На правах рукописи КАЛАШНИКОВА Елена Анатольевна

На правах рукописи КАЛАШНИКОВА Елена Анатольевна КЛЕТОЧНАЯ СЕЛЕКЦИЯ РАСТЕНИИ НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ГРИБНЫМ БОЛЕЗНЯМ Специальность 03.00.23—биотехнология АВТОРЕФЕВ\Т диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва 2003 Работа выполнена на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии Московской сельскохозяйственной академии им. К А. Тимирязева и в Институте физиологии растений Российской Академии наук им К А. Тимирязева Научный консультант—доктор биологических наук, академик РАСХН В.С. Шевелута. Официальные оппоненты доктор биологических наук А.В. Поляков, доктор биологических наук, профессор А.М. Носов, доктор биологических наук И.В. Голденкова. Ведущее учреждение — ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии Защитадиссертационного диссертации состоится г в/^ часов на заседании советаЯ& Д 220октября 043 10 2003 при Московской сельскохозяйственной академии имени К А Тимирязева по адресу 127550, Москва И-550, ул Тимирязевская, 49. Ученый совет МСХА С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ МСХА Автореферат разостан ' Ученый секретарь диссертационного совета— кандидат биологических наук ^-— / /,^/ / Г.И. Карлов ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Создание форм, сортов и гибридов растений, устойчивых к биотическим факторам является одним из важных направлений селекции. Это обусловлено большими потерями урожая сельскохозяйственных растений, вызванными поражением их грибными, бактериальными и вирусными болезнями и повреждением вредителями. Например, в середине 70-х годов XX века появление нового биотипа бурой ржавчины пшеницы привело к потере устойчивости популярных в то время на Северном Кавказе сортов Аврора и Кавказ; в конце 70-х годов наблюдалось массовое поражение подсолнечника белой и серой гнилями; вспышка фузариоза колоса пшеницы в 80-е годы снизила ее урожайность на 40-45%. Данную проблему трудно решить, используя только традиционные способы защиты растений и посевов: агротехнические, химические и биологические, так как ни один из них в отдельности не обладает достаточной эффективностью. Радикальным средством защиты растений от фитопатогенов является селекция, создание комплексно устойчивых сельскохозяйственных культур, и прежде всего, с использованием отдаленной гибридизации. Этим методом созданы многие ценные формы, сорта и гибриды сельскохозяйственных растений. Однако продолжительность такой селекции достигает 15-20 и более лет, а степень устойчивости растений к вредным организмам является недостаточной и далеко не всегда отвечает требованиям производства. Одним из новых, перспективных путей повышения эффективности селекционного процесса является использование современных методов биотехнологии, позволяющих расширить спектр генетического разнообразия (сомаклональная вариабельность, соматическая гибридизация, индуцированный мутагенез, генетическая инженерия) и сократить сроки проведения селекции. Значительное место в решении этих задач занимает клеточная селекция, основанная на отборе клеточных популяций, устойчивых к селективному фактору, и регенерации из них целых растений. В настоящее время в нашей стране и в мире достигнуты значительные результаты по клеточной селекции: созданы линии картофеля, устойчивые к фитофторозу; томатов - к альтернариозу; риса - к пирикуляриозу; люцерны и льна - к фузариозу; клевера - к склеротинии и др. Как правило, в качестве селективного фактора используются токсины белковой и небелковой природы, выделенные из патогенных грибов. Устойчивость растений-регенерантов, полученных в процессе клеточной селекции, не всегда коррелирует с устойчивостью цимо разрабатывать растений в условиях in vivo. В свяли, с. ттим ЦНБ МСХА фонАнаучнЬй литературы нетрадиционные подходы, обеспечивающие повышение устойчивости растений к фитопатогенам Начиная с первых работ по культивированию раститетьных клеток, тканей и органов растений в условиях in vitro особый интерес у исследователи вызывал вопрос о гом, какие изменения могут происходить в изолированных клетках, растущих на искусственных питатечьных средах и причины их вызывающие Важной проблемой в исстедованиях по ктеточной еетекшш на устойчивость к биотическим факторам явгяется выявление механизмов адаптации каллусных и суспензионных клеток к действию стрессового фактора, обустовлешшх изменениями на генетическом уровне, в гормональном балансе и метаботизче вторичных соединений ктеток, подвергшихся стрессовым воздействиям Изучению тгой проблемы и посвящена настоящая диссертация Цель и задачи нсси-довапия. Целью данной работы яв шется усовершенствование и разработка методов и технологий клеточной сетекшш пшеницы, моркови и карюфечя in vitro на устойчивость к фитопатогенным грибам Septoria nodorum Alternana radicina Rhizoctoma solani, d также выяснение механизмов, обеспечивающих устойчивость клеток кхттусных и суспензионных кучьтур к действию экзометаболитов исследуемых патогенов В соответствии с поставленной цетью нами решались следующие основные задачи 1 разработка методов клеточной селекции растений т vitro путем культивирования клеток каллусных н суспензионных кутьтур на питательных сепективных средах оптимизация способов потучения кутьтурального фильтрата патогенов, vc-ювий проведения клеточной сетекции и состава питате-1ьных сред, обеспечивающих получение растений-регенерантов, устойчивых к грибным патогенам, 2 исследование изменений в гормональном статусе клеточных тиний и растений-регенерантов, прошедших сеаекцию in vitro на сспективных средах с использованием экзометаботитов патогенов, 3 опредетение участия фенольных соединений в адаптации клеток каллусных и с> спензионных культур к действию стресс-фактора, 4 оценка на генетическом уровне (RAPD метод) каллусных клеток, ку тьтивируемых в стандартных и стрессовых устовиях, а также растений-регенератов, полученных в результате клеточной сетекции и от1ичающихся повышенной устойчивостью к грибным патогенам Научная новизна работы. Впервые разработаны и предложены методы клеточной л такневой сетекшш in v.tro, позволяющие получать калтусные тении и растения пшеницы, моркови и картофеля, обладающие повышенной устойчивостью к фитопатогенам Septona nodorum, Alternaria radicina, Rhizoctonia solani. Предложенные методы основаны на, культивировании каллусных или суспензионных клеточных культур на питательных средах, содержащих культуралышй фильтрат (КФ) патогена в течение 8-10 пассажей. Установлена зависимость фитотоксичности экзометаболитов возбудителей болезней в условиях in vitro от состава питательной среды. Показана целесообразность использования в качестве селективного фактора КФ патогена, полученного при выращивании изолятов грибов в течение 30-ти дней в жидкой питательной среде Чапека. В этих условиях фитотоксичность КФ в 5-7 раз превышает этот показатель при культивировании фитопатогенов на среде Мурасига и Скуга. Экспериментально установлено, что культуральный фильтрат патогенов (Septoria nodorum, Alternaria radicina, Rhizoctonia solani) в концентрациях 10-20% стимулирует рост интактных растений, а также клеток каллусных и суспензионных культур (пшеница, морковь, картофель). Более высокие концентрации экзометаболитов оказывают ингабирующее действие на указанные объекты. . Впервые разработаны индивидуальные схемы селекции in vitro для пшеницы, моркови и картофеля и подобраны оптимальные концентрации КФ патогена. Установлено, что для каллусной ткани пшеницы целесообразно использовать 20%-ый КФ Septoria nodorum; для суспензионной культуры моркови - 30-50%-ый КФ Alternaria radicina; для каллусной и суспензионной культур картофеля - 30-40%ый КФ Rhizoctonia solani. Впервые, в результате клеточной селекции получены устойчивые клеточные линии и растения-регенеранты, превышающие устойчивость исходных форм к действию изучаемых патогенов на 10-35%, а для отдельных генотипов до 50%. Выявлены изменения в гормональном статусе клеточных линий и растений-регенерантов моркови и картофеля, полученных в результате селекции к экзометаболитам патогенов. Определены различия в содержании гормонов в суспензионной культуре, длительно культивируемой в стандартных и стрессовых условиях. Установлено, что адаптация клеток к стрессовому фактору сопровождается повышением уровня цитокининов и ИУК. У растений-регенерантов моркови, полученных в результате клеточной селекции, отмечено значительное повышение содержания ауксинов, гиббереллинов и, особенно, цитокининов, по сравнению с контрольным вариантом. Изучена зависимость способности клеток суспензионных культур к синтезу фенольных соединений от генотипа, времени и условий их культивирования in vitro. Доказано участие фенольных соединений в адаптации клеток к действию стресс-фактора. Более высокое их накопление характерно для устойчивых к экзометаболитам клеточных культур, по сравнению с неустойчивыми Значите чьная роль в этом процессе принадлежит фенольному полимеру ЛИГНИНУ, ограничивающему проникновение кутьтурального фичьтрата патогена в клетки за счет чигнификации клеточной стенки В растенияхрегенерантах выявлено не только повышение содержания фенольных соединений, но и изменение их качественного состава Установлены различия в нуклеотичных последовательностях ДНК {RAPD методом) в клеточных культурах, кучьтивируемых на сечективных и стандартных средах Для устойчивых каллусных культур и растений-регенерантов, полученных в результате клеточной селекции, RAPD спектры ДНК отчичались отсутствием или присутствием новых фра1-ментов размером от 330 п н до 1200 п и, которые не были характерны дчя RAPD спектров ДНК контрочьного варианта Практическая значимость работы. Предлагаемые в работе схемы и методы клеточной сечекнии, позволяют получать растения-регенеранты пшеницы, моркови и картофечя, устойчивые к фитопатогенам Septoria nodorum ilternaria radwina Rhizoctoma io!am соответственно Такие растения vtoryr быть испопьзованы в традиционной сечекции и счужить основой для создания новых сортов и гибридов, обладающих повышенной устойчивостью к грибным бочезням Полученные новые данные об участии -эндогенных гормонов и среночышх соединений в адаптации кчеток к стрессовым условиям являются теоретической основой дчя более полной расшифровки механизмов устойчивости клеток к действию экзометаболитов опасных патогенов Речутьтаты исследований чегчи в основу раздеча «Кчеточная и тканевая биотехнология в сечекции и растениеводстве» учебного пособия и 2-х изданий учебника «Сечьскохозяйственная биотехнология» (1998, 2003), изданного колчективом авторов под редакцией академика РАСХН В С Шевепехи Обоснованность и достоверность нлучных положений и выводов обеспечивается анализом обширного экспериментального материала, полученного в течение 10 лет с испоаьэованием существующих современных и разработанных нами методик и статистической обработкой резучьтатов исследований с оценкой их точности и достоверности Личный вклад автора. Постановка проблемы, целей и задач исследований, разработка программы и новых методов исследований, обработка, анализ и обобщение потученных результатов выполнены автором Экспериментальные работы проведены автором и частично аспирантами по о. его руководством Апробация работы. Основные результаты экспериментальной работы по диссертации, выводы и предложения докладывались на симпозиуме в Вашингтоне « In vitro in Biology» (1996, 1997), на Международной конференции «Молекулярная генетика и биотехнология» ( Минск, 1998), на I и II Международной конференции «Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 1996, 2000), на V и VI Международной конференции «Регуляторы роста и развития растений» (Москва, 1997, 2001), на VII и VIII Международной конференции «Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда» (Москва, 1997, Саратов, 2003), на III Международной конференции, посвященной памяти Б.В.Квасникова (Москва, 2003), на ежегодных научных конференциях МСХА (Москва, 2000, 2001, 2002), а также на заседании кафедры сельскохозяйственной биотехнологии МСХА им К. А. Тимирязева. Публикации. Основные результаты исследований по диссертации опубликованы в 48 работах, в том числе в соответствующих главах учебного пособия и в двух учебниках для вузов «Сельскохозяйственная биотехнология» под грифом Министерства образования РФ. Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения и 8 глав: обзор литературы, объекты и методы исследований, результаты и их обсуждение (6 глав), а также выводов и списка цитируемой литературы. Материалы диссертации изложены на 270 страницах машинописного текста, содержат 55 таблиц, 55 рисунков. Библиография включает 280 источников, из которых 75 зарубежной литературы. Г л а в а 1. Клеточная селекция и другие проблемы современной биотехнологии Развитие современной молекулярной биологии и генетики, методов культивирования растительных, животных клеток и микроорганизмов в условиях in vitro, технологий рекомбинантных ДНК, открыло широкие возможности для их применения в науке и производстве. Главные направления современной биотехнологии генетическая и клеточная инженерия, получившие интенсивное развитие в 80-е годы прошлого столетия, широко используются в настоящее время во многих странах мира, в том числе и в России. Лидирующее место в этой области занимают научные учреждения США, Англии, Германии, Франции, Японии, Нидерландов, Италии. В последние годы наблюдается интенсивное развитие биотехнологических исследований в Китае, Индии и ряде других стран. Основные задачи современной биотехнологии в области сечьского хозяйства - создание генетически модифицированных объектов (растений, животных и микроорганизмов) с заранее заданными признаками и свойствами, создание высокоэффективных штаммов бактериальных препаратов, с повышенной активностью нитратредуктазы и биологического связывания атмосферного азота, уменьшение потерь органического вещества за счет контроля процессов нитрификации и денитрификации, получение регуляторов роста растений и биопрепаратов, защищающих их от болезней и вредителей, разработка приемов, позволяющих ограничить отрицательное антропогенное воздействие на биосферу в результате интенсификаиии сельского хозяйства и промышленности Современная биотехнология охватывает широкий круг методов, отраслей, объектов производства и задач, объединенных в несколько крупнейших блоков и направлений Среди них на первое место в XXI веке в стратегическом плане выходит генетическая инженерия, главной целью которой является создание трансгенных растений (Шевелуха, 2000) Для успешного решения этой приоритетной задачи необходимо преодолеть отставание в идентификации и клонировании генов, созданию их банков, расшифровке механизмов полигенной детерминации признаков и свойств био югичесчлч объектов, созданию надежных векторных систем и обеспечению высокой устойчивой экспрессии генов Уже сегодня во многих тбораториях мира с помощью методов гене-ической ин-кенерии соиаггы принципиально новые трансгенные растения, животные и микроорганизмы, используемые в коммерческих целях Созданы устойчивые формы сои и рапса к гербицидам, хлопчатника и кчкурузы - к насекомым, картофеля - к колорадскому жуку и фитофторозу 11осевные площади, занятые под трансгенными сортами и гибридами се гьскохозяиственных растении, достигают в мире уже 58 5 млн ia, которые за последние годы особенно резко возрасти Более широкое практическое применение в настоящее время получило второе важное направление современной биотехнологии клеточная инженерия, основанная на тотипотенстности клеток, способности их регенерировать целое растение, а также синтезировать важнейшие соединения вторичного метаболизма Работы в этом направлении носят многоплановый характер и позволяют размножать и сохранять ценные, шкарственные и исчезающие растения (клепальное микроразмножение), ускорять селекционный процесс (клеточная селекция), получать неполовым путем гибриды (соматическая гибридизация), а также сохранять неполноценные зародыши (культура изолированных зародышей) и ценные клеточные популяции (криоконсервадия). В клеточной биотехнологии также существуют острые научные проблемы, решение которых позволит значительно повысить ее эффективность. Главные трудности клеточной инженерии недостаточно высокая частота регенерации клеток и нарушение нормального онтогенеза организмов; узкий спектр сомаклональной вариабельности; слабая экспрессия генов, контролирующих важнейшие хозяйственно-ценные признаки, а также не высокий выход веществ вторичного синтеза. Несмотря на трудности, в этом направлении достигнуты значительные результаты, которые нашли свое применение в селекционном процессе, производстве и промышленности. Большое число работ проведено на пшенице, ячмене, рисе, сорго, картофеле, томатах, люцерне и других сельскохозяйственных культурах. Получены растения пшеницы, риса, картофеля, устойчивые к NaCl или Na2SO4 ; растения моркови, способные синтезировать в 20 раз больше метионина, в 30 раз - триптофана, в 5 раз - лизина; растения картофеля, устойчивые к кольцевой гнили. Методом гаплопродюсера созданы первые два сорта ячменя Исток и Одесский 115, отличающиеся повышенной продуктивностью и устойчивостью к засухе и болезням (Новолоцкий, 1986). В Госреестр РФ включены (1993-1994 гг.) сорта ярового ячменя Биос 1, Рамос и Эльф, полученные с участием в скрещивании дигаплоидных линий (Неттевич, 1986). Таким образом, два важнейших направления биотехнологии: генетическая и клеточная инженерия составляют основу нынешних и будущих приоритетов в биотехнологии. Закономерное развитие этого процесса наряду с другими мерами, обеспечит решение стратегических задач России, многих государств мира и всей цивилизации экологическую безопасность для людей; защиту человека и человечества от болезней; продовольственную безопасность государств; устойчивое экономическое развитие всех стран мира (Шевелуха, 2000, Скрябин, 2003). Глава 2. Объекты и методы исследований. Объекты исследований. Объектом исследования служили: яровая мягкая пшеница, морковь и картофель. Исследования с яровой мягкой пшеницей проводили на 8 генотипах, обладающих различной устойчивостью к Septoria nodorum Berk. К устойчивой группе относятся - WW-15370, Gaterin, 81S-8, 91S-10; среднеустойчивой - Московская 35, Энита; неустойчивой - Саратовская 29, Fortuna. Семена, всех изучаемых генотипов, предоставлены сотрудниками кафедры селекции и семеноводства полевых культур МСХА им К А Тимирязева Эксперименты с морковью проводили на 6 генотипах, обтадающих различной полевой устойчивостью к грибу Altemana radicma M, Dr at Е К среднеустойчивой группе относятся - тинии 906, 805, неустойчивой - сорт Rondo, линии 225П 6700, 1268 Семена всех изучаемых генотипов предоставлены сотрудниками таборатории сетекции и семеноводства овощных культур Всесоюзного научно-исстедоватетьского института овощеводства Исследования с картофелем проводили на 4 генотипах, обладающих различной устойчивостью к патогену Rhizoctoma solam Kuhn Удача, Невский, Жуковский ранний, Дезире Пробирочные растения предоставлены сотрудниками Научно-исследоватетьского института картофетъного хозяйства Методы исследований Лабораторные исследования по культуре изолированных клеток, тканей и органов растений проводили в соответствии с методическими указаниями разработанными Р Г Бутенко (1964) и автором изложенных в ибораторно-практических занятиях по сельскохозяйственной биотехно тощи (1496) В работе исгкль-ювали стандартную питатечыгую среду Мурасига и Скуга, содержащею разшчные вещества цитокининовой и а\кс«шовой природы Дчитечьность культивирования калт\сных кутьтур составляла 28 дней, а дтя суспензии - 14 дней Ку1ьт\ральный фильтрат (КФ) патогенов (Septona nodorum Altemana radicina Rhizoctoma solani) потучали путем выращивания изолятов грибов в жидкой питатечьной среде Мурасига и Скуга, а также Чапека в копбах объемом 300 мт на качалке со скоростью вращения 100 об/мин В каждую колбу вносили иноку ном содержащий 108 шт конидий гриба Кутьтуральный фитьтрат получали путем фильтрования суспензии гриба через фильтровальную бумагу с последующим автоклавированием Токсичность КФ определяли на 9, 14, 19, 23, 30-й день с момента выращивания патогенов в питате ,ьнои среде по прорастанию семян (пшеница, морковь) или по росту пробирочных растении (картофель) Селекцию in vitro проводили на каллусной культуре дтя пшеницы, на суспензионной культуре - для моркови, а также на катусной и суспензионной кутыурах - для картофеля В качестве селективного фактора использовали КФ патогена, который добавляли в питатечьную среду в концентрациях 10 - 50% от конечного объема питате чьной среды В работе применены различные схемы селекции в зависимости от объекта исследования Для характеристики роста и физиологического состояния калиевых и суспензионных культур использовали сырую массу клеток, определяли жизнеспособность, степень агрегированное™ культур, а также ростовой индекс. После селекции, каллусную ткань переносили на питательные среды для регенерации, а суспензионную культуру платировали в агар по методике, изложенной в методических указаниях «Лабораторнопрактические занятия по сельскохозяйственной биотехнологии» (1996) с целью получения микрокаллуса и растений-регенерантов. Оценку растений-регенерантов на устойчивость к исследуемым фитопатогенам осуществляли в лабораторных условиях путем культивирования растений на питательных средах, содержащих КФ патогенов в концентрации 95-100%. Эндогенные гормоны определяли в пробах суспензионных культур, культивируемых в стандартных и стрессовых условиях, на I, IV и VIII пассажах и растениях-регенерантах. Содержание ндолилуксусной кислоты (ИУК), абсцизовой кислоты (АБК), цитокининов (ЦК) (сумма зеатина), определяли с помощью ВЭЖХ и ИФА, а гибберелины (ГК3) биотестированием по методу Франкленда и Уоринга (FranHand, Wareing, 1960). Опыты проводили в двух биологических (каждая состояла из 30 растений-регенерантов) и двух химических повторностях. Фенопьные соединения определяли в каллусных и суспензионных культурах и растениях-регенерантах. Материал экстрагировали горячим 96%-ным этанолом. В этанольных экстрактах определяли содержание суммы растворимых фенольных соединений спектрофотометрическим методом (поглощение при 725 нм) с реактивом Фолина-Дениса (Запрометов, 1971). Калибровочную кривую строили по (п)оксибензойной кислоте. Хроматография. Для разделения полифенолов использовали хроматографию в тонком слое целлюлозы (Ferak, толщина слоя 0,25 мм) в системе н-бутанол - уксусная кислота - бутанол (40:12:28 по объему). Идентификацию выделенных соединений проводили на основании их флюоресценции в ультрафиолетовом свете, а также по качественной реакции с 1%-ным водным раствором железа и красной кровяной соли (Запрометов, 1985). Изучение локализации лигнина в клетках проводили с использованием реакции с флороглюцином (Стрекова, Субботина, Загоскина, Запрометов, 1980). Препараты просматривали на световом микроскопе Ergavall (Германия) с фотоприставкой. RAPD анализ каллуспой ткани и растений-регенерантов. Выделение ДНК из каллусной ткани и растений-регенерантов, а также исходного сорта проводили по методике Edwards et al. (1991). Амплификацию ДНК проводили по стандартной методике. Полимеразную цепную реакцию проводили в амплификаторе «Регкеп Emler» (США) для проведения реакции использовали наборы реактивов «Promega» (США) Для выявления полиморфизма использовали 9 стандартных праймеров Ранее они использовались дтя выявтения межсортового и внутрисортового полиморфизма у ячменя и твердой пшеницы Г л а в а 3 . Каллусогенез и морфогенез в культуре in vitro. Одной из важных и i. ложных проблем современной биологии является регенерация целого растения из изолированной клетки, обладающей свойством тотипотентности (реализация нормального морфогенеза) В ее основе лежат процессы морфогенеза, показатели которого опредетяются темпом и ориентацией к 1еточных делений, блокированием клеточного цикла, ростом клеток и их дифференциацией Процессы морфогенеза индуцируются изменением в экспрессии генов и закреп тением этой эпигенетической изменчивости клонированием перепрограммированной инициальной клетки (Б\*тенко 1994.) Ценность клеточных технологий, в первою очередь, опредетяется возможностью восстановления детого растения Регенерация побегов, корней и других органов в культуре in vjro является необходимым и важным условием успешного проведения разнообразных клеточных и генноинженерных экспериментов 3 1. Пшеница Клеточная и тканевая селемшя растений базируется на культивировании в стрессовых условиях in vitro каллусных и суспензионных клеток Однако клетки, прошедшие цикл селекции in vitro, как правило, частично или полностью теряют способность к морфогенезу Поэтому изучение влияния генотипа, состояния первичного экспланта и гормонального состава питательной среды на процесс калчусогенеза и морфогенеза, является первостепенной задачей при проведении работ по клеточной селекции Для пшеницы эти работы являются особенно актуальными, что объясняется большой зависимостью регенерационного потенциала ее клеток и тканей от генотипа и продолжительности их культивирования т vitro Особенности ка.п\согенеза и морфогенеза рапичных генотипов Зрелые и незрелые зародыши 8 исследуемых генотипов пшеницы культивировали на модифицированной питательной среде Мурасига и Скуга, содержащей 2 4-Д в концентрации 2 мг'л Эта среда была выбрана в качестве базовой, универсальность которой экспериментально доказана различными авторами дтя получения каллусной ткани из зародышей ряда злаковых культур (Иванов, 2001) Наши исследования показали, что под влиянием 2,4-Д клетки зрелого и незрелого зародышей неорганизованно делятся, образуя каллусную ткань, состоящую из рыхлых, оводненных и более плотных, структурированных участков с выраженными меристематическими очагами. Наибольшей способностью к каллусогенезу обладали генотипы WW-1S370, Gaterin, 81S, Энита, Московская 35, Саратовская 29, для которых характерно формирование каллусной ткани в 28-32% случаев, в то время как для генотипов 91S и Fortuna этот показатель не превышал 18-20%. Установлено, что формирование морфогенного каллуса происходило с разной интенсивностью и также зависело от генотипа исходного растения. Выявлено, что Gaterin и 91S обладали низким морфогенетическим потенциалом (6% и 8,3% соответственно), в то время как для остальных генотипов этот показатель находился в пределах 11,6-20%. Таким образом, генотипическая зависимость процессов каллусогенеза и морфогенеза варьирует в пределах от 6 до 32 %, что необходимо учитывать при подборе исходных форм в работах по клеточной селекции с этой культурой. Каллусогенез и морфогенез различных первичных эксппантов. Зрелые зародыши. Изучено влияние различных концентраций 2,4-Д (1-5 мг/л). Исследования позволили выявить ряд закономерностей, которые проявлялись в самом процессе формирования каллусной ткани. Как правило, каллусогенез начинался с дедифференцировки нижних клеточных слоев зародыша, которые находились в непосредственном контакте с питательной средой. Спустя 14 дней эти клетки полностью дедифференцировались и во всех исследуемых вариантах образовывалась рыхлая, оводненная каллусная ткань светло-желтого цвета. В зависимости от концентрации 2,4-Д в питательной среде наблюдался рост мристематической части зародыша и формирование проростка. Обнаружена обратная зависимость между темпами образования проростков и концентрацией 2,4-Д в среде, тогда как способность зародышей образовывать каллус и интенсивность его формирования находятся в прямой зависимости от концентрации 2,4-Д и зависит от генотипа первичного экспланта. Повышенные концентрации ауксина влияют на проницаемость мембран, что и проявляется в различном действии гормона (Гамбург, Рекославская, Швецов, 1990). Зародыши сортов Московская 35, Саратовская 29, 8 IS, Gaterin, WW-15370 в 15-80% случаев образовывали неморфогенную каллусную ткань при всех испытанных концентрациях 2,4-Д. Для генотипов Fortuna, Энита, 9IS ЭТОТ показатель находился в пределах 1038%. Результаты экспериментов позволили заключить, что использование 2,4-Д в концентрациях 2 и 3 мпл являются наилучшими для культивирования зречых зародышей пшеницы с целью получения хорошо пролиферирующей каэтусной ткани Формирование морфогенной каллусной ткани во всех вариантах отмечалось шшь в 10% случаев Известно, что для сохранения морфогенетического потенциала каллусных клеток, необходимо культивировать их на средах, содержащих ауксин в сочетании с цитокинином Исходя из этого было изучено влияние 2,4-Д в сочетании с различными цитокининами (зеатин, кинетин, БАП 0,5 мг/ч) на процесс калтусогенеза и морфогенеза Установлено, что на фоне постоянной концентрации цитокинина (0,5 мг'л), но с повышением концентрации 2,4-Д в питательной среде от 2 до 3 мг 1, во всех вариантах возрастает способность зародышей формировать морфогешто каллусною ткань Причем в варианте использования 2,4-Д 2 мг/i в сочетании с цитокинином число морфогенных каллусов не превышает 2 Э - 10,6%, в то время как в варианте i* 2,4-Д 3 мг'л этот показатель возрастает до 60,0% Из всех изученных вешеств наибольшую активность проявили природные цитокинины - зеатин и кинетин В этих вариантах наблюдалось формирование морфогечной калтуснои ткани в 30 - 60% случаев, в ю время как в варианте t, ЬАП этот показатечь не превышал 16,7-28,5% Незрелые зародыши Изучено влияние разгичных концентраций 2,4-Д на процесс формирования калтусной ткани у незрелых зародышей Обнаружена прямая корреляционная зависимость калтусогенеза и морфогенеза от концентрации 2,4-Д в среде Последующее культивирование первичной и пересадочной каллусной ткани в оптимизированных условиях приводило к формированию морфогенной калтусной ткани в пределах 30-52,5%, что зависело от генотипических особенностей исследуемого объекта Каллусная ткань сортов Московская 35, Энига и Саратовская 29 име;а повышенную морфогенетическую активность и через три субкутыивирования этот показатель достигал 45-52,5%, в то время как для остальных генотипов он оставался на уровне 30-40% В целях выявления факторов повышения морфогенетической активности каллусных клеток было изучено влияние 2,4-Д в сочетании с различными цитокининами (зеатин кинетин, БАП) на этот процесс Установлено, что культивирование незрелых зародышей на питательной среде, содержащей 2,4-Д и один из изучаемых цитокининов, не приводило к значительному увеличению морфогенетической активности каллусной ткани Наилучшие результаты были получены на 14 питательной среде, содержащей зеатин, который можно рекомендовать для получения морфогенной каллусной ткани пшеницы. Листовой эксплант. Изучена возможность получения растенийрегенерантов из изолированных листовых эксплантов различных генотипов пшеницы, а также зависимость этого процесса от условий культивирования, размера и возраста первичного экспланта. Установлена обратная зависимость интенсивности каллусогенеза от возраста экспланта (Рис. 1). 10 11 12 13 14 Возраст экспланта, дни - Московская 35 - -Фортуна • -Энита — к — WW-15370 • Рис. 1 Зависимость интенсивности каллусогенеза ( в % от общего числа эксплантов) от возраста первичного экспланта. Выявлена также зависимость каллусогенеза от генотипа первичного экспланта. У сортов WW-15370 и Caterin наблюдалось образование каллусной ткани из листовых сегментов, изолированных с 3 - 14дневных проростков, в то время как для других исследуемых генотипов этот процесс заканчивался в 11 дневном возрасте первичного экспланта. Самый высокий показатель по каллусогенезу отмечен у 7-дневного листового экспланта для всех изучаемых сортов. Изучена также зависимость каллусогенеза пшеницы от размера листового экспланта, которая находится в обратной корреляции. С увеличением размера листового экспланта от 3 до 7 мм уменьшалась их способность формировать каллусную ткань. При длине листового сегмента в 6 мм этот показатель резко снижался, при 8-10 мм формирование каллуса не наблюдалось. Оптимальным для получения хорошо яролиферирующей каллусной ткани является листовой эксплант размером 3-5 мм. Экспериментальных данных по регенерации злаковых культур из каллъсной ткани чистового происхождения пока недостаточно и они носят, в основном, поисковый характер Не опредетены концентрации питатечьных среч. дчя пшеницы, обеспечивающие высокую морфогенетическую активность калчусных клеток В связи с этим нами испытано бочыпое количество вариантов питате гьных сред, оттичающихся друг от друга концентрацией и соотношением цитокининов и ауксинов, среди которых чучшими оказались два 1) 2,4Д 2 мг/ч в сочетании с зеатином 0,5 мг'ч 2) НУК 0,5 мг/т в сочетании с БАП 0,5 мг/т Кучьтивирование каллуснои ткани в этих условиях приводило к индукции образования меристематических очш ов дающих начало развитию растений, которые характеризовались интенсивным ростом, яркой окраской чистовых пластинок и имели хорошо развитую корневую систему Суспензионная к\ тьтура Суспензионную ку-ьтуру почучали из хорошо пролиферируюшей, рыхлой калчусной ткани пшеницы трех генотипов Саратовская 29, Энита и Fortuna Иссчедовалн влияние различных концентраций 2,4-Д в сочетании с CaCI на рост суспензионной клаьтуры Установлено, что уветичение концентрации 2,4-Д и уменьшение СаСЬ в среде значитечьно повышают де 1ение клеток и формирование ме жоагрегированной суспензионной кучьтуры В других вариантах, как правию, суспензия состояла из клеточных агрегатов средних и крупных размеров (бо^ее 50 кчетох в агрегаге) что вероятно, явгячось препятствием активного лечения Дь-дифферснаированных клеток Несмотря на различия в поведении суспензионных кучьтур на разных питательных средах, выявлены обшие тенденции в росте клеточных суспензий С увешчением чиста с\ ОКУ хьтивировании увечичивается способность клеток к делению Максимум присодится на IV пассаж, а к концу V пассажа интенсивность деления клеток резко уменьшается Из всех иссчедуемых генотипов хорошей пролиферативной способностью обладали клетки суспензионной кучьтуры сорта Энита, промежуточное положение занимал сорт Fortuna, а Саратовская 29 отчичалась низкой способностью формировать хорошо пролиферирующую суспензионную кушгуру Дальнейшее ку чьтлвирование суспензий на оптимизированной питательной среде в течение VI - VIII пассажей не позволило активизировать рост кчеточных кучьгур По данным ряда авторов (Сидоров, 19ОД, Бутенко, 1994, Шаяхметов, 1999) это связано с потерей тотипотетности клеток и резкому снижению экспрессии генов контролирующих этот процесс Влияние биочогииески активных веществ и других факторов на кюрфогенетическии потенциал интактных растений и в кх 1ьтуре т vitro В настоящее время регучяторы роста природного и синтетического происхождения находят широкое применение в растениеводстве, фитопатологии, селекции и в других областях науки и отраслях производства. Насчитывается более 5 тыс. соединений, полученных из растений и микроорганизмов, обладающих регуляторным действием, из которых лишь 1% используется в мировой практике. Наряду с веществами химической природы в исследованиях стали использовать физические факторы воздействия на растительный объект: электромагнитные излучения, электрические и магнитные поля, токи высокой частоты и др. Экспериментально доказано, что все эти воздействия имеют сходный механизм действия - активация электронного комплекса молекул, их ионизация, образование свободных радикалов и т.д., что, в свою очередь, приводит к повышению интенсивности биохимических реакций, активности ферментных систем и изменению метаболизма интактных растений (Гунар, Паничкин, 1970, Станко, 1997, Ковалев, 2000). Исследования по использованию нетрадиционных факторов гормональной и негормональной природы в культуре изолированных клеток, тканей и органов растений малочисленны и нередко имеют противоречивые результаты. В связи с этим было изучено действие биологически активных веществ (крезацин, эмистим, фумаран в концентрациях 0,1100 мг/л) и физических факторов (сверх слабое электромагнитное поле: мощность 0,5 ... 1,5 Вт/м , длина волны 200 ... 300 нм, частота волны 50 МГц, продолжительность воздействия на объект 1 мин 30 сек.) на морфогенез интактных растений пшеницы и в культуре in vitro. Установлено, что все изучаемые биологически активные вещества проявляют схожее действие на развитие изолированных зародышей пшеницы в условиях in vitro. Показано, что с повышением концентрации веществ в питательной среде уменьшается способность зародышей формировать морфогенный и неморфогенный каллус, но при этом увеличивается морфогенетическая активность зародышей развиваться в проросток, в базальной части которого образуется каллус. Как правило, формирование нормальных по морфологии проростков отмечено лишь в вариантах с фумараном. Эти явления были характерны для всех изучаемых генотипов. Из всех веществ наибольшую активность в процессах каллусогенеза и морфогенеза проявили эмистим и крезацин (0,1 - 1 мг/л), в то время как действие фумарана было на 10-20% ниже. Аналогичные исследования проведены и по изучению влияния сверх слабого электромагнитного поля на морфогенез изолированных зародышей. Исследованию подвергались изолированные зародыши перед введением их в культуру in vitro. Экспериментально доказано, что применение физического фактора стимулирует образование 17 морфогенного и неморфогенного каллуса Формирование морфогенного ь.алтуса в этом случае происходит на 30% более интенсивно, чем при использованием эмистима и крезапина По видимому, это связано с изменением содержания эндогенных гормонов в первичном экспланте Нами установлено что содержание гормонов в зародышах после воздействия на них сверх слабым электромагнитным полем изменяется содержание эндогенных цитокининов повышается в 2-3 раза, а ауксинов снижается в 4-5 раз по сравнению с контрольным вариантом (без обработки) Это в свою очередь и повлияло на проявление большей способности клеток незрелых зародышей формировать морфогенный кал туе 3.2. Морковь. Особенности каллусогенеза различных генотипов и первичных эксмантов Показано, что процесс образования каллусной ткани зависит от генотипа Сорт Rondo и линия 6700 обладали высокой способностью образовывать катуснуто ткань (57 -70°'о) тогда как для тилии 906, 805 и 225 этот показатель находился в пределах 24 - 39% Установлено, что для изучаемых генотипов формирование калтусной гкани происхо шло по всей поверхности экспланта, начиная с внутренних клеточных слоев на 7 ои день с момента введения их т vitro Выявлено, что процесс калтусогенеза зависит так же и от происхождения первичного экстанта Наибольшей способностью к каллусогенезу обладали сегменты черешков по сравнению с сегментами корнеплодов Поэтому, в последующих эксперимешох использовали каллус, полученный из сегментов черешков Рост схепензионных КУ птур разтчных ^^нотипов Фазы ростового цикла определяли на суспензионной культуре всех изучаемых генотипов (Рис 2) Полученные данные свидетельствуют о том, что у исследуемых сортообразцов, фазы ростового цикла наступают в разное время Были выделены линии 225, 406 и сорт Rondo, для которых характерно одинаковое поведение клеток з суспензионной кугьтуре Лаг-фаза v этих генотипов длилась 7 дней, линейная фаза - 4 дня, затем наступала фаза замедления роста и его S-образная кривая выходила на плато Для линий 6700 и 805 характерно быстрое или постепенное вступление клеток суспензионных культур в активное деление Таким образом экспериментально установлены генотипические различия в скорости деления клеток и роста суспензионных культур, что характеризует различный уровень регенерационного потенциала исходных форм растений моркови 18 О 2 5 7 9 11 15 наблюдения, дни Рис 2 Характеристика роста суспензионных культур различных генотипов моркови. Ростовой индекс. Этот показатель регенерационного потенциала определен на трех генотипах моркови(Лол<&>, 906 и 805). Установлено, что наибольшую активность роста проявляет сорт Rondo, для которого Ri клеточной суспензии находился в пределах 3,5 ... 5,4, что примерно в 2 раза превышает ростовой индекс линии 906 и в 3-4 раза - линии 805. При существенных различиях величины ростового индекса, в экспериментах были выявлены и некоторые общие закономерности в поведении клеточных суспензий в процессе культивирования. Установлено, что на IV пассаже наблюдается увеличение Ш у всех исследуемых генотипов. Причем для сорта Rondo ростовой индекс увеличивался в 1,5 раза, а для линий 906 и 805 - 1,3 и 1,1 соответственно. В конце наблюдений (VII пассаж) Ri для всех генотипов приближался к исходным показателям, имевшем место в начале культивирования суспензионной культуры (I пассаж). Вероятно, это связано с адаптационными способностями суспензионных клеток к условиям культивирования. Жизнеспособность и степень агрегнроваяности суспензионной культуры МОРКОВИ определяли на разных пассажах (I, IV, VII) трех генотипов ( 906, 805, Rondo). Установлено, что соотношение числа живых и мертвых клеток является стабильной величиной в процессе культивирования in vitro и составляет для линия 906 9:1, для линии 805 8:2 и для сорта Rondo - 7:3. По степени агрегированности во всех суспензионных культурах были выделены три фракции: одиночные клетки, мелкие и крупные агрегаты. Установлено, что на I пассаже в суспензиях преобладали одиночные клетки, процент которых составлял 85-100%. На долю мелких агрегатов приходилось всего 15%, а крупные агрегаты отсутствовали вообще. На IV пассаже доля одиночных клеток снижалась до 53-70%, а соотношение мелких и крупных агрегатов было близко к единице. На • VII пассаже отмечалось дальнейшее снижение числа одиночных клеток 19 в суспензии, но при этом возрастало чисто крупных агрегатов ( линия 906, сорт Rondo) Особо выделялась линия 805, для которой характерно присутствие одиночных клеток в суспензии при длительном ее культивировании Морфофизио логические исследования показали, что суспензия состояла из гетерогенных клеток по форме и размеру При длительном культивировании эти показатели менялись Для всех исследуемых генотипов на ранних пассажах отмечалось формирование клеток овально-вытянутой формы, большого размера с крупной вакуолью и мелким ядром При ку льтивировании клеток в течение восьми гассажей они сохраняли овальную форму, но незначительно уменьшались в размере Для сорта Rondo и линии 906 было характерно образование крупных агрегатов, состоящих из клеток меристематического типа, в то время как для линии 805 этих изменений не наблюдалось Растения регенераты получали из каллусной ткани, формировавшейся из клеток суспензионных культур после их платирования в агар В качестве стимулятора морфогенеза в питательную среду добавляли БАП в концентрации 1 мг л В этих условиях выращивания начало морфогенеза отмечалось через 1 неделю с момента культивирования микрокаллуса в данных условиях Формирование растении-регенерантов происходило через соматический эмбриогенез 3.3. Картофыь Недостаточная морфогенетическая активность клеточных культур отдельных сортов картофеля в условиях т vitro сдерживает эффективность применения методов клеточной селекции и генной инженерии в картофелеводстве Поэтому необходимым этапом в работах по этим направлениям является изучение в кутыуре т vitro генотипических особенностей морфогенеза и регенерационной активности различных типов эксплантов картофеля с целью включения их в дальнейшие исследования по клеточной селекции Особенности каллусог^неза и морфогенеза различных генотипов и эксплантов картофегя Работа проведена на четырех сортах картофеля Невский, Жуковский ранний. Удача и Дезире В качестве первичного экспланта использовали сегменты междоузлий пробирочных растений картофеля Были выделены сорта способные интенсивно формировать каллусную ткань (Жуковский ранний и Дезире) и менее интенсивно (Невский, Удача) Эти сортовые особенности отмечались при культивировании каллусной ткани в течение пяти пассажей При различиях интенсивности каллусогенеза было также установлено, что максимальный прирост сырой биомассы ткани у всех изученных сортов наблюдался на III и IV пассажах. Выявлена зависимость каллусогенеза у картофеля от концентраций 2,4-Д в питательной среде. Установлено, что из всех изучаемых генотипов особое место занимают сорта Жуковский ранний и Дезире, для которых характерен интенсивный рост каллусной ткани, независимо от концентрации 2,4-Д в питательной среде. С увеличением концентрации ауксина указанный показатель возрастал. Для сортов Невский и Удача повышение концентрации 2,4-Д не привело к увеличению интенсивности каллусогенеза. Для этих сортов характерно формирование каллусной ткани рыхлой консистенции, не способной к морфогенезу. Установлено, что активная пролиферация каллусной ткани происходит на среде Мурасига и Скуга, содержащей 2,4-Д в концентрации 2 - 3 мг/л в сочетании с кинетином 0,2 мг/л независимо от исследуемого генотипа. Первичные зкспланты по способности к каллусогенезу расположились в следующей последовательности: междоузлия > листовые сегменты > корневые сегменты > диски микроклубней. Эта же закономерность сохранялась и в способности первичных эксплантов к морфогенезу. В целях поиска путей и методов повышения интенсивности каллусогенеза различных эксплантов картофеля, было изучено влияние веществ ауксинового типа действия (2,4-Д, ИУК, НУК, ИМЕС) и их концентраций (1-5 мг/л) на этот процесс. Наибольшей пролиферативной способностью обладала каллусная ткань, полученная на среде с НУК. В этом варианте прирост каллусной массы для сортов Жуковский ранний и Дезире составил 200% и более, в то время как в других вариантах этот показатель не превышал 183%. Для сортов Невский и Удача интенсивность каллусогенеза была в 2 раза ниже. Из всех исследуемых генотипов выделились сорта Дезире и Жуковский ранний, для которых характерно формирование быстрорастущей каллусной ткани, способной в дальнейшем к регенерации растений. Особенности роста суспензионных культур различных генотипов картофеля. Суспензионную культуру получали из хорошо пролиферирующей каллусной ткани рыхлой консистенции всех изучаемых генотипов. В качестве питательной среды использовали среду МС, содержащую 2,4-Д в концентрации 2 мг/л. На первом пассаже определяли фазы ростового цикла (рис.3). Установлено, что у изучаемых сортов, фазы ростового цикла наступают в одинаковый промежуток времени. Отличия между ними отмечены лишь в активности деления клеток. Как и при каллусогенезе рост суспензионных культур сортов Дезире и Жуковский ранний 21 чначитечьно превышает в танейной фазе сорта Удача и Невский Содержание клеток в 1 мл среды у них бы то в 2 раза выше, чем у сортов Невский и Удача —Я—Жукоасклй ранчии л. 1 4 7 11 14 Двэире 13 дни наблюдении Рпс 3 Характеристика роста о игеизиоциых KV u>rvp разчичных генотипов картпфетя Таким образом экспериментально установленные различия в скорости роста калл\снь>х и суспензионных к\льтур изучаемых генотипов пшеницы, моркови и картофе ш, позволяют заключить о возможном неодинаковом поведении к-еток при последующем их культивировании в стрессовых \сювиях in vitro Применение биологически активных веществ или физических факторов воздействия в культуре изолированных клеток, тканей и органов растений является альтернативным способом повышения регенерационнои способности дифференцированных и дедишференцированных клеток, используемых в различных биоинженерных экспериментах Г.1ЯВЦ 4 Пол>ченне кульгурального фильтрата патогеных грибов и изучение его ленствия на интактных растениях и в КУЛЫ vpa\ ш vitro. 4.1. Влияние гриба Septoria nodorum и его жзометаболитов на семена и зародыши пшеницы Токсичность гриба 9 по Jorum HI изолированных зародышах Ка\ правило, селекцию т vitro на устойчивость растении к болезням проводят с использованием КФ гриба Очнако исследователям не всегда удается получить стерильный фильтрат ПОЭТОМУ В ряде случаев при клеточной селекции используют совместное культивирование клеток растений и патогена на твердых агаризованных питательных средах Нами были предприняты попытки определить возможносхь совместного ку "ьтивирования гриба и изолированных зародышей на одной питательной среде in vitro. Результаты свидетельствуют, что с увеличением количества кусочков агара с грибом от 3 до 6 шт. в одной чашке Петри, их токсичность возрастает от 63,6 до 80,1%. Независимо от количества S. nodorum в одной чашке, резко снижается рост побегов и корней по сравнению с контролем. Получение кулътурального фильтрата гриба S. nodorum. В наших, исследованиях гриб S. nodorum выращивали на агаризованной питательной среде Мурасига и Скуга (МС), а также на среде Чапека. Для получения селективного фактора - культуральный фильтрат патогена, гриб S. nodorum культивировали в жидких питательных средах на качалке. При таком способе выращивания, гифы гриба сплетались в "клубки", образуя при этом видимые визуально структуры шарообразной формы разных размеров. Питательная среда при этом изменяла цвет и становилась темно-коричневой. Через 7 дней культивирования гриба 5. nodorum в жидкой питательной среде был получен культуральный фильтрат, который в дальнейшем использовали в работе по определению его фитотоксической активности на семенах и изолированных зародышах пшеницы. Влияние экзометаболитов гриба S. nodorum на семена и изолированные зародыши. Семена пшеницы. Установлено, что КФ гриба S. nodorum в различных концентрациях оказывает в той или иной степени токсичное действие на прорастание семян пшеницы. При использовании не разведенного КФ (100%) его токсичность составила всего лишь 51,6%, а при концентрациях 25 и 50% этот показатель значительно уменьшался и составлял соответственно 1,6 и 9,7%. Последнее было обусловлено значительной стимуляцией роста стебля в этих вариантах по сравнению с контролем. Поэтому в последующей серии экспериментов был использован 14-дневный КФ в концентрации 75% (Рис. 4). Из рисунка 4 видно, что семена, испытанных генотипов пшеницы, проявили различную чувствительность к присутствию КФ гриба в среде. Сорт Московская 35 и гибрид 91S~10 оказались устойчивыми к КФ гриба (токсичность 3,93% и 6,54%, соответственно), Fortuna, Энита, Саратовская 29, 81S-15 - средне устойчивыми (токсичность КФ 19,37 49,18%), а сорт Gaterin и гибрид WW-15370 оказались не устойчивыми к КФ гриба. Для этих сортов токсичность фильтрата составила 71,24% и 95,3%, соответственно. 23 Рис 4 Устойчивость различных icnonnioii пшеницы к действию 14-ТДСВНО1 о КФ патогена5 nodorum Таким образом показано что 7 к 14-дневные КФ гриба S nodorum проявили разчичную фиютоксичесхую активность на прорастание семян различных генотипов пшеницы Причем 14--щевный КФ оказал повышенную токсичность ПОЭТОМУ ДЛЯ проведения ктеточной се 'екции цетесообразно испочьзовать к\1ьтуральный (рильграт гриба при 14дневном его выращивании в жидкой питате 1ьной среде Изотированные зародыши Установюно, что с увеличением концентрации КФ в питатетьноц среде возрастает его токсичность Так при 75% концентрации она достигает максимума - 87,5 - 98,0% (рис 5) - 1 ike» -11 дней -14 дней 25 «С концентрация КФ " Рис 5 Зависимость юксичности КФ от его концентрации н времени выращивания гриба S nodorum в жилкой питательной среде. 0/ Достаточно высокая токсичность (67,3 о) наблюдалась у 14-дневного КФ даже при концентрации 25% Наличие в питательной среде 11 и 14- дневного КФ в концентрации 50% было также токсично для образования проростков из изолированных зародышей, а 7-дневный КФ в той же концентрации был практически нетоксичен и оказывал стимулирующий эффект на формирование более длинной корневой системы (2,9 см по сравнению с 1,9 см в контроле). 4.2. Влияние экзометаболитов гриба Alternaria radicina на прорастание семян и рост суспензионной культуры моркови. Получение кулътуралъного фильтрата гриба Alternaria radicina осуществляли путем культивирования патогена в жидкой питательной среде Мурасига и Скуга, а также Чапека. Учитываемым фактором служила токсичность культурального фильтрата гриба, после фильтрования среды и освобождения ее от гифов патогена, которую определяли в динамике по прорастанию семян моркови сорта Rondo. Установлено, что 30-дневный КФ патогена, полученный на питательной среде Чапека оказывает свое ингибирующее действие на прорастание семян моркови в 7 раз больше по сравнению с КФ, полученным на среде Мурасига и Скуга. Это в дальнейшем было доказано на семенах других генотипов моркови, которые, проращивали на 100% культуральном фильтрате, полученном на среде Чапека. В этих вариантах наблюдалось ингибирование прорастания семян в 80 - 95% случаев. Выявлено, что при длительном культивировании гриба Alternaria radicina в жидкой питательной среде, агрессивность данного патогена уменьшалась, что не позволяет проводить отбор клеток в более жестких селективных условиях in vitro. Особенности прорастания семян моркови па культуралъном фильтрате гриба Alternaria radicina, полученном разными способами. Изучено влияние: 1) автоклавированного и неавтоклавированного КФ гриба; 2) автоклавированного и неавтоклавированного КФ, полученного при совместном культивировании клеток суспензионной культуры моркови и патогена; 3) долго хранящегося КФ при пониженной температуре (+2° С). Установлены закономерности в токсичности КФ, полученного разными способами, на прорастание семян. При использовании неавтоклавированного культурального фильтрата всхожесть семян уменьшается по сравнению с использованием автоклавированного фильтрата. При применении КФ гриба A. radicina, полученного при совместном культивировании патогена и суспензии клеток его существенное ингибирующее действие проявлялось уже при концентрации 50%. Несмотря на отмеченное ингибирующее действие фитотоксичных метаболитов патогенного гриба на всхожесть семян, выявлен некоторый стимулирующий эффект ростовых процессов в случае использования КФ в низких концентрациях (25%). Для сорта 25 Rondo и тянии 805 в ITOVI варианте длина проростков была больше по отношению к контролю на 12-25% Для тании 906 этот показатечь в данном варианте находился на уровне контроля Экспериментально установлено, что испочьзовать в качестве селектирующего фактора КФ гриба A radicina дочго хранящегося при пониженных температурах, возможно, поскольку его токсическое действие не снижается по мере хранения КФ в холодильнике по сравнению со свежеполученньгм КФ Особенности ро<,та суспензионных ку чьтур моркови на к\ гыпхралъноч фильтрате rpu6a I radioing Для дополнительного доказатеаьства ботьшеи токсичности КФ, почучениого на разных питательных средах, бычи проведены эксперименты и с суспензионной ку штурой В жидкую питательную среду кучьтуральный фитьтрат гриба добавляли в концентрациях 10 - ^0% Установлено, что дтя всех изучаемых генотипов характерна общая тенденция поведения клеток суспензии в стрессовых условиях С увечичением концентрации КФ в питатетьной среде уменьшается ростовой индекс Однако при концентрации фильтрата 10% (полученного на среде Мурасига и Скуга) и 20% (полученного на среде Чапека) Ri заметно повышается Увечичение концентрации КФ гриба в питательной среде чо 40% снижало ростовой индекс в 3 раза при использовании сри"ьграта почученного на среде Чапека и Ri находился на уровне контрочя при испочьзовании среды Мурасига и Cicvra (Рис 6 ) Это доказывает, что ку чьтуральный фичьтрат, полученный на среде Чаинка содержит бочьше токсинов, которые ингибируют рост и деление ччеток -кентрогь 10% ^0". "0% 40°!, 5С°. Концентрация КФ % Рис 6 Изменение чпсла клеток в cvcneiuini моркови (сорт Rondo) в ]авнсимостн от концентрации КФ • рпба Л. radicina 4.3. Влияние зкзо метаболитов гриба Rhizoctoma solam на рост растений картофеля in vitro, каллусные и суспензионные культуры Почхчение ку1ътуралънос.о фильтрата ^риба R solam В работе испытывали кутътуральный фильтрат, полученный при кучьтивировании патогена в жидкой питательной среде Mvpacura и 26 Скуга, а также Чапека в течение 30 дней с последующим определением его токсичности по росту пробирочных растений картофеля (сорт Жуковский ранний). Установлено, что при выращивании патогена на среде Чапека начало активного выделения экзометаболитов в питательную среду приходится на 20-й день с начала культивирования патогена. В этом случае токсичность КФ составила 59,2%. При дальнейшем культивировании гриба наблюдалось значительное повышение токсичности культуральной жидкости, которая достигала максимума на 40-й день выращивания гриба и составила 93,7%. Последующее культивирование патогена в течение 30 дней (с 40-ого по 70-й день) приводило к незначительным изменениям токсичности раствора, что свидетельствовало о прекращении выделения экзометаболитов в питательную среду. При культивировании гриба Rhizoctonia solani на питательной среде МС, начало активного выделения токсинов наблюдалось лишь на 40-й день и токсичность фильтрата в этом случае была в 5 раз меньше по сравнению со средой Чапека и составила 27,1%. Максимальное ингибирующее действие КФ получено на 60-й день культивирования и составило 49,5%. Дальнейшее культивирование гриба на среде МС в течение последующих 10-ти дней (с 60-ого по 70-й) не приводило к увеличению токсичности КФ патогена. Влияние культлрального фильтрата гриба R. solani на рост пробирочных растений. Установлено, что повышенные концентрации КФ гриба в питательной среде приводят к ингибированию ростовых процессов. Так, при концентрации КФ 90% наблюдалось уменьшение длины и массы побегов. В этом варианте формировались растения с укороченными междоузлиями, о чем свидетельствовало наличие одинакового количества листьев на побегах, культивируемых в различных стрессовых условиях. Наряду с ингибирующим действием фитотоксичных метаболитов патогенного гриба, отмечен некоторый стимулирующий эффект ростовых процессов в случае использования КФ в низких концентрациях ( 25% и 50%). В этих вариантах длина побегов была выше по сравнению с контролем в среднем на 8-12%. Влияние культурального фильтрата гриба R. solani на рост каллусной ткани. При работе с каллусной культурой, основным критерием оценки влияния селективного фактора является рост каллусной ткани в стрессовых условиях, который определяется по приросту ткани в начале и конце пассажа (табл.1). Из таблицы 1 следует, что с увеличением концентрации КФ в питательной среде снижается рост каллусной ткани. Эта закономерность характерна для всех изучаемых генотипов. Интенсивность роста каллусных клеток в стрессовых условиях имеет генотипическую 27 зависимость Для сорта Невский и Удача характерно значительное инпибирование ростовых процессов стрессовым фактором Для сортов Жуковский ранний и Дезире отмечалась активная пролиферация каллусной ткани, что привело к увеличению прироста клеток на г пита' е тьных средах, содержащих КФ пато1ена в концентрации 10% и 20% в среднем на 17 - 4 0 4 Для всех изучаемых генотипов как и в стучае с пробирочными растениями, наблюдался стимулирующий эффект низких концентрации КФ Таблица 1 Прирост кал.пенои ткани картофеля, клмьгивпруечой на сепектившш cpeie с КФ патогена ( в % к начальной массе каллуса, I пассаж) Концентрация КФ "Л Сорт Невский АУКОВСКИЙ контроль 63 5+4 1 135 5±7О 11) 20 30 40 50 80 8±4 3 149 7-8 5 46 4±2 9 и; ?+HS 42 2±3 7 146 5*8 0 40 0±2 5 140 7±7 9 jq 4+ч о 134 8+7 2 7S 2+* S 1 ^ 4+6 1 46 S+* о 160 ^+-8 • « 7±:> 0 ' 7 ' 8±9 4 ^3*3 1 1114+62 Ч ^г2 2 U6Ji6 0 32 5+2 8 71 4=4j ранний Де-гире Влияние куьтуральио^о фильтрата ергюа It чо1ат на рост с\1~пензианной к\1ьтуры Сечективный фактор добавляли в питатетьную среду в концентрациях 10 - W o Учитывали ростовой индекс, жизнеспособность суспензионной к\ ibrvpu и степень ее агрегированности Исс~едования выявили бтизкие реакции в поведении клеток суспензионных культур, культивируемых в течение I пассажа на питатечьных средах, содержащих ку натуральный фильтрат гриба в различных концентрациях Усиновлено что при испочыовании КФ патогена в низких концентрациях (10° о 20°'») наблюдхлея CT»IMVтирующий эффект ростовых процессов Для суспензионной культуры ростовой индекс в этих вариантах был ниже по сравнению с контролем, но выше чем в остальных вариантах Повышение концентрации КФ гриба ( 10° о - 50° о) приводило к ^нлжению ростовых процессов Особенно это проявлялось на суспензионных культурах сортов Невский и Удача В вариантах где концентрация КФ патогена составляла 40% и 50%, прирост суспензионной культуры не был отмечен из-за 100%-ной гибели клеток (сорт Удача) (Рис 7) го за 40 "-о концентрация КФ % • Дезире " в — Жуковский ранний -~*~*невский - - Удача Рис 7 Жизнеспособность суспензионной кулы>ры различных юютштов картифе in в зависимости от концентрации КФ патогена R solani Наибольшей жизнеспособностью отличались клетки суспензионных культур сортов /Куковскии ранний и особенно Дезире Для этих генотипов независимо от условий кмьтивирования (npucvTCTBue в питательной среде стресс-фактора) ростовой индекс уменьшался незначит1льно Установлено что степень агрег ированности суспензионной ю^ьтуры увеличивалась с уветочением концентрации КФ в питательной срел.е и не зависела ог исседуемого сорта Итак, проведенные исследования свидетельствуют, что фитотоксичность экзометабочитов возбудителей болезней 51 nodorum A r^dînu R sol^m в УСЛОВИЯХ in \itro в значительной мере зависит от созыва и соотношения инградиентов питательной среды, способа и продолжительности культивирования патогена т vitro а также ею концентрации Выращивание изолятов гриба в жидкой питательной среде Чапека повышает фитотоксичность КФ грибов в 5-7 раз по сравнению с КФ полученного на среде Мурасига и Скуга Низкие концентрации КФ оказывают стимулирующее влияние на рост интактных растений и клеток каллусных и суспензионных культур (пщенипа морковь, картофе ш), высокие - ингибирующее действие Выбор концентрации КФ патогенов, при селекции растений т \itro должен обеспечивать 50% его токсичность и зависит от видовых особенностей исследуемых объектов S. Клеточная и тканевая селекция пшеницы, моркови и картофеля с использованием селективных сред на устойчивость к грибным патогенам. 5.1. Тканевая селекция пшеницы на устойчивость к патогену S. nodorum. Исследования, проведенные на каллусной ткани, полученной из зрелых и незрелых зародышей, выявили общие особенности поведения каллусных клеток в стрессовых условиях, независимо от применяемой схемы селекции. На первом этапе селекции (I - III пассажи) формировался в 85%-ах случаев каллус средней плотности, яркожелтого цвета, в котором дифференцировались меристематические клетки. К концу IV пассажа в 50%-ах случаев отмечалось образование каллусной ткани бурого цвета без признаков морфогенеза. Последующее ее культивирование на среде без селектирующего фактора (второй этап селекции) повлияло на восстановление пролиферирующей активности каллусных клеток, которые были способны к морфогенезу. Из меристематических очагов в дальнейшем формировались нормальные растения. На третьем этапе селекции (повторное культивирование каллусных клеток на среде с КФ патогена) наблюдалась гибель каллусной ткани в 40% случаев и формирование рыхлой оводненной ткани, состоящей на 70% из сильно вакуолизированных клеток. На этом этапе селекции проведена оценка каллусной ткани по приросту. Установлено, что присутствие в питательной среде КФ гриба в различных концентрациях заметно ингибирует пролиферацию каллусной ткани у всех исследуемых генотипов пшеницы. С повышением концентрации КФ уменьшается прирост каллусной ткани на 26-60%. Исключение составили генотипы 91S, Московская 35, Энита, Fortuna, для которых независимо от концентрации КФ, каллусная ткань имела стабильный прирост. Вероятно, данные генотипы обладают большей устойчивостью к грибу Septoria nodorum по сравнению с остальными исследуемыми сортообразцами. Причем для данных генотипов отмечено формирование в каллусной ткани меристематических зон, из которых в дальнейшем получены растения-регенеранты. Культивирование каллусных клеток в селективных условиях в течение восьми пассажей позволило отобрать каллусные линии, устойчивые к КФ гриба S. nodorum, которые были перенесены на питательные среды для регенерации. В качестве стимулятора морфогенеза в питательную среду добавляли зеатин в концентрации 1 мг/л. Число растений-регенерантов, полученных из каллусной ткани после ее культивирования на селективных средах, представлено в таблице 2. Для каллусов, полученных из зрелых зародышей, также было характерно формирование растений-регенерантов после проведения клеточной селекции. Однако морфогенетическая активность каллусной зо ткани была в 6-7 раз ниже, по сравнению с калтусами из незречых зародышей Единичные растения-регенеранты получены лишь дтя сортов Энита, Московская 35 и 9IS 1аблица2 Растения-регенеранты, полученные и! клеток, прошедшие отбор на селективных средах с КФ патогена 5 nodorum (незрелые зародыши) Генотип схема селекции 4(У>о КФ) 1 (0 КФ) 4(^% КФ) 4(<% КФ> 1 (0 КФ) 4(<% КФ) Московская 35 4(10° о КФ) 1(0 КФ) 4(10% КФ) 4(1*%КФ) ЦОКФ)4(15%КФ) 4(<% КФ) 1(0 КФ) й{5% КФ) Ft чипа i(io% КФ) ц о К Ф ) н:о% КФ) цо КФ) 1(Ю% КФ) 1(0КФ)(10%КФ) 4(1'!% КФ) 1(0ЧФ)4(1*%КФ» Саратовская 29 ЦУоКФ) Ц0КФ) Ц^'оКФ) 1(0КФ)1(з% КФ) НО КФ) lCô КФ) 1(0 КФ) 1(5% КФ) 1(0 КФ) 1(5% КФ) 1(10°»КФ) 1(15% КФ) 1(20% КФ) 1(0 ' Oattrm КФ) 1(^%КФ) 1(10% КФ) 1(1<:%КФ» u'o%^Ф) 4("5%КФ1 1(0КФ)4(^°оКФ> •цифры 1,4- обозначают количество проведенных пассажей Энита всего растении, шт 3 4 4 л 1 -< 1 2 j Зерновки первого поколения были проверены в табораторных устовиях по прораотанию на устойчивость ь. патогену Установлено, что проростки, полученные из зерновок раС1ений-регенерантов, обтадали устойчивостью к КФ гриба Septona nodorum на 10-15% бочьше по сравнению с исходным генотипом Для оттельныч сортов (Московская 35) устойчивость повышалась до 25° о 5.2. Клеточная селекция моркови на устойчивость к патогену Alternaria radicina. Влияние жзочетабатитов риба A radioing на рост суспензионной кгу гытры Изучено поведение кчеток суспензий моркови при дчитечьном их культивировании на сетективных средах Оценивали ростовой индекс, жизнеспособность Л степень агрегированное™ суспензионной культуры на I IV и VIII пассажах Установлено, что с увеличением содержания КФ в среде снижается ростовой индекс и жизнеспособность клеток во всех вариантах в 2-3 раза по сравнению с контротеч При изучении этого показате!Я в динамике выявлено, что на VIII пассаже сетекции, Ri увечичивался по сравнению с предыдущими пассажами, но все же оставался ниже контроля Вероятно, это связано с адаптацией клеток к стрессовым устовиям и появлением большого чиста жизнеспособных клеточных агрегатов Определена генотипическая особенность зависимости .Ri от содержания КФ гриба в среде. Для линии 906 Ri во всех вариантах был снижен в 3 раза, для линии 805 и сорта Rondo - в 2 раза. Из этого следует, что клеточную селекцию линии 906 целесообразно проводить при низких концентрациях КФ (20 - 30%), так как более высокие концентрации приводят к значительному ингибированию ростовых процессов. Экспериментально установленные условия позволяют культивировать клетки на селективных средах в течение длительного времени. Выявлено, что на ранних этапах культивирования (I пассаж), суспензионная культура состояла из одиночных клеток (60-80%) и мелких агрегатов (20-30%). Фракция крупных агрегатов на этом этапе отмечена лишь для линии 805 и составляла 20-25%. Дальнейшее культивирование клеточных суспензий в стрессовых условиях снижало содержание одиночных клеток и мелких агрегатов и увеличивало долю крупных агрегатов, процентное число которых составляло 50% и более. Изменение степени агрегированности клеточных суспензий было характерно для всех изученных нами генотипов моркови. После селекции суспензионную культуру платировали в агар с целью получения растений-регенерантов. Морфогенез индуцировали на питательных средах, содержащих различные вещества с цитокининовой активностью (БАЛ, зеатин, 2ip, эпин). Установлено, что эпин и все изучаемые цитокинины способны стимулировать образование соматических эмбриоидов и этот процесс зависел от применяемого гормона - стимулятора. При добавлении в питательную среду БАП начало морфогенеза отмечалось через 8-9 недель после инокуляции суспензии в агар, при добавлении 2ip - через 3 недели, а при добавлении зеатина или эпина - через 1 неделю. Это характерно только для суспензии, которая прошла цикл селекции, так как в контрольном варианте морфогенез начинался уже на первой неделе культивирования клеточных колоний после матирования, независимо от присутствия в питательной среде того или иного исследуемого вещества. Данные о числе полученных растений-регенерантов, после клеточной селекции, представлены в таблице 3. Растения-регенеранты контрольного варианта и полученные из клеток культивируемых на селективных средах, были проверены в лабораторных условиях на устойчивость к патогену Alternaria radicina. Пробирочные растения культивировали на питательной среде, содержащей КФ гриба в концентрации 95%. Установлено, что выживаемость растений-регенерантов в этих условиях, полученных после селекции in vitro выше на 30% для линии 906 и на 50% для сорта Rondo. 32 Таблица 3 Число растении регенерантов моркови, полученных после культивирования клеток на питательных средах с КФ патогена Л radicina Генотип 906 Rondo Схема сетскшш •!(30°икФ1 НОКФЧ4('0%КФ> 3(40° о КФ) 1(0 КФ") 4 [40% КФ) •>С?О°и КФ1 \(д КФ) 4 ( W o КФ) " ( ' 0 % КФ) ДО КФ) 4 (40% КФ) 440% КФ) 1 (0 КФ) 4 (40° о КФ1 Всего растений, шт so 14 10 25 10 5 л(<о% К Ф ) цо КФ> -* (<;о% К Ф ) * цифры 3, К 4 - обозначают количество проведенных пассажей S.J Тканевая и клеточная селекция картофеля на устойчивость к патогену Rhizoctoma solam. Тканевая селекция к^ртофе^я на устойчивость к R yolani Селекцию in vitro проводили на хорошо протаферирующей каллусной ткани, полученной из стеблевых эксп-'антов картофеля способной к морфогенезу В качестве стресс-фактора использовали 30-дневный к\льтуральный фильтра^ гриба Rhizoctoma solam в концентрациях 1050% Установлены общие особенности поведения каллусных клеток картофеля ку хьтивируемых в стрессовых усювиях в течение шести пассажей На ранних JTanax се!екшш (I и II пассажи) показано что низкие концентрации КФ патогена (10 20а/а) значитечьно стимулируют процесс калтусогенеза, в то время как высокие концентрации (40-50Olo) оказывают ингибирующии эффект Опреде 1ены условия, необходимые для проведения клеточной се гекпии - наличие в питательной среде КФ патогена в концентрации 30-40° о В этих условиях наибольшей прочиферативной способностью об7адала калтусная ткань сортов Дезире и Жуковский ранний, для которых характерно сохранение высокого прироста тканл (30-60%) даже в конце VI пассажа Для сорта Невский этот показатель постепенно снижался и к концу VI пассажа составил 10%, а для сорта Удача на згом пассаже отмечалась полная гибель калтусных клеток Вероятно клетки каллусной гкани сорта Удача не способны адаптироваться к действию зкзометаболитов гриба Rhizoctoma solam ^сточная сьлекиия картофеля на устойчивость к R solam Культивирование сусгензионной культуры в стрессовых условиях проводили в течение восьми пассажей Установлено, что высокие концентрации КФ (40 - 50%) приводили к значительному снижению жизнеспособности суспензионных культур, за счет быстрой гибели клеток При культивировании суспензионной культуры четырех генотипов картофеля в стрессовых условиях выявлены одинаковые реакции клеток на действие KV ьтурального фильтрата гриба Отмечено, зз что с увеличением продолжительности выращивания клеток на питательных средах в присутствии селективного фактора, заметно снижалась жизнеспособность суспензионных культур. При высоких концентрациях стресс-фактора этот показатель составил 0 - 8,3%. Выявлены генотипические особенности поведения клеток суспензионных культур, культивируемых на питательных средах, содержащих селективный фактор. Из всех изучаемых сортов лишь для сорта Дезире была отмечена высокая адаптационная способность клеток суспензионных культур к стрессовым условиям. Это проявлялось в увеличении жизнеспособности клеток и RL Сорт Удача оказался неустойчивым к действию культурального фильтрата гриба Rhizoctonia solani. Жизнеспособность данной суспензионной культуры на среде, содержащей КФ в концентрации 10% составила всего 3,8-28,6%. Для суспензионной культуры сорта Жуковский ранний только на II - IV пассажах наблюдался стимулирующий эффект действия вторичных экзометаболитов гриба Rhizoctonia solani (10-20%), в то время как при концентрации КФ 30% этот показатель снижался до 5-17%. Сорт Невский занимал промежуточное положение по устойчивости к изучаемому фактору, так как жизнеспособность клеток суспензионных культур постепенно снижалась и находилась в обратной корреляции от концентрации КФ в среде и числа субкультивирований. Таким образом, селекцию in vitro растений возможно проводить на каллусных и суспензионных культурах, выбор которых зависит от видовых особенностей выбранных объектов и способности дифференцированных клеток к реализации морфогенетического потенциала. Для пшеницы оптимальный эффект в селекции in vitro достигается на каллусной ткани при ее культивировании на среде, содержащей 20% КФ 5. nodorum, для моркови - на суспензионной культуре на среде с 30-50% КФ A. radicina, для картофеля - на каллусной и суспензионной культурах, на средах с 30-40% КФ R. solani. Плава 6. Участие фитогормонов в клеточной селекции растений к экзометаболнтам патогеных грибов. Известно, что процесс адаптации клеток и интактных растений к факторам абиотической и биотической природы находится под контролем гормональной системы. Однако работы, свидетельствующие о существенной роли гормонального баланса в адаптации каллусных и суспензионных культур, длительно культивируемых на питательных средах в присутствии экзометаболитов патогенов, малочислены, а полученные результаты противоречивы. Поэтому представляет интерес выяснения действительного участия фитогормонов в этом процессе. 34 Сечективные \с-овия и гормональный баране клеток суспензионной к\гьт\ры и растений-регенерантов моркови Изучение гормонального баланса суспензионных юпьтур, культивируемых на питательных средах, содержащих КФ в концентрации 20% (со стимулирующим эффектом) и 40% (эффект ингибирования), позволило выявить существенные различия по содержанию фитогормонов в клетках (табл 4) При культивировании клеток суспензии на средах, содержащих 20% КФ, наблюдается увеличение содержания ИУК и цитокининов, в то время как на средах с 40%-ным КФ «отечество этих гормонов были значительно ниже по сравнению с контролем Синтез же эндогенной ГК с увеличением концентрации КФ у обоих генотипов увеличивался Это влияло на процесс растяжечия клеток и проявлялось в формировании клеток крупных размеров и вытянутых форм Абсцизовой кислоты в клеточных ку шгурах ни в одном из исследуемых вариантов обнаружено не было Таблица 4 Содержание гормонов (мкг/i cv\ масса) в оспензионной Kv~ib~rvpe моркови, культивируемой на cpeie с содержанием селективного фактора, I пассаж. Генотип Конн КФ, "'о ЛУЧУ я ч<3ъ Контро ь 20 Сорт Rondo Контре "ь 20 40 40 ФИТОГОРМОНЫ ИУК ЦК 2Ы 6^ 0 0846 287 41 0 1083 0 029 ьЧ 0 0J47 Р 7< 346 98 0 032S ООПО 7 48 1 ГК 0 0 1 2 2 3 3945 4733 79О<: 6311 4412 1268 В дальнейшем было из\чено поведение- клеток суспензии моркови в присутствии 40% кулыурального фильтрата в течение селекции in vitro (I, IV, VIII пассажи) и их гормональный баланс (табл 5) Результаты свидетельствуют, что процесс адаптации клеток к действию стрессового фактора происходит ja счет увеличения синтеза ауксинов и цитокининов в процессе длительного их культивирования т vitro Установлено, что при культивировании суспензионной культуры моркови сорта Rondo в стрессовых условиях в процессе адаптации проявляется роль такого гормона как АБК, что говорит о некоторой разнице в механизмах адаптации у разных генотипов моркови В контрольном варианте, не содержащем слресс фактора, при длительном культивировании сусгензионной культуры вне зависимости от генотипа набчюдалось снижение содержания всех гормонов-стэмуляторов Повидимому, это связано со старением культуры, а разница в количественном уменьшении этих гормонов у линии 906 и сорта Rondo можно объяснить сортовыми особенностями. Таблица 5 Содержание гормонов (мкг/г сух. масса) в суспензионной культуре моркови при культивировании ее в стандартных и стрессовых условиях на разных пассажах. Jfl Вариант I Г/ VIII 1 IV VII! ФИТОГОРМОНЫ ЦК АБК линия 906 0,0846 261,65 0,029 6,51 0,0138 128,33 0,102 90,69 0,0083 8,91 0,126 92,05 сорт Rondo 0.0397 13,75 0,013 7,48 0,0154 6,84 0,018 1,029 4.26 4,92 0,0106 0,0209 16,24 0,72 ИУК пассажа Контроль КФ 40% Контроль КФ 40% Контроль КФ 40% Контроль КФ 40% Контроль КФ 40% Контроль КФ 40% гк 0,3995 1,7905 0,2701 0,8397 0,0952 0,8759 2.6311 3,1268 0,5390 0,3251 0,7781 2,1055 В конце VIII пассажа из клеток, культивируемых в контрольном и опытном (после селекции in vitro) вариантах, были получены растениярегенеранты, которые в дальнейшем переносили на питательную среду, содержащую 95% КФ патогена Alternaria radicina. Определение фитогормонов в таких растениях-регенерантах показало, что полученные в результате клеточной селекции растения содержат значительно больше ауксинов, гиббереллинов и особенно цитокининов по сравнению с контрольным вариантом (табл. 6). Известно, что существенную роль в адаптации к стрессовым воздействиям у растений играют такие гормоны как АБК и ЦК, а в процессах репарации после стресса - и ИУК. Доказана экспрессия генов под воздействием ЦК и АБК, которая приводит к синтезу стрессовых белков, изменению метаболизма и как результат - адаптации организма к стрессам (Дьяков, Озерецковская, Джавахия, Багирова, 2001, Тарчевский, 2002). Полагаем, что в результате стресса, каким является культуральный фильтрат патогена, начинаются модификационные изменения, которые проявляются в виде реакции устойчивости к неблагоприятным факторам, одной из которых и является изменение гормонального баланса культуры клеток моркови. 36 Таблица 6 Содержание гормонов ( мкг/г cvx массы) в растениях-регенерантах Генотип Вариант Линия 906 Контроть В рез\льтате Сорт Rondo Контроль ' В результате селекции ИУК 0 19">6 0 2~06 ФИТОГОРМОНЫ ЦК АБК 572 77 2274 58 - гк 39 965 (.СККЦИН 14960 23 264 2S09 6027 39 - 186 764 439 2^8 Сечектшные условия и юрчоналъный баланс меток с\спешио}той кучьтуры картофеля Изучен гормональный баланс суспензионных кутьтур картофсчя двух сортов - Удача и Невский, культивируемых на питатечьнык средах ^ содержанием КФ патогена 10, 30 и 40%, а также на средах не содержащих сечективный фактор (контроль) Исследования выявичи существенные разчичия по содержанию эндогенных гормонов в клетках суспензии (Табл 8) В вариантах, где юльтуральная жидкость патогена оказывала стимулирующий эффект (Юо/о для «.орта Удача и 30% дтя сорта Невский), содержание ИУК и цитокининов было выше, а уровень АБК быт на уровне или ниже контрогя С увечичением концентрации сепективного фактора в среде выше оптимальной, дтя каждого из сортов, снижался уровень гормоновстимчтяторов - ИУК ЦК ГК и значитечьно уветичивался уровень гормона-ингибитора - АБК, что говорит о сильном стрессовом воздействии КФ патогена данных концентраций и ускоренном процессе старения кчеток Уситение защитных реакций растений может происходить, например, за t-чет накопления и оттажения тагнина в местах внедрения патогена Цлтокинины способны усиливать лигнификацию клеточных стенок, что детает растительную ткань менее доступной дтя экзометаболитов патогенов Можно предположить что повышенное содержание цитокининов в клетках, возможно, ведет к некоторому механическому укрепчению клеточных стенок, что девает их более устойчивыми к проникновению патогена или его токсинов Повышение устойчивости растений к фитопатогенам также связано и со стабилизацией баланса ИУК/АБК и увечичением содержания ЦК (Ярутина, Максимов, 1999) Такое соотношение фитогормонов приводит, вероятно, к активации обмена веществ в растении, в результате чего в инфицированных тканях происходит интенсивное накоптение тишина, приводящее к токализации патогена и подавлению его развития 37 Таблица 8 Содержание фитогормоиов (мкг/г сухой массы) в суспензионной культуре картофеля, культивируемой в стандартных и стрессовых условиях, I пассаж. Сорт УДАЧА Конц. КФ патогена, % Контроль 10 30 40 НЕВСКИЙ Контроль 10 30 40 ФИТОГОРМОНЫ ЦК ИУК 1,05 0,81 0,69 0,20 0,23 0,33 0,50 0,22 5.47 12,24 6,25 2,52 2,41 2,12 11,15 2,84 ПС 1,98 0.83 1,45 2,93 2,10 1,88 1,34 2,10 АБК 0,36 0,35 1,68 3,70 1,78 0,66 1,39 2,47 Данные свидетельствуют о том, что соотношение ИУК/АБК в клетках суспензионных культур таких сортов как Дезире и Жуковский ранний, культивируемых в стрессовых условиях (табл. 9) на протяжении восьми пассажей, величина постоянная. Для сорта Дезире она составляет 2,6-2,69, а для сорта Жуковский ранний - 0,38-0,43. Для остальных исследуемых сортов это соотношение не являлось величиной постоянной. Для сорта Удача оно изменялось от 0,22 до 0,10, а для сорта Невский - от 0,35 до 0,15. Низкая устойчивость клеточных суспензий этих сортов к стрессовому фактору была обнаружена нами в более ранних исследованиях. Следует отметить, что в контрольном варианте соотношение ИУК/АБК было стабильным у сортов Дезире и Жуковский ранний при культивировании суспензионных культур на протяжении восьми пассажей, а для сортов Удача и Невский оно уменьшалось к VII пассажу за счет резкого увеличения уровня АБК в культуре (сорт Удача) и снижающегося уровня ИУК (сорт Невский). Более того, значительное увеличение уровня АБК в суспензионной культуре сорта Удача привело к быстрому их старению и гибели культуры. Установлены некоторые закономерности по содержанию эндогенного цитокинина в клетках суспензионных культур, культивируемых в стандартных и стрессовых условиях. Так, для клеток, находящихся в стандартных условиях характерно уменьшение, а для клеток, находящихся в стрессовых условиях - увеличение содержания цитокининов, особенно значительное - в культурах клеток сорта Дезире и Жуковский ранний. 38 Таблица 9 Содержание фитогормонов ( мкг/г cvxoii массы) в суспензионной культуре различных i еношпов картофе ш Сорт Л» пассажа Ф II Т О Г О Р М О I I Ы ИУК ЦК ГК ' АБК i стандартные условия культивирования I 105 \ 5 48 1 98 0 «6 8 73 1 00 УД \ЧЛ П. 0 40 VIII 0 14 1 05 0 48 1 18 0 33 I IV 0 42 1 13 1 93 ДЕЗИРЕ VIII 0 99 2 Ь4 0 40 I 0 22 2 41 2 10 IV 13 64 0 72 6 0"> НЬВСКИИ VIII 0 58 136 14-4 I 061 ЖУКОЧС 5 23 1 77 IV 0 43 4 40 КИЙ 128 Р\ННИЙ VIII 0 37 1 04 431 стрессовые vc ювия KVjih гинировапия I 0 76 I 416 2* IV >Д,ЧА 0 21 2 93 1Ч VIII 1 I 3 88 1 17 0 86 3 4J> IV 1 53 041 ДЬЗИРЕ 4 7й VIII 1 72 ОЗэ I 0 4) 1 J4 11 15 IV 0 2S 6 6» 1 б< НЕВСКИЙ 0 *"• VIII 4 94 141 I 0 6^ 10 64 0 " AVKOBC IV 0 68 КИИ 17 43 0 13 VIII РАННИЙ 0 4) 18 11 0 183 Примечание * к\ ibrvpa погибла , 0 36 0 54 0 3S 0 34 031 031 178 1 69 102 1 59 1 70 1 84 1 , 1 67 2 26 1 i 1 1 46 1 29 176 139 187 2 59 148 1 61 1 85 Таким образом, адаптация дедифференцированных ктеток и повышение четоичивооти растений-регенератов к действию экзометаболитов патогенных грибов, находится под контролем эндогенного содержания гормонов-стимутяторов, особенно цитокишшов и ауксинов, и их соотношения, что необходимо учитывать при проведении работ по селекции in vitro 7, Участие фенольных соединений в адаптации клеточных культур т \itro к действию экзометаболитов патшенных грибов. Влияние экзометаболитов гриба Alternaria radioing на образование фенольных соединений в суспензионных культурах и растенияхуегенерантах различных генотипов моркови. Объектом исследования служили 20-дневные проростки, суспензионные культуры и растениярегенеранты 2-х генотипов моркови сорта Rondo и линии 906. Установлено, что у изучаемых генотипов ответная реакция интактных растений (20-дневные проростки) на действие стресс-фактора (100% КФ патогена A. radicina) различна. Установлено, что в контрольном варианте наибольшее содержание фенольных соединений отмечено у 20-ти дневных проростков сорта Rondo, в то время как для линии 906 в этом варианте их количество было на 40% ниже. Проростки, культивируемые на среде, содержащей 100% КФ патогена, характеризовались более высоким уровнем фенольных соединений по сравнению с условиями культивирования контрольного варианта. Причем для линии 906 их количество повышалось в стрессовых условиях на 50%, в то время как для сорта Rondo - лишь на 12%. Можно предположить, что для линии 906 действие КФ патогена приводит к «запуску» повышенной программируемой защитной реакции, проявляющейся в увеличении синтеза фенольных соединений. Для сорта Rondo, вероятно, уровень фенольных соединений в клетках настолько велик, что действие КФ патогена не приводит к значительным его изменениям. Это свидетельствует о том, что растения данного сорта потенциально способны выдерживать действие высоких концентраций стресс-фактора. Суммарное содержание фенольных соединений определяли в клеточных суспензиях в динамике на I, IV и VIII пассажах селекции и в контрольном варианте. Как следует из данных, представленных на рисунке 8, на I пассаже содержание фенольных соединений в контрольном варианте сорта Rondo выше на 25% по сравнению с линией 906. Последующее культивирование клеточных суспензий в контрольном варианте не приводило к существенным изменениям количественного содержания фенольных соединений. Это свидетельствует о том, что при длительном культивировании клеток в стандартных условиях не наблюдается изменений в фенольном метаболизме. Присутствие КФ патогена в питательной среде в различных концентрациях приводило на I пассаже к уменьшению синтеза фенольных соединений в среднем на 10-12% по сравнению с контролем. Причем для линии 906 воздействие селективного фактора (50% КФ) существенно повлияло на снижение их количественного содержания (на 42%). В процессе культивирования суспензионных культур на селективных средах, способность клеток к синтезу фенольных соединений изменяется. В одних вариантах она постоянно 40 растет (50% КФ для сорта Rondo, 300/о КФ для линии 906) в других относительно стабильна (30% КФ д ш сорта Rondo, 50% КФ для линии 906) Результаты свидетечьствуют о разной чувствительности клеток суспензий к действию стрессового фактора, что, возможно, проявляется и в разтичных механизмах устойчивости ктеток к экзометаболитам патогена А Qконтр a so"» в 1-1 Рис 8 СЧмчарное содержание растворимых фенольных сосшненпй в ел спе1иионной культуре моркови, культивируемой в стандартных и стрессовых УСЛОВИЯХ (присутствие КФ патогена Л radicina) А- сорт Rondo, В .шипя 906 У растений-регенерантов, полученных после культивирования клеток на селективных средах, уровень фенольных соединений в 1,5 - 2 раза выше по сравнению с растениями контрольного варианта. Причем для растений сорта Rondo их количественное содержание превышает таковой растений линии 906 (Рис. 9). Эти результаты полностью согласуются с данными, полученными нами ранее с 20-дневными проростками и клеточными суспензиями и доказывают зависимость фенольного метаболизма от генотипических особенностей исследуемых образцов. Одномерная хроматография показала, что у растений-регенерантов, полученных после селекции in vitro, количество фенольных соединений возрастает, вероятно, за счет изменения их качественного состава. результате селекции Рис. 9 Суммарное содержание растворимых фенольных соединений в растениях-регенерантах, полученных в контрольном варианте и после культивирования клеток на селективных средах. Влияние экзометаболитов гриба Rhizoctonia solani на образование фенольных соединений в суспензионных культурах различных генотипов картофеля. Объектом исследования служили суспензионные культуры картофеля, полученные из сегментов междоузлий пробирочных растений четырех сортов - Жуковский ранний, Удача, Невский, Дезире. Клетки культивировали на стандартных питательных средах и средах, содержащих селективный фактор. Исследована зависимость накопления растворимых фенольных соединений в клетках суспензионных культур от условий культивирования и генотипа. Показано, что в контрольном варианте наибольшее содержание фенольных соединений характерно для суспензии сорта Удача (Рис. 10), для сорта Дезире их количество было на 20% ниже. Наименьшее 42 накопление этих вешеств отмечено у суспензий сортов Невский и Жуковский ранний, которые по этому показателю бтизки друг к другу Следовательно различные генотипы картофетя отличались по способности к синтезу феночьных соединений Что касается суспензионных кутьтур культивируемых на детективных средах, то уровень фенольных соединений у них отличался от такового контрольных вариантов У суспензий сортов Невский и Удача содержание феночьных соединений в процессе селекции значитечьно снижалось (вдовое по сравнению с контролем), что в большинстве счучаев коррелировало с потерей жизнеспособности клеток Очевидно ослабление способности кучьгур к образованию фенольных соединений является причиной гибели клеток Известно, что фенольные соединения участвуют в иммунитете растений (Запрометов, 1993) Исходя из этого можно предположить, что их отсутствие или низкое содержание не позволяют клеткам суспензионных культур справляться с негативным воздействием на ник чкзочетабочитов гриба Пос кдние в ряде стучаев могут sanyекать программируемую шбель клеток (апоптоз), обус1ов1енн\ю в частности действием фенолкарбоновыч кис ют (Тарчевский, 2002) • основная соеда • основная среда • КФ Рис 10 Изменения в содержании фенольных соединений у суспензионных к\льтур различных генотипов картофеля при воздействии КФ (30%) Дчя других генотипов картофеля (Дезире и Жуковский ранний) экзометабо шты гриба способствовали большему накоплению феночьных соединений в клетках (на 30% и 60%) по сравнению с контрочем Это сопровождалось не только сохранением жизнеспособности суспензионных кучьтур, но и даже ее повышением Для генотипа Дезире отмечено накопление и отложение лигнина в клетках суспензионных культур. Это свидетельствует о том, что для них под влиянием экзометаболитов гриба R. solani интенсивность синтеза фенольных соединений значительно возрастала. Таким образом, в процессах адаптации клеток in vitro к действию селективного фактора участвуют фенольные соединения, синтез которых усиливается в устойчивых клетках и растениях-регенерантах и зависит от генотипических особенностей исследуемых объектов и условий их культивирования. Глава 8. RAPD анализ ДНК каллусиых культур и растенийрегенерантов пшеницы, полученных методами клеточной селекции. ДНК полиморфизм каллусной ткани пшеницы, культивируемой в стандартных и стрессовых условиях. Для RAPD анализа тотальная ДНК была выделена из каллусной ткани, культивируемой в стандартных и стрессовых условиях. Для исследований была отобрана каллусная ткань, находящаяся на разных этапах селекции: начало (I пассаж), середина (IV пассаж) и конец (VIII пассаж). Установлено, что каждый из исследуемых образцов контрольного и опытного вариантов (I пассаж) имели определенный спектр амплифицируемых Л^/"£)-продуктов, не отличающихся друг от друга количеством фрагментов, их размером и степенью выраженности (мажорности). Однако в процессе культивирования каллусной ткани (IV пассаж) в стандартных и стрессовых условиях in vitro были отмечены общие фрагменты, а также блоки, состоящие из нескольких фрагментов. Кроме того было выявлено изменение RAPD спектра ДНК. Изменения обнаружены лишь для каллусной ткани, культивируемой на селективных средах. Дальнейшее культивирование каллусной ткани (VIII пассаж) в условиях in vitro привело к более выраженному полиморфизму ДНК ткани опытного варианта (присутствие в питательной среде КФ патогена). RAPD паттерн каллусной ткани, культивируемой на питательных средах содержащих селективный фактор, характеризовался как отсутствием ряда фрагментов, например, 1800 н.п., 850 н.п. (оба амплифицированы с праймером OPD14), 900 и 930 н.п., а также ряда минорных фрагментов (с праймером OPD6), которые присутствовали в RAPD спектрах ДНК, экстрагированной из каллусной ткани, полученной в стандартных условиях культивирования, так и присутствием новых фрагментов 330 п.н., 440 п.н. (праймер ОРА15), 800 п.н. и 250 п.н. (праймер OPD6), 1200 п.н. (праймер OPD14). Результаты исследований, вероятно, не могут связывать напрямую наличие или отсутствие полосы спектра в 44 каллусной ткани полученной в разных условиях культивирования, но отражают на молекулярном уровне их различия Помимо мочекулярного анализа различных типов калтуса пшеницы, представляло интерес сравнить RAPD спектры растений-регенерантов различных сортов пшеницы контрольного варианта Установлено, что подавляющее чисто амплифицированных фрагментов были мономорфны, то есть присутствовали в RAPD спектрах всех анализируемых растений-регенерантов Однако, при амплификации с гграймерами OPD3, ОРА15 и OPD14 в спектрах регенерантов детектировались полиморфные фрагменты ДНК Полученные нами результаты по RAPD анализу изменений, возникающих в ДНК регенерантах пшеницы, совпадают с данными других авторов о геномном по шморфизме морфотогически не различимых сомаклонов риса, гороха, пшеницы, сахарной свеклы и ряда древесных культур RAPD анализ растеннй-регеньрантов пшенииы, полученных посче клеточной селекции При RAPD анализе растений-регенерантов пшеницы полученных в результате действия ку льт\ рального фичьтрата пагогена уровень детектируемого полиморфизма ДНК регенератов пшеницы значительно повышался Из 81 RAPD фрагментов, амптифици|308анных при использовании праймеров OPD14 OPD3, ОРА15 и OPD6, 5 были полиморфными, то есть присутствовали не во всех спектрач анализируемых растений Следует отметить, что наиболее полиморфными бы™ RAPD спектры растении сорта Московская 35 По мнению ряда исследователей, появление новых, отсутствующих в родительских линиях, ампликонов у регенерантов связано с тем, что в геноме растений есть специфические районы, предрасположенные к мутациям, которые возникают в ответ на условия культивирования и приводят к формированию различных клонов в культуре in \itro (Bohanec Jakse lhan Jovorik 1995 Al-Zahim Fold Lloyd Nembury 1999) Ранее в работах Богани был проведен RAPD анализа уровня полиморфизма у длительно культивируемых суспензионных линий и различных сомаклонов томата, полученных при регенерации их на средах с различным содержанием фитогормонов, а также в присутствии стрессового фактора Был показан высокий уровень изменений как непосредственно в нуклеотидной последовательности, так и в уровне метилирования ДНК, возникающий в культуре клеток и у растенийрегенерантов томата {Bogam и я/ 1995,1996) Таким образом, культивирование каллусных клеток на селективных средах in vitro приводит к формированию гетерогенной ткани, способной реализовывать морфогенетическии потенциал в виде сомаклональных вариантов Для них характерно появление отдельных признаков, которые закрепляются на генетическом уровне. Методами молекулярного маркирования эти изменения легко установить и доказать их наличие по появившимся фрагментам ДНК, нехарактерным для контрольных образцов. Заключение Современная биотехнология охватывает широкий круг методов, среди которых центральное место занимает генетическая и клеточная инженерия. Данные исследования направлены на создание генетически модифицированных объектов, широко используемых в различных областях науки и производства. Клеточная биотехнология позволяет значительно расширить спектр генетического разнообразия; получать формы растений, обладающих повышенной устойчивостью к абиотическим и биотическим факторам окружающей среды; сократить сроки проведения селекции. Однако в этом направлении исследований существуют острые проблемы, и в частности, недостаточная регенерационная способность культивируемых клеток и отсутствие эффективных методов отбора in vitro устойчивых к заболеваниям регенератов, особенно с комплексной устойчивостью к нескольким патогенам. Поэтому поиск методов, повышающих морфогенетическую активность клеток in vitro и разработка нетрадиционных селективных систем являются актуальными проблемами. Разработанные и предложенные в диссертации схемы и методы клеточной селекции, позволяют получать формы растений пшеницы, моркови и картофеля, обладающих повышенной устойчивостью к действию фитопатогенных грибов. Применение предлагаемых технологий для других сельскохозяйственных растений возможно лишь после дополнительного проведения экспериментов с ними с учетом видовых и сортовых особенностей клеток; типа и возраста первичного экспланта; продолжительности культивирования клеток в условиях in vitro и компонентов питательной среды. Экспериментально доказано, что в устойчивых каллусных линиях и растениях-регенерантах усиливается синтез эндогенных гормонов, особенно гормонов, обладающих стимулирующим эффектом, и фенольных соединений, которые могут приводить к изменениям экспрессии генов; появлению неспецифических белков, синтезу ферментов, укреплению клеточной стенки и др. Признак повышенной устойчивости может быть обусловлен генетическими изменениями на уровне ДНК. Наши исследования показали, что в клеточных культурах, культивируемых на селективных средах с использованием 46 кульгуральной жидкости патогенов, происходят изменения в нуклетотидных последовательностях, что является свидетельством генетических изменений Таким образом, результаты работы подтверждают перспективность использования методов клеточной селекции для создания устойчивых к болезням форм растений В то же время, надо иметь ввиду, что предложенные схемы и методы не обеспечивают 100%-ного получения более устойчивых форм, а -шшь способствуют отбору популяции, обогашенной потенциально устойчивыми растениями Выводы 1 Впервые для пшеницы, моркови и картофеля разработана схема и методы тканевой и клеточной селекции, позволяющие получать формы растений, обладающие повышенной устойчивостью к фитопатогенным грибам Septona nodorum Alternaria radictna RfuzoctonM solani, соответственно Основой метода является культивирование каллусных и суспензионных клеточных кучьгур на питательных средах, содержащих токсичный селективный фактор культуральный фильтрат патогена (КФ) 2 Фитотоксичность экзометаоолитов возбудителей болезней в условиях in vitro в значительной мере зависит от состава и соотношения инградиентов питательной среды При выращивании изолятов гриба в жидкой питательной среде Чапека фитотоксичность экзометаоолитов в 5-7 раз превышает этот показатель, полученный при культивировании патогена на среде Мурасига и Скуга 3 Ку 1Ыуральный фильтрат патогенов {Septona nodorum iltemana radicmu Rhizocionia solani) в концентрациях 10-20% оказывает стимулир'ующее влияние на рост интактных растений и клеток каллусных и суспензионных культур (пшеница, морковь, картофель) При более высоких концентрациях он оказывает на них ингибируюшее действие Оптимальный эффект в селекции т \itro достигается на каллу<,ной ткани пшеницы при 20%-ом КФ St.ptona nodorum, на суспензионной культуре моркови при 30-50%-ом КФ Alternana radicma на каллусной и суспензионной культурах картофеля при 30-40%-ом КФ Rhizoctoma solani 4 Растения-регенеранты, полученные на селективных средах с указанным содержанием КФ, обладают повышенной устойчивостью (на 10-35%) к действию патогенов по сравнению с регенерантами контрольного варианта Для отдельных генотипов (сорт Rondo) устойчивость повышается до 50% 5. Выявлены существенные различия в содержании эндогенных гормонов в клетках суспензий моркови и картофеля, длительно культивируемых на контрольных и селективных средах. Адаптация клеток к селективному фактору сопровождается повышением уровня цитокининов и ИУК. У растений-регенерантов моркови, полученных из клеток, отселектированных на питательных средах с КФ, происходит значительное повышение ауксинов (в 2 раза), цитокининов (в 4-20 раз) и гиббереллинов (в 3-12 раз) по сравнению с контрольным вариантом. 6. Выявлено положительное влияние фенольных соединений на адаптацию клеток к действию селективного фактора. Они в большем количестве накапливаются в клетках, устойчивых к действию селективного фактора. Значительная роль в этом процессе принадлежит фенольному полимеру лигнину, ограничивающему проникновение культурального фильтрата патогена в клетки. 7. В клеточных культурах, выращенных на селективных. средах с использованием КФ патогенов происходят изменения в нуклеотидных последовательностях, выявленные RAPD методом. Для устойчивых каллусных культур и растений-регенерантов, полученных в результате клеточной селекции, RAPD спектры ДНК отличались отсутствием или наличием новых фрагментов размером от 330 п.н. до 1200 п.н., которые не были характерны для RAPD спектров ДНК контрольного варианта, что является доказательством, возникающих в опытных вариантах изучаемых объектов, генетических изменений. 8. Предлагаемая схема и методы клеточной селекции растений на основе отбора адаптированных клеток на селективных средах и получения из них растений-регенерантов с повышенной устойчивостью к опасным грибным болезням ffpc/ : ограниченном) применения трансгенных технологий являются существенным дополнением к ней для получения измененных форм растений с указанными признаками и свойствами. 9. Процессы каллусогенеза, пролиферации и морфогенеза, выработанные и генетически закрепленные у растений в ' УО^с. эволюции, является закономерной ответной реакцией на нарушение целостности многоклеточного растительного организма, а степень их реверсии характеризует величину важнейшего свойства клетки - их тотипотентности. 48 Слисок опубликованных работ Учебно-методическая литература 1 Сельскохозяйственная биотехнология Учебное пособие, VI, МСХА, 1995, с 310 (иод редакцией академика РАСХН В С Шевелухи, в соавторстве Дегтярев С В , Артамонова Г М и др ) 2 Сельскохозяйственная биотехнология Учебник, М Высшая школа, 1998, 416 с ( под редакцией академика РАСХН В С Шевелухи, в соавторстве Дегтярев С В , Ковалев В VI и др ) 3 Получение посадочного материала древесных, цветочных и травянистых растений с использованием методов клеточной и генной инженерии Учебное пособие Издание 2, испр и доп, М -МГУЛ, 2001, 73 с ( в соавторстве Родин А Р ) 4 Сельскохозяйственная биотехнология Учебник, М Высшая школа, 2003, с 470 (под редакцией академика РАСХН В С Шеветухи, в соавторстве Воронин Е С , Ковалев В М и др ) Основная литература 5 Методы KVibTvpbi тканей перспектилы использования // Лесное хозяйство, 1495, -N» 3, с 9-11 (в соавторстве Родин А Р ) о Использование методов биотехнологии в селекции пшеницы на устойчивость к септориозу / Тез конф «Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», 1996, с 22 ( в соавторстве Джое Л ) 7 Влияние гриба Septoria nodorum и его метаболитов на прорастание семян пшеницы '/ Известия ТСХА, 1996, вып 4, с 1-7 ( в соавторстве Джое Л ) 8 Клеточная селекция моркови на устойчивость к альтернариоэу // TeJ I Междунар конф «Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, 1996, с 47 ( в соавторстве Намбудри Н , Раскалиева В А ) 9 Использование методов биотехнологии в клеточной селекции моркови на усюйчивость к альтернариозу // Известия ТСХА, 1996, вып 4, с 163-165 ( в соавторстве Намбудри Н , Раскалиева В А ) 10 Влияние гормонального состава питательной среды на морфогенез пшеницы // Тез докл IV Международной конф «Регуляторы роста и развития растений», Москва, 1997, с 304 ( в соавторстве Джое Л ) 11 Изучение морфогенетической активности изолированных листовых эксплантов пшеницы в условиях ш vitro 'Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда Тез Докладов VII Междунар конф , Москва, 1997, с 147 ( в соавторстве Пиллай Р, Джое Л) 12. Клеточная селекция пшеницы на устойчивость к септориозу. // Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда: Тез. Докладов VII Междунар. конф. 1997, с. 317. ( в соавторстве Джое Л.) 13. Utilization of biotechnological methods in selection of stability to Septoria. // Congress on «In vitro biology» USA, 1997. /Hot topics, p. 15. 14. Morfogenesis of cerrot in vitro. // Congress on «In vitro biology» USA, 1997./Hot topics, p. 17. 15. Состояние и перспективы развития информационных технологий в сельском хозяйстве. // Известия ТСХА, 1998, вып. 3, с. 36-42. ( в соавторстве Ковалев В.М., Белов Д.В.) 16. Разработка методов клеточной селекции пшеницы на устойчивость к Septoria nodorum. II Междунар. конф. «Молекулярная генетика и биотехнология», Минск, 1998, с. 221-222. ( в соавторстве Пиллай Р., Джое Л.) 17. Использование методов биотехнологии в селекции моркови на устойчивость к грибу Alternaria radicina. II Междунар. конф. «Молекулярная генетика и биотехнология», Минск, 1998, с. 251-252. ( в соавторстве Раскалиева В.А.) 18. Влияние генотипа и условий культивирования зародышей яровой пшеницы на процесс каллусогенеза и морфогенеза. // Известия ТСХА, 1998, вып. 3, с. 94-99. ( в соавторстве Джое Л.) 19. Cellular selection of wheat resistance to glume blotch disease. // Congress on «In vitro biology» USA, 1998. /Hot topics, p. 16. 20. Влияние 2,4-Д на каллусогенез эксплантов, изолированных из микроклубней картофеля в условиях in vitro. II Материалы Международной научно-практической конференции: Молодые ученые возрождению сельского хозяйства России в XXI веке. Брянск, 2-5 октября 2000, с. 22-24. (в соавторстве Вальдеррама А.) 21. Морфогенез в культуре первичного каллуса картофеля. // Материалы Международной научно-практической конференции: Молодые ученые возрождению сельского хозяйства России в XXI веке. Брянск, 2-5 октября 2000, с. 31-33. (в соавторстве Вальдеррама А.) 22. Влияние культурального фильтрата гриба Alternaria radicina на суспензионную культуру моркови.// Тез. II Междунар. конф. «Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, 2000, с.65. ( в соавторстве Раскалиева В.А.) 23. Целесообразность использования культурального фильтрата гриба Rhizoctonia solani в селекции картофеля на устойчивость к ризоктониозу.// Тез. II Междунар. конф. «Актуальные проблемы 50 биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, 2000, с 204-205 ( в соавторстве Вальдеррама А ) 24 Кчеточная сечекши пшеницы на устойчивость к септориозу // Сельскохозяйственная биотехнология Избранные труды Под редакцией Шевелухи В С, М Евразия ^-, 2000, т 1, с 16-21 ( в соавторстве Джое Л ) 25 Influence cultural filtraie ofjunî Alternaria radicina on cell suspension of carrots "Viet Sam «International Workshop on Biology» 2001 26 Влияние факторов гормональной и негормональной природы на морфогенетический потенциал интактных растений пшеницы и в культуре m vitro //Сельскохозяйственная биотехнология Избранные труды Под редакцией Шеветухи В С , М Евразия +, 2001, т 2, с 7180' 27 Использование метотов биотехнологии в почучении форм моркови, устойчивых к хтьтернариозу / Сельскохозяйственная биотехнология Избранные труды Под редакцией Шевелухи В С , М Евразия +, 2001 т 2, с 81-91 ( в соавторстве Раскалиева В А ) 28 Действие ме^бодитов гриба \ltemana radicina на рост суспензионной кутьтуры моркови '/ Труды IV Межд> народного симпозиума Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования М изд во РУДН, 2001, с 250-253 24 В таяние KV льтурального фильтрата гриба Alternaria radicina на рост суспензионной кутьгуры моркови 7 Доклады ТСХА, М МСХА, 2001, вып 273, с 28-32 ( в соавторстве Раскалиева В А ) 30 Влияние регуляторов роста на адвентивное побегообразование на корня картофеля в кучьтуре т \itro '/ Материалы Всероссийской научно-практической конференции Молодые ученые возрождению сечьского хозяйства России в XXI веке Санкт-Петербург 2001, с 1820 (в соавторстве Вальдеррама А ) 31 Влияние метаболитов гриба Rhizoctoma sotam на рост изочированных клеток и тканей картофечя in vitro li Материалы Всероссийской научно-практической конференции Молодые ученые возро/кдению сельского хозяйства России в XXI веке СанктПетербург 2001, с 50-52 (в соавторстве Нглен Тхи Ли Ань, Сысоева ВМ) 32 Влияние биологически активных вешеств и факторов физического воздействия на морфогенетический потенциал интактных растений пшеницы и в культуре т \ttro // Тез докл VI Международной конф «Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях», Москва, 2001,с 161 33 Влияние веществ цитокининовои активности на получение растений-регенерантов моркови после клеточной сетекции // Тез докл. VI Международной конф. «Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях», Москва, 2001, с. 162. ( в соавторстве Раскалиева В.А.) 34. Метод управления гормональным статусом интактных растений и изолированных органов при их культивировании in vivo - in vitro на основе воздействия энерго-информационным полем (ЭИП). // Материалы II Международной научно-практической конференции (3^ 6 декабря 2001 г., г. Горки), Горки:БГСХА, 2002, с. 185-189. ( в соавторстве Ковалев В.М., Белов Д.В., Сальникова Б.И.) 35. Растения-регенеранты, полученные после клеточной селекции моркови на устойчивость к Alternaria radicina M., Dr. et Е. II Научные труды ВНИИО (Овощеводство: состояние, проблемы, перспективы), 2002, т. 2, с. 95-99. 36. Адаптационная способность пробирочных растений, каллусных и суспензионных культур картофеля к стрессовым условиям культивирования. // Доклады ТСХА, М.: МСХА, 2002, вып. 274, с. 105-108. 37. Влияние вторичных метаболитов гриба Fusarium avenacium на рост каллусной ткани моркови. // Научные труды ВНИИО (Овощеводство: состояние, проблемы, перспективы), 2002, т. 2, с. 100-103 (в соавторстве Ипатова Н.В.) 38. Особенности морфогенеза картофеля in vitro при использовании цитокининов.// Сельскохозяйственная биология, 2002, № 1, с. 88-90. ( в соавторстве Ковалев В.М., Глушкова Т.Н.) 39. Получение растений-регенерантов после клеточной селекции моркови на устойчивость к патогенному грибу Alternaria radicina M., Dr. et E. II Биотехнология, 2003, № 2, с. 65-68. 40. Роль фитогормонов в адаптации клеток к биотическому стрессу в культуре in vitro.ll Физиология растений и экология на рубеже веков: Материалы Всероссийской научно-практической конференции / Яросл. гос. ун-т - Ярославль, 2003, с. 204. ( в соавторстве Карсункина Н.П., Скоробогатова И.В., Захарова Е.В.) 41. Морфофизиологические особенности клеточной селекции моркови на устойчивость к патогенам. // Селекция, семеноводство и биотехнология овощных и бахчевых культур : Доклады III Международной конференции, посвященной памяти Б.В. Квасникова, 2003, с. 212-215. 42. Влияние веществ с цитокининовой активностью и первичного экспланта на процесс регенерации растений моркови. // Селекция, семеноводство и биотехнология овощных и бахчевых культур : Доклады III Международной конференции, посвященной памяти Б.В. Квасникова, 2003, с. 513-514. ( в соавторстве Ипатова Н.В.) 52 43 Регуляторная роль фитогормонов при адаптации растительных клеток к стрессовым условиям т vitro //Аллоцитоплазматическая пшеница и некоторые аспекты биотехнологии растений / Под редакцией Рейес Матамороо Х М , М Компания Спутник + , 2003, с 84-00 ( в соавторстве Карсункина Н П , Скоробогатова И В , Захарова Е В ) 44 Особенности калл\согенеза листовых экстантон картофеля, культивируемых на среде с 2,4-Д in ънго h Ахлоцитоплазматическая пшеница и некоторые аспекты биогехнотогии растений / Под редакцией Реиес Матаморос Х М , М Компания Спутник +, 2003, с 66-73 ( в соавторстве Вальдеррама Ромеро А С , Чередниченко М Ю , Высоцкая VIВ , Рейес Матаморос X VI) 45 Морфо-фичиологические особенности пробирочных растений, калтусной ткани и суспензионной ку ьтуры картофетя, обусловленные действием экзометабопитов гриба RhizoUoma solani Ч Биотехнология, 2003, .4° 3, с 36-41 46 Влияние стрессовых условий культивирования на гормональный баланс клеток суспензионных ку гьтур и растений-регенерантов моркови ;' Биотехнология, 2003, .V« 4, с 51-56 ( соавторстве Карсу нкина Н П Скоробогатова И В , Захарова Е В ) 47 Биологические основы клеточной селекции растений // Доклады ТСХА, М МСХА, 2003, вып 275 , с 113-116 48 Клеточная селекция растений на устойчивость к биотическим факторам / Био гогия клеток растений т \то биотехнология Y сохранение генофонда Гез Докладов VIII VteacTv нар конф 2003 ( 913 сентября, Саратов) 53 Объем 3,25 п.л. Зак. 438 АНО «Издательство МСХА» 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44 Тираж 100 экз.

На правах рукописи КАЛАШНИКОВА Елена Анатольевна

Related documents

Products

Support

На правах рукописи КАЛАШНИКОВА Елена Анатольевна

Related documents

Add this document to collection(s)

Add this document to saved

Suggest us how to improve StudyLib