Подавление роста бактерий экзометаболитами культуры водоросли Chlorella Плеханов С.Е., Братковская Л.Б., Садчиков А.П.

Подавление роста бактерий
экзометаболитами культуры
водоросли Chlorella
Плеханов С.Е., Братковская Л.Б., Садчиков А.П.
В настоящее время ведется поиск эффективных и безопасных методов снижения уровня бактериального загрязнения водоемов, инактивации бактерий в медицинской практике, – одним из которых является фотодинамическая терапия (ФДТ), заключающаяся в инактивации
бактерий активными формами кислорода (АФК), которые
образуются при комбинированном воздействии искусственно внесенных фотосенсибилизаторов и света спектрального состава, соответствующего полосам поглощения фотосенсибилизаторов. [1,2,3]. Однако, в водоемах
постоянно идут естественные процессы образования
АФК в связи с присутствием в водной среде фотосенсибилизаторов (пигментов), субстратов окисления (органических веществ), и металлов переменной валентности. Эти
процессы, возможно и определяют антагонистические отношения водорослей и бактерий. Развитие культур микроводорослей сопровождается постепенным накоплением
в среде внеклеточных органических веществ (ВОВ) [4]. В
фильтратах водорослей обнаружены белки, липиды, аминокислоты, фенольные соединения, углеводы, гормоны,
антибиотики, органические кислоты и другие соелинения,
некоторые из которых физиологически активны [5].
При выяснении причин гибели бактерий в растущей
культуре водоросли Westella botryoides было высказано
предположение, что свет может инициировать образование
веществ, обладающих антибактериальной активностью из
неактивных предшественников, входящих в состав внеклеточных метаболитов. При этом имели в виду фотохимические дериваты хлорофиллидов в период активного роста и
липиды в фазу отмирания культуры морской водоросли [6].
Несмотря на имеющиеся данные, остаются неясными причины возможного проявления бактерицидного действия
внеклеточных веществ водорослей.
В связи с вышеизложенным в данной работе представлены результаты изучения антибактериальных свойств
компонентов внеклеточных метаболитов культуры водоросли Chlorella pyrenoidosa в лабораторных условиях.
Объекты и методы исследования
В качестве объектов исследования использовали аксеничную культуру водоросли Chlorella pyrenoidosa Chick.
штамм DMMSU-S-39 из коллекции кафедры микробиологии МГУ имени М.В. Ломоносова. Культуры выращивали
накопительным методом в оптимальных для роста условиях
по освещенности и температуре. В качестве тест-объектов
использовали культуры бактерий из той же коллекции:
грамположительные Staphylococcus aureus шт. 205, Bacillus
subtilis и грамотрицательные Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli (выращивали на чашках Петри на МПА).
Численность клеток определяли прямым счетом в камере Горяева Мертвые клетки определяли по окрашиванию метиленовым синим подсчетом 500–1000 клеток.
Ошибка не превышала 5–7%. ВОВ определяли после
сжигания с бихроматом калия колориметрически при 630
нм [7]. Для испытания антибактериальной активности
метаболитов использовали экстракты среды водоросли
C. pyrenoidosa с конца экспоненциальной фазы роста (7
сут.), численность (N) клеток приводили к 500 млн кл./мл.
Ступенчатую экстракцию проводили растворителями различной полярности [8]. Антибактериальную активность
экстрактов определяли методом дисков на чашках Петри
[9]. Тонкослойную хроматографию липидов проводили в
12
Биологические науки
соответствии с [10]. Состав ЖК определяли методом газо-жидкостной хроматографии. [11]. Концентрацию перекисных продуктов определяли по малоновому диальдегиду
(МДА) [12]. Экзогенные ЖК ирименяли в виде солей аммония. Эксперименты проводились в 3–5 повторностях.
Данные представлены с определением ошибки репрезентативности выборочной средней для малых выборок и 5%
уровня значимости [13].
Результаты и обсуждение
Рост культуры C. pyrenoidosa характеризоваля короткой
лаг-фазой, быстро проходила фаза ускорения роста численность клеток в течение экспоненциальной фазы (3–7
сут.) увеличивалась со 170 до 600 млн/мл. По мере роста
численности клеток в культуральной среде накапливались
органические вещества, хотя прямой пропорциональности
численности не наблюдали. К концу наблюдений (14 сут.)
количество ВОВ достигало 600 мг/л. С развитием культуры
происходило увеличение количества мертвых клеток, которое составило к концу опыта 32 %. Содержание липидов в
составе ВОВ по мере роста культуры изменилось с 6 до 45
мг/л, свободных жирных кислот (СЖК) – с 0.24 до 2,4 мг/л
(табл.1).
Экперименты по определению антибактериальных
свойств хлороформ-метанольного экстракта культуральной среды С. pyrenoidosa, находящейся в конце экспоненциальной фазы роста по отношению к бактериям Staphylococcus aureus показали зависимость величины антибактериального эффекта от освещенности. Размер зон угнетения
бактерий возрастал с увеличением освещенности, однако
рост не менялся после достижения освещенности 16–24
Вт/м2.. Параллельно было показано, что при наличии антибактериального эффекта экстрактов, он проявляется при
времени освещения не менее 1 ч, а максимальный эффект
проявляется через 24 ч освещения. Большинство испытанных экстрактов не оказывали угнетающего действия на
грам-отрицательные Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli,
а в темноте не действовали и на грамположительные Staphylococcus aureus и Bacillus subtilis, возможно в связи с малым
содержаниемв средах антибактериальных веществ или, как
следует из данных литературы, определяется спецификой
клеточной оболочки и мембраны бактерий [14]., проявляющих устойчивость к веществам, содержащимся в экстрактах
Очевидно, в таком случае, что высокая антибактериальная
активность гексанового и бензольного экстрактов, связана
именно со СЖК (табл. 2). Хлороформ-метанольные экстракты и в темноте незначительно подавляли рост S. aureus.
Этилацетатный экстракт также вызывал подавление роста
бактерий.
Хроматография на бумаге ацетоновых, спиртовых, хлороформ-метанольных экстракты среды в системе растворителей, применяющейся при работе с растительными
пигментами (гексан–петролейный эфир–ацетон – 10:2,5:2)
позволила обнаружить 2 зоны угнетения роста бактерий
при наложении полосок хроматограмм на поверхность засеянной бактериями S. aureus плотной среды, но только на
свету (через 24 ч). Подавление роста происходило вокруг
участков хроматограмм с Rf 0; 0,93–0,99 и 0,69–0,87 (только
для спиртового экстракта), соответствующих пятнам хлорофиллидов, b-каротина и феофитинов соответственно. Хроматографирование в тонком слое активных по отношению
к бактериям участков бумажных хроматограмм проводили
в системах растворителей для полярных (хлороформ-метанол–вода, 65:25:4) и неполярных (петролейный эфир–этиловый эфир–уксусная кислота – 80:20:1) липидов. Среди соединений со старта бумажных хроматограмм с Rf 0,00 наряду
с веществами пигментной природы содержатся полярные
липиды, не обладающие бактерицидным действием.
Следовательно, антибактериальная активность связана
с веществами пигментной и липидной природы В пятнах с
Rf 0; 0,93–0,99 на бумажных хроматограммах при дальнейшем хроматографировании в тонком слое в системе для неполярных липидов были выявлены стерины (Rf 0,20). СЖК
(Rf 0,29), триацилглицертны (Rf 0,48), эфиры стеринов (Rf
0,79), углеводороды (Rf 0,98). Качественный состав липидов среды представлен в табл. 3. Из данных табл. 3 следует, что накопление в среде водоросли ЖК максимально в
начале кривой роста, затем уменьшается и вновь увеличивается в конце стационарной фазы роста. Относительное
содержание полярных липидов, представленных фосфо- и
гликолипидами, было существенно 17–28%).
Среди неполярных липидов присутствовали диацилглицериды и стерины, СЖК и углеводороды, причем 2 последних группы имели высокое процентное содержание.
Триацилглицерины и эфиры стеринов в средах присутствовали в незначительных количествах (в % от суммы).
Таблица 1. Накопление внеклеточных органических веществ в среде при росте культуры водоросли Chlorella pyrenoidosa Chick. S-39
Время, сут.
N кл., млн. кл/мл
Метвые клетки, %
ВОВ, мг/л
Липиды, мг/л
СЖК, мг/л
2
4
6
8
10
12
14
46,0 +12
284 + 9,0
510 + 15
683 + 22
824,0 + 44
880 + 30
831 + 42
1,0
2,6
7,4
9,4
15,0
24,3
32,4
122 + 16
200 + 31
282 + 28
372 + 16
440 + 29
494 + 10
600 + 34
5,9 + 3,0
18,3 + 4,3
20,4 + 3,8
27,8 + 9,1
46,2 + 7,5
44,8 + 11
45,2 + 12
0,24 +0,03
0,14 +0,1
0,42 +0,09
1,45 + 0,1
1,36 + 0,4
1,79 + 0,9
2,42 + 1,1
Таблица 2. Антибактериальная активность экстрактов среды культуры водоросли C. pyrenoidosa на свету (метод дисков).
Экстракт
10-кратно сконцентрированная среда
Спирт этиловый
Ацетон
Гексан
Бензол
Этилацетат
Хлороформ-метанол
Всероссийский журнал научных публикаций
Размер зон угнетения роста, мм
Bacillus subtilis
Staphilococcus aureus
1,12 + 0,37
3,50 + 0,68
2,00 + 0,21
3,67 + 1,11
3,52 + 0,96
1,00 + 0,78
4,10 + 0,70
1,33 + 0,11
2,67 + 0,78
нет данных
2,42 + 0,98
3,40 + 0,54
1,15 + 0,22
5,45 + 0,51
№ 5(15) 2013
13
Угнетение роста бактерий S. аureus происходило лишь
вокруг пятна СЖК. Близкие результаты были получены для
экстрактов клеток морской водоросли Westella botryoides [6]
и липидных экстрактов сред диатомовой Nitzschia ovalis [7].
Следовательно, основными бактерицидными веществами,
выделяемыми водорослью С. pyrenoidosa следует считать
вещества пигментной природы и СЖК. Этилацетатный
экстракт, содержащий, в основном вещества фенольной
природы, также вызывал подавление роста бактерий. Это
может быть обусловлено как способностью фенольных соединений легко проникать в клетки и подавлять энергетику, так и с их способностью при окислении образовывать
высокотоксичные хиноны [15, 16]. С целью определения,
достаточны ли реальные концентрации СЖК в средах водоросли C. pyrenoidosa для подавления роста бактерий,
были поставлены опыты, в ходе которых методом дисков
определяли антибактериальную активность фракции СЖК
сред, опираясь на их концентрации в разные фазы роста.
В период интенсивного роста (4–6 сут.) содержание СЖК
в средах было невелико и составляло 0,2–0,4 мг/л. Резкое
увеличение содержания СЖК наблюдали в стационарной
фазе: от 12 до 14 сут. содержание СЖК увеличилось с 1,8 до
2,4 мг/л (табл. 1, 3). Судя по данным табл. 5, антибактериальный эффект связан с количеством внеклеточных СЖК
и является светозависимым – зоны инактивации бактерий
на свету значительно превышают по размерам таковые в
темноте. Количество СЖК в среде C. pyrenoidosa достаточно
для проявления антибактериального эффекта уже в начале
кривой роста. Данные свидетельствуют, что СЖК в концентрации 0,42 мг/л способны подавлять рост бактерий.
Очевидно, действе света стимулирует процесс окисления
ЖК и ускоряет образование продуктов их окисления, хотя
известно, что и сами ЖК являются биологическими детергентами и физиологически активны. Содержание продуктов перекисного окисления липидов (судя по накоплению
МДА) возрастало в экспоненциальную фазу роста культуры
и и увеличивалось на протяжении рост а культуры и в стационарную фазу (табл. 4).
Ранее методом газо-жидкостной хроматографии нами
показало, что в средах C. pyrenoidosa содержатся насыщенные и ненасыщенные ЖК (НЖК) с числом углеродных атомов от 14 до 18. Степень ненасыщенности ЖК возрастала
в экспоненциальной фазе роста (2 сут.), затем снижалась и
вновь возрастала при переходе в стационарную фазу роста
(8 сут.) [17].
Одновременно к концу кривой роста наблюдали и увеличение содержания МДА, что свидетельствует об усилении процессов окисления ЖК с образованием гидроперекисей, альдегидов, кетонов, являющихся токсичными. Для
сравнения антибактериальной активности ЖК были испытаны химически чистые препараты арахидоновой (20:4),
линоленовой (18:3), олеиновой (18:1), стеариновой (18:0) и
пальмитиновой (16:0) ЖК по отношению к культуре
S. aureus. Оказалось, что при концентрации 10 мкг/мл
в темноте только НЖК обладали антибактериальной активностью: арахидоновая, линоленовая и линолевая. При
освещении 24 Вт/м2 антибактериальная активность НЖК
существенно возрастала и была тем значительней, чем
больше двойных связей содержала ЖК.
Таким образом, внеклеточное органическое вещество
зеленых микроводорослей обладает антибактериальной активностью, которая определяется наличием в своем составе
антибактериальных веществ – СЖК. Как показано в нашей рабочей группе, антибактериальная активность на свету феофитинов, хлорофиллидов, НЖК связывается и с их
прямым действием: хлорофиллиды вызывали гибель 50%
клеток S. aureus при их концентрации в средах 0,05 мкг/мл,
а НЖК – при 2 мкг/мл [18].
Есть основания полагать, что существенное значение в
антибактериальном действии культуральных сред водоросли C. pyrenoidosa и экстрактов из них может иметь синглетный кислород. Время жизни его невелико (около 2 мкс) и
он реагирует прежде всего с молекулами, вблизи которых
образовался. Такими молекулами являются молекулы хлорофилла и полиненасыщенных кислот липидов, с которыми хлорофилл гидрофобно связан. Образование синглетного или других активных форм кислорода ведет к инициации свободнорадикальных процессов окисления липидов
клеток бактерий и развитию окислительного повреждения.
Наличие НЖК в составе метаболитов, пигментов-сенсибилизаторов, синглетного кислорода, металлов переменной
валентности может инициировать процессы перекисного окисления пригодных субстратов из состава ВОВ с повреждением бактериальных клеток продуктами окисления.
Вышесказанное свидетельствует в пользу тесной связи
антимикробного действия на свету веществ пигментной и
липидной природы. Спектр действия этих соединений сходен: они подавляли на свету рост на плотных средах грамположительных бактерий и не влияли или влияли слабо на
рост грамотрицательных бактерий.
Таблица 3. Липиды (% от суммы) в среде культуры С. pyrenoidosa в процессе роста.
Время, сут.
3
7
11
14
Полярные
липиды
17,0 + 0,8
30,8 + 5,9
27,4 +6,9
28,8+ 4,8.
Диацил-глицерины
+стерины
14,5 + 2,8
17,7 + 5,4
27,0 + 2,7
22,8 + 1,3
СЖК
Триацил-глицерины
9,2 +1,7
14,4 + 6,6
7,7 + 7,9
12,1 + 1,4
9,2 + 2,2
2,8 + 1,9
8,2 + 2,1
Эфиры стеринов
Углево-дороды
16,5 + 5,2
9,7 + 1,8
6,7 + 1,5
33,6 + 7,0
37,1 + 7,0
26,4 + 5,3
22,2 + 5,5
Таблица 4. Накопление в среде C. pyrenoidosa СЖК и МДА. Антибактериальная активность хлороформ-метанольных экстрактов среды C.
pyrenoidosa в процессе роста культуры (тест-объект – S. aureus)
Время, сут.
2
6
8
14
14
СЖК, мг/л
0,24
0,42
1,36
2,42
Размер зон угнетения бактерий, мм
МДА, мМ/л-8
8
11
12
14
на свету
0,75
5,40
6,2 5
9,15
в темноте
0
0,35
0,75
3,75
Биологические науки
Искусственно вносимые источники АФК, очевидно
повысят значение процессов светозависимой окислительной деструкции внутриклеточных структур бактерий [14],
которая будет происходить одновременно с прямой инактивацией бактерий функционально активными экзометаболитами водорослей. Полученные данные свидетельствуют о значении внеклеточных метаболитов в регуляции
взаимоотношений в альгобактериальных сообществах при
совместном культивировании или в естественных условиях.
Список использованных источников
1. Wainwright M. Photodynamic antimicrobial chemotherapy
(PACT). // J. Antimicrob. Chemother. 1998. V. 42. P. 13–28.
2. Jori G., Brown S.B. Photosensitized inactivation of
microorganisms. // Photochem.Photobiol.Sci. 2004. V. 3. P.
403–405.
3. Hamblin MR, Hasan T. Photodynamic therapy: a new
antimicrobial approach to infectious disease? // Photochem
Photobiol Sci. 2004. V. 3. P. 436–450.
4. Плеханов С.Е., Максимова И.В. Функциональное состояние
культур хлорококковых водорослей и накопление внеклеточных органических веществ // Физиол. раст. 1996. Т. 43, № 1.
С. 142–149.
5. Сиренко Л.А., Козицкая В.Н. Биологически активные
вещества водорослей и качество воды. Киев: Наукова думка,
1988. 256 с.
6. Максимова И.В., Сидорова О.А. Светозависимый
антибактериаль­ный эффект водорослей и его экологическое
значение // Гидробиол. ж. 1986. Т. 22, № 6. С. 3–11.
7. Максимова И.В., Малаховская О.О., Прядильщикова Е.Г.
Антибактериальная активность диатомовых водорослей. I.
Липиды Nitrzschia ovalis и их антибактериальная активность
.// Физиол. раст. 1984. Т. 31, В. 5. С. 944–950
8. Тамбиев А.Х., Шелястина Н.Н., Болдырева Л.С. Изучение
биологической активности экзометаболитов одноклеточных
морских водорослей // Физиол. раст. 1981. Т. 28, № 3. С.
31–35.
9. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках. М.: Высшая
школа, 1979. 455 с.
10. Кейтс М. Техника липидологии. М.: Мир, 1975. 324 с.
11. Юськович А.К. Экстракция неэтерифицированных жирных
кислот из плазмы крови //Лаб. дело. 1985, № 8. С. 488–489.
12. Ланкин В.В., Гуревич С.М., Бурлакова Е.Б. Изучение аскорбат-зависимого переокисления липидов тканей с помощью
теста с 2-тиобарбитуровой кислотой / Биоантиокислители.
М.: Наука. 1975. С. 73–78.
13. Максимов В.Н. Многофакторный эксперимент в биологии.
М.: МГУ, 1980. 279 с.
14. Страховская М.Г. Фотодинамическая инактивация микроорганизмов: фундаментальные и прикладные аспекты// Автореф.
дис… докт. биол. наук. 2010. М.: МГУ, 49 с.
15. Стом Д.И., Бобовская Л.П., Тимофеева С.С. Влияние фенолов
и продуктов их окисления на водные растения и содержание
в них сульфгидрильных групп // ДАН СССР. 1974. Т. 216, № 3.
С. 698–701.
16. Плеханов С.Е. Первичные функциональные реакции пресноводных зеленых водорослей на химическое загрязнение.
// Автореф. дис… докт. биол. наук. 1999. М.: МГУ. 50с.
17. Максимова И.В., Плеханов С.Е., Светлова Е.Н. Жирные
кислоты культуры водорослей Westella botryoides // Известия
РАН. Сер. биол. 1995, № 6. С. 669–673.
18. Сидорова О.А., Максимова И.В. Причины антибактериальной
активности хлорофиллидов при их освещении // Вестник
Моск. ун-та. Сер. 16. Биол. 1989, № 3. С. 31–35.
Всероссийский журнал научных публикаций
№ 5(15) 2013
15