биологические свойства аллергоидов из пыльцы деревьев

/у
На правах рукописи
БОРЗДОВА
Ирина Юрьевна
БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
АЛЛЕРГОИДОВ ИЗ ПЫЛЬЦЫ
ДЕРЕВЬЕВ
14.00.36 - аллергология,
иммунология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Ставрополь -1996
Работа выполнена в Ставропольском НТО "Аллепген" и
Ставропольском научно-исследовательском противочумном институт
Научные туководители:
доктор медицинских наук, профессор Б.Н.Райкис
доктор медицинских наук, профессор В.И.Ефременко
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, ппофессор Мохин К.М.; кандидат меди­
цинских наук, стапший научный сотрудник Саяпина Л .В.
Ведущая организация: Ростовский научно-исследовательский
противочумный институт.
Зашита состоится "18_" ШШШ
1996г. в
.часов
на заседании специализированного совета К 0743201 при Российс!
научно-исследовательском противочумном институте "Микроб"
(4I007I, г.Саратов, ул.Университетская, 46).
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке
института "Микроб**.
Автореферат разослан "^^J'^i''J^'!^i^^J-^'3&^
Ученый секретарь
специализированного совета,
доктор медицинских наук
•
3.Л.Девдариани
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
-555155Ьность_щ)дблемд. Изучение аллергических заболеваний
- одна га актуальных проблем современной медипины. О социальном
значении борьбы с аллергическими заболеваниями свидетельствуют
данные о росте числа обращений за медицинской помошью, уровня
госпитализации и смертности от этих болезней как за рубежом,
так и в нашей стране (Адо А.Д., 1978, 1980; Адо В.А. с соавт.,
I99I; Астафьева Н.Г. с соавт., 1986; Богова А.В., 1990; Пылкий
В.Й., 1984; Пыцкий В.И. с соавт., I99I; Сидоренко Е.Н., 1986;
Фрадкин В.А., 1978, 1990; Ногак F. , 1990).
Известно, что среди аллергозов достаточно высокий'удель­
ный вес занимают аллергические заболевания атонического харак­
тера, при которых одной из основных этиолог№1еских причин яв­
ляется пыльца растений (Астафьева Н.Г. с соавт., 1986; Беклецкшев Н.Д. с соавт., 1985; Ермекова Р.К. с С(1авт., 1986, 1988,
1969; Порядин Г.В., 1984; Фрадкин В.А., 1990; J a g e r S., 1990).
Зоны наивысшей распространенности таких заболеваний тесным об­
разом связаны с климато-географическими особенностями местнос­
ти (Кобзарь В.Н. с соавт., 1990; Коваленко Н.Н. с соавт., I99I;
Муминов А.И. с соавт., 1984; Садовничая Л.Т., 1979; Садовничая
Л.Т. с соавт., I99I; Сегсеаа-LarnVaE \\,,
I99I).
Среди разнообразных этиологических факторов, вызывающих
ПОЛЛИЙОЗЫ, помимо пыльцы амброзии, луговых и злаковых трав, зна­
чительное место занимает пыльца деревьев - платан, карагач,
сосна, ольха, береза, лещина, вяз и т.д. (Гургенидзе Г.В. с
соавт., 1983; Ермекова Р.К. с соавт., 1983, 1986, 1988; Куценко
P.P., 1990; Остроумова А.И. с соавт., I99I; Хакбердыев М.М. с
соавт., 1975, 1982; 5piekman Р. , 1990; WaEEinJ.-E. , I99I).
4
Патогенетически обосновакньш и аффективный ывтодоы лечвН1Ш
при поллиноэах является специфическая иимунотерапия, успепно
Гфименяемая с I9II года (L.Noon ) . Однако, сушествуюаий уже бо­
лее 80 лет способ лечения аллергических заболеваний водно-солевыыи экстрактами аллергенов, имеет ряд недостатков: большая про­
должительность курса имцунотерапии, нестойкая супрессия лазунного ответа, опасность возникновения обоих и utsCTHax аллсфгических реакций в процессе лечения (Новиков Д.К. с соавт., I99I;
Порошина Ю.А. с соавт., 1985; Райкис Б.Н. с соавт., I974-I994;
Рай9Г5011 R. , I98I; Marsh D. , I98I; Questtrbttl^E 0. , 1982;
Prosiad A . e t a B . , 1983).
Исходя из этих позиций, проводятся целенаправленные поиски
новых форм лечебных аллергенов. С этой целью водно-солевые экст­
ракты пыльцы растений химически ыодифицировали полизт£У1енгликолем ( Sehon Н., 1978), мочевиной ( King Р. . 1974), глютаральдзгидом (Patterson R., 1973), галоформатами (OvercPi Н. , I97I).
Наиболее изученными в экспериментальных и клинических условиях
являются аллергоиды - аллергены, подвергнутые зоздействию фсрмальдех'ида ( Marsh D. el al.
, 1970).
Эти препараты обладают сниженной аллергенностьго и выражен­
ной способностью индуцировать синтез защитных антител, ч?о поз­
воляет уменьшить количество инъекций и сократить курс предсезон­
ной иммунотерапии при условии безопасного применения более вы­
соких доз препарата (Нартенко Т.М., 1990; Петрунов Б . , 1980;
Порошина Ю.А. с соавт., 1985, I99I; Фрадкин В.А.^ i990;Normwi
Р. e t a t . , I98I; Maasch H . e t a L , I982).
Научная разработка таких препаратов на основе прпызнения
модифицированной одноэтапной технологии формалинкзации га изго­
товления была начата в нашей стране в 1974 году (Райкис В.Н. с
5
с соавт., I974-I99I). Ко времени начала настоящей работы, были
завершены исследования, оформлена соответствутащая нормативнотехническая документация и внедрена технология изготовления в
прокзБОдство аллергоидов из пыльцы отдельных видов сорных трав
(амброзия, полынь) и луговых трав (тимофеевка, ежа, овсянница).
С целью расп1фения номенклатуры указанных препаратов необходимо
было изучить возможность использования такого одноэтапного мо­
дифицированного метода формалинизации для изготовгения аллерго­
идов из пальцы деревьев. В связи с этим предстояло решить воп­
рос о влиянии однозтапной формалинизации на физическое состоя­
ние, аллергенность, антнгенность и иммунохимические свойства
таких аллергенов.
Необходимо было выяснить, сохраняется ли в аллергоидах спе­
цифичность исходного аллергена и безвреден ли он при введении
яивотнни?
Коночные результаты таких исследований должны были обосно­
вать возмоякость оформления соответствующих документов, тэеглаиент1фую1Ш1х промышленный выпуск указанных препаратов и, следо­
вательно, раси1фить номенклатуру выпускаемых аллергоидов в на­
пей стране.
и§л^.ЖСЗ§50ВДЦия - научно обосновать применение одноэтапной отечественной технологии формалинизации для изготовления
аллергоидов из пыльцы деревьев.
Задачи^исследования - изготовить и изучить по:
- физико-хюлическим свойствам,
- антигеннооти,
- перекрестной антигенной реактивности,
- результатам клинического изучения (аллергенность и терапечтическая эффективность)
ионо-оялергенн и г:оно-аллергоиды из пыльцы березы, ольхи и ле-
6
шины, и аллергоиды, изготовленные из смеси пыльцы (микст-аллергоиды) указанных наименований.
Нахчдая_ндвизца:
1. Полученные одноэтапной формалиниэацией препараты из
пыльцы березы, ольхи и лешины, а также из смеси пыльцы этих ви­
дов растений, обладают сходными физико-химическими, антигенными
и аллергенными свойствами, характерными для аллергоидов, что яв­
ляется результатом однотипного влияния избранного способа на ал­
лергены, экстрагированных из пыльцы указанных видов растений.
2. Сохранение в значительной степени антигенов в аллергоидах из пыльцы деревьев (береза, ольха, лещина), перекрестно-ре­
агирующих между собой в исходных аллергенах, связано с их отно­
сительной устойчивостью к воздействию формалина.
3. Экспериментально установлено сохранение в аллергоидах
из пыльцы деревьев их иммуногенных свойств - способности инду­
цировать синтез антител, комплементарных исходному аллергену.
4.'?Метод Si оказался более инфopv!aтивнtш длл оценки оста­
точной аллергенности аллергоидов из пыльцы деревьев, чем обыч­
ный метод, основанный на сравнении размеров диаметпов волдырей
при тестировании аллергеном и аллергоидоы, что связано с учетом
индивидуальной носпецифической реактивности кожи (на гистаыин^
при использовании метода Si .
5. Терапевтическая активность аллергоидов из пыльцы дерзвьев обеспечивается их сниженной аллергенностьго и высокой иммуногенностью.
1Трактическая_цедностьлаботы|
I . Впервые на основе отечественной технологии получены
аллергоиды из пыльцы березы, ольхи и лещины и микст-аплергоиды
из смеси пыльцы березы, ольхи и лепшны.
7
2. Для 0Ц2НКИ аллергенности и специ(Т1ИЧНости аллергоидов
прик-тест является более стандартным и менее травматичным, чем
скарификационный, и позволяет проведение исследований одновремен­
но большим количеством аллеггенных препаратов.
3 . Предложенный метод Sf
( sKin index ) для оценки аллер­
генной активности формалинизированных аллергенов из пыльпы де­
ревьев - определение реакции кожи на аллерген с учетом такой ре­
акции на гистамин - позволяет повысить чувствительность и стан­
дартность прик-теста.
4. Аллгргоидотерапия поллиноза, вызванного пыльцой деревьев,
является более эффективным методом специфической иммунотепапии,
чем аллергекотерапия.
Материалы диссертации были-представлены и доложены на науч­
ных межлабораторных конференциях НПО "Аллерген" (I99I, 199?) и
Ставропольского научно-исследовательского противочумного институ­
та (1995), на Меядунпродных симпозиумах по аллергологии и иммуно­
логии в г.Алма-Ата (1992), Дагомысе (1992), на Всесоюзных конфе­
ренциях по актуальным вопросам медицинской биотехнологии в г.Пер­
ми (1988) и г.Томске (I99I).
П^^бликации. Основное содержание отоажено в 5 опубликован­
ных работах.
Положения^ ^выносимые^на_защитх:
1. Метод опно:этапной (^ормалинизаиии аллергена позволяет из­
готавливать моно- и микст-аллергоиды из пыльцы деревьев (береза,
ольха, лещина) со сниженной аллергзнностью и высокой иммуногенностью.
2. Оце::ка аллергоидов из пыльцы деревьев по их аллергеннос­
ти методом Sf
( sKin inolex ) дает объективную характеристику од-
8
НОМУ из основных свойств этих препаратов.
3 . Аллергоиды из пыльцы деревьев (береза, ольха, лещина)
являются эффективными препаратами для специфической иммуноте­
рапии поллиноза.
СтЕ^ктхЕ5работы.
Диссертация состоит из введения, I
главы обзора литературы, 4 глав собственных исследований, зак­
лючения, выводов, списка литературы. Работа изложена на 129
страницах машинописи, иллюстрирована 32 рисунками и б таблица­
ми. Библиографический указатель содержит 194литературных ис­
точника, в том числе 99
работ отечественных и 95
зарубеж­
ных авторов.
СОДЕМАНИЕ РАБОТН
I . МатеЕиалы^и^методы.
Объектом исследования служили
аллергоиды из пыльцы березы, ольхи и лещины (моно-аллергоиды),
а также аллергоиды из смеси пыльпы березы, ольхи и лешины
(иикст-аллергоиды).
В основу технологии изготовления указанных аллергоидов
положен принцип, изложенный в технологической документации на
производство аллергоида из пыльцы амброзии (Лабораторный регла­
мент получения аллергена акброзийного Лормалинизи^юванного - ал­
лергоида, !Ма-81). Особенностью нашего метода явилась трехкрат­
ная поэтапная экстракция соответствующих навесок пыльцы, что
значительно увеличивало выход аллергенного материала. Всего из­
готовлено 47 серий аллергоидов: 19 - экспериментальных серий из
пыльцы березы, 12 - из пыльцы ольхи, 5 - из пыльцы лещины, I I из смеси равных количеств пыльцы березы, ольхи и лешины.
В процессе изготовления аллергоидов физико-химические пока­
затели (рН, //Но- группы, азот белка) определяли согласно ПРИ-
9
каза МЗ СССР № 31 от 13.01.83г. "Об унификации методов контроля
медицинских и иммунобиологических препаратов".
Фракционный состав исходных и формалинизированных аллерге­
нов изучали гель-фильтрацией на сефадексе (3 - 75, на установке
Фирмы
LKB (Швеция), а также с помощью метода изоэлектпофокуси-
рования в агапозном геле, содержащем амфолины с рН от 3,5 до
9,5 (Фримель X., 19791.
Антигенные свойства препаратов исследовали в реакции преци­
питации по Оухтерлони в агаровом геле,реакции непрямой агглюти­
нации (РИГА) (Кзбот Е., Мейер М., 1968) и иммуноэлектрофореза в
агарозном геле (Фпимель X,, 1979). Антисызоротки к аллергоидам
и исходным аллергенам получали от кроликов, иммунизированных от­
носительно высокими дозами по схеме, предложенной Е.Ю.Хавкиным
и Э.В.Марковым (I98I) и по схеме, предусматривающей введение
относительно небольших доз аллергена (Райкис Б.Н., 1988).
Сравнительнуо характеристику специфичности и аллергенной
активности аллергоидов (моно- и микст-) и гомологичных аллерге­
нов (моно- и микст-) проводили методом прик-теста на ?! пациен­
те, сенсибилизированных к пыльце деревьев (береза, ольха, лешина) согласно Методических рекомендаций - "Проведение диагности­
ки аллергии тестом укола - гфик тестом" (Фралкии В.Л. с соавт.,
1985). Результаты прик-теста выражали через полусумму размеров
диаметра волдыря (Да + да)/2 и методом Si . При этом кажлнй ин­
декс рассчитывается как отношение произведения максимального и
перпендикулярного к нему диаметров волдыря, полученного в ответ
на введение аллергена, к такому же произведению диаметров
ДЫРЯ
ВОЛ­
в ответ на введение гистамина (Да + да)/Дг х дг), гпе Да и
да - максимальный и перпендикулярный к нему диаметры волдыря,по-
10
лученные при кожном тестировании аллергеном и аллергоидом; Дг
и дг - максимальный и перпендикулярный к нему диаметры волдыоя,
полученные при тестировании 0,01^ гистамина. Результаты изуче­
ния аллергенной активности аллергенов и аллергоидов (моно- и
микст-) из пыльцы деревьев проводили по четырехбальной системе
(Адо А.Д., 1978).
Статистическая обработка результатов исследований проводи­
лась общепринятыми методами вариационной статистики с определе­
нием средник, стандартных отклонений, коэффициента корреляции
( г ) . Достоверность различия показателей определяли по таблице
t - критерия Стьюдента (Ашмарин И.П., Воробьев А.А., 1962).
2. Физико-химические и антигенные свойства
аллергоидов из пыльцы березы, ольхи и
лещины
В настояшем разделе представлены результаты изучения трех
видов аллергоидов из пыльцы деревьев: березы, ольхи, лещины.
Всего изготовлено 36 серий аллергоидов: 19 - экспериментальных
серий из пыльцы березы, 12 - из пыльцы ольхи, 5 - из пыльны
лещины. При сравнительном анализе физико-химических свойств
экстрактов из пыльцы указанных деревьев в п};)оцессе их фсрмалинизации были выявлены сходные закономерности в изменении этих
свойств. Так, после формалинизации отмечается примерно одина­
ковое снижение рН с 7,48 - 7,51 до 7,37 - 7,31 и количества
свободных аминогрупп - с 28 - 39 мг^ до О иг%.
Указанные изменения в аллергенах сопровождались увеличени­
ем молекулярной массы. Так, по данным гель-фильтрации элюционные профили аллергоидов из пыльцы березы, ольхи и лещины имели
один пик, сдвинутый влево в сторону относительно более высоко­
молекулярных (фракций белка в сравнении с исходными аллергена-
II
ми. в то время как последние элюировали двумя пиками. Увеличе­
ние молекулярной кассы сопровождалось изменением соотношения
фракций белков с различными иэоэлектрическими точками. Метод
"зоэлекурофокусирования в геле агарозы выявил, что большинство
Kov?noHeHTOB аллергоидов из пыльцы деревьев фокусировались в бо­
лее узкой зоне рН от 3,5 до 6,0 в сравнении с компонентами соответствуюяих аллерх-енов - от 4,5 до 9,5. Таким образом, умень­
шение фракций с иэоэлектрическими точками, регистрируемыми при
относительно высоком рН, явилось еще одним подтверддением ак­
тивного вза1шодейотвия формальдегида с основными группами белка
(в том числе и с
tl Un- группами) и свидетельствовало о том, что
такое увеличение массы молекулы сопровождается глубокими Физи­
ко-химическими изменениями белков в аллергенах.
Однако, такие глубокие изменения в аллергенах, обусловлен­
ные взаимодействием формальдегида и температурного ifaKTora с
положительно заря71енны1ли группами белка экстрактов пыльцы де­
ревьев, не отразились отрицательно на антигенных свойствах способности аллергоидов индуцировать синтез антител гомологичнах исходному аллергену. Это было выявлено в реакции преципита­
ции по Оухтерлони, когда антиаллергоидные и антиаллергенные сы­
воротки форм1фОРЕли слинаюаиеся линии преципитации с исходным
аллергеном, что свидетельствовало об идентичности антигенов,
вступающих в реакция с антителами, содеряапихся как в одной, таге
и в другой сыворотках.
Кромз того, аллергоиды из пыльцы деревьев о(^ладали доста­
точно высокой антигенной способностью индуцировать не только
прецчпитирующие, но и гемагглготинируюшие антитела. Так, при им­
мунизации 1ф0ЛИК0в по схеме Е.Ю.Маркова - Э.В.Хавкина (достаточко высокие дозы) 1.яко-аллергоидами из пыльцы березы, ольхи и
12
лещины содержание гемагглютинирующих антител было несколько выше
(соответственно на 60^, 385S, 26%), чем при иммунизации одноимен­
ными аллергенами. Титр соответственно достигал для березы л6д1:128
и Д?§ 1:80, ольхи-й^д 1:67,3 и ^Ц
1:52,8, лешины-л£^ 1:127
и AtD 1:91,8. Эти данные свидетельствуют о сохранении в получен­
ных аллергоидах специфических антигенных детерминант исходных
аллергенов.
Для сравнительного анализа электрофоретической подвижности
аллергенов и аллергоидов использовался метод иммуноэлектрофореза
с"применением антисыворотки кроликов, кмчунизированных аллергоидом. Было установлено, что гфи обработке формальдегидом экстрак­
тов из пыльцы березы, ольхи и лещины блокируются антигены с отно­
сительно медленной электрофоретической подвитсностью. При этом,
линии преципитации располагались, в основном, со стороны анода,
так как, по-видимому, при иммунизации аллергоидом формируются
антитела, комплементарные к антигенам, сосредоточенным в зонах с
относительно более высокой электрофоретической подвижностью (как
в аллергенах, так и в аллергоидах).
В реакции иммунодифузии по Оухтерлони для анализа перекрест­
ной реактивности аллергенов из пыльцы деревьев были получены дан­
ные о наличии общих, а также уникальных антигенов в указанных
аллергенах, что подтвердило мнение Н. I p s e n e t a t .
(1986) и
K.Wiubieka e t CU/. (1987). При помоши этой же реакции с антисыво­
ротками к аллергоидам из пыльцы деревьев и одноименными аллергоидами показано, что в аллергоидах сохранялись антигенные детерми­
нанты исходных аллергенов, перекрестно реагирующих между собой.
Ьто явилось, Б известной мере, обоснованием возможности изготов­
ления аллергоидов из смеси пыльцы березы, ольхи и лещины.
13
Таким образом, представленные выше исследования характери­
зуют способность моно-аллергоидов индуцировать синтез как гомо­
логичных, так и перекрестно реагирующих антител.
Такая способность реализуется вне зависимости от того, что
часть антигенных детерминант в аллергоиде теряется, что было ус­
тановлено нами в реакциях преципитации с сыворотками, полученными
от животных, иммунизированных немодифицированным (исходным) ал­
лергеном. При этом выявлено, что в аллергоиде из пыльцы березы
в значительно большей степени были редуцированы антитела, чем в
аллергоидах из пыльцы ольхи и лещины, где они почти полностью
сохранялись.
Реакцией иммуноэлектрофореза было показано, что оставшиеся
нередуцированными антигены в аллергоидах обладают относительно
более высокой электрофоретической подвижностью, чем аллергены,
что явилось, по-видимому, результатом преобладания отрицательно
заряженных гидроксильных групп над основными положительно заря­
женными свободными
л/Нл- группами, блокированными формальдеги­
дом.
Таким образом, результаты лабораторного и экспериментально­
го изучения показали, что использование одних и тех же техноло­
гических приемов формалинизации позволяет получить аллергоиды из
пы.1ьцы березы, ольхи и лещины. Эти препараты сохраняют на высо­
ком уровне антителостимулируюшуга активность, общность антигенных
свойств между собой при сниженной способности взаимодействовать
со специфическими антиаллергенными антителами. Принципиальных
различий в изменении выше названных процессов, зависящих от ви­
да растений, из пыльцы которых готовили аллергоиды, выявить не
удалось.
14
3. Физико-химические и антигенные свойства миксталлергокдов из пыльцы березы, ольхи и лешины
Учитывая известные й клинической практике ^акты о часто
встречаемой полисенсибилизации больных к пыльце разнообразных
растений, прежде всего родственных в антигенном отноыении, како­
выми являются береза, ольха, леаина (Вик X. с соавт., 1984; Еркекова Р.Г. с соавт., 1989; HicKman В. , 1990), а также полонитзльные результаты изготовления моко-аллергоидов кз пыльцы де­
ревьев методом одноэтапной формаликизацнп, следующим этапом ис­
следования была оценка возможности применения модифицированной
технологии формалинизации аллергенов для изготовления аллергоидов из смеси пыльцы трех видов (береза, ольха, лещина) деревьев.
Аллергоиды из смеси пыльцы (микст-аллергоиды1 готовили по
технологии, разработанной для ыоно-аллергоидов деревьев, с уче­
том модификации метода экстрагирования, перед экстракцией пред­
варительно смешивая данные виды пыльцы в равных количествах.
Анализ результатов динамики показателей физико-химических
свойсгв, определяемых в процессе получения микст-аллергоидов,
практически не отличается от тех, которые наблюдались при изго­
товлении моно-аллергоидов из пыльцы деревьев. Так, в процессе
формалинизации препарата наблюдается достоверное (Р/0,05) сни­
жение рН в среднем с 7,49 до 7,37 (на 1,6/в) и свободных tJ Hgгрупп, в среднем с 218 мг^ до О мг%. Это свидетельствовало об
активном взаимодействии с формалином азотсодержащих продуктов
аллергена (свободных аминогрупп -
/»/ Hg). Такое взаимодействие
вызывало увеличение молекулярной массы аллергоида, что выража­
лось в смещении элюционной кривой микст-аллергоида в сторону от­
носительно более крупных белковых молекул в сравнении с алюцион-
15
ным профилем исходного микст-аллергена.
Данные изоэлектрофокус1фОванйя в геле агарозы подтверждают
увеличение молекулярной массы препарата, Микст-аллергоид характе­
ризовался меньггсл количеством заряженных коютонентов по сравненга
с микст-аллергеном, при этом большинство ко?шонентов аллергонда
фокусировалось в более узкой зоне рН (от 3,5 во 5,5), а в аллер­
гене - рН от 3,5 до 7,0.
Результаты изучения способности микст-аллергоидов индуциро­
вать синтез антител гомологичных как аллергоиду, так и исходног.1у
аллергену, проводилось в иммунодифузии по Оухтерлони. Анализ ланных реакции преципитации микст-аллергоида и микст-аллергена с анткаллергенной и антиаллергоидной микст-сыворотками показал, что
в микст-а."У1ергеке и в микст-аллергоиде содержатся идентичные ан­
тигены, вступающие в перекрестную реакцию с антителами, содержа­
щимися как в антиаллергенной, так и в антиаллергоидной сыворот­
ках. Это указывает на то, что полученный микст-аллергоид ип пыль­
цы деревьев икдуцирует синтез антител, комплементагных к спектру
антител, индуцированным микст-аллергеном.
Этим же методом показана способность микст-аллергоидов ин­
дуцировать синтез антител, коютлементарных к отдельным аллерге­
нам, входящим в состав такого микст-аллергоида. Так, антисыворотка к микст-аллергоиду образует менее интенсивные и в -меньшем
количестве преципитации линии, чем антисыворотка к микст-аллергену. В то же время, в аллергенах из пыльцы березы, ольхи и ле­
щины выявляются свои, уникальные ант11гены, характерные только
для этих видов пыльцы. Видимо, в процессе формалинизации миксталлергена часть антигенных детерминант экранируются и остаются,
главные! образом, антигены, общие для всех аллергенов, входящих в
16
состав микст-тэепарата.
Кроме того, результаты изучения иммуностимулирующей актив­
ности микст-аллергоидов показали, что они сохраняют способность
индуцировать и синтез специфических гемагглготинирующих антител.
При иммунизации более высокими дозами аллергоидов, изготовленных
из смеси пыльцы, формирование антител тормозилось по сравнению
с тем, что наблюдалось гфи введении микст-аллергенов. Уровень
содержания.антител был на 40^ ниже в группе животных, иммунизи­
рованных аллергоидом, чем аллергеном, что возможно, обусловлено
конкурентными взаимоотношениями аллергоидов изучаемых нами ви­
дов растений, входящих в состав микст-аллергоидов. Анализ же
результатов иммунизации микст-аллергоидами по относительно ща­
дящей схеме показал, что при этом наиболее полно реализуется
стимулирующий эффект микст-аллергоида, что выражалось в J" раза
более активным Армированием антител, чем при введении миксталлергена (результаты изучения иммуностимулирующей активности
микст-аллергоидов представлены на рис.1 и 2) (Р > 0,05).
Полученные данные свидетельствуют, что в практике исполь­
зования аллергоидов с терапевтической целью не следует стре­
миться к максимальному увеличению дозы такого препарата, учи­
тывая его сниженную аллергенность, так как это может привести
к торможению процесса формирования блокирующих Ig& - антител.
Анализируя способность микст-аллергоидов взаимодейство­
вать с антителами в реакции иммунодифузии по Оухтерлони, было
выявлено, что способность микст-аллергоида взаимодействовать
с такими преципитирующими антителами была также снижена, как
и у аллергоидов из пыльцы отдельных видов деревьев. Электрофоретический анализ позволил уточнить характер этих антител.
17
-a
ALCI
i<ita
n
.
30OO
2000
•"vl
:e5
1«00
14^
микст
(Зареза
Ь^
ольха
Ш
лещина
Рис.1. Результаты изучения иммуностимулирующей активности
микст-аллергена ( C D ) и микст-аллергоида ( GS3 ''
в условиях применения иммунизапии по схеме Б.Ю.Мар­
кова - Э.В.Хавкина,
Микст-аллергоид формировал линию преципитации с антисывороткой
к микст-аллергену в анодной части препарата, а микст-аллерген как в анодной, так и в катодной (хотя и в меньшей степени) частях.
Очеввдно, это явилось результатом блокады антигенные детерминант
в микст— аллергоиде, связанных с положительно заряженными свобод­
ными аминогруппами (аналогично тому, как это происходит в моно­
аллергенах) . Однако, данные полученные с сывороткой к микст-аллергоиду, отличались от результатов исследования электрофоретической
18
tiluL
9QQ .
lU
.
sot
3C0
.
•too
.
MKKCT
береза'
ольха.
лещина
Рис.2. Результаты изучения им1!уностимулирую!аей актив­
ности микст-аллергена (I I ) и микст-аллергоида ( GCT ) в условиях применения щадящей схемы
иммунизации.
подвижности моно-аллергенов с соответствующими им сыворотками к
моно-аллергоидам. Линии преципитации, образованные микст-аллергоидом, располагались ближе к аноду, чем линии, образованные
ыикс'1'-аллергеноы,
Таким образом, результаты изучения микст-аллергоидов из
папьцы березы, ольхи и лещины показали принцшшаль^ювозыожность
использования отечественной технологии формалинизации для полу­
чения таких препаратов, обладающих низкой аллергенностью, более
высокой им).!уностимулиругощей активностью и сохранностью антиген-
19
ных свойств каждого вида пыльцы, входящей в его состав, в срав­
нении с немодифицированными водно-солевыми экстрактами.
4. Клинические испытания аллергоидов и мшсстал.чеотоидов из пыльцы деревьев
Представленные в предыдущих разделах автореферата данные
послужили основанием для утверждения прогпамьш клинических испы­
таний лечебных свойств аллергоидов и микст-аллергоидсв из пыльпы
березы, ольхи и лещины на добровольцах (решение ученого совета
ГИСК им.Л.А.Тарасевича от 28.08.90К Результаты этих исследова­
ний, проведенных на базе различных клиник нашей страны, показали
следующее. Так, при изучении аллергенных свойств, разработанных
нами микст-аллергоидов из пыльцы березы, ольхи и лещины, было
установлено снижение интенсивности кожных проб в 2-2,5 раза в
сравнении с аналогичными аллергенами, а порог чувствительности
слизистой носа на микст-аллергоид был ниже в IO-IOO раз (Горячкина Л.А. с соавт., 1990, I99I; Никанорова М.В., I99I). Это поз­
волило начать специфическую иммунотерапию с более высокой кон­
центрации (в среднем начальная доза 0,2P/Vu.) и тем самым лостичь
высоких суряларных доз в процессе лечения (максимальная конечная
доза составила в среднем 3 000 РЛ/и, , а курсовая - 40 000 РЛ/U. ) .
Курс иммунотерапии аллергоидом из пыльцы березы и микст-аллергоидом из пыльцы деревьев составил 20 инъекций, причем положитель­
ный лечебный эффект находился в пределах от 12% до 94Й (Горячкина Л.А. с соавт., 1990, I99I; Фрадкин В.А. с соавт., 1990, I99I;
Балао'олкин И.И. с соавт., 1991).
Проведенными исследованиями было установлено, что в процес­
се лечения пациентов разработанными нами микст-аллергоидами из
пыльцу березы, ольхи и лещины, сначала отмечалось повышение, а
затем снижение исходного уровня общего iq Е (Балаболкин И.И,
20
с соавт., I99I; Горячкина Л.И. с соавт., I99I; Никанорова U.B.,
I99IK Уровень же аллергенспецифических 1^Е-антител под влиянием
специфической иммунотерапии аллергоидами имел тенденцию к сниже­
нию (Фрадкин В.А. с соавт., 1990) или не изменялся (Горячкина Л.А.
с соавт., I99I; Никанорова Ы.В., I 9 9 I ) . Показано также, что спе­
цифическая иммунотерапия аллергоидами из пыльцы деревьев способ­
ствует более интенсивной выработке блокирующих антител (Фладкин
В.А. с соавт., 1990; Горячкина Л.А. с соавт., 1990, I99I; Балаболкин И.И. с соавт., I99I) и отмечена прямая корреляция между
увеличением блокит)у:ощей активности сыворотки и эф(|ективностью
специфической иммунотерапии. Остальные группы иммуноглобулинов
( Ig
А, IQ М) менялись незначительно, а уровень ЦИК оставался
неизменным (Фрадкин В.А. с соавт., 1990).
Более подробно аллеюгенность пыльцевых аллергоидов из де­
ревьев была изучена по кожным тестам на базе Ставропольского ал­
лерголог ического кабинета. ПРИ этом выявлено, что если формалиниэация существенно не влияла на активность аллергоидов и миксталлергоидов индуцировать синтез антител, то способность взаимо­
действия аллергоидов с аллергическими антителами заметно снижа­
лась. Так, при кожном тестировании прик-тестом у больных, сенси­
билизированных к пыльце деревьев и оценки ее по средним размерам
двух диаметров волдыпя (без учета реакции на гистамин), аллергенность как в МОН0-, так и в микст-аллергоидах (рис.3) уменьшалась
примерно в 2 раза.
ПРИ оценке результатов тестирования по методу Si ( sKin
inaeai
) путем учета одновременно с активностью реакции кожи на
аллерген (аллергоид) реакции кожи на гистамин, была обнаружена
более высокая степень снижения аллергенной активности моно-и миксталлергоидов (рис.4) (в 4-6 р а з ) , что свидетельствует и о более
21
мм
9-
3-
4
О
береза
микст-
Рис.3. Результаты прик-теста на аллерген ( i i ), аллергоид (SS3 ), микст-аллерген ( S21 ), микст-ал- .
лергоид ( f==\ ^ и кратность снижения аллергенности
Ан/Аг ( ГПТП 1.
высокой чувствительности данного метода. Проведенный нами кор­
реляционный анализ показал достоверную (Р/0,05) взаимосвязь
данных прик-теста, выраженных в Si и путем сравнения только
средних размеров диаметра волдырей ( г = 0,8 - 0,93) без уче­
та реакции на гистамин.
Таким образом, клинические испытания наших микст-аллергоидов и отдельных аллергоидов из пыльцы .деревьев (береза, ольха,
лещина) на базе Ставропольского аллергологического кабинета и
22
MM
11-
SJ
3i
береза.
микстРис. 4, Результаты кожного тестигования, вьграженные oi
аллергеном ( I I ), аллергои,г.ом ( 1Л\М ), миксталлелгеном ( В ^ ), микст-аллергоидом ( P = j ) и
кпатность Si снижения аллергенности Ан/Аг ( ШШЗ )
на ограниченно1л контингенте на базе различных клиник стпаны
свидетельствуют о высокой клинической и иммунологической эф­
фективности данного препарата при проведении специфической
иммунотерапии. Это дазт возможность введения аллергоидоз в
относительно ЕЫСОКЖ дозах в силу низкой их аллергенности.
ВЫВОДЫ
I . Методом одноэтапной формалинизации получены отечест­
венные моно- и микс^-аллергоиды из пыльцы деревьев (береза,
23
ольха, лещина) со сниженной аллергенностьго, высокими иммуногенными свойствами и терапевтической активностью.
2. Формалинизация вызывает общие для моно- и микст-аллепгоидов из пыльцы деревьев (береза, ольха, лещина) изменения рН,
свободных
// 1^- групп, молекулярной массы, заряда изоэлектри-
ческой точки, иммуноэлектрофоретической подвижности, антигенности и аллергенности.
3. В аллергоидах из пыльцы березы, ольхи и лещины сохраня­
ются общие антигены, перекрестно реагирующие между собой, что
свидетельствует об их устойчивости к действию денатурирующего
влияния формальдегида.
4. Аллепгоиды из пыльцы березы, ольхи и лещины и микст-аллергоиды из пыльцы этих видов деревьев обладают способностью ак­
тивно стимул1фовать синтез гомологичных и перекрестно реагирую­
щих антител.
5. Аллергоиды из пыльцы деревьев обладают значительно сни­
женной способностью взаимодействовать с кожносенсибилизилуощими
антителами, чем алле^)гены. Наиболее объективным методом оценки
такой способности является sfcn index
(Si
). позволяющий
учесть индивидуальную неспецифииескую реакцию кожи пациентов на
стандартное количество гистамина.
6. При лечении больных моно- и микст-аллергоидамн из пыльцы
деревьев (береза, ольха, лещина) достигается более высокий терапевт1Г!ескнй эффект, чем при аллепгенотерапии, за счет сниженной
аллергенности и более высокой иммуногенности аллергоидов.
ёЦ§Я2§11И5_'Е§323Ы5Х25-ИССледовациЗ. Утверждена инструкция
по изготовлен™ и контролю микст-аллергоида из пыльцы бесэзы,
ольхи и лещины, а также Програьша проведьння Государственных
24
клинических испытаний (решение Комитета по МИБП, протокол № б
от 2 8 . 0 7 . 9 4 г . ) после проведенных испытаний на ограниченном кон­
тингенте в клинике аллергологии ЦОЛИУВ (решение Ученого совета
ГИСК и1«.Л.А.Тарасевича, протокол f' 18 от
28.08.1990Р.).
Оформле­
ны и представлены в ГИСК им.Л.А.Тарасевича экспериментально-про­
изводственный регламент и временная фармакопейная статья, кото­
рые будут утверждены после принятия решения Комитетом по МИБП о
возможности их применения в практике здравоохранения по итогам
Государственных испытаний.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИЮВАНШХ ГО ТЕМЕ
ДИССЕРТАЦИИ:
I . Экспериментальное обоснование технологии изготовления
отечаствснных пыльцевых аллергоидов (Райкис Б.Н., Воронкин Н.И.,
Ыахлиновская Ф.Л.) / / Актуальные проблемы прикладной иммунологии,
биотехнологии и производства бактерийных препаратов. - Пермь,
1988. - С.157-153.
S. Новый лечебный препарат для иммунотерапии поллинсза
микст-аллергоидом из пыльцы деревьев (береза, ольха, лещина)
(Райкис В.Н., ИЛ.ТОТОВИЧ Н.А., Деншикова Т.Ю.) / / Реабилитация
иммунной систеыъ'. - Цхалтубо, 1990, - С.337.
3 . Биологическиз свойства микст-аллергоидов из пыльцы де­
ревьев / / Актуальные вопросы медицинской биотехнологии. - Томск,
199I. - С.67-68.
4 . Депигментированныо пыльцевые аллергены (Райкис Б.Н.,
Иллртович Н.А., Филиппова З.К.) / / Меэдунарсдный сюшозиук по
аллергологии и иммунологии: Тез.докл.-Алма-Ата,1992.- С.33.
5 . Микст-аллергоидц из пычьцы деревьев (Райкио В.Н., Иллютович Н.А., Дешшков Т.1).) / / Месдународный симпозиум по аллер­
гологии и иммунологии. ~ Дагоныс, 1992. - С.236.