характеристика сообщества микромицетов арабографических
advertisement
Министерство образования и науки РФ Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования « КАЗАНСКИЙ (ПРИВОЛЖСКИЙ) ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» ИНСТИТУТ ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ И БИОЛОГИИ КАФЕДРА МИКРОБИОЛОГИИ Направление: 06.03.01 (ОКСО 020400.62) – биология ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА Бакалаврская работа ХАРАКТЕРИСТИКА СООБЩЕСТВА МИКРОМИЦЕТОВ АРАБОГРАФИЧЕСКИХ РУКОПИСНЫХ КНИГ XIX ВЕКА ИЗ БИБЛИОТЕЧНОГО ФОНДА К(П)ФУ Работа завершена: “___” г. 20 (В.В. Раденко) Работа допущена к защите: Научный руководитель к.б.н., доцент “ ___” 20 г. (Г.Ю. Яковлева) Заведующий кафедрой д.б.н., профессор “ ___” 20 г. (О.Н. Ильинская) Казань – 2015 СОДЕРЖАНИЕ стр. ВВЕДЕНИЕ 4 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6 1.1 Микроскопические грибы, морфологический 6 состав и их свойства 1.2 Условия прорастания и существования грибов на 12 поверхности рукописей 1.3 Родовая принадлежность микромицетов и их 14 химическая активность ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 20 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 20 2 2.1 Объект исследования 20 2.2 Методы отбора и анализа проб 22 2.3 Биохимическая характеристика изолятов 22 2.3.1 Определение целлюлазной активности 22 2.3.2 Определение протеолитической активности 23 2.4 Определение токсичности микромицетов 24 2.5 Определение рН среды 26 2.6 Статистическая обработка данных 26 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 3.1 Качественная и количественная характеристика 27 27 изолятов, выделенных с арабографических рукописей 3.2 Биохимическая характеристика выделенных 30 микромицетов 3.2.1 Оценка целлюлазной активности изолятов 30 3.2.2 Оценка протеолитической активности изолятов 33 3.3 Оценка токсичности микромицетов по отношению 36 к тестерным штаммам Salmonella tiphimurium TA 100 и Bacillus subtilis 2 3.4 Оценка изменения кислотности среды при 37 культивировании микромицетов ВЫВОДЫ 42 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 43 3 ВВЕДЕНИЕ Рукописные книги, найденные во время экспедиций, чаще всего хранились в очень неблагоприятных условиях: на чердаках, в подвалах и сараях. Все это пагубно сказалось на их состоянии. Подвергавшиеся длительному воздействию влаги, перепадам температур, хранящиеся в закрытых помещениях рукописи сильно пострадали. Влажность, запыленность, отсутствие проветривания – все это способствовало активному развитию микроорганизмов. Именно поэтому необходимо проводить микробиологические исследования древних книг и в том числе и рукописных. Такие исследования регулярно проводятся в самых разнообразных книгохранилищах и архивах всего мира [Michaelsen, 2010,. Roussel et al., 2012]. При ненадлежащем хранении и использовании старинные рукописи подвергаются естественному биологическому воздействию. Причем серьезное повреждение кожи и бумаги происходит не только за счет механического разрастания мицелия микроскопических грибов, а в значительной степени обусловлено воздействием ферментов [Пехташева с соавт., 2012]. Известно, что целлюлозолитической активностью обладают многие виды Penicillium и Aspergillus [Michaelsen, 2010, Roussel et al., 2012]. Кроме ферментов, микромицеты способны выделять различные органические кислоты. Благодаря этим кислотам, рН пораженной бумаги чаще всего опускается до 2, что способствует гидролизу целлюлозы и ускоряет распад бумаги [Zotti, et al., 2008]. Лабораторные исследования о микромицетах обитающих на рукописях и документах, чаще всего указывают на возможность возникновения проблем со здоровьем у людей следящих за архивами. [Roussel et al., 2012]. В связи с этим целью данной работы является микробиологический анализ сообщества микромицетов арабографических рукописей ХIХ в. 4 В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи: 1) Дать качественную и количественную характеристику сообществу микромицетов, выделенному с арабографических рукописей XIX века; 2) Дать биохимическую характеристику микромицетам, выделенным с арабографических рукописей XIX века 3) Оценить токсичность микромицетов, обладающих наибольшей целлюлазной активностью, в отношении Salmonella tiphimurium TA 100 и Bacillus subtilis 4) Оценить изменение кислотности среды культивирования микромицетов, обладающих наибольшей целлюлазной активностью. 5 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Микроскопические грибы, морфологический состав и их свойства Главная установка при работе с арабографическими рукописями XIX века, это наивысшая осторожность в использовании, аккуратность, бережность и осознание того, что каждый экземпляр уникален, так как он остается – единственным [Поповская, 2002]. Биоповреждения бумаги и пергамента древних книг и документов вызывают серьезную озабоченность для библиотек и архивов по всему миру. Механизмы порчи исторических материалов были широко изучены, также ведется работа над практическими методами по улучшению состояния древних книг, это является одним из основных направлений институтов и лабораторий, участвующих в сохранении культурного наследия [Michaelsen et al., 2010]. Но при этом на коллекции миллионов книг, древних рукописей, документов постоянно оказывают действие различные факторы окружающей среды, такие как температура, влажность, количество света, химические реагенты. Большинство микроорганизмов находящихся в помещениях и библиотечных фондах являются микроскопическими грибами, они представляют наибольшую опасность для хранилищ. Это обусловлено типом их питания и способностью к безграничному росту [Крестьянникова с соавт., 2014]. Микробные исследования, основанные на стратегии культивирования не являются надежными, потому что они дают не полную информацию о микробном разнообразии. Применение методов молекулярной биологии показали, что порча рукописей принадлежит грибным и микробным консорциумам. Так же одной из проблем для осуществления подробного анализа документов и рукописей является ограниченная выборка из художественных и документальных объектов [Michaelsen et al., 2010]. Споры грибов легко разлетаются вокруг и обладают высокой устойчивостью к действию физико-химических факторов. Одним из важнейших требований к внутренней среде библиотечных зданий является 6 обеспечение постоянных температур и влажности воздуха независимо от смены сезона года или ухудшения экологии, что отмечают исследователи разных стран [Крестьянникова с соавт., 2014]. Например, решение проблемы контаминации книг микромицетами и бактериями решается отделом реставрации и консервации Белорусского библиотечного фонда за счет комплекса разноплановых мероприятий: 1) Консервация; 2) Микологическое обследование фонда; 3) Физико-химическое исследование бумажных документов и редких рукописей; 4) Реставрация книг и рукописей; 5) Переплет. В целях профилактики биоповреждений в научной библиотеке ведутся работы по микробиологическому состоянию воздуха в хранилищах [Коваленко, 2012]. Уровни микробиологического загрязнения в музеях и архивах разнообразны и варьируются от 2.1 х от 1.4 х до 1.7 х до 7.0 х КОЕ / 100 КОЕ / в воздухе и на поверхности. Доминирующие микроорганизмы являются микромицеты, на долю которых приходится, около 48 % от общей обсемененности. Было обнаружено, что количество грибов при посещении различных архивных помещений, музеев и библиотек возрастает [Skóra J et al., 2012]. Сохранность рукописей в большинстве случаев определяется устойчивостью текста к старению и воздействию внешних и антропогенных факторов, что связано с качеством материала. Старение бумаги - весьма сложный и необратимый процесс, который зависит от ряда факторов: - стабильности во времени используемого сырья и вспомогательных веществ; - рН среды ; - температура, степень освещенности и влажность; 7 - факторов, влияющих на микробиологическое разрушение бумаги [Андреева с соавт., 2008]. Микроскопические грибы - это низшие эукариотные организмы, имеющие оформленное ядро в клетке. Распространены широко в природе и встречаются во всех районах нашей планеты на различных поверхностях. Микромицеты разнообразны по внешнему виду, особенностям и строению, им присуще одно экологическим и многоклеточность. Микроскопические грибы имеют гетеротрофный тип питания, могут синтезировать гликоген. А также микромицетам свойственен признак растений: верхушечный рост, неподвижность в вегетативном состоянии и т. д. Они обладают и другими особенностями, не встречающиеся ни у животных, ни у растений, сложные ядерные циклы, мицеллярный рост и др. [Пехташева с соавт., 2012]. Микроскопические грибы не имеют хлорофилла, и существуют только за счет готовых органических веществ, получая органику из мертвого (сапрофиты) или живого (паразиты) субстратов. Сапрофитные микромицеты участвуют в почвообразовательном процессе, многие из них известны как сильные разрушители различных материалов и изделий, в том числе, документов и книг, также они утилизируют органические остатки. Некоторые микромицеты вызывают заболевания сельскохозяйственных культур, домашних животных и человека. Многочисленные группы грибов приносят большой материальный ущерб, повреждая различные не только промышленные материалы, но и бытовые. Грибы имеют физиологические, генетические и морфологические особенности, и именно они занимают доминирующее положение среди других организмов, вызывающих повреждения [Андреева с соавт.,2008]. На сегодняшний день известно более 280 видов микромицетов, обнаруженных в книгохранилищах. Катализируемая кислотами гидролитическая деструкция целлюлозы является причиной порчи документов и древних рукописей в книгохранилищах. Споры и фрагменты мицелия, присутствующие в воздухе 8 и на поверхности книг и рукописей, переносятся с их основного природного резервуара — почвы через вентиляцию, форточки, одежду рабочих. Рассеивание спор увеличивается в жаркую погоду и снижается во влажный период. В то же время повышение влажности способствует активному росту спор и мицелия микроскопических грибов, уже попавших на поверхность или в толщу документов и рукописей хранилища [Головина с соавт, 2010]. Помимо бумаги они поражают клей, нитки, ткани, восковые печати, чернила. Современная мелованная бумага имеет щелочную реакцию и потому неблагоприятна для развития грибов, а бумага XIX – начала XX в. с повышенной кислотностью, а также казеиновый клей, крахмал, желатин являются для них подходящей средой [Нюкша, 1994]. Старопечатные и древние рукописи имеют ряд особенностей, отличающий их от других более новых документов (состав бумаги, красок, клея, чернил, кожные переплеты, ветхость бумажной основы, наличие загрязнений). Эти особенности влияют на выбор методик и средств проведения микробиологического исследования, а также дальнейшей дезобработки. Проводя исследования редких рукописей, отмечали широкое разнообразие микромицетов и их спор, продуктов распада и пигментов. Так же обнаруживаются остатки грибов потерявших жизнеспособность, в то же время на участках со старыми повреждениями, могли и сохранятся живые споры [Муратова, 2012]. Для хранилищ и библиотек характерны микромицеты, образующие налеты на поверхности книг и рукописей. Сохранность культурного наследия определяется окружающей обстановкой. Загрязнение ускоряет естественное старение хранимых реликвий и рукописей [Лаврентьева, 2000]. В процессе ферментативного расщепления целлюлозы выделяются органические кислоты и вода, при этом влажность и кислотность бумаги возрастают. В результате образуются пигментные пятна различных цветов которые маскируют текст, делают его трудночитаемым. Продукты разложения целлюлозы склеивают страницы что при перелистывании может затруднить 9 работу с документом, наблюдается выпадение целых фрагментов документа. [Головина, 2010]. В хранилищах библиотек встречаются представители 3-х классов микроскопических грибов: сумчатых, дейтеромицетов и зигомицетов [Amore А et al., 2013]. Мицелий микромицетов представленных на рисунке 1, состоит из большого количества гиф диаметром 2-10 мкм, он чаще всего бывает однотипный по строению и может быть бесцветным, воздушным также встречается окрашенный мицелий. Окрашенный мицелий в свою очередь образует на бумаге и книгах трудноудаляемые пятна и разводы. Мицелий библиотечных грибов кремового и розового цвета заполняет собой весь пергамент и бумагу сплошной пленкой. У микроскопических грибов наблюдаются 3 способа размножения, характерные для грибов. Вегетативное размножение – это размножение кусочками мицелия. Рисунок 1 – Мицелий микромицета под микроскопом. Бесполое размножение микромицетов, связанно с образованием специальных органов: спорангиев со спорангиоспорами внутри или сложно ветвящихся выростов мицелия – конидиеносцев, на веточках которых образуются конидиоспоры (рисунок 2). При половом размножении могут образовываться плодовые тела. У большинства микромицетов они сложены из переплетения гиф, внутри которых находятся аскоспоры. Аскоспоры и конидиоспоры, называемые 10 просто спорами, бывают одно- и многоклеточными и разнообразной формы: округлыми, овальными, квадратными, звездчатыми и т. д. Их размеры колеблются – от 1 до 22 мкм. Они почти всегда окрашены в самые разнообразные цвета: черный, красный, бледно-розовый, желтый, зеленый, что и обуславливает цвет колоний грибов вредителей. Поверхность спор неровная, с выростами и ворсинками. Это дает им возможность долго, находиться в воздухе и разноситься потоками воздуха на огромные расстояния [Андреева с соавт., 2008]. Плесневые грибы производят огромное количество спор, к примеру, один конидиеносец Aspergilus niger – до 10 000 спор. Споры (конидии) являются теми грибными структурами, которые, как правило, ответственны индуцировать развитие за микогенную микоаллергии. сенсибилизацию Грибы и достаточно могут хорошо приспособлены ксинтрофии с другими организмами и, как правило, обитают в ассоциациях с бактериями, грибами иных видов и родов, а также с более высоко организованными существами, например, из отдела Metazoa, тип Annelida [Винникова, 2011]. Споры потоками воздуха переносятся особенно быстро. Благодаря своим микроскопическим размерам они могут осуществлять проникновение в самые мелкие невидимые глазу трещины, которыми пронизаны даже такие плотные материалы, как различные виды железа и гранита. А иногда даже обнаруживаются в полимерных материалах на границах раздела компонентов и высокомолекулярного соединения, входящих в состав и образующих этот материал. Споры также могут увлекаться водой вглубь материалов и книг. Эти наглядные примеры говорят нам о том, что микроскопические грибы можно встретить всюду, даже там, куда не могут проникнуть другие простейшие организмы. 11 Рисунок 2 – Строение конидиеносца пеницилла. 1.2 Условия прорастания и существования грибов на поверхности рукописей Значительную часть при засорении материалов и рукописей микромицетами осуществляют их споры, которые адсорбируются на поверхности книг и рукописей. Адгезия – является первым этапом при повреждении твердых субстратов. Попав на поверхность органического субстрата, спора прорастает в благоприятных для нее условиях при оптимальной температуре и влажности. Образует мицелий, на котором уже через несколько суток могут появиться конидиеносцы. Поэтому грибы очень быстро захватывают пространство и поверхность субстрата. Для прорастания спор микромицетов необходима вода. Споры некоторых грибов способны расти при влажности воздуха чуть выше 65%, а большинство – свыше 80%. Грибам для роста и развития в больших количествах нужен атмосферный кислород [Андреева с соавт., 2008]. Другие элементы: водород, углерод, азот, фосфор – грибы получают из вещества, на котором поселились. Лабораторные рукописях и исследования документах, чаще о микромицетах всего указывают обитающих на на возможность возникновения проблем со здоровьем у людей следящих за архивами Исследования показывают, что архивы не представляют загрязненную 12 окружающую среду для человека, но люди чувствуют недомогание при прямом контакте с заплесневелыми документами, а также это может быть связано с высоким концентрациям грибов в воздухе складов архива [Roussel et al., 2012]. При анализе рукописных книг хранящейся в библиотеках, колонизация бумаги и ее биоразложение зависит от вида микроскопических грибов. В большинстве случаев биоразложение бумаги связано с их целлюлолитическими свойствами. Как и в естественной среде, разнообразие групп микроорганизмов обусловлено наличием или отсутствием субстрата для их питания или же антагонистических отношений друг с другом [Michaelsen et al., 2010]. Немаловажную роль в повреждении книг, письменностей и древних рукописей микромицетами играет способность последних расти в экстремальных условиях. Они устойчивы к высыханию. Так же известны случаи, когда они выдерживали засуху в течении 20, а то и более 30 лет. Большая часть грибных спор переносит низкие температуры без потери биохимической и физиологической активности. Это означает, что сухие документы или же ценные рукописи со следами старых грибных колоний в случае большого скопления влаги могут снова зарасти микромицетами и стать источником заражения для новых документов. При возникновении благоприятных условий споры грибов прорастают, и на рукописях начинается развитие мицелия. Оптимумом для развития грибов являются температура 250С и влажность 65%. Рост мицелия, хотя и менее активный, возможен при меньших значениях влажности и температуры. При температуре 10-150С развитие грибов практически прекращается, поэтому низкие температуры, в частности замораживание, могут быть одним из методов консервации документов и книг [Грефнер, 2001]. Многие грибы способны существовать и расти на бумаге при рН 3-10, но оптимальная точка роста в пределах рН 4.3-9.2, а для разрушения целлюлозы рН 5.6-8.6, хотя есть виды, у которых оптимум находится в 13 пределах рН 7.3-8.6. Споры микромицетов устойчивы к действию различных внешних неблагоприятных факторов: замораживанию, высоким температурам, разным дезинфицирующим агентам, радиации. Рассеянный солнечный и дневной свет не оказывает существенного влияния на споры, но на них разрушительно действует облучение коротковолновыми ультрафиолетовыми лучами. Мицелий микроскопических грибов менее устойчив к действию неблагоприятных факторов и погибает даже при высушивании. Движение воздуха косвенно влияет на развитие плесневых грибов, изменяя влажность воздуха и субстрата. Лучше всего грибы развиваются в местах с небольшим количеством воздуха и губительных лучей: в тесно заставленных углах, редко открываемых шкафах, особенно у холодных и сырых стен и потолков. Но движение воздуха играет основную роль в расселении грибов. 1.3 Родовая принадлежность микромицетов и их химическая активность Микромицеты, вызывающие повреждения бумаги, входят в группу сапрофитов. После грибковой колонизации целлюлозный материал становится более приемлемым для многих микроорганизмов, так как он становится обогащенный азотом. Среди грибов, которые были выделены из рукописи, большинство обладало целлюлолитической активностью. Это представители родов Aspergillus : A.terreus, A. pullulans, представитель рода Penicillium: P. Рinophilum. A.terreus является микромицетом, используемым в биодеградации лигноцеллюлозных отходов. A. Pullulans, по другому их называют "черные дрожжи", растут на деревьях и листьях. Этот гриб считается эффективным продуцентов целлюлаз и гемицеллюлаз. По отношению к субстрату микроскопические грибы разделяют на две группы: специфические и неспецифические сапрофиты [Michaelsen et al., 2010]. К неспецифическим относят грибы, встречающиеся на различных органических субстратах. Чаще всего это представители родов Aspergillus, Penicillium, Alternaria, Fusarium. Специфические грибы - сапрофиты 14 формировались в процессах приспособительной эволюции к тем или иным субстратам. Примером могут служить Cladosporium resinae [Пехташева с соавт., 2012]. На поверхности книг, в частности из национального библиотечного фонда Кубы, были выделены актиномицеты (род Streptomyces) способные разлагать относительно сложные органические вещества, такие как целлюлоза, пектин, хитин, белки и гуминовые вещества. Присутствие этих микромицетов на документах может ухудшить состояние бумаги при относительной влажности 90% в течение 24 часов. Были выделены микромицеты рода Aspergillus: Aspergillus niger и Aspergillus flavus. Колонии из рода Penicillium и Cladosporium [Borrego et al., 2012]. В Cанкт-Петербурге и Ленинградской области основными контаминантами жилых помещений и рукописей являлись грибы рода Penicillium (64%), Aspergillus (48%), Cladosporium (20%), реже - Rhizopus (12%) и Alternaria (12%). Разброс концентраций спор грибов в исследуемом объекте составил от 100 до 10 спор/м3. Многие микромицеты, оказываются заведомо вредными для людей. К ним относят отдельных представителей родов Aspergillus, Cladosporium, Epicoccum, Fusarium, Myrothecium,Paecilomyces, Penicillium, Stachybotrys и многих других. Подобные микромицеты могут быть причиной аллергических состояний (риниты, бронхиальная астма) у лиц, вдыхающих загрязнённый спорами воздух [Винникова, 2011]. Увеличение содержания условно патогенных грибов на древних рукописях и книгах, а также в помещении, где хранятся реликвии, является причиной повышенного Определение степени интереса вирулентности к изучению их микромицетов вирулентности. необходимо для установления их опасности для человека в первую очередь, а также для книг. К основным фактором патогенности относят: рост при 37 С , способность к адгезии, экстраклеточная секреция протеиназ и других токсичных ферментов. Протеолитической активностью обладают в большинстве случаев представители рода Penicillium, Cladosporium. Способность к росту при 15 повышенной температуре выявлена у штамма Alternaria alternate. Исследования также показывали, что в зависимости от уровня загрязнения и времени года степень распространенности токсигенных штаммов также варьирует. Например, A. niger, преобладает в зимне-весенний период [Куимова с соавт., 2009]. Материальная основа в виде бумаги, пергамена, бересты, картона, клея, кожи, ткани, досок служит источником для существования микроскопических грибов. При хранении документов и книг в условиях высокой влажности воздуха зарастание микромицетами начинается по всей поверхности. Достаточно в течение 10-14 суток заменить зараженные коробки с рукописями, чтобы предупредить поражение документов грибами. Не следует забывать о том, что влажность воздуха необходимо нормализовать в короткие сроки, чтобы не допустить поражения документов внутри коробок и контейнеров. Книги и документы, заросшие микроскопическими грибами, необходимо вынести из хранилища библиотеки, просушить, обеззаразить и привести в хорошее состояние. Только после обеззараживания их можно внести обратно в хранилище, если влажность в нем уже нормализовалась. В случае промокания бумаги начинается рост и развитие грибов, если книгу своевременно просушить, то рост прекратиться. Повреждения материалов и рукописей плесневыми грибами происходит за счет не только механического разрушения разрастающимся мицелием, но и вследствие воздействия специфических ферментов, выделяемых грибами наружу, с помощью которых субстрат путем химических преобразований разлагается на простые вещества. Действие разных ферментов строго специфично, и один и тот же фермент не может разлагать, например, целлюлозу и кожу. Обычно каждый микроскопический гриб имеет не один, а набор различных ферментов, но преимущественно выделяет фермент, необходимый для разрушения именно того субстрата, на котором он поселился. 16 Ферменты обладают высокой активностью. Даже в совсем малых количествах фермент может вовлекаться в реакцию со значительной массой реагирующего вещества. Молекула фермента за 1 мин может вызывать превращение сотен тысяч молекул субстрата. Особенностью ферментов является их специфичность, она обусловлена структурными особенностями их молекул и субстрата. Как известно субстрат и фермент подходят как ключ к замку [Мачулиса, 1990]. Активное и разрушительное действие на документы и древние рукописи оказывают ферменты из классов оксидоредуктаз, гидролаз и лиаз [Пехташева с соавт., 2012]. Обычно на книгах и рукописях представлены некоторые группы микромицетов, осуществляющие разнообразные этапы разрушения бумаги и книг: первая группа разрушает только проклейку в бумаге (в старинной бумаге это крахмал, животный клей); вторые начинают своё разрушение с основной части бумаги – целлюлозы; третьи – с помощью специальных ферментов целлюлозного комплекса разрывают целлюлозные цепи с образованием моносахаридов, утилизируемых клетками микромицета до превращения их в воду и углекислоту. Целлюлоза – полисахарид и многие виды грибов, встречающиеся на книгах и рукописях, способны в благоприятных условиях температуры и влажности за несколько месяцев разрушить более 50% целлюлозы в бумаге. Кроме ферментов, вредители выделяют в субстрат другие продукты своей жизнедеятельности – пигменты и органические кислоты. На месте колоний грибов остаются пигментные пятна: бурые, серые, желтые, красные, фиолетовые и т. д. в зависимости от состава бумаги, ее кислотности и вида грибов (рисунок 3). В зависимости от рН среды грибы меняют свою окраску на пергаменте. Грибные пигментные пятна плохо отбеливаются, и отбелка применима только к печатным документам и рукописям. В ходе своей жизнедеятельности грибы образуют следующие кислоты: лимонная, щавелевая, янтарная, яблочная, койевая и др. Благодаря этим кислотам рН 17 пораженной бумаги чаще всего опускается до 2. А такая высокая кислотность способствует гидролизу целлюлозы и ускоряет распад бумаги [Zotti, et al., 2008]. Бумага становится хрупкой. Органические кислоты остаются в бумаге и после дезинфекции, разрушая и без того уникальные рукописи. Рисунок 3 – Пигментация бумаги грибами [Андреева, Копанева, 2014] В крупных книгохранилищах и библиотеках, ведутся работы по сохранению архивных документов. Например, обработка дистиллированной водой пожелтевших от времени документов, так же наносят мыльную пену на особо загрязненные участки, затем смывают проточной водой в течении 20 минут. Многократная промывка окисленной бумаги водой полностью не устраняет кислотность, а лишь на некоторое время повышает рН. Так же специалисты отдела реконструкции пытаются придать прочность и эластичность бумаге, дополнить утраченные детали книг. Особое внимание уделяется подборке реставрационных материалов, используют бумагу устойчивою к кислотам, содержащую щелочной буфер, тонкую с высокой степенью прозрачности. Эта бумага обладает способностью хорошо впечатываться в фактуру книг и рукописей, при высыхании менять свои характеристики вместе с реставрируемым документом. Уделяется время для проведения консервации рукописей – изготовление ручным способом индивидуальных микробиологических контейнеров из бескислотных материалов. Фазовое хранение в контейнерах позволяет сохранять рукописи и книги в хорошем состоянии Недостатком такого хранения является 18 дороговизна расходных материалов и дефицит специалистов [Коваленко, 2014]. Но обеззараживание не всегда может предотвратить развитие микромицетов, если в хранилищах библиотек пыльно, воздух остается заражен спорами микроскопических грибов. В этих случаях наряду с дезинфекцией необходимо профилактических соблюдать мероприятий. Для масштабный правильного комплекс проведения мер профилактики и очистки следует знать условия, способствующие развитию грибов-паразитов. Необходимо осуществлять в хранилищах библиотек профилактические меры. Они включают следующее: соблюдать режим хранения; обеспечивать циркуляцию воздуха в хранилище; осматривать водостоки, чтобы вода не скапливалась возле стен; не допускать размещения стеллажей вплотную к наружным стенам; проверять новые поступления рукописей и документов на наличие плесени [Лапшина, 2006]. 19 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1 Объект исследования В качестве объекта исследования были выбраны арабографические рукописные книги из фонда Отдела редких рукописей и книг Научной библиотеки им. Н.И. Лобачевского Казанского федерального университета (ОРРК НБЛ КФУ). Рукописи написаны на бумаге различного производства и имели кожаные переплеты. Описание книг: Книга №1 (рисунок 4 ). Татарская рукопись на арабском языке, вторая половина XIX века, русская бумага, картонно–кожаный переплет с использованием цветной бумаги. Найдена во время археографической экспедиции 1987 года, в деревне Чимбелей Краснооктябрьского района Горьковской области. Книга №2 (рисунок 4 ). Рукопись на арабском языке, бумага среднеазиатская, среднеазиатский кожаный переплет с позолоченным тиснением, переплетена в Бухаре в 1821 году, анализ высказываний пророка Мухаммеда – хадисы, найдена в Буинском районе, деревне Кул-Черкен, экспедицией 1968 года. Книга №3 (рисунок 4 ). Татарская рукопись на арабском и тюркском языках, вторая половина XIX века, русская бумага, картонный переплет с остатками кожи. Содержит тексты на различные темы. На обложках надписи на арабском: «верхняя сторона, нижняя сторона». Имя хозяина – Шахи, сын Хорама. Найдена во время археографической экспедиции 1998 года, в деревне Янга Якуп, Абдуллинского района Оренбургской области. 20 Книга № 1 Книга № 2 Книга № 3 Рисунок 4 - Арабографические рукописные книги XIX века 21 2.2 Методы отбора и анализа проб Пробы отбирали с поверхности переплетов и бумаги с помощью стерильных ватных тампонов. Посев осуществляли в чашки Петри на поверхность агаризованных питательных сред, а так же в жидкую среду. При анализе микроскопических грибов – среду Чапека. Высев производили в не менее чем в четырех повторностях из трех последних разведений. Посев инкубировали при 280С в течении 5-7 суток. Данные выражали в виде средних величин с расчетом среднеквадратичных отклонений. Состав среды Чапека (г/л): дистиллированная вода 1 л NaNO3 2.0 KH2PO4 1.0 MgSO4 * 7H2O 0.5 KCl 0.5 FeSO4 0.01 сахароза 30.0 агар-агар 20.0 Идентификацию микроскопических грибов проводили на основании их морфолого-культуральных свойств, используя следующие определители: «Определитель токсинобразующих микромицетов» [Билай, 1990]; «Определитель патогенных и условно патогенных грибов: справочное издание» [Саттон, 2001] и с использованием планшетного фотометра «iEMSReader» (Финляндя). Световую микроскопию проводили на микроскопах PrimoStar, CarlZeiss. 2.3 Биохимическая характеристика изолятов 2.3.1 Определение целлюлазной активности Наличие целлюлазной активности у выделенных микромицетов определяли качественным методом. Накопительные культуры выращивали в пробирках с селективной средой Гетчинсона. После посева на дно пробирки 22 опускали полоску стерильной фильтровальной бумаги, не содержащей крахмал. Полоска бумаги на 3-5 см выступала над средой. О целлюлазной активности судили по степени гидролиза фильтровальной бумаги. Визуальная оценка изменения субстрата при росте грибов на целлюлозе по 5-бальной системе: 1 балл (+) – обнаружено прорастание отдельных спор; 2 балла (++) – слабый рост мицелия, отсутствие разрушенных участков целлюлозы; 3 балла (+++) – обильный рост мицелия в виде ветвящихся гиф; 4 балла (++++) – рост грибов виден отчетливо, хорошо развитый мицелий обволакивает целлюлозный субстрат; 5 баллов (+++++) – визуально отмечается деградация субстрата. Состав среды Гетчинсона (г/л): дистиллированная вода 1 л K2HPO4 1.0 CaCl2 0.1 MgSO4*7H2O 0.3 NaCl 0.1 FeCl3 0.01 NaNO3 2.5 2.3.2 Определение протеолитической активности Активность внеклеточных протеаз определяли, используя в качестве субстрата казеин и яичный белок. Для этого 14 суточную культуру микромицетов наносили на поверхность агаризованной питательной среды, предварительно протеолитической разлитой в активности чашки Петри. использовали Также для культуральную анализа жидкость, полученную при культивировании микромицетов на жидкой питательной среде. Чашки инкубировали 48 часов при температуре 30°С. По мере роста микромицетов в среду выделялись протеолитические ферменты, приводящие к расщеплению казеина и яичного белка. На месте реакции образовывались 23 зоны просветления. О протеолитической активности выделенных изолятов судили по величине этих зон. Протеолитическую активность рассчитывали по формуле: ПА = d1 - d2, где d1 – диаметр зоны просветления, d2 – диаметр колонии. Cостав среды с казеином (г/л): дистиллированная вода 1 л дрожжевой экстракт 5.0 казеин 5.0 NaCl 5.0 агар-агар 20.0 Состав среды для определения протеолитической активности с яичным белком: 1) Среда Сабуро для патогенных микромицетов дистиллированная вода 1 л глюкоза 40.0 пептон 10.0 агар-агар 20.0 2) Среда Чапека (см.выше) Для анализа протеолитической активности в среду Сабуро не вносили пептон, в среду Чапека NaNO3. Яичный белок вносили в стерильную остуженную до 45º С среду перед разливом в чашки Петри. 2.4 Определение токсичности микромицетов Для оценки токсичности микромицетов использовали штаммы Salmonella tiphimurium TA 100 (из музея доцента кафедры микробиологии Н.С. Карамовой) и Bacillus subtilis (из музея кафедры микробиологии). Исследуемые микромицеты культиировали на жидкой среде Чапека при температуре 30 ºС в стационарных условиях. 14 суточную культуру стерильно центрифугировали и использовали для дальнейшей работы. 24 Токсичность определяли двумя методами: диффузионным (по зонам просветления) и по уменьшению колониеобразующих единиц [Маргулис, с соавт., 2012]. Ход эксперимента: 1) За 12-15 ч. до проведения эксперимента делали пересев культуры тестерных штаммов с косяка в 5 мл LB–бульона для получения «ночной» культуры. 2) 2% LB–агар разливали в чашки Петри. 3) Делали разведения «ночной» культуры в стерильном изотоническом растворе. 4) На агаризованную среду сеяли газоном «ночную» культуру тестерных штаммов, вырезали лунки, в которые заливали культуральную жидкость микромицетов (диффузионный метод). 5) Для второго метода определения токсичности растопленный 0.6% LB – агар разливали стерильно по 3 мл в пробирки и ставили на водяную баню при 45 ˚С. В пробирки с полужидким агаром вносили 0.1 мл бактериальной суспензии тестерных культур нужного разведения и 0.1 мл культуральной жидкости. Раствор перемешивали и наслаивали на нижний 2% LB–агар в чашки Петри. В негативном контроле вместо раствора микромицетов добавляли 0.1 мл среды Чапека. 6) После 24 часов инкубации при 37 ˚С для S. tiphimurium и 30 ˚С для B. subtilis измеряли зоны просветления (диффузионный метод) и подсчитывали число колоний, выросших на чашках Петри в опытном и контрольном вариантах. 7) Для оценки степени токсичности по второму методу использовали критерий «выживаемость» тестерного штамма. Выживаемость = число колоний в опыте 100% число колоний в контроле Опыт проводили в 2–3-х повторностях. 25 Состав Сред (г/л): 1) LB-бульон: дистиллированная вода 1 л триптон 10.0 дрожжевой экстракт 5.0 NaCl 5.0 2) 2% LB-агар: LB-бульон 1л агар 20.0 3) 0,6% LB-агар: LB-бульон 1л агар 6.0 4) Изотонический раствор 0,9 % раствор NaCl (физраствор): дистиллированная вода 0.10 NaCl 0.90 2.5 Определение кислотности среды культивирования Изменение pH среды в процессе культивирования микромицетов определяли с использованием pH метра Testo 206 рН1. 2.6 Статистическая обработка данных Математическую обработку данных проводили в стандартной компьютерной программе «Excel 7.0.». В работе все эксперименты были проведены не менее чем в трех повторностях. Группу данных считали однородной, если среднеквадратическое отклонение σ в ней не превышало 13%. Различие между группами считали достоверным при критерии вероятности Р<0.05. 26 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1 Качественная и количественная характеристика изолятов, выделенных с арабографических рукописей При первичном визуальном осмотре исследуемых рукописных книг нами были отмечены повреждения микроорганизмами и насекомыми. На корешках книг обнаружен белый плотный налет, а на поверхности рукописей небольшие черные точечные колонии. Микробиологическое показало, что при исследование микроскопировании арабографических жидкости с рукописей фрагментами поврежденной бумаги рукописей в некоторых пробах наблюдалось большое количество спор микромицетов. Однако, при последующем посеве не все эти споры оказались способными к прорастанию на агаризованных средах. Используя классические методы микробиологии нам удалось выделить изоляты различных микромицетов, которые по морфологическим признакам были идентифицированы до родовой принадлежности (рисунок 5). Рисунок 5 – Процентное соотношение различных родов микромицетов Наиболее часто встречаемыми являлись представители родов Aspergillus и Penicillium. Представители рода Aspergillus составляли в среднем 42 %, 27 Penicillium - 30 % из всего количества выделенных микромицетов. Оставшиеся 28% пренадлежат представители родов Alternaria (12%) Sporotrichum (12%) и Aureobasidium (4%) (рисунок 6). Следует отметить, что основная масса микромицетов была выделена с книжных обложек и страниц и лишь 1 вид Aspergillus sp. VII был выделен с кожного переплета третьей рукописи. Небольшое видовое разнообразие выделенных микромицетов может быть объяснено использованием в наших экспериментах для выделения микроскопических грибов одной селективной среды Чапека. Так же следует отметить, что не все микромицеты на поверхности рукописей сохраняют свою жизнеспособность. В этом случае для их определения необходимо использовать молекулярные методы, в том числе ПЦР, как об этом сообщают итальянские ученые [Michaelsen et al., 2010]. Таким образом, использование классических микробиологических методов, которые поверхности основаны на выделении микробных изолятов с рукописных книг, позволило нам выявить сообщество микроорганизмов, состоящее главным образом из микромицетов. Выделенные нами виды микроскопических грибов относятся к родам Penicillium, Alternaria, Sporotrichum и др. Следовательно, полученные нами результаты свидетельствуют о том, что разнообразие видов и количество выявляемых колониеобразующих единиц, которые населяют исследуемые рукописи, невелико. Это скорей всего связано с тем, что в настоящее время данные рукописи хранятся в условиях (низкой влажности и температуре), которые подавляют рост микроорганизмов. Многие виды потеряли свою жизнеспособность и представлены некультивируемыми формами. Однако, ухудшение условий хранения (перепады температуры, увеличение влажности, дополнительное загрязнение) могут быть причиной активации этих форм, что в свою очередь может привести к дальнейшей деградации бумаги и переплета. 28 А Б В Г Рисунок 6 – Микромицеты, выделенные с арабографических рукописей: А – Penicillium sp; Б – Aspergillus sp.; В – Sporotrichum sp.; Г – Alternaria sp. 29 3.2 Биохимическая характеристика выделенных микромицетов 3.2.1 Оценка целлюлазной активности изолятов При ненадлежащем хранении и использовании старинные рукописи подвергаются естественному биологическому воздействию. Серьезные повреждения бумаги и кожи происходят не только за счет механического разрастания мицелия микроскопических грибов. В первую очередь такие повреждения материалов связаны с разрушающее воздействием действие ферментов. оказывают На большинство ферменты класса оксидоредуктаз и гидролаз. Поэтому на следующем этапе работы мы определили целлюлазную и протеолитическую активности выделенных нами грибов. Оценку целлюлазной активности выделенных нами микромицетов проводили по интенсивности их роста на фильтровальной бумаге (таблица 1). Для большинства микроскопических грибов первоначально отмечался рост в жидкой, а в дальнейшем – в воздушной фазе. Только Penicillium sp. II, выделенный со страницы 2 книги, и Sporotrichum sp. II, выделенный с обложки 3 книги, оказались неспособными расти на среде с целлюлозой. Максимальная активность отмечалась у Aureobasidium sp. с обложки 2 книги. Данный микромицет не только рос, но и его хорошо развитый мицелий обволакивал целлюлозный субстрат (рисунок 7). Все остальные микромицеты образовывали либо отдельные колонии на поверхности фильтровальной бумаги, либо их мицелий слабо обволакивал бумагу. Незначительная целлюлазная активность микромицетов вероятнее всего связана с тем, что они в основном были выделены с поверхности обложки исследуемых нами книг. 30 1 2 3 4 7 5 6 8 Рисунок 7 – Оценка целлюлазной активности выделенных микромицетов: 1 – Aspergillus sp. I; 2 – Aspergillus sp. II; 3 – Sporotrichum sp. II; 4 – Aspergillussp. III; 5 – Aspergillussp. VII; 6 – Alternariasp. I; 7 – Aspergillus sp. IV; 8 – Aureobasidium sp; 31 Таблица 1 - Оценка целлюлазной активности выделенных микромицетов по интенсивности роста на фильтровальной бумаге № Микромицет Место выделения Рост в баллах 1 Sporotrichum sp.I страница книга 1 + 2 Aspergillus sp. I страница книга 1 ++ 3 Aspergillus sp. II обложка книга 1 ++ 4 Alternaria sp. I обложкакнига1 + 5 Aspergillus sp. III обложка книга 2 +++ 6 Aureobasidium sp. обложка книга 2 ++++ 7 Penicillium sp.I обложка книга 2 + 8 Aspergillus sp. IV страница книга 2 ++ 9 Penicillium sp. II страница книга 2 – 10 Alternaria sp. II обложка книга 2 + 11 Penicillium sp. III обложка книга 3 + 12 Sporotrichum sp. II обложка книга 3 – 13 Aspergillus sp. V страница книга 3 + 14 Penicillium sp. IV страница книга 3 + 15 Aspergillus sp. VI обложка книга 3 + 16 Penicilliumsp. V страница книга 3 + 17 Aspergillus sp. VII переплет книга 3 ++ Примечание: «–» – полное отсутствие роста на среде с целлюлозой; 1 балл (+) – обнаружено прорастание отдельных спор; 2 балла (++) – слабый рост мицелия, отсутствие разрушенных участков целлюлозы; 3 балла (+++) – обильный рост мицелия в виде ветвящихся гиф; 4 балла (++++) – рост грибов виден отчетливо, хорошо развитый мицелий обволакивает целлюлозный субстрат. Для дальнейшей работы были выбраны микромицеты, обладающие высокой целлюлазной активностью. С использованием планшетного фотометра «iEMS-Reader» они были идентифицированы до вида (таблица 2). 32 Таблица 2 - Видовая принадлежность выделенных с арабографических рукописных книг микромицетов № 1 2 3 4 5 6 № изолята 2 3 5 6 8 17 Вид изолята Aspergillus niger I Aspergillus brasiliensis Aspergillus restrictus Aureobasidium pullulans Aspergillus wentii Aspergillus niger II 3.2.2 Оценка протеолитической активности изолятов О повреждающем действии микроорганизмов на кожу можно судить по их способности продуцировать выделяемые во внешнюю среду экзопротеазы. В работе исследовали 2 экзогенные протеазы: щелочную (среда с казеином) и слабокислую (среда с яичным белком). Все выделенные нами микромицеты оказались способными расти на среде с казеином. Однако только 50 % исследуемых микромицетов обладали экзогенной протеазой (таблица 3). Наибольшей протеолитической активностью обладал A. niger II, выделенный с поверхности кожаного переплета (рисунок 8). Не все выделенные нами микромицеты оказались способными расти на среде с яичным белком. Так рост Aureobasidium pullulans полностью отсутствовал на среде Чапека, а рост Aspergillus brasiliensis на среде Сабуро. Это свидетельствует о том, что данные микромицеты не способны использовать яичный белок в качестве источника питания. Активность экзогенной слабокислой протеазы выделенных микромицетов была в среднем в 2 раза ниже по сравнению с экзогенной щелочной (таблица 4). Максимальная протеолитическая слабокислая активность наблюдалась у A. wentii (рисунок 9), в то время как щелочная протеаза у него полностью отсутствовала. 33 Таблица 3 – Оценка протеолитической микромицетов на среде с казеином № Микромицет активности Зона просветления, мм 1 Aspergillus niger 4.5 ± 0.5 2 Aspergillus brasiliensis 3.5 ± 0.5 3 – 5 Aspergillus restrictus G.Sm. BGB Aureobasidium pullulan svarpullulans (deBarry) G.Arnaud BGA Aspergillus wentiiWehmer 6 Aspergillus nigerv.Tiegham BGA 6.0 ± 1.0 4 выделенных – – А Б Рисунок 8 – Протеолитическая активность микромицетов Aspergillus niger I (А) и Aspergillus niger II (Б) на среде с казеином. 34 Таблица 4 – Оценка протеолитической микромицетов на среде с яичным белком № Микромицет активности выделенных Зона просветления, мм Среда Чапека Среда Сабуро 2 ± 0.5 0.8 ± 0.2 1.5 ± 0.5 – 1 ± 0.2 – – 1.5 ± 0.3 1 Aspergillus niger I 2 Aspergillus brasiliensis 3 Aspergillus restrictus 4 Aureobasidium pullulan 5 Aspergillus wentii 2.5 ± 0.1 3.5 ± 0.5 6 Aspergillus niger II 3 ± 0.4 2 ± 0.1 А Б Рисунок 9 – Оценка протеолитической активности Aspergillus wentii , на средах Чапека (А) и Сабуро (Б). 35 Аналогичные данные были получены и для микромицетов Aureobasidium pullulan и Aspergillus restrictus. Следует отметить, что активность протеолитических ферментов свидетельствует о патогенных свойствах микромицетов [Евсенко, Сергеев 2005], которые ведут к развитию серьезных заболеваний у рабочих архива [Матвеева, 2008]. Следовательно, выделенные нами микромицеты обладающие протеолитической активностью могут вызывать аллергические заболевания у сотрудников библиотеки. 3.3 Оценка токсичности микромицетов по отношению к тестерным штаммам Salmonella tiphimurium TA 100 и Bacillus subtilis. Для анализа токсичности выбранных микромицетов были взяты штаммы бактерий различающиеся по строению клеточной стенки S.tiphimurium и B. subtilis. Степень токсичности культуральной жидкости оценивали по критерию «выживаемости» тестерных штаммов. Как видно из рисунка 10, токсическое действие микромицетов A. niger I (1) и A. niger II (6) в отношении выбранных нами культур бактерий достоверно не отличаются между собой. Подавление роста в среднем составляло 67.4±4.3 % и 53.6±0.2 % для A. niger I (1) и A. niger II (6) соответственно. Микромицеты A. brasiliensis (2) и A. restrictus (3) оказались токсичны по отношению к B. subtilis, вызывая подавление роста данной культуры в 1.4 и 1.2 раза больше, чем S.tiphimurium. A. pullulans (4) и A. wentii (5) оказались более токсичны для S.tiphimurium подавляя ее рост 1.5 и 2.0 раза сильнее, чем B. subtilis. Следует отметить, что микромиеты A. wentii (5) и A. niger II (6) подавляли роста S.tiphimurium более чем на 50 %. 36 выживаемость, % А Б 100 80 60 40 20 0 1 2 3 4 5 6 микромицеты Рисунок 10 – Оценка токсического действия микромицетов в отношении S. typhimurium TA100 (А) и B. subtilis (Б): 1 – A. niger I; 2 – A. brasiliensis; 3 – A. restrictus; 4 – A. pullulans; 5 – A. wentii; 6 – A. niger II. 3.4 Оценка изменения кислотности среды при культивировании микромицетов Кроме ферментов, микромицеты способны выделять органические кислоты такие как, лимонная, щавелевая, янтарная, яблочная, койевая и др. Благодаря этим кислотам рН пораженной бумаги чаще всего опускается до 2. А такая высокая кислотность способствует гидролизу целлюлозы и ускоряет распад бумаги [Zotti, et al., 2008]. Поэтому на следующем этапе работы мы определили кислотность среды культивирования выбранных нами микромицетов. Как видно из рисунка 11, на 14 сутки культивирования минимальный рН среды (в среднем 1.2 ± 0.1) наблюдали у микромицетов A. brasiliensis (2) и A. niger II (6). У A. restrictus (3) рН среды культивирования достоверно не изменялся и на протяжении всего эксперимента был равен рН 37 среды Чапека. Снижение рН среды культивирования A. pullulans (4) был незначительным и составлял 5.0±0.3. С изменение рН среды культивирования было связано и появление зон коагуляции при анализе протеолитической активности методом лунок. Как видно из рисунка 12 у A. brasiliensis (2) и A. niger II (6) уже через час после внесения культуральной жидкости отмечались большие зоны коагуляции, в то время как у A. restrictus (3) и A. pullulans (4) они полностью отсутствовали (рисунок 13). У A. niger I (1) и A. wentii (5) наблюдались небольшие зоны коагуляции, что вероятнее всего связано с невысоким содержанием кислот в среде. После 24 часов инкубации у A. pullulans (4) появились небольшие зоны коагуляции в то время как у всех остальных микромицетов данные зоны увеличились в размере (рисунок 13). У A. restrictus (3) зон коагуляции не отмечалось даже на 24 час инкубации. Следовательно, все выбранные нами микромицеты кроме A. restrictus G.Sm. BGB (3), могут представлять опасность для арабографических рукописей так как в процессе прорастания при нарушении режима хранения они могут выделять кислоты и разрушать бумагу. 38 рН 6 5 4 3 2 1 0 1 2 3 4 5 6 микромицеты Рисунок 11– Изменение рН среды Чапека при культивировании микромицетов 14 суток: 1 – A. Niger I; 2 – A. brasiliensis; 3 – A. restrictus; 4 – A. pullulans; 5 – A. wentii; 6 – A. niger II. Начальный рН среды Чапека 6.0 ± 0.5. 39 A. niger I A. brasiliensis A. restrictus A. pullulans A. wentii A. niger II Рисунок 12 – Коагуляция яичного белка через час после внесения культуральной жидкости в лунки. 40 A. niger I A. brasiliensis A. restrictus A. pullulans A. wentii A. niger II Рисунок 13– Коагуляция яичного белка после 24 часов инкубации. 41 ВЫВОДЫ 1) С поверхности арабографических рукописных книг второй половины ХIХ было выделено 17 изолятов, принадлежащих к 5 родам. 42% из выделенных микроскопических грибов принадлежит к роду Aspergillus. 2) Выделенные с поверхности арабографических рукописных книг микромицеты обладали слабовыраженной целлюлазной активностью. Максимальная активность отмечалась у Aureobasidium sp. выделенного с обложки 2 книги. 3) Выделенные микромицеты обладали слабовыраженной протеолитической активностью. Наибольшей протеолитической щелочной активностью обладал A. niger II, выделенный с поверхности кожаного переплета. Максимальная протеолитическая слабокислая активность наблюдалась у A. wentii. 4) Максимальную токсичность по отношению к Bacillus subtilis проявлял A. brasiliensis, а к Salmonella tiphimurium TA 100 – A. wentii и A. niger II. 5) Среди микромицетов обладающих наибольшей целлюлазной активностью, максимальное снижение кислотности среды культивирования наблюдалось у A. brasiliensis и A. niger II. 42 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1) Андреева, К.И. Труды Лаборатории консервации и реставрации документов Санкт-Петербургского филиала Архива РАН./ К. И. Андреевой и Н. П. Копаневой.// Выпуск I. Хранение и реставрация документов: методические рекомендации. [Электронный ресурс]. –2008. – Режим доступа: http://www.ranar.spb.ru/rus/books2/id/8/ – Дата доступа: 20.03.2014. 2) Билай, В.И. Определитель токсинобразующих микромицетов [Текст] / В.И. Билай, З.А. Курбацкая // Киев –, Наукова Думка, 1990 г. – С.236 . 3) Винникова, О.И. Микромицеты воздуха жилых и нежилых помещений [Текст] / : автореф. … доцент / О. И. Винникова; Харьковский Национальный Университет. – Харьков, 2011. – 29 с. 4) Головина, Т.А. Выделение и микрофлоры на документах объединенного идентификация государственного грибной архива Челябинской области [Текст] / Т.А. Головина, О.С. Кузнецова // Челябинский государственный университет – 2008 .- Т.4. – С.54-55. 5) Грефнер, Н.М. Защита архивных документов от плесневых грибов [Текст] / Н.М. Грефнер // Методические рекомендации; научный сотрудник НИС к.б.н. – Санкт–Петербург, 2001. – С.10-15. 6) Евсенко, М.С. К характеристике патогенных свойств дерматофитов [Текст] / М. С. Евсенко, А. Ю. Сергеев // Успехи медицинской микологии. – 2005. – Т.5. – С.51. 7) Коваленко, З.С. Научная реставрация библиотечных документов в национальной библиотеке Беларуси / З.С. Коваленко // [Электронный ресурс]. – – 2012. Режим доступа: http://repository.buk.by:8080/jspui/handle/123456789/1645 Дата доступа : 25.03.2015. 8) Крестьянникова, А.Н. Исследование микробиологического состояния воздуха в библиотечных фондах [Текст] / А.Н. Крестьянникова, 43 А.Л. Немойкина // Национальный исследовательский ТГУ, г. Томск. – 2014. – Т.13 – С.37–41. Куимова, Н.Г. Условно–патогенные грибы как показатель 9) санитарного состояния городской среды [Текст] / Н. Г. Куимова, Л. П. Шумилова // Известия Самарского центра РАН – 2009. – Т.11. – С. 1160-1162. 10) Лаврентьева, Е.В. Микроорганизмы – деструкторы старомонгольских рукописей и ксилографов [Текст]: автореф. дис.… канд.биол.наук/ Лаврентьева Е.В.; – Улан-Батор, 2000. – 152 с. 11) Лапшина, Н.С. Режим хранения документов в библиотеках [Текст] / Н.С. Лапшина// библиотеках. Сборник Обеспечение методических сохранности документов в и практических материалов. – Челябинск, 2006. – С. 21–31. 12) Маргулис, А.Б. Методы генетической токсикологии: Учебнометодическое пособие [Текст] / А.Б. Маргулис, Н.С. Карамова, О.И. Ильинская. – Казань: Казанский университет, 2012. – 36 с. 13) Матвеева, А.Р. Секретируемые протеазы некоторых мицелиальных грибов: выделение, очистка и характеристика физикохимических и функциональных свойств [Текст] : автореф. дис. … канд. биол. наук. / А. Р Матвеева; – Москва, 2008. – 3-5 с. 14) Муратова, Д.А. Микробиологическое исследование бумажного документа [Текст] / Д. А. Муратова Библиотека Белоруси [Электронный ресурс]. – 2012. – Режим доступа : http://repository.buk.by:8080/jspui/handle/123456789/1646 Дата доступа: 20.03.2015 15) Мачулиса, А.Н. Выделение, идентификация и хранение микромицетов и других микроорганизмов [Текст ] / А.Н. Мачулиса; к.б.н. – Спб. статей. Вильнюс: Институт ботаники АН Литвы.- М.: Наука, 1990. –201 с. 16) Нюкша, Ю.П. Биологическое повреждение бумаги и книг [Текст]/ Ю. П. Нюкша; Чл. Уч. Совета БАН и РНБ. –М.: Наука, 1994.-110 с. 44 17) Пехташева, Е.Л. Биодеструкция и биоповреждения материалов. Кто за это в ответе? [Текст] / Е.Л. Пехташева, А.Н. Неверов, Г.Е. Заиков О.В. Стоянов // Вестник технологического института. – 2012 . – Т. 15. – С. 222233. 18) Поповская, Е. О хранении и реставрации рукописей / Е. Поповская // [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.conservatory.ru/files/alm_04_10_popkovskaia.pdf Дата доступа: 28.03.2014. 19) Саттон, Д. Определитель патогенных и условно патогенных грибов [Текст]: [пер. с англ] / Д. Саттон, А. Фотергилл, М. Ринальд. – М.: Мир, 2001. – 486 с. 20) Хоулт, Дж. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т [Текст] / Дж. Хоулт, Н. Криг – М.: Мир, 1997. 21) Amore, А. FEMS Microbiol Lett [Text]/ A. Amore, O. Pepe, V. Ventorino, L. Birolo, C. Giangrande, V. Faraco // FEMS Microbiol Lett. – 2013. – V. 339, 2. – P. 93–101. 22) Borrego, S. Determinationof Indoor Air Quality in Archivesand Biodeterioration of the Documentary Heritage. [Text] / S. Borrego, P. Lavin, I. Perdomo, S. Gómez de Saravia, and P. Guiamet // Laboratory of Preventive Conservation, National Archive of the Republic of Cuba., 2012 – V 38. – P. 1–10. 23) Camassola, М. J Appl Microbiol [Text]/ M. Camassola, A.J. Dillon // J Appl Microbiol. –2007. – V. 103, 6. – P. 216–224. 24) Michaelsen, A. Molecular and microscopical investigation of the microflora inhabiting a deteriorated Italian manuscript dated from the thirteenth century [Text] //, A. Michaelsen, G. Pinar., F. Pinzari // Microb. ecol., –2010 – V. 60. – P. 69-80. 25) Roussel, S. Microbiological evaluation of ten French archives and link to occupational symptoms. [Text] / S. Roussel , G. Reboux , L. Millon , M. Parchas, S. Boudih , F. Skana , M. Delaforge , M. Rakotonirainy S // Rakotonirainy, Indoor Air., –2012 – V. 22, 6 – P. 514–522. 45 26) Skóra, J. Harmful biological agents at museum workposts, [Text] / J. Skóra , K. Zduniak , B. Gutarowska , D. Rembisz // Med Pr., – 2012; V. 63. – P. 153–65. 27) Zielinska-Jankiewicz, К. Ann Agric Environ Med [Text]/ K. Zielinska-Jankiewicz, A. Kozajda , M. Piotrowska , I. Szadkowska-Stanczyk, // Ann Agric Environ Med. – 2008. –V. 15, 1. – P. 71–78. 28) Zotti, M. Int Biodeterior Biodegrad [Text]/ M. Zotti, A. Ferroni, // Int Biodeterior Biodegrad. –2008. – V. 62, 2. P. 186–194. 46
