влияние биологически-активных веществ разных классов на
advertisement
Министерство образования и науки РФ Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «КАЗАНСКИЙ (ПРИВОЛЖСКИЙ) ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» ИНСТИТУТ ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ И БИОЛОГИИ КАФЕДРА МИКРОБИОЛОГИИ Специальность: 06.04.01 (ОКСО 020400.68) – биология ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА Магистерская диссертация ВЛИЯНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ-АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ РАЗНЫХ КЛАССОВ НА ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ СТАТУС МИТОХОНДРИЙ КЛЕТОК НИЗШИХ И ВЫСШИХ ЭУКАРИОТ Р а б о т а з а в е р ше н а : « »_ _ _ _ _ _ __ _ _2 0 1 5 г ._ _ _ _ _ _ _ _ __ _ _ _ _ _ _ ( Г .Р . И г ти с а м о ва ) Р а б о т а до пу ще н а к з а щ ит е : Н а уч н ы й р ук о во д и т е л ь с .н .с ., к .х .н . , « »_ _ _ _ _ _ _ _ __ _2 0 1 5 г ._ _ _ _ _ _ _ _ __ _ _ _ _ _ ( Н .В . К а ла ч е в а ) З а ве д ую щ и й к а ф е д р о й д .б .н ., п р о ф е с с ор , « »_ _ _ _ _ _ _ _ __ _2 0 1 5 г ._ _ _ _ _ _ _ _ __ _ _ _ _ _ _ ( О. Н . Ил ьи н с к а я ) Казань-2015 1 СОДЕРЖАНИЕ стр. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4 ВВЕДЕНИЕ 5 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8 1.1 Митохондрии – энергетические станции клеток 8 1.2 Нарушение функций митохондрий 9 1.3 Митохондрии дрожжей 11 1.4 Yarrowia lipolytica - корректная модель для исследования функций митохондрий высших эукариот 1.5 13 Влияние биологически-активных веществ и фармацевтических препаратов на митохондрии 1.6 14 Мембранный механизм действия цитотоксических белков на клетки 1.7 19 Фуллерены 22 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 25 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 25 2.1 Объекты и материалы 25 2.2 Методы 26 2.2.1 Определение митохондриального потенциала Δψm методом лазерной проточной цитометрии 26 2.2.2 Определение влияния биназы на митохондриальный потенциала Δψm клеток дрожжей 27 2.2.3 Определение влияния производных фуллерена на митохондриальный потенциал Δψm дрожжей 27 2.2.4 Определение влияния биназы на митохондриальный потенциал субпопуляции лейкоцитов 28 2.2.5 Оценка экспрессии фосфатидилсерина и проницаемости цитоплазматической мембраны методом проточной цитометрии 2 29 2.2.6 Определение количества колониеобразующих единиц (КОЕ) 31 2.2.7 Определение протеолитической активности в клетках дрожжей 32 2.2.8 Статистическая обработка результатов 32 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 33 3.1 Разработка модели для анализа индивидуальных митохондриальных ответов клеток с применением Yarrowia lipolytica 3.2 33 Влияние биназы на трансмембранный потенциал клеток дрожжей Yarrowia lipolytica 3.3 35 Влияние биназы на трансмембранный потенциал субпопуляций лейкоцитов крови человека 3.4 37 Водорастворимые метанофуллерены - разобщители окислительного фосфорилирования 39 Заключение 45 ВЫВОДЫ 46 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 47 3 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АТФ - аденозинтрифосфат АФК - активные формы кислорода АФ - аутофлуоресценция МП - мембранный потенциал мтДНК - митохондриальная дезоксирибонуклеиновая кислота НФ - гидрофобный сегмент ОЖК - окисление жирных кислот РНКаза - рибонуклеаза рРНК - рибосомальная рибонуклеаза тРНК - транспортная рибонуклеаза ФС - фосфатидилсерин ЭТС - эмбриональная телячья сыворотка I/R - ишемия/реперфузия MRT - мембранная проницаемость митохондрий PTP - поры перехода проницаемости 4 ВВЕДЕНИЕ Митохондрии являются уникальными клеточными органеллами, отвечающими за энергетический обмен в организме. Митохондриальная дисфункция приводит к клеточной гибели и окислительному стрессу, вызывает нейродегенеративные заболевания и «митохондриальные болезни». Все лекарственные средства, действующие на митохондрии, делят на специфически тропные к митохондриям средства и препараты, влияние которых на митохондрии является побочным [Smith et al., 2012]. Поиск и изучение веществ, модифицирующих функцию митохондрий, позволит создать новые лекарственные средства с заданными свойствами, а в случае проявления побочного действия - прогнозировать эти эффекты. В данной работе исследованы - биологически-активные соединения двух разных классов – РНКаза Bacillus pumilus (биназа) и водорастворимые производные фуллерена, митохондриальные эффекты которых предсказаны с помощью методов компьютерного моделирования. Биназа, наряду с другими РНКазами, привлекает внимание исследователей как потенциальный противоопухолевый препарат нового поколения [Makarov et al., 2008]. В опубликованной ранее работе [Shirshikov et al., 2013] нами in silico установлено, что в молекуле биназы присутствует гидрофобный (НФ) сегмент, термодинамические параметры которого свидетельствуют о том, что он способен к термодинамически выгодному взаимодействию с липидным бислоем и стерически доступен для димеризации мономеров биназы. Предложена модель цитотоксичности рибонуклеаз, в частности, биназы, которая включает механизм выхода рибонуклеаз в цитозоль и предлагающий в качестве внутриклеточной мишени действия биназы внешнюю мембрану митохондрий, увеличение проницаемости которой при действии НФ сегмента служит ключевым фактором в инициации апоптоза клеток, в том числе, опухолевых. В связи с 5 предложенной теоретической моделью представляют интерес экспериментальные исследования влияния биназы на функциональный статус митохондрий различных клеток. Фуллерен, благодаря своей уникальной химической структуре, обладает специфическими физико-химическими и фотофизическими свойствами [Fowler et al., 1995]. После того как была решена проблема его плохой растворимости, производные фуллерена вызывают большой интерес как потенциальные антиоксидантные, противоопухолевые и противовирусные средства [Ros, 2008; Yang et al., 2014]. Особенно интенсивно исследуются антиоксидантные свойства этих молекул [Andrievsky et al., 2009; Matsubayashi et al., 2008]. Фуллерен С60 и его производные, как известно, могут инактивировать свободные радикалы, что обусловлено электроноакцепторными свойствами его псевдоароматической структуры [Fowler et al., 1995; Кrustic et al., 1991]. Вместе с тем в одной из недавних работ [Chistyakov et al., 2013] на основании компьютерного моделирования с применением метода теории функционала плотности (DFT) предложен новый механизм антиоксидантного действия фуллеренов, согласно которому фуллерены способны поглощать протоны и, получив положительный заряд, аккумулироваться в митохондриях. Такой процесс позволит мягко разобщить дыхание и фосфорилирование и снизит трансмембранный потенциал митохондрий, что в свою очередь приведѐт к сокращению продукции активных форм кислорода. Цель настоящей работы – исследовать влияние биназы и водорастворимых производных фуллерена на функциональный статус митохондрий клеток дрожжей Yarrowia lipolytica и субпопуляций лейкоцитов крови человека. Были поставлены следующие задачи: 1) Разработать модель для анализа индивидуальных митохондриальных 6 ответов клеток на основе метода лазерной проточной цитометрии с применением Yarrowia lipolytica. 2) Исследовать влияние биназы на трансмембранный митохондриальный потенциал (Ψm) клеток дрожжей Yarrowia lipolytica. 3) Оценить действие биназы на трансмембранный митохондриальный потенциал различных субпопуляций лейкоцитов крови человека 4) Доказать возможность разобщения окислительного фосфорилирования с помощью водорастворимых производных фуллерена на интактных клетках дрожжей Yarrowia lipolytica. 7 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Митохондрии – энергетические станции клеток Митохондрии функцией которых – органеллы является эукариотической обеспечение В тканях млекопитающих митохондрии фосфорилирования (OXPHOS) в клетки, организма основной энергией. процессе окислительного образуют до 90% молекул АТФ. Помимо этой функции, митохондрии играют ключевую роль в апоптозе и модулировании потоков кальция в клетке [Mammucari et al., 2011] и оказывают влияние на множество основных метаболических путей человеческого организма, включая окислительное фосфорилирование, цикл трикарбоновых кислот, окисление жирных кислот, синтез Fe–S белков, биосинтез гемов и биосинтез аминокислот [Wallace et al., 2010; Duchen, Szabadkai, 2010; Murphy et al., 2009; Smith et al., 2011]. Митохондрии являются уникальными клеточными органеллами, трансмембранный электрический потенциал в них может увеличиться до 180 МВ, а значение рН в матриксе равно примерно 8, вследствие чего, в митохондриях могут накапливаться как катионные вещества, так и слабые кислоты в анионной форме. Число митохондрий определяется энергетическими потребностями клетки. В одной соматической клетке может содержаться от 200 до 2000 митохондрий. Наибольшее количество митохондрий находится в скелетных мышцах, в мышцах сердца, печени и мозге. Митохондрии встречаются в каждой человеческой клетке, за исключением зрелых эритроцитов [Cohen, Gold, 2001]. Мт ДНК кодирует 37 генов, которые необходимы для осуществления окислительного фосфорилирования [Wallace et al., 2010], однако большинство из 1500 других митохондриальных белков кодируются ядерными генами и попадают в митохондрии из цитоплазмы [Calvo, 8 Mootha, 2010]. Такое двойное происхождение митохондриальных белков требует координации ядерного и митохондриального геномов, кроме того, необходимо поступление других кофакторов, металлов и фосфолипидов. Поврежденные макромолекулы в митохондриях разрушают специализированные ферменты митохондрий, а митохондрии с необратимо нарушенными функциями саморазрушаются в процессе митофагии [Green et al., 2011; Narendra, Youle, 2011; Kim et al., 2007]. 1.2 Нарушение функций митохондрий Митохондриальные дисфункции могут быть разделены на два типа: первичная и вторичная дисфункция. Первичная дисфункция характеризуется мутацией генов мтДНК или ядерных генов, кодирующих митохондриальные белки. Например, митохондриальная энцефалопатия, лактацидоз и инсульт (MELAS) возникают из-за мутации в гене митохондриальной тРНКleu(UUR)np3243, что приводит к дефектной сборке комплексов окислительного фосфорилирования и, как следствие, вызывает дефекты в метаболизме энергии в нервно-мышечной системе [Goto et al., 1990]. Мутации в ядерных генах, кодирующих митохондриальные белки, также приводят к митохондрий [Smeitink широкому et диапазону первичных дисфункций al., 2001]. Например, такие мутации могут пагубно повлиять на процесс окислительного фосфорилирования [Angelini et al., 2009]. Вторичная митохондриальная дисфункция вызывается патологиями, происходящими вне митохондрий. Например, при ишемии/реперфузии (I/R) инициирующим событием является нарушение кровоснабжения тканей, что приводит к обширным вторичным митохондриальным нарушениям и, как следствие, повреждению тканей [Murphy, Steenbergen, 2011; Halestrap, 2005]. Так же вторичные митохондриальные повреждения играют значительную роль в сепсисе, нейродегенерации, метаболическом синдроме, 9 трансплантации органов, раковых заболеваниях и диабете [Wallace et заболеваниях, al., 2010; аутоиммунных Murphy, 2009]. В формировании первичных и вторичных митохондриальных дисфункций участвуют окислительный стресс, нарушение гомеостаза кальция и нарушение синтеза АТФ. Дыхательная цепь является основным источником супероксида, перекиси водорода и других АФК [Murphy, 2009]. Продукция супероксида возрастает в большинстве патологических процессов. Митохондрии особенно уязвимы к окислительному повреждению, поскольку содержат FeS белки, ненасыщенные жирные кислоты, плотно упакованные белки и ДНК молекулы, которые чувствительны к АФК. Окислительный стресс нарушает функционирование митохондрий, направляя клетку на путь апоптоза. С этим связано возникновение разнообразных патологий, например, сепсиса, I/R травмы, осложнений при диабете и нейродегенеративных заболеваний. Окислительный стресс, нарушение синтеза АТФ и нарушение кальциевого гомеостаза часто действуют одновременно, и каждый из этих типов повреждения ведет к двум остальным, таким образом, устанавливается замкнутый цикл. Наконец, все три фактора вместе вызывают возрастание мембранной проницаемости митохондрии (mPT). Это явление возникает из-за образования во внутренней мембране поры, которая вызывает набухание и нарушение функции митохондрий. Физиологическая роль mPT и структура пор неизвестна [Rasola, Bernardi, 2011]. Митохондриальная дисфункция обнаруживается при саркопении и неалкогольном стеатогепатите; при приобретенных заболеваниях, таких как диабет и атеросклероз; при нейродегенеративных заболеваниях (болезнь Паркинсона и болезнь Альцгеймера); и при наследственных заболеваниях, в совокупности называемых митохондриальной цитопатией. Однако, поскольку симптомы этих патологий варьируются от случая к случаю (меняется возраст начала заболевания, 10 скорость прогрессирования), митохондриальную дисфункцию трудно диагностировать при первом появлении. Ранняя фаза может быть мягкой и не похожей на митохондриальное заболевание. Кроме того, такие симптомы, как усталость, боли в мышцах, одышка, и боли в животе могут быть ошибочно приняты за коллагено-сосудистые заболевания, синдром хронической усталости, фибромиалгию или психосоматические заболевания [Cohen, Gold, 2001]. 1.3 Митохондрии дрожжей Современная митохондрии эндосимбиотическая являются потомками теория аэробных предполагает, бактерий, что которые колонизировали древние клетки около 2 миллиардов лет назад [DiMauro, Schon, 2003; Wallace, 2005]. Это дало возможность эукариотическим клеткам приспособиться к аэробному дыханию, по сути, необходимому условию для эволюции многоклеточных организмов [Spees et al.,2006]. Эта теория подтверждается тем, что, подобно прокариотическим клеткам, митохондрии содержат кольцевую ДНК и 70S-рибосомы. Отличный пример эукариотической клетки представляют собой дрожжи. Митохондрии дрожжей отличаются от митохондрий высших организмов, в первую очередь, тем, что в них содержится меньше крист, которые, к тому же, имеют жесткую и менее упорядоченную структуру. Во внутренней мембране настоящие кристы, митохондрий так и дрожжей тубули. обнаруживаются Наблюдается как поразительная вариабельность в структуре митохондрий в зависимости от условий культивирования, специфики обмена веществ и фазы роста дрожжевых клеток. Не меньшая вариабельность отмечена для формы и размеров митохондрий дрожжей. Для дрожжей характерно 2 типа обмена: аэробный и анаэробный. Дрожжи с ярко выраженным аэробным типом обмена содержат большое 11 число сложно структурированных митохондрий с многочисленными кристами. У анаэробов имеется лишь небольшое число крупных митохондрий с неправильно ориентированными кристами; у митохондрий дрожжей низового брожения кристы рудиментируются. Однако следует подчеркнуть, что структура митохондрий имеет свойство меняться в зависимости от условий культивирования, фазы роста и физиологического состояния, даже у одного и того же организма. В процессе движения митохондрии способны распадаться на мелкие образования или, наоборот, собираться в крупные агрегаты. Агрегация митохондрий может происходить при делении и почковании клеток дрожжей, при этом происходит характерная ориентация и направленное движение митохондрий. Деление митохондрий в клетках дрожжей начинается примерно к 1/5 клеточного цикла после начала деления ядра и заканчивается за 1/5 до конца цикла [Котельникова с соавт., 1973]. Такая регулярная периодичность свидетельствует о существовании тесной связи между митохондриальным и ядерным делениями. Считается, что в дрожжах, собранных в стационарную фазу роста, при минимальной возможности глюкозного эффекта, число митохондрий на одну клетку постоянно и зависит от систематической принадлежности организма. Однако использование серийных ультратонких срезов с последующей реконструкцией хондриома [Suzuki et al., 1976] показало, что в ряде случаев отдельные митохондриальные профили, обнаруживаемые на одиночных срезах, являлись лишь поперечными сечениями одной (или нескольких) ветвящейся гигантской митохондрии. Например, в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae была найдена огромная митохондрия длиной 50-60 мкм и диаметром 0,2-0,6 мкм [Hoffman et al., 1973]. Так же митохондрии-гиганты были обнаружены в клетках Schizosaccharomyces pombe [Davison, Garland, 1977], Candida utilis [Keyhani, 1980] и в других 12 дрожжевых организмах [Barajas, Keddie 1969]. Число митохондрий в клетке зависит от стадии цикла клетки и фазы роста [Suzuki et al., 1976]. Как правило, в клетках дрожжей, собранных в стационарной фазе роста, число митохондрий больше, чем в экспоненциально растущих клетках. Предполагается, что такой циклический процесс фрагментации и слияния митохондрий облегчает рекомбинацию генов митохондрий [Grimes et al., 1974]. 1.4 Yarrowia lipolytica - корректная модель для исследования функций митохондрий высших эукариот Yarrowia lipolytica представляет собой один из наиболее хорошо изученных видов " нетрадиционных" дрожжей. Будучи строго аэробными и непатогенными микроорганизмами, они способны производить важные метаболиты и обладают сильной секреторной активностью. Эти свойства позволяют использовать этот вид дрожжей в промышленности (в качестве биокатализатора), и в молекулярной биологии. Родовое название Yarrowia было предложено Ван Дер Уолтом и фон Арксом (1980) в честь Дэвида Ярроу, открывшего этот род дрожжей [Yarrow, 1972]. Название вида «lipolytica» было дано этим дрожжам благодаря их способности гидролизовать липиды. Yarrowia относится к семейству Hemiascomycetes и ранее была известна, как Candida, Endomycopsis или Saccharomycopsis lipolytica [Barth, Gaillardin, 1996, 1997]. Штаммы Yarrowia lipolytica были изолированы из молочных продуктов, таких как сыры (например, Камамбер, польский Рокфор), йогурты и сосиски [Barth, Gaillardin, 1996; Fickers et al., 2005]. Также штаммы данных дрожжей были обнаружены в богатых липидами средах (сточные воды, загрязненные нефтепродуктами), в морской среде и в гиперзасоленной среде [Beopoulos et al., 2010]. Y. lipolytica содержит хорошо структурированные кристы и убихинон 13 Q9 с девяти-единичной изопреноидной побочной цепочкой и, таким образом, близкий к убихинону Q9-Q10 млекопитающих, тогда как наиболее изучаемый вид дрожжей Saccharomycopsis cerevisiae содержит убихинон Q6 [Angerer et al., 2012; Barth et al., 2003; Brandt et al., 2005; Kerscher et al., 2004]. Также у Yarrowia обнаружен АТФ-зависимый К+-канал, схожий с таковым у млекопитающих. Было доказано, что действие АТФ на митохондрии дрожжей сходно с действием АТФ, описанным для митохондрий животных, и они содержат полноценную дыхательную цепь со всеми тремя пунктами энергетического обмена, напоминающую по своей структуре дыхательную цепь млекопитающих. [Mironova et al., 2004]. В связи с этими свойствами, Yarrowia можно считать вполне корректной моделью для исследования функций митохондрий высших эукариот и митохондриального комплекса I, который был инициализирован Stefan Kerscher (Германия) и в настоящее время интенсивно изучается Uli Brandt [Nicaud, 2012]. Это направление очень актуально, поскольку с митохондриальным комплексом I и с функциями митохондрий связано множество болезней. 1.5 Влияние биологически-активных веществ и фармацевтических препаратов на митохондрии Биологически-активные вещества и лекарственные препараты могут действовать на митохондрии: 1) через внутреннюю мембрану, проникая внутрь митохондрии; 2) через внешнюю мембрану митохондрии и 3) косвенно, через другие структуры и сигнальные пути клетки. Известны следующие механизмы действия препаратов на эти органеллы: путѐм регуляции: (a) электрон-транспортной цепи, (б) поглощения жирных кислот или окисления, (в) пор, вызывающих переход мембраны митохондрии в состояние высокой проницаемости (ППП) (permeability transition pores PTPs), (д)АТФазы, (г) ионных каналов и 14 транспортеров, (д) количества кардиолипина (CL), и (е) мтДНК и синтеза белка [Wallace, 2008; Toogood, 2008]. Препараты, влияющие на митохондриальную электрон транспортную цепь Хорошо изучен механизм действия препаратов, ингибирующих поток электронов через электрон-транспортную цепь. Вещества повреждают электрон-транспортную цепь, ингибируя белковые комплексы дыхательной цепи или отнимая электроны вместо естественных акцепторов, таких как убихинон и цитохром c [Scatena et al., 2007]. Специфичными ингибиторами белковых комплексов являются - ротенон, антимицин A, цианид и окись углерода. Искусственными электронными акцепторами – метиленовый синий, феназин метосульфат, 2,6-индофенол, тетра-метил-п-фенилендиамин и феррицианид. Некоторые из этих токсичных для дыхательной цепи веществ обычно используются в научно-исследовательских лабораториях, и вообще в фармакологии в качестве инструмента для анализа биоэнергетических функций митохондрий. Это, в основном, ротенон, миксотиазол, антимицин A, олигомицин и протонофоры, рассеивающие внутренний мембранный протонный градиент митохондрий [Toogood, 2008]. Другую группу составляют ингибиторы митохондриального комплекса цитохром bc1 (миксотиазол), кроме того, это препараты, которые связываются с цитохром с редуктазой и ингибируют окисление убихинола (антимицин) [Wallace, 2008; Scatena et al., 2007]. Нарушение дыхания выражается 1) в ухудшении β-окисления митохондрий; 2) в увеличении образования активных форм кислорода; и 3) в повреждения мтДНК. Среди препаратов, применяемых в медицине, группы с эффектом на дыхательной цепи, это внутривенные анестетики (внутривенные - барбитураты; летучие - галотан, изофлуран, и севофлуран; местные - бупивакаин и артикаина), гиполипидемические препараты 15 (фибраты и статины), тиазолидиндионы), противодиабетические антиаритмические нейролептики (галоперидол, аминазин, (бигуаниды (бета кветиапин и блокаторы), и рисперидон), и некоторые антибиотики (хлорамфеникол) [Finsterer, Segall, 2010]. Препараты, влияющие на метаболизм митохондрий Действию препаратов подвергаются два из основных митохондриальных метаболических путей: цикл трикарбоновых кислот (ЦТК) и β-окисление жирных кислот (ОЖК). Ингибирование митохондриального ОЖК может привести к накоплению свободных жирных кислот и триглицеридов в цитоплазме в виде мелких пузырьков или больших вакуолей. Аккумулированные жирные кислоты и их производные могут оказывать токсическое действие на митохондриальное дыхание, синтез АТФ, синтез кетоновых тел, и глюконеогенез [Rial et al., 2010]. Хотя гликолиз протекает в цитоплазме клетки, в присутствии кислорода полное окисление пирувата (конечный продукт гликолиза) происходит в митохондриях. В раковых клетках биоэнергетика переходит к аэробному гликолизу (эффект Варбурга), что, по своей сути, является митохондриальным дефектом. Среди гликолитических ингибиторов можно найти перспективные препараты для противоопухолевой терапии (наличие раковых клеток отображает повышенную активность гликолиза). Эти препараты оказывают влияние на ферменты, ответственные за превращение глюкозы в лактат, это, например, гексокиназы (2-дезоксиглюкозы, 3бромпируват, лонидамид и метилжасмонат), глюкозо-6-фосфат изомераза (D-фруктоза-6-фосфат и 6-фосфо-глюконовая кислота) фосфофруктокиназа [(3- (3-пиридинил) -1- (4-пиридинил) -2-пропен-1-он)], триозофосфатизомераза (орнидазол), пируват киназа (флюорофосфаты, креатинфосфата, CAP-232 / TLN-232), лактатдегидрогеназы (оксалат, оксамат) и пируват-дегидрогеназы киназы (дихлорацетат) [Pathania et al., 16 2009]. Препараты, влияющие на проницаемость мембран митохондрий Хорошо известно, что целостность мембраны митохондрий имеет решающее значение для митохондриальной функции. Не только внутренние и внешние мембраны являются мишенью для лекарственных препаратов, но и многие белки, ионные каналы и транспортеры, встроенные в липидную мембрану. Основными лекарственными препаратами, оказывающими влияние на целостность мембраны являются: 1) сложные регуляторы PTP (например, циклоспорин А), 2) регуляторы каналов калия внутренней митохондриальной мембраны (например, диазоксид и глибенкамид), 3) регуляторы обмена Na+ / Ca2+ (например, CGP37157), 4) кардиолипин и 5) липофильные катионы, направленные на внутреннюю митохондриальную мембрану (например, родамин-123). Наиболее интересными в качестве митохондриальных мишеней для многих препаратов являются белки, образующие комплекс PTP во внутренней и внешней мембране митохондрий. Этот белковый комплекс отвечает за проницаемость митохондрий и играет решающую роль в сигнальных путях гибели и выживания клетки. В зависимости от фармакологической стратегии, можно активировать проницаемость митохондриальной мембраны или защитить ее целостность. Активация PTP вызывает апоптоз и предотвращает дифференцировку многих опухолевых клеток. Стратегии, вызывающие этот эффект, как правило, связаны с прямым действием против белкового комплекса PTP или непрямой активацией через истощение эндогенных ингибиторов PTP или увеличение ионов кальция и АФК в цитоплазме. В противораковых терапевтических подходах используются различные сложные ингибиторы PTP, в том числе: 1) модуляторы адениннуклеотид транслоказы, 2) модуляторы бензодиазепиновых рецепторов, 3) модуляторы ионных каналов; 4) препараты, влияющие на циклофилин D, такие как циклоспорин А и 17 санглиферин; 5) креатинкиназные модуляторы, такие как креатин ициклокреатин; и 6) гексокиназные модуляторы, такие как глюкоза и глюкозо-6-фосфат [Neuzil et al., 2012]. Кардиолипин, уникальный отрицательно заряженный фосфолипид, локализованный во внутренней митохондриальной мембране. Кардиолипин поддерживает Изменение мембранный потенциал и целостность митохондрий. содержания кардиолипина сопряжено с митохондриальной дисфункцией во многих тканях при различных патологических состояниях, включая ишемию, старение, и сердечную недостаточность [Biasutto et al., 2010]. В качестве препаратов и биологически активных молекул, действующих на митохондрии in vivo разрабатываются липофильные катионы и белки [Smith et al., 2011]. Липофильные катионы стремительно и обширно поглощаются митохондрией в естественных условиях, влияя на трансмембранный обусловлено потенциал и проницаемость митохондрий. Это высоким мембранным потенциалом митохондрий [∆ψm (отрицательным внутри)] [Smith, et al., 2011]. Препараты, влияющие на мтДНК и синтез белка Эти препараты взаимодействуют в основном с митохондриальной полимеразой-γ (например, менадион и противовирусные препараты), с митохондриальной рибосомальной РНК (например, хлорамфеникол и тиамфеникол) и с митохондриальными топоизомеразами (например, амсакрин, этопозид и тенипозид) [Neuzil et al., 2012]. Митохондриальная ДНК более восприимчива к окислительному повреждению, чем ядерная ДНК из-за отсутствия гистонов и эффективного репарационного механизма в митохондриях. К тому же мтДНК близко расположена к дыхательной цепи. Препараты, снижающие синтез мтДНК используются в лечении 18 вируса иммунодефицита человека или гепатита В. Наиболее распространенными противовирусными препаратами являются зидовудин, диданозин, ламивудин, ставудин, абакавир, действующие как ингибиторы вирусной обратной транскриптазы [Scatena et al., 2007; Apostolova et al., 2011]. Некоторые антибиотики ингибируют синтез белка в митохондриях. В соответствии с эндосимбиотической теорией, митохондриальные рибосомные РНК (рРНК; 12S и 16S) напоминают рРНК эубактерий (16S и 23S). По этой причине, некоторые бактериальные антибиотики, такие как аминогликозиды, хлорамфеникол и эритромицин синтез белка митохондрий также действуют на [Cohen, 2010]. Хлорамфеникол, связываясь с рибосомальной субъединицей, ингибирует синтез белка в бактериях и митохондриях. Линезолид уменьшает активность комплексов дыхательной цепи, которые содержат белки, кодируемые мтДНК. Амфифильный катионный препарат эритромицин связывается с рибосомальной субъединицей бактерии, подавляя передачу аминокислот из аминоацилтРНК пептидной цепи. 1.6 Мембранный механизм действия цитотоксических белков на клетки В настоящее время известно, что нарушение целостности мембраны лежит в основе механизма действия на клетки различных токсинов, вирусных и антибактериальных белков [Epand, Vogel, 1999]. Такие белки образуют каналы, оказывают прямое или косвенное влияние на транспортные белки, изменяя мембранную вязкость и упаковку липидов, в результате чего в некоторых случаях даже возможен перенос белка внутрь клетки. В то же время, некоторые патологии, выявляемые в организме человека и животных, также являются результатом изменения нормальной структуры клеточной мембраны, которое ведет к нарушению гомеостаза, 19 трансмембранного электрохимического градиента и сигнальных систем клетки. К таким патологиям относят образование прионов и β-амилоидных структур при неправильном процессинге молекул белка в клетках организма в результате эти белки становятся способными проявлять цитотоксический эффект взаимодействуя с цитоплазматической мембраной [Gotte, Libonati, 2004]. Известно, что в норме живые клетки используют гидрофобные белки для слияния клеточных мембран и осуществления специализированного транспорта через клеточную мембрану. Цитотоксичные белки также обычно классифицируются как гидрофобные или амфипатические и несут на своей поверхности определенный положительный заряд, который обеспечивает взаимодействие с отрицательно заряженными биологическими мембранами. Положительный заряд этих белков определяется в большинстве случаев наличием в их последовательности остатков лизина и аргинина и может изменяться под действием рН в результате ионизации аминокислотных остатков, таких как гистидин. Данные литературы указывают на то, что степень заряда важный параметр определяющий адсорбцию цитотоксичных белков на клеточной мембране. Увеличение заряда в некоторых случаях усиливает действие белка в результате увеличения электростатического сродства или способствуя стабилизации вторичной структуры. Нарушения мембраны, вызванные электростатическими взаимодействиями между белком и липидами чаще всего недолговечны и обратимы. В то же время, большинство мембранотропных белков необратимо действуют на мембрану в результате внедрения в гидрофобную часть липидного бислоя. Следовательно, гидрофобные регионы молекулы белка - главный фактор влияющий на способность белка взаимодействовать с липидной мембраной. В некоторых случаях изменение ряда факторов, например рН, может спровоцировать взаимодействие белков с мембраной. В других случаях, изменение вторичной структуры и экспонирование гидрофобных участков 20 молекул белков происходит при ассоциации белков. То есть, существует определенная связь между вторичной структурой белка, расположением гидрофобных остатков и липид белковыми взаимодействиями [Epand, Vogel, 1999]. Известно, что белковая молекула стабилизируется тогда, когда гидрофобные и заряженные части молекулы находятся в условиях, которые для них наиболее благоприятны. Расчет энергии позволяет предположить, что гидрофобные пептиды в зависимости от их структуры различаются по способности внедряться и формировать ионные каналы в мембране. Следовательно, взаимодействие белка и мембраны может сопровождаться изменением вторичной структуры протеина. Эти изменения, будут происходить в направлении экспонирования гидрофобных остатков, которые будут стабилизированы путем внедрения их в гидрофобное «ядро» мембраны [Kourie, Henry, 2002]. Таким образом, предположительно состоит электростатическое аминокислотных механизм из внедрения двух взаимодействие остатков с белка в мембрану последовательных положительно отрицательно заряженными этапов: заряженных головками липидных молекул, и последующее внедрение гидрофобных регионов белка в гидрофобное пространство липидного бислоя. Это объясняется тем, что электростатическое взаимодействие приводит к увеличению свободной энергии в области взаимодействия, позволяя белку внедриться в мембрану, что ведет к уменьшению свободной энергии, которое стабилизирует систему. Результатом такого внедрения может быть нарушение целостности мембраны в результате адсорбции большого количества молекул белка, изменения в толщине липидного бислоя окружающего белок или формирование пор и каналов. Таким образом, гидрофильно-гидрофобный баланс играет важную роль в определении масштаба и механизма нарушения целостности мембраны [Ostolaza et al., 1997]. 21 Очевидно, что изменения мембраны, вызванные белком, зависят от природы пептида и взаимодействующих с ним липидов. Липидная композиция мембраны может быть главной причиной наблюдаемых различий во взаимодействии белков и мембраны разных типов клеток. В частности, композиция мембраны может определять цитотоксический эффект белка. Выявление важности факторов окружающей среды и структуры белка, влияющих на взаимодействие цитотоксичных белков с мембраной, и выявление общего механизма действия позволит моделировать широкий спектр лекарств и объяснить основные принципы взаимодействия белков с мембраной. 1.7 Фуллерены Наноматериалы – это небольшие молекулы с заданной определенной биологической активностью, которые получили широкое применение за последние 30 лет. В частности, путем индукции митохондриальной дисфункции, наночастицы могут влиять на нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера и другие виды деменции, синдром Паркинсона, латеральный амиотрофический склероз и болезнь Хантингтона.[ Migliore, Coppede, 2009]. Наиболее перспективными в этом отношении являются фуллереновые наночастицы. Фуллерены – это молекулы новой аллотропной модификации углерода (названы так в честь американского инженера и архитектора ячеистых куполов Бакминстера Фуллера). Фуллерены представляют собой устойчивые многоатомные кластеры углерода с числом атомов N≥24 и размером, примерно, 1 нм. После того как была решена проблема производные фуллерена активно изучаются плохой растворимости, как потенциальные антиоксидантные, противоопухолевые и противовирусные средства. Весьма перспективным является применение фуллеренов в фото- и радиотерапии 22 раковых заболеваний. Продолжается успешный поиск противоопухолевых препаратов среди самих фуллеренов. Особенно интенсивно исследуются антиоксидантные свойства этих структур. Традиционно считается, что способность производных фуллерена инактивировать свободные радикалы зависит от числа неразорванных двойных связей в их углеродном каркасе [Krustic et al., 1991]. Однако в ряде работ описаны и другие механизмы нейтрализации радикалов (без их непосредственной адсорбции на фуллереновый каркас) [Ali et al., 2004; Pressac et al., 2005]. Обобщая известные экспериментальные данные, полученные in vitro и in vivo, можно сказать, что производные фуллеренов способны регулировать в живых организмах свободно-радикальные процессы, инактивируя супероксидный, гидроксидный анион-радикалы и синглетный кислород [Gharbi et al., 2005; Bensasson et al., 2000], что, в конечном счѐте, и определяет многообразие биологических и фармакологических эффектов этих соединений. Описано фуллерена в множество возможностей применения производных медицине [Miller et al., 2007]. Одним из перспективных направлений дальнейшего изучения фуллеренов как фармакологических препаратов является выяснение влияния этих веществ на сигнальные пути апоптоза. Однако прогнозирование про- и антиапоптотических свойств различных производных фуллерена, тем более для различных типов клеток, пока еще затруднено. На сегодняшний день имеются сведения как об потенциально опасных, так и о, безусловно, положительных свойствах фуллереновых наночастиц [Bystrzejewska-Piotrowska et al., 2009]. В связи с этим для прогнозирования физико-химических и биологических свойств производных фуллерена активно используются компьютерные подходы и метод теории функционала плотности (density functional theory, DFT) [Jalbout et al., 2007]. В то же время при терапии таких тяжелых заболеваний, как рак, ВИЧинфекция, болезни Альцгеймера 23 и Паркинсона, латеральный амиотрофический склероз, применение фуллеренов может принести значительный успех уже сегодня. 24 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1 Объекты и материалы Штамм дрожжей Yarrowia lipolytica, получен из американской коллекции дрожжей АТСС под номером 34088. Регистрационный номер в коллекции: Y-3153. Дрожжи выращивали на среде Сабуро с добавлением агара (15 г/л) при 300С. Через 24 часа клетки дрожжей смывали с твѐрдой среды и промывали 0.9% раствором NaCl, осаждая центрифугированием в течение 5 минут. Суспендированный в 0.9% растворе NaCl осадок разводили до концентрации 106 клеток/мл и использовали в эксперименте. Исследования выполняли с клеточной культурой, находящейся в фазе логарифмического роста. Лейкоциты выделяли из венозной крови здоровых доноров добровольцев, от которых было получено предварительное согласие. Биназа (КФ 3.1.27.1) - секретируется грамположительными спорообразующими почвенными бактериями Bacillus pumilus [Шарипова с соавт., 2011]. Аминокислотная последовательность биназы состоит из 109 аминокислотных остатков [Aphanasenko et al., 1979].Пространственная структура биназы определена с помощью спектроскопии ядерного магнитного резонанса (PDB ID: 1BUJ) [Reibarkh et al., 1998]. В экспериментах использовали электрофоретически гомогенный препарат биназы, полученный по методике, описанной в работе [Голубенко с соавт., 1979]. В химическом отношении РНКаза Вi представляет собой щелочной белок с молекулярной массой 12,3 кДа и изоэлектрической точкой вблизи рН,9,5. Максимальная активность фермента наблюдается при рН 8,5. Водорастворимые метанофуллерены С60[C13H18O4((OH)4]6 и С60[C11H12O4((OH)4]6 получены снятием ацетонидной защиты с исходного 25 хроматографически чистого гекса-метанофуллерена, содержащего ацетонидные группы [Gilmutdinova et al., 2014] (рисунок 1). А Б Рисунок 1 - Структуры водорастворимых метанофуллеренов С60[C13H18O4((OH)4]6 (А) и С60[C11H12O4((OH)4]6 (Б) Образцы С60[РО(ОН)РО(ОН)2РО(ОН)2]2 и С60[СООС5Н3((СH3)4NO]2 получены по методам, описанным в работе [Gilmutdinova et al., 2014]. 2.2 Методы 2.2.1 Определение митохондриального потенциала Δψm методом лазерной проточной цитометрии Трансмембранный митохондриальный потенциал измеряли с помощью витального рациометрического катионного флуорохрома JC-1(Catalog No. 70011, Biotium, Inc. USA) на двухлазерном проточном цитометре FACSCalibur (BD, USA), оснащенном двумя лазерами с длиной волны 488 нм и 635 нм. В качестве позитивного контроля применяли протонофорный разобщитель окислительного фосфорилирования карбонилцианид-3-хлорфенилгидразон СССР (Catalog No. ab141229, Abcam, UK). 26 2.2.2 Определение влияния биназы на митохондриальный потенциала Δψm клеток дрожжей Дрожжи, суспендированные в 0.9% растворе NaCl (106 клеток/мл ) помещали в пробирки BD Falcon (Cat. No. 352235) для проточной цитометрии. В клеточную суспензию вносили СССР в конечной концентрации 100 µmol/L (позитивный контроль) и биназу в конечных концентрациях 400 мкг/мл и 40 мкг/мл. Пробы инкубировали 1 час при 27 оС. Затем добавляли флуорохром JC-1 в конечной концентрации 20 µmol/L. Клетки выдерживали с красителем при комнатной температуре в темноте в течение 15 мин, после чего проводили измерение на проточном цитофлуориметре со скоростью не более 1000 клеток/сек в программе Cell Quest Pro®. В каждом варианте опыта записывали не менее 30 000 клеточных событий. Полученные файлы анализировали при помощи программного обеспечения Weasel v2.2.3, нормированный митохондриальный потенциал выражали в условных единицах как соотношение красного и зеленого сигналов флуоресценции FL2/FL1, генерируемых димерами и мономерами JC-1, соответственно. Статистическую обработку результатов выполняли по критерию Хи-квадарат с коррекцией Yates для сравнения долей и непараметрическому критерию Колмогорова-Смирнова (пакет программ STATISTICA 6.0). 2.2.3 Определение влияния производных фуллерена на митохондриальнй потенциал Δψm дрожжей Дрожжи, суспензированные в 0.9% растворе NaCl (106 клеток/мл) помещали в пробирки BD Falcon (Cat. No. 352235) для проточной цитометрии. В клеточную суспензию вносили СССР в конечной концентрация 5 µmol/L (положительный контроль) и фуллерены в конечных концентрациях 10 мкг/мл и 100 мкг/мл. Пробы инкубировали 2 часа при 27 о С. Затем добавляли флуорохром JC-1 (конечная концентрация 20 µmol/L). Клетки выдерживали с красителем при комнатной температуре в темноте в 27 течение 15 мин, после чего проводили измерение на проточном цитофлуориметре со скоростью не более 1000 клеток/сек в программе Cell Quest Pro®. В каждом варианте опыта записывали не менее 30 000 клеточных событий. Нормированный митохондриальный потенциал выражали в условных единицах как соотношение красного и зеленого сигналов флуоресценции FL2/FL1, генерируемых димерами и мономерами JC-1, соответственно. обеспечения Файлы Weasel анализировали v2.2.3. при Статистическую помощи обработку программного результатов выполняли по критерию Хи-квадарат с коррекцией Yates для сравнения долей и непараметрическому критерию Колмогорова-Смирнова (пакет программ STATISTICA 6.0). 2.2.4 Определение влияния биназы на митохондриальный потенциал субпопуляции лейкоцитов Гепаринизированную венозную кровь условно здоровых доноров отстаивали в течение 30 минут при 37 оС, отбирали слой сыворотки с лейкоцитами и отмывали клетки центрифугированием (200 g, 5 мин). Полученный осадок лейкоцитов ресуспензировали в растворе Хэнкса / 1% ЭТС (pH 7-8) до конечной концентрации 106 клеток/мл и раскапывали по 1 мл в пробирки для проточной цитометрии (Falcon 352054, BD). В опытные пробы вносили раствор биназы в буферном солевом растворе Хэнкса (конечная концентрация 400 и 100 мкг/мл). В контрольные пробы вносили буферный солевой раствор Хэнкса в эквивалентном объеме. Клетки инкубировали 2 часа при 37°C. После инкубации клетки дважды промывали в буферном солевом растворе Хэнкса центрифугированием при 250 g в течение 5 минут, ресуспензировали в 500 мкл буфера и вносили флуорохромы. Пробы инкубировали 10 минут при 37˚С и анализировали на проточном цитофлуориметре. Гепаринизированную венозную кровь в концентрации 106 клеток/мл помещали в пробирки BD Falcon (Cat. No. 352235) для проточной 28 цитометрии. В клеточную суспензию вносили СССР в конечной концентрации 100 µmol/L (позитивный контроль) и биназу в конечных концентрациях 400 мкг/мл и 100 мкг/мл. Пробы инкубировали 2 часа при 37 о С. Затем добавляли флуорохром JC-1 в конечной концентрации 20 µmol/L и аллофикоцианин CD3 30 µmol/L. Клетки выдерживали с красителями при комнатной температуре в темноте в течение 15 мин, после чего проводили измерение на проточном цитофлуориметре со скоростью не более 1000 клеток/сек в программе Cell Quest Pro®. В каждом варианте опыта записывали не менее 5 000 клеточных событий. Полученные файлы анализировали при помощи программного обеспечения Weasel v2.2.3, статистическую обработку результатов выполняли по критерию Хи-квадарат с коррекцией Yates для сравнения долей и непараметрическому критерию Колмогорова-Смирнова (пакет программ STATISTICA 6.0). 2.2.5 Оценка экспрессии фосфатидилсерина и проницаемости цитоплазматической мембраны методом проточной цитометрии Гепаринизированную венозную кровь условно здоровых доноров отстаивали в течение 30 минут при 37 оС, отбирали слой сыворотки с лейкоцитами и отмывали клетки центрифугированием (200 g, 10 мин). Полученный осадок лейкоцитов ресуспензировали в фосфатно-солевом буфере (pH 7,4) до конечной концентрации 106 клеток/мл и раскапывали по 250 мкл в пробирки BD Falcon (Cat. No. 352235) для проточной цитометрии. В опытные пробы вносили раствор биназы в фосфатно-солевом буфере (конечная концентрация 400 мкг/мл), и пероксида водорода (конечная концентрация 3 мМ). В контрольные пробы вносили фосфатно-солевой буфер в эквивалентном объеме. Клетки инкубировали в течение 3 часов в СО2-инкубаторе при 37°C и 100% влажности. После инкубации клетки дважды промывали в фосфатно-солевом буфере центрифугированием при 250 g в течение 5 минут, затем ресуспензировали в 500 мкл буфера и вносили флуорохромы в указанных выше 29 конечных концентрациях. Пробы инкубировали 10 минут в атмосфере 5% СО2 при 37˚С, после чего проводили измерения на проточном цитофлуориметре. Экспрессию фосфатидилсерина (ФС) и проницаемость плазматической мембраны оценивали по модифицированному протоколу [Laakko et al., 2002]. В суспензию, содержащую цитометрическим анализом 106 клеток/мл, вносили непосредственно ФС-связывающий перед флуорохром мероцианин 540 [MC540] (Sigma) в конечной концентрации 0,2 мкг/мл. Для оценки проницаемости плазматической мембраны в клеточную суспензию одновременно с MC540 вносили TO-PRO-3-йодид (Invitrogen) в конечной концентрации 0,2 экспонированного M. МС540 связывается с остатками фосфатидилсерина, на мембране апоптозных клеток. ДНК-тропный флуорохром TO-PRO3 проходит внутрь клетки через поврежденную цитоплазматическую мембрану и окрашивает ДНК. Лимфоидную, моноцитарную и гранулоцитарную субпопуляции выделяли по показателям прямого (FSC, диаметр клетки) и бокового (SSC, гранулярность клетки) светорассеяния (рисунок 2). Рисунок 2 - Исследуемые регионы: R1 – гранулоциты, R2 – моноциты, R3 – лимфоциты После исключения дебриса и выделения лимфоидного, моноцитарного и гранулоцитарного гейтов, определяли долю интактных клеток (фенотип 30 MC540(-)TO-PRO3(-)), долю клеток на ранней стадии апоптоза (фенотип MC540(+)TO-PRO3(-)), клеток на поздней стадии апоптоза (фенотип MC540(+)TO-PRO3(+)) и некротических клеток (фенотип MC540(-)TO- PRO3(+)) (рисунок 3). На каждый вариант опыта просчитывали не менее 25000 клеток. Результаты измерений обрабатывали в программе CellQuest Pro (BD Biosciences), статистический анализ полученных результатов выполняли по критерию хи-квадрат с коррекцией Yates в пакете прикладных программ STATISTICA 6.0. Рисунок 3 - Цитометрическое распределение клеток при двойном окрашивании MC540 и TO-PRO-3: 1 – интактные клетки; 2 – ранний апоптоз; 3 – поздний апоптоз; 4 – некроз 2.2.6 Определение количества колониеобразующих единиц (КОЕ) Для определения процента выживания после обработки биназой (1 час) суспензию клеток разводили и высеивали на твердую среду в чашки Петри. Через 24 часа подсчитывали количество образовавшихся колоний. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью красителя метиленового синего. 31 2.2.7 Определение протеолитической активности в клетках дрожжей Для определения количества клеток дрожжей с протеолитической активностью производили посев по 1 куб. см. на чашки Петри и заливали молочным агаром. Чашки Петри с посевами выдерживали в термостате при 27 ˚С в течение 48 ч, и после этого подсчитывали число выросших колоний с протеолитической активностью. 2.2.8 Статистическая обработка результатов Статистическая экспериментов описана обработка в результатов соответствующих цитометрических методиках. Остальные эксперименты проводились в 3-5 повторностях и обрабатывались с использованием стандартного пакета программ Microsoft Excel 2007. Статистическая значимость различий между экспериментами рассчитывалась по критерию Стъюдента. Стандартное отклонение ( ) не превышало 5 %. 32 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1 Разработка модели для анализа индивидуальных митохондриальных ответов клеток с применением Yarrowia lipolytica Сходство структур митохондриального комплекса I (NADH:убихинон оксидоредуктаза, E.C. 1.6.5.3) и дыхательных цепей млекопитающих и строгих аэробов дрожжей Yarrowia lipolytica позволяет использовать Yarrowia lipolytica в качестве модели для изучения митохондриальных дисфункций человека [Nicaud, 2012]. Нами проведены три независимых эксперимента, в которых были получены воспроизводимые результаты. Репрезентативный анализ одного из экспериментов представлен на рисунке 4. На основании параметров диаметра и гранулярности была выделена целевая субпопуляция активно делящихся клеток (рисунок 4А, регион R0), для которой было установлено соотношение сигналов клеточной аутофлуоресценции в FL2 и FL1 детекторах проточного цитометра (рисунок 4Б). Интактные окрашенные клетки содержали поляризованные митохондрии, накапливающие димеры JC-1 (рисунок. 4В), в то время как дрожжи, обработанные разобщителем окислительного фосфорилирования протонофором СССР, демонстрировали выраженное снижение доли клеток с поляризованными митохондриями (с 96,7 % до 11,6 %) и 15-кратное уменьшение митохондриального потенциала в указанной субпопуляции с 593,5 у.е. до 40,0 у.е. (рисунок 4Г). В доступных базах данных мы не нашли публикаций, использующих указанный методический подход для Yarrowia lipolytica. Предлагаемая модель имеет ряд преимуществ перед другими методическими подходами в области биоэнергетики, поскольку позволяет определять трансмембранный митохондриальный потенциал в неразрушенных клетках (без выделения митохондрий), имеет внутренний положительный контроль (разобщитель 33 окислительного фосфорилирования СССР), и обеспечивает нормированные измерения трансмембранного митохондриального потенциала с учетом гетерогенности клеточных размеров и числа митохондрий в отдельной клетке. Рисунок - 4. Цитофлуориметрическое определение трансмембранного митохондриального потенциала Ψm Yarrowia lipolytica. А : выделение целевого региона клеток R0 с большим диаметром и гранулярностью (~ активно делящаяся субпопуляция). Б : соотношение красной (FL2) и зеленой (FL1) аутофлуоресценций (АФ) неокрашенных интактных клеток, по которому устанавливается cut off для квадрантной статистики. В : негативный контроль: интактные клетки, окрашенные JC-1, медиана Ψm в у.е. Г : позитивный контроль : клетки, обработанные СССР, и окрашенные JC-1 (P < 0.001 vs контроля) Д : клетки, обработанные биназой 40 мкг/мл, и окрашенные JC-1 (P < 0.001 vs контроля) Е : клетки, обработанные биназой 400 мкг/мл, и окрашенные JC-1 (P < 0.001 vs контроля) 34 3.2 Влияние биназы на трансмембранный потенциал клеток дрожжей Yarrowia lipolytica Одним из биологически активных веществ, исследованных в настоящей работе, является бактериальная рибонуклеаза – биназа, которая наряду с другими РНКазами, вызывает интерес как потенциальный противоопухолевый препарат нового поколения [Makarov et al., 2008]. Обнаруженный в биназе in silico гидрофобный НФ сегмент [Shirshikov et al., 2013], способный к термодинамически выгодному взаимодействию с липидным бислоем предопределяет еѐ мембранотропность и обосновывает выбор еѐ для наших исследований. Результаты дрожжами экспериментов сопровождается показали, что снижением доли инкубация клеток с биназы с активными митохондриями и уровнем митохондриального потенциала в них, что свидетельствует о деполяризации мембраны митохондрий под влиянием биназы. Эффект зависит от концентрации препарата (рисунок 4Д, Е). Деполяризация мембраны митохондрий, как известно, отражает нарушение еѐ проницаемости [Ковалѐва, 2009], которое в свою очередь может быть обусловлено изменением ионного гомеостаза внутри клетки под влиянием биназы. Часовая инкубация Yarrowia lipolytica с биназой (400 мкг/мл) не влияла на жизнеспособность клеток в тесте с метиленовым синим, однако приводила к снижению числа колониеобразующих единиц (КОЕ) на 30% по сравнению с контролем (рисунок 5). Цитостатический эффект бактериальной биназы в отношении дрожжей Yarrowia lipolytica может быть проявлением биомеханизмов, обеспечивающих видовые конкурентные преимущества в общих экологических нишах. Снижение митохондриального потенциала в клетках дрожжей наблюдается уже через 15 минут инкубации с биназой (400 мкг/мл) (таблица 1). Интересно, что после 120 минут инкубации происходило увеличение доли клеток с высоким Δψm и повышение в них митохондриального 35 потенциала. Мы объясняем это тем, что дрожжи в отсутствие питательной среды использовали биназу в качестве субстрата для выживания. Анализ подтвердил наличие высокой протеолитической активности у данного вида дрожжей. Таблица 1 - Влияние высокой концентрации биназы на митохондриальный потенциал дрожжей в зависимости от времени Митохондриальный мембранный потенциал Δψm, у.е. 78,3 Контроль Биназа (400 58,5 мкг/мл) 15 мин. Биназа (400 112,6 мкг/мл) 120 мин. Доля клеток с Доля клеток с высоким Δψm, низким Δψm, % % 72,4 27,6 3 97 9,18 90,8 120 100 80 Количество КОЕ % 60 40 20 0 Контроль (интактные клетки) Клетки + Биназа (40 мкг/мл) Клетки + Биназа (400 мкг/мл) Рисунок - 5. Зависимость количества колониеобразующих единиц от концентрации биназы 36 3.3 Влияние биназы на трансмембранный потенциал субпопуляций лейкоцитов крови человека Биназа как потенциальное лекарственное средство, попадая в организм, может действовать на разные клетки и субклеточные мишени, но, в первую очередь, это будут клетки крови. Результаты проведѐнных нами исследований показали, что биназа избирательно влияет на трансмембранный митохондриальный потенциал Ψm субпопуляций лейкоцитов крови человека ex vivo. При кратковременной (15 минут) экспозиции клеток с биназой только в моноцитах наблюдалась гиперполяризация мембран митохондрий. Доля моноцитов с высоким митохондриальным потенциалом увеличивалась в 2,2 раза (рисунок 6). Более продолжительная инкубация с биназой (3 часа) приводила к снижению митохондриального потенциала у моноцитов (данные не приводятся) и индуцировала увеличение доли моноцитов в фазе позднего апоптоза [MC540(+)TO-PRO-3(+) фенотип] в 2,1 раза. У других субпопуляций лейкоцитов (гранулоцитов и лимфоцитов) исследуемые параметры не менялись по сравнению с контролем (интактные клетки) (рисунок 7). В ряде работ показано, что некоторые индукторы апоптоза задолго до экспрессии фосфатидилсерина на поверхность цитоплазматической мембраны и фрагментации ядра вызывают временную гиперполяризацию митохондрий, что увеличивает генерацию активных форм кислорода, и приводит к клеточной гибели [Severin et al.,2010]. Наблюдаемое нами соответствие доли клеток с высоким Ψm с долей клеток в позднем апоптозе косвенно подтверждает эту закономерность, однако предположение требует дополнительных доказательств. 37 высказанное Рисунок - 6. Избирательное влияние биназы на трансмембранный митохондриальный потенциал Ψm субпопуляций лейкоцитов крови человека Рисунок - 7. Влияние биназы на экспрессию ФС и проницаемость цитоплазматической мембраны субпопуляций лейкоцитов крови человека 38 Водорастворимые 3.4 метанофуллерены - разобщители окислительного фосфорилирования Химические соединения, способные избирательно накапливаться в митохондриях и разобщать окислительное фосфорилирование, являются перспективными средствами борьбы с такими патологическими состояниями, которые сопровождаются повышенной генерацией свободных радикалов (паркинсонизм, болезнь Альцгеймера, старение, инсульт, ишемия и др.) [Massaad et al., 2009]. Группой академика Скулачева уже создан ряд таких веществ, так называемых ионов Скулачева SkQ, которые благодаря своей структуре и катионной природе, могут накапливаться в митохондриях и снижать избыточный митохондриальный потенциал, сокращая тем самым продукцию кислородных радикалов [Severin et al., 2010; Skulachev et al., 2010]. При этом митохондрии сами регулируют поступление подобных веществ, поскольку скорость их проникновения в митохондрии зависит от величины митохондриального потенциала. Ещѐ более многообещающими являются соединения, которые включают в себя и свойства разобщителя, нормализующего митохондриальный потенциал, и свойства антиоксиданта, нейтрализующего уже имеющиеся АФК. На роль разобщителей окислительного фосфорилирования могут претендовать фуллерены. Как цитировалось выше, с помощью метода теории функционала плотности предложен механизм, согласно которому фуллерены способны поглощать протоны (рисунок 8), накапливаться в митохондриях и снижать митохондриальный потенциал и продукцию АФК, то есть проявлять свойства разобщителя фосфорилирования и дыхания. 39 Рисунок - 8. Распределение заряда в зависимости от количества протонов в структуре фуллерена. Фуллерен с 2 протонами имеет нейтральный заряд (красный), в то время как фуллерен с 4 и 6 протонами имеют положительный заряд (зеленый и синий). Протоны меняют заряд от положительного к нейтральному (от синего к оранжевому) [Chystiakov et al., 2013] Настоящая работа является первой, в которой исследуется влияние двух новых водорастворимых С60[C11H12O4((OH)4]6 на фуллеренов трансмембранный С60[C13H18O4((OH)4]6 потенциал митохондрий и и способность этих структур разобщать окислительное фосфорилирование. На рис.9 представлены результаты одного из трѐх независимых экспериментов, в которых было исследовано влияние водорастворимых производных фуллерена на митохондриальный потенциал в клетках дрожжей. В каждом из экспериментов были получены воспроизводимые результаты. Полученные экспериментальные данные (рисунок 9) позволяют сделать следующий вывод. Фуллерен С60[C13H18O4((OH)4]6 и его аналог С60[C11H12O4((OH)4]6 действуют как разобщители окислительного фосфорилирования, снижая долю клеток с высоким митохондриальным потенциалом Ψm в сравнении с интактным контролем. При концентрации фуллеренов 10 мкг/мл доля клеток с высоким Ψm уменьшилась на 68,2% по 40 сравнению с контролем для С60[C13H18O4((OH)4]6 (Ful4) и на 79,54 %, для С60[C11H12O4((OH)4]6 (Ful5) (рисунок 9 Д,Ж). При концентрации 100 мкг/ мл это cнижение составило 89,2% и 98,2% соответвенно (рисунок 9 Е,З). Таким образом, при одинаковых концентрациях фуллерен С60[C13H18O4((OH)4]6 проявляет несколько меньшую эффективность, чем его аналог. Вероятнее всего, это связано с различиями в их структуре (рисунок 1). Первое производное имеет в своѐм составе больше метильных групп, которые повышают его гидрофобность, что, скорее всего, и влияет на величину проявляемого им эффекта. 41 Рисунок - 9. Цитофлуориметрическое определение трансмембранного митохондриального потенциала Ψm Yarrowia lipolytica. А: выделение целевого региона клеток R0 с большим диаметром и гранулярностью (~ активно делящаяся субпопуляция). Б: соотношение красной (FL2) и зеленой (FL1) аутофлуоресценций (АФ) неокрашенных интактных клеток, по которому устанавливается cut off для квадрантной статистики В: негативный контроль: интактные клетки, окрашенные JC-1, медиана Ψm в у.е., Г: позитивный контроль : клетки, обработанные СССР, и окрашенные JC-1, Д: клетки, обработанные фуллереном С60[C13H18O4((OH)4]6 в концентрации 10 мкг/мл и окрашенные JC-1, Е: клетки, обработанные фуллереном С60[C13H18O4((OH)4]6 в концентрации 100 мкг/мл и окрашенные JC-1, Ж: клетки, обработанные фуллереном С60[C11H12O4((OH)4]6 в концентрации 10 мкг/мл и окрашенные JC-1, З: клетки, обработанные фуллереном С60[C11H12O4((OH)4]6 в концентрации 100 мкг/мл и окрашенные JC-1 42 Возможность медицинского окислительного фосфорилирования токсичностью, поскольку нарушает синтез АТФ, применения ограничивается снижение крайне разобщителей их потенциальной митохондриального необходимого для потенциала поддержания жизнедеятельности клетки и организма в целом. В этом отношении на модели дрожжей Yarrowia lipolytica нами получены обнадѐживающие результаты. Инкубация дрожжей в течение 120 минут с производными фуллерена в достаточно высокой концентрации (100 мкг/мл) не влияла на диаметр и гранулярность клеток. Нами изучено влияние на митохондриальный потенциал дрожжей ещѐ двух производных фуллерена С60[РО(ОН)РО(ОН)2РО(ОН)2]2 – F1 и С60[СООС5Н3((СH3)4NO]2 – F2 (рисунок 10), которые, как свидетельствуют результаты, не снижают трансмембранный потенциал митохондрий в рамках нашей модели. Эти производные отличаются от метанофуллеренов, вопервых, структурой, во-вторых, тем, что они не растворяются в 0,9 % растворе NaCl . Образец F1 растворяется в твине при рН 7–7,2, а образец F3 – в трисе (гидроксиметил)аминометан (HOCH2)3CNH2) при рН 9,0. Твин как поверхностно-активное вещество может по-разному действовать на микроорганизмы [Кочарли, 1983]. Что касается рН, то известно, что дрожжи Yarrowia lipolytica способны выдерживать щелочной стресс и эффективно расти на средах с щелочными значениями рН – вплоть до 10,5. [Posas, 1995]. В нашем эксперименте в отсутствие питательной среды оба фактора ( ПАВ и рН 9,0 ) оказывали на дрожжи негативное воздействие, которое выражалось в снижении митохондриального потенциала в контрольных пробах, куда вместо фуллеренов вносили трис или твин в соответствующих концентрациях. Однако в присутствии фуллеренов F1 и F2 в концентрации 10 мкг/мл токсическое действие растворителей на дрожжи заметно уменьшалось (рисунок 10). Фуллерен F1 увеличивал долю клеток с высоким Ψm в 12 раз, а фуллерен F2 - в 2 раза по сравнению с контролем. т.е. оба 43 препарата проявляли протекторный эффект. Полученные результаты находятся в полном соответствии с известными данными о протекторном действии этих производных in vivo [Andrievsky et al.,2009], которое, как полагают авторы, обусловлено их антирадикальной активностью. % Рисунок - 10. Влияние на Ψm дрожжей производных фуллерена F1 и F2. 1Контроль (интактные клетки); 2-Дрожжи+твин; 3-Дрожжи + F1(10 мкг/мл); 4-Дрожжи + F1(100 мкг/мл); 5- Дрожжи+трис; 6-Дрожжи + F2(10 мкг/мл); 7Дрожжи + F2(100 мкг/мл) F1 - С60[РО(ОН)РО(ОН)2РО(ОН)2]2 F2 - С60[СООС5Н3((СH3)4NO]2 44 Заключение Обобщая изложенные в настоящей работе результаты по исследованию митохондриальных эффектов биназы и фуллеренов, можно сделать следующее заключение. Биназа дифференцированно влияет на митохондриальный потенциал дрожжей Yarrowia lipolytica и моноцитов человека. Митохондриальный эффект биназы согласуется с нашими результатами компьютерного анализа цитотоксичности биназы in silico, объясняющими мембранотропную активность биназы наличием в ее составе гидрофобного сегмента. Выявленная С60[C13H18O4((OH)4]6 способность и водорастворимых С60[C11H12O4((OH)4]6 метанофуллеренов разобщать окислительное фосфорилирование также подтверждает предложенный in silico механизм антиоксидантного действия этих структур. Полученные нами результаты позволяют отнести исследованные метанофуллерены к веществам, специфически действующим на митохондрии, и обосновывают дальнейшее изучение их как перспективных антиоксидантов и регуляторов клеточной гибели. 45 ВЫВОДЫ 1) Разработан быстрый метод анализа индивидуальных митохондриальных ответов клеток дрожжей Yarrowia lipolytica на основе технологии проточной цитометрии и потенциал-чувствительного рациометрического флуорохрома JC- 1. Предлагаемая модель позволяет определять трансмембранный неразрушенных клетках, митохондриальный потенциал в имеет внутренний положительный контроль (разобщитель окислительного фосфорилирования СССР), и обеспечивает нормированные измерения трансмембранного потенциала с учетом гетерогенности митохондриального клеточных размеров и числа митохондрий в отдельной клетке. 2) дрожжей Биназа концентрационно-зависимо снижает Yarrowia с lipolytica активными долю клеток митохондриями и уровень митохондриального потенциала в них. При этом часовая инкубация Yarrowia lipolytica с биназой не влияла на жизнеспособность клеток, однако приводила к снижению числа колониеобразующих единиц по сравнению с контролем. 3) Биназа избирательно индуцирует кратковременную гиперполяризацию мембраны митохондрий в моноцитах и не влияет на митохондриальный потенциал в гранулоцитах и лимфоцитах 4) Установлено, что фуллерен С60[C13H18O4((OH)4]6 и его аналог С60[C11H12O4((OH)4]6 действуют как разобщители окислительного фосфорилирования, снижая долю клеток с высоким митохондриальным потенциалом Ψm в сравнении с интактным контролем. 46 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 1) Афанасенко, Г.А. Первичная структура рибонуклеазы Bacillus intermedius [Текст] / Г.А. Афанасенко, С.М. Дудкин, Л.Б. Каминир // Биоорган.химия.1979.-Т.5.- №2.-С.187-202. 2) Голубенко, хроматографией И.А. на Рибонуклеаза Bacillus фосфоцеллюлозе и intermedius7P. некоторые Очистка характеристики гомогенного фермента [Текст] / И.А. Голубенко, Н.П.Балабан, И.Б. Лещинская // Биохимия.- 1979. - Т.44 – С.640 – 648 . 3) Котельникова, А.В. Биохимия дрожжевых митохондрий [Текст] /А. В. Котельникова, Р. А. Звягильская // Наука.- 1973. –C.204-232. 4) Кочарли, Н.К. Изменение проницаемости и каталитической активности дрожжей в присутствии детергентов [Текст] /Н.К. Кочарли // Физикохимические механизмы в экстремальном воздействии на мембрану клеток.– Баку.- 1983.-C.631-638. 5) Шарипова, М. Р. Новое филогенетическое положение штамма Bacillus intermedius [Текст] / М.Р. Шарипова, А. А. Тойменцева, А. Р. Сабирова // 3-19 Микробиология.- 2011.-Т.80(3).-С.424-6. 6) Andrievsky, G.V. Peculiarities of the antioxidant and radioprotective effects of hydrated C60 fullerene nanostuctures in vitro and in vivo [Text] / G. V. Andrievsky , V. I. Bruskov, A. A. Tykhomyrov et al. // Free Radical Biology and Medicine. -2009.- V. 47 (6).P. 786–793. 7) Angelini, C. Mitochondrial disorders of the nuclear genome. [Text] / C. Angelini // Acta Myol.-2009.-V.28.-P.16–23. 8) Angerer, H. Tracing the tail of ubiquinone in mitochondrial complexI. [Text] / H. Angerer, H.R. Nasiri, V. Niedergesass // Biochim Biophys Acta.- 2012.V.1817.-P.1776–1784. 9) Apostolova, N. Mitochondrial interference by anti-HIVdrugs: mechanisms beyond Pol-c inhibition. [Text] / N. Apostolova, A. Blas-Garcia, J.V. Esplugues // Trends Pharmacol.Sci.-2011.-V. 32.-P.715–725. 47 10) Barajas, L. Three-dimensional reconstruction of Pityrosporum yeast cells based on serial section electron microscopy. [Text] / L. Barajas, F.M. Keddie // J Ultrastruct Res.-1969.-V. 29(3).-P.260-75. 11) Barth, G. Functional genetics of Yarrowia lipolytica. In Functional Genetics of Industrial Yeasts, de Winde JH(ed).[Text] / G. Barth, J.M. Beckerich, A. Dominguez // Springer-Verlag: Berlin, Heidelberg, NewYork.-2003.- P.227–271. 12) Barth, G. Yarrowia lipolytica. In Nonconventional Yeasts in Biotechnology. [Text] / G. Barth, C. Gaillardin // Wolf K(ed). Springer-Verlag:Berlin,Heidelberg, NewYork.-1996.- P.313–388 13) Barth, G. Physiology and genetics of the dimorphic fungus Yarrowia lipolytica. [Text] / G. Barth, C. Gaillardin//FEMS Microbiol Rev.-1997.-V.19.-P. 219–237. 14) Beopoulos, A. Yarrowia lipolytica as a cell factory for oleochemical biotechnology. [Text] / A. Beopoulos, T. Desfougeres, J. Sabirova, J.M.Nicaud // In Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology, Timmis KN (ed.). Springer-Verlag: Berlin.-2010a. 15) Biasutto, L. Mitochondrially targeted anti-cancer agents. [Text] / L. Biasutto, L.F. Dong, M. Zoratti, J. Neuzil // Mitochondrion.-2010.-V.10.-P.670–681. 16) Brandt, U. Structure–function relationships in mitochondrial complex I of the strictly aerobic yeast Yarrowia lipolytica. [Text] / U.Brandt, A. Abdrakhmanova, V. Zickermann// Biochem Soc Trans.- 2005.-V. 33.-P.840–844. 17) Bystrzejewska-Piotrowska, G. Nanoparticles: Their potential toxicity, waste and environmental management. [Text] / G. Bystrzejewska-Piotrowska, J. Golimowski, P.L. Urban// Waste Management.- 2009.-V.29.-P.2587–95. 18) Calvo, S.E. The mitochondrial proteome and human disease. [Text] / S.E. Calvo, V.K. Mootha // Annu. Rev. Genomics Hum. Genet.-2010.-V.11.P. 25– 44. 19) Cohen, B.H. Mitochondrial cytopathy in adults: what we know so far. [Text] / B.H. Cohen, D.R.Gold // Cleve Clin J Med.-2001.-V.68(7).-P.625–626,629–642. 48 20) Cohen, B.H. Pharmacologic effects on mitochondrial function. [Text] / B.H. Cohen // Dev. Disabil. Res. Rev.-2010.-V.16.-P.189–199. 21) Chistyakov, V.A. PossibleMechanisms Fullerene C60 Antioxidant Action. [Text] / V.A. Chystiakov, Yu.O.Smirnova, E.V.Prazdnova et al. // BioMed Research International.- 2013.- Article ID 821498. 22) Davison, M.T. Structure of mitochondria and vacuoles of Candida utilis and Schizosaccharomyces pombe studied by electron microscopy of serial thin sections and model building. [Text] / M.T. Davison, P.B. Garland//J Gen Microbiol..1977.-V. 98(1).-P.147-53. 23) Di Mauro, S. Mitochondrial respiratory-chain diseases. [Text] / S. Di Mauro, E.A. Schon// N.Engl.J.Med.-2003.-V.348(26).-P.2656–2668. 24) Duchen, M.R. Roles of mitochondria in human disease.[Text] / M.R. Duchen, G. Szabadkai // Essays Biochem .-2010.-V.47.-P.115–137. 25) Epand, R. Diversity of antimicrobial peptides and their mechanisms of action [Text] / Epand J., Vogel H. // Biochimica et Biophysica Acta. – 1999. - V.1462. P.11-28. 26) Fickers, P. Hydrophobic substrate utilisation by the yeast Yarrowia lipolytica, and its potential applications. [Text] / P. Fickers, P.H. Benetti, Y. Wache // FEMS Yeast Res.-2005.-V. 5.-P.527–543. 27) Finsterer, J. Drugs interfering with mitochondrial disorders.[Text] / J. Finsterer, L. Segall // DrugChem.Toxicol.-2010.-V.33.-P.138–151. 28) Fowler, P.W. Electron deficiency of the fullerenes. [Text] / P.W. Fowler, A. Ceulemans // J Phys Chem.- 1995.-V.99.-P.508–10. 29) Gilmutdinova, A.A. derivatives, containing Synthesis and properties of new fullerene C60 acetonide and polyol fragments [Text] / A.A. Gilmutdinova, V.P. Gubskaya, G. M. Fazleeva et al // Tetrahedron. – 2014. – V. 70. – P. 5947-5953. 30) Green, D.R. Mitochondria and the autophagy-inflammation-cell death axis in organismal aging. [Text] / D.R. Green // Science.-2011.-V.333.-P.1109–1112. 49 31) Grimes, G. W. Nuclear gene dosage effects on mitochondrial mass and DNA. [Text] / G.W. Grimes, H.R. Mahler, R.S. Perlman // J Cell Biol.-1974.-V.61(3).P.565-74. 32) Gharbi, N. Fullerene is an in vivo powerful antioxidant with no acute or subacute toxicity. [Text] / N. Gharbi,M. Pressac, M. Hadchouel, H. Szwarc, H. Wilson, F. Moussa // Nano Lett. – 2005. – V.5. – P. 2578-2585. 33) Goto, Y. A mutation in the tRNALeu(UUR) gene associated with the MELAS subgroup of mitochondrial encephalomyopathies. [Text] / Y. Goto// Nature.-1990.-V.348.-P. 651–653. 34) Gotte, G. Oligomerization of Ribonuclease A. [Text] / G. Gotte, M. Libonati // The Journal of Biological Chemistry. – 2004. 35) Halestrap, A. Biochemistry: a pore way to die. [Text] / A. Halestrap // Nature.-2005.-V. 434.-P.578–579. 36) Hoffman, H.P. Mitochondrion of yeast: Ultrastructural evidence for one giant, branched organelle per cell. [Text] / H. P. Hoffman, C. Avers // Science.-1973.-V. 181.-P. 749-750. 37) Jalbout, A.F. Study of the structural and electronic properties of 1-(4, 5 and 6selenenyl derivatives-3-formyl-phenyl) pyrrolidinofullerenes. [Text] / A.F. Jalbout, A.J. Hameed, B. Trzaskowski // J Organometal Chem.- 2007.-V.692.P.1039–47. 38) Kerscher, S. Application of the yeast Yarrowia lipolytica as a model to analyse human pathogenic mutations in mitochondrial complex I (NADH:ubiquinone oxidoreductase). [Text] / S. Kerscher, L. Grgic, A. Garofano, U. Brandt// Biochim Biophys Acta.- 2004b.-V.1659.-P.197–205. 39) Keyhani, E. Oxidation-reduction potential of cytochrome C oxidase in mitochondria of yeast grown under various copper concentrations. [Text] / E. Keyhani // Biochem Biophys Res Commun.- 1980.-V.93(3).-P.919-26. 40) Кrustic, P. J. Radical reactions of C60 [Text] / P. J. Krustic, E. Wasserman, P. N. Keizer // Science. – 1991. – V. 254. – P. 1183 – 1185. 50 41) Kourie, J. Ion channel formation and membrane-linked pathologies of misfolded hydrophobic proteins: the role of dangerous unchaperoned molecules. [Text] / J. Kourie, C. Henry // Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. – 2002. – V.29. – P.741 – 753. 42) Kovaleva, M.V. Induction of a non-specific permeability transition in mitochondria from Yarrowia lipolytica and Dipodascus (Endomyces) magnusii yeasts. [Text] / M. V. Kovaleva, E.I. Sukhanova, T.A. Trendeleva et al. // J Bioenerg. Biomembr.-2009.- V.41(3).-P.239-249. 43) Laakko T. Versatility of merocyanine 540 for the flow cytometric detection of apoptosis in human and murine cells. [Text] / T. Laakko, L. King, P. Fraker // J. Immunol. Meth. - 2002. - V. 261. - P. 129–139. 44) Makarov, A.A. Binase and other microbial RNases as potential anticancer agents. [Text] / A.A. Makarov, A. Kolchinsky, O.N. Ilinskaya // BioEssays.-2008.V.30.-P.781–90. 45) Mammucari, C. Molecules and roles of mitochondrial calcium signaling. [Text] / C. Mammucari // BioFactors.-2011.-V.37.-P. 219–227. 46) Massaad, S.A. Мitochondrial superoxide: a key player in Alzheimer’s disease[Text] / A. C. Massaad, R. G. Pautler, E. Klann // AGING.- 2009.- V.1(9).P. 758 – 761. 47) Matsubayashi, K. Effects of Pin-up Oxygen on [60]Fullerene for Enhanced Antioxidant Activity. [Text] / K. Matsubayashi, T. Goto, K. Togaya et al. // Nanoscale Res Lett.-2008.-V. 3.-P.237–241. 48) Migliore, L. Genetics, environmental factors and the emerging role of epigenetics in neurodegenerative diseases. [Text] / L. Migliore, F. Coppede // Mutat Res.-2009.- V.667.-P.82–97. 49) Miller, J. Derivatized fullerenes: a new class of therapeutics and imaging agents. [Text] / J. Miller, M. Lam, R. Lebovitz // HeinOnline. Nanotech. L. & Bus.- 2007. 50) Mironova, G D. Functional distinctions between the mitochondrial ATPdependent K+ channel (mitoKATP) and its inward rectifier subunit (mitoKIR). 51 [Text] / G. D. Mironova, A.E. Negoda, B.S. Marinov et al. // J Biol Chem.- 2004.V.279(31).-P. 32562-8. 51) Murphy, M.P. Mitochondria – a neglected drug target. [Text] / M.P. Murphy // Curr. Opin. Invest. Drugs.-2009.-V.10.-P.1022–1024. 52) Narendra, D.P. Targeting mitochondrial dysfunction: role for PINK1 and Parkin in mitochondrial quality control. [Text] / D.P. Narendra, R.J. Youle // Antioxid. Redox Signal.-2011.-V.14.-P.1929–1938. 53) Neuzil, J. Classification ofmitocans, anticancer drugs acting on mitochondria. [Text] / J. Neuzil, L. F. Dong, J. Rohlena, J. Truksa, S.J. Ralph // Mitochondrion.2012.-V.28. doi:10.1016. 54) Nicaud, J-M. Yarrowia lipolytica. [Text] / J-M. Nicaud // Yeast.-2012.-V.29.P.409-418. 55) Ostolaza, H. Balance of Electrostatic and Hydrophobic Interactions in the Lysis of Model Membranes by E. coli a-Haemolysin.[Text] / H. Ostolaza, L. Baka´s, F.M. Gon˜ i // J. Membrane Biol. – 1997. - V.158. - P.137–145. 56) Pathania, D. Opportunities in discovery and delivery of anticancer drugs targeting mitochondria and cancer cell metabolism. [Text] / D. Pathania, M. Millard, N. Neamati // Adv.DrugDeliv.Rev.-2009.-V.61.-P.1250–1275. 57) Piotrovsky, L.B. Fullerenes and viruses. [Text] / L.B. Piotrovsky, O.I. Kiselev // Fullerenes, nanotubes, and carbon nanostructures. — 2004. — V. 12. — P. 397– 403. 58) Posas, F. The PPZ Protein Phosphatases Are Important Determinants of Salt Tolerance in Yeast Cells[Text] / F. Posas, M. Camps, J. Arino // J. Biol.Chem. – 1995. – V. 270. – P. 13036–13041. 59) Rasola, A. Mitochondrial permeability transition in Ca2+-dependent apoptosis and necrosis. [Text] / A. Rasola, P. Bernardi // Cell Calcium.-2011.V.50.-P.222–233. 60) Reibarkh M.Y. Three-dimensional structure of binase in solution. [Text] / M.Y. Reibarkh, D.E. Nolde, L.I. Vasilieva et al. // FEBS Lett. -1998. -V. 431. P. 250-254. 52 61) Rial, E. Lipotoxicity, fatty acid uncoupling and mitochondrial carrier function.[Text] / E. Rial, L. Rodrı´guez-Sanchez, E. Gallardo-Vara, P. Zaragoza, E. Moyano, M.M. Gonzalez-Barroso // Biochim.Biophys.Acta. - 2010. - V.1797. P.800–806. 62) Ros, T. Twenty Years of Promises: Fullerene in Medicinal Chemistry. [Text] / T. Ros // Medicinal Chemistry and Pharmacological Potential of Fullerenes and Carbon Nanotubes.- 2008.- P. 1-21. 63) Scatena, R. The role of mitochondria in pharmacotoxicology: a reevaluation of an old, newly emerging topic. [Text] / R. Scatena, P. Bottoni, G. Botta, G.E. Martorana, B. Giardina // Am.J.Physiol.Cell Physiol.-2007.-V.293.-P.C12–C21. 64) Severin, F.F. Penetrating cation/fatty acid anion pair as a mitochondriatargeted protonophore. [Text] / F.F. Severin, I.I. Severina, Y.N. Antonenko et al // Proc Natl Acad Sci U S A. – 2010.- V.107.- P. 663-668. 65) Skulachev, V.P. Prevention of cardiolipin oxidation and fatty acid cycling as two antioxidant mechanisms of cationic derivatives of plastoquinone (SkQs) (review). [Text] / V.P. Skulachev, Y. N. Antonenko, D.A. Cherepanov, B.V. et al// Biochim Biophys Acta. – 2010 -V. 1797.- P. 878-889. 66) Smeitink, J. The genetics and pathology of oxidative phosphorylation. [Text] / J. Smeitink // Nat. Rev. Genet. -2001.-V.2.-P.342–352. 67) Smith, R.A.J. Mitichondrial pharmacology. [Text] / R.A.J. Smith, R.C. Hartley, H.M. Cocheme, M.P.Murphy // Cell PRESS.-2012.-V.-33 (6).-P. 341-350. 68) Smith, R.A.J. Mitochondria-targeted small molecule therapeutics and probes.[Text] / R.A.J. Smith // Antioxid. Redox Signal.-2011.V-15.-P. 3021– 3038. 69) Spees, J.L. Mitochondrial transfer between cells can rescue aerobic respiration. [Text] / J.L. Spees, S.D. Olson, M.J. Whitney, D.J Prockop // PNAS.2006.-V.103(5)P.1283–1288. 70) Suzuki, T. The aconitase of yeast. IV. Studies on iron and sulfur in yeast aconitase. [Text] / T. Suzuki, S.Akiyama, S. Fujimoto, M.Ishikawa, Y.Nakao // J Biochem.-1976.-V.80(4).-P.799-804. 53 71) Shirshikov, F.V. A hydrophobic segment of some cytotoxic ribonucleases. [Text] / F.V. Shirshikov, G.V. Cherepnev, O.N. Ilinskaya, N.V. Kalacheva // Med. Hypotheses.-2013.-V. 81 (2).-P. 328–34 72) Toogood, P.L. Mitochondrial drugs. [Text] / P.L. Toogood // Curr. Opin. Chem. Biol. 2008.-V.12.-P. 457–463. 73) Wallace, D.C. Mitochondrial energetics and therapeutics.[Text] / D.C. Wallace // Annu. Rev. Pathol.-2010.-V.5.-P.297–348. 74) Wallace, D.C. A mitochondrial paradigm of metabolic and degenerative diseases, aging, and cancer: a dawn for evolutionary medicine. [Text] / D.C. Wallace // Annual Review of Genetics.-2005.-V.39 (1).-P. 359–407. 75) Wallace, K.,B. Mitochondrial off targets of drug therapy. [Text] / K.B. Wallace // TrendsPharmacol.Sci.-2008.-V.29.-P.361–366. 76) Yang, X. Fullerene–biomolecule conjugates and their biomedicinal applications. [Text] / X. Yang, A. Ebrahimi, J. Li, Q. Cui // International Journal of Nanomedicine.- 2014.-V.9.-P. 77–92. 77) Yarrow, D. Four new combinations in yeasts. [Text] / D. Yarrow // Antonie Van Leeuwenhoek.-1972.-V.38.P.357–360. 54 ПУБЛИКАЦИИ 1. Черепнев Г. В. Быстрый проточный цитофлуориметрический анализ функционального статуса митохондрий дрожжей Yarrowia lipolytica: корректная модель для исследования биоэнергетических ответов клеток человека/ Г.В. Черепнев, Г.Р. Игтисамова, Л. И. Зайнуллин, Н.В. Калачева, А.А. Ризванов// Сборник трудов IV научно-практической конференции ―Постгеномные методы анализа в биологии‖.-2014.- С. 235. 2. Игтисамова Г. Р. Изменение функционального статуса митохондрий при действии биназы на клетки дрожжей Yarrowia lipolytica/ Г.Р. Игтисамова, Г.В. Черепнев, Н.В. Калачева//Сборник тезисов Всероссийской школыконференции студентов, аспирантов и молодых ученых ―Материалы и технологии XXI века‖.-2014.-С. 34. 3. Игтисамова Г.Р. Фуллерен C60[C13H18O4((OH)4]6 снижает трансмембранный потенциал митохондрий в клетках низших эукариот/ Г.Р. Игтисамова, Н.В. Калачева, Г.В. Черепнев, В.П. Губская, Г.М. Фазлеева//Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых ―Ломоносов - 2015‖.-2015.-С. 38. 4. Черепнев Г.В. Быстрый проточный цитофлуориметрический анализ функционального статуса митохондрий дрожжей Yarrowia lipolytica: корректная модель для исследования биоэнергетических ответов клеток человека/ Г.В.Черепнев, Г.Р. Игтисамова, Л.И. Зайнуллин, Н.В. Калачева// Гены и клетки.-2015. – принято к печати. 5. Игтисамова Г. Р. Влияние РНКазы Bacillus pumilus на функциональный статус митохондрий клеток низших и высших эукариот/ Г.Р. Игтисамова, Н.В. Калачева, Г.В. Черепнев// 19-я Международная Пущинская школаконференция молодых ученых ―Биология – наука XXI века‖.-2015.- С. 66. 55 56
