Ключевые слова: подсолнечник, регенерация, in vitro
advertisement
МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. Вып. 2 (141), 2009 ____________________________________________________________________________________________________ Я.Б. Нескородов, научный сотрудник К.Г. Скрябин, доктор биологических наук Учреждение Российской академии наук Центр «Биоинженерия» РАН 117312, Россия, Москва, пр-т 60-летия Октября, д.7, корп. 1, тел.: +7 499 135 7319, факс: +7 499 135 0571, E-mail: office@biengi.ac.ru; NeskorodovYB@gmail.com ИНДУКЦИЯ МНОЖЕСТВЕННОГО ПОБЕГООБРАЗОВАНИЯ У ЭКСПЛАНТОВ ПОДСОЛНЕЧНИКА (Helianthus annuus L.) В КУЛЬТУРЕ IN VITRO Ключевые слова: подсолнечник, регенерация, in vitro, побегообразование УДК 579.254.2: 581.143.5 Введение. В связи с большой экономической выгодой, подсолнечник (Helianthus annuus L.) возделывается практически во всех земледельческих районах мира. В России ежегодно выращивается около 4 млн. тонн семян и 2 млн. тонн подсолнечного масла, что обеспечивает лидирующие позиции России среди стран-производителей [1]. Интенсивное возделывание этой культуры создаѐт необходимость выведения растений с новыми хозяйственно ценными признаками, способными обеспечить устойчивость к биотическим и абиотическим стрессам. Однако получение подобных генотипов затруднено в связи с узостью генофонда высокомасличного подсолнечника. Это делает проведение селекционной работы с данной культурой сложным процессом, а селекционный материал более уязвимым к болезням, вредителям и неблагоприятным факторам среды. Проблема уменьшения генетического разнообразия исходного селекционного материала может быть частично решена применением методов биотехнологии. К ним относятся культура клеток и тканей растений in vitro, что позволяет проводить селекцию клеток на широкий спектр признаков в более интенсивном режиме. Перспективна также генная инженерия, применение методов которой позволяет создать растения с такими признаками, получение которых методами «классической» селекции либо крайне затруднительно, либо вообще невозможно. Сложным этапом при работе с подсолнечником в культуре in vitro является индукция побегообразования у используемых эксплантов, которые сравнительно легко формируют каллус, однако проблема эффективного перевода ткани из стадии каллусогенеза в стадию органогенеза к настоящему времени ещѐ не решена [2, 3]. В качестве решения данной проблемы можно предложить использование эксплантов, которые изначально способны к прямому органогенезу. В культуре in vitro подсолнечника по способности к прямому органо- и эмбриогенезу наиболее способными являются незрелые зародыши [4, 5], но их использование сопряжено с необходимостью иметь в наличии большое количество цветущих растений, находящихся в определѐнной стадии онтогенеза, что часто трудновыполнимо. В меньшей степени способностью к регенерации обладают семядоли [6] и апикальные меристемы [7]. При использовании эксплантов перечисленных типов было показано влияние на эффективность органогенеза генотипа растения [8, 9], возраста экспланта [10], состава сред и условия культивирования [11]. Ранее нами был оптимизирован процесс получения эксплантов с высоким уровнем органогенеза из зрелых зародышей подсолнечника [4]. В процессе работы была выявлена способность рассеченной апикальной меристемы формировать побеги. Мы предположили, что снятие апикального доминирования методом отсечения апекса основного побега может повысить эффективность регенерации эксплантов. Целью настоящей работы было выявление влияния удаления апикального доминирования основного побега экспланта подсолнечника на способность формирования дополнительных побегов. Материалы и методы. Состав сред и условия культивирования. Растительный материал культивировали при 27 °С (±2 °С) в темноте (проращивание), далее на свету с 16-часовым фотопериодом (16/8 – день/ночь). Для освещения использовали лампы Osram L36/77 FLUORA и F36W/33 Cool White. В состав всех питательных сред входили макро- и микросоли MS [13, пантотеновая кислота [14, фитогормоны и углеводы; рН среды доводили до 5,8 перед автоклавированием. Стерилизацию среды осуществляли в автоклаве при давлении 1,2 атмосферы в течение 15 мин. Растительный материал. В работе использовали семена подсолнечника (Helianthus annuus L.) сорта Скороспелый 87 селекции ВНИИСХ Юго-востока РАСХН (районирован в ВолгоВятском, Центрально-Черноземном, Средневолжском, Нижневолжском, Уралском, ЗападноСибирском и Восточно-Сибирском регионах Российской Федерации) [15]. Семена были любезно предоставлены автором сорта, д-ром с.-х. наук В.Ф. Пимахиным. Стерилизация растительного материала. В качестве стерилизующего агента использовался 30 %-ный раствор коммерческого отбеливателя «Белизна» (ТУ-2382-255-00209645-2002), содержащий в качестве активного вещества гипохлорит натрия. Стерилизацию проводили по отработанной ранее методике [12]. Метод получения эксплантов для регенерации. Стерильные семена помещали в круглодонные колбы, содержащие 80 мл жидкой 10 %-ной среды MS, без витаминов, фитогормонов и сахарозы. Затем их проращивали в течение 48 часов при постоянном помешивании 100 об/мин. У проростков отсекали корни и удаляли верхние 2/3 части семядолей. Полученные фрагменты гипокотиля и остатков семядолей с апексом рассекали вдоль, разделяя апикальную почку на две равные части. Рассеченные фрагменты проростков располагали внутренней частью вверх и рассекали ещѐ раз вдоль через апикальную почку, разделяя еѐ на две равные части, получая, тем самым, из одного проростка четыре экспланта (рис. 1А). Их для регенерации побегов помещали срезом вверх на среду MS, содержащую витамины B5, 30 г/л сахарозы, 1 мг/л БАП [12]. Индукция множественного побегообразования. У группы эксплантов через неделю культивирования с целью индукции множественного побегообразования отсекали апекс побега. Количе- ство новых побегов подсчитывали через неделю после отсечения. Эффективность регенерации подсчитывалась как отношение эксплантов с побегами к общему количеству эксплантов без учета количества побегов на эксплант. Статистическую обработку данных проводили с использованием стандартных методик подсчета отклонения и доверительного интервала с заданным значением достоверности 95 %. Результаты и обсуждение. Использованные нами экспланты представляли собой вертикально рассечѐнные асептические проростки, которые в течение 48 ч культивировали в жидкой питательной среде (рис. 1А). Рисунок 1 – Схема регенерации из экспланта гипокотиля 2-дневного проростка подсолнечника 1 – верхний срез семядоли; 2 – область регенерации побега; 3 – боковой срез семядоли; 4 – срез гипокотиля; 5 – срез корня; 6 – вторичные побеги; 7 – формирование каллуса в области среза корня; 8 – формирование каллуса в области верхнего среза семядоли. A – схематическое изображение проростка подсолнечника через 48 ч культивирования. Серым цветом обозначены две удалѐнные семядоли и корень. Полученные экспланты – белого цвета (на схеме изображены два экспланта из четырѐх получаемых). B – схематическое изображение экспланта; C – эксплант через неделю культивирования на питательной среде; D – отсечение апекса побега; E – вторичная регенерация экспланта через неделю после отсечения апекса основного побега. По нашим наблюдениям, используемый эксплант, с точки зрения способности к органогенезу, не равномерен. Практически во всех случаях, когда формировался побег, это происходило на третий день после рассечения апикальной меристемы (рис. 1B, 2A). Обычно происходило формирование одного побега, который считался основным. Эффективность регенерации составляла 95 % (таблица). В 24 %-ах случаев мы наблюдали одновременное формирование 2-3 побегов (рис. 2B). Всего нами было получено 509 побегов с 400 эксплантов, при этом было использовано 100 стерильных семян. Таблица – Эффективность регенерации растений из эксплантов подсолнечника сорта Скороспелый 87 Вариант Контроль общее Общее Кол-во кол-во экспланэксплан- тов с побетов гами 400 380 Частота регенерации*, % Общее кол-во побегов Кол-во эксплантов с множественными побегами Кол-во побегов с множественными регенерациями**, % Кол-во побегов на эксплантах, шт. 95,0±4,6 509 92 24,2±2,1 1,3±0,1 Опыт 231 222 96,3±3,5 515 174 78,3±4,0 общее * - Кол-во эксплантов с побегами/Общее кол-во эксплантов × 100 % ** - Кол-во эксплантов с множественными побегами/Кол-во эксплантов с побегами ×100 % 2,3±0,2 При отсечении апекса основного побега формирование дополнительных побегов происходило в его основании к концу первой недели (рис. 1Е). Эффективность регенерации новых дополнительных побегов составляла 78 % (таблица). Обычно формировалось от 2 до 3 побегов, но в некоторых случаях регенерация была множественная (более 5 побегов) (рис. 2С). Эффективность регенерации побегов (как и в контрольном варианте) составляла около 96 %. Количество побегов с множественной регенерацией составило 78 %, что более чем в 3 раза превышало данную величину в контроле (24 %). Всего нами было получено 515 побегов от 231 экспланта, при этом было использовано 58 стерильных семян. Таким образом, эффективность размножения составила 1/9 (кол-во семян/количество побегов), что представляет собой высокий коэффициент размножения для такой труднорегенерируемой культуры как подсолнечник. В результате выполненной работы удалось выявить, что применѐнная нами методика в 1,5 раза повышает эффективность побегообразования; от 231-го экспланта с усечѐнным апексом было получено 515 побегов, в то время как от 400 контрольных – 509 побегов (таблица). В конце второй недели культивирования экспланты в области срезов нижней трети семядолей начинали формировать рыхлый каллус серо-белого цвета. Будучи отсечѐнным от экспланта, каллус успешно рос на питательной среде, однако нам не удалось получить побегообразование как из отсечѐнного каллуса, культивируемого отдельно, так и от каллуса, растущего на экспланте. К концу третьей недели культивирования в массе отсеченного каллуса формировались группы клеток тѐмно-зелѐного цвета и плотной консистенции. Побегообразование из данного типа клеток также получено не было. В единичных случаях на каллусе образовывались эмбриоиды (рис. 2D). Рисунок 2 – Экспланты гипокотиля 2-дневных проростков подсолнечника 1 – верхний срез семядоли; 2 – область регенерации побега; 3 – срез гипокотиля; 4 – формирование каллуса в области среза корня; 5 – сформированный побег; 6 – множественная регенерация побегов; 7 – образование органоидов в области отсечѐнного корня. А – типичный вид экспланта подсолнечника через неделю культивирования. Хорошо виден один сформированный побег. B – Эксплант подсолнечника с двумя сформированными побегами через неделю культивирования. C – эксплант через неделю после удаления главного побега. Хорошо видна множественная регенерация. D – каллусообразование. Выводы. Нами был разработан эффективный способ индукции множественного побегообразования у эксплантов подсолнечника, позволяющий получать от 2-х и более побегов на эксплант с частотой 78 %. На настоящий момент – это наиболее эффективный способ регенерации эксплантов подсолнечника. Данный способ индукции регенерации эксплантов подсолнечника может быть использован при генетической трансформации. Работа выполнена при финансовой поддержке ГК 02.518.11.7148 в рамках ФЦНТП и программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология». Список литературы 1. Масложировая промышленность. – 2005. – № 5. – С. 3-4. 2. Зезуль, Т.Г. Регенерация in vitro растений подсолнечника (Helianthus annuus L.) через соматический эмбриогенез / Т.Г. Зезуль, Э.В. Горбатенко, Г.Н. Ралдугина // Генетика. – 1995. – Т. 31. – № 2. – С. 228-233. 3. Ozyigit, I.I. Genotype dependent callus induction and shoot regeneration in sunflower (Helianthus annuus L.) / I.I. Ozyigit, N. Gozukirmizi, B.D. Semiz // African Journal of Biotechnology. – 2007. – Vol. 6 (13). – P. 1498-1502. МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. Вып. 2 (141), 2009 ____________________________________________________________________________________________________ 4. Finer, J.J. Direct somatic embryogenesis and plantlet regeneration from immature embryos of hybrid sunflower (Helianthus annuus) on a high sucrose-containing medium / J.J. Finer // Plant Cell Rep. – 1987. – 6. – Р. 373-374. 5. Freyssinet, M. Fertile plant regeneration from sunflower (Helianthus annuus) immature embryo / M. Freyssinet, G. Freyssinet // Plant Science. – 1988. – 56. – Р. 177-181. 6. Ceriani, M.F. Cotyledons: An expland for routien regeneration of sunflower plants. / M.F. Ceriani, H.E. Hopp, G. Hahne, A.S. Escandon // Plant Cell physiol. – 1992. – 33. – Р. 157-164. 7. Konov, A. Formation of epiphyllous buds in sunflower (Helianthus annuus L.): induction in vitro and cellular origin / A. Konov, R. Bronner, K. Skryabin, G. Hahne // Plant Science. – 1998. – 135. – Р. 77-86. 8. Sarrafi, A. Analysis of cotyledon culture to measure genetic variability for organogenesis parameters in sunflower (Helianthus annuus L.) / A. Sarrafi, A.R. Bolandi, H. Serieys, A. Berville, G. Alibert // Plant Sci., 121: 213-219. 9. Deglene, L. Genetic control of organogenesis in cotyledons of sunflower (Helianthus annuus) / L. Deglene, P. Lesignes, G. Alibert, A. Sarrafi // Plant Cell Tiss. Org. Cult. – 1997. – 48. – Р. 127-130. 10. Schrammeijer, B. Meristem transformation of sunflower via Agrobacterium / B. Schrammeijer, P.C. Sijmons, J.M. Peter van den Elzen, A. Hoekema // Plant Cell Reports. – 1990. – 9. – Р. 55-60. 11. Анотонова, Т.С. Индукция адвентивных побегов в культуре апикальных меристем подсолнечника / Т.С. Анотонова, В.И. Маляровская //Науч.-технич. бюл. ВНИИМК. – 1987. – Вып. 4. (99). – С. 35-40. 12. Нескородов, Я.Б. Метод регенерации in vitro побегов подсолнечника (Helianthus annuus L.) из асептических семян, как эксплантатов для генетической трансформации / Я.Б. Нескородов, Я.В. Мишуткина, А.К. Гапоненко, К.Г. Скрябин // Биотехнология. – 2007. – Т. 6. – С. 27-33. 13. Murashige, T. Revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures / T. Murashige, F. A. Skoog // Plant Physiol. – 1962. – V. 15. – P. 473-476. 14. Gamborg, O. The effects of amino acid and ammonium on the growth of plant cells in suspension cultures. / O. Gamborg // Plant Physiol. – 1970. – V. 45. – P. 372-375. 15. Госкомиссия РФ. Государственный реестр селекционных достижений. http://www. gossort.com.
