Деление клетки и движение хромосом
advertisement
На правах рукописи ЖУДЕНКОВ Кирилл Владимирович ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ КИНЕТОХОРОВ И МИКРОТРУБОЧЕК: НОВЫЙ МЕХАНИЗМ ДВИЖЕНИЯ ХРОМОСОМ 03.00.02 – биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2009 Работа выполнена в Государственном учреждении Гематологический Научный Центр Российской Академии Медицинских Наук. Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор Ф.И. Атауллаханов Официальные оппоненты - доктор биологических наук, профессор И.А. Воробьев доктор физико-математических наук, профессор В.В. Смолянинов Ведущее учреждение – Институт математических проблем биологии РАН. Защита состоится 2009 г. « » в часов на заседании Диссертационного совета Д 001.042.02 в Государственном учреждении Гематологический Научный Центр Российской Академии медицинских наук (Москва, 125167, Новый Зыковский проезд, 4). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ ГНЦ РАМН. Автореферат разослан « » 2009 г. Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук Е.Е. Зыбунова 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Одним из наиболее общих законов в биологическом мире является принцип обязательной репродукции биологических систем. В этом заключается условие существования этих систем на протяжении длительных периодов времени. Репродукция биологических систем может быть сведена к репродукции клеток. Митоз – часть клеточного цикла, в ходе которой происходит деление биологической клетки и осуществляется корректное распределение генетической информации по дочерним клеткам. В ходе митоза в нуклеоплазме работает молекулярная машина, называемая митотическим веретеном. Задача митотического веретена – распределение сестринских хроматид по дочерним ядрам будущих клеток. Митотическое веретено включает в себя полюса деления, микротрубочки (МТ), молекулярные моторы, регуляторные белки и кинетохоры хромосом. МТ состоят из полимеризованного белка тубулина и имеют конформацию трубки длиной в несколько микрон и диаметром около 25 нм. Вертикальные нити тубулиновых димеров, формирующие боковую стенку МТ, называются протофиламентами (ПФ). МТ обладают динамической нестабильностью – постоянным чередованием стадий роста и деполимеризации. Кинетохоры – массивные белковые комплексы, локализующиеся на хромосомах, включающие в себя десятки различных белков и способные взаимодействовать с МТ. Изгиб протофиламентов в процессе укорачивания МТ может стать источником силы, производящей механическую работу (Koshland et al., 1988). В ряде экспериментов было продемонстрировано процессивное движение микроскопических шариков, связанных с деполимеризующимися МТ (Lombillo et al., 1995). Даже статические связи между шариками и МТ (например, биотинстрептавединовая связь) позволяют наблюдать силовой импульс при разборке МТ (Grishchuk et al., 2005). Если кинетохоры прикреплены к МТ с помощью некоторого механизма, то энергия, освобождаемая при деполимеризации МТ, может стать источником силы в движении хромосомы к полюсу (Efremov et al., 2007; Hill, 1985; Molodtsov et al., 2005). Таким образом, деполимеризация МТ сама по себе является мотором, так что возникает вопрос о том, какова же должна быть структура кинетохора для того, чтобы позволить работать такой 3 машине. Среди современных методов исследования микроскопических структур биологических объектов можно отметить электронную томографию (ЭТ). ЭТ – метод исследования, позволяющий получать трехмерные структуры макромолекулярных объектов (Downing et al., 2007). Чтобы найти ответ на вопрос о строении механизма взаимодействия МТ и кинетохора, было проведено исследование методами ЭТ, позволившее изучить трехмерную структуру индивидуальных ПФ на плюс-концах МТ (концах МТ, на которых происходит интенсивная полимеризация и деполимеризация тубулина и осуществляется закрепление МТ к кинетохору) в митотических клетках PtK1 (Grishchuk et al., 2008). Методы получения и обработки данных позволили впервые получить детальную информацию о кривизнах ПФ в различных типах МТ. Около половины ПФ на плюс-концах КМТ (МТ, взаимодействующих с кинетохорами) имели кривизны, существенно отличающиеся от кривизн ПФ в полимеризующихся и деполимеризующихся МТ in vitro. Проведенные исследования показывают, что такие необычные формы ПФ возникают не только за счет динамики МТ, но и по причине наличия фибриллярных кинетохорных структур, взаимодействующих с концами КМТ. Исследование функционирования митотического веретена – одна из важных задач современной науки. Данная работа посвящена детальному исследованию одного из ключевых взаимодействий в митотической системе – взаимодействию кинетохоров хромосом с МТ. Цель работы. Исследование механизма взаимодействия кинетохоров и микротрубочек в клетках высших эукариот (PtK1). Задачи исследования. 1. Разработать программный комплекс, позволяющий изучить детальную форму и кривизну протофиламентов из различных микротрубочек. 2. Провести анализ форм протофиламентов из экспериментальных данных и сравнить их с теоретическими данными, полученными в ходе моделирования взаимодействия микротрубочек с кинетохорами с помощью различных механизмов. 3. Сформулировать представления о механизме закрепления протофиламентов на кинетохорах в клетках высших эукариот. 4 Научная новизна. Для детального анализа форм и кривизн ПФ, полученных в экспериментах (Grishchuk et al., 2008), была написана специальная программа, которая позволила не только оценивать усредненные кривизны и формы больших групп ПФ, но и производить автоматическую сортировку ПФ по углам наклона. Расчеты показали, что наборы ПФ по степени наклона и локальной кривизне существенно отличаются друг от друга для различных типов МТ, которым принадлежат данные ПФ. Программа позволила провести группировку ПФ, принадлежащих КМТ, и выявить среди них доминирующую по форме группу. Детальный анализ экспериментальных изображений данных ПФ позволил отчетливо наблюдать фибриллярную структуру, что явилось четким подтверждением новой гипотезы о механизме взаимодействия кинетохоров и МТ. Работа была проведена в тесном сотрудничестве экспериментальной и теоретической групп, что для современных исследований является необходимым качеством. Дело в том, что объект данного исследования (ПФ и МТ) имеет размеры единиц и десятков нанометров, и наблюдение его в динамике через световой микроскоп оказывается невозможным. Исследования методами ЭТ позволяют получать относительно четкие трехмерные изображения, но не позволяют наблюдать объект в динамике и далеко не всегда дают возможность получить четкое изображение с малым количеством шумов. В связи с этим важным оказывается постоянное использование средств ЭВМ по моделированию свойств этих микроскопических объектов, обработке экспериментальных изображений, проведения статистического анализа и оценке геометрических свойств данных объектов. Данная работа включает в себя один из важных компонентов любого современного биофизического исследования – изучение биологических объектов физико-математическими методами. 5 Научно-практическое значение. Исследование механизмов деления клеток имеет большое значение для исследования развития раковых заболеваний. Большинство препаратов, которые применятся в современности для остановки неконтролируемого роста клеток, стабилизирует длину всех МТ в организме. Это позволяет остановить процесс митоза в клетках, но оказывает токсическое действие на здоровые клетки организма. Если бы препараты действовали более избирательно, например, только на специфические компоненты митотической системы, которые наиболее интенсивно работают в раковых клетках, то токсический эффект от таких препаратов будет малым. Понимание процессов, протекающих во время митоза, и, в частности, механизма взаимодействия МТ и кинетохора, может помочь в создании антираковых препаратов и методик лечения. Основные положения, выносимые на защиту. 1. Создана специальная программа, позволяющая анализировать кривизны сотен протофиламентов из микротрубочек одновременно, автоматически оценивать их наклон, сортировать протофиламенты по типам и проводить статистический анализ. 2. Сравнение форм протофиламентов экспериментальных в сочетании с и детальным теоретических рассмотрением результатов экспериментов позволило предложить новый механизм сопряжения процесса деполимеризации микротрубочек с движением хромосом в клетках высших эукариот. Основным рабочим элементом в новом механизме является не кольцо, а множество фибрилл, способных обратимо связываться с внешней поверхностью микротрубочки. Апробация работы состоялась 11-ого декабря 2008 г. на заседании проблемной комиссии «Биохимия, биофизика и реология крови» в Гематологическом Научном Центре РАМН. Материалы диссертации докладывались на 11-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 29 октября - 2 ноября 2007 года); на 7-й Международной молодежной конференция ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика» (Москва, Россия, 12.11.2007-14.11.2007); 47-й и 48-й конференциях The American Society for Cell 6 Biology. Annual Meeting (Washington, DC December 4, 2007 и San Francisco, CA December 17, 2008) Публикации. По материалам диссертации опубликованы тезисы в сборниках 7-и конференций и 1 статья в издании, рекомендованном ВАК. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 121 страницах машинописного текста, состоит из введения, 5 глав, библиографического указателя, включающего 62 источника, списка сокращений и приложения. Работа выполнена на базе Гематологического Научного Центра РАМН в лаборатории физической биохимии системы крови (зав. лабораторией проф. Ф.И. Атауллаханов) и в Университете штата Колорадо (зав лабораторией проф. Р.Дж. Макинтош). 7 СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ По вопросам клеточной и молекулярной биологии работу консультировали: к.б.н. Е.Л. Грищук профессор Р.Дж. Макинтош. Современные представления. Деление клетки. Митотическое веретено, согласно (Rieder and Salmon, 1998), состоит из 2 перекрывающихся и направленных друг навстречу другу пучков МТ, которые испускаются центросомами (Рис. 1). Рис 1. Схема пространственной организации митотического веретена (Rieder and Salmon, 1998). Черные изгибающиеся стержни – МТ с отмеченными плюс-концами. МТ нуклеируются на полюсах деления и способны взаимодействовать с кинетохорами хромосом. Подписи А-Д соответствуют набору характерных стадий во взаимодействии МТ и кинетохоров хромосом. А – первичный захват МТ одного из сестринских кинетохоров, сопровождающийся стремительным полярным движением хромосомы. После осуществленного таким образом монополярного закрепления (закрепления к МТ от одного из полюсов), хромосома начинает осуществлять колебательные движения Б и В вместе с динамически нестабильными МТ, которые продолжаются вплоть до момента, когда МТ с другого полюса тоже войдут во взаимодействие хромосомой, тем самым, осуществляя успешную биоринетацию и выстраивание кинетохора в центральной области митотического веретена Г. После успешного осуществления биполярного закрепления всех хромосом начинается анафаза митоза Д, в ходе которой хроматиды разделяются и растаскиваются по направлению к полюсам. 8 Движение хромосом сопряжено с динамикой КМТ. Хромосома двигается к полюсу тогда, когда есть МТ, соединяющая ее кинетохор с этим полюсом. Во время движения МТ меняет свою длину, полимеризуясь во время движения хромосомы от полюса и деполимеризуясь во время движения хромосомы к полюсу. При этом полимеризация и деполимеризация происходят в месте прикрепления МТ к кинетохору (Geuens et al., 1989; Mitchison et al., 1986), а химические вещества, стимулирующие деполимеризацию МТ, вызывают и ускоряют направленные к полюсу движения хромосом. Исторически сложились различные точки зрения на то, что является основной причиной движения хромосом. Согласно первой, движение хромосом происходит благодаря наличию молекулярных моторов на кинетохорах хромосом, которые используют энергию гидролиза АТФ, чтобы перемещаться к заданному концу МТ (Pfarr et al., 1990; Hyman and Mitchison, 1991). Согласно второй точке зрения, энергии высвобождаемой при деполимеризации МТ и запасенной во время полимеризации, благодаря расщеплению ГТФ, достаточно, чтобы приводить к движению хромосом (Koshland et al., 1988; Grishchuk et al., 2005). В исследовании (Molodtsov et al., 2005) было показано, что МТ может развивать силу, благодаря освобождению энергии, заключенной в ПФ, в ходе деполимеризации МТ. В пользу второй гипотезы также говорит тот факт, что каждый известный молекулярный мотор может быть удален из кинетохора генетически без потери способности веретена деления к перемещению хромосом. Структура микротрубочки. МТ – это полимеры, состоящие из молекул тубулина - димеров, состоящих из α - и β -мономеров (Рис. 2А). Плюс-конец заканчивается субъединицами β , а зафиксированный на полюсе деления минус-конец - α -субъединицами тубулина (Hirose et al., 1995; Mitchison, 1993). Каждый мономер тубулина связан с молекулой ГТФ. Во время полимеризации МТ ГТФ, связанная с β -субъединицей, гидролизуется, фосфат уходит, а ГДФ остается связанной с мономером. Таким образом, большая часть МТ состоит из ГДФ-тубулина, или просто Д-тубулина. Во время полимеризации ГТФ тубулин, связанный с α -субъединицей, не гидролизуется. 9 Рис 2. Структура и динамика МТ (из Alberts et al., 2002). А. Димер тубулина – составляющая часть ПФ в МТ. Красным показаны связанные с тубулином ГТФ. Б. Электронные микрофотографии и условные изображения концов растущей и деполимеризующейся МТ. Внутри полимера димеры тубулина организованы в линейные ПФ. Несколько ПФ, взаимодействуя латерально, образуют цилиндрическую стенку МТ диаметром 25 нм. Когда тубулин полимеризуется в МТ in vitro, число ПФ может колебаться от 10 до 18-ти (Chretien et al., 1998; Meurer-Grob et al., 2001). In vivo и когда МТ нуклеированы на центросомах или аксонемах, число ПФ равно 13-ти. ГДФ-тубулин в составе стенки МТ находится в напряженном состоянии и удерживается в ней связями с соседними тубулинами. Это напряжение высвобождается, когда в процессе деполимеризации конца МТ ПФ, принимают равновесную конформцаию, закручиваясь в колечки (Mandelkow et al., 1991). Такая форма ПФ соответствует энергетическому минимуму конфигурации ГДФ-тубулина, в то время как ГТФ-тубулиновые ПФ являются сравнительно прямыми (Chretien et al., 1995; Muller-Reichert et al., 1998). Таким образом, морфология конца МТ отражает динамическое состояние МТ. Динамика микротрубочек и хромосом. Хромосомы прикрепляются к веретену через взаимодействие кинетохоров с плюс-концами МТ, растущими из полюсов деления. Для разделения сестринских хроматид в анафазе веретено генерирует силы, действующие со стороны МТ на хромосомы и направленные к полюсам деления. Одним из первых теоретических исследований взаимодействия кинетохора и конца МТ было осуществлено в 1985 году в работе (Hill, 1985). В модели 10 предполагается, что МТ вставлена и удерживается внутри некого рукава, расположенного во внешних слоях кинетохора (Рис. 3). При этом полимеризация и деполимеризация МТ осуществляется в более глубоких и менее плотных слоях кинетохора. Рис 3. Взаимодействие МТ с хромосомой согласно гипотезе Хилла (Koshland et al., 1988). Показана работа механизма кинетохор-МТ взаимодействия в 3 стадиях. А – МТ помещена в рукав, способный взаимодействовать с боковой стенкой МТ и имеющий на своей внутренней поверхности сайты связывания с МТ. Б – деполимеризация МТ приводит к частичному выходу конца МТ из рукава. В – тепловые колебания кинетохора в сочетании со способностью рукава закрепляться на МТ приводят к смещению кинетохора в сторону конца МТ. В альтернативной модели конформационных волн, предложенной Кошландом (Koshland et al., 1988), была выдвинута гипотеза о том, что движение кинетохора по направлению к минус-концу МТ может быть вызвано изменением конформации изгибающихся ПФ плюс-конца МТ при ее деполимеризации – изгибающиеся ПФ могут оказывать давление на структуру кинетохора и вызывать ее направленное движение (Рис. 4). 11 Рис 4. Взаимодействие МТ с хромосомой в соответствии с теорией конформационных волн (Koshland et al., 1988). А - МТ помещается в рукав, не имеющий сайтов взаимодействия с МТ. Б – деполимеризация МТ сопровождается растрескиванием ее на отдельные изогнутые ПФ, которые за счет энергии своего изгиба оказывают давление на рукав, и он смещается в сторону уменьшения длины МТ. В – дальнейшая деполимеризация МТ сопровождается отщеплением от конца МТ сегментов уже изогнутых ПФ и дальнейшим растрескиванием МТ на ПФ, что повторяет шаг механизма, описанный в Б. Авторы исследования (Koshland et al., 1988) дали предпочтение второй из описанных гипотез в связи с тем, что механизм конформационных волн не предъявляет дополнительных требований к свойствам боковой стенки сайта связывания МТ на кинетохоре. Но структур кинетохора, подобных предложенным авторами рукавов, во всех последующих экспериментах не было обнаружено. В 2006 году было опубликовано исследование соотношения динамики МТ и движения хромосом в S.Pombe (Grishchuk et al., 2006) с помощью оптической флуоресцентной микроскопии и электронной томографии. В данном исследовании много внимания было уделено не только вкладу динамической нестабильности МТ в движение хромосом, но и влиянию различных моторных белков на систему. В присутствии всех естественных для митоза S.Pombe моторов митотическая система организма демонстрировала существенную устойчивость и успешность в поиске, захвате и транспортировке разнообразно ориентированных кинетохоров. При делеции минус-направленных моторов 12 (например, динеина) система практически не теряла своих качеств в плане скорости перемещения хромосом, но поиск, захват и перемещение значительно удаленных от полюсов кинетохоров становился более длительным. Особенно это касалось биориентации хромосом, которая заключается в закреплении 2 сестринских хроматид хромосомы к 2 полюсам деления (каждая хроматида крепится к одному полюсу) с помощью растущих из этих полюсов МТ. Эти факты показывают, что ключевая причина движения хромосом кроется в динамике МТ, а не в активности молекулярных моторов. Роль Dam1-комплекса в митозе. В 2007 году было опубликовано исследование (Tanaka et al., 2007), в котором был проведен подробный анализ взаимодействия кинетохоров хромосом с МТ в почкующихся дрожжах. Исследователи показали, что полярное движение кинетохора может осуществляться двумя способами – латеральным скольжением, при котором кинетохор движется вдоль боковой поверхности МТ с помощью взаимодействия деполимеризующейся МТ и белков Dam1-комплекса. Dam1 является декамерным белком (Рис. 5), жизненно необходимым для почкующихся дрожжей. Рис 5. Схема способов размещения колец Dam1 вокруг МТ и характерные соотношения размеров в системе Dam1-МТ (Miranda et al., 2005). Внешний диаметр кольца Dam1 (50 нм) в 2 раза превышает диаметр МТ. В ходе олигомеризации Dam1 может образовывать как кольцевые, так и спиральные структуры. Dam1 входит в состав кинетохоров и способен к взаимодействию с МТ in vitro. Исследования in vitro показали, что несколько белков Dam1-комплекса способны собираться вместе и формировать вокруг МТ кольцевые структуры, способные передвигаться вдоль МТ. Авторы (Tanaka et al., 2007) обнаружили, что белки Dam1-комплекса локализуются в области плюс-концов МТ in vivo. 13 Наиболее простая интерпретация данного факта заключатся в допущении, что данные молекулы действительно формируют кольцевые структуры в живых клетках, и эти кольцевые структуры способны эффективно передвигаться вдоль МТ по мере того, как в ней происходит деполимеризация. Однако в живых клетках кольцевые структуры Dam1 не наблюдались. При этом нарушение взаимодействия Dam1 с МТ ведет к нарушению полярного движения кинетохоров. Предположительно, в метафазе Dam1-комплекс необходим для организации натяжения между биориентированными сестринскими хроматидами, стабилизируя закрепление кинетохоров на МТ и понижая чувствительность данного закрепления к разного рода механическим стрессам. Потеря функциональности комплекса Dam1 приводит к нарушению стабильности биполярного закрепления кинетохоров и разрушению митотического веретена в почкующихся дрожжах (Miranda et al., 2005). Авторы работы предполагают, что Dam1 может работать на плюс-концах МТ. Данная гипотеза поддерживает гипотезу Кошланда о существовании некого рукава (Koshland et al., 1988), в который входит МТ, взаимодействующая с кинетохором. Исследование (Miranda et al., 2005) показало, что Dam1-комплекс является вероятным претендентом на роль основного связующего звена кинетохора и МТ в почкующихся дрожжах. Но имеется и ряд замечаний, не позволяющих выдвинуть Dam1-комплекс на роль универсального связующего звена в составе кинетохоров всех организмов. Дело в том, что белки, подобные Dam1, существуют далеко не во всех организмах. Результаты исследования (Miranda et al., 2005) были достигнуты на организме in vitro. Но in vivo столь упорядоченных кольцевых структур на кинетохорах не найдено пока даже у почкующихся дрожжей, из которых Dam1 и был выделен. Роль фибриллярных кинетохорных белков в митотической системе. Существуют и другие кинетохорные белки, являющиеся жизненно- необходимыми и отвечающие за кинетохор-МТ взаимодействие. Среди них следует отметить Ndc80/Hec1 (Wigge and Kilmartin, 2001). При этом комплекс Ndc80 является универсальным и неотъемлемым белком в механизме кинетохор-МТ взаимодействия у многих организмов (DeLuca et al., 2006; McAinsh et al., 2006). Несмотря на то, что такие фибриллярные белки исключительно важны для закрепления МТ на кинетохорах, механизмы такого взаимодействия пока не известны. 14 Экспериментальные исследования клеточных культур высших позвоночных. Экспериментальные данные (Grishchuk et al., 2008), полученные при исследовании клеточной культуры PtK1 методами ЭТ, стали основой для детального анализа форм и кривизн ПФ из МТ in vivo с целью исследования механизма взаимодействия кинетохоров и МТ. К настоящему времени опубликовано довольно большое количество работ, посвященных исследованию взаимодействия кинетохоров и МТ, а также некоторым аспектам пространственного строения кинетохоров и МТ, но ясности в вопросе об устройстве механизмов развития сил на кинетохорах хромосом пока не нет. Дальнейший прогресс в данной области не возможен без тщательного моделирования МТ и сопрягающих структур с целью получения количественных оценок развиваемых сил и эффективности механизма. Также необходимым оказывается использование современных средств обработки данных с помощью ПК, так как единичные результаты микроскопических исследований часто оказываются довольно сильно зашумленными, и без специальной обработки и статистического анализа невозможно оценить устройство механизма взаимодействия кинетохоров хромосом и МТ. Задачей данного исследования было: исходя из полученных экспериментальных данных по клеткам PtK1 и данных математического моделирования МТ, провести комплексный анализ форм ПФ с целью выявления структуры механизма закрепления МТ на кинетохорах хромосом. Методы обработки данных Описание программы расчета локальных кривизн. Для детального анализа формы экспериментальных и теоретических ПФ бы разработан программный продукт «Curvature Calculation Program» или CCP. Программа CCP написана в среде Borland Delphi 7, предназначена для использования в операционных системах MS Windows 98 или более современных и не требует для своей работы каких-либо дополнительных программных пакетов, кроме операционной системы. Системные требования для работы с программой – IBM-совместимый ПК, оснащенный процессором Intel Pentium4 3000 MHz, AMD Athlon64 3000+ или более современными их аналогами. Для работы программа ССР использует файлы, содержащие в себе координаты ПФ, полученные при обработке данных 15 ЭТ с помощью пакета IMOD (Kremer et al., 1996) или же координаты ПФ, полученные в ходе теоретических расчетов. Описание алгоритма расчета локальных кривизн. Вычисление локальных кривизн в ССР производится по методу наименьших квадратов (МНК), в ходе реализации которого находится оптимальная дуга окружности, проходящая через набор точек в составе сегмента ПФ (Рис. 6). Обратная величина радиуса полученной окружности является кривизной данного сегмента. Все полученные значения кривизн (изначальная единица измерения – нм-1), обозначенные в данной работе, были пересчитаны в угловое отклонение двух последовательных димеров тубулина при изгибе ПФ (то есть, единица измерения кривизны – градус на димер). Все точки, образующие рассматриваемый ПФ, разбиваются на интервалы, каждый из которых содержит некоторое количество последовательных точек в составе ПФ. Эти интервалы располагаются друг относительно друга с наложением. Например, все ПФ из экспериментальных и теоретических исследований разбивались на интервалы по 10 точек со смещением друг относительно друга на 1 точку. То есть при таком разбиении в последовательные интервалы попадают точки с номерами 1-10, 2-11, 3-12, 4-14 и так далее. Внутри каждого интервала программа производит поиск наиболее подходящей дуги окружности (Рис. 6), проходящей через эти точки по алгоритму метода главных осей (Gegenfurtner, 1992). Рис 6. Результат поиска оптимальной окружности, характеризующей кривизну сегмента ПФ. Масштаб осей – нанометры. 16 В ходе реализации алгоритма минимизации проводился поиск наиболее оптимальных положений четырех полуокружностей (двух горизонтальных и двух вертикальных) относительно набора точек ПФ в интервале: U = ∑ [Z − [Z + L 1 j =1 L j 0 L L ] (2) [ [ R02 − ( Z j − Z 0 ) 2 ] (3) [ [ R02 − ( Z j − Z 0 ) 2 ] (4) U4 = ∑ X j + X0 + j =1 (1) R02 − ( X j − X 0 ) 2 U3 = ∑ X j − X 0 + j =1 R − (X j − X0) 2 [ [ U 2 = ∑ Z j + Z0 + j =1 ] 2 2 0 2 2 2 После минимизации четырех функционалов U i окружность выбиралась с параметрами, соответствующими минимальной величине U i . Такой подход оказался наиболее продуктивен, так как позволял найти оптимальную окружность для любого расположения точек рассматриваемого интервала ПФ на плоскости XY. Автоматический расчет наклона протофиламентов вблизи стенки микротрубочки. Программа CCP, помимо расчета усредненных кривизн и форм ПФ, также производит анализ наклона ПФ вблизи стенки МТ (на расстоянии 612 нм от стенки). Размеры интервала вдоль оси Х, внутри которого производится анализ наклона, можно варьировать. Внутри области, ограничиваемой данными параметрами, CCP методом МНК производит аппроксимацию точек ПФ полиномом первой степени и, исходя из величины коэффициента при члене в первой степени, осуществляет расчет наклона участков каждого из ПФ, выбранных пользователем: K ⎡ K ⎤ 1 K − X * Z * X * Z jN ⎥ ∑ ∑ ∑ jN jN jN ⎢ K j =1 j =1 ⎥ KoeffMNK N = arctan ⎢ j =1K K K 1 ⎢ ⎥ 2 ⎢ ∑ ( X jN ) − K * ∑ X jN * ∑ X jN ⎥ j =1 j =1 ⎣ j =1 ⎦ (5) В соответствии с получаемыми результатами, программа сортирует ПФ по степени их наклона. 17 Результаты Детальный анализ формы протофиламентов как способ изучения динамического состояния микротрубочек. На Рис. 7A изображено сравнение форм ПФ из МТ in vitro (данные Mandelkow et al., 1991) с неКМТ и КМТ из клеток PtK1 в метафазе. Большинство ПФ из МТ in vivo имеют формы, которые напоминают нечто среднее между формами ПФ из Д-МТ и П-МТ (деполимеризующихся и полимеризующихся МТ in vitro). Полученные средние локальные кривизны для ПФ из МТ in vivo расположены между кривизнами ПФ из П-МТ и Д-МТ, подтверждая различие в формах между ПФ из МТ in vivo и in vitro (Рис. 7Б). Рис 7. А - формы ПФ из концов разных типов МТ: П-МТ (зеленый) и Д-МТ (синий) типы MT in vitro (Mandelkow et al., 1991). ПФ из неКМТ (красный) принадлежат плюс-концам МТ, располагающимся близко к полюсом метафазных клеток PtK1. ПФ из КМТ показаны черным цветом. ПФ из Д-МТ показаны в разных масштабах для большего удобства при сравнении. Б - определение локальной кривизны ПФ. На графике показана зависимость локальной кривизны ПФ от расстояния до стенки МТ, цвета соответствуют A. В качестве ошибок показаны среднеквадратичные отклонения среднего. В - оценка ориентации ПФ. В квадрате показан метод измерения ориентации ПФ на любом расстоянии от стенки МТ. На графике показаны нормализованные распределения ориентаций ПФ на расстоянии от 6 до 12 нм от стенки МТ в четырех наборах данных (цвета соответствуют A). В качестве ошибок показаны 18 среднеквадратичные отклонения среднего для всех ПФ данного типа МТ. Г - ПФ были рассортированы на 4 группы, основываясь на их углах ориентации. N – число ПФ в каждом наборе данных. Получив такое разнообразие в локальных формах ПФ, необходимо было найти величины, позволяющие найти статистически значимые различия между ПФ из разных групп МТ. В качестве ключевого параметра группировки ПФ по типам был выбран угол между перпендикуляром к оси МТ и направлением сегмента ПФ, расположенного на расстоянии 6-12 нм от оси МТ (Рис. 7В), потому что данный сегмент был ближайшей к оси МТ областью ПФ, которая демонстрировала заметное отличие наклона ПФ из П-МТ и Д-МТ. Такой подход к описанию ПФ показал для ПФ из Д-МТ в диаграмме распределения ПФ по углам один пик на относительно малых углах (26o–34o), как и ожидалось для сильно искривленных ПФ (Рис. 7В). ПФ из П-МТ были преимущественно прямыми, так что вышеописанный угол для них составил около 90o, но распределение углов также в себе содержало и пик на уровне 72o, соответствующий слегка искривленным ПФ, а также небольшой пик на уровне 26o, соответствующий по форме ПФ ситуации, характерной для Д-МТ (Рис. 7В). Последний из упомянутых случаев демонстрирует наличие в группе П-МТ деполимеризующихся МТ, случайно попавших в выборку в самом начале замораживания. Мы использовали полученные ориентации ПФ для их объективной сортировки в пределах 4 отдельных групп (Рис. 7Г). «Короткие прямые» ПФ имеют угол наклона, близкий к 90o , «Удлиненные прямые» имеют угол наклона в области от 72o до 90o, и они вместе составляют около 90% всех ПФ для П-МТ in vitro. Таким образом, разумно предположить, что ПФ с такой формой in vivo (21% ПФ из КМТ и 29% ПФ из не КМТ) находились к моменту заморозки в состоянии полимеризации. Третья группа, названная «Бараньи рожки» (для них угол составил менее 40o), демонстрирует состояние деполимеризации, поскольку около 70% ПФ из Д-МТ in vitro имели такую ориентацию. Только 29% ПФ из КМТ и 40% из неКМТ имели такой же угол. Все вышеупомянутые группы не включают в себя большой массив ПФ средней кривизны (угол от 40o до 72o). Данная группа содержит в себе 17% ПФ из Д-МТ и 0% ПФ из П-МТ, но зато включает в себя 30% ПФ из неКМТ и 50% ПФ из КМТ (Рис. 7В,Г). Эти соотношения показывают, что внутриклеточная среда модифицирует структуру 19 многих МТ, так что их ПФ имеют отличную от ПФ in vitro форму, и, кроме того, имеются измеримые отличия между формами ПФ из неКМТ и КМТ. Закрепление фибрилл на протофиламентах кинетохорных микротрубочек. Мы исследовали пространство вокруг ПФ из КМТ в поисках структур, ответственных за такие изменения кривизн. Невозможно было наблюдать ни хорошо обозначенной кинетохорной пластинки, ни каких-либо располагающихся вокруг МТ колец (Рис. 8A), но ветвящиеся ПФ часто оказывались ассоциированными с фибриллами диаметром 2-4 нм и 50-150 нм длиной, и эти фибриллы простирались от ПФ по направлению к хроматину (Рис. 8A). Фибриллы не демонстрировали жесткости или периодичности, так что их описание вызвало определенные трудности. В томографических срезах толщиной около 2 нм вещество над фибриллами и под фибриллами убиралось из видимой области, так что их можно было видеть с хорошим контрастом, но их извилистые формы потребовали использования нескольких последовательных томографических срезов для выявления направления и формы фибрилл. В удачных случаях, почти вся фибрилла в своем протяжении могла наблюдаться на одном срезе (Рис. 8A). Большинство фибрилл связывались с изогнутыми ПФ, но некоторые направлялись прямо к стенкам МТ. Такие фибриллы наблюдались на КМТ в течение всех стадий митоза, но они отсутствовали на неКМТ. Эти фибриллы были названы кинетохорными фибриллами (КФ). 20 Рис 8. А - томографические срезы концов КМТ. Аналогичный набор изображений показан в нижнем ряду, где изображения КФ были наложены на изображения ПФ. Б - ПФ из КМТ, восстановленные из данных ЭТ для метафазы (I, II) и анафазы (III, IV). ПФ на схемах показаны темно-серым цветом, КФ – серым, а область локализации хроматина – светло-серым. В – Гистограмма длин КФ, основанная на данных по 40 случайно выбранным КМТ из всех обработанных КМТ. Г и Д - ПФ из всех КМТ, восстановленные из данных ЭТ для одного метафазного кинетохора. ПФ были сгруппированы с помощью программы ССР, основываясь на углах ориентации ПФ вблизи стенки МТ. Средние локальные кривизны были показаны на Д. Шкала 10нм. Е - усреднения многих томографических срезов, содержащих ПФ из разных групп (числа показаны). Средняя по кривизне группа ПФ из неКМТ может быть легко сформирована, но никаких КФ не просматривается. Средние по кривизне группы ПФ из КМТ из одной метафазной и одной анафазной клетки позволяют наблюдать КФ длиной 90-100 нм, прикрепленные к участкам ПФ и тянущиеся по направлению к хроматину под небольшим наклоном. Группа ПФ с большими кривизнами («Бараньи рожки») из тех же метафазных и анафазных клеток не демонстрирует какой-либо повышенной электронной плотности в окрестности траекторий ПФ. 21 Для изучения влияния КФ на форму ПФ из КМТ были рассортированы в каждой клетке от метафазы до анафазы и ПФ из неКМТ в метафазе по их углам ориентации (Рис. 7В,Г). Например, 52 из 98 ПФ из КМТ из метафазных клеток оказалось в группе средних кривизн (Рис. 8Б); их начальные сегменты были прямыми и составляли небольшие углы с осью МТ, но на определенном расстоянии вариации в их кривизнах существенно росли (Рис. 8В). Чтобы выяснить вопрос о том, взаимодействуют ли эти ПФ с какими-либо специфическими структурами кинетохора, изображения этих ПФ были наложены друг на друга и усреднены так, чтобы выявить какие-либо постоянные структуры, кроме изогнутых ПФ (Рис. 8Г). Прямые и изогнутые участки усредненных ПФ (изгибаются направо) были видны с хорошим контрастом, но более удаленные от стенки МТ участи выглядели существенно более размытыми (Рис. 8Г). Усредненные изображения таких ПФ из метафазы и анафазы демонстрировали КФ, простирающиеся от конца хорошо согласующихся по форме ПФ по направлению к хроматину. Но никаких КФ не было обнаружено при подобном анализе ПФ из неКМТ или же ПФ группы «Бараньих рожек» из КМТ, что показало, что КФ специфичны только для ПФ группы средних кривизн из КМТ. Данные результаты подсказывают, что формы этих средних по кривизнам ПФ вызваны взаимодействием стремления ПФ изогнуться под влиянием ГДФ-тубулина и препятствующего этому натяжения КФ. Такое взаимодействие однообразно выпрямило бы сегменты ПФ, расположенные близко к стенке МТ, но не оказало бы существенного влияния на стохастическое разнообразие локальных кривизн ПФ на удалении от стенки МТ. Закрепление фибрилл на протофиламентах кинетохорных микротрубочек. Наш новый метод анализа формы ПФ на концах МТ показал отличия между МТ in vivo и in vitro в рамках детального рассмотрения форм и кривизн ПФ. КФ, связанные с ПФ, могут быть ответственны за необычную форму ПФ в КМТ. Имеются весомые доказательства гипотезы о том, что деполимеризация тубулина может привести к полярному движению хромосом (Inoue and Salmon, 1995), но предыдущие модели такого механизма были основаны на схеме рукава (Hill, 1985) или кольца (Koshland et al., 1988; Miranda et al., 2005; Westermann et al., 2006), или моторного механизма, или механизма АТФ-независимых связей со стенкой МТ (Lombillo et al., 1995). Полученные 22 нами изображения КФ между кинетохорами и изогнутыми ПФ из КМТ демонстрируют концептуально новый способ связывания МТ с хромосомой и обеспечения полярного движения хромосом. Закрепление фибрилл на протофиламентах кинетохорных микротрубочек. Биомеханические особенности фибриллярных механизмов взаимодействия отличают их от кольцевых структур (например, Dam1комплекса). Кольцевые механизмы требуют сильного связывания со стенкой МТ для поддержания стабильности, что понижает скорость движения и энергетическую выгодность такого механизма (Efremov et al., 2007). В случае же КФ (Рис. 9Б) сила связывания повышает эффективность работы механизма. Максимальная сила, развиваемая МТ в случае фибриллярного закрепления, довольно велика, и данный способ закрепления может передать почти 100% энергии, освобождающейся в ходе деполимеризации МТ, в движение хромосомы (Grishchuk et al., 2008). Рис 9. А - зависимости силы от скорости для укорачивающихся ПФ, находящихся во взаимодействии с двумя типами механизмов. Для кольцевого механизма данные взяты из (Efremov et al., 2007). Б - сравнение индивидуальных МТ из группы средних по кривизне ПФ из одного метафазного кинетохора с набором теоретических ПФ, находящихся под средней нагрузкой в 3,1 пН на один ПФ. Модель описывает согласование форм ПФ вблизи стенки МТ хорошо, но широкое распределение кривизн экспериментальных ПФ на удалении от стенки МТ показывает присутствие неких 23 дополнительных влияющих на форму ПФ факторов. В - усредненные формы ПФ из ПМТ (45 ПФ) или Д-МТ (65 ПФ) в сравнении с усредненной формой средних по кривизне ПФ (505 ПФ). Кривые в градациях серого цвета показывают теоретические формы ПФ, находящиеся под разной нагрузкой случайно распределенных КФ. Показаны также и стандартные ошибки среднего. Показана МТ, окруженная кольцом, подобным Dam1, под нагрузкой 30 пН, что соответствует максимальной силе, которую кольцо может передать МТ, так как большие силы, приложенные со стороны кольца, вызывают его отрыв от МТ (Efremov et al, 2007). Мы использовали форму ПФ в качестве критерия оценки типа механизма взаимодействия МТ и кинетохора. Свойства кинетохорного комплекса Dam1 в почкующихся дрожжах были исследованы в ряде теоретических работ (Efremov et al., 2007; Liu and Onuchic, 2006; Molodtsov et al., 2005), так что удалось проанализировать, является ли кольцевой механизм ответственным за наблюдаемые вариации формы ПФ. Исследования показали, что не является (Рис. 9Б), поскольку кольцо, достаточно сильно связанное с МТ для обеспечения процессивного движения вдоль МТ, взаимодействует с МТ в области, распложенной ближе к стенке МТ, чем область заметного искривления ПФ (Efremov et al., 2007). Таким образом, можно поддержать предположение о том, что фибриллярные механизмы являются принципиальными для связывания МТ с кинетохором и обеспечивают полярное движение хромосом в клетках PtK1. Возможно, кольцевой механизм имеет ценность, когда на одни кинетохор приходится лишь одна МТ, как в почкующихся дрожжах, но КФ позволяют создать гибкий и эффективный механизм, когда правильная сегрегация хромосом происходит с участием многих МТ. 24 ВЫВОДЫ 1. Разработана специальная методика и программа для визуализации и детального анализа формы и кривизны протофиламентов по данным электронной томографии и данным математического моделирования взаимодействия микротрубочки и кинетохора. 2. С помощью программы детального анализа форм протофиламентов показано, что в клетках PtK1 более половины всех протофиламентов из кинетохорных микротрубочек имеет форму, отличную от формы протофиламентов в полимеризующихся и деполимеризующихся микротрубочках in vitro. 3. Сортировка и отбор протофиламентов, имеющих необычную форму, позволили провести усреднение соответствующих электронно- микроскопических изображений. В результате были обнаружены новые элементы в структуре кинетохора - фибриллы, соединяющие кинетохор с концами протофиламентов кинетохорных микротрубочек. 4. Исследование формы протофиламентов, полученных в математических моделях взаимодействия микротрубочек с кинетохорами, показало, что механизм, основанный на существовании колец в структуре кинетохора, не описывает формы протофиламентов, наблюдаемые в эксперименте. Предложен и проанализирован новый механизм сопряжения процесса деполимеризации микротрубочек с движением хромосом в клетках высших эукариот, в котором основным рабочим элементом является множество фибрилл, способных обратимо связываться с внешней поверхностью микротрубочки. 25 Список работ, опубликованных по теме диссертации: 1. Жуденков К., Атауллаханов Ф. Математическое моделирование динамики митотического веретена // Труды конференции. Конференция PACO ‘2006, Москва, 2006. 2. Жуденков К., Атауллаханов Ф. Математическое моделирование митотического веретена // Тезисы. VI Международная молодежная конференция ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика», Москва, Россия, 23.11.2006-24.11.2006. 3. Zhudenkov K., Ataullakhanov F. The spacial aspects of fission yeast mitosis // Тезисы. Biological Motility: Basic Research and Practice conference, Pushchino Moscow region, 2006. 4. Жуденков К., Ефремов А., Грищук Е., МакИнтош Р., Атауллаханов Ф. Исследование структуры кинетохорных элементов, взаимодействующих с микротрубочкой // Тезисы. 11-ая Международная Пущинская школаконференция молодых ученых «Биология – наука XXI века», Пущино, 29 октября - 2 ноября 2007 года. 5. Жуденков К., , Ефремов А., Грищук Е., МакИнтош Р., Атауллаханов Ф. Исследование взаимодействия кинетохоров хромосом и микротрубочек // Тезисы. VII Международная молодежная конференция ИБХФ РАНВУЗы «Биохимическая физика», Москва, Россия, 12.11.2007-14.11.2007. 6. J. McIntosh, M. Morphew, D. Mastronarde, A. Efremov, K. Zhudenkov, E. Grishchuk, F. Ataullakhanov. Kinetochore-Microtubule Interactions Visualized by EM Tomography. // The American Society for Cell Biology. 47th Annual Meeting Annual Meeting Washington, DC December 4, 2007 26 7. McIntosh J., Grishchuk E., Morphew M.,Efremov A., Zhudenkov K., Volkov V., Cheeseman I., Desai A., Mastronarde D., Ataullakhanov F. (2008). Fibrils Connect Microtubule Tips with Kinetochores: A Mechanism to Couple Tubulin Dynamics to Chromosome Motion. // Cell , Volume 135 , Issue 2 , Pages 322 – 333. 8. J. McIntosh, E. L. Grishchuk, E. O'Toole, A. K. Efremov, K. V. Zhudenkov, D. Mastronarde, F. I. Ataullakhanov. Structures of Kinetochore Microtubule Plus Ends from Yeasts to Mammals, Visualized by Electron Tomography. // The American Society for Cell Biology. 48th Annual Meeting San Francisco, CA December 17, 2008. Список сокращений: АТФ – аденозинтрифосфорная кислота; ГДФ – гуанозиндифосфорная кислота; ГТФ – гуанозинтрифосфорная кислота; ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота; Д-МТ – деполимеризующаяся in vitro микротрубочка; КМТ – микротрубочка, взаимодействующая с кинетохором in vivo; КФ – кинетохорная фибрилла; МНК – метод наименьших квадратов; МТ – микротрубочка; неКМТ – микротрубочка, не взаимодействующая с кинетохором in vivo; ПФ – протофиламент; П-МТ – полимеризующаяся in vitro микротрубочка; ЭТ – электронная томография; Dam1 – кинетохорный декамерный белковый комплекс, участвующий во взаимодействии МТ с кинетохором; CCP – программа расчета локальных кривизн ПФ; Hec1 – компонент комплекса Ncd80, обнаруженный у человека; IMOD - программный комплекс, разработанный для анализа и обработки изображений, получаемых методом ЭТ; Ndc80 – тетрамерный фибриллярный белок, взаимодействующий с МТ; PtK1 – культура клеток почки кенгуровой крысы Potorous tridactylis. 27
