повышение эффективности опыления капусты

ТЕОРИЯ И ПРАКТИКА СЕЛЕКЦИИ И СЕМЕНОВОДСТВА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ КУЛЬТУР
УДК 635.342:581.162.3
ПОВЫШЕНИЕ
ЭФФЕКТИВНОСТИ
ОПЫЛЕНИЯ
КАПУСТЫ
БЕЛОКОЧАННОЙ
В СЛУЧАЕ НИЗКОЙ
ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ
ПЫЛЬЦЫ
Шумилина Д.В. – кандидат биол. наук, с.н.с. лаб. биотехнологии
Батманова А.И. – м.н.с. лаб. селекции и семеноводства капустных культур
Шмыкова Н.А. – доктор с.2х. наук, зав. лаб. биотехнологии
Бондарева Л.Л. – доктор с.2х. наук, зав. лаб. селекции и семеноводства капустных культур
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Всероссийский научно2
исследовательский институт селекции и семеноводства овощных культур» (ФГБНУ
ВНИИССОК)
143080, Россия, Московская обл., Одинцовский р2н, п. ВНИИССОК, ул. Селекционная, д.14
E2mail: dasha2409@yandex.ru
Тел. +7(916)8832545
В статье отражены результаты исследований по разработке способа повышения эф,
фективности опыления капусты белокочанной в случае низкой жизнеспособности
пыльцы. Подобрана оптимальная питательная среда для проращивания пыльцы ка,
пусты белокочанной, содержащая Трис, поддерживающий значение рН 8,9, и предложе,
но наносить пыльцу на рыльце пестика в виде суспензии в этой среде. Использование
такого приема позволило получить семена у удвоенных гаплоидных растений с час,
тично стерильной пыльцой.
Ключевые слова: капуста белокочанная, гаплоиды, опыление, жизнеспособность пыльцы, пи2
тательные среды для проращивания пыльцы.
Введение
ционера с удвоенными гаплоидами, по$
ставляющих как самосовместимость,
Р
епродукция растительного ма$
лученными в культуре микроспор. Как
фертильность растения, в частности
териала является центральным
правило, в результате индукции андро$
наличие большого количества зрелой
вопросом селекции. Генетики, селек$
генного эмбриогенеза из каждой мик$
пыльцы в пыльниках на момент их от$
ционеры и семеноводы используют по$
роспоры получается одно растение –
крытия, и жизнеспособность пыльцы,
ловую и вегетативную репродукцию на
регенерант. Поскольку для селекцион$
способность прорастать на рыльце пе$
различных этапах селекционного про$
ной работы необходимо иметь большее
стика.
цесса, включая создание исходного ма$
количество индивидуальных растений,
Довольно часто у капустных культур,
териала, отбор, поддержание и раз$
первым этапом становится самоопыле$
в частности у капусты белокочанной,
множение перспективного сортолиней$
ние растений$регенерантов для полу$
наблюдается самонесовместимость.
ного материала (Бунин, 2003). Размно$
чения семенного потомства – так назы$
Как правило, при необходимости само$
жение ценного материала является од$
ваемой линии. Успешность самоопыле$
опыления таких растений селекционе$
ной из первых задач при работе селек$
ния растений складывается из таких со$
ры применяют методику опыления в бу$
научнопрактический
журнал
[ 10 ]
овощи
россии
№ 4 (25) 2014
THEORY AND PRACTICE OF CROPS BREEDING AND SEED PRODUCTION
тонах, то есть пыльцу с раскрывшихся
зависимости от вида или разновиднос$
окрашивания (Alexander, 1969). Пыль$
цветков наносят на рыльце пестиков
ти, но и от конкретных условий произ$
ник отделяли от полностью раскрывше$
нераскрывшихся бутонов.
растания исследуемого растения.
гося цветка и помещали в каплю краси$
Фертильность растений зависит от
Для определения жизнеспособности
теля, препаровальными иглами вскры$
условий внешней среды и возраста
пыльцы у разных видов рода Brassica
вали пыльник и добивались максималь$
растений. Неблагоприятные почвенные
предложено несколько вариантов пита$
ного выхода пыльцевых зёрен, после
и климатические условия и старение
тельных сред, где одним из важных
чего стенки пыльника удаляли из пре$
растений увеличивают их стериль$
факторов является рН, определенный
парата и накрывали пыльцу покровным
ность.
уровень которого достигается с помо$
стеклом. Стерильная пыльца окраши$
Другим фактором, обеспечивающим
щью буферных смесей. Часто в таких
валась в зеленовато$голубой цвет,
нормальное оплодотворение и качест$
случаях используют трис$буфер (трис$
фертильная – от розового до интенсив$
во завязавшихся семян, является жиз$
гидроксиметиламинометан), который
но красного. Наблюдения проводили с
неспособность пыльцы (Френкель Р.,
обеспечивает подщелачивание среды,
помощью микроскопа Axio Imager А2
1982). Накопленные данные показыва$
необходимое для проращивания пыль$
(Zeiss, Германия).
ют, что на жизнеспособность и качест$
цы растений рода Brassica (Лях, 2000;
во пыльцы оказывают влияние такие
Matsubara, 1999).
Подбор сред для проращивания
пыльцы. Сбор пыльцы проводили с не$
факторы среды, как влажность, темпе$
Целью данного исследования явля$
давно раскрывшихся цветков капусты
ратура, состав атмосферы (Stanley,
лось повышение эффективности опы$
белокочанной сорта Зимовка 1474 в пе$
Linskens, 1974). Жизнеспособность
ления капусты белокочанной в случае
риод массового цветения. Для опреде$
пыльцы снижается у растений, постра$
низкой жизнеспособности пыльцы. Для
ления жизнеспособности пыльцы на
давших от засухи, обезвоживания, теп$
этого решалась задача подбора опти$
предметное стекло наносили пипеткой
лового стресса и УФ$излучения (Bots,
мальной питательной среды для прора$
несколько капель питательной среды.
Mariani, 2005). Показатели жизнеспо$
щивания пыльцы и способа нанесения
Свежесобранную пыльцу при помощи
собности пыльцы имеют решающее
суспензии пыльцы на рыльце пестика.
пинцета равномерно распределяли на
поверхности среды. В опыте использо$
значение для прогнозирования качест$
ва семенной продукции и при проведе$
Материалы и методы
вали четыре варианта сред: Т, Т+, 8, 8+
нии работ по гибридизации самонесов$
исследований
(табл.1). В двух вариантах сред (Т+ и 8+)
местимых растений. Большое значение
Объект исследований. Объектом ис$
использовали экстракт пестиков цвет$
для селекционера имеет возможность
следований служили растения капусты
ков капусты белокочанной сорта Слава
предварительного определения степе$
белокочанной сортов Зимовка 1474,
грибовская 231. Выбор сорта для полу$
ни жизнеспособности используемой в
Слава грибовская 231, созданных в ла$
чения экстракта был обусловлен пока$
его работе пыльцы.
боратории селекции и семеноводства
занной ранее совместимостью сортов
Существует несколько методов оп$
капустных культур ФГБНУ ВНИИССОК,
Слава грибовская 231 и Зимовка 1474
ределения жизнеспособности пыльцы
и девять растений удвоенных гаплои$
при перекрёстном опылении. Экстракт
в лабораторных условиях, наиболее
дов, полученных методом изолирован$
готовили путём растирания 1 пестика в
распространенным из которых являет$
ных микроспор в лаборатории биотех$
1 мл воды и последующим цетрифуги$
ся проращивание пыльцы на искус$
нологии ФГБНУ ВНИИССОК. Растения
рованием с целью удаления осадка. К
ственных питательных средах in vitro
выращивали в климатической камере
20 мкл среды добавляли 1 мкл экстрак$
(Бунин, 2003). Основными компонента$
при режиме 15°С круглосуточно, 16 ч
та. Предметные стекла с пыльцой в пи$
ми таких питательных сред являются
день/8 ч ночь. Затем растения были вы$
тательной среде помещали в увлажнен$
сахароза, борная кислота, хлорид каль$
сажены в пленочную теплицу и осенью
ные чашки Петри и оставляли в термо$
ция или нитрат кальция, сульфат ма$
в фазе «20$25 настоящих листьев» пе$
стате на 2 часа при t=22°С для проращи$
гния, нитрат калия (Чеботарь и др.
ресажены в вегетационные сосуды
вания. Далее к среде с проросшей
1987; Важнецкая, 1965; Балашова и др.,
объемом 5 литров, которые в зимний
пыльцой добавляли несколько капель
1995; Степанов и др., 2000; Лях и др.,
период были помещены на яровизацию
дифференцирующего красителя и на$
2000; Matsubara et al., 1999). Для роста
при t= 3…5°С. В весенне$летний период
крывали покровным стеклом. В каждом
пыльцевых трубок некоторых растений
следующего года растения выращива$
препарате анализировали не менее 10
в состав искусственной питательной
ли в пленочной теплице для получения
полей зрения (увеличение 100х), под$
среды вводят экстракт из рыльца пес$
семенников.
считывали общее число пыльцевых зе$
тика. Подбор универсальной среды для
Определение фертильности расте$
рен и число проросших. Проросшими
проращивания пыльцы является за$
ний. Фертильность растений устанав$
считали пыльцевые зерна, трубки кото$
труднительным, поскольку требования
ливали путем окрашивания пыльцевых
рых по длине превышали диаметр
пыльцы к среде изменяются не только в
зерен методом дифференциального
пыльцевого зерна. Жизнеспособность
научнопрактический
журнал
[ 11 ]
овощи
россии
№ 4 (25) 2014
ТЕОРИЯ И ПРАКТИКА СЕЛЕКЦИИ И СЕМЕНОВОДСТВА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ КУЛЬТУР
1. Искусственные среды для проращивания пыльцевых зёрен капусты белокочанной
Среда Т*
Среда Т+
Среда 8**
Среда 8+
Сахароза, г
20
20
20
20
Бор, мг
1
1
10
10
Нитрат кальция, мг
$
$
10
10
Состав среды
Нитрат калия, мг
10
10
$
$
36,2
36,2
$
$
рН
от 8 до 9
от 8 до 9
8
8
Трис, мг
6,7$13,3
6,7$13,3
$
$
Хлорид кальция x 6 H2O, г
Экстракт из пестика, сорт Слава
Вода, мл
$
+
$
+
100
100
100
100
* Roberts I. N. et al, 1983.
**Бунин М.С. и др., 2003
пыльцы определяли путем вычисления
В таблице 2 и рисунке 2 данные пред$
Для того чтобы получить семенное
процента проросших пыльцевых зерен
ставлены в формате М ± tm, где M –
потомство, необходимо было подо$
по отношению к общему количеству
среднее арифметическое, t – критерий
брать питательную среду для проращи$
пыльцевых зерен (Бунин, 2003).
Стъюдента, m – ошибка среднего.
вания пыльцы, нанесение в которой
Опыление растений. Для проведения
пыльцевых зёрен на пестики нерас$
самоопыления опытных растений в про$
Результаты исследований и
крывшихся бутонов привело бы к завя$
бирку с 1 мл среды Т помещали пыльни$
их обсуждение
зыванию семян.
ки с раскрывшихся цветков удвоенных
Полученные ранее удвоенные гапло$
Из$за недостаточного количества
гаплоидов. Далее с помощью вольфра$
иды капусты белокочанной были выса$
пыльцы у растений удвоенных гаплои$
мового пестика проводили измельчение
жены в защищенный грунт с целью по$
дов опыты по подбору сред были про$
пыльников.
суспензию
лучения семенного потомства для
ведены на сорте Зимовка 1474, расте$
пыльцевых зёрен сразу переносили на
дальнейшей селекционной работы. В
ния которого, в числе других, были ис$
рыльца пестиков в нераскрывшихся бу$
летний период 2014 года были обнару$
пользованы в качестве родительских
тонах. Опыленные таким образом буто$
жены трудности при самоопылении
при получении удвоенных гаплоидов.
ны отмечались этикетками. Параллельно
этих растений: пыльники плохо раскры$
В результате анализа интенсивности
в качестве контроля проводили самоо$
вались и содержали малое количество
прорастания пыльцевых зерен капусты
пыление капусты белокочанной сорта
пыльцы.
белокочанной сорта Зимовка 1474 на
Полученную
Зимовка 1474 без использования среды.
При цитологическом анализе пыль$
различных средах, была выделена сре$
Статистическая обработка. Статис$
цевых зёрен методом дифференциаль$
да Т, на которой было зафиксировано
тическую обработку полученных дан$
ной окраски было показано, что содер$
наибольшее число проросших пыльце$
ных проводили в программе Microsoft
жание зрелых пыльцевых зерен в пыль$
вых зёрен – 17,46 % (рис.2). Мы пред$
Exсel 2003 при уровне значимости 0,05.
никах не превышает 10% (рис. 1).
полагаем, что положительное влияние
Пыльца удвоенных
гаплоидных растений
Жизнеспособные
пыльцевые зёрна
Стерильные
пыльцевые зерна
Рис. 1. Цитологический анализ пыльцевых зерен капусты белокочанной
научнопрактический
журнал
[ 12 ]
овощи
россии
№ 4 (25) 2014
THEORY AND PRACTICE OF CROPS BREEDING AND SEED PRODUCTION
на прорастание оказывает трис$буфер,
пыления девяти растений удвоенных
ей пыльцы в питательной среде Т завя$
обеспечивающий поддержание уровня
гаплоидов, у которых была отмечена
залось в среднем 7 семян на стручок.
рН (рис.3). Число пыльцевых зёрен,
низкая жизнеспособность пыльцы.
Несмотря на то, что завязываемость
проросших на среде 8, не содержащей
Растения удвоенных гаплоидов капу$
семян у удвоенных гаплоидов при ис$
буферного раствора, оказалось мини$
сты белокочанной с низкой жизнеспо$
пользовании среды Т оказалась мень$
мальным. Добавление экстракта пести$
собностью пыльцы были подвергнуты
шей по сравнению с контрольными
ка в состав среды 8 привело к некото$
самоопылению в бутонах. Через 2,5 ме$
растениями капусты белокочанной
рому увеличению доли проросшей
сяца был произведён сбор созревших
сорта Зимовка 1474, тем не менее, та$
пыльцы, однако разница между средой
семян в опыте и контроле. В контроль$
кое количество семян является доста$
с добавлением экстракта и без него бы$
ном варианте, при самоопылении рас$
точным для проведения дальнейшей
ла статистически не существенной. В то
тений сорта Зимовка1474, завязалось
селекционной работы.
же время, в среде, содержащей трис,
в среднем 23 семени на стручок (табл.
Таким образом, было показано, что
при добавлении экстракта пестика на$
2). В вариантах опыта, где опыление
использование среды Т для проращи$
блюдали существенное снижение спо$
удвоенных гаплоидных растений с низ$
вания пыльцевых зерен капусты бело$
собности пыльцы к прорастанию. В ре$
кой жизнеспособностью пыльцы про$
кочанной при самоопылении растений
зультате среда Т на основе трис$буфе$
водили без использования среды, за$
с низким содержанием жизнеспособ$
ра без экстракта пестика была выбрана
вязывания семян не происходило. Пос$
ной пыльцы является одним из спосо$
для проведения искусственного самоо$
ле опыления таких растений суспензи$
бов получения семенного потомства.
Рис.3. Прорастание пыльцы
капусты белокочанной сорта
Зимовка в среде Т
Рис. 2. Влияние различных сред на прорастание пыльцевых зёрен
капусты белокочанной сорта Зимовка 1474
Литература
1. Балашова Н.Н., Игнатов А.Н., Самохвалов А.Н., Рогачев Ю.Б., Шмыкова Н.А. Жизнеспособность микрогаметофита бело$
кочанной капусты под влиянием возбудителей бактериозов и килы // С.$х. биология. – 1995, № 5. – С. 115$118.
2. Бунин М.С., Шмыкова Н.А. Степанов В.И., Старцев В.И., Бондарева Л.Л. Методы репродуктивной биологии в селекции
овощных культур рода Brassica L.//Методические рекомендации. ВНИИССОК. – Москва, 2003.
3. Важнецкая Е.Р. Некоторые особенности биологии брюквы и репы в связи с межвидовой гибридизацией. Автореф. дис.
канд. с.$х. наук. – Л, 1965.
4. Лях В.А., Сорока А.И., Мищенко Л.Ю. Калинова М.Г., Мирошниченко Е.Н. Методы отбора ценных генотипов на уровне
пыльцы. // Методические рекомендации. Ин$т масличных культур Укр. Академии аграрных наук. – Запорожье, 2000.
5. Степанов В.А., Бунин М.С., Балашова Н.Н. Методические указания по селекции репы японской на холодостойкость с ис$
пользованием микрогаметофита. // Методические указания по гаметной селекции сельскохозяйственных растений (мето$
дология, результаты и перспективы). – М.: 2000. – С.127$149.
6. Френкель Р. Механизмы опыления, размножения и селекции растений / Р.Френкель, Э. Гадун – М.: Колос, 1982. – 384 с.
7. Чеботарь А.А., Челак В.Р. и др. Эмбриология зерновых, бобовых и овоще$бахчевых возделываемых растений. Кишинев,
Штиница.1987. – С. 224.
8. Alexander M.P. Differential staining of aborted and non$aborted pollen. // Stain technol. 1969. V.44. №3. P.117$122.
9. Bots M, Mariani C. Pollen viability in the field. Universitet Nijmegen. 2005. – P. 2$52.
10. Matsubara S., Murakami K., Tawara H., Hamamoto Y., Harasawa N. Promoters of in vitro pollen germination of Radish and
Brassica campestris. // J. Japan. Soc. Hort. Sci. – 1999. – V.68. – №2. – P.421$427.
11. Roberts I. N., Gaude T. C., Harrod G., Dickinson H. G. Pollen$stigma interactions in Brassica oleracea; a new pollen germination
medium and its use in elucidating the mechanism of self incompatibility. Springer$Verlag. Berlin. – 1983. – Р. 231$238.
12. Stanley R.G., Linskens H.F. Pollen Biology. Biochemistry and Managements. – 1974. – P. 307.
научнопрактический
журнал
[ 13 ]
овощи
россии
№ 4 (25) 2014