На правах рукописи Волкова Ольга Александровна СТРУКТУРА
advertisement
На правах рукописи Волкова Ольга Александровна СТРУКТУРА, РАЗВИТИЕ И ВОЗМОЖНЫЕ ПУТИ СТАНОВЛЕНИЯ ПСЕВДОБОРОЗД ПЫЛЬЦЕВЫХ ЗЕРЕН ДВУДОЛЬНЫХ РАСТЕНИЙ 03.02.01― ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2014 Работа выполнена на кафедре высших растений биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова. кандидат биологических наук Северова Елена Эрастовна, Научный руководитель: Официальные оппоненты: доктор биологических наук Новоселова Лариса Викторовна ФГБОУ ВПО Пермский государственный национальный исследовательский университет кандидат биологических наук Завьялова Наталья Евгеньевна ФГБУН Палеонтологический институт РАН Ведущая организация: ФГБУН Ботанический институт имени В.Л. Комарова РАН Защита состоится 23 мая 2014 г. в 15.30 на заседании диссертационного совета Д501.001.46 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова, по адресу: 119991 Москва, Ленинские горы, д.1/12, МГУ, биологический факультет, ауд. 398. Факс: 8(495)939-43-09 Интернет-сайт: www.bio.msu.ru С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке Московского государственного Университета имени М.В.Ломоносова. Автореферат разослан __ марта 2014 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук А.В.Щербаков 2 Общая характеристика работы Актуальность исследования. Морфология и внутренняя структура апертур всегда были в центре внимания палиноморфологов. Именно характеристики апертур – форма, положение и число – определяют палиноморфологический тип и лежат в основе классификации пыльцевых зерен и спор (Erdtman, 1952; Tsukada, 1964; Thanikaimoni, 1986; Halbritter, Hesse, 2004). Наибольшее разнообразие апертурных типов встречается у пыльцевых зерен покрытосеменных растений, среди которых существует целый ряд филогенетически не связанных друг с другом видов с разнобороздными пыльцевыми зернами, у которых простые апертуры чередуются со сложными. Простые апертуры у таких пыльцевых зерен часто называют «псевдоапертурами», «псевдобороздами» или «дополнительными бороздами», однако до настоящего времени эти термины трактуются разными исследователями поразному. Некоторые авторы полагают, что «псевдоборозды» (или «простые апертуры») представляют собой настоящие апертуры (El Ghazali, Krzywinski, 1989), другие предпочитают использовать термин «дополнительные борозды» (Clarke et al., 1979: цит. по El Ghazali, Krzywinski, 1989; Muller, 1981; Yatskievych, Zavada, 1984; Patel et al., 1984). Эти разночтения связаны в основном со смешением морфологических (Erdtman, 1947; Faegri, Iversen, 1950; Clarke, 1977; Clarke et al., 1979) и функциональных понятий (Faegri, Iversen, 1950; Erdtman, 1952). Использование ацетолизного метода как стандартного при изучении морфологии пыльцевых зерен и спор не позволяет изучать структуру всей спородермы в целом и делать выводы об особенностях ее функционирования. Для понимания природы апертур и псевдоборозд необходимы исследования спородермы на живых пыльцевых зернах представителей различных семейств покрытосеменных растений и эксперименты по выявлению их функций. Решение вопроса происхождения и функционирования псевдоборозд возможно лишь в ходе комплексных исследований, включающих изучение функций апертур и псевдоборозд, а также их тонкого строения и развития. Цели и задачи исследования. Целью работы было изучение структуры, развития и функций псевдоборозд у разнобороздных пыльцевых зерен и выявление возможных путей становления разнобороздного пыльцевого типа в разных группах покрытосеменных растений. В связи с этим были поставлены следующие задачи: 3 1. Изучить морфологию и тонкое строение спородермы разнобороздных пыльцевых зерен представителей семейств Acanthaceae, Apocynaceae, Boraginaceae, Combretaceae, Fabaceae, Hydrophyllaceae, Lennoaceae, Lythraceae, Melastomataceae, Rhynchocalycaceae и пыльцевых зерен с апертурами одного типа у представителей близкородственных им родов. 2. Исследовать развитие спородермы разнобороздных пыльцевых зерен на примере Lagerstroemia indica L., Lythrum salicaria L., Myosotis palustris (L.) L. 3. Исследовать прорастание, рост пыльцевых трубок и гармомегатную функцию разнобороздных пыльцевых зерен на примере Lythrum salicaria L., Vinca minor L., Anthyllis vulneraria L., Phacelia tanacetifolia Benth. 4. Проанализировать возможные пути становления разнобороздного пыльцевого типа в разных группах покрытосеменных растений. Научная новизна. Проведены палиноморфологические исследования 22 видов покрытосеменных растений, относящихся к 10 семействам. Впервые изучена ультраструктура спородермы 20 из этих видов. Впервые изучено развитие спородермы у пыльцевых зерен Lythrum salicaria L., Lagerstroemia indica L. и Myosotis palustris (L.) L. Впервые исследованы функции апертур пыльцевых зерен Lythrum salicaria L., Vinca minor L., Anthyllis vulneraria L., Phacelia tanacetifolia Benth. Предложены гипотезы возможного становления разнобороздного пыльцевого типа в разных группах покрытосеменных растений. Научная и практическая значимость работы. Предложен комплексный подход к анализу особенностей спородермы, необходимый для адекватной интерпретации ее структуры. Полученные данные важны для уточнения палиноморфологической терминологии и имеют значение для понимания возможных путей морфологической эволюции апертур в разных линиях покрытосеменных растений. Результаты работы могут быть использованы при чтении лекций и проведении практических занятий в ВУЗах, при составлении атласов пыльцы и анализе спорово-пыльцевых спектров различного генезиса. Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на XVII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010» (Москва, 2010), VIII Международной конференции по морфологии растений, посвященной памяти И.Г. и Т.И. Серебряковых (Москва, 2010), 8 4 Международной конференции «European Palaeobotany-Palynology Conference» (Будапешт, 2010), Всероссийской научной конференции с международным участием, посвященной памяти профессора А.П. Меликяна (Москва, 2011), конференции «Морфогенез в индивидуальном и историческом развитии: симметрия и асимметрия» (Москва, 2012), IV Международной школе для молодых ученых «Эмбриология, генетика и биотехнология» (Пермь, 2012). Публикации. По материалам исследования опубликовано 10 работ, из них 4 – статьи в журналах (3 – из списка журналов, рекомендованных ВАК), 6 – материалы и тезисы конференций. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов, списка литературы. Список литературы включает 139 работ (из них 22 на русском и 117 на иностранных языках). Общий объем диссертации – 118 страниц (основной текст – 76 страниц, приложение – 42 страницы). Диссертация включает 41 иллюстраций. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. Обзор литературы В главе рассмотрена история терминов «разнобороздный» и «псевдоборозда», проанализированы разные точки зрения на природу псевдоборозд (Diez, Ferguson, 1990; Graham et al., 1985; 1987; 1990) и крайне немногочисленные сведения об их функциях (Scotland et al., 1990). Рассмотрена возможная взаимосвязь между структурой и функциями спородермы. Выявлены характерные особенности строения интины в апертурных и межапертурных участках пыльцевых зерен с апертурами одного типа. Представлен обзор существующих данных о распространении разнобороздных пыльцевых зерен среди двудольных растений. Анализ литературы позволяет сделать вывод о том, что для понимания природы псевдоборозд необходим комплексный подход, включающий анализ палиноморфологических признаков, ультраструктуры зрелой и развивающейся спородермы, ее биохимических особенностей и экспериментальных данных о функционировании апертур и «псевдоапертур». Сопоставление строения спородермы разнобороздных пыльцевых зерен внутри близкородственных и между филогенетически отдаленными группами позволит проследить вероятные пути становления разнобороздного пыльцевого типа у двудольных растений. 5 Глава 2. Материалы и методы Изучены пыльцевые зерна 22 видов, относящихся к 10 семействам (Acanthaceae, Apocynaceae, Boraginaceae, Combretaceae, Fabaceae, Hydrophyllaceae, Lennoaceae, Lythraceae, Melastomataceae, Rhynchocalycaceae). Материалом для исследования послужил свежий и гербарный материал. Образцы пыльцы были отобраны в гербариях МГУ (MW), ГБС РАН (MHA). Свежая пыльца Lythrum salicaria была собрана в Воронежской обл. в окрестностях биостанции ВГУ «Веневитиново» и в коллекции живых растений ботанического сада МГУ. Пыльцевые зерна Myosotis palustris и Vinca minor были собраны в ботаническом саду Ботанического института им. В.Л. Комарова, пыльцевые зерна Anthyllis vulneraria и Phacelia tanacetifolia – в ходе полевых исследований во Владимирской области. Световая и сканирующая электронная микроскопия. Палиноморфологические особенности пыльцевых зерен изучали на глицерин-желатиновых препаратах. Пыльцевые зерна обрабатывали ацетолизным методом Эрдтмана (Пыльцевой анализ, 1950). Измерения проводили с помощью светового микроскопа Leica DFC290 в компьютерной программе Image Scope на 10 пыльцевых зернах при увеличениях х400 и х1000. Для описания пыльцевых зерен использовали терминологию, предложенную J. Iversen, J. Troels-Smith (1950). При описании апертур придерживались точки зрения J. Muller (1975) и A. Graham с соавторами (1985) и использовали термин «псевдоборозда», а не «простая борозда». Изучение особенностей скульптуры поверхности пыльцевых зерен проводили с помощью сканирующего электронного микроскопа на материале, высушенном при критической точке (Тимонин, 2005). Исследования проводили на сканирующих электронных микроскопах JSM и Camscan в ЦКП Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова. Трансмиссионная электронная микроскопия. Ультраструктуру зрелой спородермы и ее развитие исследовали с помощью трансмиссионного электронного микроскопии. Материал для исследования фиксировали в 2,5 % растворе глутарового альдегида на 0,15М фосфатном буфере (рН 7,3) с добавлением сахарозы (15 мг/мл) с последующей промывкой фосфатным буфером и постфиксацией в 1% растворе OsO4 при комнатной температуре в течение 2 часов. Через серию спиртов доводили до 70˚ спирта, после чего контрастировали насыщенным раствором уранилацетата в 70˚ спирте на холоде (сутки). Далее материал обезвоживали, заключали в смесь эпонов, составленную по 6 стандартной методике (Уикли, 1975) со следующими изменениями: на каждые 17 мл Epon брали 12 мл DDSA, 10 мл MNA и 1% катализатора от общего количества смолы, затем помещали в термостат на сутки при температуре +60о С. Ультратонкие срезы изготовляли на ультратоме Leica UC-5 и контрастировали на медных сеточках уранилацетатом (Уикли, 1975). Исследования проводили на трансмиссионном электронном микроскопе Jeol 1011B в ЦКП Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова. Исследования функций апертур и псевдоборозд. Для исследования гармомегатной функции апертур живые пыльцевые зерна помещали в дистиллированную воду и наблюдали за изменением объема в течение 2 часов. Для исследования функции прорастания пыльцевые зерна проращивали на стандартной питательной среде в чашках Петри диаметром 3,5 см. Стандартная среда включала 0,3 М сахарозу, 1,6 мМ H3BO3, 3 мМ Ca(NO3)2, 0,8 мМ MgSO4 и 1 мМ KNO3 в 50 мМ MES-Tris буфере, pH 5,9 (Benito Moreno et all., 1988; Брейгина и др., 2009). Эффективность прорастания пыльцевых зерен определяли после 60 мин. инкубации. Проросшими считали пыльцевые зерна с трубками длиной не менее радиуса пыльцевого зерна (Брейгина и др., 2009). Цитохимические методы. Локализованные в интине пектины выявляли с помощью красителя рутениевого красного. β-глюканы окрашивали с помощью флуоресцентного красителя Fluorescent brightener 28 (Sigma), известного также как Calcofluor white M2R и тинопал. Флуоресценцию возбуждали в диапазоне длин волн 359-371 нм и регистрировали при длинах волн больше 397 нм. Флуоресценцию возбуждали ртутной лампой. Для флуоресцентной микроскопии использовали исследовательский микроскоп Axioplan 2 imaging MOT (Zeiss, Германия) и цифровую камеру AxioCamHRc. Реконструкция эволюции признаков. Анализ эволюции признаков строения пыльцевых зерен Myrtales был проведен методом максимальной экономии в программе WinClada (Nixon, на 2002) основе топологии молекулярно- филогенетического дерева из работы S.A. Graham (2007). Помимо представителей Myrtales в анализ была включена внешняя группа – Geraniales (Wang et al., 2009). Данные по наличию или отсутствию псевдоапертур, межапертурных углублений и слитных борозд анализировали как один многокомпонентный признак. Поскольку 7 априорно доказать линейный характер переходов между состояниями этого признака невозможно, его анализировали как неупорядоченный, предполагая равно вероятными переходы между любыми из четырех принятых нами состояний этого признака. Глава 3. Результаты 3.1. Морфологические описания пыльцевых зерен В разделе приведены описания пыльцевых зерен исследованных видов. Морфологические описание приведены в алфавитном порядке латинских названий семейств, родов и видов растений и проиллюстрированы фототаблицами. Всего описано 22 вида: Acanthaceae Diflugossa colorata (Nees) Bremek; Apocynaceae Vinca minor L.; Boraginaceae Cryptantha celosioides (Eastw.) Payson, Cryptantha coryi I.M. Johmst, Heliotropium europaeum L., Myosotis palustris (L.) L., Rindera bungei Gürke, Rindera tetraspis Pall.; Combretaceae Calycopteris floribunda (Roxb.) Lam. ex Poir., Combretum lecardii Engl. & Diels, Combretum pilosum Roxb.; Fabaceae Anthyllis velneraria L.; Hydrophyllaceae Phacelia ixodes Kellogg; Lennoaceae Lennoa madreporoides Lex. f. caerulea (Kunth) Yatsk; Lythraceae Cuphea brachiata Mart. ex Koehne, Decodon verticillatus Elliott, Lagerstroemia indica L., Pleurophora saccocarpa Koehne, Lythrum salicaria L.; Melastomataceae Osbeckia stellata Buch.-Ham. ex Ker Gawl., Melastoma sanguineum Sims; Rhynchocalycaceae Rhynchocalyx lawsonioides Oliv. 3.2. Развитие спородермы пыльцевых зерен В разделе приведены подробные описания развития спородермы Lythrum salicaria, Lagerstroemia indica и Myosotis palustris от стадии материнской клетки микроспор до свободноспоровой стадии. Развитие спородермы всех исследованных видов протекает сходно и может быть разделено на два периода – тетрадный и посттетрадный (свободноспоровый) (Резникова, 1984). В среднем тетрадном периоде одновременно намечаются области будущих апертур и псевдоборозд, в которых примэкзина не формируется. На этой стадии развития строение апертур и псевдоборозд не отличается. Различия в строении становятся заметны на поздней посттетрадной стадии развития, когда в области оры сложной борозды формируется утолщенная по сравнению с межапертурными участками интина. В области псевдоборозды интина тонкая, равная по толщине интине межапертурных участков. У пыльцевых зерен M. 8 palustris в области полярной псевдоборозды толщина интины такая же, как в межапертурных участках. 3.3. Функции апертур и псевдоборозд Прорастание пыльцевых зерен Lythrum salicaria, Vinca minor, Anthyllis vulneraria, Phacelia tanacetifolia наблюдали в течение часа через каждые 15 мин. инкубации. На питательной среде прорастание пыльцевых трубок отмечали только через оры сложных апертур, через псевдоборозды прорастание не происходило. Функцию гармомегата изучали для L. salicaria и V. minor. В регуляции объема пыльцевого зерна принимают участие как апертуры, так и псевдоборозды. В дистиллированной воде разбухание пыльцевых зерен происходит равномерно, апертуры и псевдоборозды растягиваются, обеспечивая целостность пыльцевого зерна. В уменьшении объема пыльцевых зерен при дегидратации также принимают участие как апертуры, так и псевдоборозды. На примере пыльцевых зерен Vinca minor выявляли локализацию в интине пектинов с помощью красителя рутениевого красного (Sigma). Окрашивание происходило преимущественно в участках между апертурами и межапертурными углублениями. Локализацию β-глюканов выявляли с помощью флуоресцентного красителя тинопала. Интенсивная флуоресценция была обнаружена в апертурных участках интины. 3.4. Анализ эволюции признаков строения пыльцевых зерен методом максимальной экономии Анализ распределения состояний признака у терминальных групп при заданной топологии дерева выявил единственный наиболее экономный сценарий эволюции этого признака (длиной 3 шага). Этот сценарий описывает вероятную эволюцию пыльцевых типов в порядке Myrtales от трехбороздно-орового к псевдобороздному типу. На дереве виды, пыльцевые зерна которых имеют псевдоборозды, образуют единую кладу. Глава 4. Обсуждение результатов Раздел 4.1. Структурные элементы гармомегатной системы Основными элементами гармомегатной системы являются апертуры – участки спородермы, где экзина редуцирована, а интина, как правило, утолщена. Благодаря эластичности интины и сравнительно тонкой экзине апертуры становятся местами предпочтительных изгибаний оболочки. При дегидратации пыльцевого зерна 9 мембрана апертур прогибается, гранулы спорополленина апертурной мембраны сближаются, края апертур соединяются, защищая интину. Пыльцевое зерно в целом приобретает более вытянутую в полярном направлении форму, поэтому такой тип гармомегатной системы получил название полярно-ориентированного. Формирование в процессе эволюции сложных апертур можно рассматривать как первый этап структурного разделения двух основных функций апертур: формирование пыльцевой трубки оказывается локализованным в области эндоапертуры (оры) – самого эластичного участка оболочки, а функцию гармомегата берет на себя экзоапертура. У некоторых пыльцевых зерен дополнительными элементами гармомегатной системы являются специальные области в межапертурных участках, где происходит утончение эктэкзины. Если такие области имеют четкие границы, к ним применим термин «псевдоборозда» – по своей морфологии они напоминают истинные борозды, но функционально таковыми не являются, так как через эти участки никогда не происходит прорастание пыльцевого зерна. В том случае, если границы утончений нечеткие и отличаются по скульптуре от остальной поверхности спородермы, такие области описывают как межапертурные углубления. Как показали наши исследования, полярно-ориентированная гармомегатная система преобладает среди бороздных и бороздно-оровых пыльцевых зерен. У многих растений, в дополнение к ней, существует экваториально-ориентированная система гармомегата, отвечающая за сжатие/растяжение пыльцевого зерна в экваториальном направлении. К элементам такой системы мы относим экваториальные пояски, экваториальные борозды, полярные апертуры, утолщенную или утонченную на апокольпиумах спородерму, слияние апертур на полюсах. Пыльцевые зерна большинства исследованных нами видов сочетают полярно- и экваториально-ориентированные элементы гармомегатной системы. Перенос гармомегатной функции от апертур к дополнительным элементам гармомегатной системы может служить способом преодоления противоречий, связанных с выполнением апертурой разных функций (Corner, 1949). С этой точки зрения гармомегатная система, включающая только апертуры, сочетающие в себе функции прорастания и гармомегата, более примитивна, а перенос гармомегатной функции на дополнительные структуры можно рассматривать как признак эволюционной продвинутости. 10 4.2. Морфолого-функциональные особенности псевдоборозд и межапертурных углублений Как показали наши исследования, у всех разнобороздных пыльцевых зерен спородерма в области сложных борозда имеет строение, типичное для апертурных областей, и характеризуется фрагментарной эктэкзиной и утолщенной, по сравнению с межапертурными областями, двух- или трехслойной интиной (Рис.1, 1). В области псевдоборозд интина однослойная, толщина ее такая же, как в межапертурных участках (Рис.1, 2). Заложение сложных апертур и псевдоборозд происходит одновременно в среднем тетрадном периоде, на ранних стадиях развития строение апертур и псевдоборозд не отличается. По нашим данным, различия в строении апертур и псевдоборозд становятся заметными лишь на последней, поздней посттетрадной стадии развития спородермы, когда формируется интина. По своим функциям псевдоборозды и сложные апертуры не идентичны и играют разную роль в жизнедеятельности пыльцевого зерна. Проведенные нами исследования функций апертур и псевдоборозд показали, что функцию гармомегата выполняют и апертуры, и псевдоборозды. Прорастание и образование пыльцевых трубок происходит только через сложные борозды, псевдоборозды не функционируют как проростковые апертуры, что подтверждают также проведенные нами исследования цитохимических особенностей спородермы. У изученных разнобороздных пыльцевых зерен утолщение среднего слоя интины, содержащего скопления трубчатых белковых компонентов и интенсивная автофлуоресценция отмечена именно в области эндоапертур – местах выхода пыльцевой трубки. Таким образом, псевдоборозды представляют собой утончения экзины, которые внешне сходны с простыми апертурами, но не связаны с утолщением интины и не функционируют как места прорастания, но выполняют гармомегатную функцию, что удовлетворяет морфолого-функциональному определению термина «псевдоапертура» (Erdtmen, 1952; Сладков, 1967; Thanikaimoni, 1986). Проведенное нами изучение тонкого строения спородермы пыльцевых зерен бурачниковых показало, что структура оболочки в области полярных «поровидных участков» у пыльцевых зерен Myosotis сходна с таковой в области псевдоборозд, поэтому для таких структур правомерно использование термина «полярная псевдоапертура». 11 Наличие псевдоапертур у пыльцевых зерен Anthyllis неоднократно было описано в литературе (Díez, Ferguson, 1990; 1994; 1996) и рассматривалось как один из немногих структурных признаков, характеризующий клады Vulneraria и Dorycnioides (Degtjareva et al., 2012), сестринские по молекулярно-филогенетическим данным. Изучение пыльцевых зерен семи представителей этих групп (Волкова, Северова, 2011) показало, что ни для одного из исследованных видов не характерно наличие структур, удовлетворяющих структурным критериям псевдоапертур. Пыльцевые зерна Anthyllis относятся к трехбороздно-оровому типу. Их отличительной особенностью является наличие в центре межапертурных участков меридиональных утолщений экзины в виде валиков, объединенных кольцевыми валиками на полюсах. Наши исследования показали, что меридиональные утолщения обусловлены гомогенной, утолщенной эндэкзиной. Между меридиональными утолщениями и апертурами эндэкзина рыхлая, ламеллятная, интина утолщена по сравнению с апертурными областями (Рис. 1, 4,5). Эктэкзина на всем протяжении межапертурного 1 2 3 4 5 -эктэкзина -рыхлая эндэкзина -эндэкзина -наружный слой интины -внутренний слой интины Рис. 1. Схемы ультраструктуры спородермы 1. Апертурный участок разнобороздных и трехбороздно-оровых пыльцевых зерен. 2. Область псевдоборозд разнобороздных пыльцевых зерен. 3. Область межапертурного углубления пыльцевых зерен представителей порядка Myrtales и семейства Hydrophyllaceae. 4. Апертурный участок пыльцевого зерна Anthyllis. 5. Область межапертурного утолщения экзины в центре межапертурного участка пыльцевого зерна Anthyllis. 12 участка характеризуется толстым покровом, столбиковым слоем, сформированным короткими широкими столбиками и гранулами, и отсутствием подстилающего слоя. Таким образом, участки спородермы между апертурами и меридиональными валиками могут прогибаться при дегидратации пыльцевого зерна благодаря рыхлой ламеллятной эндэкзине и растягиваться благодаря утолщенной интине. Для этих участков не характерно утончение эктэкзины и они не имеют отчетливо выраженной границы, что не позволяет использовать термин «псевдоапертуры» для их описания. Морфологические особенности «межапертурных углублений» ранее были изучены лишь для нескольких видов; в большинстве случаев эти участки трактовались как неясно выраженные псевдоапертуры (Dahlgren, Thorne, 1984; Graham, 1985). Мы уточнили существующую на данный момент терминологию и впервые изучили структуру спородермы в области «межапертурных углублений» (согласно терминологии V.C. Patel et al. (1990) и R.P. Wodehouse (1928)) у представителей разных семейств. У пыльцевых зерен представителей порядка Myrtales и семейства Hydrophyllaceae межапертурные углубления, по-видимому, эволюционно связаны с псевдоапертурами и могут быть интерпретированы как результат редукции/становления последних. По нашим данным, они представляют собой нечетко отграниченные участки спородермы со специфической (как правило, более выраженной по сравнению с межапертурными областями) скульптурой. Для структуры спородермы межапертурных углублений характерно утончение эктэкзины, подстилаемое утолщенной эндэкзиной и тонкой интиной (Рис. 1, 3). Межапертурные углубления пыльцевых зерен Vinca, по нашим данным, имеют иную структуру и, по-видимому, не связаны со становлением псевдоапертур у этого рода. Проведенное нами ультратонкое исследование спородермы Vinca minor - эктэкзина, - эндэкзина, - наружный слой интины, окрашивается рутениевым красным - средний слой интины, -внутренний слой интины, окрашивается калькофлуором Рис. 2. Схема ультраструктуры спородермы пыльцевого зерна Vinca minor 13 показало, что наружный слой интины, пронизанный трубчатыми белковыми компонентами, значительно утолщен в межапертурных участках по обеим сторонам вдоль апертур и очень тонкий в апертурных участках и в центре каждого межапертурного участка (Рис. 2). Тонкий наружный слой интины в центре межапертурного участка обуславливает наличие межапертурных углублений. Внутренний слой интины утолщен в области апертур. Нетипичное для спородермы других растений утолщение интины во внеапертурных областях у барвинка можно объяснить тем, что из-за очень тонкой экзины функция защиты перешла к наружным пектиновым слоям интины. За формирование пыльцевой трубки отвечают в основном внутренние слои интины, которые утолщаются в местах прорастания, то есть в апертурах. Впервые проведенные нами цитохимические исследования и эксперименты по прорастанию у пыльцевых зерен Vinca minor, показали, что именно внутренний слой интины маркирует места возможного формирования пыльцевых трубок, тогда как скопления белковых компонентов у Vinca не указывают на область прорастания. Раздел. 4.3. Эволюция пыльцевых типов в порядке Myrtales На основании апертурных типов пыльцевых зерен в порядке миртоцветные можно выделить три группы. Эти группы практически полностью соответствуют трем основным кладам Myrtales, выявленным по молекулярно-филогенетическим данным на основании анализа последовательностей rbcL и ndhF (Systema et al., 2004) (Рис. 3). Первая группа, включающая семейства Onagraceae, Combretaceae и Lythraceae, наиболее гетерогенна палиноморфологически. В семействах Combretaceae и Lythraceae встречаются как пыльцевые зерна с псевдобороздами, так и пыльцевые зерна без псевдоапертур, причем для Lythraceae отмечено огромное разнообразие апертурных типов. Наиболее палиноморфологически обособлено семейство Onagraceae, пыльцевые зерна представителей которого имеют обычно треугольную форму, 2-(3)-4 поры, висциновые нити и гранулярную экзину. На основании молекулярных и ряда морфологически данных семейство Onagraceae, однако, признается сестринским семейству Lythraceae (Graham et al., 1993; Conti et al., 1997; Dahlgren, Thorne, 1984; Martin, 2003; Graham et al., 2005; Graham, 2007; Morris, 2007). Вторая группа, включающая семейства Psiloxylaceae, Heteropyxidaceae, Myrtaceae, Vochysiaceae, характеризуется отсутствием 14 псевдоборозд и широким распространением слитнобороздных пыльцевых зерен. Согласно последним молекулярно-филогенетическим данным, полученным с использованием ядерной ITS последовательности (Biffin et al., 2007) и обобщенным данным по matK, ndhF и ITS (Biffin et al., 2010), семейства Psiloxylaceae, Heteropyxidaceae, Myrtaceae объединены в единое семейство Myrtaceae. Рис.3. Распределение палиноморфологичесих признаков на молекулярнофилогенетическом дереве порядка Myrtales (K.J. Sytsma et al. (2004) и S.A. Graham (2007)). Остальные семейства порядка Myrtales образуют единую группу, характеризующуюся наличием у пыльцевых зерен псевдоборозд или межапертурных углублений. Эта группа включает семейства Oliniaceae, Penaeaceae, Rhynchocalycaceae, Alzateaceae, Memecylaceae, Melastomataceae и Crypteroniaceae. Проведенный нами сравнительный анализ морфологии пыльцевых зерен представителей порядка Myrtales позволяет предположить различные варианты становления псевдоборозд в этой группе. С одной стороны, можно предположить, что псевдоборозды возникли уже после разделения порядка на три группы и развивались параллельно и независимо у представителей различных семейств порядка. Псевдоборозды в этом случае следует рассматривать как новообразования, а не 15 результат редукции апертур. Межапертурные углубления при таком сценарии могут отражать как процесс становления псевдоборозд, так и редукции псевдоборозд исходно разнобороздного типа (Рис. 4: 1,2). С другой стороны, разнобороздные пыльцевые зерна могли возникнуть у общего предка порядка, затем были вторично утрачены у представителей Lythraceae, Combretaceae и в семействах Alzateaceae, Onagraceae (Рис. 4: 3). В этом случае межапертурные углубления у пыльцевых зерен представителей Alzateaceae и некоторых представителей Myrtaceae и Lythraceae можно рассматривать как отражение процесса редукции псевдоборозд, а пыльцевые зерна, лишенные псевдоборозд, как результат их утраты. Согласно третьему сценарию, можно предположить наличие пыльцевых зерен с межапертурными углублениями у предка порядка Myrtales (Рис. 4: 4). В процессе дальнейшей эволюции у одних видов межапертурные углубления были утрачены, а у других видов на их основе сформировался трехбороздно-оровый пыльцевой тип. При таком сценарии межапертурные углубления отражают процесс формирования псевдоборозд. 1 а б в 2 а в б 3 в б а 4 в б а Рис. 4. Возможные эволюционные сценарии развития пыльцевых типов в порядке Myrtales. (1) Межапертурные углубления отражают процесс становления псевдоборозд; (2) Межапертурные углубления отражают редукцию псевдоборозд разнобороздного типа; (3) Межапертурные углубления отражают процесс редукции псевдоборозд; (4) Межапертурные углубления отражают процесс формирования псевдоборозд а – трехбороздно-оровый пыльевой тип, б – пыльцевой тип с межапертурными углублениями, в – пыльцевой тип с псевдобороздами. 16 Использованный нами метод максимальной экономии показал, что наиболее экономной оказалась топология, при которой у пыльцевых зерен общего предка порядка Myrtales отсутствовали псевдоборозды. трехбороздно-орового пыльцевого типа Широкое распространение у представителей близкородственных порядков (Geraniales, Crossosomatales) подтверждают эту точку зрения. В пользу этой точки зрения свидетельствуют также ископаемые находки. Другие возможные эволюционные сценарии оказались менее выгодными при использовании метода максимальной экономии и не находят подтверждения в палеонтологической летописи. Раздел. 4.4. Эволюция пыльцевых типов в семействе Lythaceae Внутри монофилетического семейства Lythraceae отмечено огромное разнообразие апертурных типов (Эрдтман, 1956; Куприянова, Алешина, 1978; Walker, Doyle, 1975; Dahlgren, Thorne, 1984; Johnson, Briggs, 1984). Исходным типом пыльцы принято считать трехбороздно-оровый, описанный в подсемействах Punicoideae, Sonneratioideae, Duabangoideae, Trapoideae (Graham, 1977; Graham et al., 1990; Patel et al., 1984) и в родственных семействах подкласса Rosidae. Анализ распределения палиноморфологических типов внутри семейства показал, что на филогенетическом дереве семейства роды, пыльцевые зерна которых имеют межапертурные углубления и псевдоборозды, занимают обособленное положение и образуют две клады. Семейство Lythraceae можно рассматривать как иллюстрацию процессов становления и развития разнобороздного пыльцевого типа. На рисунке 5 представлены известные к настоящему времени апертурные типы семейства и их возможные связи. 17 полярно-ориентированная гармомегатная система 2 * * 3 * 4 экваториально-ориентированная гармомегатная система 8 * 5 1 9 – экзина 6 7 – утоньшение экзины * – утолщение экзины Рис. 5. Структурные пыльцевые типы в семействе Lythraceae (Muller, 1981; Graham, 1977; Graham et al., 1985, 1987; 1990; оригинальные исследования (*)). 1.Трехбороздно-оровые пыльцевые зерна (Punicoideae, Sonneratioideae, Duabangoideae, Trapoideae). 2. Трехбороздно-оровые пыльцевые зерна с межапертурными углублениями (Adenaria, Pehria, Koehneria, Woodfordia, Pleurophora). 3. Разнобороздные пыльцевые зерна с 3 псевдобороздами (Lythrum , Peplis). 4. Пыльцевые зерна с 6 межапертурными участками (Lafoensia и Lagerstroemia (*)). 5. «Разноробороздные» пыльцевые зерна с 6 псевдобороздами (Ammannia, Nesaea Lawsonia). 6. Пыльцевые зерна с меридиональными утолщениями в центре межапертурных участков и экваториальными мостиками (Decodon (*), Galpinia и некоторые виды Lagerstroemia (*), Lafoensia). 7. Пыльцевые зерна с меридиональными утолщениями экзины в центре межапертурных участков и редуцированными бороздами (Didiplis). 8. Слитнобороздные пыльцевые зерна (Cuphea (*)), сочетают в себе признаки полярно- и экваториально-ориентированной гармомегатных систем. 9. Трехпоровые пыльцевые зерна, с жесткой и толстой экзиной с гладкой поверхностью на полюсах и более тонкой и гибкой экзиной с бородавчатой поверхностью в экваториальной части (Duabanga и Diplusodon и некоторых видов Lafoensia). Экваториально-ориентированная гармомегатная система. Раздел. 4.5. Морфологическое разнообразие пыльцевых типов в семействе Boraginaceae Среди бурачниковых наиболее простым строением обладают трехбороздно-оровые пыльцевые зерна. Такой тип Аветисян (1956) считает исходным для семейства, остальные пыльцевые типы рассматривает как его дальнейшую специализацию в 18 процессе приспособительной эволюции. К признакам специализации можно отнести формирование меридиональных псевдоборозд и экваториальных поясков как дополнительных элементов гармомегатной системы и становление порово-оровых апертур в результате переноса гармомегатной функции к псевдобороздам (Clarke et al., 1979). Наши исследования показывают, что еще одной специализированной структурой можно считать полярные псевдоапертуры. По своей структуре, особенностям развития и выполняемым функциям полярные псевдоборозды бурачниковых аналогичны меридиональным псевдоапертурам и поэтому с большей вероятностью являются новообразованием, а не результатом редукции апертур. Слияние борозд на полюсах также представляется эволюционно продвинутым признаком внутри Boraginaceae (Аветисян, 1956) и, возможно, представляет собой параллельный путь оптимизации гармомегатной функции. В соответствии с таксономической системой классификации APG II (2003) семейство Boraginaceae принадлежит к группе euasterids I и включает выделявшиеся в более ранних работах (Cronquist, 1981; Takhtajan, 1997) семейства Hydrophyllaceae и Lennoaceae в ранге подсемейств. Наши исследования показали, что для представителей Lennoa (Lennoaeae) характерно наличие сфероидальных пыльцевых зерен со сложными апертурами, чередующимися с псевдобороздами. Пыльцевые зерна Phacelia (Hydrophylloideae) характеризуются наличием межапертурных углублений. Таким образом, для всего семейства Boraginaceae в широком смысле (согласно APG II) характерно наличие псевдоборозд. Межапертурные углубления представителей Hydrophyllaceae можно интерпретировать как результат редукции или становления псевдоборозд. Раздел. 4.6. Возникновение разнобороздного типа в процессе эволюции высших растений Анализ распространения разноборозных пыльцевых зерен среди покрытосеменных растений показал, что они характерны для некоторых представителей филогенетически продвинутых семейств, не связанных друг с другом родственными связями. Наличие псевдоборозд у представителей филогенетически отдаленных групп указывает, что разнобороздный пыльцевой тип формировался, по-видимому, многократно и независимо в ходе эволюции. Возможны два пути становления разнобороздного пыльцевого типа: (1) 19 редукция трех апертур у исходно шестибороздно-орового пыльцевого зерна; (2) возникновение псевдоборозд de novo у исходно трехбороздно-орового пыльцевого зерна. Отсутствие в палеоботанической летописи многобороздно-оровых пыльцевых зерен и одновременное присутствие разнобороздных пыльцевых типов уже в нижнем мелу (Graham, Graham, 1971; Muller, 1981; Graham, 2013), сравнительно неширокое распространение многобороздно-оровых пыльцевых зерен только среди эволюционно продвинутых групп двудольных свидетельствуют в пользу второй точки зрения. Псевдоборозды и межапертурные углубления следует рассматривать как результат компромисса между двумя основными функциями пыльцевого зерна – прорастанием и защитой. С одной стороны редукция или наличие более тонкой эктэкзины делает эти участки оболочки более проницаемыми для воды по сравнению с межапертурными областями. В то же время отсутствие полностью открытых участков, таких как оры, делает их менее проницаемыми по сравнению с апертурами. Псевдоапертуры в данном случае представляют собой эволюционный компромисс, означающий успешную, но не оптимальную для каждой отдельной функции структуру оболочки (Muller, 1979). Тот факт, что морфологические особенности оболочки являются проявлением адаптации, объясняет сходства в структуре спородермы в отдаленных группах. 20 Выводы 1. У разнобороздных пыльцевых всех зерен исследованных видов спородерма в области сложных апертур характеризуется фрагментарной эктэкзиной и толстой, трехслойной интиной; в области псевдоборозд – фрагментарной эктэкзиной и тонкой интиной, равной по толщине интине межапертурных участков. Структура оболочки в области полярных поровидных участков сходна с таковой в области псевдоборозд. 2. Заложение сложных апертур и псевдоборозд происходит одновременно в среднем тетрадном периоде, различия в их строении становятся заметными лишь в позднем посттетрадном периоде. 3. Различия в структуре псевдоборозд и сложных апертур связаны с разными функциями: сложные апертуры выполняют и функции прорастания, и гармомегата, а псевдоборозды и полярные поровидные участки участвуют лишь в выполнении гармомегатной функции. Наши исследования подтверждают правомерность использования термина «псевдоборозды» для меридиональных псевдоборозд разнобороздных пыльцевых зерен и термина «полярные псевдоборозды» для полярных структур пыльцевых зерен бурачниковых. 4. Межапертурные углубления пыльцевых зерен представителей порядка Myrtales и семейства Hydrophyllaceae представляют собой утончения экзины, подстилаемые тонкой интиной. По-видимому, они связаны по происхождению с псевдобороздами и могут быть интерпретированы как результат редукции или становления последних. 5. Межапертурные углубления пыльцевых зерен Vinca minor обусловлены наличием утончений интины в центре межапертурных участков по сравнению с областями вокруг апертур. Выход пыльцевой трубки происходит через апертуру. 6. Пыльцевые зерна представителей рода Anthyllis из двух клад Vulneraria и Dorycnioides относятся к трехбороздно-оровому пыльцевому типу и характеризуются наличием в центре межапертурных участков меридиональных утолщений экзины в виде валиков, образованных гомогенной, утолщенной эндэкзиной. 7. Полярно-ориентированная гармомегатная система преобладает среди бороздных и бороздно-оровых пыльцевых зерен. В исследованных группах экваториально21 ориентировання система гармомегата существует в дополнение к полярноориентированной и может быть представлена экваториальными поясками, экваториальными бороздами, полярными апертурами, утолщенной или утонченной на апокольпиумах спородермой, слиянием апертур на полюсах. 8. Перенос гармомегатной функции от апертур к дополнительным элементам гармомегатной системы может служить способом преодоления противоречий, связанных с выполнением апертурой разных функций. 9. Наличие псевдоборозд у пыльцевых зерен представителей филогенетически отдаленных семейств указывает, что разнобороздный пыльцевой тип формировался многократно и независимо в ходе эволюции двудольных. Становление разнобороздного пыльцевого типа происходило по пути возникновения псевдоборозд de novo у исходно трехбороздно-оровых пыльцевых зерен. СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых журналах из перечня ВАК Волкова О.А. Дербенник выбирает пыльцу для опыления // Природа, 2011. – № 5. – С. 39 – 42. Волкова О.А., Северова Е.Э., Полевова С.В. Развитие спородермы пыльцевых зерен Lythrum salicaria (Lythraceae) // Бюлл. МОИП. Отдел биологический, 2012. – Т. 117, № 5. – С. 57 – 63. Volkova O.A., Severova E.E., Polevova S.V. Structural basis of harmomegathy: evidence from Boraginaceae pollen / Plant Syst. Evol. – 2013. – Vol. 299, № 9. – P. 1769-1779. Прочие публикации Волкова О.А., Полевова С.В. Когда самое маленькое – не самое простое // Сб. науч.-попул. статей – победителей конкурса РФФИ 2012. Вып. 16 / Шахнов В.А. (ред.) – М.: ИТЦ МОЛНЕТ, 2013. – С. 185-188. Волкова О.А. Полиморфизм пыльцы в роде Lythrum L.: Тез. докл. конф. / XVII Междунар. науч. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов – 2010. Секция биология. – М.: МАКС пресс, 2010. – С. 71 – 72. Волкова О.А., Северова Е.Э. Полиморфизм пыльцы в роде Lythrum L.: Тез. докл. конф. / тр. VIII междунар. конф. по морфологии растений, посвященной памяти 22 Ивана Григорьевича и Татьяны Ивановны Серебряковых. – Т. 1 / Под общ. ред. Викторова. – М.: МПГУ, 2010. – С. 103 – 105. Volkova, O., Severova, E. Investigations of aperture structure and functions in Lythraceae by different methods / Budapest, Hungary, Hungarian natural history museum (Program and Abstracts of 8th European Palaeobotany-Palynology Conference. 6-10 July 2010), 2010. –P. 247. Волкова О.А., Северова Е.Э. Строение и функции апертур у гетероапертурных пыльцевых зерен: Тез. докл. конф. / Материалы Всерос. науч. конф. с международным участием, посвященной памяти проф. А.П. Меликяна – М.: ООО «Астра-Полиграфия», 2011. – С. 83 – 85. Волкова О.А., Северова Е.Э. Закономерность и симметрия формирования апертур у пыльцевых зерен Myosotis: Тез. докл. конф. / Морфогенез в индивидуальном и историческом развитии: симметрия и асимметрия – М: ОМТ Палеонтологического ин-та им. А.А. Борисяка РАН, 2012. – С. 10 – 11. Волкова О.А., Полевова С.В., Северова Е.Э. Формирование гетеробороздного пыльцевого зерна Myosotis palustris (L.) L.: Тез. докл. конф. / Материалы IV Междунар. школы для молодых ученых "Эмбриология, генетика и биотехнология" (3-9 дек. 2012 года) / под общ. ред. Л.В. Новоселовой; Перм. гос. нац. иссл. ун-т. – Пермь; Ижевск: ИП Пермяков С.А., 2012. – С. 39 – 41. 23
