(Ляпунова Н. А., 1988). Показано, что визуальный полуколичественный метод
определения размеров AgЯОР метафазных хромосом возможно использовать
для сравнения геномов человека по количеству активных (работающих) генов рРНК (Ляпунова Н. А., 2001). В последние годы стали появляться работы, в которых рассматривается вклад рибосомных генов в формирование кариотипа индивида. В работах, выполненных на классическом объекте генетических исследований – плодовой мушке дрозофиле, было показано, что
геномная доза рибосомных генов, определяя потенциальные возможности
общей интенсивности синтеза белков в клетке, имеет фенотипическое проявление в развитии количественных признаков. В последние годы такие данные появились и для человека (Ляпунова Н. А. [и др.], 2000; Воронина В. Н.,
2001).
Значительные изменения функционального состояния ЯОР обнаружены у больных с различными злокачественными новообразованиями. Первое
систематическое описание злокачественных новообразований, проведенное с
применением Аg-окрашивания позволило обнаружить значительно большее
содержание Аg-позитив-ных ЯОР в высоко злокачественных клетках НеХоджкинской лимфомы по сравнению с клетками Не-Ходжкинской лимфомы низкой степени злокачественности (Crocker J., Nаr P., 1987). В этой связи
96
цитохимическая реакция с нитратом серебра рекомендована в качестве лабораторного дифференциально-диагностического теста при злокачественных
новообразованиях.
СХО-метод. Во время репликации ДНК сестринские хроматиды обмениваются участками. В этом можно убедиться с помощью специального метода выявления сестринских хроматидных обменов (СХО). Выявление СХО
основано на
использовании аналога тимидина – 5-бромдезоксиуридина
(БДУ). Включившие его вместо тимидина участки хромосом окрашиваются
значительно слабее. После окрашивания наблюдается следующая картина:
хроматида, ДНК которой имеет БДУ в одной цепи, выглядит ярко светящейся, а хроматида, ДНК которой имеет БДУ в обеих нитях, выглядит бледно
(рис. 32).
Рис. 32. Сестринские хроматидные обмены в хромосомном наборе человека
(иллюстрация: А. Ф. Захаров [и др.], 1982)
97
Исследуются метафазы второго митоза. Их легко можно отличить по
хроматидам, имеющим на всём протяжении контрастную окраску от метафаз
первого
(обе хроматиды тёмные) и третьего (обе хроматиды некоторых
хромосом имеют светлые гомологичные участки ) митозов.
О природе СХО, высказываются самые различные предположения. Вот
основные из них:
1) СХО – следствие двухцепочечных обменов между двумя идентичными молекулами ДНК в гомологичных локусах, которые генетически не проявляются;
2) результат репарации ДНК;
3) следствие соматической рекомбинации;
4) следствие ошибки при нормальной репликации ДНК, либо репликации «в обход» сшивок нитей родительской ДНК;
5) результат процесса, приводящего к амплификации или увеличению
разнообразия генов (Паткин и др., 1993).
Но ни одна из предложенных моделей молекулярных механизмов образования СХО не в состоянии объяснить всю их феноменологию.
Количество СХО в клеточных культурах человека часто используют в
качестве индикатора мутагенности среды: чем больше межхроматидных обменов, тем она выше. B.Lambert с соавторами (1984) выделили три основные
группы факторов, влияющие на уровень спонтанных обменов. Это методические факторы, физиологические (скорость пролиферации культуры клеток и
т. д.) и факторы внешней среды (курение, употребление наркотиков, приём
противоопухолевых препаратов, производственные вредности).
Изучался вопрос о влиянии пола на уровень СХО (Лазутка, Дедоните,
1989). Обнаружено, что средняя частота СХО выше у женщин, чем у мужчин
того же возраста. Установлено увеличение уровня СХО с возрастом донора: у
молодых она равна 11,94 , у пожилых – 14,22 , в глубокой старости – 15,93 , а
98
у долгожителей увеличивается до 16,40 (Кузнецова, Зарицкая, 1986). F. Sarto
и др. (1985) также отмечает увеличение числа СХО с возрастом. Это явление
некоторыми исследователями объясняется увеличением мутагенных воздействий на клетки человека в течение его жизни (Полищук, Несина, 1990).
С-метод выявления структурного гетерохроматина. Структурный гетерохроматин – это специфические участки хромосом, ДНК которых сформирована кластерами высоко- и среднеповторяющихся, нетранскибируемых
нуклеотидов. Обязательным свойством гетерохроматина (gh) является конденсированное состояние на протяжении всего клеточного цикла, поздняя
репликация входящей в него ДНК и положительная окрашиваемость Сметодом. Наиболее крупные блоки гетерохроматина расположены в прицентромерных областях 1-ой, 9,16 хромосомах, а также в дистальной части
длинного плеча У-хромосомы (рис. 33).
Существует широкий полиморфизм индивидуальных вариантов размеров структурного гетерохроматина. Согласно рекомендациями Парижской
комиссии по стандартизации исследований хромосом человека (1975 г.),
приняты качественные критерии оценки С-сегментов: 1, 4 и 5 баллов соответствуют экстремальным вариантам (рис. 34).
Рис. 33. Хромосомы человека, окрашенные С-методом
99
Рис. 34. Экстремальный вариант гетерохроматина в виде увеличения (1,Б) и
уменьшения (Y,Б) блока в сравнении с нормой (1,А; 2,А)
(иллюстрация: А. Ф. Захаров и др., 1982)
Соответственно, 2 и 3 балла – это «норма». К экстремальным вариантам
также относят перицентрические инверсии гетерохроматинового блока. Установлено, что распределение размеров гетерохроматических сегментов соответствует нормальному, когда 80–90 % вариантов приходится на средние
размеры и лишь 10–20 % – на очень крупные или очень мелкие блоки гетерохроматина.
Биологическая роль гетерохроматических районов к настоящему времени до конца не выяснена. Полагают, что он играет роль «телохранителя»,
образуя на внутренней поверхности оболочки ядра своеобразный «щит», защищающий жизненно важные участки хромосом, несущие транскрибируемые гены; обеспечивает строгую структурированность хромосом и упорядоченность их расположения в ядре на разных этапах жизненного цикла
клетки; оказывает влияние на экспрессию окружающих генов (гипотеза об
«эффекте положения гена»); обеспечивает адаптационные свойства человека к некоторым экстремальным факторам среды (холоду, гипоксии, радиоактивным веществам, ксенобиотикам и т. д.). Установлена высокая чувствительность gh-районов к мутагенным воздействиям (спонтанным и индуцированным). В связи с этим носители экстремальных вариантов gh входят в
группу повышенного токсико-генетического риска.
100
5.2. Полиморфизм хромосом человека
Под полиморфизмом хромосом понимают нормальную изменчивость
хромосом набора, которая заключается в различиях между гомологичными хромосомами по отдельным сегментам, районам и даже целым
плечам (Баранов, 2007). Полиморфные варианты наследуются в соответствии с законами Менделя и сохраняются неизменными в процессе
онтогенеза. Большое число различных вариантов полиморфизма приводит к уникальности кариотипа каждого человека, за исключением монозиготных близнецов. Для учета полиморфных вариантов существует
специальная система символов
(таблица 6). Иногда гетерогенность
прицентромерных районов, например, на хромосомах 3, 4, выявляется
лишь при люминесцентных вариантах окрашивания (QFQ
QFH,
DAPI). Некоторые варианты хромосом, например 17ps, наблюдаемые на
окрашенных красителем Гимза препаратах, не будут зарегистрированы
при окрашивании флуорохромами.
Подробно особенности полиморфизма хромосом человека рассматриваются в монографии А.А. Прокофьевой – Бельговской «Гетерохроматические районы хромосом» (1986), а также в атласе хромосом человека
(Захаров А. Ф. [и др.], 1982).
101
Таблица 6
Перечень символов, употребляемых при описании
полиморфных вариантов хромосом человека (ISCN, 2005*)
1.Полиморфные размеры гетерохроматиновых сегментов,
спутничных нитей и спутников
9gh+
Увеличенный гетерохроматиновый блок на длинном плече хромосомы 9
YghУменьшенный гетерохроматиновый блок на длинном плече Yхромосомы
21ps+
Увеличенные спутники на коротком плече хромосомы 21
22pstk+
Удлиненные спутничные нити на коротком плече хромосомы 22
15cenh+
Увеличенный блок прицентромерного гетерохроматина на хромосоме 15
1gh-, 13cenh+, 22ps+
Уменьшенный гетерохроматиновый блок на 1 хромосоме, увеличенный прицентромерный хроматин на 13 хромосоме, увеличенные спутники на коротком плече хромосомы 22
15cenh+mat, 15s+pat
Увеличенный прицентромерный гетерохроматиновый блок на
хромосоме 15, унаследованной от матери, и увеличенные спутники на хромосоме 15, унаследованной от отца
14сenh+pstk+ps+
Увеличенный блок прицентромерного гетерохроматина, длинные
спутничные нити и увеличенные спутники на коротком плече
хромосомы 14
2. Полиморфная локализация гетерохроматиновых сегментов, спутничных нитей и
спутников
17ps
Cпутники локализованы на коротком плече хромосомы 17
Yqs
Спутники локализованы на длинном плече Y-хромосомы
9ghph
Локализация прицентромерного гетерохроматинового блока на
коротком и длинном плечах хромосомы 9
9ph
Гетерохроматиновый блокприсутствует только на коротком плече
хромосомы 9
1q41
Гетерохроматиновый блок локализован в сегменте 1q41
3. Полиморфизм числа спутников и спутничных нитей
21pss
Двойные спутники на коротком плече хромосомы 21
14 pstkstk
Двойные спутничные нити на коротком плече хромосомы 14
*ISCN – An international systems for human Cytogenetic nomenclature
102
ГЛАВА 6. МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ЦИТОГЕНЕТИКИ
К методам молекулярного кариотипирования можно отнести различные
варианты неизотопной гибридизации in situ (FISH) c хромосом- и локусспецифичными ДНК-зондами, методы спектрального кариотипирования
(SKY), сравнительной геномной гибридизации (CGH), рестрикции и никтрансляции и другие. Использование этих методов позволяет проводить как
общий, так и селективный анализ кариотипа и индивидуальных хромосом,
идентифицировать численные и структурные аномалии. Для снижениия трудоёмкости кариотипирования разработаны автоматические системы анализа
изображений с соответствующим программным обеспечением.
Флуоресцентная гибридизация in situ. Метод гибридизации in situ основан на способности хромосомной ДНК образовывать устойчивые гибридные
молекулы с ДНК(РНК)-зондами непосредственно на препаратах фиксированных хромосом и интерфазных ядер. С помощью этого метода можно определить точное местоположение практически любой последовательности ДНК
или РНК непосредственно в клетке, клеточном ядре или на хромосомах.
Использование метода FISH в цитогенетической диагностике позволяет
идентифицировать структурные хромосомные перестройки, устанавливать
природу маркерных хромосом (приложение, рис. 7), проводить анализ численных нарушений хромосомного набора, как на метафазных хромосомах,
так и в интерфазных ядрах. Комбинация различно модифицированных проб,
выявляемых с помощью разных систем детекции, позволяет одновременно
определять местоположение двух и более последовательностей ДНК в одном
интерфазном ядре или на одной метафазной пластинке. В настоящее время
для удобства исследователей разработаны коммерческие наборы зондов и
реактивов для FISH, которые используются при диагностике наиболее частых численных и структурных аберраций хромосом.
103
Согласно классической схеме проведения неизотопной гибридизации
ДНК-ДНК in situ методики FISH включают приготовление ДНК-зондов, прегибридизационную обработку препаратов, проведение реакции гибридизации, постгибридизационные отмывки, детекцию гибридных молекул, окраску
и заключение препаратов.
CISS-гибридизация (chromosomal in situ suppression hybridization) –
метод FISH с супрессией гибридизации диспергированных повторов – используется для выявления крупных протяженных участков хромосом. В составе ДНК-проб для идентификации таких участков находятся последовательности, гомологичные диспергированным повторам. Для подавления их
гибридизации с ДНК цитологического препарата перед проведением FISH
денатурированная ДНК-проба отжигается с 50–100 кратным избытком немеченой Cot1 ДНК (фракция высокоповторенной ДНК) и благодаря этому
выводится из процесса гибридизации с ДНК хромосом или интерфазных
ядер. Этот методический прием позволяет использовать ДНК пробы, созданные на основе хромосомо- и районоспецифичных ДНК-клонотек, огромных фрагментов геномной ДНК, клонированных в дрожжевых (YAC), бактериальных (BAC) и вирусных (PAC) векторах (Verma, Babu, 1994).
В основе многоцветной FISH лежит комбинаторное мечение, при котором ДНК-зонд метится не одним, а комбинацией флуорохромов, и проводится регистрация для всех точек изображения интенсивности свечения всех
флуорохромов. Например, при использовании всего 5 разных флуорохромов
(FITC, Spectrum Orang, TexRed, Cy5, DEAC) возможно получить 24псевдоцвета, окрашивающих каждую пару гомологичных хромосом в индивидуальный цвет. Такие хромосомоспецифичные пробы в английской литературе получили название «цельнохромосомных красителей» (whole chromosome paints) или сокращенно WСP. Детекция результатов такой 24-цветной
FISH может проводится, например, путем последовательной раздельной регистрации
сигналов флуорохромов через различные эпифлуоресцентные
104
фильтры с итоговой компьютерной обработкой микроизображений (multicolor, multifluor или multiplex FISH). Обычно все изображения записываются в отдельные файлы, что позволяет проводить их эффективную обработку,
связанную с разделением сигнала и фона, а также количественной оценкой
сигнала. Обработка всей записанной информации с помощью специального
программного обеспечения переводит информацию об уровне сигналов флуорохромов в каждой точке изображения в псевдоцвета.
Альтернативное технической решение было использовано при разработке
спектрального кариотипирования (spectral karyotyping- SKY). При этом методе используются флюоресцентные красители, имеющие сродство к определенным участкам хромосом. При использовании набора специфичных зондов
с разными красителями каждая пара хромосом имеет свои уникальные спектральные характеристики. Особенность метода – использование интерферометра, аналогичного, используемым для измерения спектра астрономических объектов. Незначительные вариации в спектральном составе, не различаемые человеческим глазом, учитываются при компьютерной обработке и
затем программа назначает каждой паре хромосом легко распознаваемые
цвета. Результат в виде цветного изображения чаще используется в цифровой
форме. В результате на экране компьютера каждая хромосома может быть
показана в индивидуальном, легко различимом глазом цвете. Специальная
программа производит автоматическую классификацию хромосом и обладает
мощными возможностями для редактирования, презентации результатов анализа и поддержания специализированной базы данных оптических образов.
RxFISH – метод многоцветного бэндинга хромосом (Mueller et al., 1998),
основаный на межвидовой in situ гибридизации. RxFISH позволяет идентифицировать внутрихромосомные перестройки (приложение, рис. 3–4). В качестве ДНК-проб были использованы WСP двух видов гиббонов: Hylobates
concolor и Hylobates syndactylus. В результате интенсивных хромосомных
перестроек, имевших место при формировании современных видов гиббонов,
105
материал их хромосом оказался сильно перетасованным в сравнении с организацией хромосом у человека, хромосомы которого известны своим консерватизмом. ДНК зонды, используемые в RXFISH, помечены комбинацией 3-х
флуорохромов, что обеспечивает 7 псевдоцветов. Они специфично окрашивают отдельные районы хромосом, создавая их цветную исчерченность. К
достоинствам RXFISH в настоящее время, несомненно, следует отнести следующие пункты:

Метод позволяет осуществлять анализ всего генома человека в одном
эксперименте многоцветной FISH.

Имеются в наличии коммерчески доступные наборы меченых ДНК
проб и необходимых систем детекции.

Метод позволяет проводить быструю идентификацию значительной
части внутри – и межхромосомных перестроек.

Возможна автоматическая идентификация метафазных хромосом
“цветного бэндинга”.

Для каждой хромосомы человека существует уникальный цветовой бар
код.

RXFISH интегрирован в рабочую станцию CytoVision и стандартные
системы флуоресцентной микроскопии.
К недостаткам RXFISH можно отнести большой размер многих цветных бэндов (невозможно проанализировать хромосомные перестройки внутри цветного бэнда). А такие хромосомы человека, как 15, 18, 19, 21, 22, X и Y представляют собой один цветной бэнд каждая. Использование в будущем большего числа флуорохромов и новых ДНК проб, полученных благодаря использованию искусственных хромосом или микродиссекции метафазных
хромосом, может значительно повысить разрешающие способности метода.
106
С новостями RXFISH можно ознакомиться на сайте фирмы “Applied Imaging”
(http://www.aii.co.uk/).
Сравнительная геномная гибридизация Comparative geno-mic hybridization (CGH) или Chromosomal Microarray Analysis (CMA) – это молекулярный метод анализа изменения числа копий (делеции или амплификации)
фрагментов ДНК, выделенной из анализируемого образца. Данный метод
эффективен даже в том случаев, если в распоряжении экспериментатора
находится лишь небольшой фрагмент фиксированного и хранящегося долгие
годы образца ткани или опухоли.
Суть метода CGH состоит в том, что из опухоли выделяют ДНК и метят её
определенным флюорохромом. ДНК, выделенную из нормальной ткани, метят другим флюорохромом. Хромосомные препараты приготавливают стандартным способом из лимфоцитов периферической крови контрольного индивида. Меченую ДНК из опухоли и неизменной ткани гибридизуют с хромосомным препаратом. По интенсивности свечения метки определяют область делеций и амплификаций. CGH позволяет оценивать и выявлять нарушения количественной представленности хромосомных районов размером не
менее 10Мb. Перспективным направлением развития CGH представляется
матриксная CGH (Matrix-CGH) (Solinas-Toldo et al., 1997). Ускорение проведение анализа, повышение его эффективности и уровня разрешения достигается полной автоматизацией процедур приготовления чипа и анализа результатов гибридизации (Lampel et al., 2000).
Многоцветный бэндинг
хромосом человека (multi color banding).
Данный метод предназначен для детального анализа отдельных хромосом. В
его основе лежит использование микродессекционных районоспецифичных
ДНК-клонотек, многоцветной FISH, цифровой видеозаписи микроизображений и их компьютерной обработки. Использование специальных программ
позволяет перевести в псевдоцвета не только комбинации флуорохромов, но
и соотношения их интенсивностей. Комплект ДНК-проб для индивидуальной
107
хромосомы представляет собой набор микродиссекционных ДНК-клонотек,
каждая из которых обеспечивает необходимый профиль интенсивности сигнала в пределах соответствующего хромосомного района. Уровень сигнала
каждой из микродиссекционных район-специфических ДНК-библиотек варьирует по интенсивности, достигая максимума в центре и постепенно падая
практически до нуля на его границах. Перекрывание профилей интенсивности сигналов ДНК проб обеспечивает вариации соотношений интенсивностей
флуоресценций различных флуорохромов вдоль хромосомы. Отношения интенсивностей может быть переведено в термины псевдоцвета, и таким образом, каждой точки изображения приписан свой псевдоцвет. В результате
программной обработки изображения каждому из хромосомных районов будет соответствовать свой псевдоцвет. Такой метод позволяет проводить анализ аномальных хромосом,
выявлять происхождение транслоцированных
участков, идентифицировать хромосомные районы, формирующие маркерную хромосому.
Микродиссекция метафазных хромосом и «обратная» FISH. Для анализа аномальных хромосом был разработан метод микродиссекции метафазных хромосом с последующей универсальной амплификацией ДНК изолированной хромосомы. В результате получают ДНК-клонотеку аномальной хромосомы, на её основе создают ДНК-пробы и проводят FISH с нормальными
хромосомами человека. Такой подход позволяет определять состав анализируемой хромосомы, описывая входящие в ее состав районы с точностью, достигающей уровня разрешения цитологического анализа прометафазных и
даже профазных хромосом (Рубцов 1996), а так же идентифицировать материал, формирующий гомогенно окрашиваемые хромосомные районы (Guan
[et al.], 1994, Rubtsov [et al.], 1995).
108
ГЛАВА 7. ПРИМЕНЕНИЕ КОМПЬЮТЕРНОЙ ТЕХНИКИ
В ЦИТОГЕНЕТИКЕ
Использование компьютерной техники при проведении цитогенетических исследований позволяет: избавить исследователя от рутинных операций
по поиску метафаз, их кариотипированию и архивированию данных; увеличить объем исследованных клеток и тем самым повысить точность результатов, увеличивает скорость и эффективность обработки и представления данных.
Для снижения трудоёмкости кариотипирования были разработаны автоматические системы поиска метафаз, системы кариотипирования, системы
визуализации флуоресцентных сигналов с соответствующим программным
обеспечением. Лидером в производстве подобного программного продукта
может считаться компания MetaSystems (Zeiss, Германия). Предлагаемая
данной фирмой система быстрого поиска метафаз MSearch, предназначенная для платформы сканирования Metafer, позволяет значительно увеличить эффективность повседневной работы и лабораторных исследований.
Функция автоматического сканирования в ночное время позволяет сэкономить рабочие часы для выполнения анализа. Программа позволяет обрабатывать до 8 препаратов за одну операцию поиска. Время сканирования среднестатистического препарата не превышает 6 минут. Обнаруженные метафазы
сохраняются в виде высококачественных изображений вместе с координатами. Обнаружение метафаз возможно как в светлом поле, так и в люминисценции. После выполнения сканирования для изменения положения любой метафазы достаточно щелкнуть мышью. Система Ikaros считается стандартом
для автоматического кариотипирования. Она полностью интегрируется с программой поиска метафаз Metafer MSearch и позволяет проводить быстрое и
простое кариотипирование хромосом человека, животных и растений. Возможно проведение сравнения нескольких (до шести) кариотипов на экране. В
109
процессе обработки изображений используются мощные средства, позволяющие за одно действие получать высококачественные изображения метафазной пластинки. Для визуализации FISH-сигналов была разработана система
Isis, позволяющая легко выполнять даже сложные FISH –анализы. Программа
дает возможность получать и обрабатывать высококачественные
цветные
изображения, содержащие до 9 различных флуорохромов, с хорошей воспроизводимостью и полным документированием.
Среди отечественных систем анализа изображений можно отметить аппаратно-программные комплексы ВидеоТесТ, состоящие из микроскопа, цифровой системы ввода изображений, компьютера и программного обеспечения. Комплекс ВидеоТесТ-Карио позволяет автоматизировать кариотипирование хромосом человека с различным типом дифференциальной окраски
(G, Q, R). Обладает высокой точностью распознавания хромосом человека.
Комплекс ВидеоТесТ-FISH позволяет получать качественные псевдоцветные изображения флуоресцентно меченых препаратов хромосом и клеток,
визуально анализировать положение и наличие ДНК (РНК), проводить измерения и сохранять информацию в базе данных. Комплекс ВидеоТесТCGH позволяет провести полный анализ структурных хромосомных аномалий всего генома в пределах одного эксперимента.
Безусловно, использование компьютерной техники не может заменить
знаний профессионального цитогенетика, т. к. любая программа будет давать сбой при малейшем отклонении от прописанного в ней «стандарта». Такие отклонения (наложения отдельных хромосом, варианты межиндивидуального полиморфизма дифференциальной окраски) встречаются довольно
часто и требуют внимательного анализа специалиста. В то же время проведение некоторых цитогенетических методов, например, таких как, SKY или
CGH в принципе невозможно без использования компьютерного анализа
данных.
110
Широкие возможности даёт использование компьютерной техники для
проведения точных измерений микроскопических объектов (клеток, ядер и
внутриядерных структур, хромосом). Изображение получают при помощи
цифровой фотокамеры с высоким разрешением, затем его переносят в компьютер и там измеряют с помощью специальных программ. Для проведения
анализа предварительно производят съемку масштабной линейки при данных условиях увеличения, чтобы впоследствии получать результаты в реальных единицах измерения (мкм).
111
ЛИТЕРАТУРА
1. Баранов, В. С. Цитогенетика эмбрионального развития человека /
В. С. Баранов, Т.В. Кузнецова. – СПб: Н-Л, 2007. – 640 с.
2. Бочков, Н. П. Хромосомы человека и облучение / Н. П. Бочков. – М.:
Атомиздат, 1971. – 168 с.
3. Бочков, Н. П. Клиническая генетика: учебник / Н. П. Бочков. – М.:
ГЭОТАР-МЕДИА, 2006. – 480 с.
4. Ворсанова, С. Г Медицинская цитогенетика: учебное пособие /
С. Г. Ворсанова., Ю. Б. Юров, В. Н Чернышев. – М.: Медпрактика,
2006. – 300 с.
5. Геномика – медицине / под ред. В. И. Иванова, Л. Л. Киселёва. – М.:
Академкнига, 2005. – С. 219–244.
6. Егорова, О. В. С Микроскопом на «ты». Шаг в XXI век. Световые микроскопы для биологии и медицины / О. В. Егорова. – М.: Репроцентр
М, 2006. – 416 с.
7. Жимулёв, И. Ф. Общая и молекулярная генетика: учебное пособие /
И. Ф. Жимулёв. – Новосибирск: Сибирское университетское издательство, 2003. – 479 с.
8. Хромосомы человека (Атлас) / А. Ф. Захаров [и др.]. – М.: Медицина,
1982. – 264 с.
9. Инфекционная кариопатология / И. Н. Ильинских [и др.]. – Томск: Издательство Томского университета, 2005. – 168 с.
10. Клаг, У. С. Основы генетики / У. С. Клаг, М. Р. Каммингс; пер. с англ.
А. А. Лушникова, С. М. Мусаткина. – М.: Техносфера, 2007. – 896 с.
11.Назаренко, С. А. Цитогенетика человека и хромосомные болезни /
С. А. Назаренко, Ю. С. Яковлева. – Томск: STT, 2001. – 83 с.
12.Смирнов, В. Г. Цитогенетика / В. Г. Смирнов. – М.: Высшая школа,
1991. – 247 с.
112
13.Шевченко, В. А. Генетика человека / В. А. Шевченко, Н. А. Топорнина, Н. С. Стволинская. – М.: Владос, 2002. – 240 с.
113
Приложение 1
Цитогенетические методы
Лабораторная работа № 1. Устройство светового микроскопа, методы
микроскопии и документации цитогенетического материала
Цель работы: изучить устройство микроскопа, методы подготовки микроскопа к работе, технику микроскопии и документации цитогенетического материала
Ход работы:
1. Необходимо познакомиться с устройством основных частей микроскопа. Разобраться с принципами их работы.
2. Освоить принципы юстировки микроскопа и технику микроскопии.
3. Изучить правила работы с микроскопом и принципы документации цитогенетического материала.
Лабораторная работа № 2. Определение полового хроматина
в буккальном эпителии
Цель работы: ознакомиться на практике с морфологическим выявлением полового хроматина и усвоить значение этого простого анализа в медикогенетическом консультировании.
Ход работы:
1. Половой хроматин изучают в клетках, выявляемых в соскобах со слизистой оболочки полости рта.
Стерильным шпателем необходимо сделать соскоб слизистой ротовой полости, затем материал необходимо перенести на предметное стекло, размазать
тем же шпателем и высушить. Окрасить 1 % раствором ацеторсеина в течение 5–8 минут и накрыть покровным стеклом.
2. Проводят анализ препарата под световым микроскопом.
Половой хроматин выявляется у женщин в ядрах клеток слизистой оболочки
в виде темноокрашенного тельца вблизи ядерной оболочки. Расположение
114
клеток может оказаться таким, что половой хроматин окажется вне плоскости видимости, поэтому эта структура выявляется не во всех клетках. Необходимо изучить 100 клеток. В среднем примерно 30 % клеток будут иметь
эту структуру.
3. Документация увиденного. Зарисовать клетки и половой хроматин у доноров женского пола.
Лабораторная работа № 3. Изучение ядрышек в лимфоцитах
периферической крови человека
Цель работы: познакомиться с особенностями выявления ядрышек в ядрах
клеток
Ход работы:
1. Выбрать объект исследования.
Для работы можно использовать любые цитологические препараты (мазки,
парафиновые срезы и др.) или препараты хромосом. Лучше всего взять препараты ФГА-стимулированных лимфоцитов периферической крови человека,
где ядрышки более крупные и многочисленные, чем в нативных клетках.
2. Окрашивание препаратов.
Окрашивание проводить по методу, предложенному Howell и Black (1980) с
модификациями. На препарат необходимо нанести 150 мкл 50%-ного раствора нитрата серебра («Merck», Германия), 50 мкл деионизированной
во-
ды и 100 мкл 2%-ного раствора желатина в 0,1%-ной муравьиной кислоте.
Затем препарат накрыть покровным стеклом и инкубировать в термостате в
течение 10 мин при 37 оС. Затем промыть водопроводной водой и окрасить
1%-ном раствором красителя Гимза. Смыть краску и высушить.
3. Анализ препаратов.
115
В случае правильного окрашивания ядрышки выглядят как черные области
на голубом фоне ядра (точнее говоря, темно окрашенные области представляют собой районы функционально активных ядрышковых организаторов).
Проанализировать количество аргентофильных зон ядра в 100 клетках от каждого
донора.
Лабораторная
работа
№
Выявление и анализ микроядер в буккальном эпителии
4.
Цель работы: познакомиться с особенностями выявления микроядер в клетках слизистой оболочки рта
Ход работы:
1. Подготовить буферный раствор.
Характеристики используемых реагентов приведены в таблице 3.
Таблица 3
Характеристики реагентов
объём
Реагент
Конечная концентрация
1. Tris HCl, 1 M (pH 7.0)
10 мл
0.01 M
2.
EDTA, 0.5 M
200 мл
0.1 M
3.
NaCl, 5M
4 мл
0.02 M
(786 мл)
---
4. ddH20
Этапы подготовки буфера:
 смешать Tris HCl, EDTA, NaCL;
 добавить 700 мл ddH20;
 определить pH раствора;
116
 довести до pH 7.0 при помощи HCl:
o Использовать 1 M HCl если меньше > pH 7.0.
o Использовать 10 M HCl если pH > 10.0
 Довести объем до 1 л дистиллированной водой.
Для приготовления раствора 0.5 M EDTA:
 добавить 186.12 г EDTA в 800 мл ddH20,
 добавить 23г NaOH для лучшего растворения EDTA,
 довести объем до 1000 мл ddH20.
2. Стерильной щеткой собрать с внутренней поверхности щеки буккальный эпителий и поместить его в пробирку с буфером.
3. Собранный материал перенести на предметные стекла, высушить и
зафиксировать этанол-уксусным фиксатором (3части этанола: 1 часть
ледяной уксусной кислоты).
4. Для лучшего окрашивания необходимо провести слабый кислотный
гидролиз препаратов, погружая их в 5N HCl на 10 минут.
5. Препараты окрашивают предварительно отфильтрованным 2,5 % раствором ацетоарсеина при 37оС в течение часа.
6. Промывают в двух сменах прогретой до 37оС дистиллированной воде.
Высушивают на воздухе.
7. Докрашивание цитоплазмы клеток проводили 1%-ным спиртовым
раствором светлого зеленого (light green) в течение 1–2 минут.
8. Промывают препараты в двух сменах дистиллированной воды.
9. Подсчет микроядер проводят в соответствии со стандартными требованиями. Для каждого обследуемого необходимо определить показатель «среднее количество микроядер в буккальных эпителиоцитах»
(вычисляя как арифметическое среднее). Рассчитать частоту встречаемости клеток с микроядрами в процентах на 1000 клеток.
117
Принципы учета микроядер. При оценке уровня микроядер важное
значение имеет их правильная регистрация. На препаратах, приготовленных
от каждого обследованного, обычно анализируют по 1000 клеток буккального эпителия. Пригодными для анализа считаются препараты с хорошо расправленными клетками. К микроядрам относят округлые образования с ровными краями, размером 1/20–1/5 диаметра ядра клетки и окраской, соответствующей окраске основного ядра. Микроядра должны находиться на расстоянии не более двух диаметров от ядра.
Лабораторная работа № 5. Измерение диаметра ядра лимфоцита
Цель работы: научиться определять величину объектов под микроскопом с
помощью окуляр-микрометра.
Ход работы:
1. Подготовить микроскоп к работе.
2. Установить окуляр-микрометр, выбрать объектив (увеличение х40). На
предметном столике расположить объект-микрометр для проходящего
свята.
3. Рукоятками препаратоводителя совместить шкалы объектива и окуляр-микрометра, навести резкость.
4. Определить какое число делений окуляра (n) укладывается в числе делений объект-микрометра (m). При этом цена одного деления шкалы
окуляра = m/n x 10 мк.
5.
Определить цену 1 деления окуляр-микрометра при использовании
объектива с увеличением х100. Заполнить рабочую таблицу 4.
118
Таблица 4
Таблица для ведения рабочих записей
Оптическая комбинация
объектив
окуляр
насадка
Число делений
окуляр
Цена деления (мк)
Объектмикрометр
х 40
1
х 100
1
6. На готовых препаратах измерить размеры ядер лимфоцитов периферической крови, используя различные объективы. Сравнить точность измерений при использовании различных объективов.
Лабораторная работа № 6. Определение митотического индекса и длительности фаз митоза в клетках корней лука (Allium cepa)
Цель работы: познакомиться с различными способами определения фаз митоза; на примере готовых препаратов клеток корней лука
определить про-
должительность отдельных фаз митоза и вычислить митотический индекс.
Ход работы:
Подготовить микроскоп к работе
На готовых препаратах (Кариокинез в корешке Allium cepa) отыскать и зарисовать стадии митотического цикла: интерфазу, профазу, метафазу, анафазу,
телофазу, две дочерние клетки, ориентируясь на рисунок 18.
Определить митотический индекс, подсчитав 200 клеток.
Подсчет клеток в разных фазах цикла проводится в нескольких полях зрения.
Во избежание попадания на одно и тоже поле, препарат передвигается последовательно через одно поле в сторону и опять снизу вверх и т. д. Данные по
подсчету клеток заносят в рабочую таблицу 5.
119
Митотический индекс = (П+М+А+Т)х100/всего клеток =
0/00, где И –
интерфаза, П – профаза, А – анафаза, Т – телофаза
Определение относительной длительности фаз митоза:
П=Пх100/ П+М+А+Т = %
Определить длительность фаз митоза в процентах.
При зарисовке пользоваться иммерсионным объективом, при подсчете клеток – объективом на х40.
Таблица 5
Таблица для ведения рабочих записей
Поле
зрения
Количество клеток в стадии
И
П
М
А
Т
Всего
1
2
И т. д.
Лабораторная работа № 7. Приготовление и анализ препаратов хромосом из клеток растений
Цель занятия: изучить способ приготовления препаратов хромосом из клеток
корешка лука (Allium cepa).
Ход работы:
Корешки размером примерно 1 см предварительно обрабатываются в водном
растворе 5-аминоурацила, в концентрации 700 мкг/мл.
Затем корешки промывают проточной водой при 18оС и помещают и помещают в ростовую среду. При таких условиях максимум митотических клеток
будет наблюдаться примерно через 15 часов.
Корешки обрабатывают 0,01%-ным раствором колхицина в течение 3–4 часов.
120
1. Корешки помещают в свежеприготовленный и охлажденный фиксатор
Кларка. В фиксаторе материал может находиться в течение 3-х суток
при температуре 4оС. При необходимости более длительного хранения
в качестве фиксатора используют 70%-ный этиловый спирт.
2. Фиксированный
материал помещают перед окраской в 4%-ный
раствор железоаммонийных квасцов на 5–10 мин.
3. Корешки достают пинцетом из квасцов и помещают на фильтр для
подсушивания.
4. Проводят окрашивание красителем гематоксилином Эрлиха. Для этого:
а) корешки закладывают в фарфоровый тигель и заливают красителем;
б) над пламенем спиртовки доводят краситель до кипения, затем дают
остыть до комнатной температуры.
5. Приготовление препаратов. На чистое и сухое предметное стекло
наносят каплю насыщенного раствора хлоралгидрата. В эту каплю помещают корешок, от которого с помощью препаровальной иглы отделяют участок с зоной роста (примерно 1 мм длиной). Препарат накрывают покровным стеклом. Далее предметное стекло нагревают над
пламенем спиртовки, не допуская вскипания хлоралгидрата и его высыхания. Затем накрывают фильтром и давят препарат ручкой препаровальной иглы. При этом важно избежать смещения покровного стекла относительно предметного, т. к. клетки при этом разрушаются.
6. Оценить качество готовых препаратов с помощью микроскопа. Найти и
зарисовать 3–4 клетки на стадии метафазы.
Лабораторная работа № 8. Приготовление и анализ препаратов хромосом из клеток тканей животных
Цель занятия: изучить способы приготовления препаратов хромосом из животных клеток.
121
Ход работы:
1. В крысу внутрибрюшинно вводится 0,4 мл 0,01 % раствора колхицина.
Через 1–1,5 часа животное декапитируют корнцагом и за лапки прикрепляют к препаровальному столику.
2. По брюшку делается разрез кожи и проводится отпрепаровка кожи вокруг задних лапок. Затем отпрепаровываются мышцы и берцовая кость
отрезается ножницами выше суставов. Держа кость пинцетом, срезают
эпифизы и при помощи шприца гипотоническим раствором (0,56%ный раствор хлорида калия подогретого до 37оС) костный мозг вымывается в центрифужную пробирку. В гипотоническом растворе костный мозг ставиться на инкубацию в термостат при 37 оС на 30 мин.
3. После инкубации проводится центрифугирование в течение
5 мин
при 1000 об/мин. После центрифугирования надосадочная жидкость
отсасывается при помощи водоструйного насоса.
4. Оставшийся осадок (1–1,5мл.) ресуспензируется при помощи пастеровской пипетки: затем в пробирку вливается свежеприготовленный фиксатор Кларка (3 части этилового спирта + 1 часть ледяной уксусной
кислоты, охлажденный). Осадок вновь ресуспензируют в фиксаторе и
помещают в холодильник на 30 мин.
5. Повторяют центрифугирование клеточной взвеси (5 мин. при 1000
об/мин) Надосадочную жидкость удаляют, а к осадку приливают свежую порцию фиксатора. Во втором фиксаторе клетки можно хранить в
холодильнике несколько суток.
6. При необходимости фиксацию повторяют 3–4 раза. Из последней порции удаляют надосадочную жидкость, оставляя в пробирке 1 мл с осадком. Осадок снова ресуспензируют до гомогенного распределения клеточной взвеси.
122
7. Готовую взвесь раскапывают при помощи пастеровской пипетки на чистые обезжиренные и охлажденные предметные стекла. Стекла перед
употреблением хранятся в холодильнике в стакане с дистилиррованной
водой. На одно стекло наносится 4–5 капель клеточной суспензии.
8.
После раскапывания препарат высушивают вблизи пламени спиртовки, маркируют и окрашивают 1%-ным красителем Гимза в течении 7–
10 мин.
9. Готовые препараты анализируют под микроскопом. Найти и зарисовать метафазную пластинку на приготовленном препарате. Подсчитать
и идентифицировать хромосомы, опираясь на рисунок 34.
Лабораторная работа № 9. Культивирование лимфоцитов периферической крови человека, приготовление препаратов хромосом и их анализ
Цель занятия: ознакомиться на практике с методикой культивирования и
подготовки препаратов хромосом человека и усвоить значение этого метода в
практической цитогенетике.
Ход работы:
1. Подготовьте препараты хромосом человека в соответствие с представленной ниже методикой.
Полумикрометод культивирования лимфоцитов периферической крови человека [Hungеrfоrd Р. F., 1965]
Первоначальные этапы работы проводятся в ламинарном шкафу и стерильном боксе. У двух добровольцев в асептических условиях медицинский работник забирает в шприц, содержащий 100-500 ед.
гепарина, по 1 мл крови и помещает в стерильный флакон с гепарином.
123
В условиях бокса в стандартные стерильные флаконы для культивирования помещают 4,5 мл питательной среды RPMI-1640, 1 мл сыворотки
крупного рогатого скота (или эмбриональной
телячьей сыворотки), 3–4 капли ФГА (из шприца на 10 мл). Предварительно
во флакон со средой необходимо внести 0,56 мл гентамицина. Все процедуры внесения реактивов проводят, открывая флаконы вблизи пламени спиртовки. Затем осторожно, по стенке, переносят кровь в культуральные флаконы (700 мкл на 1 флакон). Все флаконы нумеруют и помещают в термостат
на 48 часов. Каждый день их аккуратно перемешивают.
Посткультуральная обработка и подготовка препаратов:
 За 50 мин до окончания культивирования вносят колхицин по 80 м кл
н а ф лакон .
 для приготовления раствора колхицина необходимо 0,5мг колхицина
развести 5 мл среды RPMI-1640 (без гентамицина);
 по окончании культивирования клеточную взвесь центрифугируют 7
мин. 1000 об/мин, удаляют надосадок, а клеточную взвесь подвергают
гипотонической обработке 0,075М раствором КCl при 370С в течение
45 минут;
 для приготовления гипотонического раствора 555 мг КСl разводят в
100 мл воды;
 центрифугируют 7 мин. 1000 об/мин., надосадок убирают;
 уксусную кислоту (3%-ную) добавляют по каплям, постепенно доводя
объем до 10 мл. После чего сразу центрифугируют 7 мин. 1000 об/мин,
убирают надосадок.
 затем материал трижды фиксируют этанол-уксусным фиксатором (в
соотношении 3:1), до получения гомогенной суспензии (вносят фиксатор, затем на 20 минут ставят в холодильник, затем центрифугируют 7
минут 1000 об/мин и надосадок убирают, оставляя 0,5–1 мл);
124
 суспензии раскапывают на охлаждённые чистые предметные стёкла с
последующим их высушиванием вблизи пламени спиртовки (на каждого человека раскапывают по 4 стекла). Препараты шифруют цифровыми обозначениями.
2. Проанализируйте качество полученных препаратов и сформулируйте
важнейшие моменты, на которые необходимо всегда обращать внимание при
подготовке препаратов хромосом (стерильность, точное соблюдение длительности всех операций и прочие факторы).
3. Подготовьте микроскоп к работе.
2. Найдите метафазную пластинку, пригодную для анализа (с хорошим разбросом хромосом, без наложений)
3. Проанализируйте одну метафазную пластинку. Зарисуйте её.
На рисунке изобразите все наблюдаемые хромосомы. Каждую из них подпишите – к какой группе относится. Подсчитайте хромосомы на рисунке и на
метафазной пластинке.
Лабораторная работа № 10. Анализ структурных хромосомных аберраций, встречающихся у человека
Цель работы: научиться находить и классифицировать основные
виды
структурных хромосомных нарушений у человека
Ход работы:
1. Настроить микроскоп к работе.
2. Освоить основные этапы идентификации хромосомных нарушений на
метафазных пластинках.
 Отбор метафаз, включаемых в анализ, и критерии для регистрации цитогенетических нарушений должны соответствовать общепринятым рекомендациям (Бочков Н. П., 1971).
125
 В случае обнаружения возможного хромосомного нарушения необходимо
подсчитать точное количество хромосом на метафазной пластинке.
 Убедиться, что ХА относиться именно к данному митозу: для этого нужно
проверить, нет ли рядом еще одного митоза и
оценить интенсивность
окраски (в разных митозах она может отличаться).
 Обратить внимание на отличие между фрагментами и пробелами. Пробелы к ХА не относятся.
 Чтобы исключить субъективную ошибку необходимо посоветоваться с
коллегами.
3. Проанализировать 200–500 метафазных пластинок от одного донора.
Частоту хромосомных нарушений рассчитать как процент клеток, несущих
хромосомные аномалии. Проанализировать частоту встречаемости отдельных типов хромосомных нарушений. Сопоставить частоту аберраций
хромосомного и хроматидного типов.
Лабораторная работа № 11. GTG-окрашивание и анализ
дифференциальной окраски метафазных хромосом
Цель работы: познакомиться с дифференциальным окрашиванием хромосом
(G-метод).
МЕТОДИКА GTG-ОКРАСКИ
Свежераскапанные препараты необходимо выдержать перед окрашиванием в
течение 24 часов при 370С. Препарат отмыть от рутинной окраски в 96%-ном
этаноле (5 мин.). Подготовить краситель: 2–3 капли 0,025%-ного раствора
трипсина поместить в стандартный раствор красителя Гимза.
126
Время окрашивания зависит от качества красителя и температуры в помещении (обычно 4–7 мин). Затем краску смыть дистиллированной водой и высушить на воздухе.
Ход работы:
1. Выполнить процедуру окраски.
2. Подготовить микроскоп к работе.
3. Провести анализ качества окраски: хромосомы должны иметь характерный поперечнополосатый рисунок.
4. Познакомиться с характерными особенностями рисунка каждой хромосомы. Зарисовать и проанализировать метафазную пластинку.
Лабораторная работа № 12. Ag-окрашивание и анализ
индивидуальных геномных доз активных рибосомных генов
Цель работы: познакомиться с методикой Ag-окрашивания метафазных хромосом и особенностями анализа индивидуальных геномных доз активных
рибосомных генов.
МЕТОДИКА Ag-ОКРАШИВАНИЯ
1. Готовим рабочие растворы.
Для приготовления раствора AgNO3 5г сухого порошка необходимо растворить в 10 мл дистиллированной воды и хранить в темном сосуде.
Желатиновый проявитель:
В стерильный флакон поместить 2 мл желатина (аптечный 10% раствор) и
развести 8 мл воды (хорошо перемешать), только перед употреблением добавить 0,1 мл муравьиной кислоты. Закрыть флаконы стерильными пробками.
Хранить в холодильнике, а перед употреблением поставить в теплую воду.
127
Раствор CsCl (0,2 М):
8,425 г порошка разводится на 250 мл деионизиро-
ванной воды и помещается в термостат на +56оС на 30 минут.
2. Процедура окрашивания.
Раскапанный препарат должен состариться при комнатной температуре минимум неделю (лучше 10 дней) или ночь в термостате на +56оС.
Этапы окраски:
1) препарат положить в чашку Петри, накапать по 1 капле деионизированной
воды в 2 поля стекла. Добавить по 3 капли серебра и по 2 капли желатина.
Накрыть чистыми покровными стеклами Х24 мм и поставить в термостат –
на 10 мин. при температуре +56оС;
2) промыть под проточной водой, затем – деионизированной водой. Поместить в стакан с CsCl на 15 мин. (в термостат). Не ополаскивая, поместить в
спирт 70о (1 мин.), затем в 96о спирт (1 мин.). Высушить на воздухе;
3) докрасить 1%-ным раствором красителя Гимза 8 минут.
Размеры AgNOR выражают в условных единицах, визуально оценивая их
по 5 –балльной системе: 0 –окраска отсутствует, 1 – зерно серебра меньше
ширины хроматиды, 2 –зерно серебра соответствует ширине хроматиды, 3 –
зерно серебра больше ширины хроматиды, 4 – экстремально большое зерно
серебра, значительно больше ширины хроматиды.
Ход работы.
1. Законспектировать теоретический раздел и выполнить процедуру
окраски.
2.Подготовить микроскоп к работе.
3. Анализ качества окраски.
Окрашенный препарат приобретает золотисто-коричневый цвет. Акроцентрические хромосомы в районе вторичной перетяжки (зоны ядрышковых организаторов) имеют черные точки различного размера (AgЯОР).
4. Проанализировать размеры отдельных AgЯОР (у каждого
проанализировать по 20 метафаз).
128
донора
5. Оценить индивидуальные геномные дозы рибосомных генов.
Индивидуальную дозу активных рибосомных генов оценить с использованием следующих цитогенетических параметров: суммарный размер 10 AgЯОР
и число Ag-положительных ЯОР.
Лабораторная работа № 13. Выявление и анализ сестринских
хроматидных обменов
Цель работы: познакомиться с методическими особенностями выявления
сестринских хроматидных обменов.
МЕТОДИКА СХО-ОКРАШИВАНИЯ
Для регистрации СХО в подготовленные клеточные культуры (см. лабораторную работу № 8) на 24 часе роста вводят 5-БДУ в конечной концентрации 10 мкг/мл. С этого момента флаконы должны быть защищены от света
(для предотвращения фотолиза БДУ-замещённой ДНК), поэтому их обворачивают тёмной бумагой
Фиксацию проводят через 72 часа культивирования. Посткультуральная обработка – по стандартному протоколу (колхицин- гипотоническая обработка
– фиксация).
Подготовленные препараты в течение 3-х суток «состаривают» в термостате
при 37 оС в темноте. Далее окрашивают по следующему протоколу:
1. Готовят раствор флюорохрома – Хехст-33258.
Маточный раствор: 100мкг/мл в дистиллированной воде хранится при 4 оС
до 6 месяцев.
Рабочий раствор: 1 мл маточного раствора+9 мл фосфатного буфера Серенсена.
129
Буфер Серенсена: Na2PO4 2г 485 мг на 250 мл H2O
K2PO4 2г 380 мг на 250 мл H2O
2. Окрашивают раствором Хехста в темноте в течение 10 мин. Затем промывают дистиллированной водой и сушат.
3. Готовят цитратный буфер Мак-Ильвена (перед каждым окрашиванием готовят свежий):
а) 0,2М Na2PO4 (2,82 г –100мл H2O);
б) 0,1 М лимонная кислота (2,1 г – 100мл H2O)
смешать 19, 45 мл (а) и 0,55 мл (б).
4. На препараты капают 3 капли цитратного буфера, закрывают покровными
стеклами, ставят на светлое основание и облучают УФ-лампой мощностью
250 Вт с расстояния 12 см от поверхности препарата до края колпака лампы в
течение 15 мин.
5. После облучения препаратам дают остыть и погружают в стакан с дист.
водой. Легким покачиванием способствуют смыванию покровных стекол.
Высушивают препараты.
6. Препараты окрашивают 1%-ным раствором Гимза. Промывают проточной
водой. Высушивают и анализируют.
Ход работы:
1. Законспектировать теоретический раздел и выполнить процедуру, описанную в методике.
2. Подготовить микроскоп к работе.
3.Оценить качество окраски. Проанализировать 30 митозов.
130
Лабораторная работа № 14. СBG-окрашивание и анализ
гетерохроматических районов хромосом
Цель работы: познакомиться с методическими особенностями выявления и
анализа структурного гетерохроматина.
МЕТОДИКА СBG-ОКРАШИВАНИЯ
Препараты обрабатывают насыщенным раствором Ba(OH)2 в течение
5–10 мин. при комнатной температуре. Отмывают и инкубируют в 2хSSC при
температуре +60 в течение часа, отмывают в батарее спиртов 700, 960, 1000.
Высушивают и окрашивают красителем Гимза pH 6,8. Стандартный солевой
раствор может быть заменен 0,2 М хлоридом цезия.
Оценка размеров С-блоков проводится по 5 балльной системе:
1 – точечный блок, меньше 1/5 длины плеча)
2 – маленький (около 1/5 длины плеча)
3 – средний (около 1/4 длины плеча)
4 – крупный (около 1/3 длины плеча)
5 – очень крупный ( не менее 1/3 длины плеча)
Ход работы:
1. Законспектировать теоретическую часть и выполнить процедуру
окраски. Подготовить микроскоп к работе.
2. Проанализировать качество окраски (gh выглядит как крупные черные
блоки в прицентромерных областях 1,9,16, и У- хромосомах.
3. Оценить размеры gh-блоков по 5 балльной системе. Проанализировать
20 метафаз.
131
Лабораторная работа № 15. Флуоресцентная in situ гибридизация и анализ анеуплоидии в соматических клетках человека
Цель работы: познакомиться с методическими особенностями процедуры
FISH и принципами анализа анеуплоидии в интерфазных ядрах.
Принцип метода основан на использовании готовых коммерческих зондов –
AneuVysion Multicolor DNA Probe Kit (CEP 18, X, Y-alpha satellite, LSI 13 и
21). Данные зонды пригодны для исследования некультивированных клеток
амниотической жидкости, а также клеток культивированных образцов, в том
числе и лимфоцитов крови.
Подготовка рабочих растворов
20Х SSC (рН 5,3)
Необходимо смешать
66 г
20Х SSC
200 мл очищенной воды
250 мл – финальный объем
Проверить рН, и, если необходимо, довести кислотность раствора концентрированной НСl. Дополнить раствор до финального объёма 250 мл. Затем профильтровать через фильтр (размер зерна фильтра – 0,45 мкл). Хранить в закрытом сосуде при комнатной температуре до 6 месяцев.
0,3 % NP-40 в 0,4Х SSC
950 мл очищенной воды
20 мл 20Х SSC рН 5,3
3 мл NP-40
1000 мл – финальный объем
рН должна составлять 7,0–7,5 . Если необходимо, рН доводить 1N NaOH,
используя рН-метр со стеклянным электродом. Объем довести до 1 литра.
Профильтровать. Неиспользованный раствор хранить при комнатной темпе-
132
ратуре в закрытом сосуде до 6 мес. Использованный раствор должен утилизироваться в конце рабочего дня.
0,1 % NP-40 в 2X SSC
100 мл 20X SSC, рН 5,3
849 мл очищенной воды
1 мл
NP-40
1000 мл финальный объем
рН должна составлять 7,0-7,5 . Если необходимо, рН доводить 1N NaOH ,
используя рН-метр со стеклянным электродом. Объем довести до 1 литра.
Профильтровать. Неиспользованный раствор хранить при комнатной температуре в закрытом сосуде до 6 мес. Использованный раствор должен утилизоваться в конце рабочего дня.
Денатурирующий раствор. Для приготовления 70%-ного формамида в 2Х
SSC рН 7.0–8.0 необходимо смешать:
49 мл
формамид
7 мл
20Х SSC рН 5.3
14 мл очищенной воды
70 мл финальный объем
Хорошо смешать и поместить в стеклянный стакан. Измерить рН при комнатной температуре рН-метром со стеклянным электродом. Хранить в закрытом сосуде при 2–8 оС. Этот раствор может быть использован в течение 1 недели. Проверять рН перед каждым использованием.
МЕТОДИКА
1. Раскапать клеточную суспензию (3–4 капли), держа стекло над водяной
баней. Высушить на воздухе.
133
2. Под фазово-контрастным микроскопом проверить число клеток. При
использовании объектива 10Х должно быть не менее 100 интерфазных
ядер. Это оптимально для получения результата.
3. Каждое стекло накрыть двумя покровными стеклами (22 мм х 22 мм).
4. «Состарить» образцы в 2ХSSC от 30 мин. до 1 часа при 37оС или 24 часа при комнатной температуре. До гибридизации хранить в закрытой
коробке при -20оС.
Денатурация образцов ДНК
5. Нагретую до 37оС влажную гибридизационную камеру поместить в
37оС–инкубатор до подготовки стекол. (В качестве влажной гибридизационной камеры можно использовать герметичный контейнер, на
одну сторону которого поместили влажную бумагу размером 1 х 3
дюйма).
6. В стеклянный термостойкий стакан налить денатурирующий раствор и
поместить на водяную баню 73±1оС на 30 мин. Проверить температуру
раствора перед использованием.
7. Проверить рН 7.0–8.0 перед каждым использованием. Поместить стекла в денатурирующий раствор на 5 минут.
8. Пинцетом перенести стекла в 70%-ный этанол (комнатной температуры). Покачать стекла, чтобы смыть формамид. Оставить на 1 мин.
9. Перенести стекла в 85%-ный этанол на 1 мин., затем в 100% этанол.
10.Убрать излишки этанола, прикасаясь к краю стекла фильтровальной
бумагой.
11.Положить стекла на нагретый до 45–50оС slide warmer (не более, чем
за 2 мин. до подготовки раствора пробы). Если требуется большее время, стекла следует вернуть в 100%-ный этанол. Не помещать высушенные на воздухе стекла в slide warmer.
134
Подготовка ДНК-пробы
12.Разморозить пробу при комнатной температуре и хорошо размешать
(пипеттировать).
13.Встряхнуть на вортексе. Отцентрифугировать 1–3 секунды на микроцентрифуге, чтобы проба осела вниз.
14.Примечание. Используемые пробы могут требовать предварительной
денатурации.
Гибридизация
15.Добавить 10 мкл пробы CEP 18/ X/ Y на одну гибридизационную зону
на стекле и пробу LSI 13/21 на другую зону. Накрыть зоны покровными стеклами и приклеить их резиновым клеем (клей можно набрать в 5
мл шприц и выдавливать по периметру стекла)
16.Поместить стекла в предварительно нагретую 37оС влажную камеру,
накрыть крышкой и инкубировать от 6 до 24 часов.
Постгибридизационные отмывки
17.В стакан поместить 0,3%-ный NP-40 в 0,4Х SSC. Предварительно подогретый стакан поместить на водяную баню 73±1оС (баня нагревается
заранее не менее, чем 30 мин).
18.Во второй стакан поместить 0,1%-ный NP-40 в 2X SSC и оставить при
комнатной температуре. Оба раствора нужно менять каждый день.
19.Убрать клей и покровные стекла. Сразу опустить стекла в раствор
0,3%-ный NP-40 в 0,4Х SSC 73±1оС. Покачать стеклом примерно 3 сек.
Повторить то же самое с другим стеклом. Инкубировать 2 мин. Не от135
мывать сразу более четырех стекол. Время начала инкубации отсчитывать с момента помещения в раствор последнего стекла.
20.Перенести стекла из бани в стакан с 0,1%-ным NP-40 в 2X SSC комнатной температуры на 5–60 секунд. Взболтать 1–3 секунды.
21.Оставить стекла сохнуть на воздухе в темноте.
22.Добавить 10 мкл DAPI II на каждую гибридизационную зону стекла и
накрыть покровным стеклом. Хранить стекла в темноте. Длительно –
при -20оС.
Анализировать препараты в темной комнате с помощью люминесцентного микроскопа, оснащенного набором соответствующих фильтров.
Подсчитать количество сигналов 18, X, Y, 13 и 21 хромосом в интерфазных ядрах.
136
Приложение 2
Рис. 1. Спектр ртутной лампы
а
б
Рис. 2. Люминисцентный блок светофильтров:
а) внешний вид блока светофильтров; б) схема работы люминесцентного
блока светофильтров: 1 – световой поток от источника света; 2 – выделенный
световой поток возбуждения; 3 – световой поток эмиссии (свечения объектов,
137
меток); А – возбуждающий светофильтр; В – полупрозрачная пластина (полупрозрачное зеркало, дихроичное зеркало); С – запирающий светофильтр.
Рис. 3. Цветная исчерченность хромосомы 1 человека при RXFISH (иллюстрация фирмы “Applied Imaging)
Рис. 4. Цветная исчерченность хромосом человека при RXFISH:
а) метафазная пластинка; б) раскладка хромосом
(иллюстрация фирмы “Applied Imaging)
138
Рис. 5. Пренатальная диагностика синдрома Дауна
(желтым цветом показана 21 хромосома)
(иллюстрация: С. Г. Ворсанова, Ю. Б. Юров, В. Н.Чернышев, 2006)
139
Рис. 6. Мозаичный случай синдрома Клайнфельтера (47, ХХУ/ 46,ХУ)
Хромосома Х – красные сигналы, хромосома У – светло-зеленые сигналы
(иллюстрация: С. Г. Ворсанова, Ю. Б. Юров, В. Н. Чернышев, 2006)
140
Рис. 7. Маркерная хромосома в кариотипе человека
Желтым цветом окрашены хромосомы 22. В дополнении имеется одна маркерная хромосома, содержащая материал 22 хромосомы
(иллюстрация: www.pathology.washington.edu)
141
ИНТЕРФАЗА
1.Профаза
МИТОЗ
3. Анафаза
2. Метафаза
4.Телофаза
142
Рис. 8. Движение хромосомного материала во время митоза
(иллюстрация: The University of Arizona http://www.biology.arizona.edu)
Рис. 9. Частичная галерея оптических срезов интерфазного ядра
фибробласта человека.
Красным выделена ДНК хромосомы 9; зеленым – ДНК центромерного района хромосомы 9; серым – ДНК всех хромосом.
(иллюстрация: Н. Б. Рубцов, 2007)
143
ОГЛАВЛЕНИЕ
ПРЕДИСЛОВИЕ ..................................................................................................................................................... 4
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ .................................................................................................................................... 6
Глава 1. ВВЕДЕНИЕ В ЦИТОГЕНЕТИКУ .......................................................................................................... 7
1.1.Предмет и история развития цитогенетики ................................................................................................ 7
1.2. Световая микроскопия в цитогенетике .................................................................................................... 13
1.3. Люминесцентная микроскопия в цитогенетике ...................................................................................... 29
1.4. Правила работы с микроскопом ............................................................................................................... 35
Глава 2. ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ................................................................... 36
ИНТЕРФАЗНОГО ЯДРА ..................................................................................................................................... 36
2.1. Выявление полового хроматина ............................................................................................................... 39
2.2. Выявление ядрышек .................................................................................................................................. 40
2.3. Выявление микроядер ............................................................................................................................... 44
2.4. Определение размеров микроскопических объектов ............................................................................. 47
ГЛАВА 3. ИЗУЧЕНИЕ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА И ИЗМЕНЕНИЯ ХРОМОСОМ В МИТОЗЕ ................... 52
3.1. ИНТЕРФАЗА .............................................................................................................................................. 52
3.2. МИТОЗ........................................................................................................................................................ 53
3.3. Определение длительности периодов митотического цикла ................................................................. 54
ГЛАВА 4. ПОДГОТОВКА И АНАЛИЗ ПРЕПАРАТОВ ................................................................................... 57
ХРОМОСОМ ......................................................................................................................................................... 57
4.1. Строение хромосом ................................................................................................................................... 57
4.2. Морфология хромосом. ............................................................................................................................. 71
Кариотип ............................................................................................................................................................ 71
4.3. Общая характеристика подготовки препаратов хромосом .................................................................... 76
4.4. Хромосомные аберрации .......................................................................................................................... 80
ГЛАВА 5. ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЕ ОКРАШИВАНИЕ ................................................................................. 92
ХРОМОСОМ ......................................................................................................................................................... 92
5.1. Основные принципы и виды дифференциального ................................................................................. 92
окрашивания ...................................................................................................................................................... 92
5.2. Полиморфизм хромосом человека ......................................................................................................... 101
ГЛАВА 6. МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ЦИТОГЕНЕТИКИ........................................................................ 103
ГЛАВА 7. ПРИМЕНЕНИЕ КОМПЬЮТЕРНОЙ ТЕХНИКИ .......................................................................... 109
В ЦИТОГЕНЕТИКЕ ........................................................................................................................................... 109
ЛИТЕРАТУРА .................................................................................................................................................... 112
Приложение 1 ...................................................................................................................................................... 114
Лабораторная работа № 1. Устройство светового микроскопа, методы микроскопии и документации
цитогенетического материала ..................................................................................................................... 114
Лабораторная работа № 2. Определение полового хроматина .................................................................. 114
в буккальном эпителии ................................................................................................................................... 114
Лабораторная работа № 3. Изучение ядрышек в лимфоцитах ................................................................. 115
периферической крови человека ................................................................................................................... 115
Лабораторная работа № 4. Выявление и анализ микроядер в буккальном эпителии .............................. 116
Лабораторная работа № 5. Измерение диаметра ядра лимфоцита ............................................................ 118
Лабораторная работа № 6. Определение митотического индекса и длительности фаз митоза в клетках
корней лука (Allium cepa) .............................................................................................................................. 119
Лабораторная работа № 7. Приготовление и анализ препаратов хромосом из клеток растений ............ 120
Лабораторная работа № 8. Приготовление и анализ препаратов хромосом из клеток тканей животных
.......................................................................................................................................................................... 121
Лабораторная работа № 9. Культивирование лимфоцитов периферической крови человека,
приготовление препаратов хромосом и их анализ ....................................................................................... 123
Лабораторная работа № 10. Анализ структурных хромосомных аберраций, встречающихся у человека
.......................................................................................................................................................................... 125
Лабораторная работа № 11. GTG-окрашивание и анализ ............................................................................ 126
дифференциальной окраски метафазных хромосом ................................................................................... 126
Лабораторная работа № 12. Ag-окрашивание и анализ............................................................................... 127
индивидуальных геномных доз активных рибосомных генов ...................................................................... 127
Лабораторная работа № 13. Выявление и анализ сестринских .................................................................. 129
хроматидных обменов .................................................................................................................................... 129
Лабораторная работа № 14. СBG-окрашивание и анализ ........................................................................... 131
144
гетерохроматических районов хромосом ..................................................................................................... 131
Лабораторная работа № 15. Флуоресцентная in situ гибридизация и анализ анеуплоидии в соматических
клетках человека ............................................................................................................................................. 132
Приложение 2 ...................................................................................................................................................... 137
145
Учебное текстовое электронное издание
Варвара Ивановна Минина
ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ
ИЗУЧЕНИЯ МАТЕРИАЛЬНЫХ ОСНОВ
НАСЛЕДСТВЕННОСТИ НА КЛЕТОЧНОМ УРОВНЕ
Электронное учебное пособие
(Тексто-графические учебные материалы)
Редактор Л. М. Борискина
Технический редактор В. П. Долгих
Заказ № 60.
Подписано к использованию __.__.2014
Объем 18,8 Мб
Кемеровский государственный университет
650043, г. Кемерово, ул. Красная, 6
Минина Варвара Ивановна
vminina@mail.ru