Текст диссертации на соискание ученой степени доктора

ФЕДЕР АЛЬНОЕ
Г ОС У Д АР С Т ВЕ ННОЕ БЮД ЖЕТ НОЕ У ЧР ЕЖД ЕНИ Е Н АУ К И
ИНСТИТУТ
БИОЛОГИИ ГЕН А
РОССИЙСКОЙ
АК АД ЕМИИ Н АУ К
На правах рукописи
УДК 577.21
ГАВРИЛОВ Алексей Александрович
ПРОСТРАНСТВЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНОМА ЭУКАРИОТ В КОНТЕКСТЕ
РЕГУЛЯЦИИ ТРАНСКРИПЦИИ
Специальность 03.01.03 – молекулярная биология
Диссертация на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Научный консультант:
член-корр. РАН, д.б.н.,
профессор С.В. Разин
Москва 2015
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.................................................................................................... 7
ВВЕДЕНИЕ .............................................................................................................................. 9
Актуальность проблемы ....................................................................................................... 9
Цели и задачи исследования ............................................................................................... 13
Научная новизна работы ..................................................................................................... 14
Теоретическая и практическая значимость исследования ................................................ 15
Положения и результаты, выносимые на защиту .............................................................. 16
Степень обоснованности и достоверности результатов и выводов работы ..................... 17
Личный вклад автора .......................................................................................................... 18
Апробация работы .............................................................................................................. 18
Публикации ......................................................................................................................... 19
Структура и объем работы.................................................................................................. 26
Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ...................................................................................... 33
I.1
Структурно-функциональная организация хроматина .......................................... 33
I.1.1
Уровни упаковки эукариотической ДНК.......................................................... 33
I.1.2
30-нм фибрилла.................................................................................................. 34
I.1.3
Активный хроматин и гистоновый код............................................................. 39
I.1.4
Создание
областей,
свободных
от
нуклеосом,
на
регуляторных
элементах ДНК ................................................................................................................ 41
I.1.5
Декомпактизация хроматина и доступность ДНК ........................................... 48
I.1.6
Хроматиновые домены в трехмерном пространстве ядра ............................... 50
I.2
Коммуникация удаленных регуляторных элементов генома ................................ 52
2
I.2.1
Сближение промоторов и энхансеров: активаторный хроматиновый блок и
экспрессионный центр .................................................................................................... 52
I.2.2
Стабильность
промотор-энхансерного
взаимодействия:
динамический
контакт или прочный комплекс? .................................................................................... 57
I.2.3
Движущие силы коммуникации в клеточном ядре .......................................... 61
I.2.4
Свободная диффузия и макромолекулярное скопление .................................. 78
I.3
Функциональная компартментализация клеточного ядра ..................................... 81
I.3.1
Хромосомные территории ................................................................................. 84
I.3.2
Ядерный матрикс ............................................................................................... 87
I.3.3
Ламино- и ядрышко-ассоциированные домены ............................................... 90
I.3.4
Функциональные ядерные компартменты ........................................................ 94
I.4
Взаимосвязь
между
компартментализацией
ядра
и
пространственной
организацией хромосом .................................................................................................... 106
I.5
Заключительные замечания .................................................................................. 114
Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ............................................................................ 115
II.1
Работа с клеточным материалом........................................................................... 115
II.1.1
Ведение клеточных культур ............................................................................ 115
II.1.2
Индукция эритроидной дифференцировки клеток HD3 ................................ 115
II.1.3
Выделение эмбриональных эритроидных клеток и фибробластов кур......... 115
II.1.4
Выделение эмбриональных эритроидных клеток и клеток мозга мыши ...... 116
II.1.5
Получение Ter119+ и Ter119– клеток мыши ................................................... 116
II.1.6
Окрашивание клеток бензидином для выявления гемоглобина .................... 117
II.2
Работа с ДНК и РНК.............................................................................................. 117
II.2.1
Выделение геномной ДНК из эукариотических клеток ................................. 117
II.2.2
Выделение бакмидной ДНК из клеток E. сoli................................................. 118
3
II.2.3
Приготовление эквимолярной смеси продуктов лигирования на основе
бакмиды ......................................................................................................................... 119
II.2.4
Электрофорез ДНК в агарозном геле.............................................................. 119
II.2.5
Выделение тотальной РНК из эукариотических клеток ................................ 120
II.2.6
Обратная транскрипция-ПЦР .......................................................................... 121
II.2.7
Флуорометрическое измерение концентрации нуклеиновых кислот.......... 122
II.3
Полимеразная цепная реакция .............................................................................. 122
II.3.1
Простая жидкостная ПЦР................................................................................ 122
II.3.2
ПЦР в реальном времени с TaqMan-пробами................................................. 122
II.4
Клонирование ........................................................................................................ 123
II.5
3С-анализ ............................................................................................................... 123
II.5.1
Фиксация клеток и изоляция ядер................................................................... 123
II.5.2
Рестрикция и лигирование ДНК ..................................................................... 124
II.5.3
Очистка продуктов лигирования..................................................................... 125
II.5.4
Количественный анализ продуктов лигирования........................................... 125
II.6
M3C-анализ ............................................................................................................ 127
II.6.1
Выделение нуклеоидов .................................................................................... 127
II.6.2
Получение ядерных матриксов и лигирование ямДНК ................................. 128
II.6.3
Количественный анализ продуктов лигирования........................................... 129
II.7
INGRID-анализ ...................................................................................................... 130
II.7.1
Получение сшитых фрагментов хроматина.................................................... 130
II.7.2
ПЦР в геле ........................................................................................................ 131
II.8
4C-анализ ............................................................................................................... 133
II.8.1
Фиксация клеток, первичная рестрикция и лигирование............................... 133
II.8.2
Вторичная рестрикция, лигирование и третичная рестрикция ...................... 134
4
II.8.3
Амплификация продуктов лигирования ......................................................... 134
II.8.4
Подготовка 4С-библиотек для секвенирования ............................................. 135
II.8.5
Биоинформатический анализ 4C-данных ....................................................... 136
II.9
ChIP-seq .................................................................................................................. 138
II.10
Иммуноцитохимия ................................................................................................ 139
II.11
Флуоресцентная гибридизация in situ ................................................................... 141
II.12
Электронная микроскопия .................................................................................... 142
II.13
Иммуноблотинг белков и окрашивание Кумасcи ................................................ 142
II.14
Программное обеспечение .................................................................................... 143
II.15
Последовательности праймеров и флуоресцентных проб для ПЦР.................... 144
Глава III.
III.1
РЕЗУЛЬТАТЫ ............................................................................................... 155
Структура индивидуальных активаторных хроматиновых блоков ..................... 155
III.1.1 Активаторный хроматиновый блок домена бета-глобиновых генов кур ...... 155
III.1.2 Объединенный активаторный хроматиновый блок альфа-глобиновых генов и
гена TMEM8 ................................................................................................................... 166
III.2
Механизмы контактов удаленных регуляторных элементов генома .................. 173
III.2.1 Переосмысление процедуры 3С: лигирование в ядре, а не в растворе ......... 173
III.2.2 Абсолютные частоты лигирования в процедуре 3С....................................... 193
III.2.3 Количественный анализ взаимодействия удаленных элементов генома с
помощью метода молекулярных колоний.................................................................... 201
III.2.4 Изучение роли ядерного матрикса в поддержании контактов удаленных
элементов генома .......................................................................................................... 228
III.3
Механизмы поддержания трехмерной организации генома................................ 241
III.3.1 Полногеномный анализ пространственных взаимодействий СpG-островков,
содержащих промоторы генов домашнего хозяйства ................................................. 241
5
Глава IV.
IV.1
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ................................................................ 265
Пространственная
организация
домена
бета-глобиновых
генов
кур
в
эритроидных клетках на разных стадиях эмбрионального развития.............................. 265
IV.2
Регуляция транскрипции альфа-глобиновых генов и гена TMEM8 посредством
сборки альтернативных активаторных хроматиновых блоков ....................................... 271
IV.3
Пересмотр ключевых этапов техники фиксации конформации хромосомы и
предложение новой модели позиционирования геномных элементов в ядре ................ 274
IV.4
Абсолютные частоты лигирования в процедуре 3С ............................................ 284
IV.5
Выявление
прямых
контактов
между
геномными
элементами
методом
молекулярных колоний ..................................................................................................... 287
IV.6
Ядерный матрикс как платформа для взаимодействия удаленных регуляторных
элементов генома .............................................................................................................. 291
IV.7
Кластеризация
CрG-островков
как
важный
фактор
пространственной
организации интерфазных хромосом ............................................................................... 298
ЗАКЛЮЧЕНИЕ................................................................................................................... 303
ВЫВОДЫ ............................................................................................................................. 307
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ................................................................................................. 309
БЛАГОДАРНОСТИ............................................................................................................ 385
6
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
3С (chromosome conformation capture) – фиксация конформации хромосомы;
4С (circular chromosome conformation capture) – циркулярная фиксация конформации
хромосомы;
5С (сhromosome сonformation сapture сarbon сopy) – углеродная копия фиксации
конформации хромосомы;
ChIP (chromatin immunoprecipitation) – иммунопреципитация хроматина;
DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole) – 4,6-диамидино-2-фенилиндол;
DEPC (diethylpyrocarbonate) – диэтилпирокарбонат;
DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) – среда Игла, модифицированная Дульбекко;
DMSO (dimethylsulfoxide) – диметилсульфоксид;
DTT (dithiothreitol) – дитиотреитол;
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) – этилендиаминтетрауксусная кислота;
EGS
(ethylene
glycol
bis(succinimidylsuccinate))
–
этиленгликоль-
бис(сукцинимидилсукцинат));
FISH (fluorescence in situ hybridization) – флуоресцентная гибридизация in situ;
HEPES
(N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic
acid)
–
N-2-
гидроксиэтилпиперазин-N’-2-этансульфоновая кислота;
HiC (high-throughput сhromosome сonformation сapture) – фиксация конформации
хромомосы высокой производительности;
HMG (high mobility group) – группа белков с высокой подвижностью;
INGRID (in gel replication of interaction DNA segments) – репликация в геле
взаимодействующих сегментов ДНК;
LCR (locus control region) – область контроля локуса;
LIS (lithium diiodosalicylate) – дииодосалицилат лития;
7
M3C (matrix 3C) – фиксация конформации хромомосы на ядерном матриксе;
MASC (magnetic-activated cell sorting) – магнитно-активированная сортировка клеток;
MB-проба – проба типа Molecular beacon;
MRE (major regulatory element) – главный регуляторный элемент;
NDR (nucleosome-depleted region) – обедненный нуклеосомами регион ДНК;
NMI (Nuclear Myosin I) – ядерный миозин I;
PIPES (piperazine-N,N’-bis(2-ethanesulfonic) acid) - пиперазин-1,4-бис(2-этансульфоновая)
кислота;
PMSF (phenylmethylsulfonyl fluorid) – фенилметилсульфонил флуорид;
PSA (prostate specific antigen) – простатический специфический антиген;
S/MAR (scaffold/matrix attachment region) – участок связывания ДНК c ядерным
каркасом/матриксом;
SDS (sodium dodecylsulfate) – додецилсульфат натрия;
TSS (transcription start site) – точка инициации транскрипции;
БСА – бычий сывороточный альбумин;
мякРНК – малая ядрышковая РНК;
мяРНК – малая ядерная РНК;
п.н. (т.п.н., млн п.н.) – пары нуклеотидов (тысячи пар нуклеотидов, миллионы пар
нуклеотидов);
ПААГ – полиакриаламидный гель;
ПЦР – полимеразная цепная реакция;
ТАД – топологически-ассоциированный домен;
ЭМ – электронная микроскопия;
ямДНК – ДНК ядерного матрикса.
8
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы
Конец ХХ и начало ХХI века характеризуются бурным развитием сравнительно
молодого направления науки – молекулярной биологии, постоянным интересом к
достижениям в этой области со стороны общества и объективной важностью
исследований. Область интересов молекулярной биологии как науки охватывает
широчайший спектр фундаментальных научных проблем. По-прежнему ведущую роль
занимают изучение структуры и механизмов организации и функционирования
нуклеиновых кислот, белков, различных органелл клеток, биосинтеза белка, структуры и
механизмов функционирования генома, исследования строения и функционирования
различных внутриклеточных структур и их взаимодействий, работы клеточной мембраны.
Также важными направлениями исследований являются: изучение механизмов
активации
транскрипции,
коммуникации
удаленных
структурно-функциональной
организации
регуляторных
генома,
элементов
хроматина,
функциональной
компартментализации клеточного ядра и др.
Несмотря на очевидный прогресс молекулярной биологии и, в частности,
молекулярной генетики, многие вопросы ключевого характера остаются неясными или
даже спорными. Ответы на них зачастую носят дискуссионный или аннотационный
характер. Есть и белые пятна, и нестыковки; некоторые модели, схемы взаимодействий
утрачивают актуальность под напором новых экспериментальных данных. Одной из
важных задач современной молекулярной биологии является раскрытие принципов
пространственной организации генома эукариот, к которым относятся человек, животные,
растения и грибы, т.е. все организмы, как многоклеточные, так и одноклеточные, за
9
исключением бактерий и архей. Актуальность этой задачи во многом определяется тем,
что на уровне пространственной организации ДНК в клеточном ядре работают различные
эпигенетические механизмы, контролирующие работу генов.
Активация транскрипции генов – это многоступенчатый процесс, включающий
привлечение к промотору гена комплекса белков базальной транскрипции в совокупности
с
изменением
структуры
хроматина
–
ремоделированием
нуклеосом
и
посттрансляционными модификациями гистонов. Энхансеры и области контроля локуса,
удаленные
от
контролируемых
ими
генов,
привлекают
белковые
комплексы,
осуществляющие эти изменения, и, в ряде случаев, рекрутируют РНК-полимеразу II.
Вопрос относительно того, каким образом удаленные регуляторные элементы генома
взаимодействуют с подконтрольными генами, изучается достаточно давно, но и по сей
день остается дискуссионным. Исследования последних лет свидетельствуют о том, что
активирующее
действие
энхансеров
связано
с
формированием
доменов
модифицированных гистонов и осуществляется через посредство прямого контакта
энхансеров и промоторов генов с выпетливанием разделяющего участка ДНК.
Доказательства модели выпетливания получены с использованием метода фиксации
конформации хромосомы 3C (chromosome conformation capture). В пионерской работе по
3С-анализу
было
показано,
что
активные
бета-глобиновые
гены
физически
взаимодействуют в ядерном пространстве с многочисленными цис-регуляторными
элементами, что послужило основанием для модели активаторного хроматинового блока
регуляторных элементов, иначе – хроматинового хаба (Tolhuis et al., 2002). Согласно этой
модели, формирование активаторного хроматинового блока обеспечивает корректную
экспрессию генов и требует присутствия белковых факторов, обладающих афинностью
друг к другу и связывающихся с соответствующими участками на ДНК.
10
К настоящему времени накоплено большое количество экспериментальных данных
по анализу конфигурации протяженных геномных участков, содержащих различные
тканеспецифичные гены и гены домашнего хозяйства. В целом, эти данные подтверждают
модель активаторного хроматинового блока. Исследования проводились на различных
объектах от простейших одноклеточных организмов, таких как дрожжи, до человека.
Предметом исследования были как отдельные геномные домены и их регуляторные
системы, так и более протяженные геномные области и целые хромосомы. Кроме того,
ряд исследований посвящен выяснению вопросов о возможности взаимодействия
регуляторных элементов, расположенных на разных хромосомах.
Технологическией
прогресс
и
развитие
методов
высокопроизводительного
секвенирования привели к появлению панели так называемых С-методов, позволяющих
проводить
анализ
пространственных
взаимодействий
геномных
элементов
в
полногеномном масштабе. С использованием метода HiC были открыты общие принципы
укладки интерфазного генома. Было установлено, что хромосомы млекопитающих и
дрозофилы организованы иерархически. В масштабе миллионов пар нуклеотидов
хромосомы
компартментализуются
с
образованием
активного
и
неактивного
компартментов. В более мелком масштабе хромосомы подразделяются на топологическиассоциированные
домены,
которые,
по
всей
видимости,
представляют
собой
хроматиновые глобулы (Gibcus and Dekker, 2013). Было показано, что организация
хромосом в серию топологически-ассоциированных доменов отличается эволюционной
консервативностью и независимостью от типа клеток. В то же время, механизмы,
ответственные за пространственную сегрегацию активных и неактивных участков генома,
и принципы организации топологически-ассоциированных доменов остаются неясными.
В других исследованиях с использованием С-методов были обнаружены
специфичные для клеточных типов взаимодействия генов и удаленных регуляторных
11
элементов, реализующиеся в масштабе целого генома. Было показано, что на уровне
пространственной организации генома могут регулироваться различные процессы, от
активации и репрессии транскрипции и геномного импринтинга (Misteli, 2007) до
клеточного старения (Chandra et al., 2015) и циркадных ритмов (Aguilar-Arnal et al., 2013).
Однако
приходится
констатировать,
что
большинство
исследований
в области
пространственной организации генома носят аннотационный характер.
Получаемая статичная картина пространственной организации генома позволяет
установить взаимное расположение регуляторных элементов генома, подтвердить или
опровергнуть роли уже картированных регуляторных элементов, однако аспекты
механики взаимодействия геномных элементов, природа этих взаимодействий, их частота
и стабильность остаются не выясненными. Хотя модель активаторного хроматинового
блока в научном сообществе общепринята, она остается лишь гипотезой, потому что
метод 3С позволяет анализировать лишь попарные взаимодействия геномных элементов
и с его помощью в принципе невозможно продемонстрировать существование
многокомпонентных комплексов, включающих в себя более двух фрагментов ДНК. Более
того,
метод
3С
и
другие
методы,
основанные
на
принципе
лигирования
близкорасположенных фрагментов ДНК в клеточном ядре, не дают возможности
подсчитать долю клеток, в которых изучаемые последовательности ДНК расположены в
пространственной близости. Наконец, как и любой биохимический подход, метод 3С
позволяет получить лишь усредненную картину того, что происходит в различных
клетках, присутствующих в популяции. Все это определяет актуальность настоящего
исследования, направленного на изучение функционально-зависимой архитектуры
эукариотического генома и расширение методической базы для исследований в области
пространственной организации генома.
12
Цели и задачи исследования
Целью
настоящей
работы
явилось
изучение
механизмов
взаимодействия
удаленных регуляторных элементов генома и выяснение роли этих взаимодействий в
регуляции экспрессии генов. Особое внимание в нашей работе было уделено доработке и
оптимизации существующего протокола 3С-метода, а также созданию новых методов
изучения
пространственной
организации
генома,
преодолевающих
внутренние
ограничения метода 3С и его производных.
Для достижения этих целей в работе были поставлены следующие задачи:
1.
С использованием метода 3С охарактеризовать пространственную организацию
геномных доменов открытого и закрытого типов на примере доменов альфа- и бетаглобиновых генов. Изучить молекулярные механизмы активации транскрипции
глобиновых и ряда других генов удаленными энхансерными элементами. Исследовать
механизмы переключения программы транскрипции глобиновых генов в ходе
эмбрионального развития.
2.
Провести
анализ
основных
этапов
метода
3С
и
изучить
механизм
предпочтительного лигирования близкорасположенных фрагментов ДНК в этой
экспериментальной процедуре. Изучить механизмы поддержания пространственной
близости удаленных элементов генома в клеточном ядре.
3.
Разработать технику количественного анализа абсолютных частот лигирования в
процедуре 3С и
оценить
действительные частоты
взаимодействия удаленных
регуляторных элементов in vivo.
4.
На основании метода молекулярных колоний разработать метод прямого анализа
комплексов геномных элементов, не использующий процедуру лигирования и
основывающийся на амплификации фрагментов ДНК в геле. С использованием этого
метода проанализировать возможность сборки нескольких элементов в единый комплекс
13
и проверить справедливость модели активаторного хроматинового блока. Оценить
частоту сборки элементов ДНК в единый комплекс и определить стабильность
взаимодействия элементов в составе комплекса.
5.
Разработать
метод
анализа
пространственной
близости
фрагментов
ДНК,
связанных с ядерным матриксом. Изучить возможную роль ядерного матрикса во
взаимодействии удаленных элементов генома и пространственной организации
протяженных участков ДНК.
6.
С использованием метода 4С провести полногеномный анализ пространственных
взаимодействий
промоторов генов
домашнего
хозяйства. Изучить особенности
организации генов домашнего хозяйства и тканеспецифичных генов в общие
транскрипционные фабрики для осуществления скоординированной транскрипции.
Научная новизна работы
Использование в настоящей работе широкого спектра методов и модельных систем
позволило нам уточнить механизмы пространственного взаимодействия удаленных
регуляторных элементов генома, а также исследовать движущие силы позиционирования
геномных элементов в клеточном ядре и выявить факторы, определяющие специфическую
пространственную
организацию
интерфазных
хромосом.
В
работе
исследованы
молекулярные механизмы, контролирующие экспрессию тканеспецифичных генов,
предложены новые модели активации генов удаленными регуляторными элементами,
изучена пространственная организация транскрипционного аппарата в клеточном ядре. С
использованием принципиально новых подходов для изучения пространственных
взаимодействий удаленных регуляторных элементов генома (INGRID и M3C) были
существенно расширены и уточнены существующие представления о механизмах работы
эукариотических энхансеров и принципах формирования функционально-зависимой
14
пространственной организации генома. В работе уточнен принцип работы метода
фиксации конформации хромосомы (3С). Продемонстрировано, что один из основных
постулатов, положенных в основу данной экспериментальной процедуры, является
неверным. Полученные результаты свидетельствуют о необходимости переосмысления
результатов
исследований,
авторскими
коллективами.
простраственная
проведенных с использованием
организация
В
частности,
генома
в
наши
метода 3С другими
результаты
клеточном
ядре
показывают,
является
что
чрезвычайно
динамичной. Фактически постоянно происходит перебор различных вариантов, некоторые
из которых временно фиксируются посредством дополнительных взаимодействий между
связанными с регуляторными элементами генома белками.
Теоретическая и практическая значимость исследования
Настоящая работа является существенным шагом вперед на пути к пониманию
того,
каким
образом
пространственная
архитектура
генома
связана
с
его
функционированием. В работе показано, что пространственная организация ДНК является
важным фактором регуляции экспрессии генов высших эукариот. Вместе с тем, работа
представляет интерес и с практической точки зрения: новые знания о механизмах,
контролирующих экспрессию генов, могут быть с успехом использованы в медицине и
биотехнологии. В более узком плане, работа значима еще и потому, что раскрывает ряд
важных особенностей регуляции экспрессии именно глобиновых генов, нарушения в
работе которых вызывают тяжелые заболевания человека и хозяйственно-важных
домашних животных.
15
Положения и результаты, выносимые на защиту
1.
Домен бета-глобиновых генов кур имеет сложную пространственную организацию
в эритроидных клетках, предполагающую возможность сближения промоторов
глобиновых генов с удаленными энхансерными элементами. Пространственная
организация домена отличается в клетках различного происхождения и на разных этапах
эмбрионального развития. При этом корреляция между транскрипционной активностью
индивидуальных глобиновых генов и их привлечением к активаторному комплексу не
является абсолютной.
2.
Транскрипция альфа-глобиновых генов кур и эритроидспецифичного гена TMEM8,
локализованного за кластером альфа-глобиновых генов, регулируется за счет сборки
альтернативных активаторных комплексов, в составе которых имеются как общие, так и
специфичные регуляторные элементы.
3.
Для
поддержания
взаимного
позиционирования
удаленных
регуляторных
элементов генома важно сохранение целостности клеточного ядра. Стадия рестрикции и
лигирования в экспериментальном протоколе метода 3С осуществляется внутри ядра, а
не в растворе после лизиса клеток, как предполагалось ранее. Для активации
транскрипции гена существенно сближение промотора и удаленных регуляторных
элементов в одном функциональном компартменте, где они не обязательно объединены
в единый регуляторный комплекс.
4.
Разработанная нами количественная техника позволяет определять абсолютный
выход продуктов лигирования в процедуре 3С-анализа. Низкие частоты лигирования
фрагментов, предположительно входящих в состав одного активаторного хроматинового
блока, свидетельствуют о низкой частоте прямого взаимодействия регуляторных
элементов ДНК in vivo.
16
5.
Разработанный
взаимодействий
нами
удаленных
новый
подход
регуляторных
для
изучения
элементов
генома,
пространственных
основанный
на
амплификации в геле фрагментов ДНК, выделенных из фиксированных клеток, (метод
INGRID), демонстрирует, что в большинстве клеток, экспрессирующих глобиновые
гены, промоторы глобиновых генов и их энхансерные элементы не организованы в
единый ДНК-белковый комплекс.
6.
Созданная нами экспериментальная процедура (метод М3С) позволяет исследовать
вопрос о пространственной сближенности прикрепленных к ядерному матриксу
фрагментов ДНК. Связанные с ядерным матриксом промоторы ряда генов домашнего
хозяйства, расположенных во фланкирующих областях домена альфа-глобиновых генов
кур, образуют единый комплекс на ядерном матриксе и составляют основу
транскрипционной фабрики.
7.
CpG-островки, ассоциированные с промоторами генов домашнего хозяйства и
участками начала репликации ДНК, взаимодействуют в пространстве ядра в масштабе
всего генома, что является одним из факторов, определяющих специфическую
пространственную организацию интерфазных хромосом, в том числе сегрегацию
активного и неактивного хроматиновых компартментов.
Степень обоснованности и достоверности результатов и выводов работы
Работа выполнена на высоком методическом уровне; научные результаты, изложенные в
диссертационной работе, основаны на экспериментальных данных, полученных с
использованием
новейших
методических
подходов.
Достоверность
результатов
определяется использованием современного оборудования, отработанных методов
обработки и анализа данных и подтверждается высокой воспроизводимостью результатов.
17
Выводы, полученные в ходе работы, обоснованы и соответствуют целям и задачам
исследования.
Личный вклад автора
Большинство экспериментальных данных получено автором лично. Ему принадлежит
ведущая роль в выборе направления исследования, анализе и обобщении полученных
результатов. Эксперименты по использованию метода молекулярных колоний для анализа
частоты взаимодействий между удаленными геномными элементами проведены в
сотрудничестве с А.Б Четвериным и Е.В. Четвериной. Электронно-микроскопический
анализ выполнен при участии И.И. Киреева. Работы по секвенирование 4С-библиотек
проведены в сотрудничестве с М.Д. Логачевой. Биоинформатический анализ 4С-данных
осуществлен при участии А.В. Артемова.
Апробация работы
Результаты работы докладывались и обсуждались на международных и отечественных
научных конференциях, конгрессах и симпозиумах: Workshop «Protein-nucleic acid
interactions» of the International Research Training Group 1384 (Вильнус, Литва, 2010);
International Symposium «Control of gene expression and cancer» (Москва, 2010); Symposium
«Enzymes and multienzyme complexes acting on nucleic acids» (Гессен, Германия, 2010);
International Symposium «Chromatin Changes in Differentiation and Malignancies» of
Transregional Collaborative Research Centre 81 (Гессен, Германия, 2011); EMBO Conference
«Nuclear
Structure
and
Dynamics»
(Л'Иль-сюр-ла
Сорг,
Франция,
2011,
2013);
Международной конференции «Хромосома 2012» (Новосибирск, 2012); Keystone
Symposia on Molecular and Cellular Biology «Genomic Instability and DNA Repair» (Банф,
18
Канада, 2013); 38-th FEBS Congress «Mechanisms in biology» (Санкт-Петербург, 2013);
FEBS EMBO Conference (Париж, Франция, 2014).
Публикации
По теме диссертации опубликовано
52 печатные работы: 34 статьи в
рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов
диссертационных работ по биологии (из них 29 в изданиях Web of Science), и 18
тезисов докладов.
Cтатьи в научных журналах:
1.
Gavrilov A., Eivazova E., Priozhkova I., Lipinski M., Razin S., Vassetzky Y. (2009).
Chromosome conformation capture (from 3C to 5C) and its ChIP-based modification. Methods
Mol. Biol. 567, 171-88.
2.
Eivazova E.R., Gavrilov A., Pirozhkova I., Petrov A., Iarovaia O.V., Razin S.V., Lipinski
M., Vassetzky Y.S. (2009). Interaction in vivo between the Two Matrix Attachment Regions
Flanking a Single Chromatin Loop J. Mol. Biol. 386, 929-37.
3.
Klochkov D., Gavrilov A., Vassetzky E.S., Razin S.V. (2009). Early replication timing of
the chicken alpha-globin gene domain correlates with its open chromatin state in cells of
different lineages. Genomics 93, 481-86.
4.
Gavrilov A., Razin S.V. (2009). Formaldehyde fixation of cells does not greatly reduce
the ability to amplify cellular DNA. Anal Biochem. 390, 94-6.
5.
Филоненко Е.С., Гаврилов А.А., Разин С.В., Яровая О.В. (2009). В эритроидных
клетках кур протяженный фрагмент хромосомы 14, включающий кластер альфаглобиновых генов, организован в микропетли. Acta Naturae 1, 105–8.
19
6.
Philonenko E.S., Klochkov D.B., Borunova V.V., Gavrilov A.A., Razin S.V., Iarovaia
O.V. (2009). TMEM8 – a non-globin gene entrapped in the globin web. Nucleic Acids Res. 7,
7394-406.
7.
Gavrilov A.A., Zukher I.S., Philonenko E.S., Razin S.V., Iarovaia O.V. (2010). Mapping
of the nuclear matrix-bound chromatin hubs by a new M3C experimental procedure. Nucleic
Acids Res. 38, 8051-60.
8.
Разин С.В., Гаврилов А.А., Яровая О.В. (2010). Транскрипционные фабрики и
пространственная организация эукариотического генома. Биохимия 75, 1477-88.
9.
Филоненко Е.С., Гаврилов А.А., Разин С.В., Яровая О.В. (2010). Расширение
функционального домена альфа-глобиновых генов кур. Генетика 46, 1164-67.
10.
Razin S.V., Gavrilov A.A., Pichugin A., Lipinski M., Iarovaya O.V., Vassetzky Y.S.
(2011). Transcription factories in the context of the nuclear and genome organization. Nucleic
Acids Res. 39, 9085-92.
11.
Gavrilov A.A., Philonenko E.S., Iarovaya O.V., Razin S.V. (2011). Dynamic nature of
active chromatin hubs. Biopolymers and Cell 27, 364-8.
12.
Юдинкова Е.С., Бунина Д.А., Ульянов С.В., Гаврилов А.А., Разин С.В. (2011).
Профили распределения модифицированных форм гистонов в домене альфа-глобиновых
генов кур. Молекулярная биология 45, 662-7.
13.
Lorenzo P.I., Brendeford E.M., Gilfillan S., Gavrilov A.A., Leedsak M., Razin S.V.,
Sæther T., Gabrielsen O.S. (2011). Identification of c-Myb Target Genes in K562 Cells Reveals
a Role for c-Myb as a Master Regulator. Genes & Cancer 2, 805-17.
14.
Yudinkova E.S., Ulyanov S.V., Bunina D.A., Iarovaia O.V., Gavrilov A.A., Razin S.V.
(2011). The inactivation of the  gene in chicken erythroblasts of adult lineage is not mediated
by packaging of the embryonic part of the alpha-globin gene domain into a repressive
heterochromatin-like structure. Epigenetics 6, 1481-8.
20
15.
Ulianov S.V., Markova E.N., Gavrilov A.A., Razin S.V. (2012). Insulators in vertebrates:
regulatory mechanisms and chromatin structure. Biopolymers and Cell 28, 252-60.
16.
Gavrilov A.A., Razin S.V., Iarovaia O.V. (2012). C-methods to study 3D organization of
the eukaryotic genome. Biopolymers and Cell 28, 245-51.
17.
Разин С.В., Ульянов С.В, Юдинкова Е.С., Гущанская Е.С., Гаврилов А.А., Яровая
О.В. (2012). Домены альфа и бета-глобиновых генов кур в контексте структурнофункциональной организации эукариотического генома. Успехи биологической химии
52, 3-36.
18.
Ульянов С.В., Гаврилов А.А. (2012). Бета-глобиновые гены кур: модельная система
для изучения регуляции транскрипции на уровне геномных доменов. Молекулярная
биология 46, 683-98.
19.
Ulianov S.V., Gavrilov A.A., Razin S.V. (2012) Spatial organisation of the chicken β-
globin gene domain in erythroid cells of embryonic and adult lineages. Epigenetics and
chromatin 5, 16.
20.
Gavrilov A.A., Gushchanskaya E.S., Strelkova O., Zhironkina O., Kireev I.I., Iarovaia
O.V., Razin S.V. (2013) Disclosure of a structural milieu for the proximity ligation reveals the
elusive nature of an active chromatin hub. Nucleic Acids Res 41, 3563-75.
21.
Gavrilov A.A., Golov A.K., Razin S.V. (2013) Actual ligation frequencies in the
chromosome conformation capture procedure. PLoS One 8, e60403.
22.
Razin S.V., Gavrilov A.A., Ioudinkova E.S., Iarovaia O.V. (2013) Communication of
genome regulatory elements in a folded chromosome. FEBS Lett 587, 1840-7.
23.
Gavrilov A.A., Chetverina E.V., Chermnykh E.S., Razin S.V., Chetverin A.B. (2014)
Quantitative analysis of genomic element interactions by molecular colony technique. Nucleic
Acids Res. 42, e36.
21
24.
Razin S.V., Gavrilov A.A. (2014) Chromatin without the 30-nm fiber: constrained
disorder instead of hierarchical folding. Epigenetics 9, 653-7.
25.
Gushchanskaya E.S., Artemov A.V., Ulyanov S.V., Logacheva M.D., Penin A.A.,
Kotova E.S., Akopov S.B., Nikolaev L.G., Iarovaia O.V., Sverdlov E.D., Gavrilov A.A., Razin
S.V. (2014) The clusterization of CpG islands constitutes an important determinant of the 3D
organization of interphase chromosomes. Epigenetics 9, 951-63.
26.
Гущанская Е.С., Гаврилов А.А., Разин С.В. (2014) Пространственная организация
интерфазных хромосом и роль динамики хроматиновой фибриллы в позиционировании
элементов генома. Молекулярная биология 48, 386-94.
27.
Ioudinkova E.S., Gavrilov A.A., Razin S.V. (2014) Folded genome as a platform for the
functional compartmentalization of the eukaryotic cell nucleus. Biopolymers and Cell 30, 839.
28.
Гущанская Е.С., Артемов А.А., Ульянов С.В., Пенин А.А., Логачева М.Д., Разин
С.В., Гаврилов А.А. (2014) Пространственная организация генов домашнего хозяйства в
интерфазных ядрах. Молекулярная биология 48, 1008-18.
29.
Golov A.K., Razin S.V., Gavrilov A.A. (2014) Nucleosomal Packaging of Eukaryotic
DNA and the Regulation of Transcription. Biopolymers and Cell 30, 413-25.
30.
Гаврилов А.А., Разин С.В. (2015) Компартментализация клеточного ядра и
пространственная организация генома. Молекулярная биология 49, 26-45.
31.
Разин С.В., Гаврилов А.А. (2015) Организация функциональных процессов в
клеточном ядре: порядок, возникающий из беспорядка. Вестник Московского
университета 3, 13-20.
32.
Gavrilov A., Razin S.V., Cavalli G. (2015) In vivo formaldehyde cross-linking: it is time
for black box analysis. Briefings in Functional Genomics 14, 163-5.
22
33.
Разин С.В., Гаврилов А.А., Ульянов С.В. (2015) Регуляторные элементы
эукариотического генома, контролирующие транскрипцию. Молекулярная биология 49,
212-23.
34.
Ulyanov S.V., Gavrilov A.A., Razin S.V. (2015) Nuclear compartments, genome folding
and promoter-enhancer communication. Int Rev Cell Mol Biol. 315, 183-244.
Тезисы конференций
35.
Gavrilov A., Razin S.V. and Iarovaia O.V. Mapping of the nuclear matrix-bound
chromatin hubs by a new M3C procedure reveals a complex organization of transcription
factories. Workshop «Protein-nucleic acid interactions» of the International Research Training
Group Gießen/Marburg-Moscow. Lithuania, Vilnius, May 16-19, 2010, abstract book, p. 30.
36.
Gavrilov A., Razin S.V. and Iarovaia O.V. Mapping of the nuclear matrix-bound
chromatin hubs by a new M3C experimental procedure. International Symposium «Control of
gene expression and cancer». Russia, Moscow, June 21-25, 2010, abstract book, p. 57.
37.
Gavrilov A. M3C – a new technique to analyze the spatial proximity of nuclear matrix-
bound DNA fragments. On-site evaluation of the DFG/RFBR funded International Research
Training Group «Enzymes and multienzyme complexes acting on nucleic acids». Giessen,
Germany, September 21, 2010, abstract book, p. 41.
38.
Gavrilov A.A., Chetverina H.V., Chermnykh E.S., Chetverin A.B., Razin S.V. Active
chromatin hub «zoomed-in»: visual demonstration of simultaneous interaction between
promoters and distant regulatory elements. International symposium «Chromatin Changes in
Differentiation and Malignancies» of Transregional Collaborative Research Centre 81. Giessen,
Germany, September 12-14, 2011, abstract book, p. 56.
39.
E.S. Gushchanskaya, A.A. Gavrilov, S.V. Razin. Characteristic features of structural and
functional organization of transcription factories in the eukaryotic nucleus. International
23
symposium «Chromatin Changes in Differentiation and Malignancies» of Transregional
Collaborative Research Centre 81. Giessen, Germany, September 12-14, 2011, abstract book, p.
59.
40.
S.V. Ul’yanov, A.A. Gavrilov, and S.V. Razin. Сharacterization of spatial organization of
the chicken beta-globin gene domain. International symposium «Chromatin Changes in
Differentiation and Malignancies» of Transregional Collaborative Research Centre 81. Giessen,
Germany, September 12-14, 2011, abstract book, p. 113.
41.
Gavrilov A.A., Chetverina H.V., Chermnykh E.S., Chetverin A.B., Razin S.V.
Quantitative analysis of DNA-DNA interactions in vivo by molecular colony technique. EMBO
Conference Series «Nuclear Structure and Dynamics». L’Isle sur la Sorgue, France, September
28–October 2, 2011, abstract book, p. 36.
42.
Гаврилов А.А., Гущанская Е.С., Киреев И.И., Яровая О.В., Разин С.В.
Переосмысление метода 3С: лигирование в ядре, а не в растворе. Международная
конференция «Хромосома 2012», Новосибирск, Россия, 2–7 сентября 2012, сборник
тезисов, с. 73-74.
43.
Gavrilov A.A., Razin S.V., Iarovaia O.V. Nuclear matrix as a platform for interaction of
remote genomic elements: a new experimental approach. V International Meeting «Early
events in human pathologies», 9-12 July 2012, Listvianka, Russia, abstract book, p.18.
44.
Razin S.V., Gushchanskaya E.S., Iarovaia O.V., Gavrilov A.A. Folded chromatin domain
instead of an active chromatin hub: a model based on reconsidered essentials of the
chromosome conformation capture procedure. XVI Gliwice Scientific Meetings; Gliwice,
Poland, November 17-17, 2012, abstract book, p. 12.
45.
Gavrilov A.A., Gushchanskay E.S., Kireev I.I., Iarovaia O.V., Razin S.V. Rethinking the
3C procedure: proximity ligation inside the nucleus. Keystone Symposia on Molecular and
24
Cellular Biology «Genomic Instability and DNA Repair», Banff, Alberta, Canada, March 3 - 8,
2013, abstract book, p.143.
46.
Gavrilov A.A., Golov A.K., Razin S.V. Low yield of 3C ligation products: technical
issues or infrequent interaction between DNA regulatory elements? 38-th FEBS Congress
«Mechanisms in biology», Saint Petersburg, Russia, July 6–11, 2013, FEBS Journal 280
(Suppl. 1), 15. DOI: 10.1111/febs.12340.
47.
Razin S.V., Gushchanskaya E.S., Golov A.K., Iarovaia O.V., Gavrilov A.A. Elusive
active chromatin hubs: nuclear compartments, folded chromatin domains or rigid complexes of
regulatory elements? 38th FEBS Congress «Mechanisms in biology», Saint Petersburg, Russia,
July 6–11, 2013, FEBS Journal 280 (Suppl. 1), 3-4. DOI: 10.1111/febs.12340.
48.
Gushchanskaya E.S., Artemov A., Gavrilov A.A. Characterization of long range
interactions of the chicken house-keeping gene ggPRX. 38-th FEBS Congress «Mechanisms in
biology», Saint Petersburg, Russia, July 6–11, 2013, FEBS Journal 280 (Suppl. 1), 18. DOI:
10.1111/febs.12340.
49.
Razin S.V., Gushchanskaya E.S., Golov A.K., Iarovaia O.V., Gavrolov A.A. The role of
eukaryotic genome spatial organization in the regulation of transcription. 23th Wilhelm
Bernhard Workshop on the cell nucleus, Debrecen, Hungary, August 19-24, 2013, abstract
book, p.27.
50.
Gavrilov A.A., Gushchanskaya E.S., Kireev I.I., Iarovaia O.V., Razin S.V. «In cage» 3C:
revealing the principles of the proximity ligation. EMBO Conference Series «Nuclear Structure
and Dynamics». L’Isle sur la Sorgue, France, October 2–6, 2013, abstract book, p. 46.
51.
Gavrilov A., Gushchanskaya E., Ulyanov S., Iarovaia O.V., Artemov A., Razin S.V.
Spatial interaction of CpG islands in the interphase nucleus. FEBS EMBO Conference. Paris,
France, August 30 – September 4, 2014, FEBS Journal 281 (Suppl. 1), 311. DOI:
10.1111/febs.12919.
25
52.
Gushchanskaya E.S., Artemov A.V., Ulyanov S.V., Logacheva M.D., Penin A.A.,
Iarovaia O.V., Gavrilov A.A., Razin S.V. The spatial organization of eukaryotic genome. The
4-th International Conference on Science and Applied Research «Post-Genome Methods of
Analysis in Biology and Laboratory and Clinical Medicine», Kazan, Russia, 29 october–1
november, 2014, abstract book, p.45.
Структура и объем работы
Диссертация изложена на 385 страницах, содержит 68 рисунков, 16 таблиц и
состоит из введения, 4-х глав, заключения и выводов. Список использованной литературы
включает 697 наименований.
Литерурный обзор (1-я глава) посвящен рассмотрению состояния исследований
структурно-функциональной
организации
хроматина,
коммуникации
удаленных
регуляторных элементов, функциональной компартментализации клеточного ядра,
взаимосвязи между этим процессом и пространственной организацией хромосом.
Подробно рассмотрены уровни упаковки эукариотической ДНК и сделан вывод, что в
настоящее время не построена приемлемая модель пространственной организации генома,
объясняющая весь комплекс экспериментальных данных. Рассмотрена стуктура 30-нм
фибриллы, которая, возможно, существует в клетках, а также модификации гистонов и
вариантные формы гистонов в контексте особенностей организации активного хроматина.
Рассмотрена также роль создания открытых областей, свободных от нуклеосом, на
регуляторных элементах ДНК и их природа. Обсуждены вопросы декомпактизации
хроматина и доступности ДНК. Из проведенного анализа доступных данных следует, что
многие базовые концепции и существующие в настоящее время гипотезы требуют
переосмысления. Проведен сравнительный анализ различных моделей коммуникации
удаленных регуляторных элементов генома. Показано, что в настоящее время
26
отсутствуют прямые доказательства существования активаторного хроматинового блока.
Проанализирован вопрос о природе пространственной близости регуляторных участков
ДНК, который может трансформироваться в вопрос о стабильности промоторэнхансерного взаимодействия в живой клетке. При анализе работ мы коснулись
рассмотрения движущих сил коммуникации регуляторных элементов генома в клеточном
ядре. Хотя механизмы коммуникации регуляторных элементов в геноме до сих пор не
ясны, существует несколько моделей этого процесса. Подробно анализируются вопросы,
связанные с компартментализацией клеточного ядра, в том числе приводится описание
наиболее
важных
ядерных
компартментов.
Представлен
подробный
анализ
существующих методов исследования пространственной организации генома, их
возможностей и ограничений применения.
Таким образом, обзор литературы, с одной стороны, свидетельствует о степени
изученности пространственной организации хромосом и большом интересе ученых к этой
проблеме, а с другой стороны – говорит о сложности и неоднозначности интерпретации
получаемых экпериментальных данных, неточности некоторых моделей организации и
функционирования клеточных структур. Ядерная организация в целом, равно как и
совокупность контактов многих геномных элементов крайне динамичны и стохастичны по
своей природе: хромосомы могут принимать множество альтернативных конфигураций,
ядерные компартменты собираются и разбираются, а баланс между этими процессами
контролируется многими факторами. Мы видим, что изучение пространственной
организации генома – не простая задача. Порядок в клеточном ядре, в некоторой степени,
иллюзорен и складывается из случайных событий, базируясь на непрерывном выборе
между различными возможностями, которые позволяют геному быстро приспосабливать
свою работу к меняющимся условиям среды.
27
Следовательно, требуется очень сложная и кропотливая работа по выбору и
доработке, а порою, и созданию новых методов исследования, пересмотру устоявшихся
представлений, подтверждению одних и опровержению или доработке других схем,
моделей, гипотез, о чем свидетельствует подробное рассмотрение доступной литературы.
Материалам и методам исследования посвящена 2-я глава настоящей диссертации.
Описана работа с клеточным материалом, с ДНК и РНК. Рассмотрены полимеразная
цепная реакция в реальном времени и метод клонирования. Отдельные разделы
посвящены 3С-, М3С-, INGRID- и 4C- анализам. Описано проведение процедуры
иммунопреципитации хроматина. Рассмотрены методы ChIP-seq, иммуноцитохимии,
флуоресцентной гибридизации in situ, электронной микроскопии, иммуноблотинга белков.
Большое внимание уделено программному обеспечению исследования и статистической
обработке результатов экспериментов.
Глава 3 «Результаты» посвящена подробному изложению проделанной работы по
изучению структуры индивидуальных активаторных хроматиновых блоков, механизмов
контактов удаленных регуляторных элементов генома, механизмов поддержания его
трехмерной организации. С использованием техники количественного 3С-анализа нами
изучена пространственная организация домена бета-глобиновых генов кур (как модели) в
циркулирующих клетках крови куриных эмбрионов на стадиях до и после переключения
программы экспрессии генов с эмбрионального на взрослый тип. Полученные данные
позволили построить соответствующие модели и проследить за изменениями в
пространственной
организации
генома,
напрямую
связанными
с
активацией
и
переключением транскрипции глобиновых генов. Получен также ответ на вопрос о том,
контролируется ли экспрессия гена ТМЕМ8 известными регуляторными элементами
домена альфа-глобиновых генов. Проведенные эксперименты позволили предположить,
что альфа-глобиновый локус может принимать две альтернативные хроматиновые
28
конфигурации, при которых регуляторные элементы должны курсировать между
различными хроматиновыми блоками.
С учетом результатов экспериментов по анализу пространственной кофигурации
домена бета-глобиновых генов мыши переосмыслена процедура 3С-метода: показано, что
стадия лигирования осуществляется в ядре, а не растворе, как предполагалось ранее.
Изучено распределение ДНК и гистонов между растворимой и нерастворимой фракциями
3С-материала при обработке фиксированных ядер SDS и эндонуклеазами рестрикции.
Установлено,
что
предпочтительное
лигирование
фрагментов
генома,
возможно
организованных в единый активаторный комплекс, происходит в нерастворимой фракции
3С-материала, которая представлена нелизированными ядрами, а разрушение остаточных
ядер уменьшает 3С-сигналы. Проведены измерения абсолютного выхода и частот
лигирования в процедуре 3С. Осуществлен количественный анализ взаимодействия
удаленных элементов генома с применением метода молекулярных колоний (метод
INGRID). Оценено влияние формальдегидной фиксации на способность амплифицировать
ДНК. Разработан способ получения гомогенной фракции эритроидных клеток для
INGRID-анализа. Проведен анализ частоты взаимодействия фрагментов домена бетаглобиновых генов, солюбилизированных из фиксированных эритроидных клеток мыши.
Отдельная серия экспериментов была посвящена изучению роли ядерного матрикса
в поддержании контактов удаленных элементов генома, для чего нами был разработан
М3С-метод. С его помощью проведен анализ взаимодействий геномных элементов в
окрестностях домена альфа-глобиновых генов.
Изучены механизмы поддержания трехмерной организации генома, для этого
проведен полногеномный анализ пространственных взаимодействий CpG-островков,
содержащих промоторы генов домашнего хозяйства, предусматривающий использование
4С-метода. Сделан вывод о том, что пространственная кластеризация CpG-островков
29
может быть необходима как для транскрипции, так и для репликации ДНК. Изучена
пространственная сегрегация активных и неактивных участков генома, проанализировано
распределение 4С-сигнала в окрестностях CpG-островков и промоторов и сделано
заключение,
что
кластеризация
CpG-островков
является
важным
фактором,
определяющим пространственную организацию интерфазных хромосом.
Четвертая глава посвящена обсуждению результатов исследования. В первую
очередь, на основе полученных результатов обсуждена пространственная организация
домена бета-глобиновых генов в эритроидных клетках (на примере генов кур) на разных
стадиях развития. Сделан вывод о том, что домен бета-глобиновых генов испытывает
некоторое давление со стороны всей хромосомной территории, которая постепенно
принимает более компактную конфигурацию в ходе созревания эритроидных клеток.
Отмечено, что этот домен остается активным и обладает некоторыми свойствами
активных
хроматиновых
доменов,
в
том
числе
обладает
предпочтительной
чувствительностью к ДНКазе I, даже в компактных ядрах зрелых эритроцитов. Ключевую
роль здесь, возможно, играет пространственная изоляция домена от окружающего
хроматина
посредством
формирования отдельной
хроматиновой
петли
за
счет
взаимодействия концевых инсуляторов домена. Рассмотрена возможность регуляции
транскрипции
альфа-глобиновых
генов
и
гена
ТМЕМ8
посредством
сборки
альтернативных активаторных хроматиновых блоков.
Экспериментальные данные по анализу пространственной организации домена
бета-глобиновых генов мыши послужили основой для пересмотра ключевых этапов
техники фиксации конформации хромосомы и позволили предложить новую модель
позиционирования геномных элементов в ядре клеток эукариот. Мы полагаем, что в
фиксированных формальдегидом ядрах взаимные позиции регуляторных элементов,
расположенных вблизи друг от друга, сохраняются за счет сшивок между хроматиновыми
30
фибриллами независимо от природы негистоновых белков, которые непосредственно
взаимодействуют с этими регуляторными элементами.
Вывод, что взаимодействия между энхансерами и промоторами в геноме эукариот
носят динамичный, а не статичный характер, косвенно подтверждается результатами
анализа абсолютных частот лигирования в процедуре 3С-метода. Сравнение полученных
нами результатов с литературными данными указывает на необходимость постановки
различных контрольных экспериментов при проведении 3С-анализа и недопустимость
поспешных выводов.
Проведенные исследования домена бета-глобиновых генов с использованием
выбранных нами методов позволили уточнить механизмы, обеспечивающие сближение
регуляторных элементов генома. Результаты наших исследований свидетельствуют о том,
что сближение промоторов и энхансеров регулируется скорее способом макроупаковки
хроматиновой фибриллы (модель активаторного хроматинового компартмента), нежели
организацией
регуляторных
элементов
в
единый
ДНК-белковый
комплекс,
сформированный за счет взаимодействия между белками, связанными с этими
регуляторными элементами (модель активаторного хроматинового блока). Наиболее
важные результаты, подтверждающие данную точку зрения, получены посредством
INGRID-анализа.
Этот
разработанный
нами
метод,
возможно,
станет
важным
инструментом для изучения трехмерной структуры генома.
Показано, что ядерный матрикс может выступать платформой для взаимодействия
удаленных регуляторных элементов генома.
На основании анализа результатов
проведенных нами экспериментов предложена модель связанной с ядерным матриксом
транскрипционной фабрики в эритроидных клетках. Подробно обсуждена роль
кластеризации CpG-островков, ассоциированных с промоторами генов домашнего
хозяйства, в пространственной организации интерфазных хромосом. Показано, что
31
пространственное взаимодействие CpG-островков, возможно, служит движущей силой
пространственной сегрегации активных участков генома.
В заключении дана общая характеристика работы и сформулированы основные
выводы по результатам исследования.
32
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
I.1
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ХРОМАТИНА
I.1.1 УРОВНИ УПАКОВКИ ЭУКАРИОТИЧЕСКОЙ ДНК
В эукариотических клетках очень длинная молекула ДНК (общая длина ДНК гаплоидного
набора хромосом человека составляет около 2 м) упакована в сравнительно небольшом
объеме клеточного ядра, типично имеющего диаметр около 10 мкм. Несмотря на высокую
степень компактизации, ДНК остается доступной для транскрипции и других процессов,
связанных с реализацией генетических функций ДНК. Механизмы упаковки ДНК в
хроматине служат
предметом интенсивного изучения вот уже более 40 лет.
Общепризнанным является представление о том, что упаковка ДНК осуществляется на
нескольких иерархических уровнях, первым из которых является наматывание ДНК на
октамеры гистонов с образованием нуклеосом (Getzenberg et al., 1991). Предполагается,
что нуклеосомная цепь (10-нм хроматиновая фибрилла) сворачивается далее в так
называемую 30-нм фибриллу, которая, в свою очередь, образует петли или ряд
иерархически скрученных структур. Из всех этих структур лишь нуклеосомная частица
детально охарактеризована (включая рентгеноструктурный анализ гистонового октамера и
октамера с намотанной ДНК (Davey et al., 2002; Kornberg, 1974)). Структура 30-нм
фибриллы в настоящее время не только остается неясной (Grigoryev and Woodcock, 2012),
но и само существование этой фибриллы в живых клетках исследованиями некоторых
авторов (Fussner et al., 2012; Gan et al., 2013; Lieberman-Aiden et al., 2009) поставлено под
вопрос.
Что
же
касается
высших
уровней
упаковки
хроматина,
имеющиеся
экспериментальные данные настолько противоречивы, что не позволяют предложить
сколько-нибудь разумную картину макроукладки хроматиновой фибриллы (Maeshima and
33
Eltsov, 2008; Sajan and Hawkins, 2012). Принципиальная сложность заключалась долгое
время в отсутствии экспериментальных подходов, позволяющих проследить путь укладки
ДНК в интактном клеточном ядре. В связи с этим, существующие модели наднуклеосомной
организации
хроматина,
в
большинстве
своем,
базируются
на
наблюдениях, сделанных при анализе укладки хроматиновой фибриллы (в частности,
искусственно реконструированной) in vitro (Blacketer et al., 2010; Ghirlando and Felsenfeld,
2013; Grigoryev et al., 2009; Grigoryev and Woodcock, 2012; Robinson et al., 2006; Schalch et
al., 2005). Хотя подобные эксперименты предоставляют информацию о межнуклеосомных
взаимодействиях и общих механизмах укладки хроматиновой фибриллы, остается не
ясным, насколько верно они моделируют пути укладки хроматиновых фибрилл in vivo.
Одним из аспектов, который обычно не учитывается, является динамика нуклеосом и
хроматиновой фибриллы. В случае рентгеноструктурного анализа уже сам метод
исследования модифицирует объект исследования. Действительно, кристаллизации
поддаются только статичные объекты. В связи с этим в методике применяются
специфические
(зачастую
далекие
от
природных)
условия,
стабилизирующие
определенную конфигурацию нуклеосомной частицы или фрагмента хроматиновой
фибриллы (см., например, работу Ричмонда и коллег (Schalch et al., 2005)). В то же время
понятно, что существование множества других конфигураций, возможно, ускользает от
внимания исследователей.
I.1.2 30-НМ ФИБРИЛЛА
Впервые 30-нм фибрилла была обнаружена при исследовании под электронным
микроскопом фрагментов хроматина, выделенных из ядер (Finch and Klug, 1976; McGhee
et al., 1980; Tremethick, 2007). На основании результатов рентгеноструктурного анализа
было предположено, что 30-нм фибрилла формируется в результате сворачивания
34
нуклеосомной цепи в цилиндрическую структуру (соленоид), в которой нуклеосомы
уложены по спирали вокруг центральной полости с периодом примерно 6 нуклеосом на
виток. В такой структуре каждая нуклеосома в фибрилле взаимодействует с пятой и
шестой нуклеосомами по ходу цепи (Finch and Klug, 1976). Последующие электронномикроскопические исследования хроматина, замороженного сразу же после выделения из
ядер, продемонстрировали, что в 30-нм фибрилле нуклеосомы уложены не линейно по
спиральной траектории, а петляют вперед-назад, образуя зигзаг, в котором первая
нуклеосома связана с третьей, вторая – с четвертой и т.д. (Bednar et al., 1995; Dorigo et al.,
2004; Woodcock et al., 1984). Было предположено, что соленоид представляет собой
наиболее термодинамически устойчивую структуру, а другие типы над-нуклеосомных
структур легко конвертируются в соленоид в случае, если эта конверсия не блокируется
замораживанием. Изучение результатов кристаллизации фрагментов ДНК, несущих 4
нуклеосомы, представило дополнительные доказательства в пользу модели «зигзага»
организации 30-нм фибриллы (Schalch et al., 2005). Однако тетрамер был реконструирован
без линкерного гистона H1, и длина нуклеосомного повтора ДНК составляла только 167
п.н.
(в
отличие
от
200-нуклеотидного
повтора,
типичного
для
большинства
эукариотических организмов) (Schalch et al., 2005). Таким образом, значимость
полученных результатов для теоретической биологии остается неясной. В то же время,
некоторые выводы, следующие из анализа кристаллизованных тетра-нуклеосомных
фрагментов, представляются весьма важными. В частности, в указанной работе было
показано, что фибрилла стабилизируется взаимодействием положительно заряженного Nконцевого домена гистона H4 c кислотным «пэтч-доменом» гистоновой глобулы соседней
нуклеосомы (Schalch et al., 2005). Этот кислотный пэтч-домен образован несколькими
отрицательно заряженными аминокислотными остатками, присутствующими в гистонах
H2A и H2B. Вариантные формы гистонов H2A (H2A.Z, H2A.Bbd и macroH2A) имеют
35
аминокислотные замены в участке, ответственном за формирование пэтч-домена.
Присутствие этих замен хорошо коррелирует со стабильностью 30-нм фибриллы и
биологическими свойствами хроматиновых доменов, содержащих эти вариантные
гистоны (Fan et al., 2004; Zhou et al., 2007). Отметим также, что ацетилирование Nконцевого домена гистона H4 (в частности, по 16-му остатку лизина (Allahverdi et al.,
2011; Yang and Arya, 2011)) приводит к дестабилизации 30-нм фибриллы, что возможно
ожидать на основании анализа структуры кристаллизованного тетрамера нуклеосом.
Криоэлектронная микроскопия регулярных олигонуклеосомальных структур,
реконструированных
расположенными
in
vitro
участками
на
протяженных
фрагментах
ДНК
с
регулярно
позиционирования
нуклеосом,
продемонстрировала
зависимость параметров 30-нм фибриллы от длины спейсерного участка и наличия
линкерного гистона H1 (Arya and Schlick, 2006; Robinson et al., 2006). При коротких и
средних длинах нуклеосомного повтора, включая наиболее типичную для хроматина
многоклеточных организмов длину (200 п.н.), наблюдалось формирование структур типа
«зигзаг», тогда как повторы большей длины приводили к формированию соленоидоподобных структур (Robinson et al., 2006). Более важными представляются нам результаты
исследований, указывающие на то, что структура 30-нм фибриллы не является
однородной: участки с зигзаго-подобной организацией перемежаются участками,
проявляющими свойства соленоида (Grigoryev et al., 2009). Если 30-нм фибрилла
действительно существует в клетке, то, вероятнее всего, она представлена равновесием
различных конфигураций, которое должно модулироваться различными факторами, в
частности, связыванием линкерных гистонов и белков семейства HMG (high mobility
group), включением вариантных форм гистонов, модификациями N-концевых доменов
гистонов,
активностью
комплексов
ремоделирования
хроматина,
регулярностью
36
расположения нуклеосом и наличием свободных от нуклеосом участков, о которых речь
пойдет ниже (Depken and Schiessel, 2009; Perisic et al., 2010; Wong et al., 2007).
Особо отметим, что все наблюдения, касающиеся структуры 30-нм фибриллы,
были сделаны в экспериментах in vitro. Между тем, измерения контурной длины
молекулы ДНК в активных областях генома с использованием метода флуоресцентной
гибридизации in situ, FISH (fluorescence in situ hybridization), и более сложных
экспериментальных подходов указывают на то, что уровень компактизации ДНК в этих
областях намного выше уровня, который может быть достигнут упаковкой ДНК в 30-нм
фибриллу (Belmont et al., 2010; Hu et al., 2009; Lawrence and Singer, 1991; Lawrence et al.,
1990; Mahy et al., 2002a). Предполагается, что и в активных, и в репрессированных
областях генома хроматин упаковывается посредством боковой конденсации 10-нм
фибрилл с образованием компактной структуры, схожей с той, что обычно приводится в
учебных пособиях для иллюстрации возможного пути формирования гетерохроматина
(рис. 1). Показано, что ассоциация между фибриллами может стабилизироваться за счет
взаимодействия между нуклеосомами, принадлежащими разным фибриллам (Pepenella et
al., 2013). Это взаимодействие может быть либо прямым (например, взаимодействие Nконцевого домена гистона H4 с пэтч-доменом другой нуклеосомы), либо опосредованным
архитектурными белками, такими как HP1 (McBryant et al., 2006) (рис. 1). Можно
предположить возможность боковой конденсации как 10-нм, так и 30-нм фибрилл. До
Рис. 1. Схематическое представление возможного пути конденсации нескольких 10-нм фибрилл в
компактную гетерохроматин-подобную структуру. См. пояснения в тексте.
37
недавнего
времени
существовавшие
экспериментальные
подходы
не
позволяли
визуализировать ход цепи ДНК в ядре вследствие перекрывания множества хроматиновых
фибрилл при проекции на плоскость. Эта проблема была разрешена комбинацией техник
электронной и электронно-спектроскопической томографии. Единственной регулярной
структурой, которую удалось детектировать в ядрах эукариотических клеток с
использованием этой методики, оказалась 10-нм фибрилла. И эухроматиновые, и
гетерохроматиновые участки оказались построенными из плотно упакованных 10-нм
фибрилл, тогда как 30-нм фибрилл обнаружено не было (Fussner et al., 2012). Уровень
компактизации, характеризующийся числом нуклеосомных частиц на единицу объема,
был выше в гетерохроматиновых областях, но это, возможно, достигалось более плотной
упаковкой 10-нм фибрилл, нежели их сворачиванием в регулярные структуры высшего
порядка. В гетерохроматине, кроме того, наблюдался более выраженный изгиб отдельных
фибрилл (Fussner et al., 2012). Эксперименты по электронной криотомографии также
продемонстрировали отсутствие регулярности в упаковке нуклеосомных фибрилл. При
использовании этой техники интерфазный хроматин выявлялся как беспорядочное
скопление нуклеосом, которое наилучшим образом может быть описано моделью
расплавленного полимера (Gan et al., 2013). Согласно этой модели, 10-нм фибриллы
образуют
нерегулярные
динамические
структуры
за
счет
межнуклеосомных
взаимодействий удаленных участков цепи «in-trans». Было сделано предположение, что
такая укладка обеспечивает более пластичную упаковку хроматина по сравнению с 30-нм
фибриллой, благодаря которой облегчается осуществление функциональных процессов с
участием хроматиновой фибриллы (Eltsov et al., 2008; Joti et al., 2012; Maeshima et al.,
2010). На основании результатов HiC-анализа (биохимический метод, основанный на
принципе лигирования близкорасположенных фрагментов ДНК), Деккер и соавт. также
пришли к выводу, что как «открытый» (активный), так и «закрытый» (репрессированный)
38
хроматин построен из фибрилл одного типа (Lieberman-Aiden et al., 2009). Иерархической
укладки хроматиновых фибрилл в ядре обнаружено не было.
I.1.3 АКТИВНЫЙ ХРОМАТИН И ГИСТОНОВЫЙ КОД
Пионерские исследования Грудина и Вайнтрауба (Groudine and Weintraub, 1982),
подтвержденные в ряде последующих работ (Yaniv and Cereghini, 1986), показали, что
активно
транскрибируемые
гены
предпочтительно
расщепляются
нуклеазами
в
пермеабилизированных клетках. Предложенное объяснение такой предпочтительной
чувствительности к нуклеазам заключалось в том, что в активных участках хроматина
ДНК более доступна для транс-действующих белковых факторов (Yaniv and Cereghini,
1986). Повышение доступности может быть связано как с реорганизацией коровых
нуклеосомных частиц, позволяющей нуклеазам более эффективно атаковать ДНК,
намотанную на октамер гистонов, так и с изменением характера укладки хроматина, при
котором облегчается диффузия. Хотя нуклеосомные частицы, изолированные из активных
участков хроматина, обладают некоторыми специфическими характеристиками (BazettJones et al., 1996; Czarnota et al., 1997), общепризнанным всегда считалось, что именно
частичная декомпактизация хроматина (в частности, разворачивание 30-нм фибриллы
(Razin et al., 2007)) является основной причиной повышенной чувствительности активных
генов к нуклеазам. С учетом результатов текущих исследований, описанных выше,
подобная точка зрения представляется чрезмерно упрощенной. В то же время ясно, что
менее плотная упаковка хроматина в активных (эухроматиновых) областях хромосом –
твердо установленный факт, подтвержденный многими исследованиями, включая и те, в
которых было продемонстрировано отсутствие 30-нм фибрилл в интактных ядрах (Bian
and Belmont, 2012; Fussner et al., 2012). Также было установлено, что активные и
репрессированные
участки
генома
характеризуются
различными
профилями
39
модификаций гистонов. Со времени появления теории гистонового кода (Jenuwein and
Allis, 2001) роли тех или иных модификаций гистонов активно изучались и
пересматривались (Bannister and Kouzarides, 2011; Campos and Reinberg, 2009; Gardner et
al., 2011; Karch et al., 2013; Rando, 2012). Развитие методов полногеномного анализа,
включая метод иммунопреципитации хроматина ChIP (chromatin immunoprecipitation) c
последующим секвенированием, открыло возможность комплексного анализа профилей
распределения модификаций гистонов в разных организмах, на различных участках
генома и при различных условиях (например, при клеточной дифференцировке и
активации транскрипционной активности в ответ на действие гормонов) (Boyle and Furey,
2009; Ku et al., 2011; Yavartanoo and Choi, 2013). Теория гистонового кода постепенно
трансформировалась в теорию гистонового контекста (Gardner et al., 2011; Horikoshi, 2013;
Lee et al., 2010), когда было показано, что для предсказания позиций регуляторных
элементов генома и определения типа хроматиновых доменов необходимо учитывать
сразу несколько модификаций гистонов (Boros, 2012; Calo and Wysocka, 2013; Hon et al.,
2009b; Hwang et al., 2013; Murr, 2010; White, 2012). Модификации, ответственные за
активацию хроматиновых доменов, обсуждались, как правило, в терминах перехода
между 30-нм и 10-нм хроматиновыми фибриллами (Razin et al., 2007). Например, было
показано, что ацетилирование гистона H4 по позиции K16 препятствует взаимодействию
хвостового домена гистона с пэтч-доменом соседней нуклеосомной глобулы, что
приводит к дестабилизации 30-нм хроматиновой фибриллы (Allahverdi et al., 2011; Yang
and Arya, 2011). Замена гистона H2A на H2A.Bbd имела те же последствия в силу
уменьшения отрицательного заряда на пэтч-домене (Zhou et al., 2007). В свете новых
представлений об упаковке хроматина, ставящих под вопрос существование 30-нм
фибриллы, наличие подобных механизмов может вызывать сомнение. Однако, независимо
от того, существует 30-нм фибрилла или нет, модификации гистонов и включение их
40
вариантных форм представляются важными факторами, определяющими характер
макроупаковки хроматина в ядре. Так, например, в отсутствии межнуклеосомных
взаимодействий внутри фибриллы, ведущих к формированию 30-нм фибриллы, те же
механизмы могут стабилизировать межфибриллярные взаимодействия, необходимые для
поддержания хроматина в компактном состоянии (Pepenella et al., 2013), тогда как утрата
взаимодействия между соседними нуклеосомами будет приводить к локальной
декомпактизации хроматинового домена.
I.1.4
СОЗДАНИЕ
ОБЛАСТЕЙ,
СВОБОДНЫХ
ОТ
НУКЛЕОСОМ,
НА
РЕГУЛЯТОРНЫХ ЭЛЕМЕНТАХ ДНК
Несмотря на свою динамичность (Andrews and Luger, 2011), нуклеосомы в той или иной
мере препятствуют свободному доступу к ДНК различных белковых факторов. Для
связывания
большинства
общих
и
специфических
транскрипционных
факторов
необходимо локальное нарушение регулярности расположения нуклеосом на нити ДНК с
созданием областей, обедненных нуклеосомами или свободными от них – NDR
(nucleosome depleted regions) (Thurman et al., 2012; Wang et al., 2012). Эти области имеют
размер порядка нескольких сотен п.н. и могут быть картированы как области,
гиперчувствительные к ДНКазе I (Elgin, 1981; Felsenfeld et al., 1996; Gross and Garrard,
1988). Обычно в NDR располагаются различные регуляторные элементы генома (Boyle et
al., 2011; John et al., 2011; Kaplan et al., 2011; Li et al., 2011b; Pique-Regi et al., 2011). Можно
констатировать, что геном эукариот является, в сравнении с прокариотическим, как бы по
умолчанию, репрессированным, а регуляция транскрипции в значительной степени
связана с модуляцией доступности генома для транскрипционного аппарата (Schnitzler,
2008; Struhl, 1999).
41
Прежде
всего,
создание
открытых
областей
необходимо
для
сборки
преинициаторного комплекса на промоторах (Cairns, 2009); активные промоторы всегда
являются NDR (Mavrich et al., 2008; Thurman et al., 2012). В типичном для эукариот случае
освобождение
промоторов
от
нуклеосом
обеспечивается
работой
комплексов
ремоделирования хроматина, использующих энергию АТФ для своей активности (Clapier
and Cairns, 2009; Maier et al., 2008). Различные комплексы ремоделирования хроматина
могут осуществлять перемещение нуклеосомных коров вдоль молекулы ДНК, их удаление
с ДНК, замену канонических гистонов на вариантные и некоторые другие функции. В
создании и поддержании NDR главную роль играют комплексы ремоделирования
хроматина из семейств SWI/SNF и ISWI (Badis et al., 2008; Burd and Archer, 2013). У S.
cerevisiae деплеция комплекса RSC, принадлежащего семейству SWI/SNF, приводит к
частичному заполнению NDR нуклеосомами (Hartley and Madhani, 2009). Для первичного
привлечения комплексов ремоделирования хроматина к цис-регуляторным элементам и
создания NDR используются транскрипционные факторы, называемые факторамипервопроходцами (с англ. pioneering factors) (Sherwood et al., 2014; Struhl, 1985). В отличие
от большинства транскрипционных факторов, они способны узнавать свои сайты на ДНК,
связанной с нуклеосомами. Небольшой сайт для таких транскрипционных факторов
может находиться в линкерном участке между двумя позиционированными нуклеосомами
(Fascher et al., 1990; Yudkovsky et al., 1999). Для других факторов-первопроходцев
характерна способность конкурировать с нуклеосомами за связывание с ДНК (Sherwood et
al., 2014). Факторы-первопроходцы привлекают либо сами комплексы ремоделирования
хроматина, либо ферменты, вносящие посттрансляционные модификации гистонов,
которые, в свою очередь, привлекают комплексы ремоделирования хроматина. Первичное
ремоделирование промоторной области может приводить к открытию ДНК для
42
связывания других транскрипционных факторов, также способствующих поддержанию и
расширению NDR (Zaret and Carroll, 2011).
В конститутивных промоторах дрожжей, не содержащих TATA-бокса, реализуется
другая стратегия: положение нуклеосом во многом определяется последовательностью
ДНК (Cairns, 2009; Kaplan et al., 2009). Несмотря на то, что связывание нуклеосомного
кора с ДНК не является секвенс-специфичным, существуют последовательности, в
большей или меньшей степени склонные к взаимодействию с гистоновым октомером.
Вероятность посадки нуклеосомы на ту или иную последовательность ДНК во многом
определяется гибкостью фрагмента ДНК, т.е. способностью намотаться на нуклеосомную
глобулу. Одной из последовательностей, плохо связывающейся нуклеосомным кором,
является поли-(dA:dT)-тракт (Segal and Widom, 2009). Типичный конститутивный
промотор дрожжей содержит эту последовательность, заключенную между двумя
последовательностями, предпочтительно связывающими нуклеосомы (Lee et al., 2007;
Mavrich et al., 2008). NDR обычно содержит сайты для связывания транскрипционных
факторов, привлекающих к промотору белки, участвующие в инициации транскрипции
(Struhl, 1985).
Связь наличия NDR с обогащением областей хроматина определенными
гистоновыми модификациями на уровне полных геномов показана во многих
исследованиях (Gerstein et al., 2010; Ho et al., 2014; mod et al., 2010; Shen et al., 2012;
Thurman et al., 2012). Среди посттрансляционных модификаций гистонов, участвующих в
привлечении
комплексов
ремоделирования
хроматина,
важнейшую
роль
играет
ацетилирование остатков лизина в N-концевых доменах гистонов H3 и H4, высокий
уровень которого характерен для активных промоторов (Gerstein et al., 2010; Ho et al.,
2014; mod et al., 2010; Shen et al., 2012; Thurman et al., 2012). Нуклеосомы, содержащие
гистон Н3, ацетилированный по остаткам K9 и/или K27, привлекают комплексы
43
ремоделирования, содержащие бромодомен, узнающий эти модификации (Kasten et al.,
2004; VanDemark et al., 2007). Ацетилирование также увеличивает активность
привлеченных комплексов (Chatterjee et al., 2011; Ferreira et al., 2007). Многие
консервативные коактиваторные комплексы, в том числе SAGA, p300/CBP и TAF1,
проявляют гистонацетилтрансферазную активность (Koutelou et al., 2010; Sterner and
Berger, 2000; Strahl and Allis, 2000).
Наряду с высоким уровнем ацетилирования, важную роль в создании свободных от
нуклеосом участков на активных промоторах играет включение вариантных форм гистона
H2A.Z и H3.3 в окрестностях NDR (Albert et al., 2007; Ho et al., 2014). Показано, что
нуклеосомы, содержащие H2A.Z и H3.3, менее стабильны (Jin and Felsenfeld, 2007) и их
наличие облегчает поддержание NDR комплексами ремоделирования хроматина
(Henikoff, 2008). По последним данным, нестабильные нуклеосомы практически
постоянно присутствуют и внутри NDR, легко вытесняясь с ДНК теми или иными
белковыми факторами (Jin et al., 2009). У дрожжей замена димеров H2A-H2B на димеры
H2A.Z-H2B осуществляется комплексом Swr1, принадлежащим семейству SWI/SNF (у
многоклеточных организмов – его ортологами SRCAP и p400) (Mizuguchi et al., 2004; Ruhl
et al., 2006). Swr1 привлекается к ацетилированным нуклеосомам, а также просто к
свободной от нуклеосом ДНК благодаря своему сродству к ней (Ranjan et al., 2013).
Одной из самых характерных черт активных промоторов является обогащение
гистоном H3, триметилированным по 4-му остатку лизина (H3K4me3) (Gerstein et al.,
2010; Ho et al., 2014; mod et al., 2010; Shen et al., 2012; Thurman et al., 2012). Среди
множества возможных функций данной модификации – поддержание NDR (Vermeulen and
Timmers, 2010). Характерное расположение H3K4me3 в 5’-областях генов связывают с
механизмом
внесения
данной
модификации.
Гистонметилтрансфераза
Set1,
консервативная для всех эукариот и обеспечивающая триметилирование H3K4,
44
связывается
с
С-концевым
доменом
инициирующей
РНК-полимеразы,
фосфорилированным по позиции Ser5 (Ng et al., 2003; Shilatifard, 2012). По мере перехода
полимеразы к элонгации и изменения профиля посттрансляционных модификаций ее Сконцевого домена (фосфорилирование Ser2 вместо Ser5) происходит диссоциация Set1 и
снижение уровня метилирования H3K4 (Jeronimo et al., 2013; Rando and Ahmad, 2007).
Триметилирование H3K4 у позвоночных может осуществляться и по независимому от
транскрипции механизму. К промоторам генов домашнего хозяйства и мастеррегуляторов
дифференцировки
позвоночных,
лежащих
в
CpG-островках,
Set1
привлекается белком Cfp1 (оба они входят в состав комплекса COMPASS) за счет
способности Cfp1 узнавать неметилированные CpG-динуклеотиды (Lee and Skalnik, 2005;
Thomson et al., 2010). Многие комплексы ремоделирования хроматина (например, NURF
(Wysocka et al., 2006)) имеют в своем составе белки, взаимодействующие с H3K4me3. У
разных белков эту модификацию могут узнавать домены PHD, Chromo, Tudor, MBT и ZfCW (Taverna et al., 2007). Гистонацетилтрансферазы, входящие в состав комплексов
SAGA и NuA3, также могут привлекаться к промоторам через взаимодействия других
компонентов этих комплексов с H3K4me3 (Lee and Workman, 2007).
У высших эукариот, наряду с промоторами, NDR ассоциированы и с участками
связывания транскрипционных факторов в удаленных регуляторных элементах ДНК,
основными классами которых являются энхансеры и инсуляторы. Подавляющее
большинство областей, где в тех или иных типах клеток образуется NDR, у
многоклеточных организмов являются именно удаленными регуляторными элементами, а
не промоторами (Consortium, 2012; Shen et al., 2012; Thurman et al., 2012). Энхансеры
представляют собой последовательности длиной порядка нескольких сотен п.н.,
содержащие участки связывания для нескольких транскрипционных факторов, которые
обеспечивают специфическую активацию регулируемых энхансером генов (Maston et al.,
45
2006; Visel et al., 2009). Энхансеры могут располагаться на расстоянии десятков и сотен
т.п.н. от регулируемых промоторов (Shen et al., 2012; Thurman et al., 2012; Vavouri et al.,
2006). (В исключительных случаях это расстояние может превышать 1 млн п.н. (Lettice et
al., 2003)). Они могут находиться как выше, так и ниже своих промоторов-мишеней, как в
межгенных областях, так и в интронах (Kikuta et al., 2007; Sanyal et al., 2012).
Задокументированы также случаи расположения энхансеров в кодирующих областях
генов (Birnbaum et al., 2012).
В отличие от ассоциированных с промоторами NDR, NDR энхансеров намного
более тканеспецифичны (Heintzman et al., 2009; Shen et al., 2012; Thurman et al., 2012).
Считается, что создание NDR на энхансерах тесно связано с внесением характерной для
них хроматиновой модификации H3K4me1 (Ho et al., 2014; mod et al., 2010; Shen et al.,
2012;
Thurman
et
al.,
2012).
Факторы-первопроходцы
привлекают
гистонметилтрансферазы, создающие на энхансере область, обогащенную H3K4me1
(Heinz et al., 2010). H3K4me1, в свою очередь, привлекает комплекс ремоделирования
хроматина p400, осуществляющий включение в нуклеосомы вариантного гистона H2A.Z
(Calo and Wysocka, 2013; Svotelis et al., 2009). Нестабильность нуклеосом, содержащих
H2A.Z, приводит к формированию небольшого NDR на так называемых «подготовленных
энхансерах» (Creyghton et al., 2010; Heintzman et al., 2009; Rada-Iglesias et al., 2011).
Сигналы дифференцировки активируют подготовленные энхансеры, направляя к ним
дополнительные
тканеспецифические
транскрипционные
факторы
и
эффекторы
сигнальных путей, которые расширяют NDR за счет привлечения и активации комплексов
ремоделирования
хроматина
и
коактиваторных
комплексов,
обладающих
гистонацетилтрансферазной активностью, главным из которых является p300/CBP
(Heintzman et al., 2007; Visel et al., 2009). Основной мишенью p300/CBP является 27-ой
46
остаток лизина гистона H3, ацетилирование по которому принято считать характерной
меткой активных энхансеров (Creyghton et al., 2010; Heintzman et al., 2009).
Наряду
с
энхансерами,
внепромоторные
NDR
колокализуются
с
цис-
регуляторными элементами, называемыми инсуляторами. Принято считать, что эти
последовательности способны выполнять широкий спектр функций, главными из которых
являются: препятствие распространению репрессивных хроматиновых модификаций
(барьерная
активность)
и
блокирование
действия
энхансера
на
промоторы,
располагающиеся по другую сторону от инсулятора (энхансер-блокирующая активность)
(Phillips-Cremins and Corces, 2013; Schoborg and Labrador, 2014). Инсуляторы могут
проявлять как обе эти активности в тестах с репортерным трансгеном, так и
исключительно энхансер-блокирующую активность, за которую отвечают участки
связывания
особой
группы
белков,
называемых
инсуляторными.
Наиболее
консервативным инсуляторным белком является белок TFIIIC, являющийся также одним
из общих транскрипционных факторов, обеспечивающих посадку на ДНК РНК
полимеразы III (Kirkland et al., 2013; Van Bortle and Corces, 2012b). Инсуляторную
функцию у позвоночных выполняет также белок CTCF (Holwerda and de Laat, 2013; Ong
and Corces, 2014). У дрозофилы, кроме TFIIIC и гомолога CTCF позвоночных (dCTCF),
имеется целая группа белков, обеспечивающих энхансер-блокирующую активность
инсуляторов, а именно: Su(Hw), GAF, BEAF-32 и Zw5 (Gurudatta and Corces, 2009;
Kyrchanova and Georgiev, 2014).
Для NDR инсуляторов характерно обогащение модификацией H3K4me1 и
вариантным гистоном H2A.Z (Ernst and Kellis, 2010; Мod et al., 2010). По всей видимости,
механизм формирования и поддержания NDR на инсуляторах сходен с таковым на
энхансерах. Отметим, что инсуляторы позвоночных менее вариабельны, чем энхансеры,
их положение более или менее постоянно в разных клеточных типах (Shen et al., 2012).
47
Вероятно, это связано с тем, что основной инсуляторный белок позвоночных – CTCF –
присутствует во всех клеточных типах и, кроме того, является фактором-первопроходцем,
автономно связывающим свои сайты в хроматине независимо от того, свободны они от
нуклеосом или нет (Sherwood et al., 2014; Wendt et al., 2008).
Ряд инсуляторов и энхансеров демонстрируют связывание с РНК полимеразой II и
обогащение модификацией H3K4me3, что в функциональном смысле сближает их с
промоторами (De Santa et al., 2010; Hon et al., 2009a; Koch et al., 2011; Raab and Kamakaka,
2010). Проявление этих особенностей коррелирует с активацией энхансеров в
определенных клеточных типах (De Santa et al., 2010; Koch et al., 2011; Pekowska et al.,
2011). Более того, с таких энхансеров и инсуляторов могут транскрибироваться
нестабильные некодирующие РНК. Подчеркнем, что функциональное значение такой
транскрипции является предметом обсуждений (De Santa et al., 2010; Koch et al., 2011;
Natoli and Andrau, 2012).
I.1.5 ДЕКОМПАКТИЗАЦИЯ ХРОМАТИНА И ДОСТУПНОСТЬ ДНК
Многих исследователей интересует вопрос о том, является ли декомпактизация хроматина
необходимым условием для обеспечения доступа к ДНК различных ферментов и
транскрипционных факторов, ответственных за реализацию ДНК-зависимых процессов.
Ответ на него кажется очевидным. Действительно, известно, что активный хроматин
более чувствителен к расщеплению нуклеазами и упакован менее плотно. Напротив,
неактивный хроматин, который может быть найден на периферии ядра, около ядрышка и
в хромоцентрах, упакован более плотно (в частности, благодаря присутствию
архитектурных белков (см. рис. 1)). Однако до недавнего времени оставалось неясным, до
какой степени плотная упаковка нуклеосомной цепи препятствует доступу к ДНК белков
и регуляторных факторов. В своем недавнем исследовании Маешима и соавт. попытались
48
получить ответ на этот вопрос с использованием метода флуоресцентной корреляционной
спектроскопии (Hihara et al., 2012). Неожиданно было обнаружено, что достаточно
крупный объект (в исследовании использовался пентамер зеленого флуоресцентного
белка (EGFP), по размеру немного превосходящий нуклеосому) движется в цитоплазме,
интерфазном хроматине и метафазном хроматине с сопоставимыми скоростями, хотя
расчетная плотность нуклеосомных частиц в метафазном хроматине превосходит таковую
в интерфазном хроматине в 5-10 раз (Nozaki et al., 2013; Wachsmuth et al., 2008;
Weidemann et al., 2003). Компьютерное моделирование показало, что объект такого
размера должен был вовсе «завязнуть» в метафазном хроматине, если не допустить, что
нуклеосомы являются мобильными образованиями (т.е. могут совершать короткие
ненаправленные перемещения на расстояния до 10-20 нм в трехмерном пространстве
ядра). В экспериментах по визуализации единичных нуклеосом было обнаружено, что
нуклеосомы в живых клетках действительно мобильны. И в интерфазном, и в метафазном
хроматине флуктуации единичных нуклеосом составляют около 50 нм/мс (Hihara et al.,
2012). В литературе имеются и другие данные, свидетельствующие о схожей доступности
эухроматина и гетерохроматина для крупных белковых факторов. Например, геномы C.
elegans и S. cerevisiae более или менее равномерно доступны для Dam-метилирования,
независимо от степени гетерохроматизации тех или иных участков (Chen and Widom,
2005; Sha et al., 2010). Точно так же, искусственно экспрессированные транскрипционные
факторы не демонстрируют предпочтения в связывании своих участков узнавания в
эухроматине и гетерохроматине (Chen and Widom, 2005; Filion et al., 2010). Лишь
молекулярные
комплексы
массой
более
1
МДа
специфично
вытеснены
из
гетерохроматиновых участков, что следует из данных микроскопии (Gorisch et al., 2005;
Hihara et al., 2012; Pack et al., 2006; Verschure et al., 2003).
49
Все эти наблюдения открывают новую главу в изучении хроматиновых доменов.
Модификации
гистонов,
в
совокупности
именуемые гистоновым
кодом,
могут
контролировать локальную мобильность нуклеосом. При компьютерном моделировании
нуклеосомы и пентамер EGFP рассматривались как твердые сферы. В действительности,
все клеточные компоненты, включая нуклеосомы (Miyagi et al., 2011), являются
достаточно пластичными образованиями, т.е. могут изменять свою форму в некоторых
пределах, что может дополнительно увеличивать мобильность различных объектов в ядре.
I.1.6 ХРОМАТИНОВЫЕ ДОМЕНЫ В ТРЕХМЕРНОМ ПРОСТРАНСТВЕ ЯДРА
При привлечении новых данных многие базовые концепции в области изучения
хроматина и эпигенетики нуждаются в переосмыслении. Хотя хорошо известные факты
(такие как связь между ацетилированием гистонов и активацией хроматина) так и
остаются фактами, их интерпретация в терминах конкретных молекулярных событий,
происходящих в клеточном ядре, должны быть пересмотрены, исходя из новых взглядов
на укладку интерфазного хроматина. Здесь нет необходимости в пересмотре базовых
принципов распространения сигналов (активирующих или репрессирующих) в хроматине
посредством модификации гистонов на соседних нуклеосомах и привлечения «ферментовмодификаторов» на вновь модифицированные нуклеосомы (рис. 2А). Однако в массе
плотно контактирующих хроматиновых фибрилл активирующий/репрессирующий сигнал
в трехмерном пространстве ядра будет распространяться во всех направлениях, поскольку
нуклеосомы с различных фибрилл будут располагаться вблизи от центра нуклеации
(рис.2Б). В такой ситуации не вполне ясно, каким образом распространение сигнала
ограничивается
определенной
областью
генома.
Неограниченной
экспансии
хроматиновых доменов, возможно, препятствует организация хромосом в топологическиасоциированные домены ТАД (topologically associating domain, TAD) (см. раздел 1.3.2.1)
50
Рис. 2. Механизмы распространения сигналов в хроматине (на примере распространения волны
ацетилирования гистонов): (А) Классическое представление о линейном распределении сигнала в оба
направления вдоль хроматиновой фиблиллы. (Б) Распределение сигнала в трехмерном пространстве во всех
направлениях от центра нуклеации, приводящее к модификации множества участков хроматина,
расположенных как «in cis», так и «in trans».
или более мелкие глобулярные субъединицы (Gibcus and Dekker, 2013). В классической
молекулярной биологии расстояния измерялись в тысячах пар нуклеотидов, а не в
микрометрах или нанометрах. Такие принципы измерения используются, в частности, при
картировании хроматиновых модификаций (см., например, проект ENCODE). Признание
важности взаимодействия удаленных элементов ДНК, расположенных на одной или
разных хромосомах, сделало современную геномику «трехмерной» (Gavallli, 2014, Hakim
et al., 2010, Schoenfelder et al., 2010a), поэтому исследования в области изучения
хроматина будут расширяться и далее. Хроматиновые домены не обязательно являются
непрерывными.
Они
могут
представлять
собой
мозаику
геномных
участков,
объединившихся в трехмерном пространстве ядра. Результаты HiC-анализа поддерживают
идею о пространственной сегрегации активных и неактивных участков генома (LiebermanAiden et al., 2009).
51
Раскрытие механизмов, контролирующих сборку «объемных» хроматиновых
доменов, которые включают сегменты различных областей генома, составляет важную
задачу будущих исследований. С решением этой задачи станет возможным пересмотреть
существующие представления о распределении модификаций гистонов и лучше понять
принципы функционирования гистонового кода. Современный прогресс в развитии
методов микроскопии высокого разрешения, позволяющих непосредственно наблюдать за
живыми клетками, обещает новые открытия в этой области.
I.2
КОММУНИКАЦИЯ УДАЛЕННЫХ РЕГУЛЯТОРНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ
ГЕНОМА
I.2.1 СБЛИЖЕНИЕ
ПРОМОТОРОВ
И
ЭНХАНСЕРОВ:
АКТИВАТОРНЫЙ
ХРОМАТИНОВЫЙ БЛОК И ЭКСПРЕССИОННЫЙ ЦЕНТР
В соответствии с современной парадигмой, расположение промоторов и энхансеров в
ядре в пространственной близости является необходимым условием активации
транскрипции соответствующих генов в клетках нужного типа и на нужной стадии
развития (Gorkin
et
al.,
2014).
Однако
сущность
общеиспользуемого
термина
«пространственная близость» (равно как и терминов «контакты удаленных элементов
генома», «дальние взаимодействия в хроматине» и т.п.) остается пока не ясной. В
исследованиях, проведенных за последние 15 лет, накоплено большое количество
экспериментальных данных, свидетельствующих о том, что значительные геномные
расстояния между промоторами и выше- или нижележащими регуляторными элементами
компенсируется за счет сближения этих элементов в ядерном пространстве путем
выпетливания расположенных между ними фрагментов хроматиновой фибриллы.
Пространственную близость удаленных элементов генома можно регистрировать с
52
использованием методов фиксации конформации хромосомы (chromosome conformation
capture, 3С) (de Wit and de Laat, 2012) или многоцветной флуоресцентной in situ
гибридизации (FISH) (Amano et al., 2009). Наиболее популярная структурная модель
постулирует, что регуляторные элементы ДНК и подконтрольные промоторы образуют
общий ДНК-белковый комплекс – активаторный хроматиновый блок, или хаб, как его
именуют в англоязычной литературе (de Laat and Grosveld, 2003), – стабилизируемый
прямым контактом между транскрипционными факторами, компонентами комплекса
Mediator (Kagey et al., 2010) и особыми «коммуникационными белками», связанными с
промотором и энхансером (Maksimenko and Georgiev, 2014) (рис. 3). Отметим, что в
настоящее
время
отсутствуют
прямые
доказательства
существования
подобных
комплексов, однако некоторые экспериментальные данные косвенно поддерживают
модель активаторного хроматинового блока. Так, ранние электронно-микроскопические
исследования реконструированных in vitro комплексов общего транскрипционного
фактора Sp1 c ДНК указывают на то, что этот транскрипционный фактор, связывающийся
и с промоторами, и с энхансерами, может организовывать ДНК в петли и связывать две
отдельные молекулы ДНК друг с другом посредством собственной олигомеризации при
сохранении контакта с ДНК (Li et al., 1991; Su et al., 1991). Похожие наблюдения были
Рис. 3. Классическая модель промотор-энхансерной коммуникации. Энхансер (E) и промотор (P)
организованы в общий ДНК-белковый комплекс, стабилизированный прямым взаимодействием между
транскрипционными факторами и «коммуникаторными белками», связанными с геномными элементами
(фигуры в центре).
53
сделаны и для инсуляторного белка GAGA (GAF) дрозофилы (Mahmoudi et al., 2002).
GAF, связанный с одиночными молекулами ДНК, способен объединять их в общий ДНКбелковый комплекс путем мультимеризации, которая опосредуется POZ-доменом белка.
Схожим образом лимфоцито-специфичный OCA-B-зависимый энхансер, включенный в
состав
плазмиды,
способен
активировать
подконтрольный
промотор
гена
Igh,
расположенный на другой плазмиде, посредством прямого контакта между энхансерсвязанным активатором OCA-B и промотор-связанным транскрипционным фактором
TFII-I (Ren et al., 2011). Мутации в участках связывания белка OCA-B подавляют этот
эффект. Примечательно, что транскрипционный активатор OCA-B и гистондеацетилаза
HDAC3, которая участвует в эпигенетическом сайленсинге промотора Igh, конкурируют
за связывание с TFII-I. С учетом этих данных, возможно предположить, каким образом
выпетливание ДНК между энхансером
и
промотором обеспечивает
активацию
транскрипции: расположение OCA-B-зависимого энхансера вблизи промотора гена Igh
создает повышенную концентрацию фактора OCA-B в области промотора, что приводит к
вытеснению HDAC3 и дерепрессии гена.
Важность прямого контакта между белками, связанными с промотором и
энхансером,
в
установлении
промотор-энхансерной
коммуникации
была
продемонстрирована и на модели домена бета-глобиновых генов человека. В данном
случае
эритроидспецифичный
транскрипционный
фактор
GATA-1
опосредует
выпетливание ДНК между областью контроля локуса (LCR, c англ. locus control region),
главного регуляторного элемента домена, и промотором взрослого бета-глобинового гена
(Vakoc et al., 2005). GATA-1 связывается с промотором и LCR и инициирует сборку
белковых комплексов, включающих Ldb1. Этот кофактор формирует олигомеры, и его
«нокдаун» нарушает пространственное взаимодействие между LCR и промотором бетаглобинового гена (Song et al., 2007). В своем недавнем исследовании Денг и соавт.
54
показали, что искусственное закрепление олигомеризационного домена белка Ldb1 на
бета-глобиновом
промоторе
с
использованием
ДНК-связывающего
модуля
типа
«цинковые пальцы» восстанавливает петлю ДНК между LCR и промотором в
эритроидных клетках, в которых отсутствует GATA-1 (Deng et al., 2012). Более того,
искусственное привлечение Ldb1 на расположенный по соседству неактивный ген
эмбрионального
бета-глобина
приводит
к
«переброске»
петли
хроматина
на
эмбриональный ген и его активации, тогда как уровень транскрипции взрослого бетаглобинового гена падает (Deng et al., 2014). Таким образом, ясно, что Ldb1 играет роль
коммуникаторного белка в бета-глобиновом локусе.
Согласно другой модели, именуемой моделью экспрессионного центра, или
«экспрессионного хаба» (Kosak and Groudine, 2004), энхансеры и контролируемые ими
промоторы сосредотачиваются относительно близко друг от друга в пределах одного
ядерного компартмента (Bickmore, 2013). Такое расположение может способствовать
поддержанию
локально
высокой
концентрации
транскрипционных
факторов
и
комплексов ремоделирования хроматина в окрестностях промоторов и энхансеров и
установлению множественных контактов между ними, приводящих к альтернативной
активации различных промоторов, как это наблюдается в локусе бета-глобиновых генов
человека (Wijgerde et al., 1995). Экспрессионный центр, таким образом, может быть
рассмотрен как относительно небольшой ядерный компартмент, который формируется и
сохраняет свою целостность благодаря специфической укладке достаточно протяженного
участка хроматиновой фибриллы, включающего весь комплекс взаимодействующих
энхансеров
и
промоторов.
Из
описания
модели
возможно
предсказание,
что
формирование экспрессионного центра должно сопровождаться реконфигурацией
обширного хроматинового домена. Это действительно наблюдается в локусе альфаглобиновых генов человека: в клетках линии K562, экспрессирующих альфа-глобиновые
55
гены, сегмент 16-ой хромосомы протяженностью 500 т.п.н., включающий кластер альфаглобиновых генов и вышележащие регуляторные элементы, упакован менее плотно, чем в
неэритроидных клетках, где данный участок генома организован в компактную глобулу
(Bau et al., 2011). Напротив, локус бета-глобиновых генов мыши, будучи в неактивном
состоянии, может принимать несколько различных конфигураций, а при активации в ходе
эритроидной дифференцировки преобразуется в более компактную и округлую структуру,
имеющую меньшие размеры и объем, о чем свидетельствуют данные микроскопии
сверхвысокого разрешения (van de Corput et al., 2012). Схожим образом в кластере генов
HoxA установление пространственных контактов между генами и
удаленными
регуляторными элементами в зачатках конечностей мыши коррелирует со значительной
реорганизацией внутренней структуры двух топологически-ассоциированных доменов,
включающих 5’-HoxA гены и энхансеры (Berlivet et al., 2013). Все эти данные
подтверждают
гипотезу
осуществляется
в
о
том,
пределах
что
активных
коммуникация
промоторов
хроматиновых
и
энхансеров
компартментов,
которые
формируются путем реконфигурации протяженных участков генома.
В
действительности,
модели
активаторного
хроматинового
блока
и
экспрессионного центра не являются взаимоисключающими. Крупномасштабная упаковка
хроматиновой фибриллы может облегчать формирование стабильных и долгоживущих
контактов между энхансерами и промоторами или временных и короткоживущих
контактов.
При
(олигомеризации)
учете
данных,
демонстрирующих
транскрипционных
факторов
важность
для
взаимодействия
промотор-энхансерной
коммуникации, вопрос о природе «пространственной близости» регуляторных участков
ДНК трансформируется в вопрос о стабильности этих взаимодействий.
56
I.2.2 СТАБИЛЬНОСТЬ ПРОМОТОР-ЭНХАНСЕРНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ:
ДИНАМИЧЕСКИЙ КОНТАКТ ИЛИ ПРОЧНЫЙ КОМПЛЕКС?
В 1995 году Фразер и соавт. предприняли первые попытки количественного анализа
динамики промотор-энхансерной коммуникации в живой клетке (Wijgerde et al., 1995).
Они применили технику РНК-FISH для регистрации новосинтезированных транскриптов
гамма- и бета-глобиновых генов человека в трансгенных эритроидных клетках мыши. С
использованием домена глобиновых генов, как природной модели активации нескольких
промоторов общим энхансером (LCR), авторы сделали два важных заключения: (1) в
клетках, одновременно экспрессирующих гамма- и бета-глобиновые гены, LCR способен
активировать только один промотор в данный момент времени (взаимодействие между
LCR и промоторами динамично) (рис. 4А); (2) комплекс LCR и промотора достаточно
стабильный и имеет среднее время жизни 15-80 минут. Авторы предположили, что в
таком долгоживущем «комплексе» составляющие элементы на самом деле быстро и
циклично ассоциируют и диссоциируют, а не образуют один устойчивый блок (рис. 4Б).
Однако эта гипотеза сталкивается с некоторыми сложностями. Если комплекс LCR и бетаглобинового промотора легко диссоциирует и гамма-промотор в равной мере способен ко
Рис. 4. Взаимодействия в домене бета-глобиновых генов: (А) Модель стохастического взаимодействия
области контроля локуса (LCR) с различными бета-глобиновыми генами в трансгенных эритроидных
клетках мыши. (Б,В) Природа взаимодействия LCR c бета-глобиновыми генами. (Б) Элементы
осуществляют осциллирующие движения в небольшом объеме ядерного пространства и время от времени
устанавливают короткоживущие контакты. (В) Элементы устанавливают прочный долгоживущий контакт.
57
взаимодействию с LCR, то почему LCR не осциллирует между двумя промоторами, а
остается вблизи лишь с одним в течение достаточно долгого времени? Наличие неких
гипотетических
архитектурных
элементов
ДНК,
локализованных
поблизости
с
промоторами и LCR, могло бы облегчать позиционирование LCR в пространственной
близости с тем или иным промотором, однако о существовании таких элементов в домене
бета-глобиновых генов сведений нет. Таким образом, изложенные выше данные, на
первый взгляд, должны означать, что, вступив в контакт, LCR и промотор формируют
прочный долгоживущий комплекс, целостность которого могла бы поддерживаться
олигомеризацией фактора Ldb1 (рассмотрено в предыдущем разделе) (рис. 4В). Однако
биохимический анализ in vitro продемонстрировал, что молекулы Ldb1 достаточно слабо
взаимодействуют друг с другом: при концентрации белка около 10 мкМ только 50%
молекул было организовано в тримеры. Значительное повышение концентрации белка (до
200 мкМ) сдвигало равновесие в сторону формирования тримеров и олигомеров более
высокого порядка; при такой концентрации в комплексе оказывается более 95% молекул
белка (Cross et al., 2010). Здесь очевиден вопрос: какова концентрация Ldb1 в клеточном
ядре? К сожалению, прямые измерения не проводились, однако можно сделать
приблизительную оценку. Тканеспецифичные транскрипционные факторы эукариот
обычно присутствуют в количестве 103-105 молекул на клетку (Biggin, 2011). Объем ядра
эритроидной клетки человека составляет примерно 750 мкм3 (Hancock and Hadj-Sahraoui,
2009), и Ldb1 более или менее гомогенно распределен по ядру (Visvader et al., 1997).
Исходя из этих данных можно подсчитать, что средняя концентрация Ldb1 в ядре
составляет 10-2-10-1 мкМ. Таким образом, для того чтобы обеспечить формирование
стабильного комплекса LCR и промотора, поддерживаемого олигомеризацией Ldb1,
локальная концентрация Ldb1 в бета-глобиновом микрокомпартменте ядра должна быть
повышена на два-четыре порядка по сравнению со средней концентрацией в ядре.
58
Общепризнанным считается то, что промоторы и энхансеры способны к созданию
повышенной локальной концентрации транскрипционных факторов (Palstra and Grosveld,
2012), однако количественных оценок этого эффекта в живых клетках сделано не было, и
следовательно, не ясно, до какой степени локальная концентрация хроматинсвязывающих белков может быть повышена вблизи с их сайтами-мишенями. Необходимо,
впрочем,
отметить,
что
относительно
нестабильные
специфические
комплексы,
формируемые за счет олигомеризации Ldb1, могут стабилизироваться под воздействием
сил, возникающих в условиях макромолекулярного скопления (будет рассмотрено в
следующих разделах).
Подводя итог,
подчеркнем,
что взаимодействие LCR с
промоторами гамма- и бета-глобиновых генов является попеременным и динамичным, но
вопрос относительно устойчивости LCR-промоторных комплексов остается открытым.
Динамичные контакты между LCR и промоторами глобиновых генов реализуются
в пределах довольно небольшого геномного домена на расстояниях в несколько десятков
т.п.н., однако в других участках генома коммуникация между промоторами и энхансерами
может осуществляться на гораздо бóльших расстояниях. Так, в зачатках передних
конечностей мыши экспрессия гена Shh (sonic hedgehog), белковый продукт которого
играет важную роль в регуляции развития, контролируется энхансером MFCS1 (mammal
fish conserved sequence 1), локализованным 1 млн п.н. выше промотора Shh. Было
обнаружено, что FISH-сигналы от промотора Shh и MFCS1 колокализуются в 48% клеток,
несущих пре-мРНК гена Shh, что говорит о том, что в любой момент времени энхансер
MFCS1 и промотор Shh позиционируются в одном микрокомпартменте ядра и могут
непосредственно взаимодействовать друг с другом примерно в половине Shhэкспрессирующих клеток (Amano et al., 2009). Динамика этого дальнего взаимодействия
может отражать динамику пространственной организации протяженного участка
хромосомы, несущего MFCS1 и промотор Shh. Быстрые флуктуации структуры –
59
неотъемлемое свойство хроматиновой фибриллы. Эти флуктуации могут служить
движущей силой коммуникации MFCS1 и промотора Shh и временной активации
промотора, порождающей «волны» транскрипции гена Shh. Существование «волн» (или
«импульсов», «всплесков») транскрипционной активности – фундаментальное свойство
генов различных организмов от бактерий до человека (Golding et al., 2005; Kaufmann and
van Oudenaarden, 2007; Levine et al., 2013; Raj et al., 2006). Не исключено, что у высших
эукариот с их сложной организацией хроматина динамичная локальная укладка хромосом,
обеспечивающая попеременное сближение промоторов и энхансеров, является ключевой
детерминантной волн транскрипции достаточно длинного периода. В такой ситуации
продолжительность периода транкрипции должна определяться стабильностью промоторэнхансерного взаимодействия, а частота активации промотора – вероятностью, с которой
хроматиновый домен принимает пространственную конфигурацию, при которой
промотор и энхансер сближены. Локализация энхансера на большом расстоянии (на цепи
ДНК) от промотора-мишени может иметь функциональное значение. Наиболее
популярная точка зрения состоит в том, что удаленное расположение энхансеров,
обеспечивающее нестационарную активацию подконтрольных промоторов, является
регуляторным механизмом, появившимся в эволюции для контроля уровня синтеза мРНК.
Однако существует и другая возможность, состоящая в том, что значительные расстояния
между промоторами и энхансерами, характерные для геномов высших эукариот, но не
примитивных одноклеточных эукариот, это не дополнительный механизм регуляции
транскрипции, а последствие экспансии мобильных элементов генома и перестройки
хромосом (в частности, инверсий и инсерций). В этом случае, динамичная природа
промотор-энхансерной
коммуникации,
осуществляющейся
на
больших
геномных
расстояниях, представляет собой «попытку» клетки минимизировать последствия
неконтролируемой
геномной
экспансии
посредством
создания
специфической
60
пространственной архитектуры интерфазных хромосом. Возможно, что оба сценария
являются правильными: в условиях «размывания» генома, связанного с экспансией
транспозонов и геномными перестройками, клетки «нашли» способ использовать этот
феномен для регуляции транскрипции, в частности, выработали способ прерывистой
активации промоторов удаленными энхансерными элементами.
I.2.3 ДВИЖУЩИЕ СИЛЫ КОММУНИКАЦИИ В КЛЕТОЧНОМ ЯДРЕ
Первые транскрипционные энхансеры, найденные у эукариот, были идентифицированы
более тридцати лет назад (Banerji et al., 1981; Picard and Schaffner, 1983), однако
механизмы коммуникации удаленных регуляторных элементов в эукариотическом геноме
до сих пор остаются загадкой. В литературе описано несколько моделей промоторэнхансерной коммуникации (Kukreti et al., 2010; Kulaeva et al., 2012), хотя ни одна из них
полностью не проверена даже на тех модельных системах, для которых они были
предложены. Прогресс в понимании молекулярных механизмов промотор-энхансерной
коммуникации во многом сдерживается отсутствием подходящих модельных систем. С
одной стороны, в любом эксперименте, выполненном на природном геномном локусе,
достаточно сложно (если вообще возможно) учесть все эффекты сложного геномного
окружения. С другой стороны, в силу сложности задействованных процессов и
ограниченного знания о них, в настоящее время не представляется возможным создать
адекватную чистую биохимическую систему, позволяющую отслеживать промоторэнхансерную коммуникацию in vitro в реальном времени. Принимая во внимание то, что в
геномах высших эукариот средние расстояния между промоторами и энхансерами
значительно варьируют в зависимости от таксона и конкретного геномного локуса (103106 п.н.) (Chepelev et al., 2012), и что промотор-энхансерная коммуникация может
происходить как in cis, так и in trans (Gorkin et al., 2014), следует полагать, что существует
61
несколько механизмов промотор-энхансерной коммуникации, работающих в различном
геномном контексте. Далее будут рассмотрены возможные пути установления промоторэнхансерной коммуникации в клеточном ядре.
I.2.3.1 Дальние взаимодействия и топологически-ассоциированные домены
Развитие методов фиксации конформации хромосомы (3С) и высокопроизводительного
секвенирования позволило выйти на полногеномный уровень анализа взаимодействий
удаленных элементов генома. Так, метод HiC-анализа дает возможность одновременно
детектировать
все
пространственные
взаимодействия
геномных
элементов,
реализующиеся в данный момент времени в клеточном ядре (Belton et al., 2012; LiebermanAiden et al., 2009). Метод базируется на процедуре 3С, суть которой заключается в
формальдегидной фиксации хроматина, с последующим разрезанием ДНК рестриктазами
и религированием фрагментов, находящихся в пространственной близости в ядерном
пространстве (Dekker et al., 2002a; Tolhuis et al., 2002). В методе HiC в процедуру была
введена дополнительная стадия между рестрикцией и лигированием – заполнение концов
ДНК нуклеотидами, один из которых биотинилирован (рис. 5А). После лигирования
«втупую» ДНК очищают и дробят, затем биотинилированные «стыки» изолируют на
стрептовидиновых шариках и секвенируют с двух концов (рис. 5А). Данные
секвенирования позволяют построить матрицу частот лигирования между всеми
фрагментами генома, что позволяет оценить частоту взаимодействия между любой парой
геномных элементов
(рис.
5Б).
Разрешение метода HiC
зависит
от
глубины
секвенирования. Например, для того чтобы получить матрицу контактов генома человека
с разрешением 10 т.п.н., необходимо секвенировать по меньшей мере 300 миллионов
продуктов лигирования (Dixon et al., 2012; Lieberman-Aiden et al., 2009). В связи с этим
HiC-анализ обычно используют для изучения общих особенностей укладки хромосом,
62
Рис. 5. Удаленные взаимодействия в хроматине, выявленные методом HiC: (А) Ключевые этапы
экспериментального протокола. (Б) Пример контактной матрицы для произвольно выбранного участка
хромосомы (неопубликованные данные). Каждый пиксель представляет все взаимодействия между
соответствующей парой 20 т.п.н.-участков; цвет отражает суммарное число прочтений (значения вдоль
диагонали не представлены). Визуальный анализ обнаруживает присутствие квадратов вдоль диагонали,
которые соответствуют областям (топологически-ассоциированным доменам), в пределах которых локусы
часто взаимодействуют друг с другом. Эти области могут соответствовать глобулярным хроматиновым
доменам вдоль хромосомы, как схематически показано в секции (В).
которые могут быть выявлены при более низком разрешении. К настоящему времени
проведен HiC-анализ крупномасштабной организации хромосом для 9 организмов: Homo
sapiens (Jin et al., 2013; Lieberman-Aiden et al., 2009; Rao et al., 2014), Mus musculus (Dixon
et al., 2012; Zhang et al., 2012), Drosophila melanogaster (Hou et al., 2012; Sexton et al., 2012),
Plasmodium falciparum (Ay et al., 2014; Lemieux et al., 2013), Saccharomyces cerevisiae
(Duan et al., 2011), Schizosaccharomyces pombe (Tanizawa et al., 2010), Arabidopsis thaliana
(Feng et al., 2014; Grob et al., 2014; Wang et al., 2015), Escherichia coli (Cagliero et al., 2013)
и Caulobacter crescentus (Le et al., 2013; Umbarger et al., 2011). С использованием метода
HiC было установлено, что хромосомы человека, мыши и дрозофилы подразделяются на
топологически-ассоциированные домены (ТАД) размером от сотни до десятка тысяч
п.н.,
обычно
интерпретируемые
как
хроматиновые
глобулы.
Участки
генома,
расположенные в пределах одного топологического домена, контактируют друг с другом
63
более часто, чем участки из разных доменов. Домены разделены граничными участками,
не имеющими определенной пространственной структуры (по крайней мере, при
разрешении использованного метода исследования) и не взаимодействующими с
внутренними регионами доменов (Dixon et al., 2012; Nora et al., 2012) (рис. 5В). Разбиение
генома на домены консервативно между разными клеточными типами одного организма и
даже между организмами родственных таксонов, таких как человек и мышь (Dixon et al.,
2012). Это свидетельствует о том, что геномные элементы и механизмы, ответственные за
поддержание высших уровней упаковки хроматина, в эволюции могут быть относительно
древними. Между тем показано, что топологические домены утрачиваются во время
митоза и вновь восстанавливаются в интерфазе (Naumova et al., 2013), что подразумевает
наличие особых эпигенетических механизмов, ответственных за воспроизведение
крупномасштабной пространственной организации генома в индивидуальных хромосомах
и в клеточном ядре в целом в ряду поколений (Dekker, 2014). Позиции топологических
доменов хорошо коррелируют с позициями доменов распределения активных и
репрессивных модификаций гистонов, а также ламино-ассоциированных доменов (см.
раздел I.3.3). Однако стабильность топологических доменов в клетках, отличающихся по
профилям экспрессии генов и модификаций гистонов (эмбриональные стволовые клетки,
клетки мозга и фибробласты), предполагает, что структуру доменов определяют не
транскрипция или гистоновые модификации, а некие внутренние свойства, заложенные,
возможно, в последовательность ДНК, например, сайты связывания универсальных ДНКсвязывающих факторов (Bickmore, 2013; Nora et al., 2012). Некоторые различия в HiCвзаимодействиях все-таки детектируются в клетках различного типа, но обычно их
относят
к
дифференциально
регулирующимся
генам.
Интересно,
что
такие
факультативные взаимодействия обычно реализуются в пределах одного топологического
домена (Nora et al., 2012).
64
Для того чтобы выяснить, что определяет границы топологических доменов, их
позиции были наложены на профили распределения инсуляторных белков и других
эпигенетических маркеров. У дрозофилы границы доменов оказались обогащенными
участками гиперчувствительности к ДНКазе и сайтами связывания инсуляторных белков
CP190 и Chromator, известными своей функцией в организации структуры хромосом
(Sexton et al., 2012). В клетках млекопитающих границы топологических доменов были
обогащены промоторами генов домашнего хозяйства и сайтами связывания белка CTCF.
В числе других геномных элементов, встречающихся на границах доменов, – гены тРНК и
повторы семейства SINE, которые также могут быть связаны с инсуляторной функцией
(Lunyak et al., 2007; Raab et al., 2012).
Принципы укладки хроматина в топологические домены до сих пор остаются не
выясненными. Изначально предполагалось, что ТАД представляет собой фрактальную
глобулу (т.е. конденсированную незаузленную макромолекулу), сформированную
хроматиновой фибриллой (Lieberman-Aiden et al., 2009; Mirny, 2011). Однако анализ
зависимости частоты контактов для различных пар геномных локусов от длины
спейсерного участка, разделяющего эти локусы (Barbieri et al., 2013), не подтвердил это
предположение. По всей видимости, фрактальная глобула, изначально выдвинутая в
качестве подходящей модели интерфазной хромосомы, представляет собой достаточно
грубое приближение или отражает лишь одну из возможных пространственных
конфигураций хромосомы. В хромосомах арабидопсиса, почкующихся дрожжей и
плазмодиума топологически-ассоциированные домены обнаружены не были (Ay et al.,
2014; Feng et al., 2014; Grob et al., 2014; Nora et al., 2013). Одно из возможных объяснений
этому наблюдению – отсутствие CTCF и других инсуляторных белков (за исключением
TFIIIC) у этих организмов. Как было отмечено ранее, в клетках млекопитающих CTCF
обогащен на границах ТАД (что также характерно для всех инсуляторных белков в
65
клетках дрозофилы). Соответственно было предположено, что CTCF играет важную роль
в разграничении соседних топологических доменов (Ong and Corces, 2014). Делеция
граничного региона, содержащего активный CTCF-зависимый инсулятор из области
центра инактивации X-хромосомы, приводила к значительному перекрыванию соседних
топологических доменов, которые изначально были хорошо разграничены (Nora et al.,
2012). Однако отметим, что делетируемый регион был достаточно протяженный (50 т.п.н.)
и, следовательно, не ясно, связан ли наблюдаемый эффект исключительно с утратой сайта
связывания белка CTCF. Заметим, что только 15% сайтов связывания CTCF локализуется
на границах ТАД (Dixon et al., 2012). Возможно, сайты связывания CTCF, расположенные
внутри ТАД, участвуют в поддержании их структуры. Действительно, известно, что CTCF
совместно с комплексом SMC (в частности, когезином) и комплексом Mediator
стабилизируют
удаленные
промотор-энхансерные
и
промотор-промоторные
взаимодействия внутри ТАД (Kagey et al., 2010; Sofueva et al., 2013; Zuin et al., 2014).
Таким образом, ТАД может быть самоорганизующейся структурой, целостность которой
поддерживается внутренними
взаимодействиями,
тогда
как
любой
участок,
не
участвующий в этих взаимодействиях, автоматически становится границей ТАД. В этой
связи возникает два важных вопроса: (1) почему большинство промотор-энхансерных
контактов не пересекают границ топологических доменов; и (2) почему топологические
домены в большинстве своем инвариантны в клетках различного типа (по крайней мере, у
млекопитающих), тогда как промотор-энхансерные контакты представляются высоко
тканеспецифичными?
На первый вопрос дают несколько ответов. Наиболее неожиданным, пожалуй,
является тот, что граничные регионы в действительности не препятствуют коммуникации
между регуляторными элементами. Используя технику случайной встройки репортерного
гена, Симмонс и соавт. продемонстрировали, что действие тканеспецифичных энхансеров
66
не сосредотачивается на специфическом гене-мишени, а охватывает достаточно широкую
зону порядка 100 т.п.н., простирающуюся в обе стороны от энхансера и представляющую
собой так называемый регуляторный домен – «область полномочий» энхансера в пределах
определенного геномного локуса (Symmons et al., 2014). Тканеспецифичные энхансеры, по
всей видимости, устанавливают множественные случайные короткоживущие контакты с
любым промотором, локализованным в пределах регуляторного домена, возможно,
благодаря афинности белков энхансосомы к белковым комплексам, связанным с
промоторами. Регуляторные домены обычно не пересекают границ ТАД (Symmons et al.,
2014). Если ТАД представляет собой кластер регуляторных доменов, в пределах которых
реализуется большое количество стабильных высокоспецифичных и короткоживущих
случайных
контактов,
тогда
типичная
граница
–
это
участок
между
двумя
неперекрывающимися группами таких регуляторных доменов, и промотор-энхансерные
взаимодействия наблюдаются преимущественно в пределах ТАД по той причине, что эти
взаимодействия и являются первичным фактором, определяющим укладку сегмента
хроматиновой фибриллы в топологический домен (рис. 6А). В таком случае ТАД
стабилизируются внутренними связями, тогда как граничные регионы не играют роли в
создании специфической архитектуры интерфазной хромосомы.
Альтернативная возможность заключается в том, что специфические свойства
участка ДНК между топологическими доменами препятствуют пространственному
взаимодействию удаленных геномных элементов, расположенных по разные стороны от
этого участка (Dixon et al., 2012; Hou et al., 2012) (рис. 6Б). Не исключено, что границы
ТАД составляют гетерогенную группу геномных элементов. Некоторые из граничных
регионов могут препятствовать коммуникации между промоторами и энхансерами в силу
наличия у этих регионов специфических свойств, таких как присутствие сайтов
связывания инсуляторных белков или активно транскрибируемых участков, или
67
Рис. 6. Структура топологически-ассоциированных доменов: (А) Модель, предполагающая ключевую
роль специфических удаленных взаимодействий в формировании и поддержании структуры топологических
доменов. Каждый ТАД представляет собой кластер элементов, которые обладают высокой афинностью друг
к другу и более низкой (либо нулевой) афинностью к элементам из других топологических доменов. В
данном случае границы между доменами возникают пассивно и не несут структурной функции. (Б) Модель,
предполагающая ключевую роль граничных элементов (инсуляторов) в разбиении хромосом на
топологические домены. В соответствии с этой моделью элементы из различных топологических доменов
обладают широкой «кросс-реактивностью», однако граничные элементы препятствуют коммуникации
между ними.
комбинации этих факторов, тогда как другие границы (меньшая часть) не ограничивают
промотор-энхансерной
коммуникации.
Интересно,
что
частота контактов между
участками, принадлежащими топологическому домену, и участками, расположенными вне
домена, повышается при старении клеток (Chandra et al., 2015).
При рассмотрении вопроса об инвариантности распределения топологических
доменов в клетках различного типа и тканеспецифичности промотор-энхансерных
контактов в пределах ТАД, упомянем о ряде исследований, свидетельствующих о том, что
петли ДНК между тканеспецифичными энхансерами и подконтрольными промоторами не
всегда формируются только в тех клетках, где соответствующие гены активны. Например,
в клетках карциномы человека FOXO3-зависимый энхансер взаимодействует
с
подконтрольным промотором до активации транскрипции (Eijkelenboom et al., 2013).
Другой пример – глюкокортикоид-зависимые гены у мыши, которые вовлечены в сеть
пространственных взаимодействий еще до обработки гормоном (Hakim et al., 2011).
Схожим образом TNFα-зависимые энхансеры взаимодействуют с промоторами-мишенями
68
в клетках (фибробластах), не обработанных TNFα (Jin et al., 2013). Эти и другие примеры
показывают, что значительное количество удаленных взаимодействий, реализующихся в
индуцибельных локусах, предсуществуют в клетках, где эти локусы транскрипционно
неактивны. Более того, у дрозофилы большинство удаленных взаимодействий не
различаются между тканями и стадиями развития организма (Ghavi-Helm et al., 2014).
Такие структурно-инвариантные удаленные контакты могут определять консервативность
распределения ТАД в геноме. Кроме этого, контакты промоторов расположенных
поблизости и корегулируемых генов, составляющие наибольшую фракцию (42%)
удаленных контактов в клетках человека (Li et al., 2012), могут также участвовать в
формировании топологически-ассоциированных доменов. В этой связи уместно отметить,
что большинство активных генов в любой клетке – это гены домашнего хозяйства,
активные в большинстве клеточных типов.
Если
топологические
домены
–
это
самоорганизующиеся
структуры,
поддерживающиеся внутренними промотор-промоторными и промотор-энхансерными
взаимодействиями, то как объяснить тот факт, что в геноме человека и мыши существуют
протяженные области, лишенные генов (так называемые «генные пустыни»), которые
также разбиты на серию топологических доменов? Одна из возможностей объяснения
состоит в том, что в этих областях, несмотря на отсутствие генов, присутствуют
консервативные
энхансерные
элементы
способствовать
формированию
ТАД.
(Nobrega
Было
et
al.,
установлено,
2003),
что
которые
могут
энхансеры
часто
устанавливают петлевые взаимодействия без привлечения промоторов (Li et al., 2012).
Функциональный смысл этих взаимодействий не ясен, но они могли бы принимать
участие в организации топологических доменов на обедненных генами участках
хромосом.
69
Хотя заманчиво связывать укладку хромосом в топологические домены с
функциональной
организацией
генома,
такой
связи,
возможно,
не
существует.
Формирование ТАД может направляться физическими свойствами хроматиновой
фибриллы как полимерной молекулы (такими как изгиб, формирование петель,
образование межнуклеосомных контактов, суперскручивание). Слипание хроматина,
образование короткоживущих агломератов нуклеосом может инициировать сборку
хроматиновых структур более высокого порядка в условиях повышенной концентрации
макромолекул в клеточном ядре. В богатых генами участках хромосом такие «пре-ТАДы»
могут облегчать установление специфических дальних взаимодействий, которые, в свою
очередь, будут стабилизировать структуру ТАД. Таким образом, причинно-следственная
связь между локальной укладкой хромосом и контактами удаленных регуляторных
элементов может быть двунаправленной. Отметим, что выпетливание – неотъемлемое
свойство хроматиновой фибриллы (Langowski and Heermann, 2007), которое может
модулироваться плотностью гистонов (Diesinger et al., 2010) и/или их модификациями.
Таким образом, необходимость специфической движущей силы для установления
промотор-энхансерной
способствовать
коммуникации
не
постоянному движению
очевидна.
Броуновские
хроматиновых
фибрилл,
силы
должны
принятию
ими
различных пространственных конфигураций. Как только промотор сближается с
энхансером, локальная конфигурация хроматиновой фибриллы может фиксироваться в
данном состоянии благодаря взаимодействию белков, связанных с промотором и
энхансером. Хотя подобная модель представляется привлекательной в силу ее простоты,
она не объясняет всех имеющихся экспериментальных данных. Например, не ясно,
почему в доменах бета-глобиновых генов позвоночных животных действие LCR
предпочтительно распространяется на ближайший к энхансеру ген (Tanimoto et al., 1999),
несмотря на сопоставимую вероятность «дотянуться» до следующего гена путем
70
формирования альтернативной петли хроматина. Данная ситуация гораздо лучше
объясняется в рамках модели «трекинга».
I.2.3.2 Коммуникация, опосредуемая «молекулярными моторами»: РНК-полимераза
II и ядерный актин/миозин
Как известно, многие энхансеры способны привлекать компоненты базального
транскрипционного аппарата, включая комплекс Mediator и РНК-полимеразу II (Kagey et
al., 2010; Kim et al., 2010; Taatjes, 2010; Whyte et al., 2013), в результате чего вокруг
энхансеров возникает сложный «транскрипционный ландшафт». Полногеномный анализ
профилей транскрипции показал, что большинство энхансеров являются местами начала
синтеза двунаправленных транскриптов, получивших название энхансерных РНК (eRNA)
и обладающих регуляторными функциями (De Santa et al., 2010; Kim et al., 2010; Mousavi
et al., 2014; Natoli and Andrau, 2012). Кроме относительно коротких двунаправленных
транскриптов,
энхансеры
могут
направлять
синтез
протяженных
межгенных
транскриптов, которые в ряде случаев сплайсируются и полиаденилируются (Andersson et
al., 2014; Koch et al., 2011; Kowalczyk et al., 2012b; Marques et al., 2013). Важно отметить,
что в ряде геномных локусов транскрипция, инициированная на энхансере, направлена в
сторону подконтрольного промотора, что предполагает участие межгенной транскрипции
в установлении функциональной коммуникации между энхансером и промотором
(Gribnau et al., 2000; Masternak et al., 2003). Примечательно, что у C. elegans большинство
энхансеров транскрибируются в сторону ближайшего от энхансера гена (Chen et al., 2013).
В соответствии с моделью, предложенной в 1999 г. А. Траверсом (Travers, 1999),
перемещение («трекинг») РНК-полимеразы II от энхансера вдоль геномного домена
необходимо для установления и поддержания «открытого» (активного) хроматинового
статуса домена, что и является первым шагом на пути активации транскрипции внутри
71
домена. В этой модели, получившей подтверждение в ряде наблюдений (Gribnau et al.,
2000; Ling et al., 2004; Ling et al., 2005), РНК-полимераза выполняет роль «транспортного
средства»,
доставляющего
комплексы
ремоделирования
хроматина
и
гистонацетилтрансферазы с энхансера на промотор. Таким образом, данная модель
описывает
только
функциональную,
но
не
структурную
(пространственную)
коммуникацию между энхансером и промотором. Однако также существуют данные,
свидетельствующие о том, что направляемая энхансерами межгенная транскрипция с
участием РНК-полимеразы II играет роль и в установлении пространственных контактов
между энхансерами и промоторами. Показано, что связанный с РНК-полимеразой II
промотор способен «обследовать» протяженный участок ДНК в направлении движения
РНК-полимеразы (Larkin et al., 2013). Механистически это может быть объяснено с
позиций модели, постулирующей, что транскрибируемая ДНК протаскивается через
неподвижный транскрипционный комплекс за счет тяговой силы РНК-полимеразы II
(Papantonis and Cook, 2011; Papantonis et al., 2010) (рис. 7А). Принимая во внимание
данные о том, что энхансеры действуют как внегенные промоторы (Kowalczyk et al.,
2012b), можно предположить, что элонгация энхансер-связанной РНК-полимеразы II
составляет движущую силу промотор-энхансерной коммуникации. Ранее было показано,
что межгенная транскрипция в бета-глобиновом локусе в эритроидных клетках человека
контролируется энхансером HS2 (Kim et al., 2007a; Plant et al., 2001), с которого
инициируется двунаправленная транскрипция в направлении 5’-конца LCR и в
противоположном направлении – к бета-глобиновым генам. На 5’-конце LCR
транскрипция блокируется HS5 (CTCF-зависимый инсулятор), тогда как в направлении
глобиновых генов транскрибирующийся регион простирается за генный кластер до 3’HS,
колокализуясь, таким образом, с доменом ацетилированных гистонов (Miles et al., 2007).
72
Рис. 7. Гипотетические «молекулярные моторы» в клеточном ядре: (А) Схема, иллюстрирующая
возможный механизм сближения промотора и энхансера в результате транскрипции, осуществляемой
иммобилизированной РНК-полимеразой с энхансера в сторону промотора. При неподвижности РНКполимеразы (pol) в ходе транскрипции участок ДНК между энхансером (Е) и промотором (Р) протягивается
через молекулу полимеразы и выпетливается, в результате чего промотор подтягивается к энхансеру. (Б)
Миозин-зависимый транспорт энхансера вдоль актинового филамента. (В) Перемещение энхансера под
действием «толкающей силы» растущего актинового филамента.
Инверсия LCR бета-глобинового домена, при которой HS5 оказывается в позиции между
HS2 и кластером глобиновых генов, приводит к существенному снижению уровня
транскрипции бета-глобиновых генов (Tanimoto et al., 1999). Более того, инсерция
сильного транскрипционного терминатора или гетерологичного CTCF-зависимого
инсулятора в позицию между HS2 и бета-глобиновым промотором подавляет
пространственные контакты между HS2 и бета-глобиновым промотором в условиях
нормальной
геномной
ориентации
области
контроля
локуса.
Эксперименты
с
использованием методов фиксации конформации хромосомы (3С), иммунопреципитации
хроматина (ChIP) и анализ транскрипции показали, что в таких условиях энхансер73
специфичные
транскрипционные
факторы,
РНК-полимераза
II
и
нуклеотидные
последовательности энхансера преимущественно локализуются на 5’-конце вставленного
инсулятора и не достигают расположенных ниже промоторов бета-глобиновых генов
(Ling et al., 2004; Zhu et al., 2007). Эти данные поддерживают модель «облегченного
трекинга», согласно которой РНК-полимераза II, связанная с последовательностью
энхансера, движется вдоль хроматиновой фибриллы и, в конечном счете, транспортирует
энхансер на промотор.
Схожие данные были получены при анализе нескольких других геномных локусов.
В локусе Igh2/H19 инсулятор, локализованный между энхансером и промотором гена
Igh2,
способен
нарушать
промотор-энхансерную
коммуникацию
только
в
неметилированном, не препятствующем связыванию белка CTCF, состоянии, что
опосредуется блокированием РНК-полимераза-зависимого транспорта энхансера (Engel et
al., 2008). В ходе дифференцировки клеток CaCo-2 активации транскрипции гена HNF4alpha предшествует транспортировка вышележащего энхансера к промотору HNF-4alpha
(Hatzis et al., 2006; Hatzis and Talianidis, 2002). Следует отметить, что во всех
рассмотренных примерах геномные расстояния между энхансером и промотором
достаточно небольшие и коммуникация осуществляется в рамках выделенного геномного
домена. Данных о том, что опосредованная РНК-полимеразой II коммуникация между
промоторами и энхансерами может происходить на значительно бóльших расстояниях, в
настоящее время не получено. Возможно, перемещение энхансера на значительные
расстояния затруднено в условиях сложного геномного контекста из-за присутствия
протяженных гетерохроматинизированных участков, инсуляторов, регионов с высокой
плотностью транскрибируемых генов. В этой связи представляется интересным
рассмотрение вопроса о том, способны ли энхансеры, расположенные в генных
«пустынях»,
контактировать
с удаленными
генами-мишенями
с использованием
74
механизма «трекинга» энхансера. Хотя некоторые из этих энхансеров достаточно
интенсивно изучались (Nobrega et al., 2003; Smits et al., 2013; Uslu et al., 2014), механизмы
их коммуникации друг с другом и с подконтрольными промоторами в настоящее время
остаются неясными.
Заметим, что ингибирование транскрипции, осуществляемой РНК-полимеразой II,
не влияет ни на пространственные контакты удаленных регуляторных элементов и
промоторов бета-глобиновых генов мыши, ни на пространственное позиционирование
бета-глобинового локуса относительно других участков хромосомы (Palstra et al., 2008b).
Таким образом, было предположено, что определяющую роль в поддержании дальних
взаимодействий в бета-глобиновом домене играют модификации гистонов и связывание
транс-действующих факторов, а не транскрипция. Однако, принимая во внимание, что
эксперименты в указанном исследовании были выполнены на дифференцированных
клетках, уже экспрессирующих глобиновые гены, нельзя исключить, что РНК-полимераза
II обеспечивает первоначальное установление коммуникации на начальных стадиях
эритроидной
дифференцировки.
После
установления
коммуникации
она
может
поддерживаться другими механизмами, такими как мультимеризация промотор- и
энхансер-связанных белков, например, Ldb1 или CTCF, с дополнительной стабилизацией
когезиновыми кольцами (Deng et al., 2012; Guo et al., 2012). Интересный пример
взаимоотношений между направляемой энхансером межгенной транскрипцией и
промотор-энхансерными контактами был описан на модели андроген-активируемого
локуса простато-специфичного антигена PSA (prostate specific antigen) (Wang et al., 2005).
Обработка раковых клеток простаты человека дигидротестостероном сопровождалась
формированием петли хроматина между промотором гена PSA и энхансером,
расположенным на расстоянии 4 т.п.н. перед геном. Появление петли коррелировало со
связыванием РНК-полимеразы II с энхансером и последующим трекингом к PSA75
промотору. Однако в отличие от наблюдений, сделанных Туан и соавт. на модели домена
бета-глобиновых генов (Zhu et al., 2007) (см. выше), в данном случае ингибирование
трекинга РНК-полимеразы II не препятствовало формированию петли хроматина между
PSA-промотором и его энхансером. Таким образом, в некоторых геномных локусах
формирование петли между энхансером и промотором и транскрипция линкерного
участка функционально не связаны.
Другой энергозависимой молекулярной системой, которая могла бы быть
вовлечена в создание коммуникации между удаленными элементами генома в
интерфазных хромосомах, является ядерный актин/миозин I (Nuclear Myosin I, NMI). В
целом, считается, что мономерная форма актина, обнаруживаемая в клеточном ядре,
играет определенную (хотя и не вполне понятную) роль в транскрипции с участием всех
трех РНК-полимераз, принимая участие в формировании преинициаторного комплекса,
элонгации транскрипции, процессинге РНК и ремоделировании хроматина (Belin and
Mullins, 2013; Kysela et al., 2005). Существование канонических актиновых полимеров и
олигомеров в ядрах соматических клеток при нормальных физиологических условиях не
очевидно, однако можно говорить о присутствии в ядрах как минимум двух типов
актиновых филаментов: коротких актиновых филаментов (имеющих субмикронную
длину) и актин-кофилиновых комплексов, собирающихся в условиях стресса (Belin and
Mullins, 2013; Munsie et al., 2012).
Хотя
прямых
доказательств
роли
актин/миозин-зависимого
транспорта
в
установлении пространственных контактов между регуляторными элементами ДНК не
получено, ряд наблюдений свидетельствует о том, что ядерный актин и NMI участвуют в
передвижении блоков хроматина и перемещении определенных геномных локусов между
ядерными компартментами. Так, было обнаружено, что точечные мутации в актине, при
которых невозможна полимеризация, резко ингибируют быстрое и направленное
76
перемещение индуцибельного репортерного гена с периферии к центру ядра при
активации, тогда как мутации, способствующие формированию F-актина, усиливают этот
процесс (Chuang et al., 2006).
Полимеризация ядерного актина также требуется для транслокации генов малых
ядерных РНК (мяРНК) U2 к тельцам Кахаля в ходе транскрипционной активации (Dundr
et al., 2007). Более того, драматическая реорганизация хромосомных территорий и
быстрые межхромосомные контакты транскрипционных единиц, связанных с альфаэстрогеновым рецептором, зависят от активности системы ядреного актина/NMI (Hu et al.,
2008). Поскольку ядерный актин, вероятно, так или иначе вовлечен в организацию
транскрипции,
можно
предположить,
что
этот
белок
участвует
также
и
в
репозиционировании промоторов и энхансеров. Короткие актиновые филаменты могли бы
содействовать такому перемещению как минимум двумя способами (Belin and Mullins,
2013): (1) NMI-зависимый транспорт может обеспечивать перемещение фрагмента
хроматина, содержащего активный промотор или энхансер (рис. 7Б); (2) направленное
движение фрагмента хроматина, содержащего активный промотор или энхансер, может
быть вызвано действием «толкательной» силы, производимой растущим актиновым
филаментом
(т.е.
без
участия миозинового
мотора)
(рис.
7В).
Отметим,
что
предполагаемые механизмы имеют некоторые общие черты. В обоих случаях идет речь о
том, что в качестве точки нуклеации полимеризации актина выступают геномные участки,
обогащенные РНК-полимеразой II (в частности, активные промоторы), которые
организуют области («фокусы») с повышенной концентрацией коротких актиновых
филаментов. Каков бы ни был конкретный механизм, дальность каждого шага
перемещения будет зависеть от длины актиновых филаментов и силы сопротивления со
стороны хроматиновой фибриллы. Оба механизма предполагают осуществление
стохастического, но однонаправленного и быстрого перемещения геномного участка в
77
ядерном
пространстве
на
большое
расстояние
(предсказание,
подтвержденное
наблюдениями in vivo (Chuang et al., 2006)). Последняя особенность хорошо отличает
описанный механизм от свободной диффузии – стохастического, но ограниченного
движения, не способного обеспечивать масштабное направленное перемещение (Marshall
et al., 1997b). Заметим, что в отличие от перемещения, опосредованного РНК-полимеразой
II, и подобно свободной диффузии, перемещение, обусловленное работой ядерного
актина/NMI,
происходит
в
трех измерениях
(т.е.
не
ограничено
одномерным
пространством хроматиновой фибриллы). Таким образом, если система ядерного
актина/NMI действительно принимает участие в перемещении регуляторных элементов
генома, такое перемещение вряд ли повышает «точность» коммуникации, однако может
увеличивать скорость обследования ядерного пространства.
I.2.4 СВОБОДНАЯ ДИФФУЗИЯ И МАКРОМОЛЕКУЛЯРНОЕ СКОПЛЕНИЕ
При высокой концентрации макромолекул в растворе (когда они занимают 20-30% общего
объема), т.е. в условиях так называемого макромолекулярного скопления (с англ.
macromolecular crowding), макромолекулы склонны к агрегации и образованию друг с
другом комплексов (Cho and Kim, 2012; Ellis, 2001; Hancock, 2004a; Marenduzzo et al.,
2006b;
Richter
формированию
et
al.,
2008).
Причины
макромолекулярных
возникновения
комплексов
в
силы,
условиях
способствующей
макромолекулярного
скопления, кроются в том, как макромолекулы взаимодействуют друг с другом (рис. 8).
Макромолекулы возможно представить в виде сфер различного диаметра, находящихся в
состоянии броуновского движения. При движении мелкие макромолекулы бомбардируют
более крупные с различных направлений. Однако, когда последние в силу случайных
причин оказываются рядом, бомбардировка со стороны поверхности контакта становится
невозможной. Соответственно, не будет сил, способных «раздвинуть» макромолекулы,
78
тогда как сохранятся силы, удерживающие их в составе комплекса. Формирование
комплекса также приводит к некоторому уменьшению пространства, занимаемого
крупными макромолекулами, особенно в том случае, когда поверхности этих молекул
обладают пространственной комплементарностью, что типично для макромолекул,
способных к димеризации и мультимеризации. Освобождение пространства обеспечивает
больше места для движения мелких молекул, т.е. дает выигрыш в энтропии. В клетках
макромолекулярное скопление создается крупными биомолекулами, такими как белки,
нуклеиновые кислоты и карбогидраты (Weiss, 2014). В биохимических исследованиях
макромолекулярное скопление может быть смоделировано/имитировано добавлением так
называемого «краудинг-агента» (обычно полиэтиленгликоля или фикола). Присутствие в
растворе краудинг-агента позволяет сохранить характерную структуру и компактность
метафазных хромосом при их выделении (Hancock, 2012), а также способствует
Рис. 8. Силы, действующие в условиях макромолекулярного скопления, способствующие агрегации
макромолекул и их комплексов в еще более крупные комплексы. При высокой концентрации
макромолекул в растворе стохастически двигающиеся мелкие макромолекулы (маленькие сферы) постоянно
«бомбардируют» крупные макромолекулы и их комплексы (большие сферы), приводя к образованию еще
более крупных комплексов. Это увеличивает объем, доступный для маленьких сфер. В результате
возрастает энтропия системы.
79
восстановлению ядрышек и PML-телец, дезинтегрированных в гипотонических условиях
(Hancock, 2004a, b). Более того, добавление краудинг-агента ведет к агрегации
хроматиновых фибрилл in vitro (Hancock, 2008) и компактизации хроматина in vivo
(Richter et al., 2008; Walter et al., 2013). На основании этих наблюдений было
предположено, что макромолекулярное скопление служит движущей силой для сборки
крупных макромолекулярных комплексов и ядерных компартментов, таких как ядерные
тельца, спеклы и хромосомные территории (Hancock, 2004a; Marenduzzo et al., 2006a;
Marenduzzo et al., 2006b). Это предположение поддерживается также экспериментами,
показывающими, что краудинг-агенты стимулируют формирование G-квадруплексов на
теломерной ДНК (Xu et al., 2011) и модулируют их структуру (Heddi and Phan, 2011).
Более того, моделирование по методу Монте Карло показывает, что действием сил,
работающих в условиях макромолекулярного скопления, могут быть полностью
объяснены особенности топологии хроматина в ядре (Barbieri et al., 2013; Cook and
Marenduzzo, 2009).
В силу большого размера белковых комплексов, связанных с промоторами и
энхансерами, поведение этих геномных элементов, скорее всего, должно подчиняться
законам, работающим в условиях макромолекулярного скопления. Вероятно, свободная
диффузия дает возможность обследовать пространство, а макромолекулярное скопление
обеспечивает формирование промотор-энхансерных контактов. Однако диффузия и
макромолекулярное скопление, как чисто энтропийные факторы, не могут обеспечить
специфичности коммуникации регуляторных элементов, которая, очевидно, не случайна и
выходит за рамки ближайшего окружения: транскрипционные фабрики (см. раздел
I.3.4.1.2) и активаторные хроматиновые блоки/центры включают функционально
связанные гены и энхансеры, нередко разнесенные на большие расстояния на хромосоме
или даже локализованные на разных хромосомах (Osborne et al., 2007). Таким образом,
80
возможно предположить, что диффузия – это неспецифическая движущая сила
коммуникации, обеспечивающая непрерывное стохастическое движение регуляторных
элементов генома в ядерном пространстве (такое движение – «болтание» туда-сюда
подобно сжиманию и разжиманию пружины (Lucas et al., 2014), – вероятно,
ограничивается
объемом
родительского
хроматинового
домена)
и
ведущая
к
формированию множественных короткоживущих альтернативных комплексов всех
элементов со всеми. Все макромолекулярные комплексы будут стабилизироваться силами
«притяжения», возникающими в условиях макромолекулярного скопления. Однако
дополнительная стабилизация комплексов, сформированных «правильными» партнерами,
которая обеспечивается специфическим взаимодействием транскрипционных факторов и
других белков, связанных с соответствующими участками ДНК (например, энхансерами и
промоторами), будет способствовать сдвигу равновесия в сторону формирования именно
этих комплексов.
I.3
ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ КОМПАРТМЕНТАЛИЗАЦИЯ КЛЕТОЧНОГО
ЯДРА
Ядерный компартмент может быть определен как место в клеточном ядре, где
концентрируется определенный набор макромолекул. Многие авторы отождествляют
ядерные компартменты с так называемыми ядерными тельцами – функционально
зависимыми
агрегатами
макромолекул,
вовлеченными
в
различные
процессы,
происходящие в клеточном ядре (Dundr, 2012; Meldi and Brickner, 2011; Sleeman and
Trinkle-Mulcahy, 2014; Zimber et al., 2004). Наиболее узнаваемый компартмент этого типа
– ядрышко (рис. 9). Другие компартменты включают в себя следующие типы (но не
ограничиваются ими): околоядрышковый компартмент, тельца Кахаля, PML (ND10)тельца, тельца гистоновых локусов, спеклы, транскрипционные и репликационные
81
фабрики (рис. 9). Большинство этих компартментов впервые было обнаружено с помощью
световой и электронной микроскопии. Так, тельца сплайсинга, которые могут быть
выявлены путем окрашивания малых ядерных РНК (мяРНК) и белков, вовлеченных в
сборку сплайсосомы (например, Sc35), были впервые описаны как гранулы в
межхроматиновом пространстве, которые регистрировались с помощью электронного
микроскопа. Схожим образом тельца Кахаля были визуализированы в нейронах
позвоночных
животных
с
помощью
световой
микроскопии.
Развитие
техники
иммуноокрашивания в параллели с идентификацией белков, входящих в состав ядерных
телец, позволили осуществлять быструю визуализацию ядерных телец с их последующим
анализом с помощью конфокальной микроскопии.
Ядерные
тельца
долгое
время
изучались
независимо
от
исследований
пространственной организации интерфазных хромосом. Между тем, всегда было
известно, что геномная ДНК задействована в биогенезе многих ядерных компартментов.
Например, ядрышки формируются вокруг транскрибирующихся генов рибосомной РНК.
Многие другие ядерные компартменты собираются вокруг определенных геномных
локусов.
Таковы
тельца
гистоновых
локусов,
а
также
транскрипционные
и
репликационные фабрики. Даже если геномная ДНК не вовлечена непосредственно в
сборку ядерных компартментов (как в случае спеклов, параспеклов, PML-телец и
некоторых
других
компартментов),
она
по-прежнему
играет
весомую
роль
в
позиционировании этих компартментов, поскольку ядерное пространство заполнено
хроматином, в то время как указанные выше компартменты локализованы в свободных от
хроматина участках. Таким образом, есть возможность утверждать, что геном,
упакованный в пространстве ядра, составляет основу ядерной компартментализации,
которая, в свою очередь, напрямую связана с активностью генома (Lanctot et al., 2007;
Schneider and Grosschedl, 2007). Кроме того, необходимо отметить, что некоторые
82
Рис. 9. Структура эукариотического ядра и основные типы ядерных компартментов (схематичное
представление).
хроматиновые структуры также нередко причисляют к ядерным компартментам. Таковы
кластеры
центромерного
гетерохроматина
(хромоцентры),
периламеллярный
(периферический) и околоядрышковый слои (рис. 9) (Politz et al., 2013), Polycomb-тельца и
некоторые другие компартменты. Наконец, пространство, занятое хроматином, и так
называемый межхроматиновый домен (рис. 9) (Cremer and Cremer, 2001; Cremer and
Cremer, 2010) тоже представляют собой вполне определенные пространственные
компартменты, хотя они и не соответствуют определению ядерного компартмента,
данному выше.
83
Далее будет проанализирована взаимозависимость между генной активностью,
пространственной организацией хромосом и функциональной компартментализацией
клеточного ядра.
I.3.1 ХРОМОСОМНЫЕ ТЕРРИТОРИИ
Хотя компактные митотические хромосомы были описаны еще в конце XIX века, вплоть
до конца XX века оставалось не ясным, что они представляют собой в интерфазе. Первые
наблюдения, показавшие, что интерфазные хромосомы не являются в полной мере
декомпактизованными в пространстве ядра, были сделаны Т. Кремером и соавт. Они
показали, что облучение ограниченной области ядра ультрафиолетовым лазером приводит
к повреждению небольшого числа хромосом (повреждения выявлялись в ходе
последующего митоза). Большинство хромосом оставались интактными, свидетельствуя о
том, что в интерфазе каждая хромосома занимает ограниченную часть ядерного
пространства (Cremer et al., 1982; Hens et al., 1983). Такая интерпретация была полностью
подтверждена в выполненных в той же лаборатории экспериментах по окрашиванию
индивидуальных хромосом хромосомоспецифичными пробами (Cremer et al., 1993; Cremer
et al., 1988; Lichter et al., 1988). Оказалось, что интерфазные хромосомы занимают
компактные и, в первом приближении, неперекрывающиеся области ядра, разделенные
участками, обедненными хроматином или даже свободными от него. В совокупности, эти
регионы были названы межхроматиновым доменом, тогда как области, занятые
индивидуальными хромосомами, – хромосомными территориями (см. рис. 9) (Cremer et
al., 1993). Данные наблюдения были подтверждены и дополнены различными группами
исследователей (Boyle et al., 2001; Croft et al., 1999; Lukasova et al., 2002; Verschure et al.,
2002). Взаимное расположение индивидуальных хромосомных территорий внутри ядра
стало предметом интенсивного изучения. Несмотря на это, простого правила,
84
описывающего позиционирование хромосомных территорий в ядерном пространстве,
вывести не удалось, за исключением того, что богатые генами хромосомы тяготеют к
центру ядра, а обедненные генами хромосомы – к ядерной периферии (Cremer et al., 1993;
Croft et al., 1999). Примечательно, что расположение отдельно взятой хромосомы
относительно центра ядра существенно различается в индивидуальных клетках. Хотя
положение хромосомы в ядре обычно выражается средним расстоянием от центра
хромосомной территории до центра ядра, нужно помнить, что отклонение от этого
среднего весьма значительно (Taslerova et al., 2003).
Отдельные хромосомные территории характеризуются полярным распределением
богатых и бедных генами сегментов внутри них: богатые генами участки находятся ближе
к центру ядра, обедненные генами участки – ближе к его периферии (Goetze et al., 2007;
Kupper et al., 2007). Что касается межхроматинового домена, то есть основания полагать,
что он служит для транспорта продуктов транскрипции из ядра в цитоплазму и обратного
транспорта «строительных блоков» для транскрипции, репликации и других процессов,
связанных с функционированием генома. В соответствии с этой моделью ожидалось, что
активные гены должны занимать позиции ближе к поверхности хромосомных территорий.
Однако это предположение не получило экспериментального подтверждения (Kupper et
al., 2007; Mahy et al., 2002b; Niedojadlo et al., 2011; Verschure et al., 1999), за исключением
обнаружения того обстоятельства, что определенные активно транскрибируемые гены
выпетливаются за пределы своей хромосомной территории в межхроматиновый домен
(Heard and Bickmore, 2007; Mahy et al., 2002a; Ragoczy et al., 2003). В то же время было
обнаружено,
что
хромосомные территории
имеют
губкоподобную
структуру с
межхроматиновым доменом, пронизывающим внутреннее пространство хромосомных
территорий (см. рис. 9) (Cremer et al., 2006; Verschure et al., 1999). Формирование такой
структуры возможно лишь благодаря организации хромосомных территорий в серию
85
соединенных ~1 млн п.н. глобулярных доменов, погруженных в межхроматиновый домен
(Cremer and Cremer, 2001; Cremer and Cremer, 2010; Cremer et al., 2006; Ma et al., 1998;
Markaki et al., 2012). Подобные глобулярные домены, вероятно, соответствуют фокусам
репликации (Ma et al., 1998; Schermelleh et al., 2001; Wu et al., 2005) и топологическиассоциированным доменам, идентифицированным в экспериментах по HiC-анализу (см.
рис.
9
и
раздел
I.2.3.1).
Транскрипция,
предположительно,
осуществляется
в
околохроматиновом пространстве на границе конденсированных хроматиновых доменов
(Fakan and van Driel, 2007; Niedojadlo et al., 2011). На основании имеющихся данных
(Niedojadlo et al., 2011) сложно судить о том, рассредоточены ли транскрибирующиеся
гены
по
всей
поверхности
конденсированных
хроматиновых
доменов
или
сконцентрированы в определенных областях околохроматинового пространства (таких,
например, как участки, разграничивающие топологически-ассоциированные домены).
Механизмы, поддерживающие организацию интерфазных хромосом в виде
хромосомных территорий, изучены не достаточно. Поначалу предполагалось, что силы
электростатического отталкивания, действующие между отрицательно заряженными
поверхностями хромосом, обеспечивают существование межхроматинового домена
(Cremer et al., 1993). Не ясно, однако, почему те же силы не «разрывают» хромосомную
территорию изнутри, ведь она построена из отрицательно заряженных субъединиц.
Выдвигалось предположение о том, что организация хромосом в форме хромосомных
территорий поддерживается филаментным ядерным скелетом (ядерным матриксом) (Ma et
al., 1999; Petrova et al., 2005). Однако убедительных доказательств в пользу существования
подобной скелетной структуры в живых клетках до сих пор не получено (подробнее будет
обсуждено далее). С помощью компьютерного моделирования показано, что многие
свойства хромосомных территорий могут быть объяснены с точки зрения динамики
обычных полимеров, в частности, броуновского движения и сегрегации несвязанных
86
полимерных цепей вследствие топологических ограничений (Rosa and Everaers, 2008).
Модель укладки хроматиновой фибриллы в серию случайных хроматиновых петель
объясняет не только сегрегацию хромосомных территорий, но и тот экспериментальный
факт, что расстояние между парой FISH-проб не зависит от геномного расстояния между
этими пробами, если это расстояние превышает 10 млн п.н. (Bohn and Heermann, 2010;
Mateos-Langerak et al., 2009). С учетом того, что параметры петель (их размер и плотность)
могут различаться в богатых и бедных генами областях генома, можно представить,
почему богатые и обедненные генами хромосомы (плечи хромосом) имеют различную
форму (Tark-Dame et al., 2011).
Неотъемлемым свойством «территориальной» организации хромосом является
динамичность этой организации. Эксперименты по прижизненному окрашиванию клеток
показали, что хромосомные территории, равно как и отдельные домены внутри
хромосомных территорий, непрерывно движутся (Levi et al., 2005; Marshall, 2002; Marshall
et al., 1997a; Marshall et al., 1997b; Pliss et al., 2013). В соответствии с этими наблюдениями
анализ пространственной конфигурации индивидуальных хромосом в единичных клетках
c
использованием
модифицированного
протокола
HiC
(Nagano
et
al.,
2013)
продемонстрировал значительную вариабельность этой конфигурации от клетки к клетке.
I.3.2 ЯДЕРНЫЙ МАТРИКС
Ядерный белковый матрикс (иначе называемый ядерным скелетом, или каркасом) –
гипотетическая опорная структура клеточного ядра. Споры о существовании такой
структуры в ядре живой клетки ведутся вот уже более 40 лет (Berezney et al., 1995;
Radulescu and Cleveland, 2010; Razin, 1987; Razin and Gromova, 1995; Shaper et al., 1978;
Wilson and Coverley, 2013). Хотя ни одной группе исследователей до настоящего времени
не удалось охарактеризовать эту иллюзорную структуру, идея о том, что за ядерной
87
компартментализацией
должна
стоять
некоторая скелетная структура, оказалась
настолько притягательной, что она пережила
все
это
время,
скептицизм
несмотря
(Simon
and
на
большой
Wilson,
2011).
Результаты ранних исследований указывали
на то, что практически все функциональные
процессы в ядре эукариотической клетки,
включая
репликацию
и
транскрипцию,
Рис. 10. Роль ядерного матрикса в
поддержании структуры интерфазных
хромосом (модель). ДНК прикрепляется к
ядерному матриксу с образованием петель.
Сферами показаны белки ядерного матрикса,
белые участки – S/MAR-элементы.
происходят на поверхности нерастворимой в
высокосолевых растворах скелетной структуры. Более того, было обнаружено, что
геномная ДНК организована в замкнутые петли порядка 50-150 т.п.н., фиксированные на
этой скелетной структуре посредством участков начала репликации (Berezney et al., 1995;
Jackson and Cook, 1995; Razin et al., 1995) (рис. 10). Хотя никто не опровергал данных
наблюдений, их биологическая значимость была поставлена под вопрос (Martelli et al.,
1996; Martelli et al., 2002) главным образом по той причине, что белковый состав и
принципы организации ядерного матрикса/скелета не были охарактеризованы, несмотря
на многочисленные сообщения о выделении/визуализации этой структуры (см., к
примеру, (Barboro et al., 2009; Jackson and Cook, 1988; Philimonenko et al., 2001)). И тем не
менее, судя по последним публикациям, идея о существовании ядерного матрикса до сих
пор привлекает исследователей (Barboro et al., 2012; Wilson and Coverley, 2013).
В настоящее время активно обсуждается архитектурная роль некодирующих РНК в
организации ядра (Caudron-Herger and Rippe, 2012; Clemson et al., 2009; Kawaguchi and
Hirose, 2012). В этой связи интересно отметить, что ряд наблюдений свидетельствует об
участии РНК и в организации ядерного матрикса (Ioudinkova et al., 2005; Nickerson et al.,
88
1989). Переосмысление концепции ядерного матрикса с этой точки зрения может дать ей
новый виток развития. Любопытно, что SAF-A, белок ядерного матрикса, был также
идентифицирован как гетерогенный ядерный нуклеопротеин U (hnRNP U) (Fackelmayer et
al., 1994). Поначалу это обстоятельство поставило под сомнение приписывание данному
белку
роли
в
организации
структуры
ядерного
матрикса.
Однако
имеются
многочисленные примеры, когда один и тот же белок выполняет различные функции.
Действительно, было показано, что SAF-A/hnRNP-U вовлечен в регуляцию транскрипции
(Vizlin-Hodzic et al., 2011a; Vizlin-Hodzic et al., 2011b), в альтернативный сплайсинг (Xiao
et al., 2012), а также в позиционирование Xist-РНК на неактивной копии X-хромосомы в
клетках млекопитающих женского пола (Hasegawa et al., 2010; Hasegawa and Nakagawa,
2011). В последнем случае белок выполняет чисто архитектурную роль.
Важным результатом изучения ядерного матрикса и взаимодействий ДНК с
ядерным
матриксом
явилась
идентификация
так
называемых
S/MAR-элементов
(scaffold/matrix attachment regions), участков связывания ДНК c каркасом/матриксом (Bode
et al., 1995; Cockerill and Garrard, 1986; Liebich et al., 2002; Mirkovitch et al., 1984), и
белков, связывающихся с этими элементами (Wang et al., 2010). Независимо от роли
ядерного матрикса в пространственной организации ДНК, S/MAR-элементы и S/MARсвязывающие
белки
представляются
важными
структурными
элементами
эукариотических хромосом. Известно, например, что со S/MAR-элементами связываются
ламины A и B (Luderus et al., 1994). Таким образом, S/MAR-элементы могут играть
важную роль в удержании специфических генов и хроматиновых доменов на периферии
ядра (см. следующий раздел). Ламины также обнаруживаются во внутренних областях
ядра (Dechat et al., 2010; Shumaker et al., 2003), где структурно связаны с белком NuMA
(Radulescu and Cleveland, 2010), который также обладает свойством связываться со
S/MAR-элементами in vitro. Принимая во внимание способность ламинов и NuMA к
89
димеризации с образованием филаментоподобных структур, можно предположить, что
связывание S/MAR-элементов с этими белками поддерживает целостность хромосомных
территорий и участвует в организации петель ДНК. Другим S/MAR-связывающим белком,
опосредующим выпетливание ДНК, является SATB1 (special AT-rich sequence binding 1) белок, связывающийся со специфическими АТ-богатыми последовательностями (Cai et al.,
2003). Этот белок модулирует крупномасштабную организацию хроматина путем
формирования петель ДНК, стабилизируемых взаимодействием S/MAR-элементов (Cai et
al., 2006; Gong et al., 2011; Wang et al., 2009), и направлением генов в специфические
ядерные компартменты (Kumar et al., 2007) и, таким образом, играет важную роль в
регуляции транскрипции. Нуклеолин, один из мажорных белков ядрышка, участвующий в
регуляции транскрипции и ремоделировании хроматина (Mongelard and Bouvet, 2007),
также характеризуется S/MAR-связывающей активностью (Dickinson and KohwiShigematsu, 1995). Примечательно, что связывание белков со S/MAR-элементами
определяется физическими свойствами этих участков ДНК, а не специфической
нуклеотидной последовательностью (Benham et al., 1997; Luderus et al., 1994). Таким
образом, различные S/MAR-связывающие белки могут конкурировать между собой за
один и тот же участок связывания, что предполагает возможность регуляции
выпетливания,
опосредуемого
STAB1
или
ламинами,
путем
исключения
из
взаимодействия S/MAR-элементов, связанных с другими белками.
I.3.3 ЛАМИНО- И ЯДРЫШКО-АССОЦИИРОВАННЫЕ ДОМЕНЫ
Еще один класс геномных участков, взаимодействующих с относительно стабильными
ядерными структурами, составляют ламино-ассоциированные домены (lamina-associated
domain, LAD). Ядерная ламина покрывает нуклеоплазматическую часть внутренней
ядерной мембраны и состоит из белков ламинов, которые формируют длинные
90
полимерные структуры (см. рис. 9) (Burke and Stewart, 2013; Prokocimer et al., 2009). Карты
взаимодействия генома с ядерной ламиной предоставляют информацию об общей
пространственной организации интерфазных хромосом. С использованием технологии
DamID в клетках млекопитающих было идентифицировано около 1300 ламиноассоциированных доменов, контактирующих с ламином B1 (Guelen et al., 2008). Эти
довольно протяженные домены покрывают суммарно около 40% генома, а их длина
варьирует от 100 т.п.н. до 10 млн п.н. (средний размер 0.5 млн п.н.) (см. рис. 9). Контакты
с ядерной ламиной в части своей тканеспецифичны {Peric-Hupkes, 2010). Доменный
характер взаимодействий с ядерной ламиной наблюдается также у мух и червей (Gerstein
et al., 2010; Pickersgill et al., 2006; van Bemmel et al., 2010). Большинство генов,
локализованных в ламино-ассоциированных доменах, транскрипционно неактивны, что
свидетельствует о том, что ядерная ламина – это репрессивная зона ядра (Gerstein et al.,
2010; Guelen et al., 2008; Peric-Hupkes et al., 2010; Pickersgill et al., 2006; van Bemmel et al.,
2010). Действительно, искусственное закрепление локуса на ядерной ламине или
внутренней ядерной мембране приводит к снижению его транскрипционной активности
(Finlan et al., 2008; Reddy et al., 2008), хотя и не во всех случаях (Kumaran and Spector,
2008).
Механизмы, обеспечивающие направление ламино-ассоциированных доменов на
ядерную ламину и удерживание на ней, остаются плохо изученными. Возможно, что
определенную роль здесь играют ассоциированные с ядерной ламиной ДНК-связывающие
белки, узнающие специфические нуклеотидные последовательности. В недавнем
исследовании, проведенном на клетках человека, показано, что повторы типа (GA)n могут
направлять определенные ламино-ассоциированные домены к ядерной ламине (Zullo et al.,
2012). Однако систематический анализ в масштабе всего генома не выявил обогащения
ламино-ассоциированных доменов (GA)n-повторами (Guelen et al., 2008), свидетельствуя о
91
том, что механизм «заякоривания» с использованием этих повторов не является
универсальным. У млекопитающих конститутивные ламино-ассоциированные домены
(т.е. инвариантные в клетках различного типа) характеризуются высокой степенью
перекрытия с А/Т-богатыми изохорами (Meuleman et al., 2013), что указывает на
возможную роль А/Т-богатых участков ДНК в закреплении сегментов генома на ядерной
ламине. На модели C.elegance было показано, что гистон-метилтрансферазы MET-2 и
SET-25, осуществляющие метилирование 9-го остатка лизина гистона H3, кооперативно
обеспечивают периферическую локализацию и сайленсинг трансгенных повторов (Towbin
et al., 2012). «Нокаут» генов обоих ферментов приводил к частичной утрате контактов с
ядерной ламиной в масштабе всего генома. Таким образом, взаимодействие участков
генома
с
ядерной
ламиной
может
направляться
как
специфическими
последовательностями ДНК, так и хроматиновыми модификациями.
Ядрышко также представляет собой платформу для пространственной организации
генома. Двумя группами исследователей проанализирована фракция ДНК, которую
можно было выделить вместе с ядрышками при их очистке (Nemeth et al., 2010; van
Koningsbruggen et al., 2010). Кроме ожидаемых локусов генов рРНК, в этой фракции были
обнаружены участки практически со всех хромосом. Эти участки, названные ядрышкоассоциированными
доменами
(nucleolus-associated
domains,
NAD)
(см.
рис.9),
преимущественно содержат репрессированные гены и обогащены репрессивными
хроматиновыми модификациями, в частности, триметилированием гистона H3 по 9-ому
остатку лизина.
Неожиданным оказалось существенное перекрывание ламино- и ядрышкоассоциированных доменов (Nemeth et al., 2010; van Koningsbruggen et al., 2010), хотя
результаты проведенного к настоящему времени анализа основаны на сравнении данных
для клеток различного типа. Возможно, что ламино- и ядрышко-ассоциированные
92
домены, по крайней мере частично, состоят из одного типа репрессированного хроматина,
который распределяется более или менее случайным образом между ламиной и
ядрышком. Эта модель подкрепляется данными микроскопии, показывающими, что
некоторые участки хромосом, которые ассоциированы с ядрышком в материнской клетке,
могут перемещаться на периферию ядра в дочерних клетках после митоза (Thomson et al.,
2004; van Koningsbruggen et al., 2010).
Полногеномные
методологии
предоставляют
исследователям
возможность
всестороннего исследования компартментализации генома – от анализа линейного
распределения белков вдоль хромосом до построения трехмерных моделей отдельных
геномных доменов и целых геномов. Необходимо, однако, отметить, что доступные в
настоящее время техники картирования оперируют с тысячами и миллионами клеток и на
выходе продуцируют лишь усредненную картину по клеточной популяции. Большинство
микроскопических исследований и, косвенно, данные HiC-анализа свидетельствуют о том,
что специфические удаленные взаимодействия происходят только в небольшой доле
клеток в данный момент времени (Lieberman-Aiden et al., 2009; Schoenfelder et al., 2010b;
Simonis et al., 2006). Наше понимание природы хроматиновых доменов, таким образом,
должно быть размыто подобной усредненной картиной. Не ясно, например, покрывает ли
белок соответствующий хроматиновый домен в каждой клетке, представленной в
популяции, или только в доле клеток, а в отдельной клетке – домен целиком или только
частично. В своем недавнем исследовании Фразер и соавт. показали, что индивидуальные
хромосомы имеют схожую доменную организацию в масштабе млн п.н., тогда как
хромосомные структуры более высокого порядка демонстрируют межклеточные вариации
(Nagano et al., 2013).
93
I.3.4 ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ЯДЕРНЫЕ КОМПАРТМЕНТЫ
Ядерные
компартменты,
несомненно,
являются
«горячей
темой»
в
изучении
эукариотического генома и его активности. Устройство ядерных компартментов и их
функциональная роль подробно обсуждены в нескольких обзорах (Bernardi and Pandolfi,
2007; Dundr, 2012; Mao et al., 2011b; Nizami et al., 2010; Spector and Lamond, 2011). Для нас
представляется
важным
коснуться
возможной
роли
ядерных
компартментов
в
пространственной организации хромосом и роли хромосом в позиционировании ядерных
компартментов. С этой точки зрения, все ядерные компартменты уместно подразделить на
две категории: те, которые содержат ДНК в своем составе, и те, которые не содержат
ДНК, но способны формироваться вблизи некоторых геномных локусов (как, например,
тельца гистоновых локусов) или привлекать некоторые геномные локусы (как тельца
Кахаля и спеклы).
I.3.4.1 Ядерные компартменты (тельца), содержащие ДНК
I.3.4.1.1 Репликационные фабрики
О репликационных фабриках известно довольно мало. Твердо установлено, что на всех
стадиях S-фазы репликация протекает в ограниченном числе ядерных компартментов,
названных фокусами репликации (Fox et al., 1991; Hassan and Cook, 1993; Ma et al., 1998;
Nakamura et al., 1986; Nakayasu and Berezney, 1989). В начале S-фазы число одновременно
работающих фабрик репликации достигает ~1500 (Cseresnyes et al., 2009). Эксперименты
по импульсному мечению показывают, что репликационные вилки концентрируются в
центре репликационных фокусов (Philimonenko et al., 2004). Создается впечатление, что
реплицирующаяся ДНК «протаскивается» через иммобилизованные (неподвижные)
репликационные комплексы: импульсно-меченная ДНК постепенно смещается на
периферию репликационных фокусов (Cook, 1999; Kitamura et al., 2006; Philimonenko et
94
al., 2004). Некоторые авторы проводят параллель между репликационными фокусами,
глобулярными
доменами,
визуализированными
в
интерфазных
хромосомах,
и
топологически-ассоциированными доменами (Bickmore, 2013; Bickmore and van Steensel,
2013; Ma et al., 1998; Sanyal et al., 2011; Schermelleh et al., 2001; Wu et al., 2005). Показано,
что репликационные фокусы – это стабильные структурные единицы интерфазных
хромосом, сохраняющиеся в ряду последовательных клеточных делений (Jackson and
Pombo, 1998; Sadoni et al., 2004). П. Куком и соавт. представлена работа по визуализации
репликационных фабрик в ядрах после удаления хроматина, выполненная с применением
электронной микроскопии (Hozak et al., 1993). Было установлено, что фабрики включают
~40 репликационных вилок и представляют собой плотные тельца диаметром 100-300 нм
(Hozak and Cook, 1994; Hozak et al., 1993; Hozak et al., 1994b). Размер репликационных
фабрик увеличивался по ходу S-фазы (Hozak and Cook, 1994; Hozak et al., 1994b). Хотя об
этих наблюдениях было сообщено более 20 лет назад, они ни разу не были повторены в
независимых исследованиях, и не понятно, сохраняются ли репликационные фабрики
(кластеры репликационных комплексов) в отсутствие репликации. Какова бы ни была
структура репликационных фабрик, ясно, что каждый фокус репликации – это
хромосомный
домен,
содержащий
несколько
репликонов.
Вероятно,
репликоны
располагаются близко друг к другу в линейной последовательности ДНК. Поэтому
маловероятно, что репликационные фабрики участвуют в создании «ландшафта»
интерфазной хромосомы посредством установления дальних контактов между участками
генома, расположенными на значительном расстоянии друг от друга (более 1 млн п.н.).
I.3.4.1.2 Транскрипционные фабрики
Аналогично репликации, транскрипция осуществляется в ограниченном числе мест в
ядре, о чем свидетельствует распределение в виде фокусов фосфорилированной
(активной) формы РНК полимеразы II и меченых нуклеотидов, инкорпорированных в
95
новосинтезированную РНК (Carter et al., 2008; Papantonis and Cook, 2011; Razin et al., 2011;
Sutherland and Bickmore, 2009). Число таких мест заметно меньше числа генов,
транкрибирующихся в
каждый момент времени, в соответствии с чем было
предположено, что каждая фабрика вмещает нескольких генов и осуществляет их
скоординированную транскрипцию. Все три типа эукариотической РНК-полимеразы
организованы в отдельные транскрипционные фабрики (Bregman et al., 1995; Hozak et al.,
1994a; Iborra et al., 1996; Pombo et al., 1999). Рибосомные гены транскрибируются в
ядрышках, в которых РНК-полимераза I и ее кофакторы кластеризуются в небольших
(200-500 нм) фибриллярных центрах. В ходе транскрипции рДНК скользит по
поверхности фибриллярных центров, в то время как новосинтезированные транскрипты
высвобождаются в прилегающий плотный фибриллярный компонент (Hozak et al., 1994a).
Транскрипционные фабрики, несущие РНК-полимеразу II, представляют для нас особый
интерес. По данным иммуно-электронной микроскопии, средний размер этих фабрик
равен ~ 70-80 нм (Iborra et al., 1996), и каждая из них содержит до 30 молекул
элонгирующей РНК-полимеразы II и новосинтезированных транскриптов (Iborra et al.,
1996; Jackson et al., 1998). Согласно исследованиям других авторов, на фабрику
приходится в среднем по 8 полимераз (Mitchell and Fraser, 2008). При этом перемещение
гена к существующим транскрипционным фабрикам считается важным этапом в
активации транскрипции, и эта стадия может контролироваться особыми регуляторными
системами (Deng et al., 2013; Osborne et al., 2004; Osborne et al., 2007; Papantonis and Cook,
2013; Ragoczy et al., 2006; Sutherland and Bickmore, 2009). Однако природа этих
регуляторных
механизмов
тканеспецифичные
гены
остается
не
выясненной.
транскрибируются
в
Было
составе
предположено,
что
специализированных
транскрипционных фабрик, содержащих необходимые тканеспецифичные факторы
транскрипции (Bartlett et al., 2006; Kolovos et al., 2012; Xu and Cook, 2008). Заметим,
96
однако, что имеющиеся экспериментальные данные не вполне укладываются в модель
специализированных транскрипционных фабрик. Например, для эритроидных клеток
была выявлена предпочтительная ассоциация эритроидспецифичных генов в фабриках,
содержащих транскрипционный фактор EKLF (Schoenfelder et al., 2010b). Однако данная
закономерность
выполнялась
только
для
пар
эритроидспецифичных
генов.
Предпочтительной ассоциации более двух эритроидспецифичных генов в одной
транскрипционной фабрике не обнаружено (Schoenfelder et al., 2010b). С учетом того, что
транскрипционная фабрика содержит до 30 молекул элонгирующей РНК-полимеразы II и
ассоциированные транскрипты (Iborra et al., 1996; Jackson et al., 1998), можно
предположить, что так называемые специализированные транскрипционные фабрики
заняты, по большей части, транскрибирующимися генами домашнего хозяйства. Хотя,
возможно, и существует некоторая предпочтительность в ассоциации с данной
транскрипционной фабрикой разнообразных генов, транскрибирующихся при участии
одного и того же набора транскрипционных факторов (Schoenfelder et al., 2010a;
Schoenfelder et al., 2010b), фактор пространственной близости в ядерном пространстве
может играть более важную роль в определении того, какие гены окажутся в общей
транскрипционной фабрике. В этой связи уместно отметить, что уровень ассоциации в
транскрипционных фабриках генов, лежащих на одной хромосоме и особенно на одном ее
плече, заметно превышает уровень ассоциации генов, расположенных на разных
хромосомах, независимо от их тканеспецифичности (Osborne et al., 2004; Schoenfelder et
al., 2010a; Schoenfelder et al., 2010b). Вероятность того, что гены будут локализованы в
общей транскрипционной фабрике, по всей видимости, определяется их ядерной позицией
и некоторыми свойствами хроматиновой фибриллы. Ситуация, когда гены с разных
хромосом
проявляют
повышенную
частоту
колокализации, представляет
скорее
исключение из правила и зависит, вероятно, от специфической пространственной
97
архитектуры хромосомных территорий в клетках данного типа (Osborne et al., 2007). Хотя
некоторые результаты свидетельствуют в пользу того, что транскрипционные фабрики
существуют в отсутствие транскрипции (Mitchell and Fraser, 2008), эти результаты трудно
назвать
убедительными.
Действительно,
условия
подавления
транскрипции,
использованные в указанной работе, не обеспечивают диссоциации элонгирующих
комплексов РНК-полимеразы II. Вполне возможно, что уже собранные преинициаторные
или
элонгирующие
комплексы
РНК-полимеразы
II
удерживаются
вместе
под
воздействием сил, возникающих в условиях макромолекулярного скопления (см. рис. 8)
(Marenduzzo et al., 2006a; Marenduzzo et al., 2006b). Данный контакт возможен до тех пор,
пока крупные белковые комплексы не распадутся.
В заключение отметим, что существует точка зрения, что бóльшая часть
транскрипции в клеточном ядре рассредоточена по околохроматиновому пространству и
что одновременная транскрипция нескольких генов в общей транскрипционной фабрике
является скорее исключением, чем правилом (Cremer and Cremer, 2010). Таким образом,
вопрос об универсальности механизма транскрипции на базе транскрипционных фабрик
остается открытым.
I.3.4.1.3 Polycomb-тельца
Polycomb-тельца
–
репрессивные
ядерные
компартменты,
иногда
называемые
«репрессионными хабами» (repressive hubs), – наиболее хорошо изучены на модели
дрозофилы (см. рис. 9) (Pirrotta and Li, 2012). Хотя термин «Polycomb-тельца» широко
используется в литературе, попытки визуализировать их с помощью коррелятивной светоэлектронной микроскопии не увенчались успехом (Smigova et al., 2011). Комплексы
белков Polycomb, сконцентрированные в ограниченной области ядерного пространства,
могут быть визуализированы с помощью иммунофлуоресценции, однако они не выглядят
как отдельные ядерные тельца, скорее, как части обособленного гетерохроматина. Часто
98
Polycomb-тельца рассматриваются как агрегаты репрессивных комплексов белков
Polycomb, связанных с ДНК (Bantignies et al., 2011; Lanzuolo et al., 2007). Однако недавние
исследования, проведенные в лабораториях В. Пиротты и Д. Кавалли, свидетельствуют о
том, что ассоциации ДНК с комплексами Polycomb недостаточно для привлечения
соответствующих геномных участков к Polycomb-тельцам (Li et al., 2011a; Li et al., 2013).
Существенную
роль
в
этом
процессе
играют
инсуляторы
и,
в
особенности,
ассоциированный с этими геномными элементами белок CTCF (Comet et al., 2006; Li et al.,
2011a; Li et al., 2013). Напротив, линейный эррей генов, связанных с белками Polycomb,
способен сам по себе формировать Polycomb-тельца (Li et al., 2011a; Li et al., 2013). Как и
в случае взаимодействий между удаленными регуляторными элементами генома,
организация хромосом в форме хромосомных территорий накладывает определенные
ограничения на пространственное взаимодействие между мишенями белков Polycomb.
Это
взаимодействие
происходит
преимущественно
между
участками
ДНК,
расположенными в пределах одного хромосомного плеча (Tolhuis et al., 2011). Отметим,
что Polycomb-тельца являются крайне динамичными образованиями. Характер генных
контактов в Polycomb-тельцах отличается в разных клетках (Grimaud et al., 2006; Li et al.,
2011a). Скорость обмена белков Polycomb в хроматине, в частности, в той его фракции,
что представлена в Polycomb-тельцах, очень высока (Ficz et al., 2005; Hernandez-Munoz et
al., 2005). Таким образом, наличие Polycomb-телец в данном ядре или данной области
ядерного пространства контролируется динамическим равновесием между процессами
сборки и разборки этого ядерного компартмента.
I.3.4.1.4 Инсуляторные тельца
Показано, что некоторые важные для функционирования инсуляторов белки дрозофилы
скапливаются в ядре в виде фокусов (Gerasimova and Corces, 1998). Именно эти фокусы
были названы инсуляторными тельцами (см. рис.9) (Labrador and Corces, 2002). Хотя
99
подобное распределение инсуляторных белков было описано в работах многих научных
коллективов (Gerasimova et al., 2000; Golovnin et al., 2012; Pai et al., 2004), его
функциональное значение остается неясным. Ранее полагали, что ассоциация инсуляторов
(т.е. комплексов инсуляторных белков с соответствующими участками ДНК) в
инсуляторных тельцах прямо связана с функцией этих регуляторных элементов генома
(Byrd and Corces, 2003; Gerasimova et al., 2000). Однако впоследствии было установлено,
что сборка инсуляторных телец не существенна для функционирования инсуляторов
(Golovnin et al., 2008). Было предположено, что инсуляторные тельца представляют собой
«депо» для хранения инсуляторных белков в ядре (Golovnin et al., 2008).
I.3.4.2 Ядерные компартменты (тельца), не содержащие ДНК
Сложно сказать, сколько функциональных компартментов, в состав которых не входит
ДНК, существует в ядре. В действительности, многие ядерные белки демонстрируют
«фокусное» (т.е. негомогенное) распределение в ядре, по крайней мере, в некоторых типах
клеток (Caslini et al., 2000; Kantidze et al., 2007; Kazansky et al., 1999; Piwien Pilipuk et al.,
2003). Однако наиболее важные компартменты (PML-тельца, тельца Кахаля, спеклы и
некоторые другие) достаточно крупные. Они были идентифицированы с помощью
оптической
и
электронной
микроскопии
задолго
до
появления
методов
иммуноокрашивания (подробно обсуждено в обзорах (Dundr, 2012; Mao et al., 2011b;
Sleeman
and
Trinkle-Mulcahy,
2014)).
Эти
компартменты
локализованы
в
межхроматиновом домене (Cremer and Cremer, 2001; Cremer et al., 2006; Richter et al.,
2005), и многие из них вовлечены в метаболизм первичных транскриптов (сплайсинг,
процессинг концов, посттранскрипционные модификации РНК, сборка ядерных РНПчастиц и др.). Интересно заметить, что большинство из этих компартментов может
содержать различный набор белков и отличается мультифункциональностью, т.е.
100
способностью проявлять ферментативную активность, характерную для различных,
зачастую не связанных, процессов (Dundr, 2012). Хотя показано, что многие белки,
концентрирующиеся в различных ядерных компартментах, важны для клеточного
выживания, необходимость формирования скоплений этих белков для жизни клетки
ставится под сомнение рядом экспериментальных наблюдений (см. далее). Также
заслуживает внимания тот факт, что некоторые компартменты представлены только в
клетках определенного типа (например, в раковых или быстро делящихся клетках). Число
компартментов определенного типа варьирует в индивидуальных клетках. Ниже будут
просуммированы сведения о наиболее хорошо изученных ядерных компартментах, не
содержащих ДНК в своем составе.
I.3.4.2.1 PML-тельца
PML-тельца (также известные как ND10-тельца или тельца Кремера) могут быть
визуализованы путем окраски антителами, узнающими белок PML (транслокации в гене
этого белка оказались вовлеченными в развитие промиелоцитарного лейкоза). PML-тельца
имеют сферическую форму и варьируют в диаметре от 0.1 до 1 мкм (см. рис. 9). Кроме
белка PML, служащего, по-видимому, платформой для сборки этих ядерных телец (Ishov
et al., 1999; Lallemand-Breitenbach et al., 2001), в их состав входит более 100 разнообразных
белков, в качестве единственного общего свойства которых выделяют способность
выступать в качестве мишени для сумоилирования (Bernardi and Pandolfi, 2007). PMLтельца участвуют в антивирусном иммунном ответе, репарации ДНК, подавлении роста
опухолей, регуляции экспрессии генов, протеолизе, укорачивании длины теломер,
контроле клеточного цикла, старении и апоптозе (Bernardi and Pandolfi, 2007; Dellaire and
Bazett-Jones, 2004; Krieghoff-Henning and Hofmann, 2008; Sanchez-Pulido et al., 2007).
Установлено, что PML-тельца контактируют с определенными геномными локусами, что
имеет тканеспецифичный характер (Shiels et al., 2001; Sun et al., 2003; Wang et al., 2004).
101
Если принять во внимание многообразие функций, приписываемых PML-тельцам
(Lallemand-Breitenbach and de The), то не удивительно, что они неоднородны по своему
составу. Ассоциация PML с различными наборами белков может приводить к
формированию различных PML-телец (Eskiw et al., 2003). Также необходимо отметить,
что бóльшая часть белка PML находится в ядре в диффузной форме, т.е. не сосредоточена
в PML-тельцах (Lallemand-Breitenbach et al., 2001). PML-тельца часто разрушаются в ходе
вирусной инфекции (Burkham et al., 1998; Kelly et al., 1995; Sivachandran et al., 2012) и в
условиях стресса (Dellaire and Bazett-Jones, 2004; Dellaire et al., 2006; Eskiw et al., 2003).
I.3.4.2.2 Тельца Кахаля и тельца гистоновых локусов
Тельца Кахаля – ядерные компартменты, имеющие различную форму и копийность на
ядро (см. рис. 9). Наиболее важная функция из числа приписываемых им – модификация
малых ядерных РНК (мяРНК) и малых ядрышковых РНК (мякРНК), а также сборка
соответствующих РНП (Dundr, 2012; Nizami et al., 2010). Кроме того, тельца Кахаля
содержат факторы, обеспечивающие процессинг 3’-концов гистоновых и других не
содержащих поли-А пре-мРНК, и факторы, поддерживающие целостность теломер. В
культивируемых клетках тельца Кахаля ассоциированы с транскрибируемыми генами
мяРНК, что осуществляется, видимо, благодаря связыванию с новообразующимися
транскриптами (Frey et al., 1999; Smith et al., 1995; Smith and Lawrence, 2000). Участие
телец
Кахаля
в
процессинге
неполиаденилированных
3’-концов
транскриптов
связано
мяРНК
с
и
некоторых
присутствием
в
их
других
составе
мультибелкового комплекса Integrator (Takata et al., 2012). Показано, что в тельцах Кахаля
аккумулируется теломераза (Cristofari et al., 2007; Venteicher et al., 2009). По всей
видимости, тельца Кахаля участвуют в доставке теломеразы к теломерам (Stern et al.,
2012).
102
Тельца гистоновых локусов очень сходны по составу с тельцами Кахаля. В
частности, эти компартменты содержат коилин, считающийся характерным компонентом
телец Кахаля. Тельца гистоновых локусов собираются вокруг активно транскрибируемых
генов гистонов, однако их функция не связана с регуляцией активности этих генов.
Основная их функция – процессинг 3’-концов гистоновых мРНК (Marzluff, 2005; Nizami et
al., 2010). В ооцитах земноводных тельца гистоновых локусов и тельца Кахаля
практически не различимы – за тем лишь исключением, что первые ассоциированы с
гистоновыми генами, тогда как вторые свободно взвешены в нуклеоплазме (Marzluff,
2005; Wu and Gall, 1993). Принимая во внимание тот факт, что тельца гистоновых локусов
содержат белки и РНП, принимающие участие в процессинге 3’-концов гистоновых мРНК
(Mxc, FLASH, Mute и U7 мяРНП), можно было ожидать, что сам субстрат этих процессов
(непроцессированная гистоновая мРНК) служит центром нуклеации сборки этих телец.
Вопреки такому предположению было продемонстрировано, что короткий регуляторный
элемент ДНК, локализованный в двунаправленном промоторе H3- и H4-гистоновых генов,
достаточен для индукции сборки минимальных телец гистоновых локусов (так
называемых
прототелец,
содержащих
только
часть
белков,
представленных
в
полноценных тельцах). Эта сборка осуществляется даже в отсутствии транскрипции
гистоновых генов (Salzler et al., 2013). Однако, согласно другому исследованию,
направленному на изучение сборки ядерных телец de novo, привлечение различных
компонентов телец Кахаля (будь то структурные компоненты, такие как коилин, или
функциональные компоненты, такие как мякРНП или специфичные для телец Кахаля
мяРНК) к определенным участкам хроматина является необходимым условием для начала
сборки функционально способных телец Кахаля (Kaiser et al., 2008).
Хотя белки, содержащиеся в тельцах Кахаля и тельцах гистоновых локусов, важны
для
клеточного
выживания,
необходимость
концентрирования
этих
белков
в
103
определенных ядерных компартментах для выполнения ими своих функций не вполне
ясна. Прежде всего это следует из того, что в быстро пролиферирующих клетках тельца
Кахаля выявляются не во всех клетках (Hao le et al., 2007). В ядрах некоторых
дифференцированных клеток из тканей взрослых организмов тельца Кахаля отсутствуют
вовсе (Young et al., 2000). Число телец Кахаля в ядре, судя по всему, коррелирует с
интенсивностью биогенеза мяРНП (Lemm et al., 2006; Sleeman et al., 2001). Интересно, что
мутация в гене, кодирующем коилин – основной структурный компонент телец Кахаля, –
не летальна у мух (Liu et al., 2009). Такие мутанты, хотя у них не выявляются тельца
Кахаля, остаются фертильными, и в их клетках мяРНК подвергаются модификациям,
которые в норме осуществляются в тельцах Кахаля (Deryusheva and Gall, 2009). В
культивируемых клетках, полученных из тканей мышей с нуль-мутацией гена коилина,
детектируются так называемые остаточные тельца Кахаля, содержащие различные наборы
белков, которые представлены в нормальных тельцах Кахаля (Jady et al., 2003; Tucker et
al., 2001). Более того, в некоторых клетках выявлены особые компартменты, содержащие
специфичные для телец Кахаля белки, например белок SMN (от англ. Survival Motor
Neuron), способствующий выживанию моторных нейронов (Carvalho et al., 1999; Matera
and Frey, 1998). В некоторых случаях он аккумулируется в специфических компартментах,
именуемых «близнецами» телец Кахаля (Liu and Dreyfuss, 1996; Malatesta et al., 2004).
Многие белки, описанные как компоненты телец Кахаля, представлены также в PMLтельцах и ядрышках (Machyna et al., 2013).
I.3.4.2.3 Ядерные спеклы
Ядерные спеклы – специфичные компартменты, содержащие компоненты аппарата
сплайсинга (различные мяРНК, белок SC35 и другие компоненты сплайсосомы). Эти
компартменты прежде были известны как кластеры интерхроматиновых гранул (Spector et
al., 1991; Spector et al., 1983) или SC35-домены (Wansink et al., 1993). Спеклы
104
локализованы в межхроматиновом домене (Cremer and Cremer, 2001; Cremer et al., 2006) и
имеют неправильную форму и различные размеры (см. рис.9) (Lamond and Spector, 2003;
Thiry, 1995; Wansink et al., 1993). Характер распределения спеклов зависит от
транскрипционного
статуса
клеток.
При
анализе
протеома
ядерных
спеклов
идентифицировано около 150 белков с известной функцией, 80% из которых связаны с
посттранскрипционными модификациями РНК (Mintz et al., 1999; Saitoh et al., 2004).
Кроме того, в составе спеклов обнаружены ламины, различные транскрипционные
факторы и белки, вовлеченные в экспорт мРНК (Dostie et al., 2000; Jagatheesan et al., 1999;
Zeng et al., 1997). Большинство авторов считают спеклы местами временного хранения
компонентов аппарата сплайсинга (Lamond and Spector, 2003; Misteli et al., 1997; Spector
and Lamond, 2011). Однако разрушение спеклов супрессирует сплайсинг (Sacco-Bubulya
and Spector, 2002), а это предполагает, что спеклы – это не просто хранилища факторов
сплайсинга, а, скорее, реакционные центры, в которых происходит созревание и сборка
рибонуклеопротеиновых комплексов, принимающих участие в сплайсинге. Согласно
современным представлениям, сплайсинг происходит ко-транскрипционно и, таким
образом,
должен
осуществляться
в
околохроматиновом
пространстве.
Однако
определенные активно транскрибирующиеся гены располагаются вблизи ядерных спеклов
(Brown et al., 2008; Huang and Spector, 1991; Moen et al., 2004; Shopland et al., 2003;
Szczerbal and Bridger, 2010). Было предположено, что такая локализация облегчает
привлечение факторов сплайсинга к активно транскрибирующимся генам. Следовательно,
ядерные
спеклы
могут
играть
важную
роль
в
пространственной
организации
эухроматиновых областей (Shopland et al., 2003). Некоторые авторы считают ядерные
спеклы реакционными центрами («хабами»), в которых осуществляется координация
транскрипции, сплайсинга и экспорта мРНК. Предложена также модель, согласно которой
гены привлекаются к спеклам, рядом с их поверхностью или внутри спеклов
105
осуществляется транскрипция и
сплайсинг, после чего
мРНК проходит
через
пространство внутри спекла и направляется в цитоплазму (Hall et al., 2006).
I.4
ВЗАИМОСВЯЗЬ МЕЖДУ КОМПАРТМЕНТАЛИЗАЦИЕЙ ЯДРА И
ПРОСТРАНСТВЕННОЙ ОРГАНИЗАЦИЕЙ ХРОМОСОМ
Очевидно,
что
функциональная организация клеточного
ядра тесно связана с
пространственной организацией генома (Cavalli and Misteli, 2013; Lanctot et al., 2007;
Misteli, 2007; Schneider and Grosschedl, 2007). Многие исследователи полагают, что
привлечение ДНК к транскрипционным фабрикам является важным фактором,
определяющим
форму
интерфазных
хромосом,
и
даже
средством
установки
межхромосомных контактов (Cook, 2010; Deng et al., 2013; Osborne et al., 2007; Papantonis
and Cook, 2013; Schoenfelder et al., 2010b; Sexton et al., 2007; Sutherland and Bickmore,
2009). Ранее уже отмечалось, что аналогичную роль могут играть и другие компартменты,
которые не содержат ДНК, но способны привлекать определенные гены (PML-тельца,
ядерные спеклы) (Brown et al., 2008; Huang and Spector, 1991; Moen et al., 2004; Shiels et al.,
2001; Shopland et al., 2003; Sun et al., 2003; Szczerbal and Bridger, 2010; Wang et al., 2004).
Некоторое время назад достаточно популярной была модель, постулирующая, что
позиционирование ядерных компартментов опосредуется привлечением их к ядерному
скелету (ядерному матриксу) (Berezney et al., 1995; van Driel et al., 1995). Будучи
закрепленными на такой устойчивой структуре, ядерные компартменты могли бы
выступать своеобразными ориентирами для позиционирования интерфазных хромосом и
хромосомных доменов. Несмотря на привлекательность подобной модели, необходимо
отметить, что имеющихся экспериментальных наблюдений явно недостаточно для вывода
модели из категории дискуссионных. Ядерный матрикс во многом остается иллюзорной
структурой, а существование этой структуры в живых клетках не доказано. Даже если
106
подобная структура и существует, потребуется еще немало усилий для того, чтобы
объяснить механизмы позиционирования ядерных компартментов. Единственный пример
заякоривания определенных хроматиновых доменов на позиционно устойчивой ядерной
структуре – взаимодействие участков ДНК с ядерной ламиной (см. рис.9). Эти
взаимодействия, вероятно, содействуют правильному радиальному позиционированию
неактивных и активных сегментов интерфазных хромосом. Однако внутри клеточного
ядра отсутствует филаментная структура, подобная цитоскелету. Более того, если ядерные
спеклы были охарактеризованы как достаточно стабильные структуры, в течение
нескольких часов не меняющие своего местоположения в ядре (Kruhlak et al., 2000; Misteli
et al., 1997), то PML-тельца и тельца Кахаля диффундируют в межхроматиновом
пространстве так же свободно, как искусственно созданный инертный объект тех же
размеров (Gorisch et al., 2004). Все больше и больше данных свидетельствуют о том, что
упорядоченная организация эукариотического ядра создается за счет сбалансированного
действия различных сил, включая, в частности, силы, возникающие в условиях
макромолекулярного скопления (см. рис. 8) (Cho and Kim, 2012; Hancock, 2004b;
Marenduzzo et al., 2006a; Rippe, 2007). Очевидно, что взаимодействие между различными
процессами, протекающими в ядре в данный момент времени, направляет и укладку
хромосом, и пространственную компартментализацию клеточного ядра (Hancock, 2004a;
Kim and Szleifer, 2014; Rippe, 2007).
Для построения целостной картины организации клеточного ядра необходимо
рассмотреть механизмы сборки ядерных компартментов. В этой связи уместно напомнить,
что все рассмотренные выше ядерные компартменты не обладают многими свойствами,
характерными для объектов, имеющих регулярную структуру. Они имеют различную
форму и размеры; различается количество копий того или иного компартмента в клетке; в
некоторых клетках они могут отсутствовать вообще, даже если это те же самые клетки,
107
культивируемые в одной чашке Петри. Компартменты одного типа (например, тельца
Кахаля или PML-тельца) могут содержать различные ансамбли белков и выполнять
разные, порою не связанные, функции. Большинство белков, находящихся в ядерных
тельцах, представлено также и в нуклеоплазме, и уровень обмена белков между
нуклеоплазмой и тельцами достаточно высок. В совокупности эти наблюдения указывают
на то, что в процессе сборки значительную роль играют стохастические процессы (Cho
and Kim, 2012; Matera et al., 2009; Rajendra et al., 2010).
Концентрация макромолекул в ядрах эукариотических клеток столь высока, что
процесс сборки ядерных компартментов может протекать по пути самоорганизации и
подчиняться законам, описывающим поведение макромолекул и их комплексов в
высоконцентрированных растворах (Cho and Kim, 2012; Hancock, 2004b; Marenduzzo et al.,
2006a). Как было разобрано выше, в таких условиях большие объекты проявляют
тенденцию к агрегации с образованием еще более крупных комплексов, поскольку это
создает дополнительное пространство для стохастически двигающихся мелких молекул
(см. рис. 8) (Cho and Kim, 2012; Ellis, 2001; Hancock, 2004a; Marenduzzo et al., 2006b;
Richter
et
al.,
2008).
Предполагается,
что
силы,
действующие
в
условиях
макромолекулярного скопления, играют важную роль в стабилизации ядерных
компартментов/телец, и это предположение получило экспериментальное подтверждение
(Hancock, 2004a, b). В связи с этим, некоторые авторы расценивают ядерные тельца как
транзиентные, выгодные по энтропийному фактору макромолекулярные комплексы в
«перенаселенном» (переполненном молекулами) ядерном пространстве (Finan et al., 2011;
Rippe, 2007). Было даже предположено, что сами ядерные тельца не играют никакой роли
– существенны лишь ферменты и белки, представленные в них (Hancock, 2014).
Действительно, согласно нескольким наблюдениям, разрушение ядерных телец в
результате «нокаута» важнейших структурных компонентов (таких как коилин в случае
108
телец Кахаля (Deryusheva and Gall, 2009; Liu et al., 2009)) не сказывается на
жизнеспособности клеток при условии, что компоненты разрушенных телец остаются в
нуклеоплазме. Однако объединение в ядерных тельцах белков, участвующих в одном и
том же процессе, могло бы давать преимущество при каких-либо особых условиях
(быстрая пролиферация, стресс и т.п.). Эта возможность заслуживает дальнейшего
изучения.
Хотя
ядерные
тельца
обладают
некоторыми
свойствами
стохастических
конгломератов белков и их комплексов, наборы белков, представленные в ядерных
тельцах различного типа, перекрываются лишь частично. Действием сил в условиях
макромолекулярного
скопления
можно
объяснить
стабильность
крупных
макромолекулярных ансамблей, однако невозможно объяснить специфичность (или
частичную специфичность) их композиции. Можно предположить, что белки, собранные
в определенном ядерном компартменте, проявляют сродство либо друг к другу, либо к
некоему структурному компоненту, существенному для сборки компартментов этого
типа. Имеющиеся экспериментальные данные лучше всего согласуются со второй
возможностью (Hebert and Matera, 2000). Было установлено, что белки коилин и PML
необходимы для сборки телец Кахаля и PML-телец, соответственно (Ishov et al., 1999; Liu
et al., 2009), что согласуется с предположением о том, что эти белки представляют собой
платформу для сборки этих ядерных телец. Кроме того, в качестве платформы для сборки
могут выступать некодирующие РНК, как следует из исследований параспеклов (еще один
тип ядерных телец с неясной функцией) (Mao et al., 2011a). В других экспериментах было
показано, что иммобилизация различных компонентов телец Кахаля на заданном участке
хроматина инициирует сборку на нем полноценного тельца Кахаля (Kaiser et al., 2008). На
первый взгляд, это наблюдение поддерживает идею о том, что различные компоненты
телец Кахаля обладают аффинностью друг к другу. Однако, если все компоненты телец
109
Кахаля проявляют аффинность к коилину, любой из этих компонентов должен привлекать
коилин, который, в свою очередь, будет привлекать все остальные компоненты, что в
конце концов приведет к формированию полноценного тельца Кахаля. В литературе
можно найти описание несколько моделей, касающихся сборки ядерных телец:
последовательная
(упорядоченная)
сборка,
стохастическая
сборка
и
сборка,
начинающаяся с затравки («семечки»; от англ. «seeding») (Mao et al., 2011b; Sleeman and
Trinkle-Mulcahy,
2014).
Последняя
модель
наиболее
хорошо
согласуется
с
существующими экспериментальными данными. Эта модель постулирует, что должно
случиться особое, «затравочное», событие (подобное появлению центра кристаллизации в
растворах), которое инициирует сборку ядерного компартмента. Сама сборка при этом
проходит без особого порядка (Dundr, 2011; Mao et al., 2011b). Затравочное событие может
иметь отношение к функции, выполняемой ядерным компартментом. С использованием
техники заякоривания in vivo было показано, что аккумуляция в определенной зоне ядра
нескольких типов кодирующих и некодирующих РНК инициирует в этом месте сборку
различных ядерных компартментов, обслуживающих процесс созревания этих РНК
(Shevtsov and Dundr, 2011). Авторы данной работы заключили, что транскрипция является
движущей силой формирования ядерных телец. Соответственно, было предположено, что
первичные транскрипты выступают в качестве каркаса, вокруг которого формируются
основные типы ядерных телец (Carmo-Fonseca and Rino, 2011; Shevtsov and Dundr, 2011).
Для нас наиболее интересным представляется вопрос о том, как пространственная
организация интерфазных хромосом связана с функциональной компартментализацией
клеточного ядра. Хотя тезис о том, что укладка хромосом направляет ядерную
компартментализацию, на первый взгляд, противоречит тезису о том, что взаимодействие
геномных локусов с ядерными компартментами необходимо для создания специфической
архитектуры интерфазных хромосом, это не совсем так. В действительности, оба эти
110
Рис. 11. Формирование структуры хроматиновых доменов за счет привлечения локусов к ядерным
компартментам: (А) Схематическое представление взаимодействия трех локусов с определенным ядерным
компартментом (темный шестиугольник). (Б) При разборке компартмента локусы разъединяются, что
изменяет структуру хроматиновых доменов, которым принадлежат эти локусы.
тезиса в своем роде правильные. Хотя «базальная» компартментализация ядерного
пространства,
включая
формирование
межхроматинового
домена,
диктуется
территориальным принципом организации хромосом, взаимодействие индивидуальных
хромосомных локусов между собой, осуществляемое внутри или на поверхности ядерных
компартментов, играет важную роль в пространственной организации хромосом (рис. 11).
Бóльшая часть ядерного пространства занято хроматином. Если исходить из идеи об
отсутствии в ядре внутренней скелетной структуры, такой как ядерный матрикс, можно
предположить, что сама сеть хроматиновых фибрилл служит структурной основой для
ядерной компартментализации (Cavalli and Misteli, 2013; Lanctot et al., 2007; Misteli, 2007;
Schneider and Grosschedl, 2007). Сегрегацию интерфазных хромосом и, как следствие,
формирование хромосомных территорий (см. рис. 9) возможно объяснить на основании
физических свойств заряженных полимеров (Bohn and Heermann, 2010; Mateos-Langerak et
al., 2009; Rosa and Everaers, 2008; Tark-Dame et al., 2011). Менее ясно, чем обусловлено
наличие каналов внутри хромосомных территорий. Вероятно, что ключевую роль здесь
111
играет отталкивание между поверхностями топологических доменов. Поверхности
доменов могут быть более заряженными, чем их внутренние части. Такое асимметричное
распределение зарядов внутри топологических доменов может определяться тем, что
транскрипционно активные участки хроматина тяготеют к поверхности топологических
доменов, а такие участки, как известно, обогащены гиперацетилированными гистонами.
Отрицательный
положительно
заряд
на
ДНК
заряженными
частично
гистонами.
компенсируется
В
ассоциацией
транскрипционно
активных
ДНК
с
участках
положительный заряд гистонов снижен вследствие ацетилирования. По этой причине
поверхность
топологических
доменов
(где
преимущественно
локализованы
транскрипционно активные участки) должна нести больший отрицательный заряд, чем
внутренние регионы. Это может предотвращать перемешивание топологических доменов
и
обеспечивать
существование
внутрихромосомных
каналов.
В
совокупности,
рассмотренные выше факторы указывают на то, что общий «ландшафт» ядерной
компартментализации формируется, в большей степени, под действием физических сил
(Cook and Marenduzzo, 2009; Dorier and Stasiak, 2009; Kim and Szleifer, 2014; Rosa and
Everaers, 2008). Установившись после митоза, территориальная организация интерфазных
хромосом стабилизируется взаимодействием определенных участков с ядерной ламиной и
околоядрышковым компартментом. Ядрышко – это мажорный ядерный компартмент, и
его позиционирование в ядре, очевидно, диктуется пространственной организацией
хромосом,
несущих
гетерохроматиновых
активные
районов
ядрышкообразующие
различных
хромосом
регионы.
в
Закрепление
околоядрышковом
и
периферическом ядерных слоях (см. рис.9) приводит к формированию взаимосвязанных
хромосомных доменов, что создает структурную основу («хроматиновый каркас») для
ядерной
компартментализации.
Эти
хромосомные
домены
остаются
высоко
динамичными. Их структура может дополнительно модулироваться установкой меж- и
112
внутрихромосомных контактов. В данном случае «встреча» различных геномных локусов
в
функциональном
ядерном
компартменте
должна
играть
важную
роль.
Предположительно, компартменты начинают формироваться вокруг определенных
геномных участков в результате их функциональной активности (например, для
процессинга новосинтезированных транскриптов (Carmo-Fonseca and Rino, 2011; Shevtsov
and Dundr, 2011)). Микрокомпартменты, зарожденные в различных местах, могут затем
сливаться с образованием полноценных ядерных телец благодаря аффинности их
компонентов и действию сил, возникающих в условиях макромолекулярного скопления.
Соответственно, геномные регионы, ассоциированные с микрокомпартментами, будут
удерживаться в пространственной близости до тех пор, пока продолжаются процессы,
индуцировавшие сборку этих микрокомпартментов. Вероятность участия двух геномных
регионов в организации ядерного тельца определяется, прежде всего, их исходной
пространственной близостью, поскольку движение геномных локусов и связанных с ними
белковых комплексов происходит лишь локально и подчиняется законам броуновского
движения (Burnecki et al., 2012; Hajjoul et al., 2013; Kang et al., 2011; Marshall et al., 1997b;
Wiesmeijer et al., 2008). Хотя некоторые данные и свидетельствуют о возможности
активного транспорта геномных локусов и целых хромосомных территорий в
пространстве ядра при участии актин-миозиновых промоторов (Bridger, 2011; Chuang et
al., 2006; Dundr et al., 2007; Mehta et al., 2008; Rubtsov et al., 2008), универсальность
подобного механизма транспорта не очевидна.
Частота сближения регуляторных элементов в пределах или вблизи ядерных
компартментов
может
модулироваться
определенными
факторами,
как
было
предположено, например, для тканеспецифичных генов, привлекающихся к одной
транскрипционной фабрике (Kang et al., 2011; Schoenfelder et al., 2010b). В то же время,
ядерная организация в целом, равно как и совокупность контактов удаленных геномных
113
элементов (так называемый «интерактом»), крайне динамичны и стохастичны по своей
природе. Хромосомы могут принимать множество альтернативных конфигураций, о чем
свидетельствуют данные флуоресцентной гибридизации in situ (Rapkin et al., 2012;
Schoenfelder et al., 2010b) и HiC-анализа (Nagano et al., 2013). Ядерные компартменты
постоянно собираются и разбираются, о чем свидетельствует высокая скорость обмена их
составляющих (Misteli, 2001). Баланс между этими процессами контролируется
множеством факторов. Отсюда следует, что порядок в ядре эукариотической клетки, в
некоторой степени, иллюзорен. Он возникает из случайных событий и базируется на
непрерывном выборе между различными возможностями, позволяющими быстро
адаптировать функционирование генома к меняющимся условиям среды.
I.5
ЗАКЛЮЧИТЕЛЬНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ
Таким образом, материалы обзора литературы служат источниковой базой для выбора
методологии нашего исследования, интепретации полученных экспериментальных
данных, указывают пути для доработки существующих и создания новых методов
изучения пространственной организации генома, а в совокупности с результатами
проведенных исследований способствуют проверке устоявшихся представлений, схем и
гипотез, а также построению новых моделей, выдвижению новых гипотез, а
следовательно, к продвижению на пути раскрытия загадок живой природы.
114
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
II.1 РАБОТА С КЛЕТОЧНЫМ МАТЕРИАЛОМ
II.1.1 ВЕДЕНИЕ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР
Культуру куриных преэритробластов HD3 (клон А6 линии LSCC (Beug et al., 1979a; Beug
et al., 1979b)) растили в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM), содержащей
8% фетальной бычьей сыворотки, 2% куриной сыворотки, 100 ед./мл пенициллина и 100
мкг/мл стрептомицина. Куриные лимфоидные клетки линии DT40 (CRL-2111, ATCC)
растили в той же среде с добавлением 50 мкМ β-меркаптоэтанола. Культивирование
проводили при 37ºС в атмосфере, содержащей 5% СО2. Плотность клеточной суспензии
поддерживали в пределах 0.2–3.0 млн/мл.
II.1.2 ИНДУКЦИЯ ЭРИТРОИДНОЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ КЛЕТОК HD3
Индукцию терминальной эритроидной дифференцировки клеток HD3 осуществляли по
ранее отработанной методике (Gavrilov and Razin, 2008). Клетки наращивали до
концентрации 2–3 млн/мл, разводили до концентрации 0.8 млн/мл и инкубировали в
присутствии
10
мМ
HEPES
(pH
8.0)
и
20
мкМ
индуктора
iso-H-7
(1-(5-
Isoquinolinylsulfonyl)-3-methylpiperazine dihydrochloride, Fluka) при 42ºС в воздушной
атмосфере в течение 12 часов.
II.1.3 ВЫДЕЛЕНИЕ
ЭМБРИОНАЛЬНЫХ
ЭРИТРОИДНЫХ
КЛЕТОК
И
ФИБРОБЛАСТОВ КУР
Эритроциты выделяли из 3- и 9-дневных куриных эмбрионов. Яйца вскрывали и удаляли
эмбриональные оболочки, затем делали надрезы крупных кровеносных сосудов. Кровь с
115
примесью белка собирали в пробирки со средой DMEM. Клетки осаждали 5 минут при
400g и комнатной температуре, осадок промывали холодным PBS (137 мМ NaCl, 2.7 мМ
KCl, 10 мМ Na2HPO4, 1.8 мМ KH2PO4, (pH 7.4)), повторяли центрифугирование при тех же
условиях.
Фибробласты выделяли из 9-дневных куриных эмбрионов по стандартному протоколу
(Silim et al., 1982) и культивировали в среде DMEM с добавлением 8% эмбриональной
бычьей сыворотки, 2% куриной сыворотки, 100 ед./мл пенициллина и 100 ед./мл
стрептомицина при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО2.
II.1.4 ВЫДЕЛЕНИЕ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ ЭРИТРОИДНЫХ КЛЕТОК И КЛЕТОК
МОЗГА МЫШИ
На 14-й день беременности мыши проводили ее эвтаназию путем дислокации шейных
позвонков. Асептически извлекали матку, вырезали эмбрион, из эмбриона вырезали
печень и мозг. Печень эмбрионов механически гомогенизировали в среде DMEM с
добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки. Ткани мозга обрабатывали раствором
коллагеназы I (1.25мг/мл) в течение 45 минут при температуре 37°С в той же среде,
периодически помешивая. Клеточный материал пропускали через фильтр (30 мкм) для
получения суспензии единичных клеток.
II.1.5 ПОЛУЧЕНИЕ TER119+ И TER119– КЛЕТОК МЫШИ
Для получения фракций Ter119-позитивных и Ter119-негативных клеток мыши,
фиксированные
клетки
подвергали
сортингу
на
магнитных
микрошариках,
конъюгированных с антителами против белка Ter119, по процедуре MASC (magneticactivated cell sorting) с использованием колонок и сепаратора «Miltenyi Biotec» согласно
инструкциям производителя.
116
Для иммуноцитохимического анализа отсортированные клетки инкубировали с
антителами против Ter119 мыши (крысиные моноклональные, Santa Cruz Biotechnology
sc-19592),
промывали
иммуноглобулинов
PBS,
крысы,
инкубировали
со
конъюгированными
вторичными
с
AF488
антителами
(Molecular
против
Probes),
и
анализировали под флуоресцентным микроскопом после окраски ДНК DAPI.
II.1.6 ОКРАШИВАНИЕ
КЛЕТОК
БЕНЗИДИНОМ
ДЛЯ
ВЫЯВЛЕНИЯ
ГЕМОГЛОБИНА
Окрашивание проводили, как описано ранее (Rowley et al., 1985), с изменениями. К 50 мкл
0.4% (W/V) раствора бензидина (Sigma) в 4%-ной уксусной кислоте добавляли 2 мкл 30%
раствора H2O2, смешивали с 50 мкл суспензии клеток, выдерживали в течение 10 минут и
выявляли клетки, окрашенные в темно-синий цвет, с помощью светового микроскопа.
II.2 РАБОТА С ДНК И РНК
II.2.1 ВЫДЕЛЕНИЕ ГЕНОМНОЙ ДНК ИЗ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК
Клеточный осадок, содержащий 109 клеток, суспендировали в 30 мл лизирующего буфера
(10 мМ Трис (рН 7.5), 5 мМ MgCl2, 0.3 М сахарозы, 1% Triton X-100), инкубировали 1 час
на льду, затем центрифугировали при 600g 10 минут. Осадок ресуспендировали в 20 мл
буфера для протеиназы К (25 мМ EDTA, 75 мМ NaCl, 1% SDS, 2 мг протеиназы К
(Sigma)), инкубировали 16 часов при 55°С на водяной бане, после чего добавляли 600 мкг
РНКазы А (Thermoscientific) и инкубировали 16 часов при 37°С в воздушном термостате.
После переваривания РНК добавляли ацетат натрия до 0.3 М, 1 объем (V) фенола (рН 8.0),
встряхивали и центрифугировали при 3200g и 25°С 10 минут. Отбирали водную фазу и
повторяли процедуру экстракции смесью фенол:хлороформ (1:1) и хлороформом при тех
117
же условиях. К водной фазе, отобранной после экстракции хлороформом, добавляли 2 V
96% холодного этанола, выдерживали 1 час при -70°С, после чего преципитировавшую
ДНК собирали на стеклянный стержень, промывали в 70% этаноле и растворяли в 10 мМ
Трис (рН 7.5).
II.2.2 ВЫДЕЛЕНИЕ БАКМИДНОЙ ДНК ИЗ КЛЕТОК E. СOLI
В работе использовали штаммы E. coli, несущие следующие бакмиды (CHORI BACPAC
Resources Center): CH261-75C12 (включает домен альфа-глобиновых генов кур и
фланкирующие области), TAM32-28J3 (включает домен бета-глобиновых генов кур),
RP24-79I7 (включает домен бета-глобиновых генов мыши). Клетки растили в среде LB
(1% бакто-триптона, 0,5% дрожжевого экстракта, 1% NaCl, 12.5 мкг/мл хлорамфеникола)
в течение 20 часов, затем клетки осаждали центрифугированием в течение 7 минут при
3200g и комнатной температуре. Осадок ресуспендировали в 300 мкл буфера GTE (50 мМ
глюкозы, 25 мМ Трис (рН 8.0), 10 мМ EDTA), добавляли 600 мкл 7.5 М ацетата аммония и
инкубировали на льду 10 минут, несколько раз встряхивая пробирки. После инкубации
раствор центрифугировали 20 минут при 16000g и комнатной температуре. Супернатант
отбирали и повторно центрифугировали 10 минут при 16000g. К супернатанту добавляли
700 мкл изопропанола и центрифугировали 20 минут при 16000g и комнатной
температуре, после чего осадок ДНК промывали 500 мкл 70% этанола и повторно
центрифугировали 5 минут при тех же условиях. Осадок ДНК растворяли в 100 мкл
буфера ТЕ (10 мМ Трис (pH 8.0), 1 мМ EDTA), добавляли 10 мкг РНКазы А (Sigma) и
инкубировали 30 минут при 37°С. После инкубации к раствору добавляли 10 мкл 3М
ацетата натрия, 330 мкл 96% этанола и выдерживали 20 минут при -20оС. Затем
центрифугировали 15 минут при 16000g и комнатной температуре, осадок промывали 500
118
мкл 70% этанола и повторно центрифугировали 5 минут. Полученный осадок ДНК
растворяли в 50 мкл 10мМ Трис (рН 7.5). Препарат хранили в холодильнике при -70°С.
II.2.3 ПРИГОТОВЛЕНИЕ
ЭКВИМОЛЯРНОЙ
СМЕСИ
ПРОДУКТОВ
ЛИГИРОВАНИЯ НА ОСНОВЕ БАКМИДЫ
Для приготовления эквимолярной смеси продуктов лигирования рестриктных фрагментов
исследуемой области генома 10 мкг ДНК искусcтвенной бактериальной хромосомы,
несущей эту область, переваривали подходящей рестриктазой/ами, очищали ДНК
экстракцией
фенол-хлороформом
и
преципитацией
этанолом,
религировали
при
концентрации ДНК 100 нг/мкл и вновь очищали ДНК. Использовали следующие
эндонуклеазы рестрикции и бакмидные клоны: BamHI и BglII для переваривания бакмиды
CH261-75C12; Sau3A (изошизомер MboI, нечувствительный к dam-метилированию) или
NlaIII для переваривания бакмиды TAM32-28J3; HindIII или Sau3A для переваривания
бакмиды RP24-79I7. Полученный образец использовали в качестве стандарта при
определении относительных количеств продуктов лигирования в экспериментах по 3Санализу и M3C-анализу.
II.2.4 ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ДНК В АГАРОЗНОМ ГЕЛЕ
0.7–2% раствор агарозы в буфере ТАЕ (40 мМ Трис (pH 8.0), 40 мМ ацетат натрия, 1 мМ
EDTA) прогревали в СВЧ-печи до расплавления агарозы, охлаждали до 50–55°С, в ряде
случаев добавляли 1% (W/V) раствор бромистого этидия до концентрации 0.5 мкг/мл,
заливали в форму и выдерживали до застывания. К образцу ДНК добавляли 1/5 V буфера
для нанесения проб на гель (0.025% бромфеноловый синий, 40% (W/V) сахарозы).
Электрофорез проводили в буфере ТАЕ при напряженности электрического поля 8–10
В/см. По завершении электрофореза гели без бромистого этидия выдерживали 1 час в
119
буфере ТАЕ, содержащем 0.5 мкг/мл бромистого этидия, затем трижды по 20 минут
промывали чистым буфером ТАЕ или ddH2O. ДНК визуализировали, используя источник
ультрафиолетового излучения при длинах волн 312 или 366 нм. В качестве маркера длины
использовали смесь фрагментов ДНК от 0.1 до 10 т.п.н. (Fermentas, SM0331).
Для выделения ДНК из геля использовали набор колонок и реагентов «QIAquick
PCR Purification Kit» согласно инструкциям производителя.
II.2.5 ВЫДЕЛЕНИЕ ТОТАЛЬНОЙ РНК ИЗ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК
Перед работой вся вода (mQ) была обработана раствором DEPC (диэтилпирокарбонат)
при 37оС в течение 1 ночи (1/1000 V используемой воды), и затем автоклавирована 15
минут при 135°С.
Клеточный осадок, содержащий 106 клеток, суспендировали в 1 мл реактива TRIzol
(Helicon), выдерживали 5 минут при комнатной температуре до полного лизиса и
гомогенизации образца. Затем к раствору добавляли 200 мкл хлороформа, встряхивали и
выдерживали 3 минуты при комнатной температуре, после чего центрифугировали 15
минут при 16000g и 4°С. Водную фазу отбирали и осаждали из нее РНК. Для этого к
раствору добавляли 1 V изопропанола, выдерживали 10 минут при комнатной
температуре, после чего раствор центрифугировали 10 минут при 16000g и 4°С.
Супернатант удаляли, осадок РНК промывали 1 мл 70% этанола (приготовленного на
DEPC-H2O), центрифугировали 10 минут при тех же условиях. Осадок РНК подсушивали
на воздухе при комнатной температуре и растворяли в 50 мкл DEPC-H2O.
Для очистки от ДНК полученный препарат РНК обрабатывали 1 ед. ДНКазы I,
свободной от РНКаз (Thermoscientific), в присутствии 120 ед. ингибиторов РНКаз
(Thermoscientific) в течение 30 минут при 37°С. Далее добавляли 1/10 V 3М раствора
ацетата натрия (рН 5.2) и 1 V фенола (рН 5.0), встряхивали и центрифугировали 10 минут
120
при 16000g и 4°С. Водную фазу отбирали, добавляли к ней 1 V смеси фенола с
хлороформом (1:1), повторяли центрифугирование при тех же условиях. К водной фазе
добавляли 1 V хлороформа и повторно центрифугировали. Водную фазу отбирали и
осаждали РНК по описанной выше методике. Полученный осадок РНК растворяли в 50
мкл DEPC-H2O, препарат хранили в холодильнике при -70°С.
II.2.6 ОБРАТНАЯ ТРАНСКРИПЦИЯ-ПЦР
Реакционную смесь, содержащую РНК (от 100 до 1000 нг), 0.2 мкг гексануклеотидных
праймеров (Силекс), реакционный буфер для ревертазы M-MuLV (50 мМ Трис (рН 8.3), 50
мМ KCl, 4 мМ MgCl2, 10 мМ DTT), 20 нмоль каждого dNTP (Силекс), 20 ед. ингибиторов
РНКаз (Thermoscientific) и 200 ед. ревертазы M-MuLV (Thermoscientific), инкубировали 1
час при 42°С. Для инактивации ревертазы образец выдерживали при 70°С 10 минут. В
качестве отрицательного контроля вместо ревертазы добавляли эквивалентный объем
DEPC-H2O.
Количественный анализ кДНК проводили методом ПЦР в реальном времени с
TaqMan пробами. На одну реакцию амплификации использовали 1 мкл смеси после
обратной
транскрипции.
Для
построения
калибровочной
кривой
проводили
амплификацию нескольких последовательных разведений геномной ДНК (100, 10, 1 и 0.1
нг на реакцию). Последовательности праймеров и TaqMan-проб представлены в таблицах
1 и 2, размещенных в конце главы «Материалы и методы».
121
II.2.7 ФЛУОРОМЕТРИЧЕСКОЕ
ИЗМЕРЕНИЕ
КОНЦЕНТРАЦИИ
НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
Концентрацию ДНК и РНК в растворах измеряли на флуорометре «Qubit» с
использованием набора реактивов «Quant-iT dsDNA Assay Kit» и «Quant-iT RNA Assay
Kit» (Invitrogen).
II.3 ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ
II.3.1 ПРОСТАЯ ЖИДКОСТНАЯ ПЦР
Реакцию амплификации проводили в 20-50 мкл ПЦР-буфера (50 мM Трис (pH 8.6),
50 мM KCl, 1.5 мM MgCl2, 0.1% Tween 20), содержащего матричную ДНК, 0.3-0.75 мкМ
каждого праймера, 0.2 мМ каждого dNTP, 1-2.5 ед. Taq-полимеразы горячего старта
(СибЭнзим), по следующей схеме: 94°С – 5 минут, 1 цикл; 94°С – 15 секунд, Ta – 30
секунд, 72°С – 15-30 секунд, 25–40 циклов; 72°С – 3 минуты, 1 цикл. Ta – температура
отжига праймеров, 50–65°C. Для препаративной наработки ПЦР-продуктов проводили 35
циклов ПЦР.
II.3.2 ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ С TAQMAN-ПРОБАМИ
Реакцию амплификации проводили в 20 мкл ПЦР-буфера (50 мM Трис (pH 8.6),
50 мM KCl, 1.5 мM MgCl2, 0.1% Tween 20), содержащего матричную ДНК, 0.5 мкМ
каждого праймера, 0.25 мкМ TaqMan-пробы, 0.2 мМ каждого dNTP, 1 ед. Taq-полимеразы
горячего старта (СибЭнзим), по следующей схеме: 94°С – 5 минут, 1 цикл; 94°С – 15
секунд, 60°С – 60 секунд, детектирование флуоресценции, 50-60 циклов. Реакцию
проводили на приборе CFX Real-Time System (BioRad) или StepOne Plus (Applied
122
Biosystems). Температура отжига праймеров составляла 55–60°С, TaqMan-проб – 67–70°С.
Каждая реакция выполнялась в 3-х или 4-х повторах.
II.4 КЛОНИРОВАНИЕ
Клонирование осуществляли в штамме DH5a E. coli по стандартной методике (Maniatis et
al., 1982). В качестве вектора использовали плазмиду pUC18. Наработку вставок
осуществляли путем амплификации соответствующих участков геномной ДНК. На 5’концы праймеров были добавлены некомплементарные последовательности, содержашие
сайты связывания эндонуклеаз рестрикции, по которым впоследствии осуществляли
лигирование вставки в вектор. Последовательности праймеров представлены в таблице 3.
II.5 3С-АНАЛИЗ
II.5.1 ФИКСАЦИЯ КЛЕТОК И ИЗОЛЯЦИЯ ЯДЕР
Клетки в количестве 107 фиксировали в 10 мл PBS, содержащем 10% фетальной бычьей
сыворотки и 2% формальдегида, в течение 10 минут при комнатной температуре и
покачивании. Реакцию останавливали добавлением 2 М глицина до концентрации 0.125
М, после чего суспензию клеток охлаждали во льду и центрифугировали в течение 10
минут при 300g и 4°С. Осадок клеток промывали 10 мл холодного буфера PBS,
содержащего 10%-ную фетальную бычью сыворотку, и повторяли центрифугирование.
Для изоляции ядер осадок суспендировали в 5 мл буфера для лизиса клеток (10 мM Трис
(pH 8,0), 10 мM NaCl, 0,2% NP-40, ингибиторы протеаз (Thermoscientific)) и инкубировали
10 минут во льду. Ядра собирали центрифугированием в течение 5 минут при 600g и 4°С и
при необходимости замораживали в жидком азоте и хранили при -70°С.
123
II.5.2 РЕСТРИКЦИЯ И ЛИГИРОВАНИЕ ДНК
Ядра в количестве 107 суспендировали в 0.25 мл подходящего 1.2-кратного рестриктного
буфера, добавляли 20% SDS до концентрации 0.3% и инкубировали 1 час при 37°С и
интенсивном перемешивании (1400 об/мин). Далее вносили еще 0.25 мл 1.2-кратного
рестриктного буфера, добавляли 20%-ный тритон Х-100 до концентрации 1.8% (для
«нейтрализации» SDS перед последующей рестрикцией) и инкубировали 1 час при 37°С и
интенсивном перемешивании (1400 об/мин). После инкубации добавляли 600-1000 ед.
рестриктазы (или каждой из рестриктаз при комбинированной рестрикции) и
переваривали ДНК в течение 16 часов при 37°С и интенсивном перемешивании (1400
об/мин). Использовали следующие эндонуклеазы рестрикции: BamHI (NEB) и BglII (NEB)
при анализе домена альфа-глобиновых генов и гена TMEM8 кур; MboI (NEB) или NlaIII
(Thermoscientific) при анализе домена бета-глобиновых генов кур; HindIII (NEB) или MboI
(NEB) при анализе домена бета-глобиновых генов мыши. Реакцию рестрикции
останавливали добавлением 20% SDS до концентрации 1.6% и нагреванием в течение 20
минут при 65°С. В экспериментах по фракционированию 3С-материала далее проводили
центрифугирование (16000g, 20 минут, комнатная температура), после чего отбирали
супернатант, а осадок суспендировали в буфере того же состава, что и супернатант. В
некоторых экспериментах материал до центрифугирования обрабатывали ультразвуком
(прибор VirTis VirSonic 100, положение регулятора мощности «7»). При проведении
стандартного 3С-анализа центрифугирования и ультразвуковой обработки не проводили.
Раствор после рестрикции смешивали в 50-мл пластиковой пробирке с 7 мл
лигазного буфера (50 мM Трис (pH 7.5), 10 мM MgCl2, 10 мM DTT, 1 мM АТФ), добавляли
20%-ный тритон Х-100 до концентрации 1% и инкубировали 1 час при 37°С и
перемешивании (400 об/мин). Далее добавляли 100 ед. ДНК-лигазы фага Т4
124
(Thermoscientific) и инкубировали с покачиванием 4.5 часа при 16°С и 30 минут при
комнатной температуре.
II.5.3 ОЧИСТКА ПРОДУКТОВ ЛИГИРОВАНИЯ
Раствор после лигирования инкубировали в течение 16 часов при 65°С в присутствии 300
мкг протеиназы К, затем добавляли 300 мкг РНКазы А и переваривали РНК в течение 45
минут при 37°С. Раствор последовательно экстрагировали равным V фенола, смеси
фенол:хлороформ (1:1) и хлороформа, после чего разводили в два раза водой (mQ),
добавляли 150 мкг гликогена, 3 М ацетат натрия (pH 5.2) до концентрации 0.2 М, 2 V
холодного 96% этанола и выдерживали до суток при -70°С. ДНК преципитировали
центрифугированием в течение 1 часа при 3200g и 4°С, промывали осадок ДНК холодным
70% этанолом и центрифугировали так же еще 20 минут. Осадок ДНК (3С-образец)
растворяли в 200 мкл 10 мM Трис (pH 7.5) и хранили при -70ºС.
II.5.4 КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ ПРОДУКТОВ ЛИГИРОВАНИЯ
Количественный анализ продуктов лигирования осуществляли методом ПЦР в реальном
времени с TaqMan-пробами. На одну реакцию амплификации использовали 20-200 нг 3СДНК. В стандартном 3С-анализе для построения калибровочной кривой проводили
амплификацию нескольких последовательных разведений эквимолярной смеси продуктов
лигирования, приготовленной на основе бакмиды (2000, 200, 20 и 2 пг ДНК на реакцию).
При анализе абсолютных частот лигирования для построения калибровочной кривой
проводили амплификацию 105, 104, 103 или 102 копий синтезированных фрагментов ДНК,
включающих анализируемые стыки рестрикционных фрагментов (см. рис. 27). Синтез
этих фрагментов проводили путем ПЦР на матрице эквимолярной смеси продуктов
лигирования с использованием тех же праймеров, что и в 3С-анализе. Концентрацию ДНК
125
в каждом разведении доводили до концентрации ДНК в 3С-образце добавлением
геномной ДНК.
Для контроля качества проведения экспериментальных процедур для клеток
различного типа, а также для клеток одного типа в экспериментах, проведенных в разное
время, проводили 3С-анализ участка гена домашнего хозяйства ERCC3. Полученные
данные использовали для нормировки данных 3С-анализа исследуемого участка генома
(Hagege et al., 2007). В случае раздельного анализа растворимой и нерастворимой фракций
3С-материала частоты лигирования для каждой фракции нормировали на сумму частот
лигирования
фрагментов
гена
ERCC3,
полученных
для
двух
фракций.
Последовательности праймеров и TaqMan-проб представлены в таблицах 4, 5, 6 и 8.
Для определения относительных количеств рестрикционных фрагментов в
растворимой и нерастворимой фракциях 3С-материала проводили амплификацию
внутренних участков фрагментов. На одну реакцию амплификации использовали 20 нг
3С-ДНК. Для построения калибровочной кривой проводили амплификацию нескольких
последовательных разведений бакмидной ДНК, содержащей анализируемые фрагменты
(500, 50, 5 или 0.5 пг ДНК на реакцию). Последовательности праймеров и TaqMan-проб
представлены в таблице 7.
Для определения эффективности расщепления ДНК эндонуклеазами рестрикции в
процедуре 3С и эффективности восстановления исходного рестрикционного сайта в ходе
лигирования использовали ПЦР-стоп-анализ. Для этого проводили амплификацию
образцов ДНК с праймерами, подобранными таким образом, чтобы ампликоны
перекрывали рестрикционный сайт. В параллели проводили амплификацию внутреннего
участка рестрикционного фрагмента. На одну реакцию амплификации использовали 20 нг
ДНК. Для построения калибровочной кривой проводили амплификацию нескольких
последовательных разведений нерасщепленной геномной ДНК (100, 10, 1 и 0.1 нг на
126
реакцию).
Процентную
долю
нерасщепленного
(восстановленного)
ампликона
рассчитывали по формуле: A(ПЦР-стоп)/A(внутр)*100, где A(ПЦР-стоп) – ПЦР-сигнал от
ампликона,
перекрывающего
рестрикционный
сайт, A(внутр)
–
ПЦР-сигнал от
внутреннего ампликона. Последовательности праймеров и TaqMan-проб представлены в
таблице 7.
II.6 M3C-АНАЛИЗ
II.6.1 ВЫДЕЛЕНИЕ НУКЛЕОИДОВ
Клеточный осадок, содержащий 108 клеток, суспендировали в буфере ТМ (50 мМ Трис
(pH 7.5), 3 мМ MgCl2, 1 мM PMSF), содержащем 0.2 мM Cu2SO4. Все последующие
процедуры проводили на льду. Добавляли 10% NP-40 до конечной концентрации 0.2% и
разрушали клетки с помощью гомогенизатора Даунса (притертый пестик, 10 движений).
Ядра собирали центрифугированием в течение 10 минут при 700g и 4°С и дважды
промывали буфером TM путем ресуспендирования-центрифугирования. Для экстракции
гистонов ядра ресуспендировали в 10 мл холодного буфера А (10 мМ PIPES (pH 7.8), 100
мМ NaCl, 0.3 М сахароза, 3 мМ MgCl2, 0.5% Triton X-100, 0.1 мМ PMSF). Далее медленно
добавляли равный объем буфера A, cодержащего 4M NaCl, с перемешиванием. После
получасовой инкубации на льду нуклеоиды собирали центрифугированием в течение 10
минут при 3200g и 4°С и трижды промывали буфером для рестрикции (50 мМ Трис (pH
7.6), 10 мМ MgCl2, 10 мМ NaCl, 1 мМ DTT, 0.1 мМ PMSF) путем ресуспендированияцентрифугирования.
127
II.6.2 ПОЛУЧЕНИЕ ЯДЕРНЫХ МАТРИКСОВ И ЛИГИРОВАНИЕ ямДНК
Нуклеоиды ресуспендировали в 10 мл буфера для рестрикции, содержащего 100 мкг/мл
БСА, добавляли по 2000 ед. BamHI (NEB) и BglII (NEB) и инкубировали 1 час при 37°С с
перемешиванием. Для остановки реакции добавляли 0.5 М EDTA до конечной
концентрации 20 мМ и 4 М NaCl до конечной концентрации 2М. После получасовой
инкубации на льду ядерные матриксы осаждали центрифугированием в течение 10 минут
при 3200g и 4°С, трижды промывали буфером для лигазы (40 мМ Трис (pH 7.8), 10 мМ
MgCl2, 10 мМ DTT, 0.1 мM PMSF и 100 мкг/мл БСА) и ресуспендировали в 1 мл буфера
для лигазы. Далее добавляли 100 ед. ДНК-лигазы фага Т4 (Thermoscientific) и
инкубировали 3 часа при 4°С с перемешиванием. Ядерные матриксы были собраны
центрифугированием с последующим перевариванием белков протеиназой К и очисткой
ДНК экстракцией фенол-хлороформом с последующей преципитацией этанолом.
Для микроскопического анализа ядра, нуклеоиды и ядерные матриксы осаждали на
покрытые
силаном
предметные
стекла
путем
цитоспинирования,
окрашивали
флуоресцентно меченными антителами против ламина А и С (Abcam). ДНК окрашивали
DAPI. Препараты анализировали под флуоресцентным микроскопом (Axioplan Opton),
оснащенным CCD-камерой (Photometrics AT200).
В экспериментах по удалению дистальных частей петель ДНК с помощью
микрококковой нуклеазы ядра были экстрагированы 0.5 М раствором NaCl. C этой целью
суспензию ядер в буфере А (см. выше) смешивали с равным объемом буфера А,
содержащего 1 М NaCl. После получасовой инкубации на льду ядра осаждали
центрифугированием и дважды промывали в буфере для микрококковой нуклеазы (10 мМ
Трис (pH 8.0), 3 мМ MgCl2, 1 мM CaCl2). Ядра ресуспендировали в том же буфере
(конечная концентрация 109 ядер/мл) и обрабатывали микрококковой нуклеазой (20-100
ед/мл) в течение 15 минут при 37°С. Реакцию останавливали добавлением EDTA до
128
конечной концентрации 20 мМ, после чего к суспензии добавляли равный объем буфера
для нуклеазы, содержащий 4 М NaCl, и инкубировали на льду 30 минут. Ядерные
матриксы осаждали центрифугированием, дважды промывали буфером TM, содержащим
2 M NaCl, дважды буфером TM, после чего переваривали белки и очищали ДНК, как
описано выше.
II.6.3 КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ ПРОДУКТОВ ЛИГИРОВАНИЯ
Количественный анализ продуктов лигирования осуществляли методом ПЦР в реальном
времени с TaqMan-пробами аналогично тому, как делали в стандартном 3С-анализе. На
одну реакцию амплификации использовали 200 нг M3С-ДНК. Для построения
калибровочной
кривой
проводили
амплификацию
нескольких
последовательных
разведений эквимолярной смеси продуктов лигирования, приготовленной на основе
бакмиды (2000, 200, 20 и 2 пг ДНК на реакцию). Последовательности праймеров и
TaqMan-проб представлены в таблице 8.
При анализе частот лигирования фрагментов, расположенных на разных
хромосомах, для построения калибровочной кривой использовали эквимолярную смесь
продуктов лигирования, полученную на основе ПЦР-амплифицированных фрагментов,
перекрывающих анализируемые концы рестрикционных фрагментов. Амплификацию
проводили на матрице геномной ДНК, последовательности праймеров представлены в
таблице
9.
ПЦР-продукты
разделяли
электрофорезом,
очищали,
смешивали
в
эквимолярных количествах, переваривали эндонуклеазами рестрикции BamHI и BglII и
религировали.
Для определения относительных количеств фрагментов ДНК в ядерном матриксе
проводили амплификацию внутренних участков фрагментов. На одну реакцию
амплификации использовали 20 нг M3С-ДНК или ямДНК, полученной с использованием
129
микрококковой
нуклеазы.
Для
построения
калибровочной
кривой
проводили
амплификацию нескольких последовательных разведений геномной ДНК (100, 10, 1 и 0.1
нг на реакцию). Последовательности праймеров и TaqMan-проб представлены в таблице
10.
II.7 INGRID-АНАЛИЗ
II.7.1 ПОЛУЧЕНИЕ СШИТЫХ ФРАГМЕНТОВ ХРОМАТИНА
Для получения сшитых формальдегидом фрагментов хроматина клетки в количестве
5×107 инкубировали в PBS, содержащем 10% фетальной бычьей сыворотки и 1%
формальдегида, в течение 10 минут при комнатной температуре. Реакцию останавливали
добавлением 2 М глицина до концентрации 0.125 М. При необходимости осуществляли
сортинг клеток. Для высвобождения фрагментов хроматина клетки в количестве 3×106
подвергали ультразвуковой обработке в 0.6 мл холодного буфера, содержащего 50 мМ
Трис (pH 8.0), 50 мМ NaCl, 5 мМ EDTA, 1% SDS и ингибиторы протеаз (Complete Mini,
Roche), на приборе VirTis VirSonic 100 (1 импульс продолжительностью 7 или 15 секунд
при положении регулятора мощности «7»). Несолюбилизированный материал удаляли
центрифугированием в течение 20 минут при 16000g и комнатной температуре.
Супернатант подвергали ПЦР в геле после 150-кратного разбавления буфером для ПЦР,
не включающим KCl (для предотвращения преципитации SDS), и последующего 100- или
200-кратного разведения смесью для ПЦР, включающей все реакционные компоненты, за
исключением ДНК-матрицы (см. ниже).
Для переваривания солюбилизированных фрагментов хроматина рестриктазой
HindIII 100 мкл супернатанта разводили в 6 раз 1.2-кратным рестрикционным буфером 2
(NEB), содержащем 2% Triton X-100, и инкубировали раствор в течение 1 часа при 37°С и
130
интенсивном перемешивании (1400 об/мин) для «нейтрализации» SDS. Далее добавляли
100 ед. HindIII (NEB) и переваривали ДНК в течение 1 ночи при 37°С и интенсивном
перемешивании (1400 об/мин).
Для комбинированной фиксации фрагментов хроматина клетки инкубировали в
PBS, содержащем 10% фетальной бычьей сыворотки, 10% DMSO и 1.5 мМ EGS, в течение
30 минут при комнатной температуре, после чего добавляли 37.5%-ный формальдегид до
конечной концентрации 1% и инкубировали 10 минут при комнатной температуре.
Остальные этапы подготовки материала повторяют описанные выше с единственным
различием, заключающемся в том, что использовали более интенсивную ультразвуковую
обработку (2 импульса по 10 секунд при положении регулятора мощности «15»).
Для приготовления растворимой фракции 3С-материала следовали стандартному
3С-протоколу до стадии экстракции 1.6% SDS, после чего нерастворимый материал
отделяли центрифугированием (16000g в течение 20 минут при комнатной температуре).
II.7.2 ПЦР В ГЕЛЕ
ПЦР в геле выполняли, как описано в работе Саматова с соавт. (Samatov et al., 2006), с
использованием полиакриламидных гелей (7% акриламид, 0.07% бисакриламид)
толщиной 0.4 мм и диаметром 14 мм. Гели заливали в лунки, высверленные в предметных
стеклах, промывали и высушивали (Chetverina et al., 2002). Перед экспериментом в
каждую лунку вносили 60-65 мкл ПЦР-смеси, содержащей буфер (50 мМ Tрис (pH 8.6), 50
мМ KCl, 1.5 мМ MgCl2, 0.1% Tween 20 и 1 мг/мл БСА), 0.2 мМ каждого dNTP, 0.3 мкМ
каждого праймера, 0.04 мкМ каждой MB-пробы, 3 ед. Taq-полимеразы горячего старта
(СибЭнзим) и подходящую матричную ДНК. Избегая пузырьков воздуха, лунку
покрывали покровным стеклом, по краям смазанным минеральным маслом. Далее
покровное стекло заклеивали липкой фольгой (Eppendorf) с отверстием, вырезанным по
131
размеру лунки, и инкубировали в течение полутора часов при 4°С. За это время гель
абсорбировал всю жидкость. Разбухшие гели подвергали ПЦР по следующей схеме:
первичное нагревание при 94°С в течение 3 минут (что обеспечивало обращение
формальдегидных сшивок и активацию полимеразы); плавление при 94°С в течение 10
секунд, отжиг праймеров при 55°С в течение 30 секунд, копирование матрицы при 72°С в
течение 30 секунд – 41 цикл. ПЦР выполняли в ДНК-амплификаторе с плоским
нагревательным элементом. Рост колоний отслеживали в режиме реального времени. Для
этого на заданном цикле амплификации, на середине этапа отжига праймеров, стекла с
гелями извлекали из амплификатора и сканировали с использованием конфокального
сканера (ScanArray Express, PerkinElmer), используя разрешение 50 мкм, последовательно
три раза для регистрации флуоресценции флуорофоров FAM (лазер с длиной волны 488
нм, эмиссионный фильтр 508 нм), Cyanine 3 (лазер с длиной волны 550 нм, эмиссионный
фильтр 570 нм) и Cyanine 5 (лазер с длиной волны 649 нм, эмиссионный фильтр 670 нм),
после чего возобновляли ПЦР.
Черно-белые снимки гелей, полученные при регистрации флуоресценции FAM,
Cy3 и Cy5, искусственно окрашиванили в синий, зеленый и красный цвета,
соответственно, с использованием программы Leica LAS AF Lite, после чего
процессировали в программе Adobe Photoshop. Наложение изображений осуществляли в
программе ImageJ.
Последовательности праймеров и MB-проб представлены в таблице 11. Дизайн
MB-проб осуществляли с помощью программы Quikfold сервера DINAMelt для
предсказания
температуры
плавления
нуклеиновых
кислот
(http://mfold.rna.albany.edu/?q=DINAMelt/Quickfold).
Для определения степени солюбилизации различных фрагментов хроматина из
фиксированных клеток при ультразвуковой обработке и оценки количества разрывов,
132
вносимых в ампликоны, использовали метод ПЦР в реальном времени с TaqMan-пробами.
На одну реакцию амплификации использовали 20 нг ДНК, очищенной из фракции
солюбилизированного хроматина. Очистку проводили по стандартной процедуре,
включающей расшивку при 65°С в присутствии протеиназы К, экстракцию фенолхлороформом и преципитацию этанолом. Для построения калибровочной кривой
проводили амплификацию нескольких последовательных разведений геномной ДНК (50,
5, 0.5 и 0.05 нг на реакцию). Последовательности праймеров и TaqMan-проб представлены
в таблице 12.
Для анализа влияния формальдегидной фиксации клеток на способность
амплифицировать геномную ДНК также использовали метод ПЦР в реальном времени с
TaqMan-пробами. Амплификацию проводили на серии разведений геномной ДНК (110,
11, 1.1, 0.11 и 0.011 нг на реакцию), выделенной из фиксированных и нефиксированных
клеток. Последовательности праймеров и TaqMan-проб представлены в таблице 13.
II.8 4C-АНАЛИЗ
4С-анализ выполняли, следуя протоколу, описанному в работе Симониса с соавт. (Simonis
et al., 2006), с небольшими модификациями.
II.8.1 ФИКСАЦИЯ КЛЕТОК, ПЕРВИЧНАЯ РЕСТРИКЦИЯ И ЛИГИРОВАНИЕ
Первые стадии 4С-анализа совпадали с процедурой 3С-анализа (см. раздел II.5). Образцы
3С-ДНК дополнительно очищали с использованием набора реагентов «QIAEX II Gel
Extraction Kit» (Qiagen).
133
II.8.2 ВТОРИЧНАЯ
РЕСТРИКЦИЯ,
ЛИГИРОВАНИЕ
И
ТРЕТИЧНАЯ
РЕСТРИКЦИЯ
3С-ДНК (50 мкг, концентрация 100 нг/мкл) обрабатывали вторичной эндонуклеазой
рестрикции DpnII (200 ед., NEB) в течение 16 часов при 37ºС. Реакцию рестрикции
останавливали нагреванием до 65°C в течение 20 минут, добавляли ацетат натрия (pH 5.2)
до конечной концентрации 0.2 М, очищали ДНК экстракцией фенол-хлороформом и
преципитировали этанолом. Осадок ДНК растворяли в 10 мМ Трис (pH 8.0), добавляли 14
мл буфера для лигазы (Thermoscientific), 100 ед. ДНК-лигазы фага Т4 (Thermoscientific) и
инкубировали 4.5 часа при 16°С и 30 минут при комнатной температуре. После этого
экстрагировали ДНК равным объемом фенола, добавляли гликоген до 20 мкг/мл, ацетат
натрия (pH 5.2) до конечной концентрации 0.2 М, два V холодного этанола, выдерживали
сутки на -70°С и преципитировали ДНК центрифугированием в течение 20 минут при
16000g и 4°С. ДНК очищали с помощью набора колонок и реагентов «QIAquick PCR
purification kit» (Qiagen). Для линеаризации кольцевых молекул ДНК обрабатывали
третичными рестриктазами (в количестве 200 ед., в соответствующих буферах для
рестрикции): EcoNI – для якорного фрагмента TSR3; NcoI – для якорного фрагмента в
генной «пустыне» и якорных фрагментов TRAP1 и PPL; EcoRV – для якорного фрагмента
NPRL3. Инкубацию проводили в течение 16 часов при 37°С. Для очистки ДНК
использовали набор колонок и реагентов «QIAquick PCR purification kit» (Qiagen), каждый
образец растворяли в 100 мкл 10 мМ Трис (pH 8.0).
II.8.3 АМПЛИФИКАЦИЯ ПРОДУКТОВ ЛИГИРОВАНИЯ
Амплификацию проводили с использованием набора «Expand Long Template PCR System»
(Roche) согласно инструкциям производителя. Реакцию амплификации проводили в 50
мкл ПЦР-буфера (Roche buffer 1, включает 1.75 мM MgCl2), содержащего 120 нг ДНК
134
после третичной рестрикции, 0.3 мкМ каждого праймера, 0.350 мМ каждого dNTP, 3.75
ед. смеси полимераз (Taq и Tgo) по следующей схеме: первичная денатурация 94ºС – 2
минуты, 1 цикл; денатурация при 94ºС – 15 секунд, отжиг праймеров 57.3°С – 1 минута,
элонгация при 68°С – 3 минуты, 30 циклов; заключительная элонгация при 68°С – 4
минуты, 1 цикл. ПЦР выполняли на приборе GeneAmp PCR System 2700 (Applied
Biosystems). Последовательности праймеров представлены в таблице 14.
II.8.4 ПОДГОТОВКА 4С-БИБЛИОТЕК ДЛЯ СЕКВЕНИРОВАНИЯ
После амплификации образцы разделяли в 1%-ном агарозном геле, затем вырезали из
геля, разделяя на две фракции: 70-400 п.н. (короткие фрагменты) и 400-1500 п.н. (длинные
фрагменты). После выделения ДНК из геля фракцию, содержащую длинные фрагменты,
обрабатывали ультразвуком, чтобы уменьшить размер фрагментов до 100-500 п.н., на
приборе Covaris S220 (параметры: 300 секунд, режим «10», максимальная мощность 23
Вт). После этого фракции подготавливали к лигированию с адаптерами (аденилирование
тупых концов ДНК) и проводили дальнейшее лигирование с использованием набора
TruSeq DNA sample prep kit v.2 (Illumina), затем разделяли в агарозном геле и отбирали
фрагменты длиной 200-600 п.н. После очистки ДНК осуществляли ПЦР с праймерами,
комплементарными
дистальным
регионам
адаптеров
Illumina
(I-qPCR-1.1:
AATGATACGGCGACCACCGAGAT и I-qPCR-2.1: CAAGCAGAAGACGGCATACGA).
Далее фракции, содержащие длинные и короткие фрагменты, смешивали в равных
количествах, разводили до концентрации 2 нМ, денатурировали, используя 0.1 M NaOH, и
разводили буфером HT1 (Illumina) до конечной концентрации 10 пМ. Кластеры
генерировали с помощью системы CBot и реагентов TruSeq PE Cluster Kit v3 (Illumina).
Секвенирование проводили с помощью прибора HiSeq2000, используя набор TruSeq SBS
Kit v3 (Illumina). Длина прочтений составляла 101 нуклеотид с каждого конца.
135
II.8.5 БИОИНФОРМАТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ 4C-ДАННЫХ
Отбор парноконцевых прочтений, полученных с помощью прибора Illumina, проводили
путем сравнения с частью последовательности, входящей в состав якорного фрагмента. Из
пары концевых прочтений выбирали только прочтения со стороны HindIII-сайта.
Прочтения, содержащие последовательности, относящиеся к якорному фрагменту,
считали целевыми, т.е. происходящими из продуктов лигирования любого фрагмента
генома с якорным. Такие последовательности картировали на куриный геном сборки
galGal4 с помощью программы bowtie (Langmead et al., 2009). Куриный геном (сборка
galGal4) разбивали на HindIII-фрагменты in silico и регионы между сайтами рестрикции
использовали для дальнейшего анализа. Число прочтений, попадающих на левый или
правый концы одного HindIII-фрагмента, суммировали, и конечное значение считали 4Ссигналом для данного рестриктного фрагмента.
Для анализа регионов, взаимодействующих с якорным фрагментом при различном
разрешении анализа, использовали подход, описанный в работе Splinter et al. ( 2012). Для
этого сравнивали группы HindIII-рестриктных фрагментов разных размеров (от 3 до 200
фрагментов) с ненулевым покрытием с фоновым окном постоянного размера (300
фрагментов) и определяли P-значение по тесту Фишера. В результате получали
доменограммы, интенсивность цвета которых отражала P-значения в зависимости от
размера вариабельного окна (шкала Y – чем больше значение, тем больше размер окна) по
всей длине хромосомы 14 (см. рис. 52В). При дальнейшем анализе по оси Y откладывали
значение, равное отрицательному логарифму наиболее значимого P-значения в
вариабельном окне для данной геномной позиции (см. рис. 52Б).
Для корреляционного анализа геном разбивали на интервалы размером по 100
т.п.н., в которых подсчитывали суммарный 4С-сигнал и определяли плотность различных
функционально значимых мотивов. Участок, окружающий якорный фрагмент, не
136
включали в анализ (для якорного фрагмента NPRL3 – chr14: 11500000–12800000). Поиск
CpG-островков для анализа корреляций с 4С-сигналом осуществляли, используя таблицу
cpgIslandEx для куриного генома сборки galGal4 (Gardiner-Garden and Frommer, 1987).
Предполагаемые участки связывания транскрипционных факторов идентифицировали с
использованием
алгоритма
PWM.
Пермутационный
анализ
также
проводили
с
использованием PWM. Предполагаемые последовательности G-квадруплексов (d(G3+N1–
7G3+N1–7G3+N1–7G3+)) определяли с помощью программы quadparser (Huppert and
Balasubramanian, 2007).
Для построения усредненного профиля 4С-сигнала в окрестностях различных
геномных элементов (таких как CpG-островки, сайты связывания CTCF, TSS)
использовали следующий подход. Участки генома, окружающие элементы данного типа
(± 20 т.п.н.), разбивали на интервалы равной длины (1 т.п.н.), получая, таким образом, 20
интервалов выше и 20 интервалов ниже элемента. В каждом интервале подсчитывали
величину 4С-сигнала и усредняли между всеми интервалами, расположенными в одной и
той же позиции по отношению к геномному элементу. Таким образом был получен
средний 4С-сигнал в окрестностях геномного элемента данного типа. Для оценки
вариабельности среднего генерировали 10 псевдовыборок (процедура бутстрэппинга).
Размер псевдовыборок соответствовал размеру исходной выборки, однако значения
выбирались случайным образом (т.е. какие-то значения могли быть выбраны несколько
раз, какие-то не выбраны вовсе). Для каждой псевдовыборки был получен усредненный
4С-сигнал. Для построения усредненного профиля 4С-сигнала между CpG-островками
участки между последовательно расположенными CpG-островками разбивали на 40
интервалов равной длины (таким образом, для различных локусов длина интервалов
различалась), и далее осуществляли анализ, как описано выше.
137
II.9 CHIP-seq
Процедуру иммунопреципитации хроматина проводили, как описано в работе (Orlando,
2000),
с
изменениями,
описанными
в
протоколе
Life
Technologies
(http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/DynabeadsProteinG_man.pdf).
108 клеток в логарифмической фазе роста фиксировали 1%-ным формальдегидом в
среде DMEM/F-12 (1:1) (Invitrogen) при комнатной температуре 8 минут. Фиксированные
клетки осаждали центрифугированием (700g, 4°C) в течение 4 минут, промывали PBS,
содержащим ингибитор протеаз AEBSF (1мМ) и коктейль ингибиторов протеаз (2 мкл/мл)
(Sigma), снова центрифугировали и ресуспендировали в 500 мкл лизирующего буфера (50
мM Трис (pH 8.0), 1% SDS, 10 мM EDTA). Образец инкубировали 10 минут на льду и
подвергали ультразвуковой обработке
с использованием прибора Cole-Parmer CP750
(амплитуда импульса – 30% от максимальной, 40 циклов по 3 секунды с интервалом 10
секунд). Клеточный дебрис удаляли центрифугированием (10 минут, 13000g, 4°С),
супернатант разводили в 10 раз буфером, содержащим 16.7 мM Трис (pH 8.0), 16.7 мM
NaCl, 1.2 мM EDTA, 1% Triton X-100, 0.01% SDS, 1 мM AEBSF и 1 мкл/мл коктейля
ингибиторов протеаз (Sigma). На этом этапе отбирали аликвоты для последующего
использования в качестве «загрузочного контроля». Клеточные лизаты очищали
инкубированием на магнитных микрошариках Dynabeads Protein G (Life Technologies) и
затем инкубировали с 30 мкг антител против CTCF при 4°С с покачиванием.
Использовали кроличьи антитела, приготовленные против N-концевого региона куриного
CTCF, содержащего аминокислоты 86 – 233. После инкубации с антителами, ДНКбелковые комплексы преципитировали связыванием с магнитными микрошариками
Dynabeads Protein G (Life Technologies) и отмывали, как рекомендовано (Life
Technologies), затем элюировали в буфер, содержащий 1% SDS и 0.1 M NaHCO3 (две
последовательные инкубации по 15 минут при комнатной температуре). ДНК очищали,
138
используя набор колонок и реагентов «QIAquick Gel Extraction Kit» (Qiagen).
Преципитированную ДНК и «загрузочный контроль» (по 10 нг ДНК в каждом)
секвенировали в компании Евроген на платформе Illumina HiSeq. Количество прочтений
составило 41-50 миллионов для каждого образца. Прочтения картировали на куриный
геном galGal4 с помощью программного обеспечения bowtie2 (Langmead and Salzberg,
2012). Для анализа распределения участков связывания CTCF использовали программу
MACS (Zhang et al., 2008) с выбранным P-значением 10-5. Для проверки достоверности
картирования сайтов связывания CTCF полученный профиль ChIPseq-сигнала на участке
перед геном cMYC в клетках HD3 был проанализирован и обнаружен сильный пик в том
месте, где картированы «классические» сайты связывания белка CTCF (Klenova et al.,
1993; Lobanenkov et al., 1986) (рис. 12).
Рис. 12. Распределение сайтов связывания CTCF в области перед геном cMYC курицы. На рисунке
представлены позиции участка связывания CTCF, идентифицированного в работе Лобаненкова и соавт.
(Lobanenkov et al., 1986) (сайт V), и участков связывания CTCF, обнаруженных в наших ChIPseqэкспериментах (показаны «сырые» данные ChIPseq-анализа и позиции пиков, идентифицированных, как
описано в разделе «Материалы и методы», II.9); визуализация в браузере UCSC. Геномные координаты
приведены в соответствии со сборкой galGal4.
II.10 ИММУНОЦИТОХИМИЯ
Для
иммуноокрашивания
клетки
цитоспинировали
и
фиксировали
1%-ным
параформальдегидом в течение 10 минут при равномерном покачивании и комнатной
139
температуре, затем промывали 3 раза PBS и пермеабилизировали 1%-ным раствором
Triton X-100 в течение 10 минут при комнатной температуре. После фиксации и
пермеабилизации клетки помещали в блокирующий раствор (1% БСА, 0.05% Tween,
1×PBS) на 30 минут. Инкубацию с первичными антителами, разведенными в
блокирующем растворе, проводили в течение 1 часа при комнатной температуре во
влажной камере. Затем клетки промывали 3 раза по 5 минут PBS с добавлением 0.25%ного BSA и 0.05%-ного Tween-20. Были использованы следующие первичные антитела:
мышиные
моноклональные
антитела
против
Sc35
(Abcam
ab11826),
кроличьи
поликлональные антитела против нуклеолина (Sigma N2662), кроличьи поликлональные
антитела против топоизомеразы II-α (Abcam ab12318), кроличьи поликлональные антитела
против H3K9me3 (Abcam ab8898), кроличьи поликлональные антитела против H3K27me3
(LPBio AR-0171). Первичные антитела проявляли антителами против соответствующих
иммуноглобулинов, конъюгированными с различными флуорохромами в течение 30
минут при комнатной температуре в темноте. Были использованы следующие вторичные
антитела: кроличьи антитела против мышиных иммуноглобулинов, конъюгированные с
AF488 (Invitrogen A11059), и козьи антитела против кроличьих иммуноглобулинов,
конъюгированные с AF 488 (Invitrogen A11008). После этого клетки снова промывали 3
раза PBS с добавлением 0.25% БСА и 0.05% Tween-20 и окрашивали ДНК
флуоресцентным красителем DAPI в течение 10 минут при комнатной температуре в
темноте.
Препараты
анализировали
с
помощью
инвертированного
флуоресцентного
микроскопа Eclipse Ti-E (Nikon, Japan), оснащенного линзами с увеличением ×60 и
нумерической апертурой объектива NA = 1.4, а также цифровой камерой EMCCD (Andor).
Использовалось программное обеспечение NIS-Elements 4.0.
140
II.11 ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ ГИБРИДИЗАЦИЯ IN SITU
Клетки осаждали на предметные стекла цитоспинированием и фиксировали в растворе
метанол-уксусная кислота (3:1). Препараты обрабатывали РНКазой А (концентрация 100
мкг/мл), приготовленной на 2× SSC в течение 1 часа при 37°C. После обработки
препараты отмывали 3 раза в 2× SSC, затем обрабатывали 0.1% раствором пепсина в 10
мМ соляной кислоте в течение 10 минут при 37°C, после чего 2 раза промывали PBS и 1
раз в растворе PBS, содержащем 50 мМ MgCl2, затем проводили постфиксацию 1%-ным
параформальдегидом c добавлением PBS и 50 мМ MgCl2 в течение 10 минут. Далее
отмывали 3 раза раствором PBS, проводили через спирты возрастающей концентрации от
70 до 96% и высушивали на воздухе.
К препарату добавляли 5 мкл флуоресцентной пробы, специфичной к хромосоме 7
мыши
(XCyting
Mouse
Chromosome
Painting
Probe,
MetaSystems),
после
чего
денатурировали при 75°C в течение 2 минут, помещали во влажную гибридизационную
камеру на 37°C и оставляли на 1 ночь. Отмывку от непрогибридизовавшихся молекул
ДНК, входящих в состав пробы, проводили в более жестких условиях, чем условия
гибридизации. Для этого аккуратно снимали покровное стекло скальпелем и помещали в
0.4× SSC (pH 7.0) при 72°C на 2 минуты. Затем промывали в 2× SSC, содержащем 0.05%
Tween 20 (pH 7.0), при комнатной температуре 30 секунд. После отмывок высушивали
препарат на воздухе и обрабатывали ДНК флуоресцентным красителем DAPI (разведение
1:2000) в течение 5 минут при комнатной температуре в темноте. Затем отмывали в
течение 5 минут раствором PBS, промывали от соли дистиллированной водой и
заключали в среду Dako medium. Препараты анализировали с помощью инвертированного
флуоресцентного
микроскопа
Eclipse
Ti-E
(Nikon,
Japan).
Микрофотографии
обрабатывали, как указано ранее (раздел II.10).
141
II.12 ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ
По ходу 3С-процедуры образцы поэтапно фиксировали 2.5% раствором нейтрального
глютарового альдегида в соответствующем буфере (NEB буфер 2 или 3) в течение 2 часов
при комнатной температуре, затем проводили постфиксацию в водном растворе
тетраоксида осмия OsO4 и заключали в Эпон. Препарат нарезали на секции толщиной 100
нм и окрашивали (контрастировали) уксуснокислым уранилом и лимоннокислым
свинцом. Препараты анализировали с помощью трансмиссионного электронного
микроскопа JEM 1400 (JEOL, Япония), оснащенного цифровой камерой QUEMESA
(Olympus SIS, Япония), с напряжением 100 кВ.
II.13 ИММУНОБЛОТИНГ БЕЛКОВ И ОКРАШИВАНИЕ КУМАСCИ
Аликвоты растворимой и нерастворимой фракций, полученных в экспериментах по 3Санализу, подвергали ультразвуковой обработке для уменьшения размеров фрагментов
ДНК (прибор VirTis VirSonic 100, импульс 30 секунд, регулятор мощности в положении
«15»). Затем белки разделяли с помощью 15%-ного SDS-полиакриламидного гельэлектрофореза, после чего окрашивали Кумасси (Coomasie Blue R-250) по стандартному
протоколу (Maniatis et al., 1982) или переносили на мембрану из дифторида
поливинилидена (Hybond-P, Amersham Biosciences). Мебраны блокировали 1 ночь в 5%
сухом молоке, приготовленном на PBS с добавление 0.1% Tween 20 (PBS-T), и
инкубировали в течение 1 часа с первичными антителами (кроличьи поликлональные
антитела против гистона H3, Abcam ab1791), растворенными в PBS с содержанием 0.02%
Tween 20 и 5% сухого молока. После трех отмывок буфером PBS-T мембраны
инкубировали в течение 1 часа со вторичными антителами (антитела против кроличьих
иммуноглобулинов G, коньюгированные с пероксидазой хрена) в буфере, приготовленном
142
на PBS, содержащем 0.02% Tween 20 и 5% сухого молока. Иммуноблоты визуализировали
с помощью набора Amersham ECL. Количественный анализ проводили, используя
программное обеспечение ImageJ.
II.14 ПРОГРАММНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ
Праймеры и TaqMan-пробы для ПЦР подбирали с помощью программы Primer Premier 5
(PRIMER Biosoft International). Дизайн Molecular Beacon-проб осуществляли с помощью
программы
Quikfold
(http://mfold.rna.albany.edu/?q=DINAMelt/Quickfold).
сервера
Данные
DINAMelt
ПЦР
обрабатывали
в
программе Bio-Rad CFX Manager (Bio-Rad Laboratories) и StepOne Plus (Applied
Biosystems). Изображения гелей, полученные при проведении ПЦР в геле, обрабатывали с
использованием программ Leica LAS AF Lite, Adobe Photoshop и ImageJ. С
последовательностями ДНК работали в программе Vector NTI. Графики с результатами
экспериментов 3С строили при помощи программы Microsoft Excel. Рисунки были
подготовлены с использованием программ Adobe Photoshop CS6 и Adobe Illustrator CS5.
Обработку микрофотографий выполняли с помощью программного обеспечения NISElements 4.0 и ImageJ. Количественную обработку электрофорограмм и блотов
осуществляли с помощью программы ImageJ. Прочтения картировали на геном сборки
galGal4 с помощью программы bowtie. Транскрипционные факторы были найдены с
помощью алгоритма PWM в составе программного обеспечения MotifDb R package.
Анализ распределения сайтов CTCF, полученных с помощью ChIP-seq, проводили с
помощью программы MACS.
143
II.15 ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ПРАЙМЕРОВ И ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ
ПРОБ ДЛЯ ПЦР
Таблица 1. Последовательности праймеров и TaqMan-проб, использованных для количественного
анализа первичных транскриптов бета-глобиновых генов кур. Символами «s» и «a/s» обозначены
прямые и обратные праймеры (в соответствии с направлением транскрипции бета-глобиновых генов),
«TM» – TaqMan-пробы. «FAM» – флуоресцентный краситель на 5’-конце проб, «BHQ1» – гаситель
флуоресценции внутри пробы на T, «PO4» – фосфатная группа на 3’-конце проб.
Тест-участок
Праймер/TaqMan-проба (5’-3’)
s CAGAACACTGGGGTTTGGCT
ρ
a/s GGCCAGCACAATGATGAGG
TM FAM-CTCCACACC(T-BHQ1)TGCTTACCCCATTG-PO4
s CCAGAGGTTCTTTGCGTCC
β
H
a/s CTCAGTCCTATAACTCCTGCCTA
TM FAM-ACAACA(T-BHQ1)CAAGAAGAGCTTTGCCCAG-PO4
s TACACTTCTGTTCCCCATCTCTC
β
A
a/s CCAAAGGACGCAAAGAACC
TM FAM-CTGATCGTC(T-BHQ`)ACCCCTGGACCCAGA-PO4
s TAGGCAAAGAGTGAGCATTCG
ε
a/s GCCAGGACGATGATCAGGAT
TM FAM-CTGTGCTTGG(T-BHQ1)GGGAAGAGGGGAT-PO4
Таблица 2. Последовательности праймеров и TaqMan-проб, использованных для количественного
анализа первичных транскриптов генов мыши Hbb-b1/Hbb-b2, Olfr69 и GAPDH. Символами «s» и
«a/s» обозначены прямые и обратные праймеры (в соответствии с направлением транскрипции
соответствующих генов). Остальные обозначения как в таблице 1.
Тест-участок
Праймер/TaqMan-проба (5’-3’)
s AGTCTGATGGGCACCTCCTG
Hbb-b1/Hbb-b2
a/s GACTGCTCCCTAGAATCGCTT
TM FAM-CCTGGCTAT(T-BHQ1)CTGCTCAACCTTCCTATC-PO4
s GGCAAAGCACATTTACCTGAT
Olfr69
a/s ACACTTGTTCCCTGAGATGGTT
TM FAM-TCCACCCTCA(T-BHQ1)AGCATCCTCATAGCAT-PO4
s AATCAAAGCGGACTTACAGAGG
GAPDH
a/s TTTCAGAACCACCATGACTCAG
TM FAM-CAGAGGTAGT(T-BHQ1)ATGGCGTAGTGCAGAGC-PO4
s GGGAGGTAGTGACGAAAAATAACAAT
18S rRNA
a/s TTGCCCTCCAATGGATCCT
TM FAM-CGAGGCCC(T-BHQ1)GTAATTGGAATGAGTCCACT-PO4
144
Таблица 3. Последовательности праймеров, использованных для клонирования фрагментов
домена бета-глобиновых генов мыши. Строчными буквами показан некомплементарный участок,
содержащий рестриктный сайт, по которому осуществлялось клонирование (указан в первой колонке и
подчеркнут в последовательности праймера). Остальные обозначения как в таблице 1.
Клонируемый участок
DHS5-HindIII
Праймер (5’-3’)
s ttgaaagcttAGTGAAGGATGAGAACTTGAATGC
a/s atacaagcttCTCTACCATGAAAATGACGCCTA
s cattgaattcTCAGTAGTTGATTGAGCAAATGTGTT
P-b1-EcoRI
a/s cttagaatccCTATGTCAGAAGCAAATGTGAGGAG
s taatggatccCAAGGATAAGAACAGACACTACTCAGA
P-b2-BamHI
a/s atatggatccGAATCAGAAGCAAACGTAAGAAGC
Таблица 4. Последовательности праймеров и TaqMan-проб, использованных для 3С-анализа
домена бета-глобиновых генов кур. Символами «s» и «a/s» обозначены прямые и обратные праймеры
(в соответствии с направлением транскрипции бета-глобиновых генов или гена ERCC3). Остальные
обозначения как в таблице 1.
MboI-3C-анализ
Тест-фрагмент
DHS4 (якорный)
Праймер/TaqMan-проба (5’-3’)
a/s AAGCCTGCACCCGATTCTC
TM FAM-ATTCCCTGTCC(T-BHQ1)GTCCCACAGCTGT-PO4
Между DHS4 и DHS3
s GCGTGGATAGAAGTAAACTGGAA
DHS3
s GCAGTCCCAGGTTGCACAA
DHS2 (якорный)
a/s AGCAATGTATGCTGACGGTG
TM FAM-AATTTGTGA(T-BHQ1)GGACTTCAGGCCCAT-PO4
Между DHS2 и DHS1
s CAGGACCACCGTTACCCAT
DHS1
a/s ACACACCCACGGTTCCTGA
Между DHS1 и ρ
a/s GCTTCATCCCTTGGAGTTGT
a/s GCAGCATTCGTAGTCTCCCT
ρ (якорный)
Между ρ и β
β
TM FAM-AAAGGAGCTGAC(T-BHQ1)CATGCTAGCCCAG-PO4
H
a/s GCTGAGACAGAACCTTTCCATT
H
a/s CATCAGGGTGGGGCTCAG
H
A
Между β и β
βA (якорный)
a/s TGGAGCTGGGATGGACATAGT
a/s AAGGATGGCAGTGGGGCT
TM FAM-TTTGCCTCC(T-BHQ1)TTGGGAACCTCTCC-PO4
A
Между β и β/εэнхансером
β/ε-энхансер (якорный)
a/s TGGTTGTAGGTGCTCCGTGA
a/s AAGGTCTGTGCAAGTCTTGATAG
TM FAM-CAGTTCTCCGAG(T-BHQ1)CTGACTTTGGAGTCT-PO4
Между β/ε-энхансером и ε
a/s TGCCTTCCTCCATAGAATCACT
ε (якорный)
a/s CCACGTGCAACTTGTCGC
145
TM FAM-TTTGCCTCC(T-BHQ1)TTGGGAACCTCTCC-PO4
3’DHS (якорный)
s GGGCATTTCTACAGAGAGCAA
TM FAM-CAGTTCTCCGAG(T-BHQ1)CTGACTTTGGAGTCT-PO4
Ниже 3’DHS
s CCACATCTGCCAAGAGCCT
ERCC3 (тест)
a/s CTGCTGGCTCATGTTAGGTTT
ERCC3 (якорный)
a/s TCTAAGCGGCTGTCAGATTTG
TM FAM-TGGAGTGGCT(T-BHQ1)AAAAGTCGAGAGTGG-PO4
NlaIII-3C-анализ
Тест-фрагмент
Праймер/TaqMan-проба (5’-3’)
DHS4
a/s GTGGATTGAAGGATGCTGAG
Между DHS4 и DHS3
a/s CCAAAGGACCCCAGGACTA
DHS3
s TGACACAGCACAAAAGTGAGC
Между DHS3 и DHS2
a/s AGCAATGTATGCTGACGGTG
DHS2
s AAATACATCCCATCCTGGTGTTC
Между DHS2 и DHS1
s CAGGAAAAGCCTTACTTCAAATG
DHS1
s CCGCTGCTCAGTGTCACAC
Между DHS1 и ρ
a/s CGAAGTAGGGAACCTCAACA
ρ
s AGGAGGGGAGTAAAAGGGAG
β
H
s CCCTGAACGATGAGTAGGAAGT
β
A
a/s CAGCTCTGCAGCTCTATACCG
β/ε-энхансер
s TTAATCCTCCCTGGATCATTTC
Между β/ε-энхансером и ε
a/s GCTCTGCTTACATTCACATCCA
ε (якорный)
a/sAGCGCTGCCCTACCAGAC
TM FAM-CCTTTCTC(T-BHQ1)GAAAAGGGGCCCAGGT-PO4
Между ε и 3’DHS
a/s AGCAGCCTGCAGAGGGAT
3’DHS
s GGGCATTTCTACAGAGAGCAA
ERCC3 (тест)
s CAAATCTGACAGCCGCTTAGA
ERCC3 (якорный)
s CTCGATGAAGTACATACTATTCCTG
FAM-TGGAGTGGCT(T-BHQ1)AAAAGTCGAGAGTGG-PO4
Таблица 5. Последовательности праймеров и TaqMan-проб, использованных для 3С-анализа
домена альфа-глобиновых генов кур и гена TMEM8. Символами «s» и «a/s» обозначены прямые и
обратные праймеры (в соответствии с направлением транскрипции альфа-глобиновых генов или гена
ERCC3). Остальные обозначения как в таблице 1.
Тест-фрагмент
MRE (якорный)
Выше -9DHS
Праймер/TaqMan-проба (5’-3’)
s CTTTTGAAGCCAATGTCTCTC
TM FAM-CCTCCTAACC(T-BHQ1)AACAATAAC CCACAGCAC-PO4
s TTTTCTGAGCACCTCTCTGTT
146
-9DHS (якорный)
Ниже -9DHS
Промотор/CpG-островок
NPRL3
Ген π
s GCGATATTGAATGTTCTCTAGG
TM FAM-CTGAAGGCAG(T-BHQ1)CATCCAGTACAAAGCA-PO4
s AAGAACCAGCTTACATTTTGC
s TTCACAGCACAAGGGATAACT
s ACAGGACAGTGACTGCCAAC
D
Промотор α
s ATGCCTACAACCTGCGTG
Ген αA
s AGCCAAATGAGATGAAATAAAA
3’-энхансер (якорный)
Между 3’-энхансером и
промотором TMEM8
s GGAACAAGTGTGCCAAGC
ТМ FAM-TGGTAAGAGCCAG(T-BHQ1)GCCAAATCCT-PO4
s ATACACTACAATGGGAAGCCT
Промотор TMEM8
s CCCTGTTCCCAATCCTGA
(якорный)
TM FAM-ATTGTGG(T-BHQ1)CTGGTTGATTTCTTGCTG-PO4
Ниже промотора TMEM8
s AGGAGCTATCAAATGCAGTGTCT
Выше энхансера TMEM8
s TGCCACAAACCATCGTCTCA
Энхансер TMEM8
a/s ACCTCATCACCCTTCCACAT
(якорный)
TM FAM-TGGAAACAACAG(T-BHQ1)GGCTTACTTACCCTA-PO4
Ниже энхансера TMEM8
s AGCAGAGCACATTAGACAGCA
ERCC3 (тест 1)
a/s CTGCTGGCTCATGTTAGGTTT
ERCC3 (тест 2)
a/s TCTAAGCGGCTGTCAGATTTG
ERCC3 (якорный)
a/s CAGGAATAGTATGTACTTCATCGAG
TM FAM-CCACTCTCGAC(T-BHQ1)TTTAAGCCACTCCA-PO4
Таблица 6. Последовательности праймеров и TaqMan-проб, использованных для 3С-анализа
домена бета-глобиновых генов мыши. Символами «s» и «a/s» обозначены прямые и обратные
праймеры (в соответствии с направлением транскрипции бета-глобиновых генов или гена ERCC3). В
графе «тест-фрагмент» в скобках приведена однобуквенная маркировка фрагмента (анализ абсолютных
частот лигирования). Остальные обозначения как в таблице 1.
HindIII-3С-анализ
Тест-фрагмент
Праймер/TaqMan-проба (5’-3’)
DHS-62/-60 (а)
a/s GGGTGTGGGTATTTGTAAGAG
Участок «-42» (б)
a/s ATGAACAAGTTTCATGGGG
DHS4/5 (в)
a/s TTCAAGTTCTCATCCTTCACTG
Выше промотора Hbb-b1 (г)
s AGAAGGAGATTCATCCATGCACT
Промотор Hbb-b1 (якорный)
(д)
s AATCGCTGCTCCCCCTCACT
TM FAM-ACCAAAGAAAGAGGAAA(TBHQ1)GACAACACAGAACA-PO4
147
Промотор Hbb-b1
(противоположный конец) (д)
a/s CAACACATTTGCTCAATCAACTACT
Ниже промотора Hbb-b1 (е)
a/s GATGGGAAGTAAATAACCAGCTTAAT
Olfr69 (ж)
s ACTGCACTGTCTTCCAAATCACT
s CAGACAGTTTGCAGAGATGGC
Ercc3 (якорный)
TM FAM-AGCTTTATGAAG(T-BHQ1)GAACTCAAGGCAGAGG-PO4
Ercc3 (тест)
s CCCTTCTTGATAGTGATGTGACAGT
MboI-3С-анализ
Тест-фрагмент
Праймер/TaqMan-проба (5’-3’)
DHS-62/-60 (а)
s TGTAGTTCTCTAGTGTAGCCACCAG
Участок «-42» (б)
a/s TAGATGCATGGTCTTAATGGTCC
DHS4/5 (в)
a/s TACTAATAAAAGCAAGCCATCTCG
Hbb-bh1
a/s AGATGCTTGTGATAGCTGCCTT
Выше промотора Hbb-b1 (г)
s TGAGGACTTGGTTCAGTAAATAA
Промотор Hbb-b1 (якорный)
s CTGATTCCGTAGAGCCACACC
(д)
TM FAM-CCTACCTCACC(T-BHQ1)TATATGCTCTGCCCTG-PO4
Промотор Hbb-b1
(противоположный конец) (д)
a/s ACTGCCTTCAGAGAATCACCCT
Ниже промотора Hbb-b1 (е)
a/s CTATGTCAGAAGCAAATGTGAGGAG
Olfr69 (ж)
s AAAACAAGATGAGAATCGCCTG
s CTGTCTCGTCCTGGGCAACT
Ercc3 (якорный)
TM FAM FAM-ATGGTTGACCACA(T-BHQ1)CTTAAACTGGGCTTPO4
Ercc3 (тест)
s C ATTCCTAGAGATTTACAACCCTCAC
Таблица 7. Последовательности праймеров и TaqMan-проб, использованных для определения
относительных количеств рестрикционных фрагментов домена бета-глобиновых генов мыши в
растворимой и нерастворимой фракциях 3С-материала и ПЦР-стоп-анализа. Символами «s» и «a/s»
обозначены прямые и обратные праймеры (в соответствии с направлением транскрипции бетаглобиновых генов). Остальные обозначения как в таблице 1.
Тест-фрагмент
Праймер/TaqMan-проба (5’-3’)
HS-62/-60 (HindIII-3С-
s GGTATGGTGAACTCCAGAGGG
анализ)
TM FAM-TCCAGCAGTA(T-BHQ1)CATTCCAGCCTTAAAGAC-PO4
148
a/s GTGTGCAGGGCAATAGAGGAT
HS-62/-60 (MboI-3Санализ)
s ATACCCATGCTGGTTGAATCA
TM FAM-TGAAACC(T-BHQ1)GACGCTCCTTCCAAACTG-PO4
a/s CCTGGTGGCTACACTAGAGAACT
s TATCCCGTGACTATACCTTAATGAA
Участок «-42»
TM FAM-CTTGTGGAGAA(T-BHQ1)GTCATAGACTATACGAGTGAAPO4
a/s GCCAATGTGATGAGTGCAGAG
s TACAAGTCTCCTCATGTTCCCAA
DHS4/5
TM FAM-TAGCCTCAGT(T-BHQ1)ACCCGACATTAGTTCTTAGT-PO4
a/s TTTTCAGACATACTCCTCTATCCAG
s CTATGTCTTAGGCTCCTGATTGTT
Hbb-bh1
TM FAM-CCAAACTTG(T-BHQ1)CAAAGAATCTCTGAGTCCAT-PO4
a/s GCCAGGGCAGAAGAGAGGTT
Выше промотора Hbb-b1
s AAAATTGAATAGAATCACTACTGCAC
TM FAM-AATAAGGTACA(T-BHQ1)TTGAATTGAGCATACCCTG-PO4
a/s TGCCTCTCTATTTGTATGTGAACTT
s TCAGTAGTTGATTGAGCAAATGTGT
Промотор Hbb-b1
TM FAM-TCCCTCTGAA(T-BHQ1)AATGTTTGTCCTTATCTGTG-PO4
a/s TCGGTGATGACAAGCATATTTCT
s GGCAAAGCACATTTACCTGAT
Olfr69
TM FAM-TCCACCCTCA(T-BHQ1)AGCATCCTCATAGCAT-PO4
a/s ACACTTGTTCCCTGAGATGGTT
s AATCGCTGCTCCCCCTCACT
Промотор Hbb-b1
TM FAM-ACCAAAGAAAGAGGAAA(T-BHQ1)GACAACACAGAACA-
(HindIII-ПЦР-стоп)
PO4
a/s GATGGGAAGTAAATAACCAGCTTAAT
Hbb-b1
(MboI-ПЦР-стоп)
s CTGATTCCGTAGAGCCACACC
TM FAM-CCTACCTCACC(T-BHQ1)TATATGCTCTGCCCTG-PO4
a/s CTATGTCAGAAGCAAATGTGAGGAG
Таблица 8. Последовательности праймеров и TaqMan-проб, использованных для 3С- и M3Cанализов. Символами «s» и «a/s» обозначены прямые и обратные праймеры (в соответствии с
направлением транскрипции альфа-глобиновых генов, генов cMYC или ERCC3). Остальные обозначения
как в таблице 1.
Тест-фрагмент
Праймер/TaqMan-проба (5’-3’)
3’-конец NPRL3
a/s AAGCGATCCTCAATGTCCC
149
MRE
s CTTTTGAAGCCAATGTCTCTC
CpG-островок NPRL3
s TTCACAGCACAAGGGATAACT
(якорный)
ТМ FAM-CCACAAA(T-BHQ1)CAAAGCGATGCGGTAT-PO4
Ген π
s ACAGGACAGTGACTGCCAAC
Промотор D (якорный)
s GTCAATTTCAAGGCAAGCAA
ТМ FAM-TAACCCCAAGA(T-BHQ1)CCCCTGACCTGAG-PO4
3’-энхансер
s TGCCAAGCACTGGTAAGAG
Ниже 3’-энхансера
s ATACACTACAATGGGAAGCCT
CpG-островок MPRL28
a/s AAGCAGTTCAGGTGACAGCA
(якорный)
TM FAM-CCAGAATGACCG(T-BHQ1)GAGGAGCTCTATG-PO4
Тело гена MPRL28
s TTCGAGCCCAATCAAATGTG
CpG-островок между
MPRL28 и AXIN1
Выше CpG-островка
AXIN1
s ATGTCTGTGCAGGCTGTAGGA
s ATTGGCTTGGGTTCATTGG
CpG-островок AXIN1
s CCTTGCTGAATCAACAGAACG
(якорный)
TM FAM-TAAAGGAG(T-BHQ1)AGGAATGTGCGTCTGGCT-PO4
Ниже CpG-островка AXIN1
s CAGTCAGTGCAAAGGAACCG
CpG-островок cMYC
a/s CAGAATGTGGTCTTTTTGCTCA
CpG-островок ERCC3
s CAGAATGTGGTCTTTTTGCTCA
Таблица 9. Последовательности праймеров, использованных для приготовления эквимолярной
смеси продуктов лигирования рестрикционных фрагментов, расположенных на разных
хромосомах (M3C-анализ). Все обозначения как в таблице 8.
Тест-фрагмент
CpG-островок NPRL3
CpG-островок MPRL28
CpG-островок AXIN1
CpG-островок cMYC
CpG-островок ERCC3
Праймер (5’-3’)
s TTCACAGCACAAGGGATAACT
a/s TGCTTCCTGAGATGGTAACA
s CTTTCATCGCCATCTCAGTAT
a/s AAGCAGTTCAGGTGACAGCA
s CCTTGCTGAATCAACAGAACG
a/s TAAAACAGCATGAGTTCACACCA
s GCCTACACACATCTCACCTCCT
a/s CAGAATGTGGTCTTTTTGCTCA
s CAGAATGTGGTCTTTTTGCTCA
a/s CGGTCCTTATACTTCAGATGGG
Таблица 10. Последовательности праймеров и TaqMan-проб, использованных для определения
относительных количеств фрагментов ДНК в ядерном матриксе. Все обозначения как в таблице 8.
Тест-фрагмент
Праймер/TaqMan-проба (5’-3’)
3’-конец NPRL3
s TCTGTAGGTTCCTGGCATAGC
150
a/s GTGCAGAAATTCAGACACCATAA
ТМ FAM-TCTATTCAGGAGT(T-BHQ1)TCAGAGGAGCATTCA-PO4
s GCTGCCTCATGTTTGTTAAGATA
MRE
a/s GTGACTCAGCAAGAACAGCAGA
ТМ FAM-AAGTGTTGAC(T-BHQ1)CATGGTTTGCTAGTTTGC-PO4
s TTCACAGCACAAGGGATAACT
CpG-островок NPRL3
a/s GATCTGAGCTGCATCACTAAAGT
ТМ FAM-CCACAAA(T-BHQ1)CAAAGCGATGCGGTAT-PO4
s TGTTCACCACCTATCCCCA
D
Промотор 
a/s GTTGCTCAGCTCAGCCATG
ТМ FAM-AACGCCG(T-BHQ1)GAAGAACGTGGACAAC-PO4
s CTAAGAGCCACCTCCATGAACT
CpG-островок MPRL28
a/s CTCCAATAAGGCTAAGGTAAGACA
ТМ FAM-AAGGTGGCTT(T-BHQ1)AGTCACTTTGGGTTCAT-PO4
s CCTTGCTGAATCAACAGAACG
CpG-островок AXIN1
a/s AGCCTAAGCGGGTCTTAAAATA
ТМ FAM-TAAAGGAG(T-BHQ1)AGGAATGTGCGTCTGGCT-PO4
s CAGAATGTGGTCTTTTTGCTCA
CpG-островок cMYC
a/s CCCTACGCATTGCTATTGGAT
ТМ FAM-CACACAGG(T-BHQ1)GCCCCAGCTGATCTC-PO4
s TGAAACGCAACAGGTAGGCT
CpG-островок ERCC3
a/s ATCCCAGCAGGGCTACTCTC
ТМ FAM-TGACTTCTT(T-BHQ1)CACACCACCTATGGCACC-PO4
Таблица 11. Последовательности праймеров и Molecular Beacon-проб, использованных для
INGRID-анализа. Символами «s» и «a/s» обозначены прямые и обратные праймеры (в соответствии с
направлением транскрипции бета-глобиновых генов), «MB» – Molecular Beacon-пробы. «FAM», «Cy3»,
«Cy5» – флуоресцентные красители на 5’-конце проб, «BHQ1», «BHQ2», «BHQ3» – гасители
флуоресценции на 3’-конце проб. В последовательности проб концевые самокомплементарные участки
представлены строчными буквами, центральный участок, комплементарный целевой последовательности
ДНК, подчеркнут.
Тест-участок
Длина
ампликона, п.н.
Праймер/MB-проба (5’-3’)
s GGGCTATGCTGCCATGTGAT
DHS-62
258
a/s CTTGTGTTAAGTTGGAGTGGGAA
MB FAM-cccgctACCTGCCATACAACCGAGAACTCCagcggg-BHQ1
s GAACTCTGCACTCATCACATTGG
Участок «-42»
279
a/s AGTATGTTGGCAATATCTCAAAGGT
MB Cy3-cgcgctTGTAATACAGACTAATTCTAGGGCagcgcg-BHQ2
Выше DHS5
260
s ACTTCTCCTGTTGGTGTGGCA
151
(DHS5up)
a/s AGGAAACAAAATCACCTGCACA
MB Cy3-cgcgcTGTGGTCATGGTCCTGTTAGTCTCAAGgcgcgBHQ2
s AGTGAAGGATGAGAACTTGAATGC
DHS5
250
a/s CTCTACCATGAAAATGACGCCTA
MB FAM-ccggctGAGGCGTTTTCACCACTAGAGGGagccgg-BHQ1
s TCAGTAGTTGATTGAGCAAATGTGTT
P-b1
293
a/s CTATGTCAGAAGCAAATGTGAGGAG
MB Cy3-cgcgctAAGCCTGATTCCGTAGAGCCACACCagcgcg-BHQ2
s CAAGGATAAGAACAGACACTACTCAGA
P-b2
227
a/s GAATCAGAAGCAAACGTAAGAAGC
MB Cy5-cgccgCACCCTGTGTAGATATGGTTGTCAcggcg-BHQ3
s AGCAAATGTGTCTCCCAGATGTT
Chr3
313
a/s GCTGATGAGAGTTCACCACTACCA
MB Cy3-cgcgcTGTCTCTGTTGGAGGGCTCAGGAAGgcgcg-BHQ2
Таблица 12. Последовательности праймеров и TaqMan-проб, использованных для определения
относительных количеств солюбилизированных фрагментов хроматина и количества разрывов,
вносимых в ампликоны при ультразвуковой обработке. Все обозначения как в таблице 1.
Длина
Тест-участок
амплико-
Праймер/TaqMan-проба (5’-3’)
на, п.н.
Участок «-42»
(короткий)
Участок «-42»
(длинный)
s TATCCCGTGACTATACCTTAATGAA
163
a/s GCCAATGTGATGAGTGCAGAG
TM FAM-CTTGTGGAGAA(T-BHQ1)GTCATAGACTATACGAGTGAA-PO4
s TATCCCGTGACTATACCTTAATGAA
578
a/s TGTTTAAGCATTTAGAAAGAAACTGAA
TM FAM-CTTGTGGAGAA(T-BHQ1)GTCATAGACTATACGAGTGAA-PO4
s TACAAGTCTCCTCATGTTCCCAA
DHS5
117
a/s TTTTCAGACATACTCCTCTATCCAG
TM FAM-TAGCCTCAGT(T-BHQ1)ACCCGACATTAGTTCTTAGT-PO4
s AAAATTGAATAGAATCACTACTGCAC
Выше P-b1
532
a/s ACTGCCTTCAGAGAATCACCCT
TM FAM-AATAAGGTACA(T-BHQ1)TTGAATTGAGCATACCCTG-PO4
P-b1
(короткий)
s TCAGTAGTTGATTGAGCAAATGTGT
163
a/s TCGGTGATGACAAGCATATTTCT
TM FAM-TCCCTCTGAA(T-BHQ1)AATGTTTGTCCTTATCTGTG-PO4
152
P-b1
(длинный)
Hbb-b1/Hbb-b2
(короткий)
Hbb-b1/Hbb-b2
(длинный)
s TCAGTAGTTGATTGAGCAAATGTGTT
293
a/s CTATGTCAGAAGCAAATGTGAGGAG
TM FAM-TCCCTCTGAA(T-BHQ1)AATGTTTGTCCTTATCTGTG-PO4
s AATCGCTGCTCCCCCTCACT
114
a/s GATGGGAAGTAAATAACCAGCTTAAT
TM FAM-ACCAAAGAAAGAGGAAA(T-BHQ1)GACAACACAGAACA-PO4
s AGTCTGATGGGCACCTCCTG
263
a/s GATGGGAAGTAAATAACCAGCTTAAT
TM FAM-ACCAAAGAAAGAGGAAA(T-BHQ1)GACAACACAGAACA-PO4
s GGCAAAGCACATTTACCTGAT
Olfr69
110
a/s ACACTTGTTCCCTGAGATGGTT
TM FAM-TCCACCCTCA(T-BHQ1)AGCATCCTCATAGCAT-PO4
Таблица 13. Последовательности праймеров и TaqMan-проб, использованных для оценки влияния
формальдегидной фиксации на способность амплифицировать ДНК. Символами «s» и «a/s»
обозначены прямые и обратные праймеры (в соответствии с направлением транскрипции бетаглобиновых генов), «TM» – TaqMan-пробы.
Длина
Ампликон
ампли
кона,
Праймер/TaqMan-проба (5’-3’)
п.н.
s GCAGACAGGCTGGAGAAGAC
Короткий
83
a/s GGTCATAGCCCAAAGAGCAG
TM FAM-AAGTGCTGATGG(T-BHQ1)TCCTGTTGGAGTGT-PO4
s CAGCAGAGCCACATACTCATAC
Длинный
374
a/s GGTCATAGCCCAAAGAGCAG
TM FAM-AAGTGCTGATGG(T-BHQ1)TCCTGTTGGAGTGT-PO4
s GAATGTGTCCATCTGCCCTCAT
Гетерохроматин
66
a/s GGGAAGCCATCCCTGCA
TM FAM-TGCTGAGCA(T-BHQ1)GTGGCTGCCTCC-PO4
s GCTGCCTCATGTTTGTTAAGATA
DHS
121
a/s GTGACTCAGCAAGAACAGCAGA
TM FAM-AAGTGTTGAC(T-BHQ1)CATGGTTTGCTAGTTTGC-PO4
Таблица 14. Праймеры, использованные для амплификации продуктов лигирования якорного
фрагмента с другими фрагментами генома в 4С-анализе. Символами «H» и «D» обозначены
праймеры со стороны HindIII-сайта и DpnII-сайта, соответственно.
Якорный фрагмент
Праймер (5’-3’)
TSR3
H CACTCATCTCCCCGTACTTTG
153
D AAGTTTCTTTTAATTTGGAGACTTTC
Генная пустыня
NPRL3
TRAP1
PPL
H AATTTGTGAAGCAGTTGTATGTAGTC
D TCTTCTCCACATAATCCCACACT
H CCAGGATATAGATTCTGCTTT
D CTCTGACATAATTGCCGATAG
H CCAGAGATTCTCAAATCACAGCA
D CTATGGGGACAAGTGAGGAACAG
H AAAGCATCTCCTCTCCCTGAAG
D GTCTCCCACAGTCACTCCTCCT
154
ГЛАВА III.
III.1 СТРУКТУРА
РЕЗУЛЬТАТЫ
ИНДИВИДУАЛЬНЫХ
АКТИВАТОРНЫХ
ХРОМАТИНОВЫХ БЛОКОВ
III.1.1 АКТИВАТОРНЫЙ
ХРОМАТИНОВЫЙ
БЛОК
ДОМЕНА
БЕТА-
ГЛОБИНОВЫХ ГЕНОВ КУР
Домены бета-глобиновых генов позвоночных животных являются популярной моделью
для изучения регуляции транскрипции эукариотических генов. Домен бета-глобиновых
генов кур расположен на хромосоме 1 и имеет длину около 33 т.п.н. Домен включает
кластер из 4-х бета-глобиновых генов – ρ (HBG1), βH (HBE1), βA (HBG2) и ε(HBE) – и
несколько регуляторных элементов, маркированных участками гиперчувствительности к
ДНКазе (DHS), которые контролируют
транскрипцию, репликацию и хроматиновый
статус домена (Guerrero et al., 2007; Reitman and Felsenfeld, 1990). Перед геном
эмбрионального бета-глобина ρ расположена область контроля локуса (LCR), в которой
выделяют три участка, соответствующие эритроидспецифичным DHS 1-3 (Mason et al.,
1995; Reitman et al., 1995) (см. схему домена на рис. 15A). Конститутивный DHS4,
локализованный в 5’-части LCR, маркирует позицию хорошо изученного CTCFзависимого инсулятора (Bell et al., 1999; Chung et al., 1993; Pikaart et al., 1998; RecillasTarga et al., 1999; Recillas-Targa et al., 2002). Энхансер-блокирующий элемент, активность
которого также связана со связыванием белка CTCF, локализован и на 3’-конце домена,
колокализуясь с конститутивным DHS (так называемым 3’ DHS) (Burgess-Beusse et al.,
2002; Saitoh et al., 2000). Помимо LCR, домен содержит внутренний энхансерный элемент
(β/ε-энхансер),
расположенный
между
генами
A
и
ε
и,
предположительно,
контролирующий активность этих генов (Choi and Engel, 1986; Emerson et al., 1987;
155
Reitman et al., 1990). Распределение «обязанностей» между LCR и β/ε-энхансером не
вполне ясно. Результаты экспериментов с трансгенными мышами, несущими домен бетаглобиновых генов кур, предполагают, что экспрессия одного из эмбриональных генов (ρ)
контролируется областью контроля локуса, тогда как экспрессия второго эмбрионального
гена (ε) контролируется β/ε-энхансером (Mason et al., 1995). Кроме того, оба регуляторные
элемента представляются важными для корректной экспрессии взрослых глобиновых
генов в ходе развития (Reitman et al., 1995). Домен бета-глобиновых генов кур является
одной из наиболее хорошо изученных областей генома высших эукариот (Recillas-Targa
and Razin, 2001). Этот домен обладает всеми характерными свойствами доменов
закрытого типа (доменов с четко выраженными границами), которые изменяют характер
чувствительности к ДНКазе в зависимости от типа клеток (Dillon and Sabbatini, 2000;
Razin et al., 2003). Детальный анализ распределения различных модификаций гистонов
вдоль домена внес значительный вклад в развитие гипотезы гистонового кода (Litt et al.,
2001a; Litt et al., 2001b). Между тем, механизмы, ответственные за переключение
программы экспрессии бета-глобиновых генов кур с эмбрионального на взрослый тип в
ходе развития, изучены недостаточно (Recillas-Targa and Razin, 2001). Переключение
транскрипции глобиновых генов в ходе развития характерно для всех позвоночных
животных (Guerrero et al., 2007). У кур первые молекулы эмбрионального гемоглобина
появляются в эмбриональных эритробластах через 32 часа после фертелизации (Groudine
et al., 1974). Бета-цепи гемоглобина представлены белковыми продуктами генов ρ и ε,
которые транскрибируются со 2-го по 5-й день эмбрионального развития. После 5-го дня в
кровеносном русле появляется новая популяция эритроидных клеток, экспрессирующих
гены фетального и взрослого глобинов βН and βА. Эти клетки постепенно вытесняют
эритробласты эмбрионального типа, экспрессирующие гены ρ and ε (Groudine et al., 1974).
156
В эритробластах взрослой линии транскрипция эмбриональных бета-глобиновых генов
репрессирована.
Недавние
исследования
пространственной
конфигурации
доменов
бета-
глобиновых генов человека и мыши предполагают, что в эритроидных клетках все
регуляторные
элементы
домена
собираются
в
общий
комплекс
(активаторный
хроматиновый блок), в который привлекаются промоторы эмбриональных или взрослых
глобиновых генов в зависимости от стадии развития (de Laat and Grosveld, 2003; Dostie et
al., 2006; Palstra et al., 2003; Tolhuis et al., 2002). В нашем исследовании было решено
изучить
пространственную
организацию
домена
бета-глобиновых
генов
кур
в
циркулирующих клетках крови куриных эмбрионов на стадии до (3-дневные эритроциты)
и после (9-дневные эритроциты) переключения программы экспрессии глобиновых генов
с эмбрионального на взрослый тип.
III.1.1.1 Определение уровня транскрипции бета-глобиновых генов в эритроидных
клетках 3- и 9-дневных куриных эмбрионов
Прежде всего мы проанализировали уровень первичных транскриптов 4-х бетаглобиновых генов в клетках крови 3- и 9-дневных эмбрионов кур, используя метод
обратной транскрипции с последующим ПЦР в реальном времени с TaqMan-пробами.
Чтобы исключить из анализа сплайсированные мРНК, тест-ампликоны были выбраны
таким образом, чтобы они перекрывали экзон-интронный стык. Полученные нами
результаты (рис. 13) согласуются с ранее опубликованными данными (Bruns and Ingram,
1973; Reitman and Felsenfeld, 1990). В эритроцитах 3-го дня развития активно
транскрибируются только эмбриональные бета-глобиновые гены ε и ρ, причем уровень
транскрипции гена ρ примерно в пять раз превышает уровень транскрипции гена ε. В
эритроцитах 9-го дня обнаруживаются транскрипты всех 4-х бета-глобиновых генов, при
этом наиболее представлен транскрипт гена βА (рис. 13). Присутствие небольших
157
количеств транскриптов генов ε и ρ в эритроидных клетках 9-дневных куриных эмбрионов
согласуется с более ранними наблюдениями, показывающими, что даже на 10-м дне
развития примерно 10% эритроидных клеток экспрессирует гены ε- и ρ-глобинов (Reitman
and Felsenfeld, 1990).
Рис. 13. Анализ мРНК бета-глобиновых генов в эритроидных клетках 3- и 9-дневных эмбрионов кур.
Ось Y отображает относительные количества первичных транскриптов, определенных с помощью
количественной ПЦР (последовательности праймеров и TaqMan-проб представлены в таблице 1).
Количества транскриптов бета-глобиновых генов, определенные в различных образцах РНК, были
нормированы на число клеток, использованных для выделения РНК. Количество наиболее представленного
транскрипта (ρ-транскрипт в 3-дневных эритроидных клетках) было принято за 100% и остальные значения
пересчитаны пропорционально. Линии погрешностей показывают стандартную ошибку среднего для двух
независимых экспериментов.
III.1.1.2 Анализ взаимодействия области контроля локуса и β/ε-энхансера с
промоторами бета-глобиновых генов в эритроидных клетках 3- и 9-дневных
куриных эмбрионов
Анализ пространственной организации домена бета-глобиновых генов был осуществлен с
использованием техники количественного 3С-анализа. Принципиальная схема метода 3С
представлена на рис. 14. Особенности экспериментальной процедуры будут подробно
обсуждены в разделе III.2.1. Здесь лишь отметим, что обсчет и интерпретация результатов
158
Рис. 14. Схема метода 3С: (А) Основные этапы экспериментальной процедуры (классическое
представление). Живые клетки обрабатывают формальдегидом и лизируют с помощью SDS, после чего
добавляют тритон Х-100 (не показано) и переваривают ДНК эндонуклеазой рестрикции (тритон
обеспечивает более эффективную работу фермента в присутствии SDS). Фрагменты ДНК религируют после
разбавления при низкой концентрации ДНК. Продукты лигирования очищают и анализируют с помощью
ПЦР (праймеры для ПЦР подбирают на концах рестриктных фрагментов навстречу друг другу). (Б) Дизайн
праймеров. Как правило, используют однонаправленные праймеры. С помощью таких праймеров
анализируются продукты лигирования типа «голова-к-голове» и «хвост-к-хвосту». Однонаправленность
праймеров исключает возможность образования ПЦР-продуктов на матрице недорасщепленной ДНК. Один
праймер выбирается в качестве «якорного» (отмечен овалом) и поочередно используется для ПЦР со всеми
другими праймерами. TaqMan-пробы для ПЦР в реальном времени подбирают ниже якорного праймера на
самом конце рестриктного фрагмента (проба отмечена как «TaqMan»; «F» – флуоресцентный краситель, «Q»
– гаситель флуоресценции). Таким образом, одна и та же TaqMan-проба может быть использована для всех
ПЦР с данным якорным праймером. (В) Представление данных 3С-анализа. Строится график,
показывающий частоты лигирования якорного рестрикционного фрагмента (фрагмент «a», показан темносерым) с другими фрагментами изучаемой области генома (показаны светло-серыми). Частоты лигирования
159
3С-анализа – непростая задача (Dekker, 2006). Часто оказывается достаточно сложным
различить события лигирования, отражающие реальные взаимодействия участков
хроматиновой фибриллы, от фонового лигирования и артефактов формальдегидной
фиксации. Одна из проблем в интерпретации результатов 3С-анализа заключается в том,
что соседние рестриктные фрагменты всегда лигируются с той или иной эффективностью
вследствие образования между ними случайных сшивок через нуклеосомальные белки,
даже если эти фрагменты не вовлечены в прямые пространственные взаимодействия. Для
того чтобы отличить функционально значимые взаимодействия от фонового сшивания, в
параллели с эритроидными клетками мы проводили 3С-анализ домена бета-глобиновых
генов в куриных эмбриональных фибробластах. Эти клетки не экспрессируют глобиновые
гены. Таким образом, были основания ожидать, что домен в этих клетках не принимает
какую-либо функционально значимую пространственную конфигурацию.
В большинстве экспериментов для расщепления ДНК перед стадией лигирования
была использована мелкощепящая эндонуклеаза рестрикции MboI. Эта нуклеаза
расщепляет домен бета-глобиновых генов на сравнительно мелкие фрагменты таким
образом, что промоторы бета-глобиновых генов и регуляторные элементы оказываются в
составе различных рестриктных фрагментов,
разделенных несколькими сайтами
рестрикции. Это позволяло осуществлять раздельный анализ различных регуляторных
элементов.
Сначала в качестве якорного был выбран рестриктный фрагмент, несущий DHS2
(участок LCR бета-глобинового домена). Было установлено, что в 3-дневных эритроцитах
Рис. 14 (продолжение)
выражаются как ПЦР-сигнал от соответствующей пары праймеров (с коррекцией на эффективность
праймеров). Повышенная частота лигирования свидетельствует о взаимодействии фрагментов друг с
другом. (Г) Интерпретация результатов. При получении кривой с заполненными точками делается вывод об
отсутствии взаимодействия якорного фрагмента с какими-либо другими фрагментами локуса. При
получении кривой с незаполненными точками делается вывод о взаимодействии фрагмента «а» с
фрагментами «b» и «с». Однако нет возможности сделать вывод о том, одновременное ли это
взаимодействие (a+b+c) или суперпозиция попарных взаимодействий (a+b и a+c).
160
этот якорный фрагмент предпочтительно взаимодействует с фрагментами, содержащими
промотор эмбрионального гена ρ, взрослый ген βА и β/ε-энхансер (рис. 15Б, синяя кривая).
Кроме этого, была засвидетельствована повышенная частота взаимодействия DHS2 с 5’- и
3’-концевыми
инсуляторами
домена.
Примечательно,
что
мы
не
обнаружили
взаимодействия DHS2 c эмбриональным геном ε. В 9-дневных эритроцитах частота
взаимодействия
DHS2
c
геном
βA
возросла.
Помимо
этого,
детектировалось
взаимодействие DHS2 c промотором фетального гена βH (рис. 15Б, красная кривая). В
эмбриональных фибробластах взаимодействий DHS2 c другими функциональными
элементами домена бета-глобиновых генов обнаружено не было (рис. 15Б, зеленая
кривая).
Достоверность наблюдений при анализе частот взаимодействия DHS2 была
подтверждена в экспериментах с «якорем» на промоторе гена ρ (рис. 15В), 5’-части гена
βА (рис. 15Г), 5’-части гена ε (рис. 15Е) и β/ε-энхансере (рис.15Д). Якорный фрагмент,
содержащий промотор гена ρ, продемонстрировал высокую частоту взаимодействия с
DHS 1-3 области контроля локуса в 3-дневных эритроцитах (рис. 15В, синяя кривая).
Частота взаимодействия этого фрагмента с DHS1 оставалась на том же уровне и для 9дневных эритроцитов, тогда как частота взаимодействия с DHS2 и DHS3 уменьшалась
(рис. 15В, красная кривая). Неожиданным стало обнаружение того, что в 3-дневных
эритроцитах промотор гена ρ взаимодействует с 5’-частью гена βА. Частота этого
взаимодействия в 9-дневных эритроцитах снижалась, но по-прежнему оставалась весьма
значительной (рис. 15В, синяя и красная кривые). Взаимодействие между генами ρ и β А
детектировалось также в эмбриональных фибробластах (рис. 15В, зеленая кривая). Таким
образом,
полученные
данные
могут
отражать
некоторые
особенности
161
162
пространственной организации
домена бета-глобиновых генов,
не связанные с
транскрипционным статусом домена.
Вывод о взаимодействии генов ρ и βА, сделанный по результатам 3С-анализа с
«якорем» на промоторе гена ρ, был подтвержден в реципрокном эксперименте с «якорем»
на 5’-части гена βА (рис. 15Г, все кривые). Для 3- и 9-дневных эритроцитов было также
выявлено взаимодействие гена βА с промотором гена βH. В этой связи следует отметить,
что в 3-дневных эритроцитах промотор гена βH не взаимодействует с другими якорными
фрагментами (рис. 15Б-Е, синяя кривая). Таким образом, взаимодействие генов βH и βА в
этих клетках должно происходить независимо от взаимодействия гена βА с другими
регуляторными элементами (более подробно этот факт будет рассмотрен в главе
«Обсуждение результатов»). Как и ожидалось, для 5’-части гена βА выявлено сильное
взаимодействие с DHS 1-3 области контроля локуса в 9-дневных, но не в 3-дневных
эритроцитах. Также показано, что в 9-дневных эритроцитах осуществляется и
Рис. 15. 3C-анализ домена бета-глобиновых генов кур: (А) Схема домена бета-глобиновых генов кур,
показывающая позиции важнейших регуляторных элементов. Открытые рамки обозначают гены (синими
прямоугольниками отображены экзоны, стрелки показывают направление транскрипции). Зеленые
прямоугольники обозначают DHS. 5’-инсулятор, -энхансер и 3’-инсулятор обозначены оранжевыми
овалами. FOLR1 – ген фолатного рецептора, экспрессирующийся в ранних предшественниках эритроидных
клеток; HAS – эритроидспецифичный DHS; DHS1-3 – область контроля локуса (LCR) домена бетаглобиновых генов; OR51M1 – открытая рамка считывания гена обонятельного рецептора. (Б-Ж)
Относительные частоты лигирования якорного фрагмента, несущего DHS2 (Б), промотор гена ρ (В), 5’-часть
гена βA (Г), β/ε-энхансер (Д), 5’-часть гена ε (Е) или промотор гена ε (Ж), с другими фрагментами домена. В
секциях (Б-Е) представлены результаты 3С-анализа, проведенного с использованием MboI; в секции (Ж) –
результаты 3С-анализа, проведенного с использованием NlaIII. В верхней части каждого графика дана схема
домена с такой же символикой, как в (А). На оси X показаны позиции рестрикционных фрагментов. Темносерые прямоугольники на заднем плане со значком якоря сверху демонстрируют позицию якорного
фрагмента, светло-серые прямоугольники – тест-фрагменты, границы между соседними фрагментами
обозначены темно-серыми линиями. Белые зоны соответствуют непроанализированным областям.
Галочками отмечены позиции праймеров, использованных для 3С-анализа (последовательности праймеров
и TaqMan-проб представлены в таблице 4).По оси Y отложены относительные частоты лигирования между
анализируемыми фрагментами. Частоты лигирования, определенные для различных образцов, были
нормированы на частоту лигирования фрагментов контрольной области (ген ERCC3) в этих образцах.
Наибольшая частота лигирования принята за 100% (частота лигирования фрагмента, несущего промотор
гена ρ, и фрагмента, несущего 5’-часть гена βA, в 3-дневных эритроидных клетках в случае MboI-3C-анализа;
и частота лигирования фрагмента, несущего DHS1, и фрагмента, несущего DHS2, в 3-дневных эритроидных
клетках в случае NlaIII-3C-анализа (данные не показаны)), и остальные значения пересчитаны
пропорционально. Линии погрешностей соответствуют стандартной ошибке среднего для трех (Б-Е) или
двух (Ж) независимых экспериментов.
163
взаимодействие гена βA с β/ε-энхансером (рис. 15Г, красная кривая). Хотя в данном случае
якорный фрагмент (5’-часть гена βA) и тест-фрагмент (β/ε-энхансер) расположены близко
друг к другу, частота взаимодействия этих фрагментов в 9-дневных эритроцитах
значительно
превышала
фибробластах,
что
взаимодействия
между
таковую
предполагает
геном
βA
в
3-дневных
эритроцитах
существование
и
β/ε-энхансером
и
эмбриональных
функционально
в
эритроидных
значимого
клетках,
экспрессирующих взрослые глобиновые гены (9-дневные эритроциты). Этот вывод
подтверждается результатами реципрокного эксперимента с «якорем» на β/ε-энхансере.
Действительно, в 9-дневных эритроцитах β/ε-энхансер демонстрирует более высокую
частоту взаимодействия с 5’-частью гена βA, чем в 3-дневных эритроцитах и
эмбриональных фибробластах (рис 13Д, красная кривая). Кроме этого, в 9-дневных
эритроцитах β/ε-энхансер взаимодействует с промотором фетального гена βH. Напротив, в
3-дневных эритроцитах с β/ε-энхансером предпочтительно взаимодействует промотор
эмбрионального гена ρ, тогда как промотор гена βH не участвует во взаимодействии (рис.
15Д, синяя кривая). Наконец, для обоих типов эритроидных клеток, но не эмбриональных
фибробластов, выявлено взаимодействие β/ε-энхансера с DHS 1-3 области контроля
локуса.
Примечательно,
что
мы
не обнаружили
взаимодействия
β/ε-энхансера
с
эмбриональным геном ε ни для одного из исследованных типов клеток (рис. 15Д). В
соответствии с этим наблюдением, эксперименты с «якорем» на 5’-части гена ε показали
отсутствие взаимодействия этого гена с какими-либо тест-фрагментами, использованными
в настоящем анализе, в эритроидных и неэритроидных клетках (рис. 15Е). Отсюда
следует, что ген ε не взаимодействует с какими-либо регуляторными элементами домена.
Для проверки этого результата мы провели 3С-анализ с использованием другой
эндонуклеазы рестрикции – NlaIII. Сайты узнавания этой рестриктазы распределены в
164
бета-глобиновом домене таким образом, что было возможным провести анализ
непосредственно для промотора гена ε. Для анализа были использованы 3-дневные
эритроциты и эмбриональные фибробласты. Как и в случае анализа с использованием
рестриктазы MboI, мы не выявили взаимодействий гена ε с какими-либо регуляторными
элементами домена (рис. 15Ж). Частота взаимодействия промотора гена ε со всеми
проанализированными фрагментами бета-глобинового домена была похожей для 3дневных эритроидных клеток,
экспрессирующих ген ε, и
для эмбриональных
фибробластов, которые вовсе не экспрессируют глобиновые гены.
III.1.1.3 Взаимодействие между 5’- и 3’-концевыми инсуляторами домена бетаглобиновых генов
На рис. 16 представлены результаты экспериментов, в которых в качестве якорных были
использованы рестриктные фрагменты, несущие 5’- и 3’-концевые инсуляторы домена
бета-глобиновых генов. Видно, что в эритроидных клетках эмбрионов 3-го и 9-го дней
развития инсуляторы взаимодействуют друг с другом, что должно приводить к
формированию петли хроматина, захватывающей весь домен бета-глобиновых генов. В
дополнение к этому, в 9-дневных эритроцитах оба инсулятора демонстрируют
взаимодействие с β/ε-энхансером, тогда как в 3-дневных эритроцитах 5’-концевой
инсулятор взаимодействует с генами ρ и βА (рис. 16). Наконец, в обоих типах
эритроидных клеток инсуляторы проявляют повышенную частоту взаимодействия с
областью контроля локуса (участок DHS3). В эмбриональных фибробластах мы не
обнаружили
взаимодействия
инсуляторов
ни
между
собой,
ни
с
другими
функциональными участками домена бета-глобиновых генов (рис. 16, зеленая кривая).
Полученные результаты позволили построить модели пространственной организации
домена бета-глобиновых генов кур в эритроидных клетках до и после переключения
165
Рис. 16. 3C-анализ пространственного взаимодействия краевых инсуляторов домена бета-глобиновых
генов кур. Представлены относительные частоты лигирования якорного фрагмента, несущего 5’-инсулятор
(А) или 3’-инсулятор (Б), с другими фрагментами домена. Все обозначения как на рис. 15.
программы экспрессии с эмбрионального на взрослый тип и проследить за изменениями в
структуре домена, напрямую связанными с активацией и переключением транскрипции
глобиновых генов (см. главу «Обсуждение результатов»).
III.1.2 ОБЪЕДИНЕННЫЙ АКТИВАТОРНЫЙ ХРОМАТИНОВЫЙ БЛОК АЛЬФАГЛОБИНОВЫХ ГЕНОВ И ГЕНА TMEM8
Домены альфа-глобиновых генов позвоночных животных относятся к доменам открытого
типа (доменам с невыраженными границами). Такие домены располагаются в богатых
генами областях хромосом и часто перекрываются с функционально и филогенетически
не связанными генами, в частности, с генами домашнего хозяйства, в связи с чем
характеризуются высокой чувствительностью к ДНКазе во всех типах тканей, независимо
166
от транскрипционного статуса присутствующих в этих доменах тканеспецифичных генов.
Границы доменов открытого типа и их функциональная изоляция определяются не
наличием инсулятов, а распределением и специфичностью действия регуляторных
элементов в отношении определенных промоторов (Razin et al., 2003). Сравнительный
анализ геномов 22 видов позвоночных показал, что домен альфа-глобиновых генов
консервативен в эволюции и включает кластер собственно альфа-глобиновых генов и ген
домашнего хозяйства NPRL3, в одном из интронов которого находится главный
регуляторный элемент, контролирующий работу альфа-глобиновых генов (Hughes et al.,
2005) (см. рис. 18А). Не только альфа-глобиновые гены и их регуляторные элементы
эволюционно консервативны – консервативно также и их окружение. Область синтении
(т.е. одинакового порядка расположения генов у разных видов) вокруг кластера альфаглобиновых генов гораздо шире самого кластера – она включает собственно глобиновые
гены и три гена домашнего хозяйства, расположенные перед кластером альфа-глобиновых
генов. Участок, непосредственно следующий за альфа-глобиновыми генами, у кур и
млекопитающих отличается порядком расположения генов. Несколько генов-ортологов,
граничащих с кластером альфа-глобиновых генов, расположены в инвертированном
порядке у курицы по сравнению с человеком и рядом других позвоночных (рис. 17).
Вследствие этого у кур ген TMEM8 оказался в непосредственной близости к кластеру
альфа-глобиновых генов, тогда как у человека он расположен на расстоянии 170 т.п.н. от
него. Таким образом, в ходе эволюции на одной из границ альфа-глобинового домена
произошло
нарушение
консервативного
расположения
генов
и,
возможно,
перераспределение установившихся взаимодействий удаленных регуляторных элементов.
Мы предположили, что это перемещение могло повлиять и на характер экспрессии гена
TMEM8 и хроматиновую конфигурацию всего альфа-глобинового домена.
167
Гены, «обрамляющие» хромосомную инверсию, хорошо изучены и не являются
эритроидспецифичными у человека. Человеческий ортолог TMEM8 экспрессируется в
поджелудочной железе, плаценте, селезенке и лимфоцитах, где он является маркером их
неактивного состояния (Motohashi et al., 2000). В исследованиях нашей лаборатории,
Рис. 17. Схема, иллюстрирующая инвертированный порядок генов ниже кластера альфа-глобиновых
генов на хромосоме 14 курицы и хромосоме 16 человека. Гены обозначены черными прямоугольниками,
стрелка справа от названия гена указывает направление транскрипции, геномные координаты даны в
соответствии со сборками генома курицы galGal4 и человека GRCh38.p2. Названия генов даны в
соответствии с номенклатурой Genes-seq (NCBI). Инвертированный фрагмент показан серым
прямоугольником и включает гены от TMEM8 до LUC7L.
168
проведенных
в
параллели
с
настоящей
диссертационной
работой,
было
продемонстрировано, что куриный ген TMEM8, в отличие от человеческого, не
экспрессируется в лимфоидных клетках. У кур этот ген обладает ярко выраженным
эритроидспецифичным характером экспрессии. Более того, индукция эритроидной
дифференцировки в культуре клеток вызывала увеличение уровня экспрессии не только
глобиновых генов, но и гена TMEM8. Одновременно было показано, что в одном из
интронов
куриного
гена
TMEM8
расположен
эритроидспецифичный
энхансер,
работающий при участии транскрипционного фактора GATA1. В совокупности
полученные результаты свидетельствовали о том, что в геноме кур произошло
расширение функциональных границ домена альфа-глобиновых генов по сравнению с
геномами млекопитающих.
Продолжая изучение экспансии функционального домена альфа-глобиновых генов
в геноме кур, мы решили получить ответ на вопрос, контролируется ли экспрессия гена
TMEM8 известными регуляторными элементами домена альфа-глобиновых генов. Ранее в
нашей лаборатории с использованием метода фиксации конформации хромосомы (3С)
была детально охарактеризована хроматиновая конфигурация домена альфа-глобиновых
генов кур. Было продемонстрировано, что в терминально дифференцированных
эритробластах собирается активаторный хроматиновый блок, включающий промотор
взрослого альфа-глобинового гена D, главный регуляторный элемент MRE (Major
Regulatory Element), -9 DHS (эритроидспецифичный участок гиперчувствительности к
ДНКазе, расположенный на расстоянии 9 т.п.н. выше кластера глобиновых генов), CpGостровок домена и 3’-концевой энхансер (Gavrilov and Razin, 2008). Было логично
предположить, что ген TMEM8 также привлекается к этому хроматиновому блоку. Для
проверки этого предположения был проведен количественный 3С-анализ. Как и в
предыдущем исследовании (Gavrilov and Razin, 2008), мы сравнили пространственную
169
Рис. 18. 3С-aнализ взаимодействия промотора гена TMEM8 с регуляторными элементами домена
альфа-глобиновых генов в неэритроидных и трансформированных эритроидных клетках кур: (А)
Схема анализируемой области генома (выше) и ее BamHI/BglII-рестрикционная карта (ниже). На схеме:
красные прямоугольники – альфа-глобиновые гены, зеленый прямоугольник – ген NPRL3 (белые участки
соответствуют экзонам, стрелками показано направление транскрипции); красные овалы – MRE, 3’-энхансер
и энхансер ТМЕМ8; толстая черная стрелка – -9DHS; желтые окружности – CpG-островки. На карте:
170
организацию анализируемого участка генома в лимфоидных (DT40) и эритроидных
клетках (пролиферирующие эритробласты линии HD3 и те же клетки, индуцированные в
терминальную эритроидную дифференцировку). Фрагментацию ДНК в 3С-анализе
осуществляли с использованием эндонуклеаз рестрикции BamHI и BglII. Позиции
праймеров и TaqMan-проб представлены на рис. 18А. Вначале мы проанализировали
взаимодействие
расположенными
рестрикционного
ниже
фрагмента,
кластера
несущего
альфа-глобиновых
MRE,
генов.
с
фрагментами,
Единственным
взаимодействием, детектированным в нашей работе, было взаимодействие MRE c 3’концевым энхансером в дифференцированных клетках HD3. Это взаимодействие было
идентифицировано еще в нашем предыдущем исследовании (Gavrilov and Razin, 2008),
однако других взаимодействий обнаружено не было. Промотор гена TMEM8 и фрагменты
из «тела» гена не демонстрировали повышенной частоты взаимодействия с якорным
фрагментом, несущем MRE (рис. 18Б). Иные результаты были получены при анализе, в
котором в качестве якорного был использован рестриктный фрагмент, несущий -9DHS. В
клетках HD3, в добавок к 3’-концевому энхансеру, данный фрагмент демонстрировал
повышенную частоту взаимодействия с двумя фрагментами, расположенными ниже
энхансера, а именно: с фрагментом, содержащим промотор гена TMEM8, и фрагментом
внутри гена TMEM8, в пределах которого расположен GATA-специфичный энхансер.
Частота ассоциации -9DHS с фрагментом внутри гена TMEM8 была примерно одинаковой
в пролиферирующих и дифференцированных клетках HD3. Напротив, частота ассоциации
Рис. 18 (продолжение)
короткие насечки – BglII-сайты, длинные насечки – BamHI-сайты; точка «0» соответствует 3’-концу гена
NPRL3, размерность шкалы представлена в т.п.н. Позиции праймеров и TaqMan-проб, использованных для
3С-анализа, отмечены соответственно галочками и черточками над картой (последовательности
представлены в таблице 5). (Б-Е) Относительные частоты лигирования между якорными рестрикционными
фрагментами, несущими MRE (Б), -9DHS (В), 3’-энхансер (Г), промотор ТМЕМ8 (Д) или энхансер ТМЕМ8
(Е), и другими фрагментами домена. По оси Y показаны частоты лигирования между анализируемыми
фрагментами, нормированные относительно частоты лигирования между фрагментами гена ERCC3 в том же
образце (принята за 1). Линии погрешностей соответствуют стандартной ошибке среднего для трех
независимых экспериментов. Остальные обозначения как на рис. 15.
171
-9DHS с промотором ТМЕМ8 была примерно втрое выше в дифференцированных клетках
HD3 по сравнению с пролиферирующими (рис. 18В). В экспериментах с «якорем» на 3’концевом энхансере мы детектировали высокую частоту взаимодействия с промотором
гена TMEM8 и участком гена TMEM8, несущим GATA-специфичный энхансер, в
дифференцированных клетках HD3 (рис. 18Г). Кроме того, в подтверждение ранее
полученных данных (Gavrilov and Razin, 2008), в этих клетках наблюдался повышенный
уровень взаимодействия 3’-концевого энхансера с -9DHS. Все указанные взаимодействия
отсутствовали в клетках DT40 (рис. 18В,Г).
В совокупности, результаты, представленные на рис. 18 В и Г, указывают на то, что
-9DHS вовлечен в регуляцию транскрипции гена TMEM8 в пролиферирующих клетках
HD3, -9DHS в паре 3’-концевым энхансером домена альфа-глобиновых генов – в
дифференцированных клетках HD3. Мишени данных регуляторных элементов, по всей
видимости, локализованы в пределах BamHI-BglII-фрагмента, содержащего промотор
гена TMEM8, и BamHI-BglII-фрагмента из внутренней части гена, несущего GATAспецифичный энхансер. Для проверки этого предположения мы провели 3С-анализ с
«якорями» на том и другом фрагментах. Полученные результаты (рис. 18 Д и Е)
свидетельствуют о том, что в дифференцированных клетках HD3 эти фрагменты
взаимодействуют друг с другом, а также с -9DHS и 3’-концевым энхансером. В
соответствии с наблюдениями, сделанными в экспериментах с «якорем» на -9DHS (рис.
18В), в реципрокном эксперименте было показано, что частота ассоциации промотора
TMEM8 c -9DHS существенно меньше в пролиферирующих клетках HD3 по сравнению с
теми же клетками, индуцированными в терминальную эритроидную дифференцировку
(рис. 18Д). Было также подтверждено, что частоты взаимодействия внутреннего участка
гена
TMEM8,
содержащего
GATA-специфичный
энхансер,
с
-9DHS
схожи
в
пролиферирующих и дифференцированных клетках HD3 (рис. 18Е). Интересно, что ни
172
один из двух проанализированных фрагментов не взаимодействует с промоторами
взрослых глобиновых генов αD и αА. Это позволяет предположить, что альфа-глобиновый
домен может принимать две альтернативные хроматиновые конфигурации, при которых
-9DHS и 3’-концевой энхансер активируют либо глобиновые гены, либо ген TMEM8. Эти
регуляторные элементы должны, таким образом, курсировать между двумя различными
активаторными хроматиновыми блоками.
III.2 МЕХАНИЗМЫ
КОНТАКТОВ
УДАЛЕННЫХ
РЕГУЛЯТОРНЫХ
ЭЛЕМЕНТОВ ГЕНОМА
III.2.1 ПЕРЕОСМЫСЛЕНИЕ ПРОЦЕДУРЫ 3С: ЛИГИРОВАНИЕ В ЯДРЕ, А НЕ В
РАСТВОРЕ
Успехи последних лет в изучении пространственной организации эукариотического
генома стали возможными благодаря развитию техники фиксации конформации
хромосомы (3С) и набора производных методов, позволяющих оценивать степень
пространственной близости различных фрагментов генома в клеточном ядре (de Wit and
de Laat, 2012; Dekker et al., 2002a; Ethier et al., 2012). Все эти методы известны под общим
названием C-методов. С использованием оригинального протокола 3С де Лаат и соавт.
продемонстрировали, что в эмбриональных эритробластах мыши удаленные регуляторные
элементы домена бета-глобиновых генов организованы в общий комплекс, к которому
привлекаются промоторы активных на данной стадии развития бета-глобиновых генов
(Tolhuis et al., 2002). На основании этих наблюдений была предложена модель
активаторного хроматинового блока, которая в настоящее время поддерживается большим
количеством экспериментальных данных (de Laat and Grosveld, 2003; Gavrilov and Razin,
2008; Palstra, 2009; Palstra et al., 2008a; Tolhuis et al., 2002; Vernimmen et al., 2007;
173
Vernimmen et al., 2009). Полногеномные варианты 3С-анализа (Fullwood et al., 2009;
Lieberman-Aiden et al., 2009; Simonis et al., 2006; Zhao et al., 2006) позволили
исследователям изучить множество важных биологических вопросов, в частности,
выяснить принципы укладки эукариотических хромосом (Duan et al., 2011; LiebermanAiden et al., 2009; Zhang et al., 2012), проанализировать состав транскрипционных фабрик
(Schoenfelder et al., 2010b) и др. Учитывая непрырывно растущий спектр задач,
выполняемых с использованием С-методов, и важность выводов по результатам уже
законченных исследований, крайне важно иметь ясное представление о том, как эти
методы работают и каковы ограничения их применения.
В основе всех С-методов лежит принцип предпочтительного лигирования
близкорасположенных фрагментов ДНК (de Wit and de Laat, 2012). Экспериментальный
протокол включает формальдегидную фиксацию ДНК-белковых комплексов in vivo с
последующей
полученных
обработкой
фрагментов
ДНК
ДНК
эндонуклеазами
(см.
рис.
14А).
рестрикции
Фрагменты,
и
религированием
расположенные
в
непосредственной близости друг от друга, имеют большие шансы встретиться и быть
сшитыми лигазой. Это относится, в частности, и к фрагментам, находящимся в составе
одного ДНК-белкового комплекса. Согласно экспериментальной процедуре, клетки после
фиксации обрабатываются детергентами и рестрикция также проводится в присутствии
детергента (SDS). Авторы протокола считали, что такая обработка обеспечивает
высвобождение ДНК-белковых комплексов из ядер в раствор. Дальнейшее лигирование
проводили после сильного разведения материала. Понижение концентрации ДНК должно
было минимизировать лигирование фрагментов, не объединенных белковыми сшивками,
в то время как вероятность лигирования фрагментов, сшитых через белковые мостики,
будет оставаться высокой независимо от концентрации (см. рис. 14А). В этой связи
частоту лигирования различных фрагментов ДНК рассматривали как прямой показатель
174
вероятности их нахождения в составе одного ДНК-белкового комплекса. После
лигирования формальдегидные сшивки «расшиваются», и продукты лигирования
анализируются и «подсчитываются» с помощью количественной ПЦР, секвенирования
или других технических приемов (de Wit and de Laat, 2012). Очевидно, что солюбилизация
фрагментов хроматина является необходимым условием для реализации принципа
предпочтительного лигирования (по крайней мере в том виде, в котором он представлен
выше).
Между
фиксированных
тем
известно,
формальдегидом
что
ядер
солюбилизация
представляет
фрагментов
собой
хроматина
сложную
задачу,
из
за
исключением случаев использования ультразвуковой обработки для внесения разрывов в
ДНК и физического разобщения материала ядер. Таким образом, на одном из этапов
работы мы решили изучить степень солюбилизации фрагментов хроматина из
фиксированных формальдегидом ядер в процедуре 3С-анализа.
III.2.1.1 Распределение ДНК и гистонов между растворимой и нерастворимой
фракциями при обработке фиксированных ядер SDS и эндонуклеазами
рестрикции
Для анализа степени солюбилизации хроматина в процедуре 3С были выбраны клетки
печени и мозга эмбрионов мыши (см. рис. 38А). Именно на этих клетках впервые были
осуществлены эксперименты по 3С-анализу домена бета-глобиновых генов (клетки
печени служили источником эритроидных клеток, клетки мозга – контрольных
неэритроидных клеток) (Tolhuis et al., 2002). Использование данной клеточной модели
создавало возможность для последующего анализа частоты лигирования фрагментов бетаглобинового домена отдельно в растворимой и (при наличии) нерастворимой фракциях
материала и сравнения полученных результатов с ранее опубликованными данными
(Tolhuis et al., 2002).
175
В
первой
серии
экспериментов
ядра,
выделенные
из
фиксированных
формальдегидом клеток, инкубировали в лизирующем буфере, содержащем SDS (в
соответствии со стандартным протоколом 3С (Dekker et al., 2002a; Tolhuis et al., 2002)), и
обрабатывали рестриказой HindIII. Реакцию останавливали добавлением SDS до
финальной концентрации 1.6% и инкубацией при 65°C в течение 20 мин. Растворимый и
нерастворимый материал разделяли центрифугированием (16000 g, 20 мин). После отбора
супернатанта нерастворимый материал (осадок) ресуспендировали в буфере того же
состава, что и супернатант. Полученную суспензию и супернатант разделяли на две части.
Первую часть разводили лигазным буфером и осуществляли реакцию лигирования, как в
стандартном протоколе 3С (Dekker et al., 2002a; Tolhuis et al., 2002), после чего выделяли
ДНК. Из второй части сразу выделяли ДНК, минуя стадию лигирования. При анализе
полученных образцов ДНК неожиданно выяснилось, что большая часть ДНК (85 и 70% в
экспериментах с клетками печени и мозга, соответственно) остается в нерастворимой
фракции (рис. 19А, столбики «Hind»). Распределение фрагментов ДНК по размерам было
очень похожим для растворимой и нерастворимой фракций, и в обоих случаях фрагменты
ДНК были лигируемы (рис. 19Б, панели «Hind»). Мы повторили описанные выше
эксперименты с использованием рестриктазы MboI вместо HindIII. Рестриктаза MboI
узнает последовательность из 4-х нуклеотидов (GATC) и, таким образом, расщепляет
ДНК на более мелкие фрагменты по сравнению с рестриктазой HindIII, узнающей 6нуклеотидную последовательность (AAGCTT). Действительно, анализ распределения
фрагментов ДНК по размеру показал, что при использовании MboI образуются более
короткие фрагменты, чем в случае HindIII (рис. 19Б, панели «Mbo»). Степень
солюбилизации этих коротких фрагментов повышалась (рис. 19А, столбики «Mbo»).
Несмотря на это, значительное количество ДНК (~60 и ~25% в случае клеток печени и
мозга, соответственно) оставалось в нерастворимой фракции. Отметим также, что MboI176
Рис 19. Распределение ДНК и гистонов между растворимой и нерастворимой частями 3С-материала и
молекулярно-массовое распределение фрагментов ДНК: (А) Относительные количества ДНК в
растворимой (супернатант) и нерастворимой (осадок) фракциях 3С-материала по данным
флуорометрического определения концентрации ДНК. В каждом эксперименте общее количество ДНК в
двух фракциях взято за 100%. (Б) Электрофоретическое разделение ДНК из растворимой и нерастворимой
фракций 3С-материала до и после лигирования (агарозный гель, окраска бромистым этидием). М –
маркерная ДНК. (В, Г) Распределение гистонов между растворимой и нерастворимой фракциями 3Сматериала. Белки, представленные в равных аликвотах растворимого и нерастворимого 3С-материала, были
разделены в ПААГ и визуализованы иммуноблотингом с антителами против гистона H3 (В) или окрашены
Кумасси (Г). Интенсивность полос была оценена с помощью программы ImageJ. В каждом эксперименте
общее количество гистонов в двух фракциях взято за 100%. Линии погрешностей соответствуют
стандартной ошибке среднего для трех независимых экспериментов.
177
фрагменты из обеих фракций 3С-материала лигировались при обработке лигазой, как и в
случае HindIII-фрагментов, о чем свидетельствует увеличение длины фрагментов ДНК
после реакции (рис. 19Б, панели «Mbo»).
Далее мы проанализировали распределение гистонов между растворимой и
нерастворимой фракциями 3С-материала. Для этого образцы были подвергнуты
ультразвуковой обработке для уменьшения размера фрагментов ДНК и проинкубированы
в течение 1 ночи при 65°C для обращения формальдегидных сшивок. Белки затем были
разделены в 15% ПААГ и либо напрямую окрашены Кумасси-бриллиантовым синим (рис.
19В), либо перенесены на мембрану с последующей визуализацией гистона H3 с помощью
иммуноокрашивания (рис. 19Г). Результаты типичного эксперимента показаны в верхней
части рисунка, обсчет данных трех независимых экспериментов – в нижней. Видно, что
распределение гистонов между растворимой и нерастворимой фракциями не повторяет
распределение ДНК. В случае клеток печени значительная часть гистонов (75-80%)
солюбилизируется в результате обработки фиксированных ядер SDS и эндонуклеазой
HindIII, тогда как бóльшая часть ДНК (85%) остается в нерастворимой фракции (см.
выше). Данный результат может быть объяснен неполной пришивкой гистонов к ДНК.
III.2.1.2 Предпочтительное
организованных
лигирование
в
единый
фрагментов,
активаторный
предположительно
комплекс,
происходит
в
нерастворимой фракции 3С-материала
В первую очередь мы воспроизвели эксперименты по 3С-анализу домена бета-глобиновых
генов мыши, опубликованные Толхиусом и соавт. (Tolhuis et al., 2002). 3С-анализ был
проведен по стандартному протоколу с использованием рестриктазы HindIII. В полном
соответствии с результатами указанной работы в клетках печени (эритроидные клетки)
якорный фрагмент, включающий промотор мажорного бета-глобинового гена Hbb-b1,
показал повышенную частоту лигирования с участком гиперчувствительности к ДНКазе I
178
4/5 (DHS4/5) области контроля локуса и более отдаленным DHS-62/-60, тогда как частота
взаимодействия с участком «-42» (отрицательный контроль) была ниже (рис. 20А, левый
график). В клетках мозга указанных пиков 3С-сигнала обнаружено не было. Частота
лигирования уменьшалась с увеличением расстояния между якорным фрагментом и тестфрагментом, опять же в соответствии с ранее опубликованными данными (Dekker et al.,
2002a; Tolhuis et al., 2002). Основные результаты 3C-анализа, проведенного с
использованием рестриктазы HindIII, были подтверждены в экспрериментах, в которых
для расщепления фиксированного хроматина использовалась рестриктаза MboI (рис. 20А,
правый график).
Продукты лигирования, полученные в описанных выше экспериментах, могли
образовываться в обеих частях 3С-материала без каких-либо предпочтений, либо
преимущественно или даже исключительно в растворимой или нерастворимой фракции.
Для выбора между этими возможностями мы проанализировали частоты лигирования
отдельно в растворимой и нерастворимой фракции 3С-материала, полученного в
экспериментах с HindIII и MboI. Для начала мы сравнивали частоты лигирования в равных
аликвотах растворимого и нерастворимого материала, не принимая во внимание, что
количество ДНК в этих аликвотах существенно различается. Результаты этих
экспериментов (рис. 20Б) ясно показали, что практически все 3С-сигналы, детектируемые
в экспериментах с нефракционированным материалом, происходят из нерастворимой
фракции. В самом деле, в нерастворимом 3С-материале, полученном из эритроидных
клеток, наблюдалась повышенная частота лигирования якорного фрагмента (промотор
гена Hbb-b1) с DHS4/5 и DHS-62/60 и относительно низкая частота лигирования с
участком «-42». При анализе растворимой фракции 3С-материала из тех же клеток
характерного подъема частот лигирования на элементах DHS4/5 и DHS-62/-60
179
180
обнаружено не было. Более того, даже частоты лигирования якорного фрагмента с
соседними рестриктными фрагментами были заметно снижены. В растворимой части 3Сматериала, приготовленного из клеток мозга, частота лигирования якорного фрагмента с
соседними фрагментами была также снижена (рис. 20Б, левый график). Как и в
экспериментах с нефракционированным 3С-материалом, использование рестриктазы MboI
дало очень похожие результаты (рис. 20Б, правый график). Характерные профили 3Ссигналов в растворимой и нерастворимой фракциях не претерпели существенных
изменений и после того, как экспериментально определенные частоты лигирования были
нормированы на количество ДНК в различных образцах (рис. 20В). Представление
результатов по растворимой фракции на отдельном графике (в масштабе, позволяющем
лучше различать слабые взаимодействия) не выявляет увеличения 3С-сигналов на
элементах DHS4/5 и DHS-62/-60 в эритроидных клетках (рис. 20Г).
Для правильной интерпретации изложенных выше результатов необходимо
Рис. 20. Частоты лигирования фрагмента, несущего промотор гена Hbb-b1, c несколькими
выбранными фрагментами домена бета-глобиновых генов в растворимой и нерастворимой фракциях
3С-материала: (А) Результаты стандартного 3С-анализа, выполненного без фракционирования 3Сматериала. (Б) Результаты 3С-анализа, выполненного отдельно на растворимой (супернатант) и
нерастворимой (осадок) фракциях. (В) То же, что (Б), после нормирования частот лигирования на
количество ДНК в образце. (Д) То же, что (В), только растворимая фракция. В верхней части каждого
графика представлена схема домена. Бета-глобиновые гены, гены обонятельных рецепторов и участки
гиперчувствительности к ДНКазе показаны, соответственно, красными стрелками, голубыми стрелками и
черными вертикальными линиями. Шкала оси Х – в т.п.н. согласно сборке генома мыши mm9, точка «0»
соответствует началу гена эмбрионального бета-глобина Hbb-y. Согласно сборке mm9, DHS-62 и DHS-60 и
участок «-42» расположены в координатах -60, -58 и -38, соответственно, однако сохранены оригинальные
названия элементов, используемые в работе (Tolhuis et al., 2002). По оси Y показаны относительные частоты
лигирования между анализируемыми фрагментами. Частоты лигирования, определенные для различных
образцов, были нормированы на частоту лигирования фрагментов гена ERCC3 в этих образцах (А) или на
суммарную частоту лигирования фрагментов гена ERCC3 в растворимой и нерастворимой фракциях (Б-Г).
Наибольшая частота лигирования принята за 100% (частота лигирования якорного рестрикционного
фрагмента и вышележащего фрагмента в нефракционированном 3С-материале из клеток печени (А), в
нерастворимой фракции из клеток печени (Б, В) или в растворимой фракции из клеток мозга (Г)) и
остальные значения пересчитаны пропорционально. Последовательности праймеров и TaqMan-проб,
использованных для 3С-анализа, представлены в таблице 6. Красными и синими линиями представлены
результаты для эритроидных и неэритроидных клеток, соответственно (клетки печени и мозга эмбрионов
мыши); сплошными линиями показаны результаты для нефракционированного (суммарного) 3С-материала
(А) или нерастворимого 3С-материала (Б, В); пунктирными линиями показаны результаты для растворимого
3С-материала. Частоты лигирования HindIII- и MboI-фрагментов представлены на графиках слева и справа,
соответственно. Линии погрешностей соответствуют стандартной ошибке среднего для трех независимых
экспериментов. Остальные обозначения как на рис. 15.
181
рассмотреть возможность неравной солюбилизации различных фрагментов ДНК после
обработки фиксированных ядер SDS и эндонуклеазами рестрикции. В предельном случае
какие-то фрагменты могут полностью отсутствовать в растворимой или нерастворимой
фракции. Понятно, что это будет оказывать влияние на частоты лигирования. Для учета
подобных эффектов мы определили относительные количества всех исследованных
фрагментов домена бета-глобиновых генов в растворимой и нерастворимой фракциях 3Сматериала. В случае использования рестриктазы HindIII было показано, что с увеличением
длины фрагмента степень солюбилизации падает (рис. 21А,Б). Однако мы не выявили
Рис. 21. Распределение анализируемых рестрикционных фрагментов домена бета-глобиновых генов
мыши между растворимой и нерастворимой частями 3С-материала. Представлены относительные
количества указанных фрагментов в растворимой (супернатант) и нерастворимой (осадок) фракциях 3Сматериала в экспериментах на клетках мозга с рестриктазой HindIII (А), клетках печени с рестриктазой
HindIII (Б), клетках мозга с рестриктазой MboI (В) и клетках печени с рестриктазой MboI (Г) по данным
количественной ПЦР с праймерами к внутренним участкам рестрикционных фрагментов
(последовательности праймеров и TaqMan-проб приведены в таблице 7). Суммарное количество каждого
фрагмента в двух фракциях принято за 100%. Зеленые столбики на заднем плане на каждом графике
показывают размер рестрикционных фрагментов в соответствии со шкалой, представленной справа от
графика. Линии погрешностей соответствуют стандартной ошибке среднего для двух независимых
экспериментов.
182
корреляции
между
относительным
количеством
фрагмента
в
растворимой
и
нерастворимой фракциях 3С-материала и наблюдающейся частотой лигирования. К
примеру, в случае клеток печени два наиболее длинных HindIII-фрагмента, включающих
DHS4/5 и ген Olfr59, практически полностью (95%) находятся в составе нерастворимой
фракции, однако только один из них (DHS4/5) преимущественно лигируется с
промотором гена Hbb-b1. В растворимой фракции наибольшая частота лигирования
наблюдается для фрагмента, локализованного в непосредственной близости от якорного
фрагмента, и этот фрагмент не является тем, что представлен на наиболее высоком уровне
в этой фракции (рис. 21Б). MboI-фрагменты распределялись между растворимой и
нерастворимой фракциями 3С-материала более или менее случайным образом независимо
от их размера, и различия в распределении различных фрагментов между двумя
фракциями не превышали полутора-двух раз (рис. 21В, Г). Точно так же, мы не выявили
корреляции
между относительным
количеством
фрагмента
в
растворимой
или
нерастворимой фракции 3С-материала и частотой лигирования этого фрагмента в данной
фракции.
III.2.1.3 Нерастворимая фракция 3С-материала представлена нелизированными
ядрами
Поскольку специфические события лигирования, детектируемые в последующем как «3Ссигнал», происходят преимущественно в нерастворимой фракции фиксированного
материала, необходимо было изучить природу этой нерастворимой фракции. С этой
целью нерастворимая фракция была окрашена DAPI для визуализации ДНК и
иммуноокрашена с использованием антител, узнающих характерные компоненты
различных ядерных компартментов, после чего исследована под флуоресцентным
микроскопом. Результаты этих экспериментов приведены на рис. 22. В первую очередь
183
Рис. 22. Визуализация ядерных компартментов и хроматиновых доменов в необработанных клетках
печени (А) и тех же клетках, проведенных по протоколу 3С до стадии лигирования (Б). Нерастворимая
фракция 3С-материала была отобрана после рестрикции HindIII и экстракции 1.6% раствором SDS.
(a-e) Иммуноокрашивание антителами против нуклеолина (a), Sc35 (b), ДНК-топоизомеразы II (с), H3K9me3
(d) и H3K27me3 (e). (f) Визуализация территории хромосомы 7 (FISH с набором проб, специфичных к
хромосоме 7). В обеих секциях рисунка в первом ряду представлены результаты иммуноокрашивания/FISH
(красный), во втором ряду – окрашивание ДНК DAPI, в третьем ряду – суперпозиция
иммуноокрашивания/FISH и окрашивания ДНК. Масштаб: 5 мкм.
184
стало очевидно, что нерастворимая часть 3С-материала представлена нелизированными
ядрами, которые сохранили сферическую форму и ряд характерных особенностей
внутренней организации после экстракции 0.3% раствором SDS, обработки рестриктазой
и последующей экстракции 1.6%-ным раствором SDS. Действительно, в ядрах,
проведенных через все этапы процедуры 3С, предшествующие стадии лигирования,
присутствуют ядрышки, тельца сплайсинга (спеклы) и ядерный матрикс, как показывает
окрашивание с использованием антител против нуклеолина, Sc35 и ДНК-топоизомеразы II
(рис. 22Б, панели a-c). Таким образом, указанные ядерные компартменты сохраняются в
фиксированных ядрах, обработанных детергентом и эндонуклеазами рестрикции.
Окрашивание образцов преципитированного 3С-материала DAPI полностью
подтвердило
результаты
количественного
анализа
распределения
ДНК
между
растворимой и нерастворимой фракциями 3С-материала. Видно, что остаточные ядра,
полученные после SDS-экстракции и обработки рестриктазами, все еще содержат
достаточное количество ДНК. Однако подобная обработка приводит к увеличению
размера ядер, их разбуханию. Возможно, это происходит из-за частичной деконденсации
хроматина после экстракции гистонов, которые не были пришиты к ДНК. В этой связи
важным представляется ответ на вопрос о том, не сопровождается ли подобная
деконденсация перераспределением хроматина в ядре. Для получения ответа мы
проследили
за
судьбой
гетерохроматинового
компартмента
в
ходе
обработки
фиксированных ядер эндонуклеазами рестрикции и SDS. Для этого ядра были окрашены
флуоресцентно меченными антителами, узнающими модификации гистонов, характерные
для конститутивного (триметилирование гистона H3 по 9-му остатку лизина, H3K9me3) и
факультативного (триметилирование гистона H3 по 27-му остатку лизина, H3K27me3)
гетерохроматина (Martin and Zhang, 2005). В необработанных клетках оба антитела
визуализировали области скопления гетерохроматина (рис. 22А, панели d, e). После
185
расщепления ДНК эндонуклеазами растрикции и экстракции SDS эти области попрежнему хорошо различимы, хотя и увеличены вместе с целым ядром (рис. 22Б, панели
d, e). Это убедительно указывает на то, что жесткие обработки, осуществляемые при
подготовке 3С-материала, не разрушают фиксированные формальдегидом ядра и не
приводят к перемешиванию хроматиновых доменов. Для проверки этого вывода мы
окрасили одну из хромосом (хромосома 7) с помощью флуоресцентной гибридизации in
situ с хромосом-специфичными пробами. Отдельные хромосомные территории ясно
различимы до и после обработки фиксированных формальдегидом ядер рестриктазами и
SDS (рис. 22А, Б, панели f). Более того, следующий этап процедуры 3С, инкубация в
лигазном буфере, не меняет характера распределения гетерохроматина и хромосомных
территорий в остаточных ядрах; в таких ядрах по-прежнему выявляются ядрышки, тельца
сплайсинга и ядерный матрикс (данные не показаны). Наконец, степень расщепления
хроматина не оказывает существенного влияния на распределение хроматина (как
показывает окрашивание хромосомных территорий и областей гетерохроматина) и
ядерных компартментов, исследованных в наших экспериментах. Действительно,
обработка фиксированных ядер эндонуклеазой MboI вместо HindIII дает сопоставимые
результаты (рис. 23). Таким образом, сшивка формальдегидом «защищает» ядра от лизиса
в присутствии SDS и препятствует солюбилизации хроматина. Соответственно,
предпочтительное
лигирование
пространственно-сближенных
фрагментов
ДНК
происходит на уровне частично деконденсированного хроматина в масштабе всего ядра.
Показательно, что это заключение верно не только для клеток печени, но и для клеток
мозга мыши. Повторение описанных выше экспериментов для этих клеток дало очень
похожие результаты (рис. 24).
Для получения большей информации о «структурной основе» принципа
предпочтительного лигирования в процедуре 3С остаточные ядра после обработки
186
Рис. 23. Визуализация ядерных компартментов и хроматиновых доменов в нерастворимом 3Сматериале, полученном из клеток печени эмбрионов мыши с использованием рестриктазы MboI.
Все обозначения как на рис. 22. Масштаб: 5 мкм.
фиксированных ядер SDS и эндонуклеазами рестрикции, были исследованы под
электронным микроскопом. На рис. 25 можно наблюдать типичную морфологию
эритробласта
из
эмбриональной
печени
мыши
со
значительным
количеством
высококонденсированного гетерохроматина по периферии ядра (рис. 25 А и А’).
Характерная морфология ядра хорошо сохраняется после лизиса клеток и экстракции
0.3% раствором SDS и 1.8% раствором Triton X-100, что практически полностью удаляет
цитоплазму (рис. 25 Б и Б’). Переваривание ДНК эндонуклеазой HindIII с последующей
экстракцией 1.6% раствором SDS приводит к существенному изменению структуры
хроматина. Ядра становятся менее электронно-плотными, почти полностью исчезают
глыбки плотного конденсированного гетерохроматина (рис. 25 В и В’). Основной
структурный компонент таких ядер – сеть тонких фибрилл (10-25 нм в диаметре), повидимому, хроматиновой природы, как это можно было предположить на основании
окрашивания ДНК и гистонов (см. рис. 23). Фибриллы практически гомогенно
187
Рис. 24. Визуализация ядерных компартментов и хроматиновых доменов в необработанных клетках
мозга (А) и тех же клетках, проведенных по протоколу 3С до стадии лигирования (Б). Нерастворимая
фракция 3С-материала была отобрана после рестрикции HindIII и экстракции 1.6% раствором SDS. Все
обозначения как на рис. 22. Масштаб: 5 мкм.
распределены по объему ядра, и только небольшое увеличение плотности фибрилл
наблюдается на периферии ядра (вероятно, соответствуя участкам гетерохроматина).
Межфибриллярные расстояния варьируют от 20-25 нм на периферии ядра до 30-50 нм в
188
Рис. 25. Электронно-микроскопический анализ нерастворимого 3С-материала из клеток печени на
разных стадиях процедуры 3С. Представлены ЭМ-фотографии материала после формальдегидной
фиксации (А, A’), после изоляции ядер и экстракции 0.3% раствором SDS и последующей экстракции 1.8%
раствором Triton X-100 (Б, Б’) и после рестрикции и экстракции 1.6% раствором SDS (В, В’ и Г, Г’). В
секциях (В, В’) представлены результаты экспериментов с эндонуклеазой HindIII, в секциях (Г, Г’) –MboI.
Панели в нижнем ряду демонстрируют увеличенное изображение выделенных рамкой участков верхних
панелей. Масштабы: 1 мкм (А-Г) и 250 нм (А’-Г’).
его центральных областях. Похожие результаты были получены при ЭМ-анализе
фиксированных ядер, обработанных рестриктазой MboI вместо HindIII (рис. 25 Г и Г’).
III.2.1.4 Разрушение остаточных ядер уменьшает 3С-сигналы
В совокупности, данные, представленные выше, могут свидетельствовать о том, что
сохранение внутренней организации ядра является необходимым условием для генерации
специфических 3С-сигналов. Другая возможность заключается в том, что остаточные ядра
лишь
препятствуют
специфичность
и/или
солюбилизации
эффективность
ДНК-белковых
лигирования.
комплексов,
Для
выбора
возможностями необходимо было разрушить остаточные ядра в
не
влияя
между
на
этими
условиях, не
нарушающих целостности предполагаемых ДНК-белковых комплексов, и затем провести
189
реакцию лигирования в растворе. Мы испытали несколько сильных детергентов, таких как
гуанидин хлорид и гуанидин изотиоцианат, однако нам не удалось лизировать ядра,
фиксированные формальдегидом. В работах других исследователей сообщалось, что
ультразвуковая обработка увеличивает солюбилизацию 3С-материала (Comet et al., 2011)
и даже увеличивает разрешение метода (Fullwood and Ruan, 2009). Мы также решили
провести ультразвуковую обработку 3С-материала перед стадией лигирования и
проанализировать 3С-сигналы в суммарном (нефракционированном) 3С-материале и
отдельно в растворимой и нерастворимой фракциях. Эксперименты были выполнены на
клетках печени эмбрионов мыши c использованием эндонуклеаз HindIII или MboI. Как и
ожидалось, даже слабая ультразвуковая обработка (1-секундный импульс) привела к
высвобождению существенной доли фиксированных фрагментов хроматина в раствор
(~50% в случае использования Hind III и ~ 80% в случае использования MboI). Более
продолжительная ультразвуковая обработка (3-секундный
импульс)
обеспечивала
солюбилизацию ~85% ДНК из обработанных HindIII ядер (рис. 26А). В этих условиях
средний размер солюбилизированных фрагментов хроматина немного уменьшался,
однако их способность к лигированию сохранялась (рис. 26Б). Солюбилизация
значительной (или даже большей) части фиксированных фрагментов хроматина после
ультразвуковой обработки коррелировала с появлением некоторого уровня 3С-сигнала в
растворимой фракции. Однако уровень этого сигнала был значительно меньше такового,
обнаруженного в нерастворимой фракции (рис. 26В). Особенно явно это было заметно
после нормирования 3С-сигналов на количество ДНК в каждой фракции (рис. 26Г). Более
того, суммарный 3С-сигнал (т.е. сигнал, детектируемый в нефракционированном 3Сматериале) падал с увеличением доли солюбилизированных фрагментов хроматина. К
примеру, в экспериментах с HindIII относительная частота лигирования между
фрагментами, содержащими промотор гена Hbb-b1 и DHS4/5 области контроля локуса, в
190
191
суммарном 3С-материале уменьшается с ~65% (отсутствие ультразвуковой обработки) до
~25% (3-секундный импульс ультразвука) (рис. 26Е). Можно было бы предположить, что
падение уровня 3С-сигналов происходит вследствие внесения разрывов в рестрикционные
фрагменты в результате ультразвуковой обработки. Для проверки возможности такого
эффекта при использованных условиях ультразвуковой обработки мы проанализировали
уровень циркуляризации якорного HindIII-фрагмента при лигировании смеси рестриктных
фрагментов, выделенных из контрольного 3С-материала (после стадии рестрикции) и того
же материала, обработанного ультразвуком в течение 1 и 3 секунд. Полученные
результаты показали, что в наших условиях ультразвуковой обработки уровень разрыва
протестированного 1 т.п.н.-HindIII-фрагмента составляет не более 5% (данные не
показаны). Хотя более длинные HindIII-фрагменты могли быть более сильно повреждены
в результате ультразвуковой обработки, маловероятно, чтобы это сказывалось на
возможности лигирования их концов к якорному фрагменту, ведущему к образованию
bona fide ампликонов, которые были достаточно короткие (100-200 п.н.) во всех наших
экспериментах. Таким образом, падение уровня 3С-сигналов, наблюдающееся при
обработке фиксированных ядер ультразвуком, скорее всего, связано с дезорганизацией
ядра, нежели с дополнительной фрагментацией ДНК, что указывает на важную роль
общей ядерной организации в поддержании пространственной близости удаленных
элементов генома.
Рис. 26. Влияние ультразвуковой обработки на распределение ДНК между растворимой и
нерастворимой частями 3С-материала и на частоты лигирования фрагментов домена бетаглобиновых генов: (А) Относительные количества ДНК в растворимой и нерастворимой фракциях 3Сматериала, обработанного ультразвуком. (Б) Электрофоретическое разделение ДНК из растворимой и
нерастворимой фракций обработанного ультразвуком 3С-материала до и после лигирования. (В) Результаты
3С-анализа, выполненного отдельно на растворимой (супернатант) и нерастворимой (осадок) фракциях
обработанного ультразвуком 3С-материала. (Г) То же, что (В), после нормирования частот лигирования на
количество ДНК в образце. (Д) Результаты стандартного 3С-анализа, выполненного на обработанном
ультразвуком 3С-материале без фракционирования на растворимую и нерастворимую части. Анализ
проведен на клетках печени эмбрионов мыши. Продолжительность УЗ-обработки приведена в секундах;
«0’» – УЗ-обработка не проводилась. Линии погрешностей соответствуют стандартной ошибке среднего для
двух независимых экспериментов. Остальные обозначения как на рис. 19 и 20.
192
III.2.2 АБСОЛЮТНЫЕ ЧАСТОТЫ ЛИГИРОВАНИЯ В ПРОЦЕДУРЕ 3С
Метод фиксации конформации хромосомы является важным инструментом для изучения
пространственной организации интерфазных хромосом. В настоящее время он получил
широкое распространение и используется во многих лабораториях мира для изучения
различных ДНК-зависимых процессов. Несмотря на это, принципы метода 3С все-таки
остаются недостаточно изученными. Так, на этапе работы, описанном в разделе III.2.1, мы
показали, что одно из ключевых положений метода, постулирующее, что лигирование
фрагментов ДНК осуществляется в составе солюбилизированных ДНК-белковых
комплексов, является ошибочным. Также заслуживает внимания тот факт, что до
настоящего времени не было осуществлено попыток измерения абсолютного выхода
продуктов лигирования в процедуре 3С. В стандартном эксперименте по 3С-анализу
частоты лигирования определяются с помощью количественной ПЦР с праймерами,
подобранными к концам рестриктных фрагментов (см. рис. 14Б), и выражаются в
единицах, отражающих относительные количества продуктов лигирования (Hagege et al.,
2007; Naumova et al., 2012). Наличие пика на 3С-кривой считается показателем
взаимодействия соответствующих фрагментов генома (рис. 14В, Г). При этом, сколько в
действительности продуктов лигирования образуется из участков генома, расцениваемых
как «партнеры по взаимодействию», остается не ясным. Не известен и уровень фонового
лигирования.
В нашем исследовании мы решили проанализировать эти вопросы путем
сопоставления количества рестрикционных фрагментов на входе в реакцию лигирования и
количества продуктов лигирования на выходе из реакции. В качестве модельной системы
был выбран домен бета-глобиновых генов мыши в эритроидных клетках. Согласно
результатам предыдущих исследований, подтвержденных и в нашей работе (предыдущей
раздел), в эритроидных клетках промоторы мажорного и минорного бета-глобиновых
193
генов (Hbb-b1 и Hbb-b2, соответственно) взаимодействуют с несколькими энхансерами, в
частности DHS 1, 4 и 5 области контроля локуса и DHS-62/-60. Предполагается, что все
эти элементы собраны в активаторный хроматиновый блок, что существенно для
транскрипции бета-глобиновых генов (Tolhuis et al., 2002). Мы провели 3С-анализ с
использованием рестриктазы HindIII и проанализировали частоту лигирования фрагмента,
содержащего промотор гена Hbb-b1, с несколькими выбранными фрагментами домена
(фрагменты «a»-«g» на рис. 29, см. далее). В обычном 3С-эксперименте ПЦР-сигналы для
разных пар праймеров нормируют на сигналы, полученные на контрольном образце. Этот
образец готовится путем лигирования эквимолярного количества всех исследуемых
рестрикционных фрагментов (или их концов) и, таким образом, должен содержать равное
количество всех продуктов лигирования (Hagege et al., 2007; Splinter et al., 2004). Однако с
использованием подобного стандарта возможно определить только относительные
количества продуктов лигирования в 3С-образце, поскольку количество копий продуктов
лигирования в контрольном образце не известно. Для определения абсолютного выхода
продуктов лигирования мы использовали другой стандарт, приготовленный путем
смешения равных и известных количеств искусственно синтезированных фрагментов
ДНК, представляющих собой интересующие нас продукты лигирования. Смесь была
составлена
из
ПЦР-амплифицированных
фрагментов
ДНК,
перекрывающих
интересующие нас стыки рестрикционных фрагментов. Эквимолярная смесь продуктов
лигирования, которая обычно используется в 3С-экспериментах в качестве стандарта (см.
раздел «Материалы и методы», II.2.3), была использована в качестве матрицы для
амплификации, и праймеры были те же, что впоследствии использовались для анализа
частот лигирования. Продукты амплификации были разделены с помощью электрофореза,
очищены и после определения концентрации ДНК смешаны в эквимолярных количествах
(рис. 27). Полученный образец был использован для приготовления серии стандартных
194
Рис. 27. Приготовление эквимолярной смеси продуктов лигирования с известным числом копий
каждого продукта. Эквимолярная смесь продуктов лигирования, приготовленная на основе бакмиды, была
амплифицирована с использовнием 3С-праймеров. ПЦР-продукты были очищены и после определения их
копийности смешены в эквимолярных количествах.
разведений с известным количеством ДНК-мишеней; эти стандарты амплифицировались в
параллели с 3С-образцами.
Данный подход позволил определять точное число различных продуктов
лигирования в 3С-образце. В качестве примера на рис. 28А приведены результаты
амплификации
продукта
лигирования
«Hbb-b1–DHS4/5»
(продукт
лигирования
фрагментов, несущих промотор гена Hbb-b1 и DHS4/5). Число копий данного продукта
лигирования в 50 нг 3С-ДНК оказалось равным 170. Такое количество 3С-образца должно
содержать примерно 18000 копий каждого геномного фрагмента (расчет сделан на
основании размера гаплоидного генома мыши, составляющего ~ 2.7×109 п.н., по данным
сборки GRCm38/mm10). Абсолютный выход продукта лигирования, вычисленный по
формуле, представленной на рис. 28В, составляет в данном случае ~0.9%. Для проверки
правильности наших вычислений, мы напрямую измерили количества рестрикционных
фрагментов с помощью количественной ПЦР с праймерами к внутренним частям
195
Рис. 28. Результаты амплификации, использованной для определения выхода продукта лигирования
«Hbb-b1–DHS4/5»: (А) Амплификация стыка рестрикционных фрагментов «Hbb-b1» и «DHS4/5». (Б)
Амплификация внутреннего участка фрагмента «DHS4/5» (контрольная амплификация). На графиках слева
представлены кривые увеличения уровня флуоресценции (логарифмическая шкала) в ходе ПЦР. Зелеными
кривыми показаны результаты для 3С-образца; синими кривыми – результаты для негативного контроля (50
нг геномной ДНК мыши (А) или mQ (Б)); красными кривыми с ниспадающей интенсивностью цвета –
результаты для ДНК-стандартов. Все реакции выполнены в 4-х повторах. На графиках справа представлены
калибровочные кривые, построенные по данным амплификации ДНК-стандартов. (В) Формула,
использованная для вычисления выхода продуктов лигирования. Nобщ – количество каждого из двух
рестрикционных фрагментов; Nлигир – количество продукта лигирования. .
196
фрагментов. ДНК-стандарты были приготовлены точно так же, как при анализе продуктов
лигирования (см. выше). На рис. 28Б представлены результаты амплификации фрагмента
«DHS4/5». Количество копий этого фрагмента в 50 нг 3С-ДНК оказалось равным
примерно 19000, что очень близко к таковому, вычисленному на основании длины генома
мыши.
Количественный анализ частот лигирования, выполненный с использованием
разработанного нами подхода, подтвердил зафиксированные ранее различия в частоте
лигирования фрагмента, несущего промотор гена Hbb-b1, с различными фрагментами
домена бета-глобиновых генов (рис. 29). Между тем, абсолютная частота лигирования
была достаточно низкой во всех случаях. Так, фрагмент, несущий DHS-62/-60 –
регуляторный элемент, который, как считают, принимает участие в формировании
активаторного хроматинового блока наряду с DHS4/5, лигировался к фрагменту,
несущему промотор Hbb-b1, с частотой 0.4-0.5% (рис. 29А, продукт лигирования «a/e»),
тогда как участки, считающиеся выпетленными за пределы активаторного хроматинового
блока, такие как ген обонятельного рецептора Olfr69 и участок «-42», показали частоту
лигирования ~0.05 и 0.15%, соответственно (рис. 29А, продукты лигирования «b/e» и
«g/e»). Наибольшая частота лигирования (~1.5%) была зафиксирована для фрагмента,
расположенного непосредственно перед якорным фрагментом (рис. 29А, продукт
лигирования «d/e»). Используя описанный выше экспериментальный подход, мы также
определили частоту циркуляризации якорного фрагмента, она составила около 9% (рис.
29Б, левый график, продукт лигирования «e/e»). Кроме того, мы определили частоту
лигирования, в результате которой восстанавливается исходный сайт рестрикции между
якорным и нижележащим фрагментом (фрагменты лигируются в природной геномной
ориентации). Частота регенерации рестриктоного сайта составила около 8% (рис. 29Б,
правый график, религированный продукт «f/e»).
197
Рис. 29. Выход продуктов лигирования фрагмента, несущего промотор гена Hbb-b1, с различными
фрагментами домена бета-глобиновых генов: (А, Б) Результаты для HindIII-фрагментов. (В, Г)
Результаты для MboI-фрагментов. Анализ проведен на клетках печени эмбрионов мыши. В верхней части
каждой секции представлена схема анализируемого участка (обозначения как на рис. 20). Черные
горизонтальные линии под схемой показывают позиции и размеры анализируемых рестрикционных
фрагментов. Фрагменты обозначены строчными буквами латинского алфавита, якорный фрагмент
(фрагмент «е») отмечен значком якоря. Масштаб – 10 т.п.н. (A, В) и 0.2 т.п.н. (Б, Д). Графики в секциях (А)
и (В) показывают выход продуктов лигирования якорного фрагмента с фрагментами «a», «b», «c», «d» и «g»,
как отмечено стрелками над графиками. Графики в левой части секций (Б) и (Г) показывают выход
циркуляризованного якорного фрагмента. Выход определяли по формуле, представленной на рис. 28В; при
анализе циркуляризованного якорного фрагмента перед ПЦР проводили линеаризацию фрагмента
посредством обработки подходящей рестриктазой. Графики в правой части (Б) и (Г) показывают частоту
регенерации исходного сайта рестрикции, рассчитанную как разница между процентной долей интактного
(нерасщепленного) сайта рестрикции в образцах до и после лигирования. Долю нерасщепленного сайта
определяли с помощью ПЦР-стоп-анализа. Линии погрешностей соответствуют стандартной ошибке
среднего для трех независимых экспериментов.
198
Дальнейшие эксперименты были выполнены с использованием частощепящей
рестриктазы MboI с последующим анализом тех же участков домена бета-глобиновых
генов, которые были проанализированы в экспериментах с HindIII. Общий уровень
лигирования в экспериментах с MboI был примерно втрое ниже такового в экcпериментах
с HindIII (рис. 29В), однако частота циркуляризации якорного рестриктного фрагмента
осталась примерно на том же уровне (~10%) (рис. 29Г, левый график, продукт
лигирования «e/e»). То же касается и частоты регенерации сайта рестрикции между
якорным и соседним фрагментами (рис. 29Г, правый график, продукт лигирования «f/e»).
Принимая во внимание относительно низкие частоты лигирования, обнаруженные
в наших экспериментах, мы проверили полноту эндонуклеазного расщепления ДНК, что
должно напрямую влиять на выход продуктов лигирования. Расщепление ДНК в
процедуре 3С осуществляется в присутствии 0.1-0.3% SDS – детергент оказывает
ингибирующее действие на работу фермента. Кроме того, переваривается не чистая ДНК,
а ДНК, сшитая с белками, что также затрудняет работу рестриктазы. Для повышения
эффективности рестрикции используется большое количество фермента. Повысить
эффективность расщепления помогает и добавление в реакционную смесь неионного
детергента Triton X-100, который связывает («мицеллизует») SDS. Однако даже в этих
условиях многие эндонуклеазы рестрикции не работают должным образом (Hagege et al.,
2007; Splinter et al., 2004). Используя ПЦР-стоп-анализ, мы определили эффективность
расщепления домена бета-глобиновых генов по различным рестриктным сайтам.
Эффективность расщепления составила >85% для рестриктазы HindIII (что согласуется с
ранее опубликованными данными (Palstra et al., 2003; Splinter et al., 2006; Tolhuis et al.,
2002)) и >70% для рестриктазы MboI (рис. 29Б,Г и непоказанные данные). Мы также
проверили, нормально ли работает лигаза в условиях, используемых в 3С-анализе.
Лигирование в процедуре 3С осуществляется в присутствии 0.1% SDS и 1% Triton X-100.
199
Чтобы проверить, влияет ли присутствие этих детергентов на эффективность лигирования,
мы сравнили кинетику лигирования HindIII-фрагментов, полученных линеаризацией
плазмиды pUC18, в присутствии и в отcутствии детергентов. Результаты, представленные
на рис. 30, свидетельствуют о том, что, в условиях наших экспериментов, SDS не
препятствует реакции лигирования. Хотя ясно, что низкий выход продуктов лигирования
может быть объяснен и другими причинами, такими как конкуренция концов ДНК за
лигирование, мы предполагаем, что низкие частоты лигирования могут отражать также
низкую частоту прямого взаимодействия регуляторных элементов ДНК in vivo.
Рис. 30. Кинетика реакции лигирования в присутствии и отсутствии SDS. Электрофоретическое
разделение продуктов, полученных в ходе лигирования HindIII-фрагментов плазмиды pUC18 в течение
указанного времени в присутствии и отсутствии SDS и Triton X-100 (агарозный гель, окраска бромистым
этидием). Реакция была поставлена в 1× буфере для ДНК-лигазы фага Т4 (Fermentas) с 100 нг/мкл ДНК и 0.1
ед/мкл ДНК-лигазы фага Т4 (Fermentas). M – маркерная ДНК.
200
III.2.3 КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ
АНАЛИЗ
ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ
УДАЛЕННЫХ
ЭЛЕМЕНТОВ ГЕНОМА С ПОМОЩЬЮ МЕТОДА МОЛЕКУЛЯРНЫХ
КОЛОНИЙ
Хотя механизмы работы транскрипционных энхансеров во многом остаются не ясными,
большинство
современных
моделей
предполагают,
что
энхансеры
напрямую
взаимодействуют с подконтрольными промоторами, в то время как сегмент хроматиновой
фибриллы, разделяющий промотор и энхансер, выпетливается (Bartkuhn and Renkawitz,
2008; Bulger and Groudine, 1999, 2010). Единичный энхансер может активировать
несколько промоторов. К примеру, в эритроидных клетках мыши на позднеэмбриональной стадии развития область контроля локуса домена бета-глобиновых генов
стимулирует экспрессию двух бета-глобиновых генов (Hbb-b1 и Hbb-b2). Промоторы этих
генов расположены на расстоянии 14 т.п.н. друг от друга и не могли бы одновременно
взаимодействовать с LCR, если бы образовывалась только одна петля хроматина. Поэтому
было
предположено,
что
одновременное
взаимодействие
LCR
c
несколькими
промоторами осуществляется в составе мультикомпонентного комплекса, из которого
выпетлено несколько сегментов хроматиновой фибриллы (модель активаторного
хроматинового блока (de Laat and Grosveld, 2003; Tolhuis et al., 2002)). Хотя данная модель
получила широкое признание в научном сообществе (de Laat et al., 2008; Kooren et al.,
2007; Palstra et al., 2008a; Zhou et al., 2006), она остается гипотезой, поскольку 3С-анализ
позволяет проводить лишь попарный анализ взаимодействия геномных элементов и не
может ответить на вопрос, происходят ли два или более попарных взаимодействий в
одном месте в одной и той же клетке. Те же результаты могут быть объяснены
альтернативным взаимодействием энхансера поочередно с каждым из активируемых
промоторов (Gribnau et al., 1998; Wijgerde et al., 1995). Соответственно, в каждый момент
времени различные попарные взаимодействия могут реализовываться в различных суб201
популяциях клеток. Более того, ни 3С-метод, ни его производные методы, основанные на
принципе предпочтительного лигирования (Dostie et al., 2006; Fullwood et al., 2009;
Lieberman-Aiden et al., 2009; Simonis et al., 2006; Zhao et al., 2006), не могут быть
использованы для подсчета доли клеток, в которых две определенные последовательности
ДНК взаимодействуют друг с другом (Hagege et al., 2007; Splinter et al., 2004). Таким
образом, даже наиболее типичная пространственная конфигурация локуса остается
неизвестной. Количественный анализ 3С-данных затруднен тем обстоятельством, что
каждый конец рестрикционного фрагмента может быть лигирован к любому концу
неизвестного числа других рестрикционных фрагментов, представленных в том же
хроматиновом комплексе или локализованных поблизости.
Среди существующих методов только флуоресцентная гибридизация in situ (FISH)
может быть использована для обнаружения мультикомпонентных комплексов удаленных
фрагментов генома в клеточном ядре. Однако разрешение данного метода не высоко. Хотя
в ряде недавних работ сообщалось об успешном использовании FISH для разрешения
хромосомальных элементов, расположенных на расстоянии 50 т.п.н. (Eskeland et al., 2010)
или даже меньше (Markaki et al., 2012), FISH редко используется для анализа
конфигурации единичных локусов, имеющих длину менее 150 т.п.н. (Simonis and de Laat,
2008). Кроме того, необходимо подчеркнуть, что 3С-метод и FISH позволяют выявить
лишь сближение геномных элементов в клеточном ядре; вопрос о том, собираются ли эти
элементы в единый ДНК-белковый комплекс, так и остается открытым.
В нашем исследовании мы разработали новый экспериментальный подход,
названный INGRID (in-gel replication of interacting DNA segments – репликация в геле
взаимодействующих сегментов ДНК), позволяющий осуществлять прямую детекцию
мультикомпонентных комплексов геномных элементов и определять доли комплексов
различного типа.
202
III.2.3.1 Разработка метода INGRID
Принцип метода INGRID проиллюстрирован рис. 31. Главное отличие INGRID от 3Сметода и производных С-методов заключается в том, что фиксированные фрагменты
хроматина, высвобожденные из ядер, не лигируются. Вместо этого они распределяются в
тонком слое полиакриламидного геля (рис. 31А), и интересующие фрагменты
амплифицируются прямо в геле. Как было показано ранее, вследствие ограниченной
подвижности в геле, ПЦР-продукты остаются поблизости с матричной молекулой ДНК,
образуя так называемые молекулярные колонии (Chetverin and Chetverina, 2008; Chetverina
et al., 2002) (рис. 31Б). Рост молекулярных колоний отслеживается в режиме реального
времени (Samatov et al., 2006) с использованием, к примеру, проб типа Molecular Beacon
(«молекулярные маячки») (Tyagi and Kramer, 1996), несущих различные комбинации
флуорофор–тушитель для каждого из амплифицируемых фрагментов (рис. 31В; см. также
рис. 34). Фрагменты хроматина, которые были сшиты в одном комплексе, колокализуются
в геле и дают начало мультикомпонентным колониям, тогда как несшитые фрагменты
распределяются в геле независимо друг
от друга и, как правило, образуют
монокомпонентные колонии. Таким образом, метод INGRID позволяет визуализировать и
подсчитывать количество индивидуальных комплексов элементов ДНК путем перевода их
в мультикомпонентные ДНК-колонии.
III.2.3.2 Подбор праймеров и MolecularBeacon-проб для анализа взаимодействий в
домене бета-глобиновых генов мыши
Для апробации метода INGRID был снова выбран домен бета-глобиновых генов мыши
(рис. 32А), пространственная организация которого интенсивно исследовалась с помощью
обычных C-методов ((Noordermeer et al., 2011; Palstra et al., 2003; Simonis et al., 2006;
Splinter et al., 2006; Tolhuis et al., 2002; Vakoc et al., 2005) и настоящая работа). В
203
Рис. 31. Принципы метода INGRID: (А) Основные этапы экспериментальной процедуры. После фиксации
формальдегидом клетки лизируют и хроматин фрагментируют (с помощью ультразвуковой обработки,
переваривания эндонуклеазами рестрикции или другим методом). Высвобожденные в раствор фрагменты
хроматина распределяют в тонком слое полиакриаламидного геля и интересующие фрагменты
амплифицируют в геле. ПЦР-продукты остаются близко к матричной молекуле ДНК вследствие
ограниченной подвижности в геле и образуют молекулярные колонии. Формирование мультикомпонентной
колонии, представленной ПЦР-продуктами нескольких типов, свидетельствует о том, что соответствующие
участки хромосомы были организованы в общий комплекс в клетке. (Б) Увеличенная схема
мультикомпонентной (тройной) молекулярной колонии, иллюстрирующая принцип сиквенс-специфичной
визуализации ампликонов с использованием проб типа Molecular Beacon (Tyagi and Kramer, 1996). (В)
Принцип действия проб Molecular Beacon. Проба представляет собой олигонуклеотид, меченый с
противоположных концов флуорофором и гасителем флуоресценции и способный к формированию
«шпильки» благодаря присутствию комплементарных последовательностей на концах. Выпетленный
центральный участок олигонуклеотида комплементарен целевой последовательности ДНК. Гибридизация
пробы с ДНК-мишенью приводит к разобщению флуорофора и гасителя, в результате чего возрастает
флуоресценция. Использованные комбинации флуорофор–тушитель представлены справа. (Г) Постановка
ПЦР в геле.
204
Рис. 32. Молекулярные колонии, формирующиеся при амплификации в геле тест-фрагментов из
домена бета-глобиновых генов мыши: (А) Схема домена бета-глобиновых генов мыши (все обозначения
как на рис. 20). Позиции тест-ампликонов показаны черными прямоугольниками под схемой (названы как в
тексте). P-b1 – промотор гена Hbb-b1, P-b2 – промотор гена Hbb-b2. Шкала в т.п.н. (Б-Г) Детекция ДНКколоний с использованием MB-проб, меченных флуорофорами FAM, Cy3 и Cy5. (Б) Гель, содержащий ~15
копий плазмиды, несущей тест-ампликон «DHS5», ~15 копий плазмиды, несущей тест-ампликон «P-b1», и
~15 копий плазмиды, несущей тест-ампликон «P-b2». (В) Гель, содержащий ~15 копий плазмиды, несущей
все три тест-ампликона. (Г) Гель, содержащий ~15 копий каждой из плазмид, несущих одиночные
ампликоны, и ~15 копий плазмиды, несущей все три тест-ампликона. Для ПЦР использовали
линеаризованную форму плазмид. (Д) Цветовая схема, использованная при подготовке изображений гелей.
Изображения, полученные при регистрации флуоресценции FAM, Cy3 и Cy5, были искусственно окрашены
в синий, зеленый и красный цвета, соответственно; если сигналы перекрывались, три цвета
преобразовывались в белый, тогда как попарные комбинации давали желтый, голубой и пурпурный цвета.
(E) Наложенные изображения двух гелей, содержащих геномную ДНК мыши (~15 копий гаплоидного
набора хромосом), переваренную эндонуклеазами рестрикции HindIII или MboI.
205
первичных экспериментах мы подобрали праймеры и MolecularBeacon (MB)-пробы к
DHS5 области контроля локуса и промоторам мажорного и минорного бета-глобиновых
генов (P-b1 и P-b2, соответственно; см. рис. 32А). Все три элемента считаются частью
активаторного хроматинового блока домена бета-глобиновых генов (Tolhuis et al., 2002).
Специфичность амплификации была проверена с помощью стандартной жидкостной ПЦР
с последующим гель-электрофорезом ПЦР-продуктов (рис. 33). Далее мы проверили,
могут ли три выбранные последовательности ДНК, одновременно амплифицируемые в
одном геле, индивидуально отслеживаться с использованием смеси MB-проб, помеченных
флуорофорами FAM, Cy3 и Cy5 (спектральные характеристики флуорофоров и
использованных в комбинации с ними тушителей представлены на рис. 34). Три
последовательности были по отдельности клонированы в плазмиды, и в среднем по 15
копий каждого конструкта были распределены в геле. Рис. 33Б показывает, что в данном
случае индивидуальные колонии всех трех типов легко различимы. Изображения,
полученные при регистрации флуоресценции FAM, Cy3 и Сy5, были искусственно
окрашены в синий, зеленый и красный цвета, соответственно. Если сигналы
перекрывались, изображения становились белыми, тогда как попарные комбинации
образовывали желтый, голубой и пурпурный цвета (см. цветовую схему на рис. 32Д).
Колонии появлялись на 32 цикле амплификации и после 35 цикла были уже хорошо
видны. Хотя иногда колонии двух различных цветов частично перекрывались (см.
увеличенное изображение геля на рис. 32Б), мы не наблюдали перекрывания всех трех
цветов. Напротив, если в гель были помещены плазмиды, несущие три изучаемые
последовательности в виде тройной вставки, каждая колония гибридизовалась со всеми
тремя пробами и представала белой при наложении цветов, что является признаком
мультикомпонентной колонии (рис. 32В). Наконец, когда три плазмиды, несущие
индивидуальные ампликоны, и плазмида, несущая сцепленные ампликоны, были
206
Рис. 33. Электрофоретическое разделение ПЦР-продуктов, полученных при амплификации
геномной ДНК мыши с использованием указанных пар праймеров (А) и их комбинаций (Б) в
жидкостной ПЦР. Разделение в агарозном геле, окраска бромистым этидием, представлено в
обращенных цветах. Число циклов амплификации (слева направо) – 25, 30, 35 и 40. Размер ПЦРпродуктов (п.н.) приведен в скобках. Звездочкой отмечены комбинации праймеров, использованные для
INGRID-анализа. Последовательности праймеров приведены в таблице 11.
207
Рис. 34. Спектральные характеристики флуорофоров и тушителей, использованных в составе MBпроб: (А) Спектры поглощения и флуоресценции флуорофоров. (Б) Спектры поглощения тушителей
флуоресценции; в скобках приведены максимумы поглощения. Также отмечены максимумы излучения
флуорофоров, представленных в (А).
распределены и коамплифицированы в одном геле, моно- и трехкомпонентные колонии
были легко различимыми (рис.32Г). Существенно, что сигналы от индивидуальных проб в
моно- и трехкомпонентных колониях появлялись на одном и том же цикле амплификации
(32-ом), что свидетельствует о том, что амплификация одного из колокализующихся
ампликонов не затрудняет амплификации других ампликонов. Мы также проверили,
подходят ли выбранные праймеры и MB-пробы для амплификации целевых сегментов с
геномной ДНК, расщепленной эндонуклеазой HindIII. Несмотря на большой избыток
нецелевых фрагментов ДНК, каждый из трех сегментов успешно амплифицировался,
208
приводя к образованию примерно одинакового числа колоний (рис.32Е, фото слева).
Отсутствие ложно-позитивной амплификации было проверено в экспериментах по
адресному расщеплению ампликонов, продуцирующих синие и зеленые колонии,
рестриктазой MboI, сайты узнавания которой содержатся в этих ампликонах. Фото справа
на рис.32Е показывает, что в геле, содержащем MboI-фрагменты геномной ДНК,
образуются только красные колонии.
III.2.3.3 Оценка
влияния
формальдегидной
фиксации
на
способность
амплифицировать ДНК
Формальдегидная фиксация ДНК-белковых комплексов in vivo лежит в основе методов
фиксации конформации хромосомы (3С), иммунопреципитации хроматина (ChIP) и
разработанного нами метода. После проникновения в клетки формальдегид реагирует с
амино- и иминогруппами белков и ДНК, приводя к образованию белок-белковых и ДНКбелковых ковалентных сшивок, однако не реагирует со свободной двухцепочной ДНК
(Orlando et al., 1997) (рис. 35). Повышение температуры обеспечивает распад
(«обращение») формальдегидных сшивок, создавая возможность для дальнейшего анализа
белков и ДНК. Однако известно, что формальдегид может повреждать ДНК. К примеру,
обработка
формальдегидом
может
приводить
к
образованию
апуриновых/апиримидиновых (AP)-сайтов посредством гидролиза N-гликозидных связей
и вызывать слабый гидролиз фосфодиэфирных связей (Douglas and Rogers, 1998;
Srinivasan et al., 2002). Следовательно, после фиксации часть молекул ДНК может
потерять
способность
формальдегидных
к
сшивок.
амплификации,
Данное
даже
в
обстоятельство
условиях
полного
некритично
для
обращения
методов,
использующих большое количество клеток, таких как 3С и ChIP. В противоположность
этому, метод INGRID оперирует с небольшим количеством клеток и требует сохранения
209
практически всех ампликонов в ходе процедуры сшивки/расшивки. Действительно, если
один
из
двух
взаимодействующих
фрагментов
поврежден,
он
не
будет
амплифицироваться, что приведет к формированию монокомпонентной колонии вместо
двухкомпонентной. В конечном счете анализ окажется недостоверным. Данная проблема
стоит особенно остро в случае анализа взаимодействия трех и более участков ДНК.
Рис. 35. Химическая сшивка ДНК и белков с помощью формальдегида. Формальдегид (HCOH) очень
активная биполярная молекула, в которой атом углерода выступает электрофильным центром. Амино- и
иминогруппы белков (например, боковые цепи лизина и аргенина) и ДНК (например, цитозин) реагируют с
формальдегидом с формированием Шиффова основания (реакция I). Этот интермедиат может реагировать
со второй аминогруппой (реакция II) с образованием формальдегидной сшивки. Реакция может быть
обращена при нагревании и понижении pH. При этом аминогруппы протонируются, что смещает равновесие
в сторону исходных веществ. (А) Образование формальдегидной сшивки между боковыми цепями двух
остатков лизина. (Б) Сшивка между цитозином и лизином. По работе (Orlando et al., 1997).
210
Чтобы
выяснить,
формальдегидом,
мы
повреждается
сравнили
ли
профили
ДНК
при
фиксации
амплификации
ДНК,
живых
клеток
выделенной
из
фиксированных и нефиксированных клеток. В качестве модели были использованы
культивируемые куриные эритробласты линии HD3. После наращивания клеток в среде
роста клетки были разделены на две части. Одну часть фиксировали в 2%-ом растворе
формальдегида в течение 10 минут, как в стандартном протоколе 3С, и процесс фиксации
останавливали добавлением глицина. Второй образец готовили аналогичным образом, но
без обработки формальдегидом (рис. 36А). Клетки обоих образцов суспендировали в
буфере, содержащим SDS (нефиксированные клетки при этом немедленно лизировались),
после чего добавляли протеиназу К и инкубировали 1 ночь при 65°C для протеолиза
белков и расшивки формальдегидных связей в фиксированном образце. Препарат
обрабатывали РНКазой А, после чего очищали ДНК фенол-хлороформной экстракцией и
этаноловой
преципитацией.
Качество
и
целостность
ДНК
были
проверены
электрофорезом, а количество ДНК в образцах определено с использованием
флуорометрического метода.
Для сравнения способности сшитой и несшитой ДНК к амплификации была
использована техника ПЦР в реальном времени с TaqMan-пробами. Реакцию ставили с
уменьшающимся количеством ДНК, используя 110 нг, 11 нг, 1.1 нг, 110 пг или 11 пг ДНК
на реакцию, что соответсвует примерно 105, 104, 103, 102 или 10 копий каждой уникальной
последовательности генома на реакцию (размер гаплоидного генома курицы составляет
1.04×109 п.н. по данным сборки galGal4). Данные амплификации были использованы для
построения зависимости предельного цикла амплификации Ct (цикл амплификации, на
котором репортерная флуоресценция достигает некоторого заданного уровня) от
начального количества ДНК в реакции. Последующее сравнение графиков, полученных со
211
Рис. 36. Сравнение амплификационной способности ДНК, выделенной из фиксированных
формальдегидом клеток и нефиксированных клеток: (А) Схема эксперимента. Клетки (культивируемые
куриные эритробласты HD3) были фиксированы/не фиксированы 2%-ным формальдегидом с последующей
обработкой SDS и инкубацией при 65°C в присутствии протеиназы К (обращение формальдегидных связей
и переваривание белков). После очистки ДНК анализировали с помощью ПЦР в реальном времени с
212
сшитым и несшитым образцами ДНК, позволило оценить степень повреждения ДНК
формальдегидом.
Вначале мы использовали праймеры к участку куриного генома длиной 83 п.н.
поблизости с кластером альфа-глобиновых генов. Как видно из рис. 36Б, на котором
представлены результаты амплификации, для получения одинакового ПЦР-сигнала
требуется постановка реакции с бóльшим количеством сшитого/расшитого образца ДНК
по сравнению с количеством несшитого образца. К примеру, для достижения порогового
уровня флуоресценции на 32-м цикле амплификации (Сt=32) начальное количество
матричных молекул ДНК должно составлять 260 в случае сшитого/расшитого образца и
218 в случае необработанного формальдегидом образца (рис. 36Б, значения a и b,
соответственно). Таким образом, степень «порчи» ДНК формальдегидом была оценена
как 16%: (260-218)/260×100%=16%, (рис. 35Б). В следующем эксперименте в качестве
прямого был использован другой праймер, расположенный выше исходного, что
позволило увеличить длину амплифицируемого участка ДНК до 374 п.н (рис. 36В).
Способность ДНК к амплификации осталась практически на том же уровне (рис. 36В).
Это означает, что обработка формальдегидом не вызывает серьезных повреждений ДНК,
при которых амплификация становится невозможной, таких как двухцепочные разрывы.
Если бы такие повреждения были представлены в 16% ампликонов длиной 84 п.н., то для
Рис. 36 (продолжение)
и переваривание белков). После очистки ДНК анализировали с помощью ПЦР в реальном времени с
TaqMan-пробами (последовательности представлены в таблице 13). Серые сферы обозначают белки,
спираль обозначает ДНК. (Б-Д) Результаты ПЦР-амплификации указанных участков ДНК и оцененная
степень ухудшения качества образца ДНК в результате фиксации клеток формальдегидом и последующего
обращения формальдегидных сшивок. Каждый график показывает результаты типичной амплификации;
заполненные точки – несшитая ДНК, незаполненные точки – сшитая/расшитая ДНК. В секции (Б) показано,
как вычислялась степень ухудшения качества ДНК (см. пояснения в тексте). Линии погрешностей
соответствуют стандартной ошибке среднего для трех независимых экспериментов. Над графиками (Б, В)
представлена схема ампликонов (s – прямой праймер, a/s – обратный праймер, звездочка обозначает
флуоресцентную метку на 5’-конце пробы, неиспользованный праймер показан светло-серым). Над
графиками (Г, Д) показан характер упаковки хроматина в амплифицируемой области генома (серыми
сферами показаны нуклеосомы, черными линиями – ДНК).
213
ампликона длиной 374 п.н. можно было бы ожидать примерно в 4 раза более высокий
процент повреждений, что не наблюдалось.
Далее мы оценили чувствительность к формальдегидной фиксации участков ДНК,
характеризующихся различной плотностью упаковки в составе хроматина. Один тестампликон был выбран на участке гетерохроматина, локализованного выше домена бетаглобиновых генов (Prioleau et al., 1999). Второй тест-ампликон был выбран в открытой
(возможно
свободной
гиперчувствительности
от
к
нуклеосом)
ДНКазе,
области
колокализующемся
хроматина
на
с
регуляторным
главным
участке
элементом домена альфа-глобиновых генов (Flint et al., 2001). Результаты амплификации
свидетельствуют примерно об одной и той степени ухудшения качества ДНК в обоих
случаях (от 15 до 20%), что повторяет результаты первой серии экспериментов (рис. 36Г,
Д).
Таким образом, фиксация живых клеток формальдегидом незначительно снижает
способность ДНК к амплификации (по крайней мере, в условиях, используемых в наших
экспериментах). Снижение эффективности амплификации не зависит от длины ампликона
и хроматинового контекста и, возможно, связано с таким фактором, как химическая
чистота ДНК, но не связано с накоплением повреждений ДНК. Последнее представляется
особенно важным в контексте использования формальдегидной фиксации в методе
INGRID.
Еще одна проблема в методе INGRID возникает из-за необходимости проводить
расшивку ДНК после распределения образца в геле. Стандартный протокол для
обращения формальдегидных сшивок включает инкубацию образца при 65°C в течение
нескольких часов в присутствии протеиназы К с последующей очисткой ДНК с помощью
фенол-хлороформной экстракции и спиртовой преципитации. Однако такая процедура
была бы очень трудоемкой в случае иммобилизированных в геле ДНК-белковых
214
комплексов. Для упрощения протокола INGRID мы опустили этапы расшивки и
протеолиза, используемые в стандартной процедуре 3С. Мы предположили, что
первичная инкубация при 94°C на этапе денатурации ПЦР может сама по себе служить
для обращения формальдегидных сшивок и что короткое время инкубации должно
компенсироваться высокой температурой. Кроме того, принимая во внимание, что в гель
вносится материал из небольшого количества клеток, мы посчитали, что остаточные
белки не должны препятствовать ПЦР и что этап очистки ДНК, таким образом, может
быть также пропущен.
Для того чтобы проверить, сказываются ли указанные выше модификации на
результативности метода, мы сравнили выход молекулярных колоний в эскпериментах,
когда сшитые фрагменты хроматина были распределены в геле непосредственно после
выделения из клеток или после проведения стандартной процедуры расшивки и
депротеинизации. В обоих случаях число амплифицируемых матричных молекул ДНК
оказалось примерно одинаковым (рис. 37).
Рис. 37. Сравнение амплификационной способности ДНК, сшитой и не сшитой с белками: (А)
Наложенные изображения двух гелей, содержащих формальдегид-фиксированные фрагменты ДНК,
распределенные в геле без предварительной расшивки и очистки ДНК (сшитая ДНК) или после этой
процедуры (расшитая ДНК). Каждый гель содержит ~15 копий гаплоидного генома мыши. (Б) Гистограмма,
показывающая результаты 3-х независимых экспериментов, выполненных как в (А), в каждом из которых
было проанализировано 6 гелей с образцом каждого типа. Копийность фрагмента в эксперименте с
расшитой ДНК принята за 100%, и значение в эксперименте со сшитой ДНК пересчитано пропорционально.
Линии погрешностей соответствуют стандартной ошибке среднего.
215
III.2.3.4 Получение гомогенной фракции эритроидных клеток для INGRID-анализа
Печень эмбрионов мыши 14-го дня развития была использована в качестве источника
эритроидных клеток. В первой серии экспериментов клетки были фиксированы
формальдегидом
и
дополнительно
отсортированы
с
использованием
магнитных
микрошариков, несущих антитела к белку Ter119 – специфическому рецептору на
поверхности эритроидных клеток (Splinter et al., 2004) (рис. 38А). Это позволило отделить
эритроидные Ter119+-клетки от неэритроидных, присутствующих в эмбриональной
печени, например, клеток паренхимы (Zhang et al., 2003). Гомогенность клеточной
популяции особенно важна для метода INGRID, в котором пространственная организация
хроматина изучается на уровне единичных клеток. Для контроля были использованы
клетки мозга эмбриона мыши. С использованием тех же магнитных шариков эти клетки
были очищены от примеси эритроидных клеток, в результате был получен препарат
Ter119–-клеток (рис. 38А).
Рис. 38 (Б, В) показывает, что практически все клетки в препарате эритроидных
клеток
являются
Ter119-позитивными
(Ter119+)
и
>90%
клеток
положительно
окрашиваются на гемоглобин бензидином (Rowley et al., 1985). В то же время, препарат
неэритроидных клеток был представлен только Ter119-отрицательными клетками (Ter
119–),
не
содержащими
гемоглобина.
В
дополнение
препараты
клеток
были
проанализированы на содержание первичных транскриптов генов бета-глобинов (Hbb-b1
и
Hbb-b2),
гена
обонятельного
рецептора
(Olfr69)
и
гена
глицеральдегидфосфатдегидрогеназы (GAPDH). Как и ожидалось, бета-глобиновые гены
транскрибировались только в Ter119+-клетках, в обоих типах клеток транскрибировался
ген GAPDH, и ни в одном типе клеток не транкрибировался ген Olfr69 (рис.38Г).
216
217
III.2.3.5 Анализ частоты взаимодействия фрагментов домена бета-глобиновых генов,
солюбилизинованных из фиксированных эритроидных клеток
Для солюбилизации и одновременной фрагментации хроматина Ter119+-клетки были
обработаны ультразвуком в SDS-содержащем буфере с последующим удалением
нерастворимого
материала
центрифугированием.
Хотя
обработка
ультразвуком
обеспечивает достаточно эффективную солюбилизацию фиксированного материала, под
воздействием ультразвука могут также образовываться разрывы в тест-ампликонах. В
предварительных экспериментах были подобраны условия ультразвуковой обработки (7секундный импульс), обеспечивающие солюбилизацию большей части ДНК (~90%, рис.
39А, Б, Г) при минимальном повреждении тест-ампликонов (уровень разрывов <10%, рис.
39Е). После подходящего разведения (на один гель наносился материал, содержащий ~30
копий гаплоидного генома мыши) супернатант был подвержен амплификации в геле с
Рис. 38. Выделение и характеризация Ter119-позитивных и Ter119-негативных клеток для INGRIDанализа: (А) Схема, иллюстрирующая основные этапы выделения и дальнейшего анализа Ter119+ и Ter119–
клеток мыши. Dpc – day post coitum (дней после спаривания). Отмечено также, на каких клетках
проводились эксперименты по 3С-анализу домена бета-глобиновых генов мыши (раздел III.2.1). (Б-Г)
Характеристика выделенных клеток. (Б) Верхние панели: световая микроскопия клеток, окрашенных
бензидином для выявления гемоглобина. Нижние панели: гистограммы, показывающие процентную долю
бензидин-позитивных и бензидин-негативных клеток в популяциях Ter119+ и Ter119– клеток, полученных в
результате сортинга. Линии погрешностей соответствуют стандартной ошибке среднего для трех
независимых экспериментов (в каждом эксперименте осмотрено ~200 клеток). (В) Верхние панели:
флуоресцентная микроскопия фиксированных формальдегидом клеток, окрашенных флуоресцентно
меченными антителами против Ter119. ДНК окрашена DAPI. Нижние панели: гистограммы, показывающие
процентную долю Ter119-позитивных и Ter119-негативных клеток в полученных популяциях Ter119+ и
Ter119– клеток. Линии погрешностей соответствуют стандартной ошибке среднего для трех независимых
экспериментов (в каждом эксперименте осмотрено ~200 клеток). (Г) Транскрипционная активность
мажорного и минорного взрослых бета-глобиновых генов Hbb-b1 и Hbb-b2, гена обонятельного рецептора
Olfr69 и гена GAPDH в Ter119+ и Ter119– клетках, определенная методом обратной транскрипции с
последующей количественной ПЦР с ампликонами к интронным участкам (последовательности праймеров
и TaqMan-проб представлены в таблице 2). Гены Hbb-b1 и Hbb-b2 имеют схожие нуклеотидные
последовательности, и праймеры, которые мы использовали, позволяли анализировать суммарное
количество транскриптов обоих типов. Экспериментально определенные количества кДНК в каждом
образце были нормированы на количество кДНК рибосомальной РНК в этом образце. Количество кДНК
гена GAPDH в Ter119– клетках было принято за 100 отн. ед., и остальные значения пересчитаны
пропорционально. Линии погрешностей соответствуют стандартной ошибке среднего для трех независимых
экспериментов.
218
219
использованием праймеров и MB-проб к DHS5 области контроля локуса, P-b1 и P-b2
(промоторы генов Hbb-b1 и Hbb-b2). Число продуцированных колоний (рис. 40А, Б) было
на 10-20% меньше, чем можно было бы ожидать на основании числа ДНК, внесенного в
гель, что может быть обусловлено разрывом ампликонов после ультразвуковой обработки
(рис. 39Е), неполным восстановлением фрагментов ДНК, способных к амплификации
вследствие исключения этапов расшивки ДНК и протеолиза (рис. 37Б) или потерей
материала в ходе манипуляций. И все же, доля амплифицируемых молекул ДНК была
достаточно высокой, что было очень важно для анализа частот колокализаций.
Рис. 39. Солюбилизация и разрыв фрагментов домена бета-глобиновых генов, несущих выбранные
тест-ампликоны, при ультразвуковой обработке фиксированных формальдегидом клеток печени
мышиных эмбрионов: (А) Распределение ДНК между растворимой (супернатант) и нерастворимой
(осадок) фракциями после обработки фиксированных клеток ультразвуком в течение указаного времени
(положение регулятора мощности «7») и молекулярно-массовое распределение фрагментов ДНК. После УЗобработки растворимая и нерастворимая фракции были разделены центрифугированием с последующим
выделением ДНК и электрофорезом (агарозный гель, окраска бромистым этидием, представление в
обращенных цветах). (Б) Относительные количества ДНК в растворимой и нерастворимой фракциях по
данным флуорометрического определения концентрации ДНК. В каждом эксперименте общее количество
ДНК в двух фракциях принято за 100%. (В) Схема домена бета-глобиновых генов мыши (все обозначения
как на рис. 20), показывающая позиции тест-ампликонов, использованных в INGRID-анализе (черные
прямоугольники под схемой), и тест-ампликонов, использованных для ПЦР-анализа степени солюбилизации
и разрушения фрагментов (цветные прямоугольники под схемой). (Г,Д) Графики, показывающие степень
солюбилизации различных тест-ампликонов (S) – отношение общего количества тест-ампликона в
растворимой фракции (включая разрушенные и неразрушенные ампликоны) к общему количеству этого
ампликона в двух фракциях, которое было подсчитано на основании результатов ПЦР-анализа очищенных
образцов ДНК по следующей формуле: S(%)=[A(общ)–A(осадок)]/A(общ)*100%, где A(общ) – ПЦР-сигнал,
полученный для фиксированного, не обработанного ультразвуком, нефракционированного контрольного
образца, A(осадок) – ПЦР-сигнал, наблюдающийся в нерастворимой фракции. (Е, Ж) Графики,
показывающие уровень неповрежденных (неразорванных) тест-ампликонов в растворимой фракции (I) –
отношение количества неразорванного тест-ампликона в растворимой фракции к общему количеству этого
ампликона в растворимой фракции, которое было посчитано по следующей формуле:
I(%)=A(супер)/[A(общ)–A(осадок)]*100%, где A(супер) – ПЦР-сигнал, наблюдающийся в растворимой
фракции. На основании результатов электрофореза (А) мы принимаем в наших вычислениях, что тестампликоны в нерастворимой фракции по большей части не разорваны. На графиках в секциях (Г, Е)
представлены результаты экспериментов с 7-секундной ультразвуковой обработкой, на графиках в секциях
(Д, Ж) – результаты экспериментов с 15-секундной ультразвуковой обработкой. Чтобы избежать возможных
различий в эффективности амплификации образцов ДНК разной длины, перед ПЦР все образцы были
обработаны рестриктазой, сайты узнавания которой расположены за пределами тест-ампликонов.
Последовательности праймеров и TaqMan-проб, использованных для ПЦР-анализа, представлены в таблице
12. На каждом графике результаты для индивидуальных ампликонов представлены в соответствии с длиной
ампликонов с использованием той же цветовой кодировки, что принята в (В) для указания позиций
ампликонов. Серый прямоугольник на заднем плане графиков показывает размерный интервал, в который
попадают все тест-ампликоны, использованные в INGRID-анализе. Голубые линии – линии тренда. Линии
погрешностей соответствуют стандартной ошибке среднего для двух независимых экспериментов.
220
Анализ материала из Ter119+-клеток не показал наличия колоний белого цвета,
свидетельствуя о том, что все три ампликона редко представлены (или вовсе не
представлены) в одном и том же комплексе фиксированных фрагментов хроматина (рис.
40А). Колонии, содержащие два из трех ампликонов в различных комбинациях
(двухкомпонентные колонии) были обнаружены, однако процент таких колоний был
сравнительно низким. Для того чтобы учесть уровень случайного перекрывания двух и
более молекулярных колоний, часть фиксированных фрагментов хроматина была
подверждена стандартной процедуре расшивки и очистки ДНК до проведения анализа, с
тем чтобы какие-либо связи между фрагментами ДНК были разрушены до нанесения
материала на гель. Далее, принимая во внимание только точно совпадающие колонии,
растущие из одного центра, и не учитывая частично перекрывающиеся колонии (примеры
таких колоний показаны стрелками на увеличенной секции рис. 40А), мы подсчитали
число колоний каждого типа, наблюдающиеся в экспериментах со сшитыми и расшитыми
фрагментами. Оказалось, что частоты встречаемости смешанных колоний примерно
одинаковы в экспериментах со сшитыми фрагментами хроматина и в контрольных
экспериментах с расшитыми фрагментами (сравнивали рис. 40Б и В). Различия в доле
двойных и тройных колоний, зафиксированные между сшитым и расшитым образцами,
статистически
не
значимы
(p>0.4,
двухвыборочный
T-тест).
Низкая
частота
колокализации была также воспроизведена в экспериментах с более продолжительной
ультразвуковой обработкой (15-секундный импульс), обеспечивающей солюбилизацию
практически всех фрагментов ДНК (рис. 40Г и 39А,Б,Д).
Принимая во внимание уровень случайной колокализации колоний в наших
экспериментах (~5% для пары сигналов) и разброс результатов, наблюдающийся в
параллельных экспериментах, мы подсчитали, что комплексы двух или более геномных
фрагментов были бы надежно детектированы (различие между опытом и контролем было
221
Рис. 40. INGRID-анализ фрагментов хроматина, высвобожденных из фиксированных
формальдегидом эритроидных клеток мыши (Ter119+) при 7-секундной (А-В) и 15-секундной (Г)
ультразвуковой обработке: (А) Гель, содержащий сшитые фрагменты хроматина (эквивалент ~30 копий
гаплоидного генома мыши). Стрелками на увеличенном изображении геля показаны примеры
перекрывающихся и частично перекрывающихся колоний. (Б-Г) Диаграммы, показывающие среднее число
колоний на гель, подсчитанное при осмотре 6 гелей (Б, В) или 9 гелей (Г), содержащих материал из
фиксированных клеток (Б, Г) или тот же материал после стандартной процедуры расшивки и очистки ДНК
(В). В каждой диаграмме, слева направо, первые три столбика показывают общее число колоний,
гибридизующихся с указанной пробой (включая моно-, ди- и трикомпонентные колонии), вторые три
столбика показывают число колоний, гибридизующихся с указанной парой проб (дикомпонентные
колонии), и последний столбик показывает число колоний, гибридизующихся со всеми тремя
использованными пробами (трикомпонентные колонии). Линии погрешностей соответствуют стандартному
отклонению.
222
бы статистически значимым), если бы количество геномного фрагмента, представленного
в комплексе, составляло ≥3% общего количества этого фрагмента. Таким образом, сшитые
комплексы исследованных элементов генома, если и представлены, то составляют не
более 3% от общего количества любого из этих элементов. Можно было бы
предположить, что данный результат является следствием низкой эффективности
формальдегидной фиксации. Для проверки этого предположения в следующем
эксперименте мы осуществили комбинированную фиксацию клеток с использованием
двух
агентов
–
формальдегида
и
EGS
(этиленгликоль-
бис(сульфосукцинимидилсукцинат)), фиксирующий агент с длинным плечом (Zeng et al.,
2006) (рис. 41)). Следует отметить, что в этом эксперименте даже после 15-секундной
ультразвуковой обработки бóльшая часть
ДНК (~70%) оставалась в нерастворимой
фракции
(вероятно,
вследствие
сильной
сшивки) и, таким образом, исключалась из
последующего анализа. Как и в первой серии
экспериментов, ПЦР в геле была поставлена
на
солюбилизированном
материале
Рис.
41.
Химическая
структура
бифункционального фиксирующего агента
EGS.
с
использованием праймеров и MB-проб к P-b1, P-b2 и DHS5. Кроме того, в анализ был
включен энхансерный элемент DHS-62, который, как предполагается, участвует в сборке
активаторного хроматинового блока (Tolhuis et al., 2002), а также два «отрицательных
контроля»: участок «-42» и участок из «генной пустыни» с другой хромосомы (Chr3)
(Nobrega et al., 2004) (см. рис. 32А). С материалом, зафиксированным формальдегидом и
EGS, наблюдались значительные вариации в числе колоний, образованных различными
тест-участками. К примеру, DHS5 и P-b2 образовывали ~25 колоний на гель, тогда как HS62, -42 и Chr3 – 10-15 (рис. 42 А,В,Г). Отчасти эти вариации могут быть связаны с
223
неравной солюбилизацией различных фрагментов из клеток, зафиксированных двумя
агентами, как в случае солюбилизации фрагментов хроматина в процедуре 3С (см. рис.
21). Более важным представляется то, что ни с одной комбинацией тест-фрагментов мы не
обнаружили превышения доли мультикомпонентных колоний над уровнем случайной
колокализации (рис. 42). Различий между опытными и контрольными образцами выявлено
не было (p>0.3, двухвыборочный T-тест).
Рис. 42. INGRID-анализ фрагментов хроматина, высвобожденных с помощью ультразвуковой
обработки из эмбриональных клеток печени мыши, фиксированных EGS и формальдегидом.
Диаграммы показывают среднее число колоний на гель, подсчитанное при осмотре 6 гелей, содержащих
материал из фиксированных клеток (А, В, Г) или тот же материал после стандартной процедуры расшивки и
очистки ДНК (Б). В каждом случае в гель был внесен материал, эквивалентный ~25 копиям гаплоидного
генома мыши. Все обозначения как на рис. 40.
224
В заключительной серии экспериментов фиксированные фрагменты хроматина для
INGRID-анализа были приготовлены согласно стандартному протоколу 3C. Ядра
формальдегид-фиксированных клеток эмбриональной печени мыши были обработаны
SDS
и
эндонуклеазой
HindIII.
После
удаления
нерастворимого
материала
центрифугированием супернатант был подвержен INGRID-анализу с использованием
праймеров и MB-проб, отжигающихся в HindIII-фрагментах, несущих DHS4/5, P-b1, P-b2
и тест-участок с хромосомы 3 (см.
выше). В соответствии с результатами,
изложенными
в
разделе
III.2.1,
обработка фиксированных ядер SDS и
HindIII
привела
незначительного
к
и
солюбилизации
неэквимолярного
количества каждого из фрагментов
(рис.
43).
В
этих
экспериментах
молекулярные колонии, выявляемые
различными пробами, точно так же
колокализовывались только случайным
образом (рис. 43).
Все
описанные
выше
эксперименты были выполнены и для
эмбриональных клеток мозга мыши, в
которых глобиновые гены неактивны
(см. рис. 38), и были получены схожие
Рис. 43. INGRID-анализ фрагментов хроматина,
высвобожденных
из
фиксированных
формальдегидом эмбриональных клеток печени
мыши с использованием протокола 3С.
Диаграммы показывают среднее число колоний на
гель, подсчитанное при осмотре 6 гелей,
содержащих материал из фиксированных клеток.
Все обозначения как на рис. 40.
результаты (данные не показаны).
225
Чтобы выяснить, действительно ли с помощью метода INGRID возможно
идентифицировать хромосомальные элементы, взаимодействующие через «белковые
мостики», мы проверили, будут ли два ампликона, лежащие в соседних рестрикционных
фрагментах, которые должны эффективно сшиваться через гистоны, часто формировать
бинарные колонии в ходе амплификации фиксированного и переваренного рестриктазой
хроматина. В этом контрольном эксперименте в комбинации с ампликонами DHS5 и P-b2
был использован новый ампликон DHS5up, лежащий ~130 п.н. выше ампликона DHS5
(рис. 44А). После проведения ПЦР в геле на образце, который был фиксирован
формальдегидом, обработан ультразвуком, но не переварен рестриктазой, мы смогли
идентифицировать ~20 индивидуальных колоний каждого типа, и ~60% ампликонов DHS5
и DHS5up колокализовывались, то есть образовывали бинарные колонии (рис. 44Б).
Уровень колокализации был меньше 100% – уровня, который можно было ожидать для
фрагментов,
принадлежащих
одному
фрагменту
ДНК,
образованному
в
ходе
ультразвуковой обработки. Это может быть объяснено частичным разрушением участка
ДНК длиной 650 п.н., захватывающего пару ампликонов, при обработке ультразвуком (см.
рис. 39Е) или неполным восстановлением фрагментов ДНК, способных к амплификации
(см. рис. 37Б). В то же время уровень колокализации двух других пар ампликонов,
DHS5∙P-b2 и DHS5up∙P-b2, был намного меньше, ~3% (рис. 44Б). После расщепления
сшитого и подверженного ультразвуковой обработке хроматина по сайту HindIII,
разобщающего ампликоны DHS5 и DHS5up, уровень колокализации ампликонов снизился,
но остался при этом весьма значительным, ~15% после вычитания уровня фоновой
колокализации (рис. 44В). Когда HindIII-расщепленный материал был подвержен
стандартной процедуре расшивки и очистки ДНК до ПЦР в геле, уровень колокализации
оказался ниже 5% (рис. 44Г) – величины, близкой к расчетной доле нерасщепленных
фрагментов хроматина. Основываясь на этих данных, мы заключили, что ~10% соседних
226
Рис. 44. Регистрация взаимодействия между элементами, соседствующими друг с другом на
хромосомальной ДНК: (А) Схема анализируемого участка, показывающая позиции праймеров (стрелки) и
MB-проб, рестрикционный сайт HindIII, элемент DHS5 (черный прямоугольник) и первый экзон минорного
бета-глобинового гена Hbb-b2 (красный прямоугольник). (Б-Г) Диаграммы, показывающие среднее число
колоний на гель и линии погрешностей (стандартное отклонение, n=6) в экспериментах с фрагментами
хроматина, высвобожденными из фиксированных формальдегидом эмбриональных клеток печени при 7секундной ультразвуковой обработке (Б), тем же материалом, обработанным рестриктазой HindIII (В), и
HindIII-обработанным материалом после процедуры расшивки и очистки ДНК (Г). В каждом случае в гель
внесено ~20 копий гаплоидного генома. В правом верхнем углу диаграммы (Б) представлен один из 6 гелей,
использованных в эксперименте. Процент двойных колоний подсчитан относительно среднего общего числа
индивидуальных колоний каждого типа (среднее по первым трем столбикам диаграммы). Остальные
обозначения как на рис. 40.
227
рестрикционных фрагментов сшиваются формальдегидом в процессе фиксации живых
клеток.
В целом, результаты INGRID-анализа свидетельствуют об отсутствии прямых
«белковых мостиков» между промоторами активных глобиновых генов и их удаленными
энхансерными элементами, что согласуется с результатами 3С-анализа, представленными
в разделах III.2.1 и III.2.2. Таким образом, полученные нами данные опровергают
общепринятую модель, постулирующую, что удаленные энхансеры и контролируемые
ими промоторы объединяются в стабильный активаторный комплекс.
III.2.4 ИЗУЧЕНИЕ
РОЛИ
ЯДЕРНОГО
МАТРИКСА
В
ПОДДЕРЖАНИИ
КОНТАКТОВ УДАЛЕННЫХ ЭЛЕМЕНТОВ ГЕНОМА
Как показали наши исследования, пространственная близость промоторов и энхансеров
требует сохранения целостности ядра и не обусловлена сборкой элементов в единый ДНКбелковый комплекс. Мы предположили, что контакт удаленных регуляторных элементов
генома может опосредоваться их привлечением к некоторой общей структуре, такой как
ядерный белковый матрикс. Как отмечалось в обзоре литературы, ядерный матрикс –
гипотетическая опорная структура клеточного ядра (Berezney and Coffey, 1977).
Предполагается, что эта структура построена преимущественно из негистоновых белков,
которые
формируют
сложную
разветвленную
сеть,
пронизывающую
ядро
и
сообщающуюся с ядерной ламиной. Хотя природа ядерного матрикса остается не ясной, и
само существование ядерного матрикса ставится под вопрос рядом исследователей
(Hancock, 2000; Misteli, 2007; Pederson, 2000), представляется весьма вероятным, что
ядерная компартментализация все-таки поддерживается некоторой скелетной структурой,
возможно, и не такой прочной и стабильной, как цитоскелет (Barboro et al., 2003; Brown,
1999; Cai et al., 2003; Malyavantham et al., 2009; Simon and Wilson, 2011).
228
Ядерный матрикс может быть выделен путем высокосолевой экстракции ядер,
предварительно обработанных нуклеазой (Berezney and Coffey, 1977). Эта обработка
удаляет из ядра бóльшую часть белков, включая гистоны. Часть ДНК остается
ассоциированной с ядерным матриксом после высокосолевой экстракции. Такую ДНК
называют «ДНК ядерного матрикса», или ямДНК, и размер фрагментов ямДНК зависит от
интенсивности
нуклеазной
обработки
(Mant'eva
et
al.,
1979).
Многочисленные
исследования свидетельствуют о том, что различные регуляторные элементы (такие как
промоторы, энхансеры и инсуляторы) ассоциируют с ядерным матриксом (обсуждено в
обзорах (Dorman et al., 2007; Jackson, 1997; Stein et al., 2004)). Таким образом, можно
предположить, что ядерный матрикс выступает «платформой» для взаимодействия
геномных элементов. Если это так, то последовательности ДНК, вовлеченные во
взаимодействие, должны сохраняться на ядерном матриксе в пространственной близости
друг от друга после удаления основной массы хроматина посредством нуклеазной
обработки и солевой экстракции. Для проверки этой гипотезы, основываясь на протоколе
3С, мы разработали новый экспериментальный подход, названный нами M3C (matrix 3C),
который
позволяет
анализировать
вопрос
о
пространственной
сближенности
прикрепленных к ядерному матриксу фрагментов ДНК. Протокол M3C включает
изоляцию так называемых нуклеоидов (ядер, обработанных высокосолевым раствором,
содержащих всю геномную ДНК, организованную в виде петель, прикрепленных к
ядерному матриксу) (Cook et al., 1976), удаление дистальных частей петель ДНК
посредством обработки эндонуклеазами рестрикции (Cook and Brazell, 1980) и
последующий анализ частот лигирования фрагментов ДНК, связанных с ядерным
матриксом (рис. 45A).
229
III.2.4.1 Разработка метода M3C
В протоколе 3С-метода пространственная близость между фрагментами ДНК в ядре
«фиксируется»
путем
обработки
формальдегидом,
что
обеспечивает
сохранение
взаиморасположения участков ДНК при последующей экстракции SDS. Комплексы же
ДНК с ядерным матриксом должны быть устойчивы к солевой экстракции и не требуют
формальдегидной фиксации. Для анализа частоты взаимодействия фрагментов ямДНК
необходимо было изолировать ядерные матриксы, содержащие сравнительно короткие
фрагменты ДНК, концы которых были бы лигируемы друг с другом. Для удовлетворения
этих условий мы использовали эндонуклеазы рестрикции для удаления дистальных частей
петель ДНК (Cook and Brazell, 1980). Рестриктазы работают недостаточно эффективно на
образцах хроматина, поэтому вначале мы удалили гистоны путем экстракции ядер
высокосолевым раствором (2M NaCl) и получили нуклеоиды (Cook et al., 1976), которые
затем были обработаны подходящей рестриктазой. Отщепленные фрагменты ДНК были
удалены отмывкой. Анализ препаратов под микроскопом продемонстрировал, что ядерное
«галло» (петли ДНК, окружающие ядерный матрикс) эффективно удаляется после
обработки нуклеоидов рестриктазами и последующих отмывок (рис. 45Б). Детальное
описание экспериментальной процедуры, использованной для получения ядерных
матриксов и связанных с ними фрагментов ДНК, представлено в разделе «Материалы и
методы» (II.6). Ядерные матриксы со связанными фрагментами ямДНК были обработаны
лигазой. После этого матриксы лизировали и очищали ДНК стандартными методами.
Частоты лигирования различных фрагментов ДНК анализировали с использованием
метода ПЦР в реальном времени с TaqMan-пробами, как в стандартном протоколе 3Сметода.
230
Рис. 45. Принципиальная схема метода M3C: (А) Основные этапы экспериментальной процедуры (см.
пояснения в тексте). (Б) Флуоресцентная микроскопия ядер, нуклеоидов и матриксов, выделенных из
пролиферирующих клеток HD3. Верхний ряд – иммуноокрашивание ламинов A и C, нижний ряд –
окрашивание ДНК DAPI.
231
III.2.4.2 M3C-анализ взаимодействий геномных элементов в окрестностях домена
альфа-глобиновых генов кур
Для апробации нового экспериментального протокола мы выбрали сегмент хромосомы 14
курицы, включающий домен альфа-глобиновых генов и ряд генов домашнего хозяйства
(рис. 46А). Применение метода M3C должно было дать ответ на вопрос, взаимодействуют
ли какие-либо функциональные элементы этой области генома на «поверхности» ядерного
матрикса. Для дискриминации конститутивных (не зависимых от типа клеток) и
эритроидспецифичных взаимодействий пространственная конфигурация локуса была
проанализирована в параллели в эритроидных (HD3) и лимфоидных (DT40) куриных
клетках. В некоторых экспериментах клетки HD3 были индуцированы в терминальную
эритроидную дифференцировку. В результате этой индукции значительно стимулируется
экспрессия взрослых альфа-глобиновых генов (Gavrilov and Razin, 2008).
Для расщепления ДНК была использована комбинация эндонуклеаз рестрикции
BglII и BamHI. Эти ферменты узнают различные последовательности ДНК (AGATCT и
GGATCC), но продуцируют совместимые концы, которые могут лигироваться друг с
другом. С использованием рестриктаз BglII и BamHI исследуемый участок куриного
генома расщепляется на фрагменты от 0.02 до 7.7 т.п.н. Сначала мы проанализировали
относительную представленность во фракции ямДНК фрагментов, несущих важные
функциональные элементы. Для этих фрагментов были подобраны тест-ампликоны и
проведена ПЦР-амплификация с TaqMan-пробами. Результаты этих экспериментов (рис.
47А) продемонстрировали, что в клетках DT40 и HD3 (пролифирирующих или
индуцированных
ассоциированный
к
дифференцировке)
с
промотором
фрагмент
гена
ДНК,
NPRL3,
несущий
представлен
CpG-островок,
в
ядерном
232
233
матриксе на значительно более высоком уровне, чем фрагменты, несущие 3’-конец гена
NPRL3, главный регуляторный элемент альфа-глобиновых генов (MRE) и промотор гена
D.
Мы
также
выделили
ямДНК
с
использованием
микрококковой
нуклеазы
(ограниченный гидролиз) для удаления дистальных частей петель ДНК. Относительные
количества фрагментов, включающих 3’-конец гена NPRL3, CpG-островок гена NPRL3 и
ген D, в полученных препаратах ДНК были схожи с таковыми в препаратах, полученных
с использованием рестриктаз BglII и BamHI (рис. 47Б).
Для выяснения роли ядерного матрикса в пространственной организации
вышеупомянутого участка генома (рис. 46А) мы провели 3С-анализ в параллели с M3Cанализом и сравнили результаты, полученные с использованием этих двух различных
методов (рис. 46Б,В). В качестве якорного был использован рестрикционный фрагмент,
содержащий CpG-островок, внутри которого находится промотор гена домашнего
хозяйства NPRL3 (Flint et al., 2001; Klochkov et al., 2006; Kowalczyk et al., 2012a).
В
стандартном
3С-эксперименте
якорный
фрагмент
предпочтительно
взаимодействовал с фрагментами, несущими промотор гена D и СpG-островки,
ассоциированные с промоторами генов домашнего хозяйства MPRL28 и AXIN1 (рис. 46Б).
Рис. 46. Сравнение результатов 3С- и M3C- анализов: (А) Схема изучаемого участка куриного генома, на
которой отмечены позиции генов (большие стрелки), регуляторных элементов (черные овалы) и CpGостровков (вертикальные прямоугольники). Ниже показаны позиции сайтов рестрикции BamHI (черные
черточки) и BglII (серые черточки) и праймеров, использованных для ПЦР-анализа продуктов лигирования
(галочки); праймеры на якорных рестрикционных фрагментах заключены в кружок. Последовательности
праймеров и TaqMan-проб представлены в таблице 8. Шкала - в т.п.н., точка «0» соответствует 3’-концу
гена NPRL3. (Б) Результаты 3С-эксперимента с «якорем» на CpG-островке гена NPRL3. График показывает
относительные частоты лигирования якорного фрагмента с другими фрагментами анализируемой области.
Частоты лигирования, определенные для различных образцов, были нормированы на частоту лигирования
фрагментов гена ERCC3 в этих образцах. Наибольшая частота лигирования (частота лигирования якорного
фрагмента и фрагмента, несущего промотор гена αD, в эксперименте с индуцированными клетками HD3)
принята за 100%, и остальные значения пересчитаны пропорционально. (В) Результаты M3С-эксперимента с
«якорем» на CpG-островке гена NPRL3. График аналогичен представленному в (Б). Наибольшая частота
лигирования (частота лигирования якорного фрагмента и фрагмента, несущего CpG-островок гена MPRL28,
в эксперименте с пролиферирующими клетками HD3) принята за 100%, и остальные значения пересчитаны
пропорционально. Линии погрешностей соответствуют стандартной ошибке среднего для трех независимых
экспериментов. Остальные обозначения как на рис. 15.
234
Рис. 47. Анализ представленности различных фрагментов исследуемой области генома во фракции
ДНК ядерного матрикса, полученной с помощью обработки нуклеоидов рестриктазами BamHI и BglII
(А) или обработки ядер микрококковой нуклеазой (Б). Относительные количества фрагментов
определены методом количественной ПЦР (последовательности праймеров и TaqMan-проб представлены в
таблице 10). В секции (А) представлены результаты экспериментов с клетками DT40 и HD3
(пролиферирующими и индуцированными в дифференцировку). Количество фрагмента, представленного в
ядерном матриксе на наиболее высоком уровне (CpG-островок гена NPRL3 в пролиферирующих клетках
HD3), принято за 100%, и остальные значения пересчитаны пропорционально. В секции (Б) ядерные
матриксы были выделены из пролиферирующих клеток HD3. С каждым тест-ампликоном было
проанализировано три образца ямДНК, полученной после обработки ядер возрастающим количеством
микрококковой нуклеазы. Наибольшее количество фрагмента, обнаруженное во всех экспериментах,
принято за 100%, и остальные значения пересчитаны пропорционально.
Данные взаимодействия наблюдались во всех трех исследованных типах клеток. Кроме
того, в пролиферирующих клетках HD3 якорный фрагмент демонстрировал повышенную
частоту взаимодействия с MRE. Частота взаимодействия с промотором гена D была
примерно вдвое выше в клетках HD3 по сравнению с DT40 и еще больше в
дифференцированных клетках HD3. Частота взаимодействия якорного фрагмента с
фрагментом,
несущим
MRE,
также
увеличивалась
примерно
в
два раза при
235
дифференцировке
клеток
HD3.
опубликованными
результатами
Эти
данные
(Gavrilov
and
согласуются
Razin,
с
2008).
нашими
Иной
ранее
характер
взаимодействий был обнаружен в M3C-экспериментах (рис. 46В). В этих экспериментах
мы выявили взаимодействие между якорным фрагментом и CpG-островками генов
MPRL28 и AXIN1 в клетках DT40 и клетках HD3 как до, так и после индукции
терминальной эритроидной дифференцировки, однако взаимодействие с MRE и
промотором гена D зарегистрировано не было.
Для правильной интерпретации результатов M3C-экспериментов необходимо было
рассмотреть возможность лигирования фрагментов ямДНК, не локализованных в
пространственной близости друг от друга на ядерном матриксе. Диаметр ядра/ядерного
матрикса клетки HD3 составляет примерно 10 мкм, что соответствует линейному
фрагменту ДНК длиной 29.4 т.п.н. Как было отмечено выше, исследуемая область генома
расщепляется на фрагменты длиной от 0.02 до 7.7 т.п.н. при обработке нуклеоидов
комбинацией рестриктаз BamHI и BglII (см. рис. 46А). Якорный фрагмент имеет длину 5.9
т.п.н. В зависимости от позиции участка прикрепления к ядерному матриксу конец этого
фрагмента может обследовать достаточно обширную область ядра (1-2 мкм от участка
прикрепления, т.е. 10-20% диаметра ядра). В такой ситуации нельзя исключить
возможности лигирования между фрагментами ДНК, расположенными на ядерном
матриксе на значительном расстоянии друг от друга (рис. 48А, слева). С другой стороны,
этого не произойдет, если фрагменты ямДНК достаточно короткие или если их
подвижность ограничена множественными участками прикрепления к ядерному матриксу
(рис. 48А, справа). Для того чтобы выяснить, могут ли кажущиеся взаимодействия между
фрагментами ямДНК, детектируемые в M3C-экспериментах, отражать лигирование
фрагментов, удаленных друг от друга, мы проанализировали частоту лигирования
якорного фрагмента, несущего CpG-островок гена NPRL3, c фрагментами ямДНК,
236
расположенными
хромосомах.
фрагментов
на
В
в
эксперименте
других
качестве
этом
тест-
контрольном
были
выбраны
фрагменты, несущие CpG-островки
генов c-Myc (хромосома 2) и ERCC3
(хромосома 7), поскольку результаты,
обсужденные выше (рис. 46, 47), и
представленные
предполагают,
на
что
рис.
49,
CpG-островки,
несущие промоторы генов домашнего
хозяйства,
матриксом.
обоих
связаны
Частота
фрагментов
с
ядерным
лигирования
с
якорным
фрагментом, несущим CpG-островок
гена NPRL3, была очень низкой, хотя
представленность во фракции ямДНК
фрагментов, несущих CpG-островки
генов c-MYC и ERCC3, была выше (cMyc) или сопоставима (ERCC3) с
таковой для фрагментов, несущих
CpG-островки генов NPRL3, MPRL28
и AXIN1 (таблица 15).
Рис 48. Схема, иллюстрирующая возможность
лигирования фрагментов ямДНК, расположенных на
значительном расстоянии друг от друга (А), и
контрольный
эксперимент
по
лигированию
фрагментов ямДНК после лизиса ядерного матрикса с
помощью SDS (Б, В). (А) Возможные варианты
организации фрагментов ДНК на ядерном матриксе.
Длинные фрагменты, имеющие протяженные свободные
концы, могут лигироваться, даже если занимают
отдаленные позиции на ядерном матриксе (схема слева). В
случае
коротких
фрагментов
и/или
наличия
множественных участков прикрепления к ядерному
матриксу лигирования не произойдет (схема справа). (Б)
Схема контрольного эксперимента по лизису ядерного
матрикса.
(В)
График,
показывающий
частоты
лигирования якорного фрагмента, несущего CpG-островок
гена NPRL3, и нижележащих фрагментов в контрольном
эксперименте. Значения представлены относительно
частоты лигирования фрагмента, несущего CpG-островок
гена NPRL3, и фрагмента, несущего CpG-островок гена
MPRL28,
в
стандартном
M3C-эксперименте
с
пролиферирующими клетками HD3 (принята за 100%, см.
рис. 46В). Все обозначения как на рис. 46.
237
Таблица 15. M3C-анализ взаимодействия CpG-островка гена NPRL3 и CpG-островков генов
домашнего хозяйства, расположенных на той же и других хромосомах.
Клетки DT40
Тест-участок
Хромосома
Клетки HD3
Содержание в
Отн.частота
Содержание в
Отн.частота
матриксе,%
лигирования,%
матриксе,%
лигирования,%
NPRL3 (якорь)
14
20.2
MRPL28
14
33.1
100
14.9
100
AXIN1
14
32.8
90
19.4
83
ERCC3
7
26.4
0.7
16.0
1.2
cMYC
2
100
2.1
100
0.4
31.6
В колонке «Содержание в матриксе» показаны относительные количества рестрикционных фрагментов
во фракции ямДНК по данным количественной ПЦР с праймерами к внутренним участкам
рестрикционных фрагментов (последовательности праймеров и TaqMan-проб представлены в таблице
10). Для каждого типа клеток количество наиболее представленного фрагмента (CpG-островок гена
сMYC) принято за 100%, и остальные значения пересчитаны пропорционально. В колонке «Частота
лигирования» представлены относительные частоты лигирования якорного фрагмента (CpG-островок
гена NPRL3) с фрагментами, несущими CpG-островки указанных генов. Для каждого типа клеток
наибольшая частота лигирования (частота лигирования якорного фрагмента и фрагмента, несущего CpGостровок гена MPRL28) принята за 100%, и остальные значения пересчитаны пропорционально.
Последовательности праймеров и TaqMan-проб, использованные для анализа частот лигирования,
представлены в таблице 8. Для приготовления эквимолярной смеси продуктов лигирования проводили
ПЦР-амплификацию участков куриного генома, перекрывающих анализируемые концы рестрикционных
фрагментов, с последующим перевариванием ПЦР-продуктов рестриктазами BamHI и BglII и
религированием (последовательности праймеров представлены в таблице 9).
Мы провели также дополнительный контрольный эксперимент, в котором ядерные
матриксы, выделенные в соответствии со стандартной процедурой M3C, были лизированы
с помощью SDS перед проведением реакции лигирования (рис. 48Б). В этом случае
предпочтительного лигирования якорного фрагмента ни с одним из нижележащих
фрагментов обнаружено не было (рис. 48В). Таким образом ясно, что возможность
выявления взаимодействий фрагментов ямДНК с помощью протокола M3C строго зависит
от целостности ядерного матрикса.
Основной вывод из M3C-экспериментов с «якорем» на CpG-островке гена NPRL3
состоит в том, что CpG-островки генов домашнего хозяйства, представленных в
238
изучаемой области генома, формируют некий стабильный комплекс (ассоциат), который
сохраняет целостность после удаления хроматина (т.е. привлечен к ядерному матриксу
или является его составной частью). Для проверки этого вывода «якорь» был
последовательно перемещен на CpG-островки генов MPRL28 и AXIN1. В этих M3Cэкспериментах
мы
снова
наблюдали
взаимодействие
между
CpG-островком,
использованным в качестве «якоря», и двумя другими CpG-островками, несущими
промоторы генов домашнего хозяйства, как в эритроидных, так и в лимфоидных клетках
(рис. 49А,Б). Следовательно, CpG-островки, ассоциированные с промоторами генов
домашнего хозяйства (NPRL3, MPRL28 и AXIN1), взаимодействуют друг с другом на
ядерном матриксе. Примечательно, что CpG-островок, локализованный между генами
MPRL28 и AXIN1, не содержит промотора и не взаимодействует на ядерном матриксе ни с
одним из трех других CpG-островков, изученных в наших экспериментах.
M3C-эксперименты,
рестрикционные
в
фрагменты,
которых в
несущие
качестве якорного
CpG-островки
генов
были использованы
MPRL28
и
AXIN1,
продемонстрировали отсутствие взаимодействия этих CpG-островков с промотором гена
D на ядерном матриксе (рис. 49А,Б). Это наблюдение было дополнительно подтверждено
в экспериментах с «якорем» на промоторе гена D (рис. 49В). Характер взаимодействий не
изменился и при индукции терминальной эритроидной дифференцировки клеток HD3,
при которой ген D начинает активно экспрессироваться (рис. 49Г).
239
Рис. 49. Частоты лигирования различных якорных фрагментов в экспериментах по M3C-анализу.
Представлены относительные частоты лигирования якорного фрагмента, несущего CpG-островок гена
MPRL28 (А), CpG-островок гена AXIN1 (Б) или промотор гена αD (В, Г), с другими фрагментами
анализируемой области генома. Значения представлены относительно частоты лигирования фрагмента,
несущего CpG-островок гена NPRL3, и фрагмента, несущего CpG-островок гена MPRL28, в M3Cэксперименте с пролиферирующими клетками HD3 (принята за 100%; см. рис. 46В). Линии погрешностей
соответствуют стандартной ошибке среднего для как минимум двух независимых экспериментов. Все
обозначения как на рис. 46.
240
III.3 МЕХАНИЗМЫ
ПОДДЕРЖАНИЯ
ТРЕХМЕРНОЙ
ОРГАНИЗАЦИИ
ГЕНОМА
III.3.1 ПОЛНОГЕНОМНЫЙ
АНАЛИЗ
ПРОСТРАНСТВЕННЫХ
ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ СpG-ОСТРОВКОВ, СОДЕРЖАЩИХ ПРОМОТОРЫ
ГЕНОВ ДОМАШНЕГО ХОЗЯЙСТВА
Как было рассмотрено в обзоре литературы, трехмерная организация эукариотического
генома тесно связана с пространственной компартментализацией клеточного ядра.
Хорошим примером, демонстрирующим эту взаимосвязь, служат транскрипционные
фабрики (раздел I.3.4.1.2) – ядерные компартменты, в которых концентрируется РНКполимераза
II
и
вспомогательные
белки,
осуществляющие
транскрипцию
(транскрипционные факторы, комплексы ремоделирования хроматина и др.), и куда
привлекаются гены и их регуляторные элементы (Carter et al., 2008; Faro-Trindade and
Cook, 2006; Osborne et al., 2004; Sutherland and Bickmore, 2009). Было предположено, что
объединение
генов
в
транскрипционные
фабрики
является
главным
фактором
поддержания функционально-зависимой трехмерной организации интерфазного генома
(Cook, 2010). Принципы организации генов в транскрипционные фабрики явились
предметом интенсивных исследований, однако остаются не выясненными до конца.
Сообщалось,
что
функционально
связанные
гены
привлекаются
к
общим
транскрипционным фабрикам (Schoenfelder et al., 2010a; Schoenfelder et al., 2010b), что
соотносится с моделью специализированных транскрипционных фабрик (Bartlett et al.,
2006). Однако данные, на которых основана эта модель, довольно противоречивы. К
примеру,
было
продемонстрировано,
что
вероятность
нахождения
в
одной
транскрипционной фабрике более чем двух генов, обладающих одной и той же
тканеспецифичностью, меньше той, которую можно ожидать на основании случайного
241
распределения экспрессирующихся генов между всеми транскрипционными фабриками
(Schoenfelder et al., 2010a; Schoenfelder et al., 2010b). Более того, описаны примеры
транскрипционных фабрик, содержащих как тканеспецифичные гены, так и гены
домашнего хозяйства (Osborne et al., 2007; Zhou et al., 2006).
Важно отметить, что даже в дифференцированных клетках общее число
транскрибирующихся генов домашнего хозяйства существенно превосходит число
транскрибирующихся тканеспецифичных генов (рис. 50). Следовательно, если сближение
генов
в
составе
транскрипционных
фабрик
действительно
направляет
укладку
интерфазного генома, разумно предположить, что эта укладка в первую очередь
определяется сближением генов домашнего хозяйства. Для того чтобы идентифицировать
механизмы,
лежащие
тканеспецифичных
в
генов
основе
в
объединения
транскрипционные
генов
домашнего
фабрики,
мы
хозяйства
решили
и
провести
Рис. 50. Численность генов домашнего хозяйства и тканеспецифичных генов человека. Представлено
число генов домашнего хозяйства (по (Eisenberg and Levanon, 2013)) и число различных тканеспецифичных
генов (по базе данных TiGER (Liu et al., 2008)).
242
полногеномный анализ пространственных контактов гена домашнего хозяйства курицы
NPRL3 (Kowalczyk et al., 2012a), локализованного на хромосоме 14 перед кластером
альфа-глобиновых генов (см. рис. 18А). Ген NPRL3 находится в протяженном участке
геномной синтении и высоко консервативен у позвоночных животных (Flint et al., 2001;
Hughes et al., 2005). Промотор гена NPRL3 ассоциирован с CpG-островком (Klochkov et al.,
2006), который также содержит участок начала репликации (Razin et al., 1986). В
исследованиях, посвященных разработке метода анализа взаимодействия геномных
элементов на ядерном матриксе (предыдущий раздел), было показано, что CpG-островок
гена NPRL3 взаимодействует с расположенными поблизости CpG-островками, несущими
промоторы генов домашнего хозяйства MPRL28 и AXIN1. Наши предыдущие
исследования свидетельствуют о том, что в эритроидных клетках кур CpG-островок гена
NPRL3 привлекается к активаторному хроматиновому блоку, контролирующему
экспрессию альфа-глобиновых генов (Gavrilov and Razin, 2008). На настоящем этапе
работы мы идентифицировали полный спектр контактов геномного фрагмента, несущего
CpG-островок гена NPRL3, с другими фрагментами хромосомы 14 и других хромосом в
лимфоидных (DT40) и эритроидных (HD3) клетках курицы с использованием метода 4Санализа.
III.3.1.1 Принцип метода 4С
Метод 4С (от англ. circular chromosome conformation capture) – циркулярная фиксация
конформации хромосомы – полногеномный метод из панели С-методов, позволяющий
анализировать степень пространственной близости одного выбранного геномного
фрагмента с остальными фрагментами генома (Simonis et al., 2006; van de Werken et al.,
2012). В основе метода лежит процедура 3С. Клетки фиксируют формальдегидом,
геномную ДНК расщепляют эндонуклеазами рестрикции и религируют (рис. 51). Как
243
было показано в наших исследованиях (раздел III.2.1), эти стадии осуществляются in situ,
т.е. непосредственно в ядрах. Фрагменты, расположенные в ядре в пространственной
близости, лигируются случайным образом и образуют химерные продукты лигирования.
Полученную ДНК (3С-библиотека) очищают, повторно расщепляют частощепящей
рестриктазой и религируют при низкой концентрации ДНК. Это приводит к
Рис. 51. Схема метода 4С. Представлены основные этапы экспериментальной процедуры. Первые этапы
повторяют процедуру 3С («3С-часть»). 4С-часть включает вторичную рестрикцию мелкощепящей
рестриктазой, циркуляризацию фрагментов и инвертированную ПЦР с праймерами к интересующему
(якорному) фрагменту, в ходе которой происходит амплификация всех фрагментов генома, лигированных к
якорному на этапе 3С. Анализ продуктов амплификации проводится с помощью секвенирования.
244
циркуляризации фрагментов, образованных после вторичной рестрикции. На следующем
этапе проводят инвертированную ПЦР с праймерами, отжигающимися во фрагменте,
представляющем интерес, и направленными «наружу» своими 3’-концами (рис. 51). В
результате происходит амплификация всех геномных фрагментов, объединенных с
якорным фрагментом на этапе первичного лигирования (т.е. находящихся с этим
фрагментом
в
пространственной
близости).
Для
повышения
эффективности
амплификации перед ПЦР кольцевые матричные молекулы линеаризуют путем третичной
рестрикции по сайту, расположенному во внутренней части якорного фрагмента.
Продукты
амплификации
(4С-библиотека)
анализируют
с
помощью
массивного
параллельного секвенирования (рис. 51) (van de Werken et al., 2012).
III.3.1.2 Дизайн 4С-экспериментов
Мы применили метод 4С для картирования дальних взаимодействий CpG-островка,
несущего промотор гена домашнего хозяйства NPRL3, в масштабе всего генома.
Эксперименты в параллели были проведены на культивируемых лимфоидных (DT40) и
эритроидных (HD3) клетках курицы. По данным RNAseq-анализа, в этих клеточных
линиях ген NPRL3 транскрибируется примерно на одном уровне (неопубликованные
данные нашей лаборатории). Для получения 3С-библиотек была использована рестриктаза
HindIII, для получения 4С-библиотек – рестриктаза DpnII. Эксперименты на каждой
клеточной линии были проведены в двух независимых биологических повторах;
сравнение результатов показало хорошую воспроизводимость 4С-данных (см. ниже). 4Сбиблиотеки секвенировали на приборе Иллюмина (45-64×106 парноконцевых прочтений,
т.е. около 22-32 миллионов пар прочтений для каждого образца), после чего отбирали
прочтения со стороны HindIII-сайта и картировали на куриный геном (galGal4, UCSC).
Учитывая тот факт, что любой из HindIII-концов искомого фрагмента может быть
245
объединен с якорным в процессе лигирования, мы суммировали число прочтений,
картированных независимо на оба конца HindIII-фрагментов, и рассматривали эту сумму
как параметр, отвечающий вероятности лигирования данного HindIII-фрагмента с
якорным. Прочтения со стороны DpnII-сайта не включали в анализ по той причине, что
некоторые
фрагменты,
детектированные
со
стороны
DpnII-сайта,
отражают
неспецифические продукты вторичного лигирования. Последующий анализ проводили,
как описано ранее (Tolhuis et al., 2011). Кластеры взаимодействующих фрагментов были
определены с использованием алгоритма «скользящего окна» (Tolhuis et al., 2011) (размер
окна – 3-200 HindIII-рестрикционных фрагментов) и путем бинирования генома на
отрезки длиной 100 т.п.н. (см. главу «Материалы и методы», II.8.5).
На рис. 52А,Б представлено распределение «сырого» 4С-сигнала вдоль хромосомы
14 (на которой расположен якорный фрагмент) и P-значения, подсчитанные, как описано в
главе «Материалы и методы» (II.8.5). Распределение P-значений представлено в форме
доменограмм (рис. 52В). Видно, что профили распределения 4С-сигналов схожи для двух
биологических реплик и различаются для двух клеточных линий, которые мы
использовали (дендрограммы показаны справа от графиков распределения «сырого» 4Ссигнала на рис. 52А). С учетом сходства биологических реплик (коэффициенты
корреляции Пирсона равны 0.878 для клеток DT40 и 0.978 – для клеток HD3) прочтения,
полученные в двух параллельных экспериментах, были объединены для последующего
анализа.
246
247
III.3.1.3 Взаимодействие якорного фрагмента с удаленными участками той же
хромосомы и участками других хромосом
В результате секвенирования было идентифицировано ~15×106 химерных продуктов
лигирования для каждого образца. На рис. 53А представлено суммарное число и доля
прочтений, картированных на хромосому 14 (хромосома, несущая якорный фрагмент) и
другие хромосомы. Примечательно, что налицо существенное различие в распределении
прочтений между хромосомой 14 и другими хромосомами для клеток DT40 и HD3. В
случае клеток DT40 только около 14% всех прочтений картировалось на хромосому 14,
тогда как 86% прочтений распределялось без особых предпочтений между остальными
хромосомами. Среднее число прочтений, приходящееся на 1 т.п.н., сходно для коротких и
длинных хромосом (рис. 53Б). Напротив, для клеток HD3 около 63% всех прочтений
картировалось на хромосому 14. Более того, оставшиеся прочтения (37%) распределялись
неравномерно между другими хромосомами, с предпочтением к маленьким хромосомам.
Этот результат, вероятно, отражает более компактную организацию этих хромосом в
эритроидных клетках и более выраженную сегрегацию коротких и длинных хромосом в
ядерном пространстве.
Рис. 52. Распределение 4С-сигнала, CpG-островков и участков связывания CTCF вдоль хромосомы 14
кур: (А) «Сырой» 4С-сигнал, полученный в экспериментах с якорным фрагментом «NPRL3», выполненных
на клетках DT40 (культивируемые лимфоидные) и HD3 (культивируемые эритроидные). По оси X отмечены
координаты хромосомы 14 (млн.п.н.). По оси Y отложены количества прочтений, картированные на концы
HindIII-фрагментов куриного генома сборки galGal4, как описано в главе «Материалы и методы» (II.8.5).
Положение якорного фрагмента обозначено белой вертикальной линией и отмечено значком якоря.
Представлены результаты для двух биологических реплик; дендрограммы справа показывают степень
сходства биологических реплик и величину различия между клетками HD3 и DT40. (Б) То же, что и (А), но
представлены P-значения, отражающие наиболее значительное превышение сигнала над фоном в каждой
геномной позиции вдоль хромосомы 14 (см. «Материалы и методы», раздел II.8.5). По оси Y приведен –log10
наиболее значимого P-значения. (В) Доменограммы (Splinter et al., 2012), отражающие распределение 4Ссигнала вдоль хромосомы 14 для клеток HD3 и DT40. Интенсивность 4С-сигнала (доля рестрикционных
фрагментов с ненулевым покрытием) в маленьких окнах вариабильной длины (3-200 HindIIIрестрикционных фрагментов) сравнивали с интенсивностью сигнала в большом фоновом окне (300 HindIIIрестрикционных фрагментов). Цвет каждого пикселя отражает значимость отличия – от черного
незначимого до желтого, наиболее значимого; по оси Х показана геномная координата и по оси Y – размер
вариабильного окна (чем больше значение, тем больше размер окна). (Г) Распределение участков
связывания белка CTCF вдоль хромосомы 14 по данным проведенного нами ChIPseq-анализа. (Д)
Распределение аннотированных CpG-островков вдоль хромосомы 14.
248
III.3.1.4 Взаимодействие между CpG-островками
Нами проанализированы возможные корреляции между частотами взаимодействия
якорного фрагмента с удаленными областями генома и наличием в этих областях
функционально значимых геномных мотивов. Анализу были подвергнуты такие
параметры, как GC-состав, плотность генов, наличие CpG-островков и сайтов связывания
общих и тканеспецифичных транскрипционных факторов. Наиболее значительная
корреляция была обнаружена между уровнем 4С-сигнала и плотностью CpG-островков
(рис. 54). Эта корреляция была видна особенно отчетливо для всей совокупности
хромосом (рис. 54А) и для всех хромосом за исключением 14-й (рис. 54Б). Хотя
корреляция просматривается и для хромосомы 14 (рис. 54В), разброс значений в данном
случае достаточно высок, вероятно, вследствие относительно небольшого числа геномных
сегментов, на которые разбивается при анализе небольшая 14-я хромосома. Следует
отметить, что положительные корреляции между уровнем 4С-сигнала и плотностью CpGостровков наблюдались для обоих клеточных типов (рис. 54). Принимая во внимание, что
якорный фрагмент содержал CpG-островок, мы пришли к заключению, что существует
тенденция к кластеризации CpG-островков, расположенных как на одной, так и на разных
хромосомах. В соответствии с этим выводом мы обнаружили положительную корреляцию
интенсивности
4С-сигнала
с
присутствием
GC-богатых
мотивов
связывания
транскрипционного фактора Sp1, которые часто локализуются в пределах CpG-островков
(рис. 55А). Эта тенденция была выявлена и в клетках DT40, и в клетках HD3 (рис. 55А).
Мы также проанализировали корреляцию между интенсивностью 4С-сигнала и
присутствием мотивов связывания белка CTCF. Известно, что белок CTCF принимает
участие в установлении контактов между удаленными элементами генома (PhillipsCremins et al., 2013; Splinter et al., 2006; Van Bortle and Corces, 2012a). В данном случае мы
также выявили положительную корреляцию (рис. 55Б). Следует, однако, отметить, что
249
Рис. 54. Корреляция между 4С-сигналом и плотностью CpG-островков для якорного фрагмента
«NPRL3». Представлены диаграммы рассеяния (скаттер-плоты) и диаграммы размаха (бокс-плоты). Точки
на скаттер-плотах представляют собой неперекрывающиеся интервалы длиной 100 т.п.н. (см. раздел II.8.5).
Анализ проведен для всех хромосом (А), всех хромосом за исключением хромосомы 14 (Б), либо только
хромосомы 14 (В). Область, окружающая якорный фрагмент (Хр14: 11500000-12800000), не взята в анализ.
Приведены линии линейной регрессии и доверительные интервалы. Точки, в которых 4С-сигнал был выше
2000 прочтений на интервал для всех хромосом и выше 10000 прочтений на интервал для хромосомы 14,
исключены из анализа. Для построения бокс-плотов точки были разделены на 5 групп равного размера в
соответствии со значением по оси Х.
мотивы связывания CTCF слегка различаются в клетках различного происхождения
(Essien et al., 2009; Kim et al., 2007b; Nakahashi et al., 2013). Поэтому мы провели
картирование истинных сайтов связывания белка CTCF в клетках DT40 и HD3 с
использованием метода ChIP-seq. Карта низкого разрешения участков связывания CTCF
на хромосоме 14 представлена на рис. 52Г. Результаты
продемонстрировали
хорошую
корреляцию
между
анализа (рис.
позициями
55В)
экспериментально
определенных сайтов связывания CTCF и уровнем 4С-сигнала.
250
Рис. 55. Корреляция между 4С-сигналом и плотностью различных функционально значимых мотивов
генома для якорного фрагмента «NPRL3». Представлены диаграммы рассеяния (скаттер-плоты) и
диаграммы размаха (бокс-плоты), показывающие зависимость между 4С-сигналом и плотностью мотивов
связывания Sp1 (А), мотивов связывания CTCF (Б), участков связывания CTCF, картированных с помощью
процедуры ChIP-seq (В), мотивов связывания NF-E2 (Г), мотивов связывания GATA1 (Д) и мотивов G4квадруплексов (Е). Все обозначения как на рис. 54.
251
К нашему удивлению, в эритроидных клетках (HD3) была обнаружена
отрицательная корреляция 4С-сигнала с позициями предсказанных сайтов связывания
эритроидспецифичных транскрипционных факторов (NF-E2 и GATA1). В данном аспекте
эритроидные клетки не отличались от лимфоидных клеток (рис. 55 Г,Д). Мы
предположили, что наблюдаемые положительные и отрицательные корреляции между 4Ссигналом и плотностью мотивов связывания различных транскрипционных факторов
могут попросту отражать различия в GC-составе этих мотивов. Для проверки этого
предположения
мы
транскрипционных
провели
факторов
пермутационный
(случайное
анализ
перемешивание
мотивов
букв
связывания
консенсусной
последовательности). Этот анализ был выполнен только для клеток HD3, потому что в
этих клетках корреляции более выражены (рис. 54 и 55). Его результаты согласуются с
нашим предположением (рис. 56, якорный фрагмент «NPRL3»). Действительно,
интенсивность 4С-сигнала хорошо коррелирует с GC-составом. Однако корреляция 4Ссигнала с содержанием CpG-островков оказалась более сильной. Кроме того,
наблюдаемые антикорреляции 4С-сигнала с плотностью мотивов NF-E2 и GATA1,
уменьшались в ответ на «шаффлинг» (перемешивание) мотива.
Особо отметим наличие положительной корреляции между 4С-сигналом и
присутствием мотивов так называемых G-квадруплексов (рис. 55Е и рис.56). Gквадруплексы представляют собой последовательности, обогащенные гуанином и
способные образовывать особые пространственные структуры из четырех цепей.
Предполагается, что G-квадруплексы являются важными элементами участков начала
репликации в клетках эукариот (Besnard et al., 2012; Cayrou et al., 2011). Таким образом,
пространственная кластеризация CpG-островков может быть необходима как для
транскрипции, так и для репликации ДНК.
252
Рис. 56. Тепловая карта, отражающая корреляцию между плотностью различных фукциональнозначимых мотивов (ряды) и 4С-сигналом для различных якорных фрагментов (колонки).
Представлены данные для клеток HD3. Цвет показывает степень корреляции: черный – отсутствие
корреляции, зеленый и красный – положительная и отрицательная корреляции, соответственно.
Гистограмма в правом верхнем углу показывает распределение значений корреляции, представленных на
тепловой карте. В некоторых рядах представлены корреляции с плотностью мотивов, в которых позиции
нуклеотидов были перемешаны случайным образом (пермутационный анализ).
III.3.1.5 Пространственная сегрегация активных и неактивных участков генома
Для проверки правильности выводов, сделанных на основании экспериментов с «якорем»
на промоторе гена NPRL3, мы провели дополнительные эксперименты с несколькими
якорными фрагментами с использованием в качестве модели клеток HD3. В качестве
якорных были использованы фрагменты хромосомы 14, несущие CpG-островки генов
домашнего хозяйства TSR3, TRAP1 и PPL и в основном эксперименте демонстрирующие
253
взаимодействие с промотором гена NPRL3 (рис. 57, якорные фрагменты TSR3, TRAP1 и
PPL). Четвертый «якорь» (GENE-Des) был размещен в обедненном генами, неактивном
участке хромосомы 14, не взаимодействующем с промотором гена NPRL3. Пятый «якорь»
был снова помещен на промотор гена NPRL3 с тем, чтобы сравнить новые данные с
данными, описанными выше (рис. 57, якорный фрагмент NPRL3). Было проведено два
Рис. 57. Распределение 4С-сигнала вдоль хромосомы 14 для якорных фрагментов, несущих CpGостровки (NPRL3, TSR3, TRAP1, PPL), и якорного фрагмента из области, обедненной генами и CpGостровками (GENE-Des). Представлены результаты экспериментов, выполненных на клетках HD3.
Графики распределения 4С-сигнала аналогичны представленным на рис. 52А, с той разницей, что
представлен сглаженный сигнал. Сглаживание проведено с использованием алгоритма скользящего окна
(длина окна 200 т.п.н.). Все обозначения как на рис. 52.
254
независимых биологических эксперимента и для каждой реплики было идентифицировано
~10 миллионов химерных продуктов лигирования, отражающих «интерактом» выбранных
якорных фрагментов. Сходство биологических реплик было достаточно высоким
(коэффициенты корреляции Пирсона оказались > 0.97 для якорных фрагментов TSR3,
GENE-Des, NPRL3 и PPL и 0.64 для якорного фрагмента TRAP1). Однако с учетом
сравнительно невысокого коэффициента для якорного фрагмента TRAP1, два массива
данных были проанализированы по отдельности. По умолчанию, ниже будут приведены
данные по первой реплике (депонированы в базе данных GEO под номером GSM1255519).
Профили распределения 4С-сигналов по
хромосоме 14 для каждого из пяти якорных
фрагментов представлены на рис. 57. По
Таблица 16. Сравнение профилей 4Ссигналов, полученных для якорных
фрагментов
«GENE-Des»,
«TSR3»,
«TRAP1» и «PPL», с профилями 4Ссигнала, полученными для якорного
фрагмента «NPRL3».
позиции пиков и провалов профили, полученные
для фрагментов TSR3, TRAP1 и PPL, сравнимы с
таковым
для
фрагмента
NPRL3.
Якорный
фрагмент, локализованный в «генной пустыне»
(GENE-Des), также демонстрирует ряд удаленных
взаимодействий вдоль хромосомы 14. Однако
профиль
этих
взаимодействий
существенно
отличается от таковых, наблюдающихся для
якорных фрагментов, несущих CpG-островки
NPRL3 (1)
NPRL3 (2)
GENE-Des (1)
-0.063
-0.016
GENE-Des (2)
-0.141
-0.094
TSR3 (1)
0.335
0.288
TSR3 (2)
0.328
0.289
NPRL3 (1)
1
0.976
NPRL3 (2)
0.976
1
TRAP1 (1)
0.631
0.570
TRAP1 (2)
0.568
0.490
PPL (1)
0.440
0.384
PPL (2)
0.481
0.399
Представлены коэффициенты корреляции
Пирсона. Результаты двух независимых
биологических
экспериментов
были
обработаны независимо.
(рис. 57). Коэффициент корреляции Пирсона 4С-сигнала фрагмента NPRL3 (в двух
биологических повторах) с 4С-сигналами фрагментов TSR3, TRAP1 и PPL (в двух
биологических повторах) составляет ≥ 0.288. В то же время, профиль 4С-сигнала
фрагмента GENE-Des не обнаруживает сходства с профилем фрагмента NPRL3
(коэффициенты корреляции Пирсона меньше 0) (таблица 16).
255
Как и в случае якорного фрагмента NPRL3, якорные фрагменты TSR3, TRAP1 и
PPL продемонстрировали наличие предпочтительных удаленных взаимодействий с CpGостровками, участками связывания CTСF, предсказанными участками связывания Sp1, но
не NF-E2 или GATA1 (рис. 56, 58 - 60). Для якорного фрагмента GENE-Des таких
корреляций выявлено не было (рис. 56, 61).
III.3.1.6 Распределение 4С-сигнала в окрестностях промоторов и CpG-островков
CpG-островки часто содержат активные промоторы (Deaton and Bird, 2011; Kundu and Rao,
1999). Может так случиться, что кластеризация CpG-островков, выявленная в нашем
анализе, обусловлена исключительно присутствием активных промоторов. Альтернативно
этому, кластеризация CpG-островков может происходить независимо от присутствия
активных промоторов. В попытке разрешить этот вопрос мы проанализировали
распределение 4C-сигнала в окрестностях CpG-островков и промоторов, используя 4Сданные, полученные с якорным фрагментом NPRL3 в экспериментах с клетками HD3.
Сначала мы построили профили 4С-сигналов для каждого CpG-островка, найденного в
геноме курицы, и его окрестных зон (± 20 т.п.н.), затем наложили профили друг на друга и
усреднили. Полученная 4С-кривая имела четкий максимум на CpG-островке (рис. 62А),
подтверждая таким образом результаты корреляционного анализа. Напротив, на участках
между CpG-островками был зафиксирован спад 4C-кривой (рис. 62Б). Далее мы провели
аналогичный анализ точек инициации транскрипции (transcriptionstart site, TSS) и
обнаружили максимум, несколько выше TSS (т.е. на предполагаемом промоторе), хотя в
этом случае абсолютный уровень 4С-сигнала был ниже (рис. 62В). Для интерпретации
этих данных следует учесть, что многие промоторы колокализуются с CpG-островками.
256
Рис. 58. Корреляция между 4С-сигналом и плотностью различных функционально значимых мотивов
генома для якорного фрагмента «TSR3». Представлены диаграммы рассеяния (скаттер-плоты) и
диаграммы размаха (бокс-плоты), показывающие зависимость между 4С-сигналом и плотностью СpGостровков (А), мотивов связывания Sp1 (Б), мотивов связывания CTCF (В), участков связывания CTCF,
картированных с помощью процедуры ChIP-seq (Г), мотивов связывания NF-E2 (Д), мотивов связывания
GATA1 (Е) и мотивов G4-квадруплексов (Ж). Данные для клеток HD3. Все обозначения как на рис. 54.
257
Рис. 59. Корреляция между 4С-сигналом и плотностью различных функционально значимых мотивов
генома для якорного фрагмента «TRAP1». Представлены диаграммы рассеяния (скаттер-плоты) и
диаграммы размаха (бокс-плоты), показывающие зависимость между 4С-сигналом и плотностью СpGостровков (А), мотивов связывания Sp1 (Б), мотивов связывания CTCF (В), участков связывания CTCF,
картированных с помощью процедуры ChIP-seq (Г), мотивов связывания NF-E2 (Д), мотивов связывания
GATA1 (Е) и мотивов G4-квадруплексов (Ж). Данные для клеток HD3. Все обозначения как на рис. 54.
258
Рис. 60. Корреляция между 4С-сигналом и плотностью различных функционально значимых мотивов
генома для якорного фрагмента «PPL». Представлены диаграммы рассеяния (скаттер-плоты) и
диаграммы размаха (бокс-плоты), показывающие зависимость между 4С-сигналом и плотностью СpGостровков (А), мотивов связывания Sp1 (Б), мотивов связывания CTCF (В), участков связывания CTCF,
картированных с помощью процедуры ChIP-seq (Г), мотивов связывания NF-E2 (Д), мотивов связывания
GATA1 (Е) и мотивов G4-квадруплексов (Ж). Данные для клеток HD3. Все обозначения как на рис. 54.
259
Рис. 61. Корреляция между 4С-сигналом и плотностью различных функционально значимых мотивов
генома для якорного фрагмента «GENE-Des». Представлены диаграммы рассеяния (скаттер-плоты) и
диаграммы размаха (бокс-плоты), показывающие зависимость между 4С-сигналом и плотностью СpGостровков (А), мотивов связывания Sp1 (Б), мотивов связывания CTCF (В), участков связывания CTCF,
картированных с помощью процедуры ChIP-seq (Г), мотивов связывания NF-E2 (Д), мотивов связывания
GATA1 (Е) и мотивов G4-квадруплексов (Ж). Данные для клеток HD3. Все обозначения как на рис. 54.
260
261
Это верно для промотора гена NPRL3, использованного в качестве «якоря» в настоящем
анализе. Мы подсчитали, что из 16950 TSS, идентифицированных в геноме курицы, 5650
лежат в CpG-островках (рис. 62Д), и 4911 из 19309 CpG-островков, представленных в
геноме курицы, содержат TSS (рис. 62Е). Чтобы выяснить, сами ли CpG-островки или
расположенные в них промоторы вносят больший вклад в наблюдаемый феномен
кластеризации CpG-островков, мы по отдельности проанализировали промоторы,
ассоциированные с CpG-островками, и промоторы, не демонстрирующие такой
ассоциации. Все TSS были разделены на 5 групп в соответствии с расстоянием до
ближайшего CpG-островка, который мог быть найден выше или ниже этого TSS. Далее
усредненные профили 4С-сигналов были рассмотрены отдельно для каждой из групп. Как
видно из рис. 62Ж, TSS, колокализующиеся или расположенные вблизи с CpGостровками, показали более высокую частоту взаимодействия с якорным рестриктным
фрагментом. Более того, на 4С-кривых наблюдался пик в области предполагаемого
промотора (до 5 т.п.н. выше TSS) (рис. 62Ж, красная, желтая и зеленая кривые). TSS,
локализованные вдали от CpG-островков, показали меньшую частоту взаимодействия, без
максимума на предполагаемом промоторе (рис. 62Ж, синяя и фиолетовая кривые). Далее
мы таким же образом проанализировали CpG-островки, сгруппировав их по расстоянию
Рис. 62. Распределение 4С-сигнала в окрестностях промоторов и CpG-островков для якорного
фрагмента «NPRL3». Представлены данные для клеток HD3. (А, В, Г) Профиль усредненного 4С-сигнала
для 40 последовательных интервалов длиной 1 т.п.н., окружающих функционально значимые участки
генома: СpG-островки (А), участки инициации транскрипции (TSS) (В) или участки связывания CTCF (Г).
По оси X представлены координаты относительно выбранного функционально значимого участка (в т.п.н.),
по оси Y – усредненный 4С-сигнал. Тонкими полупрозрачными линиями показаны профили усредненного
4С-сигнала для 10 псевдовыборок, полученных с помощью процедуры бутстрэппинга (см. раздел II.8.5). (Б)
Профиль усредненного 4С-сигнала для участков между CpG-островками. По оси Х представлена
относительная позиция между последовательно расположенными CpG-островками. (Д) Доля участков
инициации транскрипции, перекрывающихся CpG-островком, и (Е) доля CpG-островков, перекрывающих
участок инициации транскрипции. (Ж, З) Графики, аналогичные представленным в секциях (А, В),
демонстрирующие усредненный 4С-сигнал в окрестностях участков инициации транскрипции, разделенных
на группы по расстоянию до ближайшего CpG-островка (Ж), и в окрестностях CpG-островков, разделенных
на группы по расстоянию до ближайшего участка инициации транскрипции (З). Использованные интервалы
расстояний приведены под графиками.
262
Рис. 63. Распределение 4С-сигнала в окрестностях промоторов и CpG-островков для якорного
фрагмента «GENE-Des». Графики, аналогичные представленным на рис. 62А-В, построены по результатам
экспериментов с якорным фрагментом «GENE-Des», выполненных на клетках HD3. Все обозначения как на
рис. 62.
до ближайшего промотора. В данном случае, зависимость 4С-сигнала от расстояния
между CpG-островком и промотором была менее выражена. CpG-островки, содержащие
промотор, и CpG-островки, расположенные на расстоянии 1.5-10 т.п.н. от промотора,
демонстрировали сравнимые уровни 4С-сигнала, с максимумом на CpG-островке
(рис. 62 З, красная, желтая и зеленая кривые). Примечательно, что даже для удаленных
CpG-островков (˃ 25 т.п.н. от ближайшего промотора) детектировался пик на 4С-кривой
(рис. 62З, фиолетовая кривая). В совокупности, эти данные свидетельствуют о том, что
кластеризация CpG-островков в ядерном пространстве не обязательно связана с
присутствием в составе этих CpG-островков активных промоторов. CpG-островки, не
содержащие промоторов, участвуют в кластеризации наряду с теми, которые содержат
промоторы в своем составе.
263
Как было отмечено выше, кластеризация CpG-сотровков, по крайней мере отчасти,
может опосредоваться белком CTCF. Действительно, в окрестностях участков связывания
CTCF наблюдается небольшой рост 4С-сигнала (рис. 62 Г).
Наблюдения, сделанные при анализе 4С-данных для якорного фрагмента NPRL3,
были подтверждены в аналогичном анализе, проведенном для якорных фрагментов TSR3,
TRAP1 и PPL (данные не показаны). Однако анализ 4С-данных, полученных для якорного
фрагмента GENE-Des, выявил противоположные тенденции. В данном случае на CpGостровках и промоторах наблюдался спад 4С-кривой (рис. 63 А,В), а на участках между
CpG-островками – подъем (рис.63Б).
Итак, подводя итог проведенному анализу, представляется возможным заключить,
что
кластеризация
CpG-островков
является
важным
фактором,
определяющим
пространственную организацию интерфазных хромосом.
264
ГЛАВА IV.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
IV.1 ПРОСТРАНСТВЕННАЯ
ОРГАНИЗАЦИЯ
ДОМЕНА
БЕТА-
ГЛОБИНОВЫХ ГЕНОВ КУР В ЭРИТРОИДНЫХ КЛЕТКАХ НА
РАЗНЫХ СТАДИЯХ ЭМБРИОНАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ
Согласно современным представлениям, для реализации активирующего действия
энхансера необходимо его сближение с подконтрольным промотором (de Laat and
Grosveld, 2003; West and Fraser, 2005; Wijgerde et al., 1995; Zhu et al., 2007).
Предполагается, что промоторы и энхансеры объединяются в общий ДНК-белковый
комплекс – активаторный хроматиновый блок. Один или несколько энхансеров,
представленных в активаторном хроматиновом блоке, могут контролировать активность
одного или нескольких промоторов, привлекающихся в этот активаторный блок (West and
Fraser, 2005; Wijgerde et al., 1995; Zhu et al., 2007). Было показано, что переключение
экспрессии бета-глобиновых генов мыши в ходе развития коррелирует с реконфигурацией
активаторного хроматинового блока (Palstra et al., 2003). Целью нашего исследования на
этом этапе была проверка, сопровождается ли переключение экспрессии бета-глобиновых
генов кур пространственной реконфигурацией соответствующего геномного домена.
Анализ именно домена бета-глобиновых генов кур казался нам интересным по двум
причинам. Во-первых, домен бета-глобиновых генов кур представляет собой наиболее
характерный пример так называемых доменов закрытого типа (Razin et al., 2003),
поскольку
фланкирующие
домен
инсуляторы
точно
ограничивают
область
предпочтительной чувствительности к ДНКазе I в эритроидных клетках (Kukushkin et al.,
1988), что не характерно для доменов бета-глобиновых генов мыши и человека (Bulger et
al., 2003; Schubeler et al., 2000). Во-вторых, в домене бета-глобиновых генов кур
265
присутствует внутренний энхансерный элемент в дополнение к области контроля локуса
(Choi and Engel, 1986). В доменах бета-глобиновых генов человека и мыши таких
элементов не обнаружено. Таким образом, есть основания полагать, что регуляция
экспрессии бета-глобиновых генов кур отличается от регуляции экспрессии этих генов у
млекопитающих.
Результаты
нашего
исследования
показали,
что
в
эритроидных
клетках
осуществляется взаимодействие между 5’- и 3’-концевыми инсуляторами домена бетаглобиновых генов кур. В результате домен должен быть организован в замкнутую петлю
хроматина. Хотя мы не исследовали механизм формирования этой петли, весьма
вероятно, что в этот процесс вовлечен белок CTCF, поскольку оба инсулятора содержат
CTCF-связывающие участки (Bell et al., 1999; Saitoh et al., 2000) и ряд работ указывает на
важную роль белка CTCF как медиатора взаимодействия удаленных элементов генома
(Kurukuti et al., 2006; Splinter et al., 2006; Zuin et al., 2014). Также вероятно, что концы
петли хроматина, включающей домен бета-глобиновых генов, фиксированы на ядерном
матриксе, так как в предыдущих исследованиях было показано, что 5’-инсулятор домена
бета-глобиновых генов кур взаимодействует с ядерным матриксом (Yusufzai and
Felsenfeld, 2004). Подобный тип пространственной организации может объяснять тот
факт, что ограниченный инсуляторами функциональный домен, включающий область
контроля локуса и, собственно, кластер глобиновых генов, практически точно
колокализуется с эритроидспецифичным доменом предпочтительной чувствительности к
ДНКазе I и эритроидспецифичным доменом гиперацетилирования гистонов (Hebbes et al.,
1994). В согласии с этой моделью, мы не обнаружили взаимодействия между концевыми
инсуляторами домена бета-глобиновых генов кур в неэритроидных клетках, в которых
домен не обладает предпочтительной чувствительностью к ДНКазе I (Wood and Felsenfeld,
1982). Следует отметить, что инсуляторы, фланкирующие домены бета-глобиновых генов
266
в геноме человека и мыши, также взаимодействуют друг с другом (Palstra et al., 2003;
Splinter et al., 2006; Tolhuis et al., 2002), однако в данном случае петля хроматина,
формирующаяся
за
счет
данного
взаимодействия,
не
соответствует
области
предпочтительной чувствительности к ДНКазе I (Bulger et al., 2003).
Наиболее интересной особенностью пространственной организации домена бетаглобиновых генов кур является, с нашей точки зрения, отсутствие взаимодействия
эмбрионального бета-глобинового гена ε с областью контроля локуса (LCR) и /энхансером. Это не исключает возможности, что /-энхансер, локализованный на
небольшом расстоянии от промотора гена ε, активирует этот промотор посредством
некоторого механизма «трекинга». Однако возможность активации гена ε областью
контроля локуса маловероятна. В данной связи примечательно, что в домене альфаглобиновых генов кур ген эмбрионального альфа-глобина π также не взаимодействует ни
с одним удаленным регуляторным элементом домена (Ioudinkova et al., 2011). Таким
образом, создается впечатление, что у курицы раннеэмбриональные глобиновые гены и
альфа-, и бета-типов обладают автономной регуляторной системой.
При изучении состава активаторного хроматинового блока домена бетаглобиновых генов в 3- и 9-дневных эритроцитах куриных эмбрионов мы обнаружили
несколько неожиданных особенностей. Прежде всего то, что участок DHS2 области
контроля локуса демонстрирует значительную частоту взаимодействия с промотором гена
βA уже в 3-дневных эритроцитах, для которых уровень транскрипции этого гена очень
низкий. Однако некоторый уровень транскрипции все-таки детектируется. Правда, ранее
сообщалось, что ген βA транскрибируется на некотором уровне даже в 2-дневных
эритроидных клетках (Alev et al., 2008). Следовательно, взаимодействие гена βA с LCR в 3дневных эритроцитах может иметь функциональное значение. С другой стороны, мы
обнаружили сильное взаимодействие между промоторами генов ρ и βA, особенно ярко
267
выраженное в 3-дневных эритроцитах, в которых ген βA транскрибируется на низком
уровне. Значение этого взаимодействия в настоящее время не ясно. Тот факт, что данное
взаимодействие детектируется также в клетках неэритроидного происхождения, позволяет
предположить, что оно может отражать некоторые характерные особенности укладки
домена бета-глобиновых генов в составе хромосомы, не имеющие прямого отношения к
сборке активаторного хроматинового блока и регуляции транскрипции внутри домена.
Любопытно, что несмотря на указанное взаимодействие между промоторами генов ρ и βA,
уровень взаимодействия промоторов этих генов с DHS2 значительно различается в
эритроидных клетках 3-го дня развития (там промотор гена ρ предпочтительно
взаимодействует с DHS2) и 9-го дня развития (здесь промотор гена βA предпочтительно
взаимодействует с DHS2). Таким образом, установлено, что тонкая структура
активаторного хроматинового блока домена бета-глобиновых генов различается для 3- и
9-дневных эритроцитов. Мы предполагаем, что на 3-ем дне эмбрионального развития
промотор гена  непосредственно взаимодействует с LCR, тогда как промотор гена βA
пассивно привлекается к активаторному блоку через взаимодействие с геном ρ. На 9-ом
дне развития ситуация оказывается зеркально противоположной. В итоге, несмотря на
взаимодействие друг с другом, гены ρ и βA обнаруживают специфичную по отношению к
стадии развития ассоциацию с LCR, коррелирующую с экспрессионным статусом этих
генов. Еще в большей степени такую специфичность демонстрирует фетальный бетаглобиновый ген βH, который не взаимодействует с LCR на 3-ем дне эмбрионального
развития и начинает взаимодействовать с LCR на 9-ом дне, когда программа
транскрипции глобиновых генов переключается с эмбрионального на взрослый тип.
Наконец, отметим, что на обеих стадиях развития наблюдается взаимодействие между
промоторами генов βA и βH. Принимая во внимание тот факт, что якорные фрагменты,
несущие DHS2 и промотор гена ρ, не взаимодействуют с геном βH, но взаимодействуют с
268
геном βA в 3-дневных эритроцитах, следует заключить, что на данной стадии развития
взаимодействие промоторов двух взрослых бета-глобиновых генов осуществляется за
пределами активаторного хроматинового блока, тогда как привлечение промотора гена βA
к активаторному блоку происходит вне связи с геном βH за счет взаимодействия с геном ρ.
Две альтернативные хроматиновые конфигурации домена бета-глобиновых генов,
характерные для эритроидных клеток 3-х дневных куриных эмбрионов, показаны на рис.
64. Эти конфигурации могут реализовываться в разных клетках, представленных в
популяции, или на разных копиях гомологичных хромосом в одних и тех же клетках.
Рис. 64. Пространственная конфигурация домена бета-глобиновых генов в эритроидных клетках 3- и
9-дневных эмбрионов кур и эмбриональных фибробластах. Окружностями обозначены зоны контакта
регуляторных элементов (активаторный хроматиновый блок). Голубые эллипсы символизируют белковые
комплексы на концевых инсуляторах домена.
269
В эритроцитах 9-го дня эмбрионального развития уровень взаимодействия
большинства регуляторных элементов домена бета-глобиновых генов повышается при
сравнении с эритроцитами 3-го дня развития. Это наблюдение может отражать более
компактную
организацию
всего
бета-глобинового
домена.
Как
показали
наши
исследования, эритроидные клетки 9-го дня развития резко отличаются от эритроидных
клеток 3-го дня по суммарному количеству РНК (включая рРНК), представленному в
клетке
(данные
не
показаны).
Очевидно,
что
9-дневные
эритроциты
менее
метаболитически активны по сравнению с 3-дневными эритроцитами. Другими словами,
они обладают определенными свойствами зрелых куриных эритроцитов, ядра которых не
активны. В то же время, глобиновые гены все еще транскрибируются в большинстве 9дневных эритроцитов (Iarovaia et al., 2009). Следовательно, предположение, что более
компактная организация домена бета-глобиновых генов в 9-дневных эритроцитах
отражает
лишь
присутствие
значительного
количества
зрелых
эритроцитов
в
анализируемой клеточной популяции, было бы некорректным. Скорее всего, домен бетаглобиновых генов испытывает некоторое давление со стороны всей хромосомной
территории, которая постепенно принимает более компактную конфигурацию в ходе
созревания эритроидных клеток. В то же время, этот домен остается активным и обладает
некоторыми свойствами активных хроматиновых доменов, в частности, обладает
предпочтительной чувствительностью к ДНКазе I, даже в компактных ядрах зрелых
эритроцитов
курицы
(Goldsmith,
1981).
Ключевую
роль
здесь
может
играть
пространственная изоляция домена от окружающего хроматина посредством его
размещения в отдельной хроматиновой петле, образованной посредством взаимодействия
концевых инсуляторов домена.
270
IV.2 РЕГУЛЯЦИЯ ТРАНСКРИПЦИИ АЛЬФА-ГЛОБИНОВЫХ ГЕНОВ И
ГЕНА
TMEM8
ПОСРЕДСТВОМ
СБОРКИ
АЛЬТЕРНАТИВНЫХ
АКТИВАТОРНЫХ ХРОМАТИНОВЫХ БЛОКОВ
Наряду
с
доменами
бета-глобиновых
генов,
домены
альфа-глобиновых
генов
позвоночных животных в течение многих лет служат моделью для изучения регуляции
транскрипции высших эукариот (de Laat et al., 2008; Guerrero et al., 2007; Higgs et al.,
2008). За последние 30 лет модели, описывающие регуляцию экспрессии глобиновых
генов, становились все более и более сложными. Однако в одном аспекте представления о
доменах глобиновых генов оставались неизменными: общепринятым считалось, что эти
эритроидспецифичные домены содержат только гены, кодирующие глобиновые цепи. В
нашей лаборатории было показано, что у кур домен альфа-глобиновых генов включает
также ген TMEM8 – эритроидспецифичный ген, индуцирующийся в ходе терминальной
эритроидной дифференцировки, который не кодирует глобиновую цепь. Вероятно, ген
TMEM8 оказался в составе домена альфа-глобиновых генов в результате инверсии
относительно короткого сегмента хромосомы, вследствие которой этот ген оказался
поблизости с кластером альфа-глобиновых генов (см. рис. 17). В «прототипном» домене
альфа-глобиновых
генов,
выведенном
путем
сопоставления
нуклеотидных
последовательностей различных видов, место гена TMEM8 занято геном LUC7L (Hughes et
al., 2005), который расположен сразу за кластером альфа-глобиновых генов в геноме
большинства современных животных (Tufarelli et al., 2001; Tufarelli et al., 2004; Vyas,
1995). При этом ген TMEM8 локализуется достаточно далеко от кластера и не
демонстрирует эритроидной специфичности (Motohashi et al., 2000). А вот в геноме
курицы последовательность генов инвертирована.
271
Мы предположили, что установление соседства с альфа-глобиновыми генами в
результате хромосомной инверсии привело к тому, что ген TMEM8 попал под контроль
регуляторных элементов альфа-глобиновых генов и оказался «втянутым» в сеть
пространственных взаимодействий внутри домена. С использованием техники фиксации
конформации
хромосомы
мы
установили,
что
два
ранее
идентифицированных
регуляторных элемента домена альфа-глобиновых генов кур взаимодействуют с
промотором гена TMEM8 в терминально дифференцированных клетках HD3. Это 3’концевой энхансер домена альфа-глобиновых генов и, до настоящего времени не
охарактеризованный, регуляторный элемент, колокализующийся с эритроидспецифичным
участком гиперчувствительности к ДНКазе I -9DHS (правая конформация на рис. 65).
Примечательно, что данный регуляторный элемент привлекается к промотору гена
TMEM8 еще до начала терминальной эритроидной дифференцировки (центральная
конформация на рис. 65). В дифференцированных клетках HD3 промотор гена TMEM8
взаимодействует также с энхансерным элементом, локализованном в «теле» гена TMEM8.
Неожиданным явилось обнаружение того, что главный регуляторный элемент
домена альфа-глобиновых генов MRE, а также промотор взрослого альфа-глобинового
гена D не взаимодействуют с промотором гена TMEM8. Это означает, что TMEM8 не
привлекается к активаторному хроматиновому блоку альфа-глобиновых генов; для
активации транскрипции гена TMEM8 собирается альтернативный активаторный
хроматиновый комплекс. Активаторные хроматиновые блоки альфа-глобиновых генов и
гена TMEM8 делят два общих элемента (3’-концевой энхансер и -9DHS), тогда как другие
элементы различаются (рис. 65). В этой связи интересно заметить, что ни 3’-концевой
энхансер, ни -9DHS не представлены в числе ранее идентифицированных эволюционно
консервативных последовательностей (Hughes et al., 2005). Иными словами, эти элементы
уникальны для кур. Возможно, определенные свойства регуляторный системы домена
272
альфа-глобиновых генов кур, в особенности наличие 3’-концевого энхансера, сделало
возможным
репрограммирование
гена
TMEM8
и
превращение
его
в
эритроидспецифичный ген.
Рис. 65. Альтернативные активаторные хроматиновые блоки альфа-глобиновых генов (слева) и гена
TMEM8 (справа) в дифференцированных эритроидных клетках кур. Оба блока включают -9DHS и 3’концевой энхансер, тогда как другие «игроки» различны. Схема активаторного хроматинового блока альфаглобиновых генов представлена в соответствии с работой (Gavrilov and Razin, 2008).
Тот факт, что регуляция экспрессии взрослых альфа-глобиновых генов и гена
TMEM8 осуществляется посредством формирования двух альтернативных хроматиновых
блоков, в составе которых имеются общие элементы (3’-концевой энхансер и -9DHS),
представляется чрезвычайно интересным. Альфа-глобиновые гены кур не являются
импринтируемыми. Они не демонстрируют асинхронной репликации, типичной для
импринтируемых генов (Klochkov et al., 2009), и транскрипция обоих аллелей
детектируется с помощью гибридизации in situ (Iarovaia et al., 2001; Iarovaia et al., 2009).
Это предполагает, что на каждой хромосоме -9DHS и энхансер должны перемещаться
(курсировать) между двумя альтернативными хроматиновыми блоками в соответствии с
предложенной ранее «флип-флоп» моделью (Gribnau et al., 1998; Wijgerde et al., 1995),
которая была построена для объяснения способности LCR домена бета-глобиновых генов
активировать транскрипцию нескольких генов, одновременно транскрибирующихся в
273
одной клетке. Хотя данную модель не опровергали, она была практически забыта после
предложения модели активаторного хроматинового блока (de Laat and Grosveld, 2003; de
Laat et al., 2008; Kooren et al., 2007; Patrinos et al., 2004; Tolhuis et al., 2002; Zhou et al.,
2006), поскольку объединением энхансера и нескольких промоторов в составе единого
комплекса более просто объяснить способность энхансера к одновременной активации
нескольких промоторов. На основе полученных нами данных можно предположить, что
две модели не являются взаимоисключающими и что активные хроматиновые блоки
следует рассматривать как динамичные, а не статичные структуры.
IV.3 ПЕРЕСМОТР
КЛЮЧЕВЫХ
КОНФОРМАЦИИ
ЭТАПОВ
ХРОМОСОМЫ
И
ТЕХНИКИ
ФИКСАЦИИ
ПРЕДЛОЖЕНИЕ
НОВОЙ
МОДЕЛИ ПОЗИЦИОНИРОВАНИЯ ГЕНОМНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ В
ЯДРЕ
Принцип
предпочтительного
лигирования
фрагментов
ДНК,
расположенных
в
пространственной близости, составляет основу всех С-методов (de Wit and de Laat, 2012).
Предполагалось,
что
фрагменты
ДНК,
сцепленные
«белковыми
мостиками»,
солюбилизируются из фиксированных формальдегидом ядер после расщепления ДНК
эндонуклеазами рестрикции и экстракции SDS. В разбавленном растворе кросслигирование сцепленных фрагментов должно проходить намного эффективнее, чем
лигирование обособленных, несцепленных фрагментов (Dekker et al., 2002a; Tolhuis et al.,
2002). Основное наблюдение, сделанное в нашем исследовании, состоит в том, что
лигирование близкорасположенных фрагментов ДНК, регистрируемое в экспериментах
как «3С-сигнал», происходит в нерастворимой фракции 3С-материала в составе
фиксированных ядер, которые оказались достаточно устойчивыми, чтобы выдержать
экстракцию
ионным
детергентом.
Прежде
всего,
мы
продемонстрировали,
что
274
значительная доля ДНК не экстрагируется из фиксированных формальдегидом ядер после
расщепления ДНК эндонуклеазами
рестрикции
и
экстракции SDS.
Количество
растворимого материала зависит от степени фрагментации ДНК. Большее количество
ДНК солюбилизируется после обработки сшитых ядер эндонуклеазой рестрикции MboI и
меньше – после обработки HindIII. Эти эндонуклеазы расщепляют ДНК на фрагменты от
~0.02 до ~1.4 т.п.н. и от ~0.15 до ~10 т.п.н., соответственно. Степень солюбилизации
также зависит от природы клеток. В наших экспериментах при одних и тех же условиях из
клеток мозга солюбилизировалось больше ДНК, чем из эритроидных клеток. Важным
представляется нам то, что специфические продукты лигирования образовывались только
в нерастворимой фракции, независимо от доли солюбилизированного материала.
Особенно очевидно это при сравнении результатов анализа частот лигирования в
нерастворимой и растворимой фракциях 3С-материала, полученного из эритроидных
клеток с использованием эндонуклеаз HindIII (солюбилизация ~15% общего количества
ДНК) и MboI (солюбилизация ~40% общего количества ДНК). В обоих случаях
предпочтительное лигирование фрагментов, несущих регуляторные элементы домена
бета-глобиновых генов, наблюдалось только в нерастворимой фракции 3С-материала.
Анализ нерастворимой фракции, полученной в ходе стандартной процедуры 3С,
показал, что ядра, фиксированные формальдегидом, сохраняют свою целостность при
экстракции SDS. Эта обработка вызывает значительную декомпактизацию хроматина,
однако не приводит к радикальному перераспределению хроматиновых доменов и не
нарушает
общей
архитектуры
ядра:
в
таких
ядрах
сохраняются
различные
функциональные компартменты, включая ядрышки, тельца сплайсинга, компоненты
ядерного матрикса и места предпочтительной локализации гетерохроматина. Ранее
сообщалось, что разведение 3С-материала перед стадией лигирования не существенно для
получения характерных профилей 3С-сигналов (Comet et al., 2011), что находится в
275
некотором противоречии с общепринятой схемой 3С-анализа (см. рис. 14А) (Dekker et al.,
2002b; Splinter et al., 2004; Tolhuis et al., 2002). Мы повторили эти эксперименты и пришли
к тем же заключениям (данные не показаны). Эти наблюдения легко объяснить, исходя из
того факта, что лигирование осуществляется в нелизированных ядрах. Однако возникает
вопрос: только ли в нелизированных ядрах могут образовываться специфические
продукты лигирования? Существует две возможности. Первая заключается в том, что
«заморозка» относительно больших, специфически сложенных хромосомальных доменов
внутри ядра может быть существенна для генерации характеристических продуктов
лигирования. Эти домены могут стабилизироваться как за счет случайных сшивок между
расположенными рядом хроматиновыми фибриллами, так и за счет «пришивки» к
нехроматиновым структурам, таким как ядерная ламина, ядерный белковый матрикс,
спеклы сплайсинга и т.д. В данном случае можно ожидать, что механическое разрушение
фиксированных ядер ультразвуком перед стадией лигирования будет препятствовать
возможности генерации специфических продуктов лигирования. Вторая возможность
состоит
в
том,
что
комплексы
регуляторных
элементов,
связанные
через
взаимодействующие белки, фиксируются в ядрах так, как изначально предполагалось
(Dekker et al., 2002b; Splinter et al., 2004; Tolhuis et al., 2002), но не могут
солюбилизироваться вследствие механических препятсвий (таких как окружающая сеть
сшитых
хроматиновых
фибрилл
или
ядерная
ламина,
стабилизированная
формальдегидными сшивками). В этом случае механическое разрушение не должно
препятствовать генерации специфического набора продуктов лигирования. Эти продукты
будут образовываться в разбавленном растворе точно так, как постулируется в
оригинальном протоколе 3С-анализа (Dekker et al., 2002b; Splinter et al., 2004; Tolhuis et al.,
2002). В более ранних работах сообщалось, что ультразвуковая обработка улучшает
солюбилизацию 3С-материала, но не улучшает разрешения 3С-анализа (Comet et al.,
276
2011). В нашей работе мы провели более систематический анализ эффектов
ультразвуковой обработки и сделали два важных наблюдения: (1) хотя ультразвуковая
обработка повышает солюбилизацию 3С-материала, основная масса характеристических
продуктов
лигирования
генерируется
в
нерастворимой
фракции
даже
после
солюбилизации >80% фиксированных фрагментов хроматина (см. рис. 26В); и (2)
солюбилизация фиксированных фрагментов коррелирует с уменьшением общего уровня
3С-сигналов (т.е. сигналов, детектируемых в нефракционированном материале). Оба
наблюдения лучше согласуются с предположением, что специфические продукты
лигирования в процедуре 3С могут образовываться только в нелизированных ядрах (рис.
66).
Рис. 66. К вопросу о переосмыслении процедуры 3С. Стадия рестрикции и лигирования в протоколе 3С
осуществляется в нелизированных ядрах в сети фиксированных хроматиновых фибрилл, внутри которой
фрагменты могут быть не сшиты напрямую. Предположение о том, что предпочтительное лигирование
осуществляется на уровне сшитых ДНК-белковых комплексов, солюбилизированных в раствор (см.
рис.14А) (Dekker et al., 2002a; Splinter et al., 2004), не является верным. Более подробная иллюстрация
механизма предпочтительного лигирования в процедуре 3С представлена на рис. 67.
277
Мы полагаем, что в фиксированных формальдегидом ядрах взаимные позиции
регуляторных элементов, расположенных поблизости друг от друга, сохраняются за счет
сшивок между хроматиновыми фибриллами независимо от природы негистоновых
белков, которые непосредственно взаимодействуют с этими регуляторными элементами
(рис. 67). Стохастические сшивки между расположенными рядом хроматиновыми
фибриллами
будут
«замораживать»
пространственную
конфигурацию
больших
хромосомальных доменов. Относительные позиции различных геномных элементов
внутри этих доменов не изменятся после внесения ограниченного числа двухцепочных
разрывов в ДНК до тех пор, пока каждый из фрагментов будет связан с другими
фрагментами формальдегидными сшивками (т.е. пока он будет оставаться частью сети
сшитых хроматиновых фибрилл). Между тем, концы ДНК будут обладать ограниченной
подвижностью, достаточной для лигирования с другими концами, локализованными в
пространственной близости. В первом приближении можно предположить, что процесс
сшивки хроматиновых фибрилл формальдегидом носит случайный характер. Иногда даже
относительно длинные фрагменты могут избежать пришивки к общей сети, и тогда эти
фрагменты будут солюбилизироваться в ходе экстракции SDS. С уменьшением среднего
размера фрагментов доля тех, которые не сшиты с другими фрагментами, должна
увеличиваться. Это объясняет наблюдающуюся бóльшую степень солюбилизации ДНК
(хроматина) в случае обработки фиксированных ядер частощепящей эндонуклеазой
рестрикции (MboI). Однако взаимные позиции различных геномных элементов не будут
сохраняться в растворимой фракции, представленной (по крайней мере, в большей части)
обособленными фрагментами ДНК. Следовательно, мы не регистрируем ожидаемых 3Ссигналов в растворимой фракции 3С-материала. Даже частоты лигирования соседних
рестрикционных фрагментов, которые должны достаточно эффективно сшиваться через
гистоны, заметно снижены в этой фракции по сравнению с нерастворимой фракцией. Это
278
Рис. 67. Модель активаторного хроматинового блока/компартмента и механизм предпочтительного
лигирования в процедуре 3С: (А) Схематическое представление предполагаемого активаторного
хроматинового компартмента, содержащего два промотора (P1 и P2) и контролирующий их энхансер (enh).
Энхансер локализован в пространственной близости с промоторами благодаря формированию петли
хроматина, стабилизированной когезиновым кольцом (голубое кольцо на схеме). Формирование комплекса
регуляторных белков (желтые сферы), напрямую связывающих энхансер и промотор(ы), может не
происходить. После фиксации формальдегидом взаимные позиции энхансера и промоторов
«замораживаются» за счет образования сшивок между расположенными рядом хроматиновыми
фибриллами. Для простоты представления фибриллы изображены пересекающими друг друга. (Б) После
экстракции SDS мультикомпонентные белковые комплексы, не сшитые с ДНК, вымываются, тогда как
«хроматиновая сеть», стабилизированная формальдегидными сшивками, сохраняется. При расщеплении
ДНК эндонуклеазами рестрикции образуются «липкие» концы, обладающие определенной (ограниченной)
подвижностью внутри сети, обеспечивающей возможность кросс-лигирования концов различных
фрагментов, находящихся в пространственной близости. Сшивание хроматиновых фибрилл
формальдегидом – стохастический процесс. В нашей модели функциональный компартмент стабилизирован
4 сшивками. Если образования каких-то из этих сшивок не произойдет, фрагменты ДНК, несущие энхансер
и промоторы, отделятся от сети. Такие фрагменты будут солюбилизированы. Однако в растворе фрагменты,
несущие энхансер и промоторы, не будут более удерживаться в пространственной близости.
Соответственно, лигирование солюбилизированных фрагментов ДНК будет протекать без каких-либо
предпочтений и не приведет к генерации характеристических 3С-сигналов.
279
наблюдение может быть легко объяснено более низкой вероятностью солюбилизации
сшитых фрагментов, поскольку оба фрагмента будут удерживаться в составе сшитой
хроматиновой сети, даже если только один из них связан с этой сетью. Механическое
разрушение фиксированных ядер ультразвуковой обработкой, вероятно, приводит к
образованию множества продуктов – от отдельных фрагментов хроматина до крупных
агрегатов (относительно больших фрагментов хроматиновой сети), которые будут
распределяться между растворимой и нерастворимой фракциями 3С-материала, а
наиболее тяжелые – преципитироваться в условиях, использованных для разделения.
Внутри больших агрегатов хроматина относительные позиции индивидуальных геномных
элементов, вероятнее всего, сохраняются. Это должно обеспечить возможность генерации
специфического набора 3С-продуктов в ходе последующей реакции лигирования. С
уменьшением размера хроматиновых агрегатов, информация о позиционировании
участков
генома
утрачивается
в
силу
разобщения/разрушения
индивидуальных
фрагментов и увеличения подвижности целой структуры. Действительно, в наших
экспериментах по ультразвуковой обработке фиксированных ядер специфические
продукты лигирования образовывались преимущественно в нерастворимом материале,
состоящем из больших агрегатов хроматина и остаточных ядер.
Отметим, что признание того факта, что лигирование близкорасположенных
фрагментов ДНК в протоколе 3С осуществляется в нелизированных ядрах, не ставит под
сомнение существование и функциональную значимость петель хроматина, сближающих
удаленные регуляторные элементы. В действительности, первые экспериментальные
свидетельства такого выпетливания были получены с использозованием метода
лигирования в ядрах (nuclear ligation assay) – экспериментального подхода, основанного
на рестрикции и религировании фрагментов ДНК в нативных ядрах, – фактически
прародителя метода 3С (Cullen et al., 1993; Gothard et al., 1996). Модель лигирования
280
близкорасположенных фрагментов ДНК в составе хроматиновой сети (см. рис. 67)
предполагает некоторую степень пластичности активаторного хроматинового блока. Коль
скоро жесткой фиксации всех составляющих элементов путем формирования общего
ДНК-белкового комплекса не требуется, активаторный хроматиновый блок может быть
рассмотрен
как
компартмент,
к
специфически
которому
уложенный
привлекаются
хроматиновый
регуляторные
домен
элементы
или
и
ядерный
промоторы
транскрибируемых генов («экспрессионный центр», как предложен Козак и Грудиным
(Kosak and Groudine, 2004)). Близкие позиции всех регуляторных элементов могут
поддерживаться с помощью белков, непосредственно не взаимодействующими с каждым
из элементов, например, CTCF и когезином, удерживающим вместе два инсулятора (Hou
et al., 2010; Mishiro et al., 2009; Sofueva and Hadjur, 2012), или SATB1/2,
взаимодействующим с S/MAR-элементами (Zhou et al., 2012). Предложенная нами модель
не исключает возможности реализации короткоживущих, попеременных взаимодействий
регуляторных элементов с различными промоторами, представленными в активаторном
хроматиновом компартменте. Наличие этих временных взаимодействий может объяснить
ранее обнаруженный феномен альтернативной транскрипции бета-глобиновых генов
(Gribnau et al., 1998; Wijgerde et al., 1995), предположительно привлекающихся к общему
активаторному блоку (Tolhuis et al., 2002). Не следует также исключать возможность того,
что энхансеры, представленные в активаторном компартменте, могут служить центрами
нуклеации для привлечения РНК-полимеразы II, комплексов ремоделирования хроматина,
гистонацетилтрансфераз и других белков, обеспечивающих работу транскрипционного
аппарата.
Специфическая пространственная конфигурация хроматинового домена может
поддерживаться и с участием факторов, изменяющих характер упаковки хроматина.
Формирование
коротких
участков
конденсированного
хроматина
резко
меняет
281
траекторию хроматиновой фибриллы. Поэтому белки, участвующие в формировании
гетерохроматина, такие как HP1 и Polycomb, а также гистонметилтрансферазы,
осуществляющие метилирование гистонов по позициям H3K27 и H3K9, вероятно, играют
определенную роль в позиционировании участков генома относительно друг друга.
Схожим образом пространственная организация протяженных геномных областей может
модулироваться
факторами,
влияющими
на
динамику хроматиновой
фибриллы:
модификациями гистонов, включением их вариантных форм (H2ABbd и Macro-H2A) и
связыванием архитектурных белков (du Preez and Patterton, 2012; Li and Reinberg, 2011).
Определенную роль здесь может играть и связывание белков, изгибающих ДНК. Среди
таких белков – HMG1 (Bianchi and Agresti, 2005; Stros, 2010), специфические
транскрипционные факторы (Cress and Nevins, 1996; Scaffidi and Bianchi, 2001; van der
Vliet and Verrijzer, 1993), белки, вовлеченные в инициацию репликации (Bashaw and Yates,
2001; Caddle et al., 1990), и даже CTCF (MacPherson and Sadowski, 2010). Наконец,
структурные особенности ДНК (присутствие искривленных участков, АТ-трактов,
участков, способных к образованию неканонических структур, легкоплавких участков)
также могут вносить вклад в макроупаковку хроматиновой фибриллы и регулировать
позиционирование геномных элементов в ядре.
Большинство С-методов (4С, 5С, HiC) не базируются на солюбилизации сшитых
фрагментов хроматина. Наблюдения, полученные с использованием протокола HiC (Dixon
et al., 2012; Lieberman-Aiden et al., 2009; Rao et al., 2014; Sexton et al., 2012; Zhang et al.,
2012), касаются главным образом характера макроупаковки больших хромосомальных
доменов. Важное значение в этих исследованиях имеет идентификация множественных
контактов между расположенными по соседству хроматиновыми фибриллами, которая, с
нашей точки зрения, может быть осуществлена без солюбилизации хроматина из ядра (см.
рис. 67).
282
В отличие от 4С-, 5С- и HiC-методов, такие методы как ChIA-PET (Fullwood et al.,
2009), ChIP-loop (Horike et al., 2005) и e4C (Schoenfelder et al., 2010b) всецело зависят от
солюбилизации фиксированных фрагментов хроматина, поскольку специфические
фракции данных фрагментов отбираются для последующего анализа с помощью
иммунопреципитации из раствора. В протоколе ChIA-PET (Fullwood et al., 2009)
используется ультразвуковая обработка для солюбилизации относительно коротких
фрагментов хроматина. Считаем необходимым заметить, что ультразвуковая обработка,
как показано в наших исследованиях, влечет за собой драматическое падение
детектируемого 3С-сигнала. В условиях, используемых для подготовки ChIA-PETматериала, могут быть идентифицированы только «истинные» комплексы регуляторных
элементов, объединенных белковыми мостиками. Очевидно, что такие комплексы тоже
существуют, иначе бы метод ChIA-PET не работал. Однако доля таких сшитых
комплексов должна быть достаточно низкой. Действительно, для регистрации сигналов в
методе ChIA-PET требуется очень глубокое секвенирование (de Wit and de Laat, 2012). Это
не должно представлять проблемы до тех пор, пока есть понимание, что взаимодействия,
идентифицируемые с помощью ChIA-PET и большинства других C-методов, могут в
корне различаться. Протокол 3С, равно как и 4С, 5С и HiC, в самом деле базируется на
фиксации конформации хромосомы («заморозке» проксимальных позиций удаленных
регуляторных элементов внутри хромосомной территории), а не на фиксации прямых
взаимодействий между промоторами и энхансерами через регуляторные белки (белковые
комплексы). Соответственно, результаты 3С-анализа скорее показывают относительную
близость фрагментов в ядерном пространстве (или вероятность нахождения фрагментов в
пространственной близости), нежели чем частоту взаимодействия этих фрагментов.
Протоколы ChIP-loop (Horike et al., 2005) и e4C- методов (Schoenfelder et al., 2010b) не
включают ультразвуковой обработки. Однако только растворимая часть 3С-материала
283
используется для исследования – подвергается иммунопреципитации перед стадией
лигирования. В предложенной нами клеточной модели только 15% ДНК (доля ДНК,
солюбилизирующаяся из ядер после обработки рестриктазой, узнающей 6-нуклеотидную
последовательность) было бы доступным для ChIP-loop- и e4C-анализов. Более того, она
не была бы репрезентативной долей 3С-материала вследствие неравной солюбилизации
фрагментов ДНК различного размера и недопредставленности взаимодействующих
фрагментов, которые могут
быть
идентифицированы путем
анализа продуктов
лигирования in situ. Возможно, степень солюбилизации фиксированных фрагментов
хроматина различается в разных клеточных моделях. И все же очевидно, что использовать
методы ChIP-loop и e4C нужно с большой осторожностью. В частности, необходимо
строго контролировать степень солюбилизации фиксированных фрагментов хроматина.
IV.4 АБСОЛЮТНЫЕ ЧАСТОТЫ ЛИГИРОВАНИЯ В ПРОЦЕДУРЕ 3С
Вывод о том, что взаимодействия между энхансерами и промоторами носят динамичный,
а не статичный характер, косвенно подтверждается результатами нашей работы по
анализу абсолютных частот лигирования в процедуре 3C. Здесь мы показали, что частота
лигирования между фрагментами, предположительно собранными в один активаторный
хроматиновый блок, составляет не более десятых долей процента, если определять ее
относительно общего количества каждого из фрагментов. Данная низкая частота
лигирования наблюдалась для фрагментов, содержащих промотор активного бетаглобинового гена, Hbb-b1, и его удаленные энхансеры. В то же время, частота
лигирования фрагментов, использованных в качестве отрицательного контроля, таких как
участок «-42» или ген Olfr69, с фрагментом, несущим промотор гена Hbb-b1, была в
большинстве случаев ниже 0.1%. В наших экспериментах использовались две
эндонуклеазы рестрикции – стандартная, узнающая последовательность из 6 нуклеотидов
284
(HindIII), и частощепящая (MboI). Хотя характерные отличия в частоте лигирования,
наблюдаемые для различных пар рестрикционных фрагментов, воспроизводились между
экспериментами с этими двумя рестриктазами, общий уровень лигирования в
экспериментах с MboI был существенно ниже.
Низкий выход продуктов лигирования в процедуре 3С, наблюдаемый в наших
экспериментах, может иметь разные объяснения. Прежде всего, необходимо рассмотреть
технические особенности экспериментальной процедуры. Каждый рестрикционный
фрагмент имеет два «липких» конца, которыми он может лигироваться с другими
фрагментами. Если учесть наличие двух концов у якорного рестрикционного фрагмента и
у взаимодействующего с ним фрагмента, общий выход продуктов лигирования должен
увеличиться примерно в 4 раза. В предполагаемом активаторном хроматиновом блоке
якорный
фрагмент,
вероятно,
сближен
со
многими
другими
рестрикционными
фрагментами, включая соседние с ним фрагменты и фрагменты по соседству со
взаимодействующими регуляторными элементами. Если предположить, что различные
фрагменты, локализованные в пространственной близости с якорным, лигируются с ним
примерно с равной вероятностью, можно ожидать, что выход продуктов лигирования с
каждым конкретным концом, доступным для лигирования, будет обратно пропорционален
числу этих концов. Модель лигирования фрагментов ДНК в составе сшитой сети
хроматиновых фибрилл (см. рис. 67) также предполагает, что вероятность лигирования
концов всех рестрикционных фрагментов, локализованных в пространственной близости,
должна быть схожей, если не одинаковой. Наши эксперименты подтверждают эти
предположения. Действительно, MboI вносит намного больше разрывов, чем HindIII, и
выход специфических продуктов лигирования в экспериментах с MboI существенно ниже
такового в экспериментах с HindIII.
285
С другой стороны, все рассмотренные выше факторы должны в равной степени
затрагивать
вероятность
циркуляризации
якорного
фрагмента.
Между тем,
мы
установили, что выход циркуляризованного якорного фрагмента как минимум в 10 раз
превышает выход продуктов лигирования этого фрагмента с любым из удаленных
фрагментов, предположительно участвующих во взаимодействии с якорным фрагментом.
Более того, выход циркуляризованного якорного фрагмента был примерно одинаков в
экспериментах с HindIII и MboI. Следовательно, он не затрагивается присутствием
дополнительных «липких» концов, способных к лигированию. Простейшее объяснение
этому наблюдению состоит в том, что значительная доля якорных фрагментов не сшита
ни с одним другим рестрикционным фрагментом, включая фрагмент, локализованный
непосредственно перед якорным. Выход продукта лигирования в данном случае составлял
около 1.5% против 9% в случае циркуляризации.
Вероятность сшивки различных участков сложенной хроматиновой фибриллы
может зависеть от многих факторов, включая эффективность сшивки самой по себе и
действительные частоты, с которыми целевые участки ДНК взаимодействуют в ядре. В
данном
отношении
следует
отметить,
что
большинство
клеток
в
популяции,
использованной в нашем исследовании (клетки печени эмбрионов мыши 14-го дня
развития), являются предшественниками эритроидных клеток, транскрибирующих гены
Hbb-b1 и Hbb-b2 (Wijgerde et al., 1995; Zhang et al., 2003); можно ожидать, что
взаимодействия между глобиновыми генами и их энхансерами реализуются во всех этих
клетках. В свете этих соображений, низкая частота лигирования, наблюдающаяся в наших
экспериментах, может отражать тот факт, что эти взаимодействия не являются в
достаточной мере стабильными или единообразными для того, чтобы поддерживать
сшивку соответствующих фрагментов хроматиновой фибриллы в большинстве клеток,
представленных в популяции. Эти данные снова приводят нас к «флип-флоп» модели
286
действия энхансера, предполагающей, что взаимодействия между промоторами и
энхансерами бета-глобиновых генов короткоживущие и динамичные.
Каковы бы ни были причины низкого уровня продуктов лигирования в 3С-анализе,
это может служить источником различных артефактов. Чем ниже уровень измеряемого
сигнала, тем больше вероятность его искажения под влиянием факторов, которые
невозможно учесть. Приведем ряд факторов, влияющих на эффективность лигирования.
Помимо пространственной близости рестрикционных фрагментов, состояние «липких
концов» (их длина, подвижность, присутствие пришитых белков и др.) должно определять
их способность «дотянуться» друг до друга и быть лигированными. Принимая во
внимание тот факт, что даже в такой классической модельной системе, как домен бетаглобиновых генов мыши, уровень продуктов лигирования в точках максимумов 3Скривой не превосходит 1%, нельзя исключить, что профили 3С-кривых искажаются под
воздействием факторов иных, нежели пространственная близость. Необходимость
постановки
различных
контрольных
экспериментов
при
проведении
3С-анализа
неоднократно подчеркивалась и в литературе (de Wit and de Laat, 2012; Dekker, 2006;
Naumova et al., 2012). Результаты, представленные в нашей работе, дополнительно
указывают на важность этой проблемы.
IV.5 ВЫЯВЛЕНИЕ
ПРЯМЫХ
КОНТАКТОВ
МЕЖДУ
ГЕНОМНЫМИ
ЭЛЕМЕНТАМИ МЕТОДОМ МОЛЕКУЛЯРНЫХ КОЛОНИЙ
Проведенные нами исследования домена бета-глобиновых генов мыши методом 3С
позволили показать, что образование прямых «белковых мостиков» между регуляторными
элементами ДНК, такими как промоторы и энхансеры активных бета-глобиновых генов,
является достаточно редким событием (если вовсе осуществляется). Этот вывод
представляется
чрезвычайно
интересным
в
контексте
понимания
механизмов,
287
опосредующих сближение регуляторных элементов генома. Полученные нами результаты
свидетельствуют о том, что сближение промоторов и энхансеров регулируется скорее
способом макроупаковки хроматиновой фибриллы (модель активаторного хроматинового
компартмента, см. рис. 67), нежели организацией элементов в единый ДНК-белковый
комплекс,
сформированный
за
счет
взаимодействия
связанных
с
элементами
регуляторных белков (модель активаторного хроматинового хаба (de Laat and Grosveld,
2003)). Вместе с тем, необходимо учитывать, что данные 3С-анализа сложно
интерпретируемы и не всегда однозначны, о чем неоднократно упомянулось выше.
Однако до разработки нами метода INGRID альтернатив методу 3С не существовало (по
крайней мере, если речь идет об анализе специфических взаимодействий в отдельно
взятых геномных доменах). Для оценки частоты прямого взаимодействия регуляторных
элементов генома важно иметь экспериментальный подход, позволяющий напрямую
идентифицировать и подсчитывать мультикомпонентные комплексы геномных элементов,
не полагаясь на принцип лигирования близкорасположенных фрагментов. С этой целью
нами и был разработан метод INGRID.
В методе INGRID комплексы идентифицируются тем же прямым образом, как и в
методе FISH. Однако, поскольку разрешение анализа повышается на несколько порядков
(оно определяется размером фрагментов, на которые расщепляется геном и площадью
поверхности, на которой иммобилизуются фрагменты), метод позволяет исследовать
пространственное взаимодействие намного менее удаленных участков хроматина.
Подобно FISH, INGRID-анализ позволяет определить долю геномных локусов, в которых
определенные участки ДНК взаимодействуют. Обнаружение определенной комбинации
фрагментов в составе мультикомпонентных ДНК-колоний свидетельствует о присутствии
этих фрагментов в составе недиссоциируемых (сшитых) хроматиновых комплексов, тогда
как определение доли этих мультикомпонентных колоний среди всех колоний,
288
визуализируемых данной пробой, позволяет определить долю хромосом, в которых
представлен комплекс.
В нашей работе мы использовали протокол INGRID для анализа предполагаемого
активаторного
хроматинового
блока
домена
бета-глобиновых
генов
мыши.
С
использованием этой классической модельной системы нам не удалось зарегистрировать
комплексы, несущие промоторы мажорного и минорного бета-глобиновых генов и
участок DHS5 области контроля локуса (ни попарно, ни в тройных комплексах) (см. рис.
40). Принимая во внимание фоновый уровень случайной колокализации молекулярных
колоний, мы подсчитали, что если такие комплексы и существуют, то они должны
присутствовать не более чем в 3% хромосом, представленных в анализируемом образце.
Способность метода INGRID к регистрации опосредованных белками взаимодействий в
хроматине была продемонстрирована обнаружением того факта, что ампликоны из
отдельных
рестрикционных
фрагментов
образовывали
около
10%
бинарных
молекулярных колоний, если эти фрагменты располагались по соседству друг с другом в
хромосоме (см. рис. 44В). Это значение примерно в 6 раз больше частоты лигирования
соседних рестрикционных фрагментов в процедуре 3С (см. рис. 29). Указанное
несоответствие
может
быть
обусловлено
наличием
нескольких
концов
ДНК,
конкурирующих за лигирование.
В целом, результаты INGRID-анализа подтверждают выводы, сделанные на
основании проведенного нами 3С-анализа, и свидетельствуют о том, что активаторные
хроматиновые блоки, предложенные де Лаатом и Гроссвелдом (de Laat and Grosveld,
2003), либо не существуют, либо являются нестабильными и/или короткоживущими
образованиями, которые в каждый момент времени собраны лишь в небольшой доле
клеток,
представленных
в
популяции.
Данное
наблюдение
может
показаться
противоречащим результатам флуоресцентной гибридизации in situ, демонстрирующим,
289
что в некоторых случаях гены и удаленные регуляторные элементы колокализуются в
значительной доле клеток в популяции, которая может достигать 30% (Williamson et al.,
2012) или даже 85% (Phillips-Cremins et al., 2013). Однако с помощью FISH невозможно
отличить
ситуации,
когда
элементы
взаимодействуют
непосредственно
(модель
активаторного хроматинового хаба (de Laat and Grosveld, 2003)) или лишь сближены в
ядерном пространстве (модель активаторного хроматинового компартмента). Наши
результаты не ставят под сомнение важность промотор-энхансерных взаимодействий,
однако указывают на бóльшую пластичность этих взаимодействий, чем постулируется в
модели активаторного хроматинового блока.
Безусловно, необходимо рассмотреть и возможность того, что комплексы
регуляторных элементов, существующие в живых клетках, плохо фиксируются
формальдегидом. Для проверки этой возможности в комбинации с формальдегидом мы
использовали EGS – фиксирующий агент с двумя активными группами, разделенными
спейсером,
применение которого
рекомендовано
для фиксации
мультибелковых
комплексов, непосредственно не связанных с ДНК (Fujita and Wade, 2004; Zeng et al.,
2006). Однако, и в этом случае нам не удалось детектировать наличие комплексов между
промоторами и энхансерами бета-глобиновых генов в материале, солюбилизированном из
эритроидных клеток.
Очевидно, что применимость протокола INGRID для анализа пространственной
организации хромосом полностью зависит от растворимости анализируемого образца. В
самом деле, в нелизированных ядрах и больших агрегатах хроматина фрагменты ДНК
будут
колокализовываться
независимо
от
того,
присутствуют
они
в
составе
специфических комплексов или нет, поэтому такие крупные частицы должны быть
удалены из раствора, нанесенного на гель. Как подробно рассмотрено в предыдущем
разделе, бóльшая часть фиксированного материала не солюбилизируется из ядер даже
290
после экстракции SDS и обработки эндонуклеазами рестрикции согласно стандартному
протоколу 3С. Поэтому перед распределением материала в геле образцы были
подвергнуты ультразвуковой обработке в условиях, обеспечивающих сохранность тестампликонов и солюбилизацию >90% ДНК (см. рис. 39).
В заключение отметим, что INGRID-метод может стать важным инструментом для
изучения трехмерной структуры генома. То, что для проведения эксперимента требуются
небольшие количества начального материала, открывает широкие возможности для
исследования индивидуальных клеток. Хотя в нашем случае мы осуществляли
мониторинг лишь трех ампликонов для визуализации тройственных взаимодействий,
протокол INGRID может быть легко адаптирован для анализа 4-х и более ампликонов при
условии наличия устройств, позволяющих одновременно регистрировать флуоресценцию
большего числа различных флуорофоров. С использованием более длинных ампликонов
и/или более плотных гелей размер молекулярных колоний может быть уменьшен до 10
мкм и меньше, что создает возможность для разрешения тысяч колоний в единичном геле
и сильно повышает производительность метода (Chetverin and Chetverina, 2008).
Возможность определения состава и количества ассоциированных геномных элементов
открывает широкую дорогу для использования метода INGRID в исследованиях по
изучению разнообразия и динамики любых хроматиновых структур, доступных для
исследования в растворимой форме.
IV.6 ЯДЕРНЫЙ МАТРИКС КАК ПЛАТФОРМА ДЛЯ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ
УДАЛЕННЫХ РЕГУЛЯТОРНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ ГЕНОМА
Пространственная организация эукариотического генома тесно связана с функциональной
компартментализацией клеточного ядра. Укладка хроматина в значительной мере
определяет позиционирование внутриядерных компартментов, и наоборот – привлечение
291
геномных локусов к различным ядерным компартментам играет определенную роль в
создании специфической архитектуры интерфазных хромосом. Не вполне ясно, чем
подобная организация структурно поддерживается. Возможно, специальной скелетной
структуры не существует вообще. Как обсуждалось в обзоре литературы, ее функцию, в
известной степени, может выполнять сама ДНК. Альтернативная точка зрения состоит в
том, что в ядре имеется белковый скелет – ядерный белковый матрикс, обеспечивающий
заякоривание петель хроматина и позиционирование ядерных компартментов. В этой
связи интересно отметить, что ряд архитектурных белков, принимающих участие в
пространственной организации генома, таких как CTCF у позвоночных животных (Mishiro
et al., 2009; Ong and Corces, 2014; Phillips-Cremins et al., 2013; Splinter et al., 2006; Zlatanova
and Caiafa, 2009) и Su(Hw) у дрозофилы (Muravyova et al., 2001; Savitskaya et al., 2006), по
крайней мере частично, локализуются в ядерном матриксе (Byrd and Corces, 2003; Dunn et
al., 2003; Yusufzai and Felsenfeld, 2004). Это обстоятельство позволило поставить вопрос о
том, может ли ядерный матрикс играть специфическую роль в поддержании
функциональной архитектуры генома?
Как отмечалось выше, природа ядерного матрикса остается не ясной, а некоторые
исследователи даже ставят под сомнение его существование. Однако ряд недавних
исследований, направленных, в частности, на описание протеома ядерного матрикса
(Albrethsen et al., 2009; Ishii et al., 2008; Mika and Rost, 2005) и детальное изучение его
ультраструктуры с использованием новых методов (Barboro et al., 2003; Barboro et al.,
2010), все-таки поддерживают идею о том, что ядерный матрикс существует в живых
клетках и поддерживает функциональную компартментализацию клеточного ядра
(обсуждено в (Berezney, 2002; Elcock and Bridger, 2008)). По результатам ранних
исследований в нашей лаборатории была выдвинута гипотеза, что эукариотический геном
организован в петли, прикрепленные к ядерному матриксу (см. (Razin et al., 1995)).
292
Многие исследователи изучали специфичность этой организации, но результаты
противоречили друг другу. Было показано, что определенные последовательности
обладают
способностью
специфично
связываться
с
изолированными
ядерными
матриксами in vitro. Эти последовательности были названы MAR (Matrix Attachment
Region, участки прикрепления к матриксу) (Cockerill and Garrard, 1986). Те же
последовательности ДНК, изолированные с использованием другой экспериментальной
процедуры, включающей экстракцию ядер дииодо-салицилатом лития (LIS), получили
название SAR (Scaffold Attachment Region – участок прикрепления к скафолду)
(Mirkovitch et al., 1984). В современной литературе данные элементы часто именуют
S/MAR-элементами (Bode et al., 1995). Хотя общепринятым считается, что S/MARэлементы опосредуют прикрепление петель ДНК к ядерному матриксу, это никогда не
проверялось экспериментально. Напротив, было показано, что последовательности
S/MAR электроэллюируются из инкапсулированных, обработанных эндонуклеазой
рестрикции ядер при физиологических солевых условиях (Hempel and Stratling, 1996) –
наблюдение, не стыкующееся с предположением о том, что S/MAR-элементы вовлечены в
заякоривание петель ДНК на ядерном матриксе. Чтобы выяснить, какие участки ДНК
связаны с ядерным матриксом in vivo, некоторое время назад в нашей лаборатории был
разработан протокол картирования участков прикрепления петель, основанный на
вырезании петель ДНК топоизомеразой II ядерного матрикса в условиях подавления
лигирующей активности фермента специфическими ингибиторами (Gromova et al., 1995).
Достоверность предложенного протокола была подтверждена прямой визуализацией
связанных с ядерным матриксом петель ДНК, которые изначально были картированы с
использованием протокола выщепления петель при ингибировании топоизомеразы II
(Iarovaia et al., 2004). В контексте нашего обсуждения важно отметить, что участки
прикрепления петель ДНК к ядерному матриксу, картированные по протоколу вырезания
293
петель топоизомеразой II, часто локализуются в CpG-островках, включая CpG-островок
гена NPRL3 кур (Razin et al., 1991) и CpG-островок гена c-Myc человека (Gromova et al.,
1995).
Нам представлялось интересным выяснить, существует ли связь между петлями
ДНК, ассоциированными с ядерным матриксом, и петлями ДНК, которые могут быть
картированы с помощью процедуры 3С. Протокол M3C опирается на операционное
определение ядерного матрикса (Berezney and Coffey, 1977). Если ядерный матрикс и
комплексы ДНК с ядерным матриксом устойчивы к экстракции 2M раствором NaCl, тогда
частоты лигирования связанных с ядерным матриксом фрагментов ДНК можно
анализировать без процедуры фиксации. Следует отметить, что то обстоятельство, что
экспериментальный протокол, основанный на свойствах ядерного матрикса, позволил
идентифицировать специфические взаимодействия между определенными участками
генома, уже само по себе косвенно поддерживает концепцию ядерного матрикса.
Протокол M3C был использован для изучения роли ядерного матрикса в
пространственной организации участка хромосомы 14 кур длиной около 130 т.п.н.,
который включает домен альфа-глобиновых генов. В наших предыдущих экспериментах
((Gavrilov and Razin, 2008) и раздел III.1.2) был осуществлен анализ пространственной
организации этого участка генома с использованием стандартного протокола 3С. В
текущей работе мы решили применить метод M3C для анализа того же модельного
участка и сопоставить результаты, полученные с использованием двух методов.
Полученные нами данные свидетельствуют о взаимодействии нескольких CpG-островков,
представленных в изучаемой области генома, на ядерном матриксе. Это – СpG-островки,
ассоциированные с промоторами генов домашнего хозяйства NPRL3, MPRL28 и AXIN1.
Они локализуются на ядерном матриксе в пространственной близости друг от друга в
лимфоидных и эритроидных клетках. Вероятно, группа CpG-островков на ядерном
294
матриксе представляет собой транскрипционную фабрику (или часть транскрипционной
фабрики), которая может включать CpG-островки, несущие промоторы других генов,
лежащих вне анализируемой области генома. В данной связи важно отметить, что гены
NPRL3, MPRL28 и AXIN1 транскрибируются и в эритроидных, и в неэритроидных клетках.
Напротив, CpG-островок, локализованный между генами MPRL28 и AXIN1 и не
ассоциированный с каким-либо геном, не привлечен к указанной группе CpG-островков.
Отсюда следует, что взаимодействие CpG-островков на ядерном матриксе коррелирует с
транскрипцией генов домашнего хозяйства, ассоциированных с этими CpG-островками.
Об
организации
транскрипционных
фабрик
известно
сравнительно
мало
(Papantonis and Cook, 2013; Sutherland and Bickmore, 2009). Основным доказательством в
пользу их существования является кластеризация транскрибирующих молекул РНКполимеразы II. Сообщалось, что транскрипционные фабрики собираются на ядерном
матриксе (Jackson, 1997). Наши данные согласуются с этим наблюдением. Исследования
по анализу пространственной организации домена альфа-глобиновых генов мыши
предполагают,
что
предсуществующей
промоторы
альфа-глобиновых
транскрипционной
фабрике,
генов
привлекаются
опосредующей
к
транскрипцию
окружающих генов домашнего хозяйства в ответ на активацию глобиновых генов (Zhou et
al., 2006). Полученные нами результаты (см. рис. 46Б и более раннюю работу (Gavrilov and
Razin, 2008)) предполагают, что это же верно и для домена альфа-глобиновых генов кур.
Однако, эритроидспецифичные взаимодействия между промоторами глобиновых генов и
CpG-островками
фланкирующих
генов
домашнего
хозяйства,
детектируемые
с
использованием обычного протокола 3С, в наших M3C-экспериментах выявлены не были.
Это наблюдение согласуется с низким содержанием эритроидспецифичных регуляторных
элементов в ядерном матриксе, выделенном из эритроидных (HD3) или неэритроидных
(DT40) клеток (см. рис. 47). Таким образом, эти взаимодействия не стабилизированы
295
ядерным матриксом и не устойчивы к высокосолевой экстракции. Следует подчеркнуть,
что это не является специфическим свойством пролиферирующих клеток HD3, в которых
глобиновые
гены
транскрибируются
на
базальном
уровне,
но
активаторный
хроматиновый блок, контролирующий экспрессию глобиновых генов, еще не полностью
собран (Gavrilov and Razin, 2008). В ходе дифференцировки уровень экспрессии
глобиновых генов в клетках HD3 существенно увеличивается, а промотор гена D
становится частью активаторного хроматинового блока глобиновых генов, который
включает CpG-островок гена NPRL3 и, вероятно, CpG-островки нескольких других генов
домашнего хозяйства (см. рис. 46Б, а также рис. 65). Однако промотор гена D
высвобождается из указанного активаторного блока (компартмента) при выделении
ядерного матрикса из клеток HD3, индуцированных к терминальной эритроидной
дифференцировке. В индуцированных клетках HD3 M3C-анализ не выявил ассоциации
промотора гена D ни с одним из проанализированных CpG-островков (см. рис. 49Г). В
целом, полученные нами данные указывают на то, что транскрипционные фабрики
смешанного типа, осуществляющие транскрипцию как тканеспецифичных генов, так и
генов домашнего хозяйства, построены из «базового», или «конститутивного»,
компартмента, включающего промоторы генов домашнего хозяйства, которые стабильно
интегрированы в ядерный матрикс, и «гостевого» компартмента, куда могут временно
привлекаться промоторы и регуляторные элементы тканеспецифичных генов. Модель
связанной с ядерным матриксом транскрипционной фабрики представлена на рис. 68.
Функциональный смысл подразделения транскрипционной фабрики на два компартмента
в настоящее время не вполне ясен. Возможно, высокий уровень транскрипции не
совместим с интеграцией гена в ядерный матрикс.
296
Рис. 68. Модель связанной с ядерным матриксом транскрипционной фабрики в эритроидных клетках.
CpG-островки, содержащие промоторы генов домашнего хозяйства NPRL3, MPRL28 и AXIN1 (обозначены
номерами 1, 3 и 5), составляют «конститутивный компартмент» транскрипционной фабрики. Они
перманентно прикреплены к ядерному матриксу (частично интегрированы в него). Элементы «гостевого
компартмента» (промотор гена αD и эритроидспецифичный главный регуляторный элемент MRE)
взаимодействуют с поверхностью конститутивного компартмента, не погруженной в ядерный матрикс. Эти
взаимодействия не устойчивы к экстракции 2 M NaCl и утрачиваются в результате этой экстракции.
297
IV.7 КЛАСТЕРИЗАЦИЯ
CРG-ОСТРОВКОВ
ПРОСТРАНСТВЕННОЙ
КАК
ОРГАНИЗАЦИИ
ВАЖНЫЙ
ФАКТОР
ИНТЕРФАЗНЫХ
ХРОМОСОМ
Анализ пространственной организации участка куриной хромосомы 14, включающего
кластер альфа-глобиновых генов и окружающие гены домашнего хозяйства, показал, что
CpG-островки, ассоциированные с промоторами изученных генов домашнего хозяйства,
взаимодействуют друг с другом в ядерном пространстве (см. раздел IV.6). На настоящем
этапе работы мы провели полногеномный анализ пространственных взаимодействий
нескольких CpG-островков с хромосомы 14, ассоциированных с промоторами генов
домашнего хозяйства. Результаты анализа показали, что CpG-островки проявляют
тенденцию к пространственной кластеризации в масштабе всего генома.
На основании результатов HiC-анализа Деккер и соавт. предположили, что
активный и неактивный хроматин сегрегированы в пространстве ядра и формируют два
различных компартмента (Lieberman-Aiden et al., 2009; Sanyal et al., 2012). Они также
отметили, что богатые генами маленькие хромосомы имеют тенденцию располагаться в
ядерном пространстве ближе друг к другу. Пространственная сегрегации обедненных
генами длинных и обогащенных генами коротких хромосом была ранее описана для
клеток кур, в которых все богатые генами микрохромосомы сосредотачиваются ближе к
центру ядра (Habermann et al., 2001). Поэтому не удивительно, что наш анализ обнаружил
предпочтительное взаимодействие хромосомы 14 кур с другими короткими хромосомами,
по крайней мере, в эритроидных клетках. Наши результаты поддерживают гипотезу о том,
что активные участки генома формируют отдельный пространственный компартмент.
Действительно, как показали результаты 4С-анализа, якорные фрагменты, размещенные
на CpG-островках, вовлечены в пространственные взаимодействия с участками той же и
298
других хромосом, обогащенными CpG-островками. Напротив, якорный фрагмент,
локализованный в области, обедненной генами и CpG-островками, не демонстрирует
предпочтительного взаимодействия с областями, обогащенными CpG-островками. Не
вполне ясно, может ли укладка хромосомы обеспечить одновременное взаимодействие
всех богатых генами ее участков. Однако важно вспомнить, что 4С- и другие С-методы
позволяют получить лишь усредненную картину того, что происходит в различных
клетках, присутствующих в популяции. Эта картина, вероятно, представляет собой
суперпозицию ряда альтернативных хроматиновых конфигураций, существующих в
индивидуальных клетках (Barbieri et al., 2013; Nagano et al., 2013).
Результаты проведенного нами исследования дают основания полагать, что
пространственное взаимодействие (кластеризация) CpG-островков может служить
движущей
силой
пространственной
сегрегации
активных
участков
генома.
Функциональный смысл пространственной кластеризации CpG-островков и механизмы,
поддерживающие эту кластеризацию, не вполне очевидны. В последние годы большое
внимание
уделяется
вопросу
об
ассоциации
транскрибируемых
генов
в
транскрипционных фабриках (Cook, 2010; Sexton et al., 2007; Sutherland and Bickmore,
2009). Примечательно, что гены домашнего хозяйства составляют основную часть
транскрибируемых генов даже в специализированных типах клеток (см. рис. 50) и
промоторы большинства генов домашнего хозяйства лежат в CpG-островках (Deaton and
Bird, 2011). Предполагая отсутствие большой специфичности в ассоциации генов в
составе транскрипционных фабрик, можно ожидать, что каждая транскрипционная
фабрика содержит один или несколько генов домашнего хозяйства. И все же, детальный
анализ распределения 4С-сигнала в окрестностях промоторов, ассоциированных и не
ассоциированных с CpG-островками, и в окрестностях CpG-островков, не содержащих
299
промоторов, показывает, что CpG-островки участвуют в кластеризации независимо от
присутствия промотора (см. рис. 62).
В эритроидных клетках эритроидспецифичные гены демонстрируют тенденцию к
транскрипции в составе общих транскрипционных фабрик (Schoenfelder et al., 2010a;
Schoenfelder et al., 2010b). Однако заметим, что вероятность ассоциации более двух
эритроидспецифичных генов в одной транскрипционной фабрике меньше ожидаемой,
рассчитанной
на
основании
транскрипционными
случайного
фабриками.
распределения
Принимая
во
генов
внимание
между
тот
факт,
всеми
что
«среднестатистическая» транскрипционная фабрика содержит 8 молекул элонгирующей
РНК-полимеразы II (Martin and Pombo, 2003) (согласно другим оценкам – до 30 молекул
(Iborra et al., 1996; Jackson et al., 1998)), можно предположить, что в эритроидных клетках
ядро
всех транскрипционных фабрик образовано
домашнего
хозяйства.
Отметим,
что
нашу
транскрибирующимися генами
экспериментальную
модель
можно
использовать для оценки относительного вклада ассоциации тканеспецифичных генов и
генов домашнего хозяйства в создание специфической пространственной организации
интерфазных хромосом. В качестве якорного рестрикционного фрагмента в основных
экспериментах по 4С-анализу был выбран фрагмент, несущий CpG-островок, который
расположен на небольшом расстоянии (~ 5 т.п.н.) от кластера альфа-глобиновых генов,
неактивных
в
лимфоидных
клетках.
Соответственно,
ассоциация
между
эритроидспецифичными генами не должна вносить вклад в спектр 4С-сигналов,
наблюдаемых в этих клетках. Наоборот, такой вклад можно ожидать для эритроидных
клеток (HD3). Тем не менее, и в эритроидных, и в лимфоидных клетках была
засвидетельствована лишь корреляция 4С-сигнала с плотностью CpG-островков и мотивов
связывания универсального транскрипционного фактора Sp1, но не с плотностью
предсказанных участков связывания эритроидспецифичных транскрипционных факторов.
300
Отсюда
следует,
что
ассоциация
CpG-островков
вносит
больший
вклад
в
пространственную организацию генома, чем ассоциация эритроидспецифичных генов.
Этот вывод подкрепляется наблюдениями, что в эритроидных клетках мыши и курицы
альфа-глобиновые гены привлекаются к транскрипционным фабрикам, опосредующим
транскрипцию генов домашнего хозяйства ((Zhou et al., 2006) и раздел IV.6).
При рассмотрении возможного функционального значения кластеризации CpGостровков необходимо отметить, что CpG-островки часто содержат участки начала
репликации ДНК (Cayrou et al., 2011). Более того, показано, что наиболее активные
участки начала репликации располагаются в CpG-островках, содержащих промоторы
активных генов (Sequeira-Mendes et al., 2009). Ориджины репликации и связанные с ними
белки организуются в фокусы репликации (Fujita et al., 2002), которые, по всей видимости,
преобразуются в репликационные фабрики (Cseresnyes et al., 2009; Hozak and Cook, 1994)
при активации ориджинов. Это предполагает, что кластеризация CpG-островков может
иметь отношение к пространственной организации репликационных единиц. Указанная
гипотеза заслуживает дальнейшего изучения. Тем не менее, наши результаты дают
косвенное подтверждение возможной связи между кластеризацией CpG-островков и
пространственной организацией репликации. Мы показали, что якорный фрагмент
«NPRL3», в котором расположен CpG-островок, несущий участок начала репликации
(Razin et al., 1986), устанавливает дальние взаимодействия с участками хромосом,
содержащими G-тетрадные мотивы, которые часто присутствуют в CpG-островках и
представляются важными элементами участков начала репликации высших эукариот
(Cayrou et al., 2012). Другие якорные фрагменты, содержащие CpG-островки, также
демонстрировали предпочтительные взаимодействия с G-квадруплексами. Таким образом,
возможно,
что
кластеризация
CpG-островков
отражает
организацию ориджинов
репликации в репликационные фабрики.
301
Гипотезы о том, что кластеризация CpG-островков важна для пространственной
организации репликационных единиц и что эта кластеризация отражает организацию
генов
домашнего
хозяйства
в
транскрипционные
фабрики,
не
являются
взаимоисключающими. В обоих случаях кластеризация может поддерживаться под
действием сил, возникающих в условиях макромолекулярного скопления, как описано
ранее (Ellis, 2001; Hancock, 2004b; Marenduzzo et al., 2006b). Какие-то дополнительные
взаимодействия
могут
также
стабилизировать
ассоциацию
CpG-островков.
Так,
сообщалось, что белок Sp1 опосредует взаимодействие между удаленными геномными
элементами (Nolis et al., 2009). Мы тоже наблюдали хорошую корреляцию между 4Cсигналом и присутствием мотивов связывания Sp1. CpG-островки часто содержат участки
связывания белка CTCF, а роль CTCF в поддержке трехмерной организации генома
неоднократно обсуждалась выше. Соответственно, в проведенном полногеномном анализе
была выявлена корреляция между 4С-сигналом и участками связывания CTCF, которые
были определены методом ChIP-seq. По всей видимости, присутствие участков
связывания
CTCF
в
транскрипционно
активных
областях
генома
содействует
пространственной сегрегации этих геномных областей.
302
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Настоящая работа посвящена изучению пространственной организации генома эукариот и
ее роли в регуляции экспрессии генов. В работе изучен спектр пространственных
взаимодействий
регуляторных элементов домена бета-глобиновых генов
кур в
эритроидных клетках на разных стадиях эмбрионального развития. На основании
полученных результатов построены модели пространственной организации домена в этих
клетках.
Впервые
продемонстрировано,
что
привлечение
глобиновых
генов
к
активаторному хроматиновому блоку не является обязательным для обеспечения
активной транскрипции этих генов. Также показано, что не всегда привлечение промотора
гена в активаторный хроматиновый блок коррелирует с активацией гена.
Важно и обнаружение нескольких альтернативных хроматиновых конфигураций
домена, которые, по всей видимости, отражают вариабильность пространственной
организации
генома
на
уровне
индивидуальных
клеток.
Данное
направление
исследований продолжено при изучении пространственной организации домена альфаглобиновых генов кур и расположенного за ними эритроидспецифичного гена TMEM8.
Продемонстрировано, что регуляция экспрессии взрослых альфа-глобиновых генов и гена
TMEM8 осуществляется посредством сборки двух альтернативных хроматиновых блоков,
в составе которых имеются общие регуляторные элементы, которые «курсируют» между
альтернативными хроматиновыми блоками. Результаты работы указывают на то, что
активаторные хроматиновые блоки представляют собой скорее динамичные, нежели
статичные образования.
Особое внимание в работе уделено развитию существующих и созданию новых
методов изучения пространственной организации генома. В ходе работы пересмотрены
ключевые стадии метода фиксации конформации хромосомы и показано, что одно из
303
исходных допущений экспериментального протокола некорректно. Впервые показано, что
стадия лигирования осуществляется внутри ядра, а не в растворе после лизиса клеток, как
предполагалось ранее. На основании полученных данных предложена новая модель
действия энхансера, согласно которой сближение промоторов и энхансеров регулируется
способом макроупаковки хроматиновой фибриллы, обеспечивающим позиционирование
промоторов и контролирующих их энхансеров в одном ядерном компартменте, где эти
элементы не обязательно объединены в единый регуляторный комплекс.
Предложенная
модель
подтверждена
экспериментами
с
использованием
принципиально нового подхода для изучения пространственных взаимодействий
удаленных регуляторных элементов, разработанного нами для преодоления внутренних
ограничений метода 3С. С помощью этого метода (INGRID) осуществлен количественный
анализ
пространственных взаимодействий промоторов
бета-глобиновых генов
и
вышележащих регуляторных элементов в эритроидных клетках мышиных эмбрионов.
Впервые показано, что в большинстве клеток, экспрессирующих глобиновые гены,
промоторы глобиновых генов и их энхансерные элементы не организованы в единый
ДНК-белковый комплекс. Таким образом, полученные нами результаты опровергают
общепринятую модель, постулирующую, что удаленные энхансеры и контролируемые
ими промоторы объединяются в стабильный активаторный комплекс.
В ходе работы оценено влияние формальдегидной фиксации на способность
амплифицировать ДНК, а также разработана техника, позволяющая количественно
определять абсолютный выход продуктов лигирования в процедуре 3С. С использованием
этой техники продемонстрировано, что частоты лигирования фрагментов, несущих
промотор активного бета-глобинового гена и его удаленные энхансерные элементы, не
превышают 1%. Обнаруженные низкие частоты лигирования подтверждают вывод об
304
отсутствиии
стабильных
долгоживущих
взаимодействий
между
промоторами
и
контролирующими их энхансерами.
В работе разработана новая экспериментальная процедура (М3С), позволяющая
оценивать пространственную сближенность прикрепленных к ядерному матриксу
фрагментов ДНК. С использованием метода М3С показано, что ядерный матрикс
выступает в качестве «платформы» для пространственного взаимодействия промоторов
генов домашнего хозяйства. На основании полученных результатов предложена новая
модель транскрипционной фабрики, связанной с ядерным матриксом. Результаты данного
исследования представляют важный шаг в понимании и переосмыслении концепции
ядерного матрикса.
В заключительной части работы с использованием полногеномного анализа
показано, что одной из важных детерминант, обеспечивающих трехмерную организацию
интерфазной
хромосомы,
является
кластеризация
CpG-островков,
включающих
промоторы активных генов и участки начала репликации ДНК.
Результаты настоящей работы существенно расширяют наши представления о
механизмах работы энхансеров эукариот и принципах пространственной организации
генома. Очевидно, что механизмы, ответственные за реконфигурацию геномных доменов
и позиционирование регуляторных элементов ДНК в клеточном ядре, являются частью
эпигенетической системы клетки, контролирующей экспрессию генов.
Вместе с тем, необходимо отдавать себе отчет, что большинство современных
методов исследований позволяют получать лишь статичную картину пространственной
организации генома. Более того, во многих случаях эта картина представляет собой не
более чем усредненную модель, интегрирующую результаты анализа тысяч и миллионов
индивидуальных
клеток.
Такова
специфика
исследований,
базирующихся
на
биохимических методах, в частности, на методе 3С и его производных. С использованием
305
этих методов можно получить информацию относительно нелинейной конфигурации
генома, однако они не дают ответа на вопрос, является ли эта конфигурация базовой или
наиболее типична простая линейная конфигурация. Данные по анализу конформации
хромосом в индивидуальных клетках, полученные нами с использованием метода
INGRID, свидетельствуют о том, что частота прямых контактов регуляторных элементов,
опосредованных «белковыми мостиками», мала. И все же результаты 3С-анализа и
флуоресцентной гибридизации in situ свидетельствуют о том, что активные гены и их
регуляторные элементы занимают в клеточном ядре сближенные позиции. Характер
взаимодействий удаленных регуляторных элементов, разнесенных на расстояния до 1-2
млн п.н., различается в клетках, дифференцированных по разным путям. Аналогично,
ассоциация генов с различными ядерными компартментами связана с реализацией
функциональных процессов в клеточном ядре. Не ясным пока остается вопрос о том,
устанавливаются ли все вышеуказанные взаимодействия в активной или пассивной
форме? Чем является пространственная организация генома – движущей силой или
следствием реализации функциональных процессов в ядре?
Как часто бывает в науке, будущий прогресс в раскрытии причинно-следственных
связей между активностью генома и его пространственной организацией будет зависеть от
развития новых методов исследования. Возможность наблюдения за реконфигурацией
индивидуальных геномных локусов в живых клетках представляется особенно важной для
решения этих вопросов.
306
ВЫВОДЫ
1.
На модели домена бета-глобиновых генов кур продемонстрировано, что
корреляция между привлечением промотора к активаторному хроматиновому блоку и
вовлечением гена в транскрипцию не является абсолютной. Установлено, что
эмбриональный ген ε не взаимодействует ни с одним из удаленных регуляторных
элементов.
2.
Продемонстрировано, что транскрипция альфа-глобиновых генов и гена TMEM8
контролируется
альтернативными
активаторными
хроматиновыми
блоками,
включающими два общих регуляторных элемента.
3.
Уточнен принцип работы протокола фиксации конформации хромосомы (3С).
Впервые продемонстрировано, что стадия лигирования осуществляется внутри ядра в
сети сшитых хроматиновых фибрилл, а не в растворе после лизиса ядер.
4.
Разработан новый метод количественного анализа взаимодействий геномных
элементов на основе техники молекулярных колоний. С использованием этого метода
продемонстрировано, что промоторы активных бета-глобиновых генов мыши и их
удаленные энхансерные элементы не организованы в единый ДНК-белковый комплекс.
5.
Обоснована новая модель позиционирования геномных элементов в ядре,
постулирующая, что сближение промоторов и энхансеров регулируется способом
макроупаковки
хроматиновой
фибриллы,
обеспечивающим
позиционирование
промоторов и контролирующих их энхансеров в одном ядерном компартменте.
6.
Разработан новый метод, позволяющий анализировать степень пространственной
сближенности прикрепленных к ядерному матриксу фрагментов ДНК. С использованием
этого метода показано, что промоторы ряда генов домашнего хозяйства, расположенных
во фланкирующих областях домена альфа-глобиновых генов кур, взаимодействуют друг
307
с другом на ядерном матриксе. Предложена модель транскрипционной фабрики,
связанной с ядерным матриксом.
7.
Продемонстрировано, что кластеризация CpG-островков, включающих промоторы
генов домашнего хозяйства и участки начала репликации ДНК, является важным
фактором пространственной организации интерфазного генома.
308
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.
Aguilar-Arnal, L., Hakim, O., Patel, V.R., Baldi, P., Hager, G.L., and Sassone-Corsi, P.
(2013). Cycles in spatial and temporal chromosomal organization driven by the circadian clock.
Nat Struct Mol Biol 20, 1206-1213.
2.
Albert, I., Mavrich, T.N., Tomsho, L.P., Qi, J., Zanton, S.J., Schuster, S.C., and Pugh,
B.F. (2007). Translational and rotational settings of H2A.Z nucleosomes across the
Saccharomyces cerevisiae genome. Nature 446, 572-576.
3.
Albrethsen, J., Knol, J.C., and Jimenez, C.R. (2009). Unravelling the nuclear matrix
proteome. J Proteomics 72, 71-81.
4.
Alev, C., McIntyre, B.A., Nagai, H., Shin, M., Shinmyozu, K., Jakt, L.M., and Sheng, G.
(2008). BetaA, the major beta globin in definitive red blood cells, is present from the onset of
primitive erythropoiesis in chicken. Dev Dyn 237, 1193-1197.
5.
Allahverdi, A., Yang, R., Korolev, N., Fan, Y., Davey, C.A., Liu, C.F., and
Nordenskiold, L. (2011). The effects of histone H4 tail acetylations on cation-induced
chromatin folding and self-association. Nucleic Acids Res 39, 1680-1691.
6.
Amano, T., Sagai, T., Tanabe, H., Mizushina, Y., Nakazawa, H., and Shiroishi, T. (2009).
Chromosomal dynamics at the Shh locus: limb bud-specific differential regulation of
competence and active transcription. Dev Cell 16, 47-57.
7.
Andersson, R., Gebhard, C., Miguel-Escalada, I., Hoof, I., Bornholdt, J., Boyd, M., Chen,
Y., Zhao, X., Schmidl, C., Suzuki, T., et al. (2014). An atlas of active enhancers across human
cell types and tissues. Nature 507, 455-461.
8.
Andrews, A.J., and Luger, K. (2011). Nucleosome structure(s) and stability: variations on
a theme. Annual review of biophysics 40, 99-117.
309
9.
Arya, G., and Schlick, T. (2006). Role of histone tails in chromatin folding revealed by a
mesoscopic oligonucleosome model. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 16236-16241.
10.
Ay, F., Bunnik, E.M., Varoquaux, N., Bol, S.M., Prudhomme, J., Vert, J.P., Noble, W.S.,
and Le Roch, K.G. (2014). Three-dimensional modeling of the P. falciparum genome during
the erythrocytic cycle reveals a strong connection between genome architecture and gene
expression. Genome Res 24, 974-988.
11.
Badis, G., Chan, E.T., van Bakel, H., Pena-Castillo, L., Tillo, D., Tsui, K., Carlson, C.D.,
Gossett, A.J., Hasinoff, M.J., Warren, C.L., et al. (2008). A library of yeast transcription factor
motifs reveals a widespread function for Rsc3 in targeting nucleosome exclusion at promoters.
Mol CeLL 32, 878-887.
12.
Banerji, J., Rusconi, S., and Schaffner, W. (1981). Expression of a beta-globin gene is
enhanced by remote SV40 DNA sequences. Cell 27, 299-308.
13.
Bannister, A.J., and Kouzarides, T. (2011). Regulation of chromatin by histone
modifications. Cell Res 21, 381-395.
14.
Bantignies, F., Roure, V., Comet, I., Leblanc, B., Schuettengruber, B., Bonnet, J., Tixier,
V., Mas, A., and Cavalli, G. (2011). Polycomb-dependent regulatory contacts between distant
Hox loci in Drosophila. Cell 144, 214-226.
15.
Barbieri, M., Fraser, J., Lavitas, L.M., Chotalia, M., Dostie, J., Pombo, A., and Nicodemi,
M. (2013). A polymer model explains the complexity of large-scale chromatin folding. Nucleus
4.
16.
Barboro, P., D'Arrigo, C., Mormino, M., Coradeghini, R., Parodi, S., Patrone, E., and
Balbi, C. (2003). An intranuclear frame for chromatin compartmentalization and higher-order
folding. J Cell Biochem 88, 113-120.
17.
Barboro, P., D'Arrigo, C., Repaci, E., Bagnasco, L., Orecchia, P., Carnemolla, B.,
Patrone, E., and Balbi, C. (2009). Proteomic analysis of the nuclear matrix in the early stages of
310
rat liver carcinogenesis: identification of differentially expressed and MAR-binding proteins.
Exp Cell Res 315, 226-239.
18.
Barboro, P., D'Arrigo, C., Repaci, E., Patrone, E., and Balbi, C. (2010). Organization of
the lamin scaffold in the internal nuclear matrix of normal and transformed hepatocytes. Exp
Cell Res 316, 992-1001.
19.
Barboro, P., Repaci, E., D'Arrigo, C., and Balbi, C. (2012). The role of nuclear matrix
proteins binding to matrix attachment regions (Mars) in prostate cancer cell differentiation.
PLoS One 7, e40617.
20.
Bartkuhn, M., and Renkawitz, R. (2008). Long range chromatin interactions involved in
gene regulation. Biochim Biophys Acta 1783, 2161-2166.
21.
Bartlett, J., Blagojevic, J., Carter, D., Eskiw, C., Fromaget, M., Job, C., Shamsher, M.,
Trindade, I.F., Xu, M., and Cook, P.R. (2006). Specialized transcription factories. Biochem Soc
Symp, 67-75.
22.
Bashaw, J.M., and Yates, J.L. (2001). Replication from oriP of Epstein-Barr virus
requires exact spacing of two bound dimers of EBNA1 which bend DNA. J Virol 75, 1060310611.
23.
Bau, D., Sanyal, A., Lajoie, B.R., Capriotti, E., Byron, M., Lawrence, J.B., Dekker, J.,
and Marti-Renom, M.A. (2011). The three-dimensional folding of the alpha-globin gene
domain reveals formation of chromatin globules. Nat Struct Mol Biol 18, 107-114.
24.
Bazett-Jones, D.P., Mendez, E., Czarnota, G.J., Ottensmeyer, F.P., and Allfrey, V.G.
(1996). Visualization and analysis of unfolded nucleosomes associated with transcribing
chromatin. Nucleic Acids Res 24, 321-329.
25.
Bednar, J., Horowitz, R.A., Dubochet, J., and Woodcock, C.L. (1995). Chromatin
conformation and salt-induced compaction: three-dimensional structural information from
cryoelectron microscopy. J Cell Biol 131, 1365-1376.
311
26.
Belin, B.J., and Mullins, R.D. (2013). What we talk about when we talk about nuclear
actin. Nucleus 4, 291-297.
27.
Bell, A.C., West, A.G., and Felsenfeld, G. (1999). The protein CTCF is required for the
enhancer-blocking activity of vertebrate insulators. Cell 98, 387-396.
28.
Belmont, A.S., Hu, Y., Sinclair, P.B., Wu, W., Bian, Q., and Kireev, I. (2010). Insights
into interphase large-scale chromatin structure from analysis of engineered chromosome
regions. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 75, 453-460.
29.
Belton, J.M., McCord, R.P., Gibcus, J.H., Naumova, N., Zhan, Y., and Dekker, J. (2012).
Hi-C: a comprehensive technique to capture the conformation of genomes. Methods 58, 268276.
30.
Benham, C., Kohwi-Shigematsu, T., and Bode, J. (1997). Stress-induced duplex DNA
destabilization in scaffold/matrix attachment regions. J Mol Biol 274, 181-196.
31.
Berezney, R. (2002). Regulating the mammalian genome: the role of nuclear architecture.
Adv Enzyme Regul 42, 39-52.
32.
Berezney, R., and Coffey, D.S. (1977). Nuclear matrix: isolation and characterization of a
framework structure from rat liver nuclei. J Cell Biol 73, 616-637.
33.
Berezney, R., Mortillaro, M.J., Ma, H., Wei, X., and Samarabandu, J. (1995). The nuclear
matrix: a structural milieu for genomic function. Int Rev Cytol 162A, 1-65.
34.
Berlivet, S., Paquette, D., Dumouchel, A., Langlais, D., Dostie, J., and Kmita, M. (2013).
Clustering of tissue-specific sub-TADs accompanies the regulation of HoxA genes in
developing limbs. PLoS Genet 9, e1004018.
35.
Bernardi, R., and Pandolfi, P.P. (2007). Structure, dynamics and functions of
promyelocytic leukaemia nuclear bodies. Nat Rev Mol Cell Biol 8, 1006-1016.
36.
Besnard, E., Babled, A., Lapasset, L., Milhavet, O., Parrinello, H., Dantec, C., Marin,
J.M., and Lemaitre, J.M. (2012). Unraveling cell type-specific and reprogrammable human
312
replication origin signatures associated with G-quadruplex consensus motifs. Nat Struct Mol
Biol 19, 837-844.
37.
Beug, H., Doederlein, G., Freudenstrein, C., and Graf, T. (1979a). Erythroblast cell lines
transformed by a temperature sensitive mutant of avian erythroblastosis virus. A model system
to study erythroid differentiation in vitro. J Cell Physiol 1, 195-207.
38.
Beug, H., Von Kirchbach, A., Doderlin, J., Conscience, J.F., and Graf, T. (1979b).
Chicken hematopoietic cells transformed by seven strains of defective avian leukemia viruses
display three distinct phenotypes of differentiation. Cell 18, 375-390.
39.
Bian, Q., and Belmont, A.S. (2012). Revisiting higher-order and large-scale chromatin
organization. Curr Opin Cell Biol 24, 359-366.
40.
Bianchi, M.E., and Agresti, A. (2005). HMG proteins: dynamic players in gene regulation
and differentiation. Curr Opin Genet Dev 15, 496-506.
41.
Bickmore, W.A. (2013). The spatial organization of the human genome. Annual review
of genomics and human genetics 14, 67-84.
42.
Bickmore, W.A., and van Steensel, B. (2013). Genome architecture: domain organization
of interphase chromosomes. Cell 152, 1270-1284.
43.
Biggin, M.D. (2011). Animal transcription networks as highly connected, quantitative
continua. Dev Cell 21, 611-626.
44.
Birnbaum, R.Y., Clowney, E.J., Agamy, O., Kim, M.J., Zhao, J., Yamanaka, T.,
Pappalardo, Z., Clarke, S.L., Wenger, A.M., Nguyen, L., et al. (2012). Coding exons function
as tissue-specific enhancers of nearby genes. Genome Res 22, 1059-1068.
45.
Blacketer, M.J., Feely, S.J., and Shogren-Knaak, M.A. (2010). Nucleosome interactions
and stability in an ordered nucleosome array model system. J Biol Chem 285, 34597-34607.
313
46.
Bode, J., Schlake, T., Rios-Ramirez, M., Mielke, C., Stengert, M., Kay, V., and Klehr-
Wirth,
D.
(1995).
Scaffold/matrix-attached
regions:
Structural
properties
creating
transcriptionally active loci. Int Rev Cytol 162A, 389-454.
47.
Bode, J., Schlake, T., Rios-Ramirez, M., Mielke, C., Stengert, M., Kay, V., and Klehr-
Wirth,
D.
(1995).
Scaffold/matrix-attached
regions:
Structural
properties
creating
transcriptionally active loci. Int Rev Cytol 162A, 389-454.
48.
Bohn, M., and Heermann, D.W. (2010). Diffusion-driven looping provides a consistent
framework for chromatin organization. PLoS One 5, e12218.
49.
Boros, I.M. (2012). Histone modification in Drosophila. Brief Funct Genomics 11, 319-
331.
50.
Boyle, A.P., and Furey, T.S. (2009). High-resolution mapping studies of chromatin and
gene regulatory elements. Epigenomics 1, 319-329.
51.
Boyle, A.P., Song, L., Lee, B.K., London, D., Keefe, D., Birney, E., Iyer, V.R.,
Crawford, G.E., and Furey, T.S. (2011). High-resolution genome-wide in vivo footprinting of
diverse transcription factors in human cells. Genome Res 21, 456-464.
52.
Boyle, S., Gilchrist, S., Bridger, J.M., Mahy, N.L., Ellis, J.A., and Bickmore, W.A.
(2001). The spatial organization of human chromosomes within the nuclei of normal and
emerin-mutant cells. Human Mol Genet 10, 211-219.
53.
Bregman, D.B., Du, L., van der Zee, S., and Warren, S.L. (1995). Transcription-
dependent redistribution of the large subunit of RNA polymerase II to discrete nuclear
domains. J Cell Biol 129, 287-298.
54.
Bridger, J.M. (2011). Chromobility: the rapid movement of chromosomes in interphase
nuclei. Biochem Soc Trans 39, 1747-1751.
314
55.
Brown, J.M., Green, J., das Neves, R.P., Wallace, H.A., Smith, A.J., Hughes, J., Gray, N.,
Taylor, S., Wood, W.G., Higgs, D.R., et al. (2008). Association between active genes occurs at
nuclear speckles and is modulated by chromatin environment. J Cell Biol 182, 1083-1097.
56.
Brown, K. (1999). Nuclear structure, gene expression and development. Crit Rev
Eukaryot Gene Expr 9, 203-212.
57.
Bruns, G.A., and Ingram, V.M. (1973). Erythropoiesis in the developing chick embryo.
Dev Biol 30, 455-459.
58.
Bulger, M., and Groudine, M. (1999). Looping versus linking: toward a model of long
distance gene activation. Genes Dev 13, 2465-2477.
59.
Bulger, M., and Groudine, M. (2010). Functional and mechanistic diversity of distal
transcription enhancers. Cell 144, 327-339.
60.
Bulger, M., Schubeler, D., Bender, M.A., Hamilton, J., Farrell, C.M., Hardison, R.C., and
Groudine, M. (2003). A complex chromatin landscape revealed by patterns of nuclease
sensitivity and histone modification within the mouse beta-globin locus. Mol Cell Biol 23,
5234-5244.
61.
Burd, C.J., and Archer, T.K. (2013). Chromatin architecture defines the glucocorticoid
response. Molecular and cellular endocrinology 380, 25-31.
62.
Burgess-Beusse, B., Farrell, C., Gaszner, M., Litt, M., Mutskov, V., Recillas-Targa, F.,
Simpson, M., West, A., and Felsenfeld, G. (2002). The insulation of genes from external
enhancers and silencing chromatin. Proc Natl Acad Sci USA in press.
63.
Burke, B., and Stewart, C.L. (2013). The nuclear lamins: flexibility in function. Nat Rev
Mol Cell Biol 14, 13-24.
64.
Burkham, J., Coen, D.M., and Weller, S.K. (1998). ND10 protein PML is recruited to
herpes simplex virus type 1 prereplicative sites and replication compartments in the presence of
viral DNA polymerase. J Virol 72, 10100-10107.
315
65.
Burnecki, K., Kepten, E., Janczura, J., Bronshtein, I., Garini, Y., and Weron, A. (2012).
Universal algorithm for identification of fractional Brownian motion. A case of telomere
subdiffusion. Biophys J 103, 1839-1847.
66.
Byrd, K., and Corces, G. (2003). Visualisation of chromatin domains created by the
gypsy insulator of Drosophila. J Cell Biol 162, 565-574.
67.
Caddle, M.S., Dailey, L., and Heintz, N.H. (1990). RIP60, a mammalian origin-binding
protein, enhances DNA bending near the dihydrofolate reductase origin of replication. Mol Cell
Biol 10, 6236-6243.
68.
Cagliero, C., Grand, R.S., Jones, M.B., Jin, D.J., and O'Sullivan, J.M. (2013). Genome
conformation capture reveals that the Escherichia coli chromosome is organized by replication
and transcription. Nucleic Acids Res 41, 6058-6071.
69.
Cai, S., Han, H.J., and Kohwi-Shigematsu, T. (2003). Tissue-specific nuclear architecture
and gene expression regulated by SATB1. Nat Genet 34, 42-51.
70.
Cai, S., Lee, C.C., and Kohwi-Shigematsu, T. (2006). SATB1 packages densely looped,
transcriptionally active chromatin for coordinated expression of cytokine genes. Nat Genet 38,
1278-1288.
71.
Cairns, B.R. (2009). The logic of chromatin architecture and remodelling at promoters.
Nature 461, 193-198.
72.
Calo, E., and Wysocka, J. (2013). Modification of enhancer chromatin: what, how, and
why? Mol CeLL 49, 825-837.
73.
Campos, E.I., and Reinberg, D. (2009). Histones: annotating chromatin. Annu Rev Genet
43, 559-599.
74.
Carmo-Fonseca, M., and Rino, J. (2011). RNA seeds nuclear bodies. Nat Cell Biol 13,
110-112.
316
75.
Carter, D.R., Eskiw, C., and Cook, P.R. (2008). Transcription factories. Biochem Soc
Trans 36, 585-589.
76.
Carvalho, T., Almeida, F., Calapez, A., Lafarga, M., Berciano, M.T., and Carmo-
Fonseca, M. (1999). The spinal muscular atrophy disease gene product, SMN: A link between
snRNP biogenesis and the Cajal (coiled) body. J Cell Biol 147, 715-728.
77.
Caslini, C., Alarcon, A.S., Hess, J.L., Tanaka, R., Murti, K.G., and Biondi, A. (2000).
The amino terminus targets the mixed lineage leukemia (MLL) protein to the nucleolus, nuclear
matrix and mitotic chromosomal scaffolds. Leukemia 14, 1898-1908.
78.
Caudron-Herger, M., and Rippe, K. (2012). Nuclear architecture by RNA. Curr Opin
Genet Dev 22, 179-187.
79.
Cavalli, G. (2014). Chromosomes: now in 3D! Nat Rev Mol Cell Biol 15, 6.
80.
Cavalli, G., and Misteli, T. (2013). Functional implications of genome topology. Nat
Struct Mol Biol 20, 290-299.
81.
Cayrou, C., Coulombe, P., Puy, A., Rialle, S., Kaplan, N., Segal, E., and Mechali, M.
(2012). New insights into replication origin characteristics in metazoans. Cell Cycle 11, 658667.
82.
Cayrou, C., Coulombe, P., Vigneron, A., Stanojcic, S., Ganier, O., Peiffer, I., Rivals, E.,
Puy, A., Laurent-Chabalier, S., Desprat, R., et al. (2011). Genome-scale analysis of metazoan
replication origins reveals their organization in specific but flexible sites defined by conserved
features. Genome Res 21, 1438-1449.
83.
Chandra, T., Ewels, P.A., Schoenfelder, S., Furlan-Magaril, M., Wingett, S.W.,
Kirschner, K., Thuret, J.Y., Andrews, S., Fraser, P., and Reik, W. (2015). Global reorganization
of the nuclear landscape in senescent cells. Cell reports 10, 471-483.
317
84.
Chatterjee, N., Sinha, D., Lemma-Dechassa, M., Tan, S., Shogren-Knaak, M.A., and
Bartholomew, B. (2011). Histone H3 tail acetylation modulates ATP-dependent remodeling
through multiple mechanisms. Nucleic Acids Res 39, 8378-8391.
85.
Chen, L., and Widom, J. (2005). Mechanism of transcriptional silencing in yeast. Cell
120, 37-48.
86.
Chen, R.A., Down, T.A., Stempor, P., Chen, Q.B., Egelhofer, T.A., Hillier, L.W., Jeffers,
T.E., and Ahringer, J. (2013). The landscape of RNA polymerase II transcription initiation in
C. elegans reveals promoter and enhancer architectures. Genome Res 23, 1339-1347.
87.
Chepelev, I., Wei, G., Wangsa, D., Tang, Q., and Zhao, K. (2012). Characterization of
genome-wide enhancer-promoter interactions reveals co-expression of interacting genes and
modes of higher order chromatin organization. Cell Res 22, 490-503.
88.
Chetverin, A.B., and Chetverina, H.V. (2008). Molecular colony technique: a new tool
for biomedical research and clinical practice. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 82, 219-255.
89.
Chetverina, H.V., Samatov, T.R., Ugarov, V.I., and Chetverin, A.B. (2002). Molecular
colony diagnostics: detection and quantitation of viral nucleic acids by in-gel PCR.
Biotechniques 33, 150-152, 154, 156.
90.
Cho, E.J., and Kim, J.S. (2012). Crowding effects on the formation and maintenance of
nuclear bodies: insights from molecular-dynamics simulations of simple spherical model
particles. Biophys J 103, 424-433.
91.
Choi, O., and Engel, J.D. (1986). A 3' enhancer is required for temporal and tissue-
specific transcriptional activation of the chicken adult b-globin gene. Nature 323, 731-734.
92.
Chuang, C.H., Carpenter, A.E., Fuchsova, B., Johnson, T., de Lanerolle, P., and Belmont,
A.S. (2006). Long-range directional movement of an interphase chromosome site. Curr Biol 16,
825-831.
318
93.
Chung, J.H., Whiteley, M., and Felsenfeld, G. (1993). A 5' element of the chicken beta-
globin domain serves as an insulator in human erythroid cells and protects against position
effect in Drosophila. Cell 74, 505-514.
94.
Clapier, C.R., and Cairns, B.R. (2009). The biology of chromatin remodeling complexes.
Annu Rev Biochem 78, 273-304.
95.
Clemson, C.M., Hutchinson, J.N., Sara, S.A., Ensminger, A.W., Fox, A.H., Chess, A.,
and Lawrence, J.B. (2009). An architectural role for a nuclear noncoding RNA: NEAT1 RNA
is essential for the structure of paraspeckles. Mol CeLL 33, 717-726.
96.
Cockerill, P.N., and Garrard, W.T. (1986). Chromosomal loop anchorage of the kappa
immunoglobulin gene occurs next to the nenhancer in a region containing topoisomerase II
sites. Cell 44, 273-282.
97.
Cockerill, P.N., and Garrard, W.T. (1986). Chromosomal loop anchorage sites appear to
be evolutionary conserved. FEBS Lett 204, 5-7.
98.
Comet, I., Savitskaya, E., Schuettengruber, B., Negre, N., Lavrov, S., Parshikov, A.,
Juge, F., Gracheva, E., Georgiev, P., and Cavalli, G. (2006). PRE-mediated bypass of two
Su(Hw) insulators targets PcG proteins to a downstream promoter. Dev Cell 11, 117-124.
99.
Comet, I., Schuettengruber, B., Sexton, T., and Cavalli, G. (2011). A chromatin insulator
driving three-dimensional Polycomb response element (PRE) contacts and Polycomb
association with the chromatin fiber. Proc Natl Acad Sci U S A 108, 2294-2299.
100.
Consortium, E.P. (2012). An integrated encyclopedia of DNA elements in the human
genome. Nature 489, 57-74.
101.
Cook, P.R. (1999). The organization of replication and transcription. Science 284, 1790-
1795.
102.
Cook, P.R. (2010). A model for all genomes: the role of transcription factories. J Mol
Biol 395, 1-10.
319
103.
Cook, P.R., and Brazell, I.A. (1980). Mapping sequences in loops of nuclear DNA by
their progressive detachment from the nuclear cage. Nucleic Acids Research 8, 2895-2907.
104.
Cook, P.R., and Marenduzzo, D. (2009). Entropic organization of interphase
chromosomes. J Cell Biol 186, 825-834.
105.
Cook, P.R., Brazell, I.A., and Jost, E. (1976). Characterization of nuclear structures
containing superhelical DNA. J Cell Sci 22, 303-324.
106.
Cremer, T., and Cremer, C. (2001). Chromosome territories, nuclear architecture and
gene regulation in mammalian cells. Nat Rev Genet 2, 292-301.
107.
Cremer, T., and Cremer, M. (2010). Chromosome territories. Cold Spring Harb Perspect
Biol 2, a003889.
108.
Cremer, T., Cremer, C., Schneider, T., Baumann, H., Hens, L., and Kirsch-Volders, M.
(1982). Analysis of chromosome positions in the interphase nucleus of Chinese hamster cells
by laser-UV-microirradiation experiments. Hum Genet 62, 201-209.
109.
Cremer, T., Cremer, M., Dietzel, S., Muller, S., Solovei, I., and Fakan, S. (2006).
Chromosome territories--a functional nuclear landscape. Curr Opin Cell Biol 18, 307-316.
110.
Cremer, T., Kurz, A., Zirbel, R., Dietzel, S., Rinke, B., Schrock, E., Speicher, M.R.,
Mathieu, U., Jauch, A., Emmerich, P., et al. (1993). Role of chromosome territories in the
functional compartmentalization of the cell nucleus. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 58,
777-792.
111.
Cremer, T., Lichter, P., Borden, J., Ward, D.C., and Manuelidis, L. (1988). Detection of
chromosome aberrations in metaphase and interphase tumor cells by in situ hybridization using
chromosome-specific library probes. Hum Genet 80, 235-246.
112.
Cress, W.D., and Nevins, J.R. (1996). A role for a bent DNA structure in E2F-mediated
transcription activation. Mol Cell Biol 16, 2119-2127.
320
113.
Creyghton, M.P., Cheng, A.W., Welstead, G.G., Kooistra, T., Carey, B.W., Steine, E.J.,
Hanna, J., Lodato, M.A., Frampton, G.M., Sharp, P.A., et al. (2010). Histone H3K27ac
separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Natl Acad Sci U
S A 107, 21931-21936.
114.
Cristofari, G., Adolf, E., Reichenbach, P., Sikora, K., Terns, R.M., Terns, M.P., and
Lingner, J. (2007). Human telomerase RNA accumulation in Cajal bodies facilitates telomerase
recruitment to telomeres and telomere elongation. Mol CeLL 27, 882-889.
115.
Croft, J.A., Bridger, J.M., Boyle, S., Perry, P., Teague, P., and Bickmore, W.A. (1999).
Differences in the localization and morphology of chromosomes in the human nucleus. J Cell
Biol 145, 1119-1131.
116.
Cross, A.J., Jeffries, C.M., Trewhella, J., and Matthews, J.M. (2010). LIM domain
binding proteins 1 and 2 have different oligomeric states. J Mol Biol 399, 133-144.
117.
Cseresnyes, Z., Schwarz, U., and Green, C.M. (2009). Analysis of replication factories in
human cells by super-resolution light microscopy. BMC Cell Biol 10, 88.
118.
Cullen, K.E., Kladde, M.P., and Seyfred, M.A. (1993). Interaction between transcription
regulatory regions of prolactin chromatin. Science 261, 203-206.
119.
Czarnota, G.J., Bazett-Jones, D.P., Mendez, E., Allfrey, V.G., and Ottensmeyer, F.P.
(1997). High resolution microanalysis and three-dimensional nucleosome structure associated
with transcribing chromatin. Micron 28, 419-431.
120.
Davey, C.A., Sargent, D.F., Luger, K., Maeder, A.W., and Richmond, T.J. (2002).
Solvent mediated interactions in the structure of the nucleosome core particle at 1.9 a
resolution. J Mol Biol 319, 1097-1113.
121.
de Laat, W., and Grosveld, F. (2003). Spatial organization of gene expression: the active
chromatin hub. Chromosome Res 11, 447-459.
321
122.
de Laat, W., Klous, P., Kooren, J., Noordermeer, D., Palstra, R.J., Simonis, M., Splinter,
E., and Grosveld, F. (2008). Three-dimensional organization of gene expression in erythroid
cells. Curr Top Dev Biol 82, 117-139.
123.
De Santa, F., Barozzi, I., Mietton, F., Ghisletti, S., Polletti, S., Tusi, B.K., Muller, H.,
Ragoussis, J., Wei, C.L., and Natoli, G. (2010). A large fraction of extragenic RNA pol II
transcription sites overlap enhancers. PLoS Biol 8, e1000384.
124.
de Wit, E., and de Laat, W. (2012). A decade of 3C technologies: insights into nuclear
organization. Genes Dev 26, 11-24.
125.
Deaton, A.M., and Bird, A. (2011). CpG islands and the regulation of transcription.
Genes Dev 25, 1010-1022.
126.
Dechat, T., Gesson, K., and Foisner, R. (2010). Lamina-independent lamins in the nuclear
interior serve important functions. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 75, 533-543.
127.
Dekker, J. (2006). The three 'C' s of chromosome conformation capture: controls,
controls, controls. Nat Methods 3, 17-21.
128.
Dekker, J. (2014). Two ways to fold the genome during the cell cycle: insights obtained
with chromosome conformation capture. Epigenetics Chromatin 7, 25.
129.
Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., and Kleckner, N. (2002a). Capturing chromosome
conformation. Science 295, 1306-1311.
130.
Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., and Kleckner, N. (2002b). Capturing chromosome
conformation. Science 295, 1306-1311.
131.
Dellaire, G., and Bazett-Jones, D.P. (2004). PML nuclear bodies: dynamic sensors of
DNA damage and cellular stress. BioEssays 26, 963-977.
132.
Dellaire, G., Ching, R.W., Ahmed, K., Jalali, F., Tse, K.C., Bristow, R.G., and Bazett-
Jones, D.P. (2006). Promyelocytic leukemia nuclear bodies behave as DNA damage sensors
322
whose response to DNA double-strand breaks is regulated by NBS1 and the kinases ATM,
Chk2, and ATR. J Cell Biol 175, 55-66.
133.
Deng, B., Melnik, S., and Cook, P.R. (2013). Transcription factories, chromatin loops,
and the dysregulation of gene expression in malignancy. Semin Cancer Biol 23, 65-71.
134.
Deng, W., Lee, J., Wang, H., Miller, J., Reik, A., Gregory, P.D., Dean, A., and Blobel,
G.A. (2012). Controlling long-range genomic interactions at a native locus by targeted
tethering of a looping factor. Cell 149, 1233-1244.
135.
Deng, W., Rupon, J.W., Krivega, I., Breda, L., Motta, I., Jahn, K.S., Reik, A., Gregory,
P.D., Rivella, S., Dean, A., et al. (2014). Reactivation of developmentally silenced globin genes
by forced chromatin looping. Cell 158, 849-860.
136.
Depken, M., and Schiessel, H. (2009). Nucleosome shape dictates chromatin fiber
structure. Biophys J 96, 777-784.
137.
Deryusheva, S., and Gall, J.G. (2009). Small Cajal body-specific RNAs of Drosophila
function in the absence of Cajal bodies. Mol Biol Cell 20, 5250-5259.
138.
Dickinson, L.A., and Kohwi-Shigematsu, T. (1995). Nucleolin is a matrix attachment
region DNA-binding protein that specifically recognizes a region with high base-unpairing
potential. Mol Cell Biol 15, 456-465.
139.
Diesinger, P.M., Kunkel, S., Langowski, J., and Heermann, D.W. (2010). Histone
depletion facilitates chromatin loops on the kilobasepair scale. Biophys J 99, 2995-3001.
140.
Dillon, N., and Sabbatini, P. (2000). Functional gene expression domains: defining the
functional units of eukaryotic gene regulation. BioEssays 22, 657-665.
141.
Dixon, J.R., Selvaraj, S., Yue, F., Kim, A., Li, Y., Shen, Y., Hu, M., Liu, J.S., and Ren,
B. (2012). Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin
interactions. Nature 485, 376-380.
323
142.
Dorier, J., and Stasiak, A. (2009). Topological origins of chromosomal territories.
Nucleic Acids Res 37, 6316-6322.
143.
Dorigo, B., Schalch, T., Kulangara, A., Duda, S., Schroeder, R.R., and Richmond, T.J.
(2004). Nucleosome arrays reveal the two-start organization of the chromatin fiber. Science
306, 1571-1573.
144.
Dorman, E.R., Bushey, A.M., and Corces, V.G. (2007). The role of insulator elements in
large-scale chromatin structure in interphase. Semin Cell Dev Biol 18, 682-690.
145.
Dostie, J., Lejbkowicz, F., and Sonenberg, N. (2000). Nuclear eukaryotic initiation factor
4E (eIF4E) colocalizes with splicing factors in speckles. J Cell Biol 148, 239-247.
146.
Dostie, J., Richmond, T.A., Arnaout, R.A., Selzer, R.R., Lee, W.L., Honan, T.A., Rubio,
E.D., Krumm, A., Lamb, J., Nusbaum, C., et al. (2006). Chromosome Conformation Capture
Carbon Copy (5C): a massively parallel solution for mapping interactions between genomic
elements. Genome Res 16, 1299-1309.
147.
Douglas, M.P., and Rogers, S.O. (1998). DNA damage caused by common cytological
fixatives. Mutat Res 401, 77-88.
148.
du Preez, L.L., and Patterton, H.G. (2012). Secondary Structures of the Core Histone N-
terminal Tails: Their Role in Regulating Chromatin Structure. Subcell Biochem 61, 37-55.
149.
Duan, Z., Andronescu, M., Schutz, K., McIlwain, S., Kim, Y.J., Lee, C., Shendure, J.,
Fields, S., Blau, C.A., and Noble, W.S. (2011). A three-dimensional model of the yeast
genome. Nature 465, 363-367.
150.
Dundr, M. (2011). Seed and grow: a two-step model for nuclear body biogenesis. J Cell
Biol 193, 605-606.
151.
Dundr, M. (2012). Nuclear bodies: multifunctional companions of the genome. Curr Opin
Cell Biol 24, 415-422.
324
152.
Dundr, M., Ospina, J.K., Sung, M.H., John, S., Upender, M., Ried, T., Hager, G.L., and
Matera, A.G. (2007). Actin-dependent intranuclear repositioning of an active gene locus in
vivo. J Cell Biol 179, 1095-1103.
153.
Dunn, K.L., Zhao, H., and Davie, J.R. (2003). The insulator binding protein CTCF
associates with the nuclear matrix. Exp Cell Res 288, 218-223.
154.
Eijkelenboom, A., Mokry, M., de Wit, E., Smits, L.M., Polderman, P.E., van Triest,
M.H., van Boxtel, R., Schulze, A., de Laat, W., Cuppen, E., et al. (2013). Genome-wide
analysis of FOXO3 mediated transcription regulation through RNA polymerase II profiling.
Molecular systems biology 9, 638.
155.
Eisenberg, E., and Levanon, E.Y. (2013). Human housekeeping genes, revisited. Trends
Genet 29, 569-574.
156.
Elcock, L.S., and Bridger, J.M. (2008). Exploring the effects of a dysfunctional nuclear
matrix. Biochem Soc Trans 36, 1378-1383.
157.
Elgin, S.C. (1981). DNAase I-hypersensitive sites of chromatin. Cell 27, 413-415.
158.
Ellis, R.J. (2001). Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends
Biochem Sci 26, 597-604.
159.
Eltsov, M., Maclellan, K.M., Maeshima, K., Frangakis, A.S., and Dubochet, J. (2008).
Analysis of cryo-electron microscopy images does not support the existence of 30-nm
chromatin fibers in mitotic chromosomes in situ. Proc Natl Acad Sci U S A 105, 19732-19737.
160.
Emerson, B.M., Nickol, J.M., Jackson, P.D., and Felsenfeld, G. (1987). Analysis of the
tissue-specific enhancer at the 3' end of the chicken adult beta-globin gene. Proc Natl Acad Sci
U S A 84, 4786-4790.
161.
Engel, N., Raval, A.K., Thorvaldsen, J.L., and Bartolomei, S.M. (2008). Three-
dimensional conformation at the H19/Igf2 locus supports a model of enhancer tracking. Hum
Mol Genet 17, 3021-3029.
325
162.
Ernst, J., and Kellis, M. (2010). Discovery and characterization of chromatin states for
systematic annotation of the human genome. Nat Biotechnol 28, 817-825.
163.
Eskeland, R., Leeb, M., Grimes, G.R., Kress, C., Boyle, S., Sproul, D., Gilbert, N., Fan,
Y., Skoultchi, A.I., Wutz, A., et al. (2010). Ring1B compacts chromatin structure and represses
gene expression independent of histone ubiquitination. Mol CeLL 38, 452-464.
164.
Eskiw, C.H., Dellaire, G., Mymryk, J.S., and Bazett-Jones, D.P. (2003). Size, position
and dynamic behavior of PML nuclear bodies following cell stress as a paradigm for
supramolecular trafficking and assembly. J Cell Sci 116, 4455-4466.
165.
Essien, K., Vigneau, S., Apreleva, S., Singh, L.N., Bartolomei, M.S., and Hannenhalli, S.
(2009). CTCF binding site classes exhibit distinct evolutionary, genomic, epigenomic and
transcriptomic features. Genome Biol 10, R131.
166.
Ethier, S.D., Miura, H., and Dostie, J. (2012). Discovering genome regulation with 3C
and 3C-related technologies. Biochim Biophys Acta 1819, 401-410.
167.
Fackelmayer, F.O., Dahm, K., Renz, A., Ramsperger, U., and Richter, A. (1994).
Nucleic-acid-binding properties of hnRNP-U/SAF-A, a nuclear-matrix protein which binds
DNA and RNA in vivo and in vitro. Eur J Biochem 221, 749-757.
168.
Fakan, S., and van Driel, R. (2007). The perichromatin region: a functional compartment
in the nucleus that determines large-scale chromatin folding. Semin Cell Dev Biol 18, 676-681.
169.
Fan, J.Y., Rangasamy, D., Luger, K., and Tremethick, D.J. (2004). H2A.Z alters the
nucleosome surface to promote HP1alpha-mediated chromatin fiber folding. Mol CeLL 16,
655-661.
170.
Faro-Trindade, I., and Cook, P.R. (2006). Transcription factories: structures conserved
during differentiation and evolution. Biochem Soc Trans 34, 1133-1137.
171.
Fascher, K.D., Schmitz, J., and Horz, W. (1990). Role of trans-activating proteins in the
generation of active chromatin at the PHO5 promoter in S. cerevisiae. EMBO J 9, 2523-2528.
326
172.
Felsenfeld, G., Boyes, J., Chung, J., Clark, D., and Studitsky, V. (1996). Chromatin
structure and gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A 93, 9384-9388.
173.
Feng, S., Cokus, S.J., Schubert, V., Zhai, J., Pellegrini, M., and Jacobsen, S.E. (2014).
Genome-wide Hi-C Analyses in Wild-Type and Mutants Reveal High-Resolution Chromatin
Interactions in Arabidopsis. Mol CeLL.
174.
Ferreira, H., Flaus, A., and Owen-Hughes, T. (2007). Histone modifications influence the
action of Snf2 family remodelling enzymes by different mechanisms. J Mol Biol 374, 563-579.
175.
Ficz, G., Heintzmann, R., and Arndt-Jovin, D.J. (2005). Polycomb group protein
complexes exchange rapidly in living Drosophila. Development 132, 3963-3976.
176.
Filion, G.J., van Bemmel, J.G., Braunschweig, U., Talhout, W., Kind, J., Ward, L.D.,
Brugman, W., de Castro, I.J., Kerkhoven, R.M., Bussemaker, H.J., et al. (2010). Systematic
protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells. Cell 143,
212-224.
177.
Finan, K., Cook, P.R., and Marenduzzo, D. (2011). Non-specific (entropic) forces as
major determinants of the structure of mammalian chromosomes. Chromosome Res 19, 53-61.
178.
Finch, J.T., and Klug, A. (1976). Solenoidal model for superstructure in chromatin. Proc
Natl Acad Sci U S A 73, 1897-1901.
179.
Finlan, L.E., Sproul, D., Thomson, I., Boyle, S., Kerr, E., Perry, P., Ylstra, B., Chubb,
J.R., and Bickmore, W.A. (2008). Recruitment to the nuclear periphery can alter expression of
genes in human cells. PLoS Genet 4, e1000039.
180.
Flint, J., Tufarelli, C., Peden, J., Clark, K., Daniels, R.J., Hardison, R., Miller, W.,
Philipsen, S., Tan-Un, K.C., McMorrow, T., et al. (2001). Comparative genome analysis
delimits a chromosomal domain and identifies key regulatory elements in the alpha globin
cluster. Hum Mol Genet 10, 371-382.
327
181.
Fox, M.H., Arndt-Jovin, D.J., Jovin, T.M., Baumann, P.H., and Robert-Nicoud, M.
(1991). Spatial and temporal distribution of DNA replication sites localized by
immunofluorescence and confocal microscopy in mouse fibroblasts. J Cell Sci 99 ( Pt 2), 247253.
182.
Frey, M.R., Bailey, A.D., Weiner, A.M., and Matera, A.G. (1999). Association of snRNA
genes with coiled bodies is mediated by nascent snRNA transcripts. Curr Biol 9, 126-135.
183.
Fujita, M., Ishimi, Y., Nakamura, H., Kiyono, T., and Tsurumi, T. (2002). Nuclear
organization of DNA replication initiation proteins in Mammalian cells. J Biol Chem 277,
10354-10361.
184.
Fujita, N., and Wade, P.A. (2004). Use of bifunctional cross-linking reagents in mapping
genomic distribution of chromatin remodeling complexes. Methods 33, 81-85.
185.
Fullwood, M.J., and Ruan, Y. (2009). ChIP-based methods for the identification of long-
range chromatin interactions. J Cell Biochem 107, 30-39.
186.
Fullwood, M.J., Liu, M.H., Pan, Y.F., Liu, J., Xu, H., Mohamed, Y.B., Orlov, Y.L.,
Velkov, S., Ho, A., Mei, P.H., et al. (2009). An oestrogen-receptor-alpha-bound human
chromatin interactome. Nature 462, 58-64.
187.
Fussner, E., Strauss, M., Djuric, U., Li, R., Ahmed, K., Hart, M., Ellis, J., and Bazett-
Jones, D.P. (2012). Open and closed domains in the mouse genome are configured as 10-nm
chromatin fibres. EMBO Rep 13, 992-996.
188.
Gan, L., Ladinsky, M.S., and Jensen, G.J. (2013). Chromatin in a marine picoeukaryote is
a disordered assemblage of nucleosomes. Chromosoma 122, 377-386.
189.
Gardiner-Garden, M., and Frommer, M. (1987). CpG islands in vertebrate genomes. J
Mol Biol 196, 261-282.
190.
Gardner, K.E., Allis, C.D., and Strahl, B.D. (2011). Operating on chromatin, a colorful
language where context matters. J Mol Biol 409, 36-46.
328
191.
Gavrilov, A.A., and Razin, S.V. (2008). Spatial configuration of the chicken {alpha}-
globin gene domain: immature and active chromatin hubs. Nucleic Acids Res 36, 4629-4640.
192.
Gerasimova, T.I., and Corces, V.G. (1998). Polycomb and trithorax group proteins
mediate the function of a chromatin insulator. Cell 92, 511-521.
193.
Gerasimova, T.I., Byrd, K., and Corces, V.G. (2000). A chromatin insulator determines
the nuclear localization of DNA. Mol Cell 6, 1025-1035.
194.
Gerstein, M.B., Lu, Z.J., Van Nostrand, E.L., Cheng, C., Arshinoff, B.I., Liu, T., Yip,
K.Y., Robilotto, R., Rechtsteiner, A., Ikegami, K., et al. (2010). Integrative analysis of the
Caenorhabditis elegans genome by the modENCODE project. Science 330, 1775-1787.
195.
Getzenberg, R.H., Pienta, K.J., Ward, W.S., and Coffey, D.S. (1991). Nuclear structure
and the three-dimensional organization of DNA. Journal of Cellular Biochemistry 47, 289-299.
196.
Ghavi-Helm, Y., Klein, F.A., Pakozdi, T., Ciglar, L., Noordermeer, D., Huber, W., and
Furlong, E.E. (2014). Enhancer loops appear stable during development and are associated with
paused polymerase. Nature 512, 96-100.
197.
Ghirlando, R., and Felsenfeld, G. (2013). Chromatin structure outside and inside the
nucleus. Biopolymers 99, 225-232.
198.
Gibcus, J.H., and Dekker, J. (2013). The hierarchy of the 3D genome. Mol CeLL 49, 773-
782.
199.
Goetze, S., Mateos-Langerak, J., Gierman, H.J., de Leeuw, W., Giromus, O., Indemans,
M.H., Koster, J., Ondrej, V., Versteeg, R., and van Driel, R. (2007). The three-dimensional
structure of human interphase chromosomes is related to the transcriptome map. Mol Cell Biol
27, 4475-4487.
200.
Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S.M., and Cox, E.C. (2005). Real-time kinetics of
gene activity in individual bacteria. Cell 123, 1025-1036.
329
201.
Goldsmith, M.E. (1981). Release of a globin gene enriched chromatin fraction from
chicken erythrocyte nuclei following DNase II digestion. Nucleic Acids Res 9, 6471-6485.
202.
Golovnin, A., Melnikova, L., Volkov, I., Kostuchenko, M., Galkin, A.V., and Georgiev,
P. (2008). 'Insulator bodies' are aggregates of proteins but not of insulators. EMBO Rep 9, 440445.
203.
Golovnin, A., Volkov, I., and Georgiev, P. (2012). SUMO conjugation is required for the
assembly of Drosophila Su(Hw) and Mod(mdg4) into insulator bodies that facilitate insulator
complex formation. J Cell Sci 125, 2064-2074.
204.
Gong, F., Sun, L., Wang, Z., Shi, J., Li, W., Wang, S., Han, X., and Sun, Y. (2011). The
BCL2 gene is regulated by a special AT-rich sequence binding protein 1-mediated long range
chromosomal interaction between the promoter and the distal element located within the 3'UTR. Nucleic Acids Res 39, 4640-4652.
205.
Gorisch, S.M., Lichter, P., and Rippe, K. (2005). Mobility of multi-subunit complexes in
the nucleus: accessibility and dynamics of chromatin subcompartments. Histochem Cell Biol
123, 217-228.
206.
Gorisch, S.M., Wachsmuth, M., Ittrich, C., Bacher, C.P., Rippe, K., and Lichter, P.
(2004). Nuclear body movement is determined by chromatin accessibility and dynamics. Proc
Natl Acad Sci U S A 101, 13221-13226.
207.
Gorkin, D.U., Leung, D., and Ren, B. (2014). The 3D genome in transcriptional
regulation and pluripotency. Cell stem cell 14, 762-775.
208.
Gothard, L.Q., Hibbard, J.C., and Seyfred, M.A. (1996). Estrogen-mediated induction of
rat prolactin gene transcription requires the formation of a chromatin loop between the distal
enhancer and proximal promoter regions. Mol Endocrinol 10, 185-195.
330
209.
Gribnau, G., Diderich, K., Pruzina, S., Calzolari, R., and Frazer, P. (2000). Intergenic
transcription and developmental remodelling of chromatin subdomains in the human b-globin
locus. Mol CeLL 5, 377-386.
210.
Gribnau, J., de Boer, E., Trimborn, T., Wijgerde, M., Milot, E., Grosveld, F., and Fraser,
P. (1998). Chromatin interaction mechanism of transcriptional control in vivo. EMBO J 17,
6020-6027.
211.
Grigoryev, S.A., and Woodcock, C.L. (2012). Chromatin organization - the 30 nm fiber.
Exp Cell Res 318, 1448-1455.
212.
Grigoryev, S.A., Arya, G., Correll, S., Woodcock, C.L., and Schlick, T. (2009). Evidence
for heteromorphic chromatin fibers from analysis of nucleosome interactions. Proc Natl Acad
Sci U S A 106, 13317-13322.
213.
Grimaud, C., Bantignies, F., Pal-Bhadra, M., Ghana, P., Bhadra, U., and Cavalli, G.
(2006). RNAi components are required for nuclear clustering of Polycomb group response
elements. Cell 124, 957-971.
214.
Grob, S., Schmid, M.W., and Grossniklaus, U. (2014). Hi-C analysis in Arabidopsis
identifies the KNOT, a structure with similarities to the flamenco locus of Drosophila. Mol
CeLL 55, 678-693.
215.
Gromova, II, Thomsen, B., and Razin, S.V. (1995). Different topoisomerase II antitumor
drugs direct similar specific long-range fragmentation of an amplified c-MYC gene locus in
living cells and in high-salt-extracted nuclei. Proc Natl Acad Sci U S A 92, 102-106.
216.
Gross, D.S., and Garrard, W.T. (1988). Nuclease hypersensitive sites in chromatin. Ann
Rev Biochem 57, 159-197.
217.
Groudine, M., and Weintraub, H. (1982). Propagation of globin DNAase I-hypersensitive
sites in absence of factors required for induction: a possible mechanism for determination. Cell
30, 131-139.
331
218.
Groudine, M., Holtzer, H., Scherrer, K., and Therwath, A. (1974). Lineage-dependent
transcription of globin genes. Cell 3, 243-247.
219.
Guelen, L., Pagie, L., Brasset, E., Meuleman, W., Faza, M.B., Talhout, W., Eussen, B.H.,
de Klein, A., Wessels, L., de Laat, W., et al. (2008). Domain organization of human
chromosomes revealed by mapping of nuclear lamina interactions. Nature 453, 948-951.
220.
Guerrero, G., Delgado-Olguin, P., Escamilla-Del-Arenal, M., Furlan-Magaril, M.,
Rebollar, E., De La Rosa-Velazquez, I.A., Soto-Reyes, E., Rincon-Arano, H., Valdes-Quezada,
C., Valadez-Graham, V., et al. (2007). Globin genes transcriptional switching, chromatin
structure and linked lessons to epigenetics in cancer: a comparative overview. Comp Biochem
Physiol A Mol Integr Physiol 147, 750-760.
221.
Guo, Y., Monahan, K., Wu, H., Gertz, J., Varley, K.E., Li, W., Myers, R.M., Maniatis,
T., and Wu, Q. (2012). CTCF/cohesin-mediated DNA looping is required for protocadherin
alpha promoter choice. Proc Natl Acad Sci U S A 109, 21081-21086.
222.
Gurudatta, B.V., and Corces, V.G. (2009). Chromatin insulators: lessons from the fly.
Brief Funct Genomic Proteomic 8, 276-282.
223.
Habermann, F.A., Cremer, M., Walter, J., Kreth, G., von Hase, J., Bauer, K., Wienberg,
J., Cremer, C., Cremer, T., and Solovei, I. (2001). Arrangements of macro- and
microchromosomes in chicken cells. Chromosome Res 9, 569-584.
224.
Hagege, H., Klous, P., Braem, C., Splinter, E., Dekker, J., Cathala, G., de Laat, W., and
Forne, T. (2007). Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3CqPCR). Nat Protoc 2, 1722-1733.
225.
Hajjoul, H., Mathon, J., Ranchon, H., Goiffon, I., Mozziconacci, J., Albert, B., Carrivain,
P., Victor, J.M., Gadal, O., Bystricky, K., et al. (2013). High-throughput chromatin motion
tracking in living yeast reveals the flexibility of the fiber throughout the genome. Genome Res
23, 1829-1838.
332
226.
Hakim, O., Sung, M.H., and Hager, G.L. (2010). 3D shortcuts to gene regulation. Curr
Opin Cell Biol 22, 305-313.
227.
Hakim, O., Sung, M.H., Voss, T.C., Splinter, E., John, S., Sabo, P.J., Thurman, R.E.,
Stamatoyannopoulos, J.A., de Laat, W., and Hager, G.L. (2011). Diverse gene reprogramming
events occur in the same spatial clusters of distal regulatory elements. Genome Res 21, 697706.
228.
Hall, L.L., Smith, K.P., Byron, M., and Lawrence, J.B. (2006). Molecular anatomy of a
speckle. The anatomical record Part A, Discoveries in molecular, cellular, and evolutionary
biology 288, 664-675.
229.
Hancock, R. (2000). A new look at the nuclear matrix. Chromosoma 109, 219-225.
230.
Hancock, R. (2004a). Internal organisation of the nucleus: assembly of compartments by
macromolecular crowding and the nuclear matrix model. Biol Cell 96, 595-601.
231.
Hancock, R. (2004b). A role for macromolecular crowding effects in the assembly and
function of compartments in the nucleus. J Struct Biol 146, 281-290.
232.
Hancock, R. (2008). Self-association of polynucleosome chains by macromolecular
crowding. European biophysics journal : EBJ 37, 1059-1064.
233.
Hancock, R. (2012). Structure of metaphase chromosomes: a role for effects of
macromolecular crowding. PLoS One 7, e36045.
234.
Hancock, R. (2014). The crowded nucleus. International review of cell and molecular
biology 307, 15-26.
235.
Hancock, R., and Hadj-Sahraoui, Y. (2009). Isolation of cell nuclei using inert
macromolecules to mimic the crowded cytoplasm. PLoS One 4, e7560.
236.
Hao le, T., Fuller, H.R., Lam le, T., Le, T.T., Burghes, A.H., and Morris, G.E. (2007).
Absence of gemin5 from SMN complexes in nuclear Cajal bodies. BMC Cell Biol 8, 28.
333
237.
Hartley, P.D., and Madhani, H.D. (2009). Mechanisms that specify promoter nucleosome
location and identity. Cell 137, 445-458.
238.
Hasegawa, Y., and Nakagawa, S. (2011). Revisiting the function of nuclear
scaffold/matrix binding proteins in X chromosome inactivation. RNA biology 8, 735-739.
239.
Hasegawa, Y., Brockdorff, N., Kawano, S., Tsutui, K., Tsutui, K., and Nakagawa, S.
(2010). The matrix protein hnRNP U is required for chromosomal localization of Xist RNA.
Dev Cell 19, 469-476.
240.
Hassan, A.B., and Cook, P.R. (1993). Visualization of replication sites in unfixed human
cells. J Cell Sci 105 ( Pt 2), 541-550.
241.
Hatzis, P., and Talianidis, I. (2002). Dynamics of enhancer-promoter communication
during differentiation-induced gene activation. Mol CeLL 10, 1467-1477.
242.
Hatzis, P., Kyrmizi, I., and Talianidis, I. (2006). Mitogen-activated protein kinase-
mediated disruption of enhancer-promoter communication inhibits hepatocyte nuclear factor
4alpha expression. Mol Cell Biol 26, 7017-7029.
243.
Heard, E., and Bickmore, W. (2007). The ins and outs of gene regulation and
chromosome territory organisation. Curr Opin Cell Biol 19, 311-316.
244.
Hebbes, T.R., Clayton, A.L., Thorne, A.W., and Crane-Robinson, C. (1994). Core histone
hyperacetillation co-maps with generalised DNase I sensitivity in the chicken beta-globin
chromosomal domain. EMBO J 13, 1823-1830.
245.
Hebert, M.D., and Matera, A.G. (2000). Self-association of coilin reveals a common
theme in nuclear body localization. Mol Biol Cell 11, 4159-4171.
246.
Heddi, B., and Phan, A.T. (2011). Structure of human telomeric DNA in crowded
solution. Journal of the American Chemical Society 133, 9824-9833.
334
247.
Heintzman, N.D., Hon, G.C., Hawkins, R.D., Kheradpour, P., Stark, A., Harp, L.F., Ye,
Z., Lee, L.K., Stuart, R.K., Ching, C.W., et al. (2009). Histone modifications at human
enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature 459, 108-112.
248.
Heintzman, N.D., Stuart, R.K., Hon, G., Fu, Y., Ching, C.W., Hawkins, R.D., Barrera,
L.O., Van Calcar, S., Qu, C., Ching, K.A., et al. (2007). Distinct and predictive chromatin
signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nat Genet 39,
311-318.
249.
Heinz, S., Benner, C., Spann, N., Bertolino, E., Lin, Y.C., Laslo, P., Cheng, J.X., Murre,
C., Singh, H., and Glass, C.K. (2010). Simple combinations of lineage-determining
transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell
identities. Mol CeLL 38, 576-589.
250.
Hempel, K., and Stratling, W.H. (1996). The chicken lysozyme gene 5' MAR and the
Drosophila histone SAR are electroelutable from encapsulated and digested nuclei. J Cell Sci
109, 1459-1469.
251.
Henikoff, S. (2008). Nucleosome destabilization in the epigenetic regulation of gene
expression. Nat Rev Genet 9, 15-26.
252.
Hens, L., Baumann, H., Cremer, T., Sutter, A., Cornelis, J.J., and Cremer, C. (1983).
Immunocytochemical localization of chromatin regions UV-microirradiated in S phase or
anaphase. Evidence for a territorial organization of chromosomes during cell cycle of cultured
Chinese hamster cells. Exp Cell Res 149, 257-269.
253.
Hernandez-Munoz, I., Taghavi, P., Kuijl, C., Neefjes, J., and van Lohuizen, M. (2005).
Association of BMI1 with polycomb bodies is dynamic and requires PRC2/EZH2 and the
maintenance DNA methyltransferase DNMT1. Mol Cell Biol 25, 11047-11058.
254.
Higgs, D.R., Vernimmen, D., and Wood, B. (2008). Long-range regulation of alpha-
globin gene expression. Adv Genet 61, 143-173.
335
255.
Hihara, S., Pack, C.G., Kaizu, K., Tani, T., Hanafusa, T., Nozaki, T., Takemoto, S.,
Yoshimi, T., Yokota, H., Imamoto, N., et al. (2012). Local nucleosome dynamics facilitate
chromatin accessibility in living mammalian cells. Cell reports 2, 1645-1656.
256.
Ho, J.W., Jung, Y.L., Liu, T., Alver, B.H., Lee, S., Ikegami, K., Sohn, K.A., Minoda, A.,
Tolstorukov, M.Y., Appert, A., et al. (2014). Comparative analysis of metazoan chromatin
organization. Nature 512, 449-452.
257.
Holwerda, S.J., and de Laat, W. (2013). CTCF: the protein, the binding partners, the
binding sites and their chromatin loops. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 368, 20120369.
258.
Hon, G., Wang, W., and Ren, B. (2009a). Discovery and annotation of functional
chromatin signatures in the human genome. PLoS computational biology 5, e1000566.
259.
Hon, G.C., Hawkins, R.D., and Ren, B. (2009b). Predictive chromatin signatures in the
mammalian genome. Hum Mol Genet 18, R195-201.
260.
Horike, S., Cai, S., Miyano, M., Cheng, J.F., and Kohwi-Shigematsu, T. (2005). Loss of
silent-chromatin looping and impaired imprinting of DLX5 in Rett syndrome. Nat Genet 37,
31-40.
261.
Horikoshi, M. (2013). Histone acetylation: from code to web and router via intrinsically
disordered regions. Current pharmaceutical design 19, 5019-5042.
262.
Hou, C., Dale, R., and Dean, A. (2010). Cell type specificity of chromatin organization
mediated by CTCF and cohesin. Proc Natl Acad Sci U S A 107, 3651-3656.
263.
Hou, C., Li, L., Qin, Z.S., and Corces, V.G. (2012). Gene density, transcription, and
insulators contribute to the partition of the Drosophila genome into physical domains. Mol
CeLL 48, 471-484.
264.
Hozak, P., and Cook, P.R. (1994). Replication factories. Trends Cell Biol 4, 48-52.
336
265.
Hozak, P., Cook, P.R., Schofer, C., Mosgoller, W., and Wachtler, F. (1994a). Site of
transcription of ribosomal RNA and intranucleolar structure in HeLa cells. J Cell Sci 107 ( Pt
2), 639-648.
266.
Hozak, P., Hassan, A.B., Jackson, D.A., and Cook, P.R. (1993). Visualization of
replication factories attached to nucleoskeleton. Cell 73, 361-373.
267.
Hozak, P., Jackson, D.A., and Cook, P.R. (1994b). Replication factories and nuclear
bodies: the ultrastructural characterization of replication sites during the cell cycle. J Cell Sci
107 ( Pt 8), 2191-2202.
268.
Hu, Q., Kwon, Y.S., Nunez, E., Cardamone, M.D., Hutt, K.R., Ohgi, K.A., Garcia-
Bassets, I., Rose, D.W., Glass, C.K., Rosenfeld, M.G., et al. (2008). Enhancing nuclear
receptor-induced transcription requires nuclear motor and LSD1-dependent gene networking in
interchromatin granules. Proc Natl Acad Sci U S A 105, 19199-19204.
269.
Hu, Y., Kireev, I., Plutz, M., Ashourian, N., and Belmont, A.S. (2009). Large-scale
chromatin structure of inducible genes: transcription on a condensed, linear template. J Cell
Biol 185, 87-100.
270.
Huang, S., and Spector, D.L. (1991). Nascent pre-mRNA transcripts are associated with
nuclear regions enriched in splicing factors. Genes Dev 5, 2288-2302.
271.
Hughes, J.R., Cheng, J.F., Ventress, N., Prabhakar, S., Clark, K., Anguita, E., De Gobbi,
M., de Jong, P., Rubin, E., and Higgs, D.R. (2005). Annotation of cis-regulatory elements by
identification, subclassification, and functional assessment of multispecies conserved
sequences. Proc Natl Acad Sci USA 102, 9830-9835.
272.
Huppert, J.L., and Balasubramanian, S. (2007). G-quadruplexes in promoters throughout
the human genome. Nucleic Acids Res 35, 406-413.
337
273.
Hwang, Y.C., Zheng, Q., Gregory, B.D., and Wang, L.S. (2013). High-throughput
identification of long-range regulatory elements and their target promoters in the human
genome. Nucleic Acids Res 41, 4835-4846.
274.
Iarovaia, O., Razin, S.V., Linares-Cruz, G., Sjakste, N., and Scherrer, K. (2001). In
chicken leukemia cells globin genes are fully transcribed but their rnas are retained in the
perinucleolar area. Exp Cell Res 270, 159-165.
275.
Iarovaia, O.V., Borounova, V.V., Philonenko, E.S., Kantidze, O.L., Vassetzky, Y.S., and
Razin, S.V. (2009). In embryonic chicken erythrocytes actively transcribed alpha globin genes
are not associated with the nuclear matrix. J Cell Biochem 106, 170-178.
276.
Iarovaia, O.V., Bystritskiy, A., Ravcheev, D., Hancock, R., and Razin, S.V. (2004).
Visualization of individual DNA loops and a map of loop-domains in the human dystrophin
gene. Nucl Acids Res 32, 2079-2086.
277.
Iborra, F.J., Pombo, A., Jackson, D.A., and Cook, P.R. (1996). Active RNA polymerases
are localized within discrete transcription "factories' in human nuclei. J Cell Sci 109 ( Pt 6),
1427-1436.
278.
Ioudinkova, E., Razin, S.V., Borunova, V., de Conto, F., Rynditch, A., and Scherrer, K.
(2005). RNA-dependent nuclear matrix contains a 33 kb globin full domain transcript as well
as prosomes but no 26S proteasomes. J Cell Biochem 94, 529-539.
279.
Ioudinkova, E.S., Ulianov, S.V., Bunina, D., Iarovaia, O.V., Gavrilov, A.A., and Razin,
S.V. (2011). The inactivation of the pi gene in chicken erythroblasts of adult lineage is not
mediated by packaging of the embryonic part of the alpha-globin gene domain into a repressive
heterochromatin-like structure. Epigenetics 6, 1481-1488.
280.
Ishii, K., Hirano, Y., Araki, N., Oda, T., Kumeta, M., Takeyasu, K., Furukawa, K., and
Horigome, T. (2008). Nuclear matrix contains novel WD-repeat and disordered-region-rich
proteins. FEBS Lett 582, 3515-3519.
338
281.
Ishov, A.M., Sotnikov, A.G., Negorev, D., Vladimirova, O.V., Neff, N., Kamitani, T.,
Yeh, E.T., Strauss, J.F., 3rd, and Maul, G.G. (1999). PML is critical for ND10 formation and
recruits the PML-interacting protein daxx to this nuclear structure when modified by SUMO-1.
J Cell Biol 147, 221-234.
282.
Jackson, D.A. (1997). Chromatin domains and nuclear compartments: establishing sites
of gene expression in eukaryotic nuclei. Mol Biol Rep 24, 209-220.
283.
Jackson, D.A., and Cook, P.R. (1988). Visualization of a filamentous nucleoskeleton with
a 23 nm axial repeat. EMBO J 7, 3667-3677.
284.
Jackson, D.A., and Cook, P.R. (1995). The structural basis of nuclear function. Int Rev
Cytol 162A, 125-149.
285.
Jackson, D.A., and Pombo, A. (1998). Replicon clusters are stable units of chromosome
structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and
propagation of S phase in human cells. J Cell Biol 140, 1285-1295.
286.
Jackson, D.A., Iborra, F.J., Manders, E.M., and Cook, P.R. (1998). Numbers and
organization of RNA polymerases, nascent transcripts, and transcription units in HeLa nuclei.
Mol Biol Cell 9, 1523-1536.
287.
Jady, B.E., Darzacq, X., Tucker, K.E., Matera, A.G., Bertrand, E., and Kiss, T. (2003).
Modification of Sm small nuclear RNAs occurs in the nucleoplasmic Cajal body following
import from the cytoplasm. EMBO J 22, 1878-1888.
288.
Jagatheesan, G., Thanumalayan, S., Muralikrishna, B., Rangaraj, N., Karande, A.A., and
Parnaik, V.K. (1999). Colocalization of intranuclear lamin foci with RNA splicing factors. J
Cell Sci 112 ( Pt 24), 4651-4661.
289.
Jenuwein, T., and Allis, C.D. (2001). Translating the histone code. Science 293, 1074-
1080.
339
290.
Jeronimo, C., Bataille, A.R., and Robert, F. (2013). The writers, readers, and functions of
the RNA polymerase II C-terminal domain code. Chemical reviews 113, 8491-8522.
291.
Jin, C., and Felsenfeld, G. (2007). Nucleosome stability mediated by histone variants
H3.3 and H2A.Z. Genes Dev 21, 1519-1529.
292.
Jin, C., Zang, C., Wei, G., Cui, K., Peng, W., Zhao, K., and Felsenfeld, G. (2009).
H3.3/H2A.Z double variant-containing nucleosomes mark 'nucleosome-free regions' of active
promoters and other regulatory regions. Nat Genet 41, 941-945.
293.
Jin, F., Li, Y., Dixon, J.R., Selvaraj, S., Ye, Z., Lee, A.Y., Yen, C.A., Schmitt, A.D.,
Espinoza, C.A., and Ren, B. (2013). A high-resolution map of the three-dimensional chromatin
interactome in human cells. Nature 503, 290-294.
294.
John, S., Sabo, P.J., Thurman, R.E., Sung, M.H., Biddie, S.C., Johnson, T.A., Hager,
G.L., and Stamatoyannopoulos, J.A. (2011). Chromatin accessibility pre-determines
glucocorticoid receptor binding patterns. Nat Genet 43, 264-268.
295.
Joti, Y., Hikima, T., Nishino, Y., Kamada, F., Hihara, S., Takata, H., Ishikawa, T., and
Maeshima, K. (2012). Chromosomes without a 30-nm chromatin fiber. Nucleus 3, 404-410.
296.
Kagey, M.H., Newman, J.J., Bilodeau, S., Zhan, Y., Orlando, D.A., van Berkum, N.L.,
Ebmeier, C.C., Goossens, J., Rahl, P.B., Levine, S.S., et al. (2010). Mediator and cohesin
connect gene expression and chromatin architecture. Nature 467, 430-435.
297.
Kaiser, T.E., Intine, R.V., and Dundr, M. (2008). De novo formation of a subnuclear
body. Science 322, 1713-1717.
298.
Kang, J., Xu, B., Yao, Y., Lin, W., Hennessy, C., Fraser, P., and Feng, J. (2011). A
dynamical model reveals gene co-localizations in nucleus. PLoS computational biology 7,
e1002094.
340
299.
Kantidze, O.L., Iarovaia, O.V., Philonenko, E.S., Yakutenko, II, and Razin, S.V. (2007).
Unusual compartmentalization of CTCF and other transcription factors in the course of
terminal erythroid differentiation. Biochim Biophys Acta 1773, 924-933.
300.
Kaplan, N., Moore, I.K., Fondufe-Mittendorf, Y., Gossett, A.J., Tillo, D., Field, Y.,
LeProust, E.M., Hughes, T.R., Lieb, J.D., Widom, J., et al. (2009). The DNA-encoded
nucleosome organization of a eukaryotic genome. Nature 458, 362-366.
301.
Kaplan, T., Li, X.Y., Sabo, P.J., Thomas, S., Stamatoyannopoulos, J.A., Biggin, M.D.,
and Eisen, M.B. (2011). Quantitative models of the mechanisms that control genome-wide
patterns of transcription factor binding during early Drosophila development. PLoS Genet 7,
e1001290.
302.
Karch, K.R., Denizio, J.E., Black, B.E., and Garcia, B.A. (2013). Identification and
interrogation of combinatorial histone modifications. Frontiers in genetics 4, 264.
303.
Kasten, M., Szerlong, H., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Werner, M., and Cairns,
B.R. (2004). Tandem bromodomains in the chromatin remodeler RSC recognize acetylated
histone H3 Lys14. EMBO J 23, 1348-1359.
304.
Kaufmann, B.B., and van Oudenaarden, A. (2007). Stochastic gene expression: from
single molecules to the proteome. Curr Opin Genet Dev 17, 107-112.
305.
Kawaguchi, T., and Hirose, T. (2012). Architectural roles of long noncoding RNAs in the
intranuclear formation of functional paraspeckles. Front Biosci 17, 1729-1746.
306.
Kazansky, A.V., Kabotyanski, E.B., Wyszomierski, S.L., Mancini, M.A., and Rosen,
J.M. (1999). Differential effects of prolactin and src/abl kinases on the nuclear translocation of
STAT5B and STAT5A. J Biol Chem 274, 22484-22492.
307.
Kelly, C., Van Driel, R., and Wilkinson, G.W. (1995). Disruption of PML-associated
nuclear bodies during human cytomegalovirus infection. The Journal of general virology 76 (
Pt 11), 2887-2893.
341
308.
Kikuta, H., Laplante, M., Navratilova, P., Komisarczuk, A.Z., Engstrom, P.G., Fredman,
D., Akalin, A., Caccamo, M., Sealy, I., Howe, K., et al. (2007). Genomic regulatory blocks
encompass multiple neighboring genes and maintain conserved synteny in vertebrates. Genome
Res 17, 545-555.
309.
Kim, A., Zhao, H., Ifrim, I., and Dean, A. (2007a). {beta}-globin intergenic transcription
and histone acetylation dependent on an enhancer. Mol Cell Biol.
310.
Kim, J.S., and Szleifer, I. (2014). Crowding-induced formation and structural alteration
of nuclear compartments: insights from computer simulations. International review of cell and
molecular biology 307, 73-108.
311.
Kim, T.H., Abdullaev, Z.K., Smith, A.D., Ching, K.A., Loukinov, D.I., Green, R.D.,
Zhang, M.Q., Lobanenkov, V.V., and Ren, B. (2007b). Analysis of the vertebrate insulator
protein CTCF-binding sites in the human genome. Cell 128, 1231-1245.
312.
Kim, T.K., Hemberg, M., Gray, J.M., Costa, A.M., Bear, D.M., Wu, J., Harmin, D.A.,
Laptewicz, M., Barbara-Haley, K., Kuersten, S., et al. (2010). Widespread transcription at
neuronal activity-regulated enhancers. Nature 465, 182-187.
313.
Kirkland, J.G., Raab, J.R., and Kamakaka, R.T. (2013). TFIIIC bound DNA elements in
nuclear organization and insulation. Biochim Biophys Acta 1829, 418-424.
314.
Kitamura, E., Blow, J.J., and Tanaka, T.U. (2006). Live-cell imaging reveals replication
of individual replicons in eukaryotic replication factories. Cell 125, 1297-1308.
315.
Klenova, E.M., Nicolas, R.H., Paterson, H.F., Carne, A.F., Heath, C.M., Goodwin, G.H.,
Neiman, P.E., and Lobanenkov, V.V. (1993). CTCF, a conserved nuclear factor required for
optimal transcriptional activity of the chicken c-myc gene, is an 11-Zn-finger protein
differentially expressed in multiple forms. Mol Cell Biol 13, 7612-7624.
316.
Klochkov, D., Rincon-Arano, H., Ioudinkova, E.S., Valadez-Graham, V., Gavrilov, A.,
Recillas-Targa, F., and Razin, S.V. (2006). A CTCF-dependent silencer located in the
342
differentially methylated area may regulate expression of a housekeeping gene overlapping a
tissue-specific gene domain. Mol Cell Biol 26, 1589-1597.
317.
Klochkov, D.B., Gavrilov, A.A., Vassetzky, Y.S., and Razin, S.V. (2009). Early
replication timing of the chicken alpha-globin gene domain correlates with its open chromatin
state in cells of different lineages. Genomics 93, 481-486.
318.
Koch, F., Fenouil, R., Gut, M., Cauchy, P., Albert, T.K., Zacarias-Cabeza, J., Spicuglia,
S., de la Chapelle, A.L., Heidemann, M., Hintermair, C., et al. (2011). Transcription initiation
platforms and GTF recruitment at tissue-specific enhancers and promoters. Nat Struct Mol Biol
18, 956-963.
319.
Kolovos, P., Knoch, T.A., Grosveld, F.G., Cook, P.R., and Papantonis, A. (2012).
Enhancers and silencers: an integrated and simple model for their function. Epigenetics
Chromatin 5, 1.
320.
Kooren, J., Palstra, R.J., Klous, P., Splinter, E., von Lindern, M., Grosveld, F., and de
Laat, W. (2007). Beta-globin active chromatin Hub formation in differentiating erythroid cells
and in p45 NF-E2 knock-out mice. J Biol Chem 282, 16544-16552.
321.
Kornberg, R. (1974). Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science
184, 868-871.
322.
Kosak, S.T., and Groudine, M. (2004). Form follows function: The genomic organization
of cellular differentiation. Genes Dev 18, 1371-1384.
323.
Koutelou, E., Hirsch, C.L., and Dent, S.Y. (2010). Multiple faces of the SAGA complex.
Curr Opin Cell Biol 22, 374-382.
324.
Kowalczyk, M.S., Hughes, J.R., Babbs, C., Sanchez-Pulido, L., Szumska, D., Sharpe,
J.A., Sloane-Stanley, J.A., Morriss-Kay, G.M., Smoot, L.B., Roberts, A.E., et al. (2012a).
Nprl3 is required for normal development of the cardiovascular system. Mamm Genome 23,
404-415.
343
325.
Kowalczyk, M.S., Hughes, J.R., Garrick, D., Lynch, M.D., Sharpe, J.A., Sloane-Stanley,
J.A., McGowan, S.J., De Gobbi, M., Hosseini, M., Vernimmen, D., et al. (2012b). Intragenic
enhancers act as alternative promoters. Mol CeLL 45, 447-458.
326.
Krieghoff-Henning, E., and Hofmann, T.G. (2008). Role of nuclear bodies in apoptosis
signalling. Biochim Biophys Acta 1783, 2185-2194.
327.
Kruhlak, M.J., Lever, M.A., Fischle, W., Verdin, E., Bazett-Jones, D.P., and Hendzel,
M.J. (2000). Reduced mobility of the alternate splicing factor (ASF) through the nucleoplasm
and steady state speckle compartments. J Cell Biol 150, 41-51.
328.
Ku, C.S., Naidoo, N., Wu, M., and Soong, R. (2011). Studying the epigenome using next
generation sequencing. Journal of medical genetics 48, 721-730.
329.
Kukreti, S., Kaur, H., Kaushik, M., Bansal, A., Saxena, S., Kaushik, S., and Kukreti, R.
(2010). Structural polymorphism at LCR and its role in beta-globin gene regulation. Biochimie
92, 1199-1206.
330.
Kukushkin, A.N., Svetlikova, S.B., and Pospelov, V.A. (1988). A structure of potentially
active and inactive genes of chicken erythrocyte chromatin upon decondensation. Nucleic
Acids Res 16, 8555-8569.
331.
Kulaeva, O.I., Nizovtseva, E.V., Polikanov, Y.S., Ulianov, S.V., and Studitsky, V.M.
(2012). Distant activation of transcription: mechanisms of enhancer action. Mol Cell Biol 32,
4892-4897.
332.
Kumar, P.P., Bischof, O., Purbey, P.K., Notani, D., Urlaub, H., Dejean, A., and Galande,
S. (2007). Functional interaction between PML and SATB1 regulates chromatin-loop
architecture and transcription of the MHC class I locus. Nat Cell Biol 9, 45-56.
333.
Kumaran, R.I., and Spector, D.L. (2008). A genetic locus targeted to the nuclear
periphery in living cells maintains its transcriptional competence. J Cell Biol 180, 51-65.
344
334.
Kundu, T.K., and Rao, M.R. (1999). CpG islands in chromatin organization and gene
expression. Journal of biochemistry 125, 217-222.
335.
Kupper, K., Kolbl, A., Biener, D., Dittrich, S., von Hase, J., Thormeyer, T., Fiegler, H.,
Carter, N.P., Speicher, M.R., Cremer, T., et al. (2007). Radial chromatin positioning is shaped
by local gene density, not by gene expression. Chromosoma 116, 285-306.
336.
Kurukuti, S., Tiwari, V.K., Tavoosidana, G., Pugacheva, E., Murrell, A., Zhao, Z.,
Lobanenkov, V., Reik, W., and Ohlsson, R. (2006). CTCF binding at the H19 imprinting
control region mediates maternally inherited higher-order chromatin conformation to restrict
enhancer access to Igf2. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 10684-10689.
337.
Kyrchanova, O., and Georgiev, P. (2014). Chromatin insulators and long-distance
interactions in Drosophila. FEBS Lett 588, 8-14.
338.
Kysela, K., Philimonenko, A.A., Philimonenko, V.V., Janacek, J., Kahle, M., and Hozak,
P. (2005). Nuclear distribution of actin and myosin I depends on transcriptional activity of the
cell. Histochem Cell Biol 124, 347-358.
339.
Labrador, M., and Corces, V.G. (2002). Setting the boundaries of chromatin domains and
nuclear organization. Cell 111, 151-154.
340.
Lallemand-Breitenbach, V., and de The, H. PML nuclear bodies. Cold Spring Harb
Perspect Biol 2, a000661.
341.
Lallemand-Breitenbach, V., Zhu, J., Puvion, F., Koken, M., Honore, N., Doubeikovsky,
A., Duprez, E., Pandolfi, P.P., Puvion, E., Freemont, P., et al. (2001). Role of promyelocytic
leukemia (PML) sumolation in nuclear body formation, 11S proteasome recruitment, and
As2O3-induced PML or PML/retinoic acid receptor alpha degradation. J Exp Med 193, 13611371.
342.
Lamond, A.I., and Spector, D.L. (2003). Nuclear speckles: a model for nuclear
organelles. Nat Rev Mol Cell Biol 4, 605-612.
345
343.
Lanctot, C., Cheutin, T., Cremer, M., Cavalli, G., and Cremer, T. (2007). Dynamic
genome architecture in the nuclear space: regulation of gene expression in three dimensions.
Nat Rev Genet 8, 104-115.
344.
Langmead, B., and Salzberg, S.L. (2012). Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat
Methods 9, 357-359.
345.
Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., and Salzberg, S.L. (2009). Ultrafast and memory-
efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol 10, R25.
346.
Langowski, J., and Heermann, D.W. (2007). Computational modeling of the chromatin
fiber. Semin Cell Dev Biol 18, 659-667.
347.
Lanzuolo, C., Roure, V., Dekker, J., Bantignies, F., and Orlando, V. (2007). Polycomb
response elements mediate the formation of chromosome higher-order structures in the bithorax
complex. Nat Cell Biol 9, 1167-1174.
348.
Larkin, J.D., Papantonis, A., Cook, P.R., and Marenduzzo, D. (2013). Space exploration
by the promoter of a long human gene during one transcription cycle. Nucleic Acids Res 41,
2216-2227.
349.
Lawrence, J.B., and Singer, R.H. (1991). Spatial organization of nucleic acid sequences
within cells. Semin Cell Biol 2, 83-101.
350.
Lawrence, J.B., Singer, R.H., and McNeil, J.A. (1990). Interphase and metaphase
resolution of different distances within the human dystrophin gene. Science 249, 928-932.
351.
Le, T.B., Imakaev, M.V., Mirny, L.A., and Laub, M.T. (2013). High-resolution mapping
of the spatial organization of a bacterial chromosome. Science 342, 731-734.
352.
Lee, J.H., and Skalnik, D.G. (2005). CpG-binding protein (CXXC finger protein 1) is a
component of the mammalian Set1 histone H3-Lys4 methyltransferase complex, the analogue
of the yeast Set1/COMPASS complex. J Biol Chem 280, 41725-41731.
346
353.
Lee, J.S., Smith, E., and Shilatifard, A. (2010). The language of histone crosstalk. Cell
142, 682-685.
354.
Lee, K.K., and Workman, J.L. (2007). Histone acetyltransferase complexes: one size
doesn't fit all. Nat Rev Mol Cell Biol 8, 284-295.
355.
Lee, W., Tillo, D., Bray, N., Morse, R.H., Davis, R.W., Hughes, T.R., and Nislow, C.
(2007). A high-resolution atlas of nucleosome occupancy in yeast. Nat Genet 39, 1235-1244.
356.
Lemieux, J.E., Kyes, S.A., Otto, T.D., Feller, A.I., Eastman, R.T., Pinches, R.A.,
Berriman, M., Su, X.Z., and Newbold, C.I. (2013). Genome-wide profiling of chromosome
interactions in Plasmodium falciparum characterizes nuclear architecture and reconfigurations
associated with antigenic variation. Mol Microbiol 90, 519-537.
357.
Lemm, I., Girard, C., Kuhn, A.N., Watkins, N.J., Schneider, M., Bordonne, R., and
Luhrmann, R. (2006). Ongoing U snRNP biogenesis is required for the integrity of Cajal
bodies. Mol Biol Cell 17, 3221-3231.
358.
Lettice, L.A., Heaney, S.J., Purdie, L.A., Li, L., de Beer, P., Oostra, B.A., Goode, D.,
Elgar, G., Hill, R.E., and de Graaff, E. (2003). A long-range Shh enhancer regulates expression
in the developing limb and fin and is associated with preaxial polydactyly. Hum Mol Genet 12,
1725-1735.
359.
Levi, V., Ruan, Q., Plutz, M., Belmont, A.S., and Gratton, E. (2005). Chromatin
dynamics in interphase cells revealed by tracking in a two-photon excitation microscope.
Biophys J 89, 4275-4285.
360.
Levine, J.H., Lin, Y., and Elowitz, M.B. (2013). Functional roles of pulsing in genetic
circuits. Science 342, 1193-1200.
361.
Li, G., and Reinberg, D. (2011). Chromatin higher-order structures and gene regulation.
Curr Opin Genet Dev 21, 175-186.
347
362.
Li, G., Ruan, X., Auerbach, R.K., Sandhu, K.S., Zheng, M., Wang, P., Poh, H.M., Goh,
Y., Lim, J., Zhang, J., et al. (2012). Extensive promoter-centered chromatin interactions
provide a topological basis for transcription regulation. Cell 148, 84-98.
363.
Li, H.B., Muller, M., Bahechar, I.A., Kyrchanova, O., Ohno, K., Georgiev, P., and
Pirrotta, V. (2011a). Insulators, not Polycomb response elements, are required for long-range
interactions between Polycomb targets in Drosophila melanogaster. Mol Cell Biol 31, 616-625.
364.
Li, H.B., Ohno, K., Gui, H., and Pirrotta, V. (2013). Insulators target active genes to
transcription factories and polycomb-repressed genes to polycomb bodies. PLoS Genet 9,
e1003436.
365.
Li, R., Knight, J.D., Jackson, S.P., Tjian, R., and Botchan, M.R. (1991). Direct interaction
between Sp1 and the BPV enhancer E2 protein mediates synergistic activation of transcription.
Cell 65, 493-505.
366.
Li, X.Y., Thomas, S., Sabo, P.J., Eisen, M.B., Stamatoyannopoulos, J.A., and Biggin,
M.D. (2011b). The role of chromatin accessibility in directing the widespread, overlapping
patterns of Drosophila transcription factor binding. Genome Biol 12, R34.
367.
Lichter, P., Cremer, T., Borden, J., Manuelidis, L., and Ward, D.C. (1988). Delineation of
individual human chromosomes in metaphase and interphase cells by in situ suppression
hybridization using recombinant DNA libraries. Hum Genet 80, 224-234.
368.
Lieberman-Aiden, E., van Berkum, N.L., Williams, L., Imakaev, M., Ragoczy, T.,
Telling, A., Amit, I., Lajoie, B.R., Sabo, P.J., Dorschner, M.O., et al. (2009). Comprehensive
mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science
326, 289-293.
369.
Liebich, I., Bode, J., Frisch, M., and Wingender, E. (2002). S/MARt DB: a database on
scaffold/matrix attached regions. Nucleic Acids Res 30, 372-374.
348
370.
Ling, J., Ainol, L., Zhang, L., Yu, X., Pi, W., and Tuan, D. (2004). HS2 enhancer
function is blocked by a transcriptional terminator inserted between the enhancer and the
promoter. J Biol Chem 279, 51704-51713.
371.
Ling, J., Baibakov, B., Pi, W., Emerson, B.M., and Tuan, D. (2005). The HS2 enhancer
of the beta-globin locus control region initiates synthesis of non-coding, polyadenylated RNAs
independent of a cis-linked globin promoter. J Mol Biol 350, 883-896.
372.
Litt, M.D., Simpson, M., Gaszner, M., Allis, C.D., and Felsenfeld, G. (2001a).
Correlation between histone lysine methylation and developmental changes at the chicken betaglobin locus. Science 293, 2453-2455.
373.
Litt, M.D., Simpson, M., Recillas-Targa, F., Prioleau, M.N., and Felsenfeld, G. (2001b).
Transitions in histone acetylation reveal boundaries of three separately regulated neighboring
loci. EMBO J 20, 2224-2235.
374.
Liu, J.L., Wu, Z., Nizami, Z., Deryusheva, S., Rajendra, T.K., Beumer, K.J., Gao, H.,
Matera, A.G., Carroll, D., and Gall, J.G. (2009). Coilin is essential for Cajal body organization
in Drosophila melanogaster. Mol Biol Cell 20, 1661-1670.
375.
Liu, Q., and Dreyfuss, G. (1996). A novel nuclear structure containing the survival of
motor neurons protein. EMBO J 15, 3555-3565.
376.
Liu, X., Yu, X., Zack, D.J., Zhu, H., and Qian, J. (2008). TiGER: a database for tissue-
specific gene expression and regulation. BMC bioinformatics 9, 271.
377.
Lobanenkov, V.V., Nicolas, R.H., Plumb, M.A., Wright, C.A., and Goodwin, G.H.
(1986). Sequence-specific DNA-binding proteins which interact with (G + C)-rich sequences
flanking the chicken c-myc gene. Eur J Biochem 159, 181-188.
378.
Lucas, J.S., Zhang, Y., Dudko, O.K., and Murre, C. (2014). 3D Trajectories Adopted by
Coding and Regulatory DNA Elements: First-Passage Times for Genomic Interactions. Cell
158, 339-352.
349
379.
Luderus, M.E., den Blaauwen, J.L., de Smit, O.J., Compton, D.A., and van Driel, R.
(1994). Binding of matrix attachment regions to lamin polymers involves single-stranded
regions and the minor groove. Mol Cell Biol 14, 6297-6305.
380.
Lukasova, E., Kozubek, S., Kozubek, M., Falk, M., and Amrichova, J. (2002). The 3D
structure of human chromosomes in cell nuclei. Chromosome Res 10, 535-548.
381.
Lunyak, V.V., Prefontaine, G.G., Nunez, E., Cramer, T., Ju, B.G., Ohgi, K.A., Hutt, K.,
Roy, R., Garcia-Diaz, A., Zhu, X., et al. (2007). Developmentally regulated activation of a
SINE B2 repeat as a domain boundary in organogenesis. Science 317, 248-251.
382.
Ma, H., Samarabandu, J., Devdhar, R.S., Acharya, R., Cheng, P.C., Meng, C., and
Berezney, R. (1998). Spatial and temporal dynamics of DNA replication sites in mammalian
cells. J Cell Biol 143, 1415-1425.
383.
Ma, H., Siegel, A.J., and Berezney, R. (1999). Association of chromosome territories
with the nuclear matrix. Disruption of human chromosome territories correlates with the release
of a subset of nuclear matrix proteins. J Cell Biol 146, 531-542.
384.
Machyna, M., Heyn, P., and Neugebauer, K.M. (2013). Cajal bodies: where form meets
function. Wiley interdisciplinary reviews RNA 4, 17-34.
385.
MacPherson, M.J., and Sadowski, P.D. (2010). The CTCF insulator protein forms an
unusual DNA structure. BMC Mol Biol 11, 101.
386.
Maeshima, K., and Eltsov, M. (2008). Packaging the genome: the structure of mitotic
chromosomes. Journal of biochemistry 143, 145-153.
387.
Maeshima, K., Hihara, S., and Takata, H. (2010). New insight into the mitotic
chromosome structure: irregular folding of nucleosome fibers without 30-nm chromatin
structure. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 75, 439-444.
388.
Mahmoudi, T., Katsani, K.R., and Verrijzer, C.P. (2002). GAGA can mediate enhancer
function in trans by linking two separate DNA molecules. EMBO J 21, 1775-1781.
350
389.
Mahy, N.L., Perry, P.E., and Bickmore, W.A. (2002a). Gene density and transcription
influence the localization of chromatin outside of chromosome territories detectable by FISH. J
Cell Biol 159, 753-763.
390.
Mahy, N.L., Perry, P.E., Gilchrist, S., Baldock, R.A., and Bickmore, W.A. (2002b).
Spatial organization of active and inactive genes and noncoding DNA within chromosome
territories. J Cell Biol 157, 579-589.
391.
Maier, V.K., Chioda, M., and Becker, P.B. (2008). ATP-dependent chromatosome
remodeling. Biol Chem 389, 345-352.
392.
Maksimenko, O., and Georgiev, P. (2014). Mechanisms and proteins involved in long-
distance interactions. Frontiers in genetics 5, 28.
393.
Malatesta, M., Scassellati, C., Meister, G., Plottner, O., Buhler, D., Sowa, G., Martin,
T.E., Keidel, E., Fischer, U., and Fakan, S. (2004). Ultrastructural characterisation of a nuclear
domain highly enriched in survival of motor neuron (SMN) protein. Exp Cell Res 292, 312321.
394.
Malyavantham, K.S., Bhattacharya, S., and Berezney, R. (2009). The architecture of
functional neighborhoods within the mammalian cell nucleus. Adv Enzyme Regul.
395.
Maniatis, T., Fritsch, E.F., and Sambrook, J. (1982). Molecular Cloning: a laboratory
manual (Cold Spring Harbor Lab. Press,).
396.
Mant'eva, V.L., Razin, S.V., and Georgiev, G.P. (1979). [Isolation of DNA fraction
bound to the axial structure of metaphase chromosomes and studies of renaturation]. Mol Biol
(Mosk) 13, 1360-1368.
397.
Mao, Y.S., Sunwoo, H., Zhang, B., and Spector, D.L. (2011a). Direct visualization of the
co-transcriptional assembly of a nuclear body by noncoding RNAs. Nat Cell Biol 13, 95-101.
398.
Mao, Y.S., Zhang, B., and Spector, D.L. (2011b). Biogenesis and function of nuclear
bodies. Trends Genet 27, 295-306.
351
399.
Marenduzzo, D., Finan, K., and Cook, P.R. (2006a). The depletion attraction: an
underappreciated force driving cellular organization. J Cell Biol 175, 681-686.
400.
Marenduzzo, D., Micheletti, C., and Cook, P.R. (2006b). Entropy-driven genome
organization. Biophys J 90, 3712-3721.
401.
Markaki, Y., Smeets, D., Fiedler, S., Schmid, V.J., Schermelleh, L., Cremer, T., and
Cremer, M. (2012). The potential of 3D-FISH and super-resolution structured illumination
microscopy for studies of 3D nuclear architecture: 3D structured illumination microscopy of
defined chromosomal structures visualized by 3D (immuno)-FISH opens new perspectives for
studies of nuclear architecture. BioEssays 34, 412-426.
402.
Marques, A.C., Hughes, J., Graham, B., Kowalczyk, M.S., Higgs, D.R., and Ponting,
C.P. (2013). Chromatin signatures at transcriptional start sites separate two equally populated
yet distinct classes of intergenic long noncoding RNAs. Genome Biol 14, R131.
403.
Marshall, W.F. (2002). Order and disorder in the nucleus. Curr Biol 12, R185-192.
404.
Marshall, W.F., Fung, J.C., and Sedat, J.W. (1997a). Deconstructing the nucleus: global
architecture from local interactions. Curr Opin Genet Dev 7, 259-263.
405.
Marshall, W.F., Straight, A., Marko, J.F., Swedlow, J., Dernburg, A., Belmont, A.,
Murray, A.W., Agard, D.A., and Sedat, J.W. (1997b). Interphase chromosomes undergo
constrained diffusional motion in living cells. Curr Biol 7, 930-939.
406.
Martelli, A.M., Cocco, L., Riederer, B.M., and Neri, L.M. (1996). The nuclear matrix: a
critical appraisal. Histol Histopathol 11, 1035-1048.
407.
Martelli, A.M., Falcieri, E., Zweyer, M., Bortul, R., Tabellini, G., Cappellini, A., Cocco,
L., and Manzoli, L. (2002). The controversial nuclear matrix: a balanced point of view. Histol
Histopathol 17, 1193-1205.
408.
Martin, C., and Zhang, Y. (2005). The diverse functions of histone lysine methylation.
Nat Rev Mol Cell Biol 6, 838-849.
352
409.
Martin, S., and Pombo, A. (2003). Transcription factories: quantitative studies of
nanostructures in the mammalian nucleus. Chromosome Res 11, 461-470.
410.
Marzluff, W.F. (2005). Metazoan replication-dependent histone mRNAs: a distinct set of
RNA polymerase II transcripts. Curr Opin Cell Biol 17, 274-280.
411.
Mason, M.M., Lee, E., Westphal, H., and Reitman, M. (1995). Expression of the chicken
b-globin cluster in mice: correct developmental expression and distributed control. Mol Cell
Biol 15, 407-414.
412.
Masternak, K., Peyraud, N., Krawczyk, M., Barras, E., and Reith, W. (2003). Chromatin
remodeling and extragenic transcription at the MHC class II locus control region. Nat Immunol
4, 132-137.
413.
Maston, G.A., Evans, S.K., and Green, M.R. (2006). Transcriptional regulatory elements
in the human genome. Annual review of genomics and human genetics 7, 29-59.
414.
Mateos-Langerak, J., Bohn, M., de Leeuw, W., Giromus, O., Manders, E.M., Verschure,
P.J., Indemans, M.H., Gierman, H.J., Heermann, D.W., van Driel, R., et al. (2009). Spatially
confined folding of chromatin in the interphase nucleus. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 38123817.
415.
Matera, A.G., and Frey, M.R. (1998). Coiled bodies and gems: Janus or gemini? Am J
Hum Genet 63, 317-321.
416.
Matera, A.G., Izaguire-Sierra, M., Praveen, K., and Rajendra, T.K. (2009). Nuclear
bodies: random aggregates of sticky proteins or crucibles of macromolecular assembly? Dev
Cell 17, 639-647.
417.
Mavrich, T.N., Ioshikhes, I.P., Venters, B.J., Jiang, C., Tomsho, L.P., Qi, J., Schuster,
S.C., Albert, I., and Pugh, B.F. (2008). A barrier nucleosome model for statistical positioning
of nucleosomes throughout the yeast genome. Genome Res 18, 1073-1083.
353
418.
McBryant, S.J., Adams, V.H., and Hansen, J.C. (2006). Chromatin architectural proteins.
Chromosome Res 14, 39-51.
419.
McGhee, J.D., Rau, D.C., Charney, E., and Felsenfeld, G. (1980). Orientation of the
nucleosome within the higher order structure of chromatin. Cell 22, 87-96.
420.
Mehta, I.S., Elcock, L.S., Amira, M., Kill, I.R., and Bridger, J.M. (2008). Nuclear motors
and nuclear structures containing A-type lamins and emerin: is there a functional link?
Biochem Soc Trans 36, 1384-1388.
421.
Meldi, L., and Brickner, J.H. (2011). Compartmentalization of the nucleus. Trends Cell
Biol 21, 701-708.
422.
Meuleman, W., Peric-Hupkes, D., Kind, J., Beaudry, J.B., Pagie, L., Kellis, M., Reinders,
M., Wessels, L., and van Steensel, B. (2013). Constitutive nuclear lamina-genome interactions
are highly conserved and associated with A/T-rich sequence. Genome Res 23, 270-280.
423.
Mika, S., and Rost, B. (2005). NMPdb: Database of Nuclear Matrix Proteins. Nucleic
Acids Res 33, D160-163.
424.
Miles, J., Mitchell, J.A., Chakalova, L., Goyenechea, B., Osborne, C.S., O'Neill, L.,
Tanimoto, K., Engel, J.D., and Fraser, P. (2007). Intergenic transcription, cell-cycle and the
developmentally regulated epigenetic profile of the human beta-globin locus. PLoS One 2,
e630.
425.
Mintz, P.J., Patterson, S.D., Neuwald, A.F., Spahr, C.S., and Spector, D.L. (1999).
Purification and biochemical characterization of interchromatin granule clusters. EMBO J 18,
4308-4320.
426.
Mirkovitch, J., Mirault, M.-E., and Laemmli, U.K. (1984). Organization of the higher-
order chromatin loop: specific DNA attachement sites on nuclear scaffold. Cell 39, 223-232.
427.
Mirkovitch, J., Mirault, M.-E., and Laemmli, U.K. (1984). Organization of the higher-
order chromatin loop: specific DNA attachement sites on nuclear scaffold. Cell 39, 223-232.
354
428.
Mirny, L.A. (2011). The fractal globule as a model of chromatin architecture in the cell.
Chromosome Res 19, 37-51.
429.
Mishiro, T., Ishihara, K., Hino, S., Tsutsumi, S., Aburatani, H., Shirahige, K., Kinoshita,
Y., and Nakao, M. (2009). Architectural roles of multiple chromatin insulators at the human
apolipoprotein gene cluster. EMBO J 28, 1234-1245.
430.
Misteli, T. (2001). Protein dynamics: implications for nuclear architecture and gene
expression. Science 291, 843-847.
431.
Misteli, T. (2007). Beyond the sequence: cellular organization of genome function. Cell
128, 787-800.
432.
Misteli, T., Caceres, J.F., and Spector, D.L. (1997). The dynamics of a pre-mRNA
splicing factor in living cells. Nature 387, 523-527.
433.
Mitchell, J.A., and Fraser, P. (2008). Transcription factories are nuclear subcompartments
that remain in the absence of transcription. Genes Dev 22, 20-25.
434.
Miyagi, A., Ando, T., and Lyubchenko, Y.L. (2011). Dynamics of nucleosomes assessed
with time-lapse high-speed atomic force microscopy. Biochemistry 50, 7901-7908.
435.
Mizuguchi, G., Shen, X., Landry, J., Wu, W.H., Sen, S., and Wu, C. (2004). ATP-driven
exchange of histone H2AZ variant catalyzed by SWR1 chromatin remodeling complex.
Science 303, 343-348.
436.
Mod, E.C., Roy, S., Ernst, J., Kharchenko, P.V., Kheradpour, P., Negre, N., Eaton, M.L.,
Landolin, J.M., Bristow, C.A., Ma, L., et al. (2010). Identification of functional elements and
regulatory circuits by Drosophila modENCODE. Science 330, 1787-1797.
437.
Moen, P.T., Jr., Johnson, C.V., Byron, M., Shopland, L.S., de la Serna, I.L., Imbalzano,
A.N., and Lawrence, J.B. (2004). Repositioning of muscle-specific genes relative to the
periphery of SC-35 domains during skeletal myogenesis. Mol Biol Cell 15, 197-206.
355
438.
Mongelard, F., and Bouvet, P. (2007). Nucleolin: a multiFACeTed protein. Trends Cell
Biol 17, 80-86.
439.
Motohashi, T., Miyoshi, S., Osawa, M., Eyre, H.J., Sutherland, G.R., Matsuda, Y.,
Nakamura, Y., Shibuya, A., Iwama, A., and Nakauchi, H. (2000). Molecular cloning and
chromosomal mapping of a novel five-span transmembrane protein gene, M83. Biochem
Biophys Res Commun 276, 244-250.
440.
Mousavi, K., Zare, H., Koulnis, M., and Sartorelli, V. (2014). The emerging roles of
eRNAs in transcriptional regulatory networks. RNA biology 11, 106-110.
441.
Munsie, L.N., Desmond, C.R., and Truant, R. (2012). Cofilin nuclear-cytoplasmic
shuttling affects cofilin-actin rod formation during stress. J Cell Sci 125, 3977-3988.
442.
Muravyova, E., Golovnin, A., Gracheva, E., Parshikov, A., Belenkaya, T., Pirrotta, V.,
and Georgiev, P. (2001). Loss of insulator activity by paired Su(Hw) chromatin insulators.
Science 291, 495-498.
443.
Murr, R. (2010). Interplay between different epigenetic modifications and mechanisms.
Adv Genet 70, 101-141.
444.
Nagano, T., Lubling, Y., Stevens, T.J., Schoenfelder, S., Yaffe, E., Dean, W., Laue, E.D.,
Tanay, A., and Fraser, P. (2013). Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in
chromosome structure. Nature 502, 59-64.
445.
Nakahashi, H., Kwon, K.R., Resch, W., Vian, L., Dose, M., Stavreva, D., Hakim, O.,
Pruett, N., Nelson, S., Yamane, A., et al. (2013). A genome-wide map of CTCF multivalency
redefines the CTCF code. Cell reports 3, 1678-1689.
446.
Nakamura, H., Morita, T., and Sato, C. (1986). Structural organizations of replicon
domains during DNA synthetic phase in the mammalian nucleus. Exp Cell Res 165, 291-297.
447.
Nakayasu, H., and Berezney, R. (1989). Mapping replicational sites in the eucaryotic cell
nucleus. J Cell Biol 108, 1-11.
356
448.
Natoli, G., and Andrau, J.C. (2012). Noncoding transcription at enhancers: general
principles and functional models. Annu Rev Genet 46, 1-19.
449.
Naumova, N., Imakaev, M., Fudenberg, G., Zhan, Y., Lajoie, B.R., Mirny, L.A., and
Dekker, J. (2013). Organization of the mitotic chromosome. Science 342, 948-953.
450.
Naumova, N., Smith, E.M., Zhan, Y., and Dekker, J. (2012). Analysis of long-range
chromatin interactions using Chromosome Conformation Capture. Methods 58, 192-203.
451.
Nemeth, A., Conesa, A., Santoyo-Lopez, J., Medina, I., Montaner, D., Peterfia, B.,
Solovei, I., Cremer, T., Dopazo, J., and Langst, G. (2010). Initial genomics of the human
nucleolus. PLoS Genet 6, e1000889.
452.
Ng, H.H., Robert, F., Young, R.A., and Struhl, K. (2003). Targeted recruitment of Set1
histone methylase by elongating Pol II provides a localized mark and memory of recent
transcriptional activity. Mol CeLL 11, 709-719.
453.
Nickerson, J.A., Krochmalnic, G., Wan, K.M., and Penman, S. (1989). Chromatin
architecture and nuclear RNA. Proc Natl Acad Sci USA 86, 177-181.
454.
Niedojadlo, J., Perret-Vivancos, C., Kalland, K.H., Cmarko, D., Cremer, T., van Driel,
R., and Fakan, S. (2011). Transcribed DNA is preferentially located in the perichromatin region
of mammalian cell nuclei. Exp Cell Res 317, 433-444.
455.
Nizami, Z., Deryusheva, S., and Gall, J.G. (2010). The Cajal body and histone locus
body. Cold Spring Harb Perspect Biol 2, a000653.
456.
Nobrega, M.A., Ovcharenko, I., Afzal, V., and Rubin, E.M. (2003). Scanning human
gene deserts for long-range enhancers. Science 302, 413.
457.
Nobrega, M.A., Zhu, Y., Plajzer-Frick, I., Afzal, V., and Rubin, E.M. (2004). Megabase
deletions of gene deserts result in viable mice. Nature 431, 988-993.
357
458.
Nolis, I.K., McKay, D.J., Mantouvalou, E., Lomvardas, S., Merika, M., and Thanos, D.
(2009). Transcription factors mediate long-range enhancer-promoter interactions. Proc Natl
Acad Sci U S A 106, 20222-20227.
459.
Noordermeer, D., de Wit, E., Klous, P., van de Werken, H., Simonis, M., Lopez-Jones,
M., Eussen, B., de Klein, A., Singer, R.H., and de Laat, W. (2011). Variegated gene expression
caused by cell-specific long-range DNA interactions. Nat Cell Biol 13, 944-951.
460.
Nora, E.P., Dekker, J., and Heard, E. (2013). Segmental folding of chromosomes: a basis
for structural and regulatory chromosomal neighborhoods? BioEssays 35, 818-828.
461.
Nora, E.P., Lajoie, B.R., Schulz, E.G., Giorgetti, L., Okamoto, I., Servant, N., Piolot, T.,
van Berkum, N.L., Meisig, J., Sedat, J., et al. (2012). Spatial partitioning of the regulatory
landscape of the X-inactivation centre. Nature 485, 381-385.
462.
Nozaki, T., Kaizu, K., Pack, C.G., Tamura, S., Tani, T., Hihara, S., Nagai, T., Takahashi,
K., and Maeshima, K. (2013). Flexible and dynamic nucleosome fiber in living mammalian
cells. Nucleus 4, 349-356.
463.
Ong, C.T., and Corces, V.G. (2014). CTCF: an architectural protein bridging genome
topology and function. Nat Rev Genet 15, 234-246.
464.
Orlando, V. (2000). Mapping chromosomal proteins in vivo by formaldehyde-
crosslinked-chromatin immunoprecipitation. Trends Biochem Sci 25, 99-104.
465.
Orlando, V., Strutt, H., and Paro, R. (1997). Analysis of chromatin structure by in vivo
formaldehyde cross-linking. Methods 11, 205-214.
466.
Osborne, C.S., Chakalova, L., Brown, K.E., Carter, D., Horton, A., Debrand, E.,
Goyenechea, B., Mitchell, J.A., Lopes, S., Reik, W., et al. (2004). Active genes dynamically
colocalize to shared sites of ongoing transcription. Nat Genet 36, 1065-1071.
358
467.
Osborne, C.S., Chakalova, L., Mitchell, J.A., Horton, A., Wood, A.L., Bolland, D.J.,
Corcoran, A.E., and Fraser, P. (2007). Myc dynamically and preferentially relocates to a
transcription factory occupied by Igh. PLoS Biol 5, e192.
468.
Pack, C., Saito, K., Tamura, M., and Kinjo, M. (2006). Microenvironment and effect of
energy depletion in the nucleus analyzed by mobility of multiple oligomeric EGFPs. Biophys J
91, 3921-3936.
469.
Pai, C.Y., Lei, E.P., Ghosh, D., and Corces, V.G. (2004). The centrosomal protein CP190
is a component of the gypsy chromatin insulator. Mol CeLL 16, 737-748.
470.
Palstra, R.J. (2009). Close encounters of the 3C kind: long-range chromatin interactions
and transcriptional regulation. Brief Funct Genomic Proteomic 8, 297-309.
471.
Palstra, R.J., and Grosveld, F. (2012). Transcription factor binding at enhancers: shaping
a genomic regulatory landscape in flux. Frontiers in genetics 3, 195.
472.
Palstra, R.J., de Laat, W., and Grosveld, F. (2008a). Beta-globin regulation and long-
range interactions. Adv Genet 61, 107-142.
473.
Palstra, R.J., Simonis, M., Klous, P., Brasset, E., Eijkelkamp, B., and de Laat, W.
(2008b). Maintenance of long-range DNA interactions after inhibition of ongoing RNA
polymerase II transcription. PLoS One 3, e1661.
474.
Palstra, R.J., Tolhuis, B., Splinter, E., Nijmeijer, R., Grosveld, F., and de Laat, W. (2003).
The beta-globin nuclear compartment in development and erythroid differentiation. Nat Genet
35, 190-194.
475.
Papantonis, A., and Cook, P.R. (2011). Fixing the model for transcription: The DNA
moves, not the polymerase. Transcr 2, 41-44.
476.
Papantonis, A., and Cook, P.R. (2013). Transcription factories: genome organization and
gene regulation. Chemical reviews 113, 8683-8705.
359
477.
Papantonis, A., Larkin, J.D., Wada, Y., Ohta, Y., Ihara, S., Kodama, T., and Cook, P.R.
(2010). Active RNA polymerases: mobile or immobile molecular machines? PLoS Biol 8,
e1000419.
478.
Patrinos, G.P., de Krom, M., de Boer, E., Langeveld, A., Imam, A.M., Strouboulis, J., de
Laat, W., and Grosveld, F.G. (2004). Multiple interactions between regulatory regions are
required to stabilize an active chromatin hub. Genes Dev 18, 1495-1509.
479.
Pederson, T. (2000). Half a century of "the nuclear matrix". Mol Biol Cell 11, 799-805.
480.
Pekowska, A., Benoukraf, T., Zacarias-Cabeza, J., Belhocine, M., Koch, F., Holota, H.,
Imbert, J., Andrau, J.C., Ferrier, P., and Spicuglia, S. (2011). H3K4 tri-methylation provides an
epigenetic signature of active enhancers. EMBO J 30, 4198-4210.
481.
Pepenella, S., Murphy, K.J., and Hayes, J.J. (2013). Intra- and inter-nucleosome
interactions of the core histone tail domains in higher-order chromatin structure. Chromosoma.
482.
Peric-Hupkes, D., Meuleman, W., Pagie, L., Bruggeman, S.W., Solovei, I., Brugman, W.,
Graf, S., Flicek, P., Kerkhoven, R.M., van Lohuizen, M., et al. (2010). Molecular maps of the
reorganization of genome-nuclear lamina interactions during differentiation. Mol CeLL 38,
603-613.
483.
Perisic, O., Collepardo-Guevara, R., and Schlick, T. (2010). Modeling studies of
chromatin fiber structure as a function of DNA linker length. J Mol Biol 403, 777-802.
484.
Petrova, N.V., Iarovaia, O.V., Verbovoy, V.A., and Razin, S.V. (2005). Specific radial
positions of centromeres of human chromosomes X, 1, and 19 remain unchanged in chromatindepleted nuclei of primary human fibroblasts: Evidence for the organizing role of the nuclear
matrix. J Cell Biochem 96, 850-857.
485.
Philimonenko, A.A., Jackson, D.A., Hodny, Z., Janacek, J., Cook, P.R., and Hozak, P.
(2004). Dynamics of DNA replication: an ultrastructural study. J Struct Biol 148, 279-289.
360
486.
Philimonenko, V.V., Flechon, J.E., and Hozak, P. (2001). The nucleoskeleton: a
permanent structure of cell nuclei regardless of their transcriptional activity. Exp Cell Res 264,
201-210.
487.
Phillips-Cremins, J.E., and Corces, V.G. (2013). Chromatin insulators: linking genome
organization to cellular function. Mol CeLL 50, 461-474.
488.
Phillips-Cremins, J.E., Sauria, M.E., Sanyal, A., Gerasimova, T.I., Lajoie, B.R., Bell,
J.S., Ong, C.T., Hookway, T.A., Guo, C., Sun, Y., et al. (2013). Architectural protein
subclasses shape 3D organization of genomes during lineage commitment. Cell 153, 12811295.
489.
Picard, D., and Schaffner, W. (1983). Correct transcription of a cloned mouse
immunoglobulin gene in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A 80, 417-421.
490.
Pickersgill, H., Kalverda, B., de Wit, E., Talhout, W., Fornerod, M., and van Steensel, B.
(2006). Characterization of the Drosophila melanogaster genome at the nuclear lamina. Nat
Genet 38, 1005-1014.
491.
Pikaart, M.J., Recillas-Targa, F., and Felsenfeld, G. (1998). Loss of transcriptional
activity of a transgene is accompanied by DNA methylation and histone deacetylation and is
prevented by insulators. Gen Dev 12, 2852-2862.
492.
Pique-Regi, R., Degner, J.F., Pai, A.A., Gaffney, D.J., Gilad, Y., and Pritchard, J.K.
(2011). Accurate inference of transcription factor binding from DNA sequence and chromatin
accessibility data. Genome Res 21, 447-455.
493.
Pirrotta, V., and Li, H.B. (2012). A view of nuclear Polycomb bodies. Curr Opin Genet
Dev 22, 101-109.
494.
Piwien Pilipuk, G., Galigniana, M.D., and Schwartz, J. (2003). Subnuclear localization of
C/EBP beta is regulated by growth hormone and dependent on MAPK. J Biol Chem 278,
35668-35677.
361
495.
Plant, K.E., Routledge, S.J., and Proudfoot, N.J. (2001). Intergenic transcription in the
human beta-globin gene cluster. Mol Cell Biol 21, 6507-6514.
496.
Pliss, A., Malyavantham, K.S., Bhattacharya, S., and Berezney, R. (2013). Chromatin
dynamics in living cells: identification of oscillatory motion. J Cell Physiol 228, 609-616.
497.
Politz, J.C., Scalzo, D., and Groudine, M. (2013). Something silent this way forms: the
functional organization of the repressive nuclear compartment. Annual review of cell and
developmental biology 29, 241-270.
498.
Pombo, A., Jackson, D.A., Hollinshead, M., Wang, Z., Roeder, R.G., and Cook, P.R.
(1999). Regional specialization in human nuclei: visualization of discrete sites of transcription
by RNA polymerase III. EMBO J 18, 2241-2253.
499.
Prioleau, M.-N., Nony, P., Simpson, M., and Felsenfeld, G. (1999). An insulator element
and condensed chromatin region separate the chicken b-globin locus from an independently
regulated erythroid-specific folate receptor gene. EMBO J 18, 4035-4048.
500.
Prokocimer, M., Davidovich, M., Nissim-Rafinia, M., Wiesel-Motiuk, N., Bar, D.Z.,
Barkan, R., Meshorer, E., and Gruenbaum, Y. (2009). Nuclear lamins: key regulators of nuclear
structure and activities. Journal of cellular and molecular medicine 13, 1059-1085.
501.
Raab, J.R., and Kamakaka, R.T. (2010). Insulators and promoters: closer than we think.
Nat Rev Genet 11, 439-446.
502.
Raab, J.R., Chiu, J., Zhu, J., Katzman, S., Kurukuti, S., Wade, P.A., Haussler, D., and
Kamakaka, R.T. (2012). Human tRNA genes function as chromatin insulators. EMBO J 31,
330-350.
503.
Rada-Iglesias, A., Bajpai, R., Swigut, T., Brugmann, S.A., Flynn, R.A., and Wysocka, J.
(2011). A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans.
Nature 470, 279-283.
362
504.
Radulescu, A.E., and Cleveland, D.W. (2010). NuMA after 30 years: the matrix revisited.
Trends Cell Biol 20, 214-222.
505.
Ragoczy, T., Bender, M.A., Telling, A., Byron, R., and Groudine, M. (2006). The locus
control region is required for association of the murine beta-globin locus with engaged
transcription factories during erythroid maturation. Genes Dev 20, 1447-1457.
506.
Ragoczy, T., Telling, A., Sawado, T., Groudine, M., and Kosak, S.T. (2003). A genetic
analysis of chromosome territory looping: diverse roles for distal regulatory elements.
Chromosome Res 11, 513-525.
507.
Raj, A., Peskin, C.S., Tranchina, D., Vargas, D.Y., and Tyagi, S. (2006). Stochastic
mRNA synthesis in mammalian cells. PLoS Biol 4, e309.
508.
Rajendra, T.K., Praveen, K., and Matera, A.G. (2010). Genetic analysis of nuclear bodies:
from nondeterministic chaos to deterministic order. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 75,
365-374.
509.
Rando, O.J. (2012). Combinatorial complexity in chromatin structure and function:
revisiting the histone code. Curr Opin Genet Dev 22, 148-155.
510.
Rando, O.J., and Ahmad, K. (2007). Rules and regulation in the primary structure of
chromatin. Curr Opin Cell Biol 19, 250-256.
511.
Ranjan, A., Mizuguchi, G., FitzGerald, P.C., Wei, D., Wang, F., Huang, Y., Luk, E.,
Woodcock, C.L., and Wu, C. (2013). Nucleosome-free region dominates histone acetylation in
targeting SWR1 to promoters for H2A.Z replacement. Cell 154, 1232-1245.
512.
Rao, S.S., Huntley, M.H., Durand, N.C., Stamenova, E.K., Bochkov, I.D., Robinson, J.T.,
Sanborn, A.L., Machol, I., Omer, A.D., Lander, E.S., et al. (2014). A 3D map of the human
genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell 159, 1665-1680.
513.
Rapkin, L.M., Anchel, D.R., Li, R., and Bazett-Jones, D.P. (2012). A view of the
chromatin landscape. Micron 43, 150-158.
363
514.
Razin, S.V. (1987). DNA interaction with the nuclear matrix and spatial organization of
replication and transcription. BioEssays 6, 19-23.
515.
Razin, S.V., and Gromova, I.I. (1995). The channels model of the nuclear matrix
structure. BioEssays 17, 443-450.
516.
Razin, S.V., Farrell, C.M., and Recillas-Targa, F. (2003). Genomic domains and
regulatory elements operating at the domain level. Int Rev Cytol 226, 63-125.
517.
Razin, S.V., Gromova, II, and Iarovaia, O.V. (1995). Specificity and functional
significance of DNA interaction with the nuclear matrix: new approaches to clarify the old
questions. Int Rev Cytol 162B, 405-448.
518.
Razin, S.V., Iarovaia, O.V., Sjakste, N., Sjakste, T., Bagdoniene, L., Rynditch, A.V.,
Eivazova, E.R., Lipinski, M., and Vassetzky, Y.S. (2007). Chromatin domains and regulation
of transcription. J Mol Biol 369, 597-607.
519.
Razin, S.V., Kekelidze, M.G., Lukanidin, E.M., Scherrer, K., and Georgiev, G.P. (1986).
Replication origins are attached to the nuclear skeleton. Nucl Acids Res 14, 8189-8207.
520.
Razin, S.V., Petrov, P., and Hancock, R. (1991). Precise localization of the a-globin gene
cluster within one of the 20- to 300-Kilobase DNA fragment released by cleavage of chicken
chromosomal DNA at topoisomerase II site in vivo: evidence that the fragment are DNA loops
or domains. Porc Natl Acad Sci USA 88, 8515-8519.
521.
Recillas-Targa, F., and Razin, S.V. (2001). Chromatin domains and regulation of gene
expression: familiar and enigmatic clusters of chicken globin genes. Crit Rev Eukaryot Gene
Expr 11, 227-242.
522.
Recillas-Targa, F., Bell, A.C., and Felsenfeld, G. (1999). Positional enhancer-blocking
activity of the chicken beta-globin insulator in transiently transfected cells. Proc Natl Acad Sci
U S A 96, 14354-14359.
364
523.
Recillas-Targa, F., Pikaart, M.J., Burgess-Beusse, B., Bell, A.C., Litt, M.D., West, A.G.,
Gaszner, M., and Felsenfeld, G. (2002). Position-effect protection and enhancer blocking by the
chicken beta-globin insulator are separable activities. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 6883-6888.
524.
Reddy, K.L., Zullo, J.M., Bertolino, E., and Singh, H. (2008). Transcriptional repression
mediated by repositioning of genes to the nuclear lamina. Nature 452, 243-247.
525.
Reitman, M., and Felsenfeld, G. (1990). Developmental regulation of topoisomerase II
sites and DNase I-hypersensitive sites in the chicken beta-globin locus. Mol Cell Biol 10, 27742786.
526.
Reitman, M., Lee, E., and Westphal, H. (1995). Function of the upstream hypersensitive
sites of the chicken beta-globin gene cluster in mice. Nucleic Acids Res 23, 1790-1794.
527.
Reitman, M., Lee, E., Westphal, H., and Felsenfeld, G. (1990). Site-independent
expression of the chicken beta A-globin gene in transgenic mice. Nature 348, 749-752.
528.
Ren, X., Siegel, R., Kim, U., and Roeder, R.G. (2011). Direct interactions of OCA-B and
TFII-I regulate immunoglobulin heavy-chain gene transcription by facilitating enhancerpromoter communication. Mol CeLL 42, 342-355.
529.
Richter, K., Nessling, M., and Lichter, P. (2008). Macromolecular crowding and its
potential impact on nuclear function. Biochim Biophys Acta 1783, 2100-2107.
530.
Richter, K., Reichenzeller, M., Gorisch, S.M., Schmidt, U., Scheuermann, M.O.,
Herrmann, H., and Lichter, P. (2005). Characterization of a nuclear compartment shared by
nuclear bodies applying ectopic protein expression and correlative light and electron
microscopy. Exp Cell Res 303, 128-137.
531.
Rippe, K. (2007). Dynamic organization of the cell nucleus. Curr Opin Genet Dev 17,
373-380.
365
532.
Robinson, P.J., Fairall, L., Huynh, V.A., and Rhodes, D. (2006). EM measurements
define the dimensions of the "30-nm" chromatin fiber: evidence for a compact, interdigitated
structure. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 6506-6511.
533.
Rosa, A., and Everaers, R. (2008). Structure and dynamics of interphase chromosomes.
PLoS computational biology 4, e1000153.
534.
Rowley, P.T., Ohlsson-Wilhelm, B.M., and Farley, B.A. (1985). K562 human
erythroleukemia cells demonstrate commitment. Blood 65, 862-868.
535.
Rubtsov, M.A., Terekhov, S.M., Razin, S.V., and Iarovaia, O.V. (2008). Repositioning of
ETO gene in cells treated with VP-16, an inhibitor of DNA-Topoisomerase II. J Cell Biochem.
536.
Ruhl, D.D., Jin, J., Cai, Y., Swanson, S., Florens, L., Washburn, M.P., Conaway, R.C.,
Conaway, J.W., and Chrivia, J.C. (2006). Purification of a human SRCAP complex that
remodels chromatin by incorporating the histone variant H2A.Z into nucleosomes.
Biochemistry 45, 5671-5677.
537.
Sacco-Bubulya, P., and Spector, D.L. (2002). Disassembly of interchromatin granule
clusters alters the coordination of transcription and pre-mRNA splicing. J Cell Biol 156, 425436.
538.
Sadoni, N., Cardoso, M.C., Stelzer, E.H., Leonhardt, H., and Zink, D. (2004). Stable
chromosomal units determine the spatial and temporal organization of DNA replication. J Cell
Sci 117, 5353-5365.
539.
Saitoh, N., Bell, A.C., Recillas-Targa, F., West, A.G., Simpson, M., Pikaart, M., and
Felsenfeld, G. (2000). Structural and functional conservation at the boundaries of the chicken
beta-globin domain. EMBO J 19, 2315-2322.
540.
Saitoh, N., Spahr, C.S., Patterson, S.D., Bubulya, P., Neuwald, A.F., and Spector, D.L.
(2004). Proteomic analysis of interchromatin granule clusters. Mol Biol Cell 15, 3876-3890.
366
541.
Sajan, S.A., and Hawkins, R.D. (2012). Methods for identifying higher-order chromatin
structure. Annual review of genomics and human genetics 13, 59-82.
542.
Salzler, H.R., Tatomer, D.C., Malek, P.Y., McDaniel, S.L., Orlando, A.N., Marzluff,
W.F., and Duronio, R.J. (2013). A sequence in the Drosophila H3-H4 Promoter triggers histone
locus body assembly and biosynthesis of replication-coupled histone mRNAs. Dev Cell 24,
623-634.
543.
Samatov, T.R., Chetverina, H.V., and Chetverin, A.B. (2006). Real-time monitoring of
DNA colonies growing in a polyacrylamide gel. Anal Biochem 356, 300-302.
544.
Sanchez-Pulido, L., Valencia, A., and Rojas, A.M. (2007). Are promyelocytic leukaemia
protein nuclear bodies a scaffold for caspase-2 programmed cell death? Trends Biochem Sci
32, 400-406.
545.
Sanyal, A., Bau, D., Marti-Renom, M.A., and Dekker, J. (2011). Chromatin globules: a
common motif of higher order chromosome structure? Curr Opin Cell Biol 23, 325-331.
546.
Sanyal, A., Lajoie, B.R., Jain, G., and Dekker, J. (2012). The long-range interaction
landscape of gene promoters. Nature 489, 109-113.
547.
Savitskaya, E., Melnikova, L., Kostuchenko, M., Kravchenko, E., Pomerantseva, E.,
Boikova, T., Chetverina, D., Parshikov, A., Zobacheva, P., Gracheva, E., et al. (2006). Study of
long-distance functional interactions between Su(Hw) insulators that can regulate enhancerpromoter communication in Drosophila melanogaster. Mol Cell Biol 26, 754-761.
548.
Scaffidi, P., and Bianchi, M.E. (2001). Spatially precise DNA bending is an essential
activity of the sox2 transcription factor. J Biol Chem 276, 47296-47302.
549.
Schalch, T., Duda, S., Sargent, D.F., and Richmond, T.J. (2005). X-ray structure of a
tetranucleosome and its implications for the chromatin fibre. Nature 436, 138-141.
367
550.
Schermelleh, L., Solovei, I., Zink, D., and Cremer, T. (2001). Two-color fluorescence
labeling of early and mid-to-late replicating chromatin in living cells. Chromosome Res 9, 7780.
551.
Schneider, R., and Grosschedl, R. (2007). Dynamics and interplay of nuclear architecture,
genome organization, and gene expression. Genes Dev 21, 3027-3043.
552.
Schnitzler, G.R. (2008). Control of nucleosome positions by DNA sequence and
remodeling machines. Cell Biochem Biophys 51, 67-80.
553.
Schoborg, T., and Labrador, M. (2014). Expanding the roles of chromatin insulators in
nuclear architecture, chromatin organization and genome function. Cell Mol Life Sci.
554.
Schoenfelder, S., Clay, I., and Fraser, P. (2010a). The transcriptional interactome: gene
expression in 3D. Curr Opin Genet Dev 20, 127-133.
555.
Schoenfelder, S., Sexton, T., Chakalova, L., Cope, N.F., Horton, A., Andrews, S.,
Kurukuti, S., Mitchell, J.A., Umlauf, D., Dimitrova, D.S., et al. (2010b). Preferential
associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells.
Nat Genet 42, 53-61.
556.
Schubeler, D., Francastel, C., Cimbora, D.M., Reik, A., Martin, D.I.K., and Groudine, M.
(2000). Nuclear localization and histone acetilation: a pathway for chromatin opening and
transcription activation of the human b-globin locus. Gen Dev 14, 940-950.
557.
Segal, E., and Widom, J. (2009). Poly(dA:dT) tracts: major determinants of nucleosome
organization. Curr Opin Struct Biol 19, 65-71.
558.
Sequeira-Mendes, J., Diaz-Uriarte, R., Apedaile, A., Huntley, D., Brockdorff, N., and
Gomez, M. (2009). Transcription initiation activity sets replication origin efficiency in
mammalian cells. PLoS Genet 5, e1000446.
368
559.
Sexton, T., Umlauf, D., Kurukuti, S., and Fraser, P. (2007). The role of transcription
factories in large-scale structure and dynamics of interphase chromatin. Semin Cell Dev Biol
18, 691-697.
560.
Sexton, T., Yaffe, E., Kenigsberg, E., Bantignies, F., Leblanc, B., Hoichman, M.,
Parrinello, H., Tanay, A., and Cavalli, G. (2012). Three-dimensional folding and functional
organization principles of the Drosophila genome. Cell 148, 458-472.
561.
Sha, K., Gu, S.G., Pantalena-Filho, L.C., Goh, A., Fleenor, J., Blanchard, D., Krishna, C.,
and Fire, A. (2010). Distributed probing of chromatin structure in vivo reveals pervasive
chromatin accessibility for expressed and non-expressed genes during tissue differentiation in
C. elegans. BMC Genomics 11, 465.
562.
Shaper, J.H., Pardoll, D.M., Kaufmann, S.H., Barrack, E.R., Vogelstein, B., and Coffey,
D.S. (1978). The relationship of the nuclear matrix to cellular structure and function. Adv
Enzyme Regul 17, 213-248.
563.
Shen, Y., Yue, F., McCleary, D.F., Ye, Z., Edsall, L., Kuan, S., Wagner, U., Dixon, J.,
Lee, L., Lobanenkov, V.V., et al. (2012). A map of the cis-regulatory sequences in the mouse
genome. Nature 488, 116-120.
564.
Sherwood, R.I., Hashimoto, T., O'Donnell, C.W., Lewis, S., Barkal, A.A., van Hoff, J.P.,
Karun, V., Jaakkola, T., and Gifford, D.K. (2014). Discovery of directional and nondirectional
pioneer transcription factors by modeling DNase profile magnitude and shape. Nat Biotechnol
32, 171-178.
565.
Shevtsov, S.P., and Dundr, M. (2011). Nucleation of nuclear bodies by RNA. Nat Cell
Biol 13, 167-173.
566.
Shiels, C., Islam, S.A., Vatcheva, R., Sasieni, P., Sternberg, M.J., Freemont, P.S., and
Sheer, D. (2001). PML bodies associate specifically with the MHC gene cluster in interphase
nuclei. J Cell Sci 114, 3705-3716.
369
567.
Shilatifard, A. (2012). The COMPASS family of histone H3K4 methylases: mechanisms
of regulation in development and disease pathogenesis. Annu Rev Biochem 81, 65-95.
568.
Shopland, L.S., Johnson, C.V., Byron, M., McNeil, J., and Lawrence, J.B. (2003).
Clustering of multiple specific genes and gene-rich R-bands around SC-35 domains: evidence
for local euchromatic neighborhoods. J Cell Biol 162, 981-990.
569.
Shumaker, D.K., Kuczmarski, E.R., and Goldman, R.D. (2003). The nucleoskeleton:
lamins and actin are major players in essential nuclear functions. Curr Opin Cell Biol 15, 358366.
570.
Silim, A., El Azhary, M.A., and Roy, R.S. (1982). A simple technique for preparation of
chicken-embryo-skin cell cultures. Avian Dis 26, 182-185.
571.
Simon, D.N., and Wilson, K.L. (2011). The nucleoskeleton as a genome-associated
dynamic 'network of networks'. Nat Rev Mol Cell Biol 12, 695-708.
572.
Simonis, M., and de Laat, W. (2008). FISH-eyed and genome-wide views on the spatial
organisation of gene expression. Biochim Biophys Acta 1783, 2052-2060.
573.
Simonis, M., Klous, P., Splinter, E., Moshkin, Y., Willemsen, R., de Wit, E., van
Steensel, B., and de Laat, W. (2006). Nuclear organization of active and inactive chromatin
domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4C). Nat Genet 38, 13481354.
574.
Sivachandran, N., Wang, X., and Frappier, L. (2012). Functions of the Epstein-Barr virus
EBNA1 protein in viral reactivation and lytic infection. J Virol 86, 6146-6158.
575.
Sleeman, J.E., Ajuh, P., and Lamond, A.I. (2001). snRNP protein expression enhances
the formation of Cajal bodies containing p80-coilin and SMN. J Cell Sci 114, 4407-4419.
576.
Sleeman, J.E., and Trinkle-Mulcahy, L. (2014). Nuclear bodies: new insights into
assembly/dynamics and disease relevance. Curr Opin Cell Biol 28C, 76-83.
370
577.
Smigova, J., Juda, P., Cmarko, D., and Raska, I. (2011). Fine structure of the "PcG body"
in human U-2 OS cells established by correlative light-electron microscopy. Nucleus 2, 219228.
578.
Smith, K.P., and Lawrence, J.B. (2000). Interactions of U2 gene loci and their nuclear
transcripts with Cajal (coiled) bodies: evidence for PreU2 within Cajal bodies. Mol Biol Cell
11, 2987-2998.
579.
Smith, K.P., Carter, K.C., Johnson, C.V., and Lawrence, J.B. (1995). U2 and U1 snRNA
gene loci associate with coiled bodies. J Cell Biochem 59, 473-485.
580.
Smits, B.M., Haag, J.D., Rissman, A.I., Sharma, D., Tran, A., Schoenborn, A.A., Baird,
R.C., Peiffer, D.S., Leinweber, D.Q., Muelbl, M.J., et al. (2013). The gene desert mammary
carcinoma susceptibility locus Mcs1a regulates Nr2f1 modifying mammary epithelial cell
differentiation and proliferation. PLoS Genet 9, e1003549.
581.
Sofueva, S., and Hadjur, S. (2012). Cohesin-mediated chromatin interactions--into the
third dimension of gene regulation. Brief Funct Genomics 11, 205-216.
582.
Sofueva, S., Yaffe, E., Chan, W.C., Georgopoulou, D., Vietri Rudan, M., Mira-
Bontenbal, H., Pollard, S.M., Schroth, G.P., Tanay, A., and Hadjur, S. (2013). Cohesinmediated interactions organize chromosomal domain architecture. EMBO J 32, 3119-3129.
583.
Song, S.H., Hou, C., and Dean, A. (2007). A positive role for NLI/Ldb1 in long-range
beta-globin locus control region function. Mol CeLL 28, 810-822.
584.
Spector, D.L., and Lamond, A.I. (2011). Nuclear speckles. Cold Spring Harb Perspect
Biol 3.
585.
Spector, D.L., Fu, X.D., and Maniatis, T. (1991). Associations between distinct pre-
mRNA splicing components and the cell nucleus. EMBO J 10, 3467-3481.
586.
Spector, D.L., Schrier, W.H., and Busch, H. (1983). Immunoelectron microscopic
localization of snRNPs. Biol Cell 49, 1-10.
371
587.
Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H.J., Klous, P., and de Laat, W. (2012).
Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq
technology: from fixation to computation. Methods 58, 221-230.
588.
Splinter, E., Grosveld, F., and de Laat, W. (2004). 3C technology: analyzing the spatial
organization of genomic loci in vivo. Methods Enzymol 375, 493-507.
589.
Splinter, E., Heath, H., Kooren, J., Palstra, R.J., Klous, P., Grosveld, F., Galjart, N., and
de Laat, W. (2006). CTCF mediates long-range chromatin looping and local histone
modification in the beta-globin locus. Genes Dev 20, 2349-2354.
590.
Srinivasan, M., Sedmak, D., and Jewell, S. (2002). Effect of fixatives and tissue
processing on the content and integrity of nucleic acids. Am J Pathol 161, 1961-1971.
591.
Stein, G.S., Lian, J.B., van Wijnen, A.J., Stein, J.L., Javed, A., Montecino, M., Zaidi,
S.K., Young, D., Choi, J.Y., Gutierrez, S., et al. (2004). Nuclear microenvironments support
assembly and organization of the transcriptional regulatory machinery for cell proliferation and
differentiation. J Cell Biochem 91, 287-302.
592.
Stern, J.L., Zyner, K.G., Pickett, H.A., Cohen, S.B., and Bryan, T.M. (2012). Telomerase
recruitment requires both TCAB1 and Cajal bodies independently. Mol Cell Biol 32, 23842395.
593.
Sterner, D.E., and Berger, S.L. (2000). Acetylation of histones and transcription-related
factors. Microbiol Mol Biol Rev 64, 435-459.
594.
Strahl, B.D., and Allis, C.D. (2000). The language of covalent histone modifications.
Nature 403, 41-45.
595.
Stros, M. (2010). HMGB proteins: interactions with DNA and chromatin. Biochim
Biophys Acta 1799, 101-113.
596.
Struhl, K. (1985). Naturally occurring poly(dA-dT) sequences are upstream promoter
elements for constitutive transcription in yeast. Proc Natl Acad Sci U S A 82, 8419-8423.
372
597.
Struhl, K. (1999). Fundamentally different logic of gene regulation in eukaryotes and
prokaryotes. Cell 98, 1-4.
598.
Su, W., Jackson, S., Tjian, R., and Echols, H. (1991). DNA looping between sites for
transcriptional activation: self-association of DNA-bound Sp1. Genes Dev 5, 820-826.
599.
Sun, Y., Durrin, L.K., and Krontiris, T.G. (2003). Specific interaction of PML bodies
with the TP53 locus in Jurkat interphase nuclei. Genomics 82, 250-252.
600.
Sutherland, H., and Bickmore, W.A. (2009). Transcription factories: gene expression in
unions? Nat Rev Genet 10, 457-466.
601.
Svotelis, A., Gevry, N., and Gaudreau, L. (2009). Regulation of gene expression and
cellular proliferation by histone H2A.Z. Biochem Cell Biol 87, 179-188.
602.
Symmons, O., Uslu, V.V., Tsujimura, T., Ruf, S., Nassari, S., Schwarzer, W., Ettwiller,
L., and Spitz, F. (2014). Functional and topological characteristics of mammalian regulatory
domains. Genome Res 24, 390-400.
603.
Szczerbal, I., and Bridger, J.M. (2010). Association of adipogenic genes with SC-35
domains during porcine adipogenesis. Chromosome Res 18, 887-895.
604.
Taatjes, D.J. (2010). The human Mediator complex: a versatile, genome-wide regulator
of transcription. Trends Biochem Sci 35, 315-322.
605.
Takata, H., Nishijima, H., Maeshima, K., and Shibahara, K. (2012). The integrator
complex is required for integrity of Cajal bodies. J Cell Sci 125, 166-175.
606.
Tanimoto, K., Liu, Q., Bungert, J., and J.D., E. (1999). Effects of altered gene order or
orientation of the locus control region on human b-globin gene expression in mice. Nature 398,
344-348.
607.
Tanizawa, H., Iwasaki, O., Tanaka, A., Capizzi, J.R., Wickramasinghe, P., Lee, M., Fu,
Z., and Noma, K. (2010). Mapping of long-range associations throughout the fission yeast
373
genome reveals global genome organization linked to transcriptional regulation. Nucleic Acids
Res 38, 8164-8177.
608.
Tark-Dame, M., van Driel, R., and Heermann, D.W. (2011). Chromatin folding--from
biology to polymer models and back. J Cell Sci 124, 839-845.
609.
Taslerova, R., Kozubek, S., Lukasova, E., Jirsova, P., Bartova, E., and Kozubek, M.
(2003). Arrangement of chromosome 11 and 22 territories, EWSR1 and FLI1 genes, and other
genetic elements of these chromosomes in human lymphocytes and Ewing sarcoma cells. Hum
Genet 112, 143-155.
610.
Taverna, S.D., Li, H., Ruthenburg, A.J., Allis, C.D., and Patel, D.J. (2007). How
chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket
pickers. Nat Struct Mol Biol 14, 1025-1040.
611.
Thiry, M. (1995). The interchromatin granules. Histol Histopathol 10, 1035-1045.
612.
Thomson, I., Gilchrist, S., Bickmore, W.A., and Chubb, J.R. (2004). The radial
positioning of chromatin is not inherited through mitosis but is established de novo in early G1.
Curr Biol 14, 166-172.
613.
Thomson, J.P., Skene, P.J., Selfridge, J., Clouaire, T., Guy, J., Webb, S., Kerr, A.R.,
Deaton, A., Andrews, R., James, K.D., et al. (2010). CpG islands influence chromatin structure
via the CpG-binding protein Cfp1. Nature 464, 1082-1086.
614.
Thurman, R.E., Rynes, E., Humbert, R., Vierstra, J., Maurano, M.T., Haugen, E.,
Sheffield, N.C., Stergachis, A.B., Wang, H., Vernot, B., et al. (2012). The accessible chromatin
landscape of the human genome. Nature 489, 75-82.
615.
Tolhuis, B., Blom, M., Kerkhoven, R.M., Pagie, L., Teunissen, H., Nieuwland, M.,
Simonis, M., de Laat, W., van Lohuizen, M., and van Steensel, B. (2011). Interactions among
Polycomb domains are guided by chromosome architecture. PLoS Genet 7, e1001343.
374
616.
Tolhuis, B., Palstra, R.J., Splinter, E., Grosveld, F., and de Laat, W. (2002). Looping and
interaction between hypersensitive sites in the active beta-globin locus. Mol Cell 10, 14531465.
617.
Towbin, B.D., Gonzalez-Aguilera, C., Sack, R., Gaidatzis, D., Kalck, V., Meister, P.,
Askjaer, P., and Gasser, S.M. (2012). Step-wise methylation of histone H3K9 positions
heterochromatin at the nuclear periphery. Cell 150, 934-947.
618.
Travers, A. (1999). Chromatin modification by DNA tracking. Proc Natl Acad Sci USA
96, 13634-13637.
619.
Tremethick, D.J. (2007). Higher-order structures of chromatin: the elusive 30 nm fiber.
Cell 128, 651-654.
620.
Tucker, K.E., Berciano, M.T., Jacobs, E.Y., LePage, D.F., Shpargel, K.B., Rossire, J.J.,
Chan, E.K., Lafarga, M., Conlon, R.A., and Matera, A.G. (2001). Residual Cajal bodies in
coilin knockout mice fail to recruit Sm snRNPs and SMN, the spinal muscular atrophy gene
product. J Cell Biol 154, 293-307.
621.
Tufarelli, C., Frischauf, A.M., Hardison, R., Flint, J., and Higgs, D.R. (2001).
Characterization of a widely expressed gene (LUC7-LIKE; LUC7L) defining the centromeric
boundary of the human alpha-globin domain. Genomics 71, 307-314.
622.
Tufarelli, C., Hardison, R., Miller, W., Hughes, J., Clark, K., Ventress, N., Frischauf,
A.M., and Higgs, D.R. (2004). Comparative analysis of the alpha-like globin clusters in mouse,
rat, and human chromosomes indicates a mechanism underlying breaks in conserved synteny.
Genome Res 14, 623-630.
623.
Tyagi, S., and Kramer, F.R. (1996). Molecular beacons: probes that fluoresce upon
hybridization. Nat Biotechnol 14, 303-308.
624.
Umbarger, M.A., Toro, E., Wright, M.A., Porreca, G.J., Bau, D., Hong, S.H., Fero, M.J.,
Zhu, L.J., Marti-Renom, M.A., McAdams, H.H., et al. (2011). The three-dimensional
375
architecture of a bacterial genome and its alteration by genetic perturbation. Mol CeLL 44, 252264.
625.
Uslu, V.V., Petretich, M., Ruf, S., Langenfeld, K., Fonseca, N.A., Marioni, J.C., and
Spitz, F. (2014). Long-range enhancers regulating Myc expression are required for normal
facial morphogenesis. Nat Genet 46, 753-758.
626.
Vakoc, C.R., Letting, D.L., Gheldof, N., Sawado, T., Bender, M.A., Groudine, M.,
Weiss, M.J., Dekker, J., and Blobel, G.A. (2005). Proximity among distant regulatory elements
at the beta-globin locus requires GATA-1 and FOG-1. Mol Cell 17, 453-462.
627.
van Bemmel, J.G., Pagie, L., Braunschweig, U., Brugman, W., Meuleman, W.,
Kerkhoven, R.M., and van Steensel, B. (2010). The insulator protein SU(HW) fine-tunes
nuclear lamina interactions of the Drosophila genome. PLoS One 5, e15013.
628.
Van Bortle, K., and Corces, V.G. (2012a). Nuclear organization and genome function.
Annual review of cell and developmental biology 28, 163-187.
629.
Van Bortle, K., and Corces, V.G. (2012b). tDNA insulators and the emerging role of
TFIIIC in genome organization. Transcription 3, 277-284.
630.
van de Corput, M.P., de Boer, E., Knoch, T.A., van Cappellen, W.A., Quintanilla, A.,
Ferrand, L., and Grosveld, F.G. (2012). Super-resolution imaging reveals 3D folding dynamics
of the beta-globin locus upon gene activation. J Cell Sci.
631.
van de Werken, H.J., de Vree, P.J., Splinter, E., Holwerda, S.J., Klous, P., de Wit, E., and
de Laat, W. (2012). 4C technology: protocols and data analysis. Methods Enzymol 513, 89112.
632.
van der Vliet, P.C., and Verrijzer, C.P. (1993). Bending of DNA by transcription factors.
BioEssays 15, 25-32.
633.
van Driel, R., Wansink, D.G., van Steensel, B., Grande, M.A., Schul, W., and de Jong, L.
(1995). Nuclear domains and the nuclear matrix. Int Rev Cytol 162A, 151-189.
376
634.
van Koningsbruggen, S., Gierlinski, M., Schofield, P., Martin, D., Barton, G.J., Ariyurek,
Y., den Dunnen, J.T., and Lamond, A.I. (2010). High-resolution whole-genome sequencing
reveals that specific chromatin domains from most human chromosomes associate with
nucleoli. Mol Biol Cell 21, 3735-3748.
635.
VanDemark, A.P., Kasten, M.M., Ferris, E., Heroux, A., Hill, C.P., and Cairns, B.R.
(2007). Autoregulation of the rsc4 tandem bromodomain by gcn5 acetylation. Mol CeLL 27,
817-828.
636.
Vavouri, T., McEwen, G.K., Woolfe, A., Gilks, W.R., and Elgar, G. (2006). Defining a
genomic radius for long-range enhancer action: duplicated conserved non-coding elements hold
the key. Trends Genet 22, 5-10.
637.
Venteicher, A.S., Abreu, E.B., Meng, Z., McCann, K.E., Terns, R.M., Veenstra, T.D.,
Terns, M.P., and Artandi, S.E. (2009). A human telomerase holoenzyme protein required for
Cajal body localization and telomere synthesis. Science 323, 644-648.
638.
Vermeulen, M., and Timmers, H.T. (2010). Grasping trimethylation of histone H3 at
lysine 4. Epigenomics 2, 395-406.
639.
Vernimmen, D., De Gobbi, M., Sloane-Stanley, J.A., Wood, W.G., and Higgs, D.R.
(2007). Long-range chromosomal interactions regulate the timing of the transition between
poised and active gene expression. EMBO J 26, 2041-2051.
640.
Vernimmen, D., Marques-Kranc, F., Sharpe, J.A., Sloane-Stanley, J.A., Wood, W.G.,
Wallace, H.A., Smith, A.J., and Higgs, D.R. (2009). Chromosome looping at the human alphaglobin locus is mediated via the major upstream regulatory element (HS -40). Blood 114, 42534260.
641.
Verschure, P.J., Van Der Kraan, I., Enserink, J.M., Mone, M.J., Manders, E.M., and Van
Driel, R. (2002). Large-scale chromatin organization and the localization of proteins involved
in gene expression in human cells. J Histochem Cytochem 50, 1303-1312.
377
642.
Verschure, P.J., van Der Kraan, I., Manders, E.M., and van Driel, R. (1999). Spatial
relationship between transcription sites and chromosome territories. J Cell Biol 147, 13-24.
643.
Verschure, P.J., van der Kraan, I., Manders, E.M., Hoogstraten, D., Houtsmuller, A.B.,
and van Driel, R. (2003). Condensed chromatin domains in the mammalian nucleus are
accessible to large macromolecules. EMBO Rep 4, 861-866.
644.
Visel, A., Rubin, E.M., and Pennacchio, L.A. (2009). Genomic views of distant-acting
enhancers. Nature 461, 199-205.
645.
Visvader, J.E., Mao, X., Fujiwara, Y., Hahm, K., and Orkin, S.H. (1997). The LIM-
domain binding protein Ldb1 and its partner LMO2 act as negative regulators of erythroid
differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 13707-13712.
646.
Vizlin-Hodzic, D., Johansson, H., Ryme, J., Simonsson, T., and Simonsson, S. (2011a).
SAF-A has a role in transcriptional regulation of Oct4 in ES cells through promoter binding.
Cellular reprogramming 13, 13-27.
647.
Vizlin-Hodzic, D., Runnberg, R., Ryme, J., Simonsson, S., and Simonsson, T. (2011b).
SAF-A forms a complex with BRG1 and both components are required for RNA polymerase II
mediated transcription. PLoS One 6, e28049.
648.
Vyas, P., Vickers, M.A., Picketts, D.J., Higgs, D.R. (1995). Conservation of position and
sequence of a novel, widely expressed gene containing the major human alpha-globin
regulatory element. Genomics 29, 679-689.
649.
Wachsmuth, M., Caudron-Herger, M., and Rippe, K. (2008). Genome organization:
balancing stability and plasticity. Biochim Biophys Acta 1783, 2061-2079.
650.
Walter, A., Chapuis, C., Huet, S., and Ellenberg, J. (2013). Crowded chromatin is not
sufficient for heterochromatin formation and not required for its maintenance. J Struct Biol
184, 445-453.
378
651.
Wang, C., Liu, C., Roqueiro, D., Grimm, D., Schwab, R., Becker, C., Lanz, C., and
Weigel, D. (2015). Genome-wide analysis of local chromatin packing in Arabidopsis thaliana.
Genome Res 25, 246-256.
652.
Wang, J., Shiels, C., Sasieni, P., Wu, P.J., Islam, S.A., Freemont, P.S., and Sheer, D.
(2004). Promyelocytic leukemia nuclear bodies associate with transcriptionally active genomic
regions. J Cell Biol 164, 515-526.
653.
Wang, J., Zhuang, J., Iyer, S., Lin, X., Whitfield, T.W., Greven, M.C., Pierce, B.G.,
Dong, X., Kundaje, A., Cheng, Y., et al. (2012). Sequence features and chromatin structure
around the genomic regions bound by 119 human transcription factors. Genome Res 22, 17981812.
654.
Wang, L., Di, L.J., Lv, X., Zheng, W., Xue, Z., Guo, Z.C., Liu, D.P., and Liang, C.C.
(2009). Inter-MAR association contributes to transcriptionally active looping events in human
beta-globin gene cluster. PLoS One 4, e4629.
655.
Wang, Q., Carroll, J.S., and Brown, M. (2005). Spatial and temporal recruitment of
androgen receptor and its coactivators involves chromosomal looping and polymerase tracking.
Mol CeLL 19, 631-642.
656.
Wang, T.Y., Han, Z.M., Chai, Y.R., and Zhang, J.H. (2010). A mini review of MAR-
binding proteins. Mol Biol Rep 37, 3553-3560.
657.
Wansink, D.G., Schul, W., van der Kraan, I., van Steensel, B., van Driel, R., and de Jong,
L. (1993). Fluorescent labeling of nascent RNA reveals transcription by RNA polymerase II in
domains scattered throughout the nucleus. J Cell Biol 122, 283-293.
658.
Weidemann, T., Wachsmuth, M., Knoch, T.A., Muller, G., Waldeck, W., and Langowski,
J. (2003). Counting nucleosomes in living cells with a combination of fluorescence correlation
spectroscopy and confocal imaging. J Mol Biol 334, 229-240.
379
659.
Weiss, M. (2014). Crowding, diffusion, and biochemical reactions. International review
of cell and molecular biology 307, 383-417.
660.
Wendt, K.S., Yoshida, K., Itoh, T., Bando, M., Koch, B., Schirghuber, E., Tsutsumi, S.,
Nagae, G., Ishihara, K., Mishiro, T., et al. (2008). Cohesin mediates transcriptional insulation
by CCCTC-binding factor. Nature 451, 796-801.
661.
West, A.G., and Fraser, P. (2005). Remote control of gene transcription. Hum Mol Genet
14 Spec No 1, R101-111.
662.
White, R. (2012). Packaging the fly genome: domains and dynamics. Brief Funct
Genomics 11, 347-355.
663.
Whyte, W.A., Orlando, D.A., Hnisz, D., Abraham, B.J., Lin, C.Y., Kagey, M.H., Rahl,
P.B., Lee, T.I., and Young, R.A. (2013). Master transcription factors and mediator establish
super-enhancers at key cell identity genes. Cell 153, 307-319.
664.
Wiesmeijer, K., Krouwels, I.M., Tanke, H.J., and Dirks, R.W. (2008). Chromatin
movement visualized with photoactivable GFP-labeled histone H4. Differentiation; research in
biological diversity 76, 83-90.
665.
Wijgerde, M., Grosveld, F., and Fraser, P. (1995). Transcription complex stability and
chromatin dynamics in vivo. Nature 377, 209-213.
666.
Williamson, I., Eskeland, R., Lettice, L.A., Hill, A.E., Boyle, S., Grimes, G.R., Hill, R.E.,
and Bickmore, W.A. (2012). Anterior-posterior differences in HoxD chromatin topology in
limb development. Development 139, 3157-3167.
667.
Wilson, R.H., and Coverley, D. (2013). Relationship between DNA replication and the
nuclear matrix. Genes Cells 18, 17-31.
668.
Wong, H., Victor, J.M., and Mozziconacci, J. (2007). An all-atom model of the chromatin
fiber containing linker histones reveals a versatile structure tuned by the nucleosomal repeat
length. PLoS One 2, e877.
380
669.
Wood, W.I., and Felsenfeld, G. (1982). Chromatin structure of the chicken beta-globin
gene region. Sensitivity to DNase I, micrococcal nuclease, and DNase II. J Biol Chem 257,
7730-7736.
670.
Woodcock, C.L., Frado, L.L., and Rattner, J.B. (1984). The higher-order structure of
chromatin: evidence for a helical ribbon arrangement. J Cell Biol 99, 42-52.
671.
Wu, C.H., and Gall, J.G. (1993). U7 small nuclear RNA in C snurposomes of the
Xenopus germinal vesicle. Proc Natl Acad Sci U S A 90, 6257-6259.
672.
Wu, R., Terry, A.V., Singh, P.B., and Gilbert, D.M. (2005). Differential subnuclear
localization and replication timing of histone H3 lysine 9 methylation states. Mol Biol Cell 16,
2872-2881.
673.
Wysocka, J., Swigut, T., Xiao, H., Milne, T.A., Kwon, S.Y., Landry, J., Kauer, M.,
Tackett, A.J., Chait, B.T., Badenhorst, P., et al. (2006). A PHD finger of NURF couples
histone H3 lysine 4 trimethylation with chromatin remodelling. Nature 442, 86-90.
674.
Xiao, R., Tang, P., Yang, B., Huang, J., Zhou, Y., Shao, C., Li, H., Sun, H., Zhang, Y.,
and Fu, X.D. (2012). Nuclear matrix factor hnRNP U/SAF-A exerts a global control of
alternative splicing by regulating U2 snRNP maturation. Mol CeLL 45, 656-668.
675.
Xu, L., Feng, S., and Zhou, X. (2011). Human telomeric G-quadruplexes undergo
dynamic conversion in a molecular crowding environment. Chem Commun (Camb) 47, 35173519.
676.
Xu, M., and Cook, P.R. (2008). Similar active genes cluster in specialized transcription
factories. J Cell Biol 181, 615-623.
677.
Yang, D., and Arya, G. (2011). Structure and binding of the H4 histone tail and the
effects of lysine 16 acetylation. Physical chemistry chemical physics : PCCP 13, 2911-2921.
678.
Yaniv, M., and Cereghini, S. (1986). Structure of transcriptionally active chromatin. CRC
Crit Rev Biochem 21, 1-26.
381
679.
Yavartanoo, M., and Choi, J.K. (2013). ENCODE: A Sourcebook of Epigenomes and
Chromatin Language. Genomics & informatics 11, 2-6.
680.
Young, P.J., Le, T.T., thi Man, N., Burghes, A.H., and Morris, G.E. (2000). The
relationship between SMN, the spinal muscular atrophy protein, and nuclear coiled bodies in
differentiated tissues and cultured cells. Exp Cell Res 256, 365-374.
681.
Yudkovsky, N., Logie, C., Hahn, S., and Peterson, C.L. (1999). Recruitment of the
SWI/SNF chromatin remodeling complex by transcriptional activators. Genes Dev 13, 23692374.
682.
Yusufzai, T.M., and Felsenfeld, G. (2004). The 5'-HS4 chicken beta-globin insulator is a
CTCF-dependent nuclear matrix-associated element. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 86208624.
683.
Zaret, K.S., and Carroll, J.S. (2011). Pioneer transcription factors: establishing
competence for gene expression. Genes Dev 25, 2227-2241.
684.
Zeng, C., Kim, E., Warren, S.L., and Berget, S.M. (1997). Dynamic relocation of
transcription and splicing factors dependent upon transcriptional activity. EMBO J 16, 14011412.
685.
Zeng, P.Y., Vakoc, C.R., Chen, Z.C., Blobel, G.A., and Berger, S.L. (2006). In vivo dual
cross-linking for
identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin
immunoprecipitation. Biotechniques 41, 694, 696, 698.
686.
Zhang, J., Socolovsky, M., Gross, A.W., and Lodish, H.F. (2003). Role of Ras signaling
in erythroid differentiation of mouse fetal liver cells: functional analysis by a flow cytometrybased novel culture system. Blood 102, 3938-3946.
687.
Zhang, Y., Liu, T., Meyer, C.A., Eeckhoute, J., Johnson, D.S., Bernstein, B.E., Nusbaum,
C., Myers, R.M., Brown, M., Li, W., et al. (2008). Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).
Genome Biol 9, R137.
382
688.
Zhang, Y., McCord, R.P., Ho, Y.J., Lajoie, B.R., Hildebrand, D.G., Simon, A.C., Becker,
M.S., Alt, F.W., and Dekker, J. (2012). Spatial Organization of the Mouse Genome and Its
Role in Recurrent Chromosomal Translocations. Cell.
689.
Zhao, Z., Tavoosidana, G., Sjolinder, M., Gondor, A., Mariano, P., Wang, S., Kanduri,
C., Lezcano, M., Sandhu, K.S., Singh, U., et al. (2006). Circular chromosome conformation
capture (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and
interchromosomal interactions. Nat Genet 38, 1341-1347.
690.
Zhou, G.L., Xin, L., Song, W., Di, L.J., Liu, G., Wu, X.S., Liu, D.P., and Liang, C.C.
(2006). Active chromatin hub of the mouse alpha-globin locus forms in a transcription factory
of clustered housekeeping genes. Mol Cell Biol 26, 5096-5105.
691.
Zhou, J., Fan, J.Y., Rangasamy, D., and Tremethick, D.J. (2007). The nucleosome
surface regulates chromatin compaction and couples it with transcriptional repression. Nat
Struct Mol Biol 14, 1070-1076.
692.
Zhou, L.Q., Wu, J., Wang, W.T., Yu, W., Zhao, G.N., Zhang, P., Xiong, J., Li, M., Xue,
Z., Wang, X., et al. (2012). The AT-rich DNA binding protein SATB2 promotes expression
and physical association of human Ggamma- and Agamma-Globin genes. J Biol Chem.
693.
Zhu, X., Ling, J., Zhang, L., Pi, W., Wu, M., and Tuan, D. (2007). A facilitated tracking
and transcription mechanism of long-range enhancer function. Nucleic Acids Res 35, 55325544.
694.
Zimber, A., Nguyen, Q.D., and Gespach, C. (2004). Nuclear bodies and compartments:
functional roles and cellular signalling in health and disease. Cell Signal 16, 1085-1104.
695.
Zlatanova, J., and Caiafa, P. (2009). CCCTC-binding factor: to loop or to bridge. Cell
Mol Life Sci 66, 1647-1660.
696.
Zuin, J., Dixon, J.R., van der Reijden, M.I., Ye, Z., Kolovos, P., Brouwer, R.W., van de
Corput, M.P., van de Werken, H.J., Knoch, T.A., van, I.W.F., et al. (2014). Cohesin and CTCF
383
differentially affect chromatin architecture and gene expression in human cells. Proc Natl Acad
Sci U S A 111, 996-1001.
697.
Zullo, J.M., Demarco, I.A., Pique-Regi, R., Gaffney, D.J., Epstein, C.B., Spooner, C.J.,
Luperchio, T.R., Bernstein, B.E., Pritchard, J.K., Reddy, K.L., et al. (2012). DNA sequencedependent compartmentalization and silencing of chromatin at the nuclear lamina. Cell 149,
1474-1487.
384
БЛАГОДАРНОСТИ
Автор выражает глубокую благодарность своему учителю и научному консультанту
Сергею Владимировичу Разину за помощь на всех этапах работы, обсуждение результатов
и
всестороннюю
поддержку.
Автор
выражает
благодарность
за
плодотворное
сотрудничество Ольге Владимировне Яровой, Егору Сергеевичу Васецкому и Александру
Борисовичу Четверину. Автор благодарит всех сотрудников, аспирантов и студентов
лаборатории
структурно-функциональной
организации
хромосом
и
группы
пространственной организации генома за доброе отношение и помощь в работе. Автор
благодарит Алексея Дейкина и Татьяну Ермолкевич за предоставленную возможность
работы
с лабораторными
мышами.
Искреннюю благодарность
автор выражает
оппонентам и рецензентам данной работы. Отдельную благодарность автор приносит
дирекции и администрации Института биологии гена РАН за обеспечение благоприятных
условий для научных исследований. Особые слова благодарности автор приносит своему
отцу Гаврилову Александру Григорьевичу за правку текста и полезные советы по
оформлению диссертации.
385