006655 Область техники

006655
Область техники
Областью применения настоящего изобретения являются неврологические заболевания и нарушения. Данное изобретение относится к нейропротекции, миелинизации нервного волокна и генерации или
регенерации миелинпродуцирующих клеток. В частности, данное изобретение относится к демиелинизирующим и нейродегенеративным заболеваниям, невропатиям, травматическому повреждению нервов,
инсульту и неврологическим заболеваниям, вызываемым врожденными нарушениями обмена веществ.
Более конкретно, настоящее изобретение относится к применению остеопонтина или агониста активности остеопонтина для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения и/или профилактики неврологических заболеваний.
Предпосылки изобретения
Миелинизация нервного волокна является важным процессом в формировании и функционировании разных отделов центральной (CNS) и периферической нервной системы (PNS). Миелиновая оболочка вокруг аксонов необходима для эффективной проводимости электрических импульсов по нервам. Разрушение миелина происходит в ряде заболеваний, к которым относится рассеянный склероз (MS), поражающий центральную нервную систему, синдром Гийена-Барре, хроническая иммунная демиелинизирующая полиневропатия (CIDP) и другие заболевания (см. Abramsky and Ovadia, 1997; Trojaborg, 1998,
Hartung et al., 1998). Независимо от разной этиологии, такой как инфекционные патогенные микроорганизмы или аутоиммунные реакции, все демиелинизирующие заболевания вызывают нарушение неврологической функции и могут стать причиной паралича и смерти. Хотя существующие лекарственные средства уменьшают воспалительные поражения при рассеянном склерозе и задерживают развитие болезни,
существует потребность в новых способах лечения, которые позволили бы регенерировать миелиновый
слой и восстановить неврологическую функцию (Abramsky and Ovadia, 1997, Pohlau et al., 1998).
Повреждение центральной нервной системы, вызываемое такими факторами, как травма, гипоксия
и ишемия, может затрагивать как нейроны, так и белое вещество. Хотя основное внимание уделяется
процессам, вызывающим гибель нейронов, все большее количество данных позволяет предположить, что
поражение олигодендроцитов, образующих миелиновый слой аксонов, также является составной частью
повреждения центральной нервной системы. Патология олигодендроцитов, обнаруженная на очень ранней стадии инсульта (3 ч) у крыс, позволяет предположить, что указанные клетки в большей степени
подвержены экситотоксическому воздействию, чем нервные клетки (Pantoni et al., 1996). Одним возможным фактором, опосредующим гибель клеток, является значительное увеличение концентрации глутамата, сопровождающее многие острые поражения центральной нервной системы (Lipton et al., 1994). Установлено, что подобно нейронам олигодендроциты экспрессируют функциональные рецепторы глутамата,
относящиеся к АМРА/кайнатному подтипу. Поэтому олигодендроциты в значительной степени подвержены воздействию глутамата (McDonald et al., 1998).
Травма является одной из причин повреждения или поражения нервов. Такой травмой может быть
травма спинного мозга, в результате которой блокируются все нервные функции на уровне и ниже уровня травмы, включая управление мышцами и чувствительность, или черепно-мозговая травма, например,
травма, вызываемая закрытым повреждением черепа.
Гипоксия головного мозга представляет кислородное голодание, поражающее, в частности, полушария большого мозга, и, как правило, указанный термин используется для определения кислородного
голодания всего головного мозга. В зависимости от степени гипоксии могут наблюдаться симптомы от
спутанности сознания до необратимого поражения головного мозга, комы и смерти.
Инсульт обычно вызывается ишемией головного мозга. Такое поражение также определяется как
цереброваскулярное заболевание или острое сосудистое расстройство. Существует группа заболеваний
головного мозга, характеризующихся нарушением функций головного мозга, которые возникают при
прерывании притока крови к какой-либо части головного мозга. Головной мозг требует примерно 20% от
всего кровотока в организме. Основное кровоснабжение головного мозга происходит по 2 артериям в
области шеи (сонные артерии), которые затем разветвляются в головном мозге на множество артерий,
обеспечивающих подачу крови к определенным участкам головного мозга. Даже кратковременное прерывание кровотока может вызвать ухудшение функции головного мозга (неврологическое расстройство).
Симптомы могут изменяться в зависимости от пораженного участка головного мозга и обычно включают
такие проблемы, как ухудшение зрения, изменение речи, снижение подвижности или чувствительности в
какой-либо части тела либо изменение уровня сознания. Если кровоток уменьшается более, чем на несколько секунд, клетки головного мозга в данной области разрушаются (подвергаются инфаркту), вызывая постоянное поражение указанной области головного мозга или даже смерть.
Инсульт наблюдается примерно у 4 из 1000 человек. Данное заболевание является третьей по значимости причиной смертности в большинстве развитых стран, включая США. Вероятность инсульта
резко увеличивается с возрастом, причем риск возникновения инсульта удваивается каждые десять лет
после 35 лет. Примерно 5% человек в возрасте старше 65 лет перенесли по крайней мере один инсульт.
Указанное заболевание чаще возникает у мужчин, чем у женщин.
Как указывалось выше, инсульт вызывает утрату функций головного мозга (неврологические расстройства) вследствие прекращения кровоснабжения разных областей головного мозга. Конкретные нев-1-
006655
рологические расстройства могут изменяться в зависимости от местоположения и степени поражения, а
также от причины данного нарушения. Инсульт может быть вызван уменьшением кровотока (ишемия), в
результате чего ухудшается кровоснабжение и происходит гибель тканей в данной области (инфаркт).
Причиной ишемических инсультов являются сгустки крови, образующиеся в головном мозге (тромбы), и
сгустки крови, частицы атеросклеротических бляшек или другие вещества, попадающие в головной мозг
из других частей тела (эмболия). Кровотечение (кровоизлияние) в головном мозге может вызвать симптомы, напоминающие инсульт.
Наиболее распространенной причиной инсульта является атеросклероз (церебральный тромбоз).
Атеросклероз ("отвердение артерий") представляет образование жировых отложений на внутренней выстилке артерий, в результате чего образуются атеросклеротические бляшки (масса, состоящая из жировых отложений и тромбоцитов). Артерия медленно закупоривается. Атеросклеротические бляшки необязательно вызывают инсульт. Между разными артериями головного мозга существует много мелких соединительных каналов. Если кровоток постепенно уменьшается, размер мелких соединительных каналов
увеличивается, что позволяет шунтировать закупоренный участок (коллатеральное кровообращение).
Если коллатеральное кровообращение является достаточным, даже полностью заблокированная артерия
может не вызывать неврологических расстройств. Вторым защитным механизмом в головном мозге является достаточно большой размер артерий, поэтому даже при 75% окклюзии кровеносного сосуда все
еще обеспечивается достаточный кровоток к данной области головного мозга.
Тромботический инсульт (инсульт, вызываемый тромбозом) особенно распространен среди пожилых людей и часто сопровождается атеросклеротической ишемической болезнью сердца или сахарным
диабетом. Инсульт такого типа может произойти в любое время, даже во время отдыха. При этом субъект может терять или не терять сознание.
Инсульты, вызываемые эмболией (движущимся сгустком крови), чаще всего возникают в результате кардиогенной эмболии, при этом сгустки, образующиеся вследствие заболеваний сердца, попадают с
кровотоком в головной мозг. Эмболия может возникать в других частях тела, в частности, в местах образования атеросклеротических бляшек. Сгусток, перемещающийся в кровотоке, застревает в мелкой артерии головного мозга. Инсульт возникает совершенно неожиданно и сразу же сопровождается максимальными неврологическими расстройствами. Данное заболевание не связано со степенью активности и
может возникать в любое время. Указанное заболевания обычно сопровождает аритмию сердца, которая
часто является причиной образования тромбов. Поражение головного мозга в данном случае часто бывает более серьезным, чем в случае инсульта, вызываемого церебральным тромбозом. Субъект может терять или не терять сознание. Вероятный исход заболевания ухудшается, если кровеносные сосуды, пораженные инсультом, разрушаются с возникновением кровотечения (геморрагический инсульт).
Периферическая невропатия представляет синдром, обусловленный потерей чувствительности,
мышечной слабостью и атрофией, ухудшением глубоких сухожильных рефлексов и вазомоторными
симптомами, проявляющимися отдельно или в сочетании друг с другом.
Указанное заболевание может поражать отдельный нерв (мононевропатия), два или большее число
нервов в разных частях тела (множественная мононевропатия) или множество нервов одновременно (полиневропатия). Прежде всего поражается аксон (например, в случае сахарного диабета, болезни Лайма,
уремии или при употреблении токсических веществ), миелиновая оболочка или Шваннова клетка (например, в случае острой или хронической воспалительной полиневропатии, лейкодистрофии или синдрома Гийена-Барре). Поражение мелких немиелиновых и миелиновых волокон прежде всего вызывает
утрату тепловой и болевой чувствительности; поражение крупных миелиновых волокон вызывает двигательные или проприоцептивные нарушения. Некоторые невропатии (возникающие, например, вследствие токсического воздействия свинца, приема дапсона, укуса клеща, порфирии или синдрома ГийенаБарре) прежде всего поражают двигательные нервные волокна; другие невропатии (возникающие, например, вследствие ганглионита заднего корешка, при злокачественных опухолях, лепре, СПИД, сахарном диабете или хронической интоксикации пиридоксином) прежде всего поражают ганглий заднего
корешка или чувствительное нервное волокно, вызывая ухудшение чувствительности. Иногда также поражаются черепно-мозговые нервы (например, в случае синдрома Гийена-Барре, болезни Лайма, сахарного диабета и дифтерии). Определение характера заболевания помогает выявить причину его возникновения.
Травма является наиболее распространенной причиной местного повреждения отдельного нерва.
Резкая мышечная активность, принудительное перенапряжение сустава и повторные мелкие травмы (например, в результате крепкого обхвата мелких инструментов или чрезмерной вибрации отбойного молотка) могут вызвать местную невропатию. Паралич от сдавливания или ущемления нерва обычно поражает поверхностные нервы (локтевые, лучевые, перонеальные) на костных выступах (например, во время
крепкого сна или анестезии у худых или истощенных субъектов и часто у алкоголиков) или в узких каналах (например, в случае запястного синдрома). Причиной возникновения паралича от сдавливания
нерва могут быть опухоли, костный гиперостоз, гипсовые повязки, костыли или неудобное положение
тела, сохраняемое в течение длительного периода времени (например, при работе в саду). Невропатию
-2-
006655
может вызвать кровоизлияние в нерв и воздействие холода или излучения. Мононевропатия может возникнуть в результате прямого прорастания опухоли.
Множественная мононевропатия обычно возникает вследствие сосудистых нарушений под действием коллагена (например, полиартрит с утолщением суставов, SLE, синдром Шегрена, RA), саркоидоза,
болезней обмена веществ (диабет, амилоидоз) или инфекционных болезней (например, болезнь Лайма,
ВИЧ-инфекция). Микроорганизмы могут вызвать множественную мононевропатию в результате прямой
инвазии в нерв (например, в случае лепры).
Полиневропатия вследствие острых воспалительных заболеваний может возникнуть под действием
токсина (например, в случае дифтерии) или аутоиммунной реакции (например, в случае синдрома Гийена-Барре); полиневропатия, которая иногда возникает после иммунизации, вероятно также имеет аутоиммунный характер.
Токсические вещества обычно вызывают полиневропатию и иногда мононевропатию. Указанные
вещества включают эметин, гексобарбитал, барбитал, хлорбутанол, сульфонамиды, фенитоин, нитрофурантоин, алкалоиды, выделенные из барвинка, тяжелые металлы, моноксид углерода, триортокрезилфосфат, ортодинитрофенол, многие растворители, другие промышленные яды и некоторые лекарственные средства от СПИДа (например, зальцитабин, диданозин).
Полиневропатия может возникнуть в результате дефицита питательных веществ и нарушения обмена веществ. Причиной возникновения вышеуказанного заболевания может быть недостаточность витамина В (например, в случае алкоголизма, алиментарного полиневрита, пернициозной анемии, изониазид-индуцированной недостаточности пиридоксина, синдромов недостаточности всасывания и гиперемии беременности). Полиневропатия также возникает в случае гипотиреоза, порфирии, саркоидоза, амилоидоза и уремии. Сахарный диабет может вызвать сенсомоторную полиневропатию (наиболее распространенную), множественную мононевропатию и местную мононевропатию (например, глазодвигательных или отводящих черепно-мозговых нервов).
Злокачественные опухоли могут вызвать полиневропатию вследствие моноклональной гаммапатии
(множественная миелома, лимфома), амилоидной инвазии, дефицита питательных веществ или опухолевого синдрома.
Типичные мононевропатии, включающие единичные и множественные мононевропатии, сопровождаются болью, слабостью и парестезией пораженного нерва. Множественная мононевропатия является
асимметричной; нервы могут быть поражены одновременно или поочередно. Многочисленные поражения нервов могут стимулировать полиневропатию.
Паралич локтевого нерва часто возникает в результате травмы нерва в локтевом углублении или
асимметричного роста кости после перелома, произошедшего в детстве (поздний паралич локтевого нерва). Локтевой нерв может быть также сдавлен в области локтевого канала. Парестезия и пониженная чувствительность возникают в 5-ом пальце и в медиальной половине 4-го пальца, аддукторе большого пальца, аддукторе 5-го пальца, при этом межкостные мышцы становятся слабыми и атрофируются. Сильный
хронический паралич локтевого нерва вызывает деформацию в виде когтеобразной кисти. Исследования
проводимости нервов позволяют идентифицировать место поражения. Прежде чем предпринять попытку
хирургического восстановления необходимо прибегнуть к консервативному лечению.
Запястный синдром возникает в результате сдавливания центрального нерва запястья между поперечной поверхностной связкой запястья и продольными сухожилиями мышц предплечья, которые вызывают сгибание руки. Указанный синдром может быть односторонним или двусторонним. Сдавливание
вызывает парестезию кисти и боль в запястье или ладони; иногда боль возникает вблизи от места сдавливания в предплечье и плече. Боль может усиливаться ночью. Затем может понизиться чувствительность в области первых трех пальцев кисти; мышцы, управляющие отведением и прижиманием большого пальца к ладони, могут ослабеть и атрофироваться. Указанный синдром следует отличать от сдавливания корешка нерва С-6 вследствие цервикальной радикулопатии.
Паралич перонеального нерва обычно вызывается сдавливанием нерва в боковой части шейки малоберцовой кости. Указанный паралич особенно характерен для прикованных к постели истощенных
субъектов и для худых субъектов, имеющих привычку скрещивать ноги. Возникает слабость при сгибании и вывороте стопы (отвислая стопа). Пониженная чувствительность иногда возникает в переднебоковой области нижней части ноги и тыльной стороне ступни или в промежутке между 1-ой и 2-ой
плюснами. Невропатию от сдавливания нерва обычно лечат консервативными методами (например, запрещая скрещивать ноги). Неполные невропатии обычно поддаются клиническому лечению и постепенно восстанавливаются. В противном случае может быть рекомендовано хирургическое вмешательство.
Паралич лучевого нерва (паралич субботней ночи) вызывается прижатием нерва к плечевой кости,
например, при свисании руки со спинки стула во время интоксикации или глубокого сна. Симптомы указанного паралича включают слабость экстензоров запястья и пальцев (свисающая кисть) и иногда потерю чувствительности с тыльной стороны 1-ой задней межкостной мышцы. Лечение такого паралича аналогично лечению сдавливающей перонеальной невропатии.
Полиневропатии являются относительно симметричными заболеваниями, часто одновременно поражающими сенсорные, моторные и вазомоторные нервные волокна. Полиневропатии могут поражать
-3-
006655
аксон или миелиновую оболочку и носить острый (например, синдром Гийена-Барре) или хронический
характер (например, почечная недостаточность).
Полиневропатия вследствие нарушений обмена вещества (например, сахарный диабет) или почечной недостаточности развивается медленно, часто в течение нескольких месяцев или лет. Полиневропатия часто начинается с ухудшения чувствительности в нижних конечностях, более выраженного в нижней части ног. Часто ощущается покалывание, онемение, жгучая боль или ухудшение чувствительности
в суставах или ощущение подергивания. Боль часто усиливается ночью и может становиться невыносимой при прикосновении к пораженному участку или при изменении температуры. В тяжелых случаях
наблюдаются объективные признаки потери чувствительности в виде чулок-перчаток. Ахиллов и другие
глубокие сухожильные рефлексы становятся менее выраженными или полностью отсутствуют. При
сильной потере чувствительности могут появиться безболезненные язвы на пальцах или суставах Шарко.
Отсутствие чувствительности или проприоцептивности может вызвать изменение походки. Двигательные нарушения вызывают слабость и атрофию периферических мышц. Дополнительно или избирательно
может быть поражена автономная нервная система, что вызывает ночную диарею, недержание мочи и
кала, импотенцию или постуральную гипотензию. Вазомоторные симптомы могут быть различными.
Кожа может стать бледнее и суше по сравнению с нормальной, иногда с сероватым обесцвечиванием;
может быть усилено потоотделение. Для тяжелых запущенных случаев характерны трофические изменения (мягкая и матовая кожа, ломкие или бугристые ногти, остеопороз).
Полиневропатия питания широко распространена среди алкоголиков и плохо питающихся людей.
Первичная аксонопатия может вызвать вторичную демиелинизацию и разрушение аксонов в наиболее
длинных и крупных нервах. Не ясно, является ли причиной указанной полиневропатии дефицит тиамина
или другого витамина (например, пиридоксина, пантотеновой кислоты, фолиевой кислоты). Невропатия
вследствие недостаточности пиридоксина обычно возникает только у субъектов, принимающих изониазид для лечения туберкулеза; у детей, страдающих недостаточностью или зависимостью от пиридоксина,
могут возникать судороги. Симметричная слабость нижних конечностей обычно развивается постепенно,
но может прогрессировать быстро и иногда сопровождается потерей чувствительности, парестезией и
болью. Боль, судороги, ощущение холода, жжения и онемения в задней части голени и ступнях могут
усиливаться при прикосновении. При неясной этиологии может быть назначен комплекс витаминов, но
результат необязательно является благоприятным.
Исключительно сенсорная полиневропатия начинается с периферических болей и парестезии и прогрессирует с поражением центральной нервной системы и потерей всех форм чувствительности. Указанное заболевание возникает как дистанционный эффект карциномы (в частности, бронхогенной) после
чрезмерного употребления пиридоксина (>0,5 г/сутки), а также в случае амилоидоза, гипотиреоза, миеломы и уремии. Пиридоксин-индуцированная невропатия излечивается при прекращении приема пиридоксина.
Наследственные невропатии классифицируются как сенсомоторные или сенсорные невропатии. Болезнь Шарко-Мари-Тута является наиболее распространенной наследственной сенсомоторной невропатией. Менее распространенные сенсомоторные невропатии возникают сразу же после рождения и вызывают большую степень инвалидности. В случае сенсорных невропатий, которые встречаются редко, в
большей степени выражено нарушение болевой и температурной чувствительности, чем потеря ощущения дрожания и правильного положения. Основной проблемой является повреждение стопы из-за нечувствительности к боли при высокой подверженности инфекционным заболеваниям и остеомиелиту.
Наследственная моторная и сенсорная невропатия типов I и II (болезнь Шарко-Мари-Тута, перонеальная мышечная атрофия) является довольно распространенным, обычно основным аутосомным нарушением, характеризующимся слабостью и атрофией, прежде всего перонеальных и дистальных ножных
мышц. Субъекты, страдающие невропатией указанных типов, могут также иметь другие дегенеративные
заболевания (например, наследственную атаксию Фридрейха) или семейный анамнез таких заболеваний.
Субъекты, страдающие невропатией типа I, в подростковом возрасте характеризуются наличием отвислой стопы и медленно прогрессирующей атрофией мышц нижних конечностей, проявляющейся в так
называемом явлении "птичьих ног". Позже появляется характерная мышечная слабость в кистях. Дрожание, боль и ухудшение температурной чувствительности проявляется в виде чулок-перчаток. Отсутствуют глубокие сухожильные рефлексы. Высокие своды стопы или молоткообразные пальцы стопы могут
быть единственными признаками у членов семьи, в меньшей степени пораженных данным заболеванием.
Скорость проводимости нервов замедляется, при этом скрытый период выполнения функции удлиняется.
Происходит сегментная демиелинизация и ремиелинизация. Могут пальпироваться увеличенные периферические нервы. Болезнь прогрессирует медленно и не влияет на продолжительность жизни. Невропатия типа II протекает еще медленнее, при этом слабость обычно появляется в конце жизни. Пациенты
характеризуются относительно нормальной скоростью проводимости нервов, но низкой амплитудой потенциала действия. Биопсия свидетельствует о дегенерации клеток.
Наследственная моторная и сенсорная невропатия типа III (гипертрофическая интерстициальная
невропатия, болезнь Дежерина-Сотта), редкое аутосомное рецессивное заболевание возникает в детстве
и прогрессирует с возникновением слабости, потерей чувствительности и отсутствием глубоких сухо-4-
006655
жильных рефлексов. Вначале невропатия типа III напоминает болезнь Шарко-Мари-Тута, но двигательная слабость развивается гораздо быстрее. Происходит демиелинизация и ремиелинизация, вызывая увеличение и выбухание периферических нервов, выявляемое при биопсии нерва.
Характерное распределение двигательной слабости, деформация стопы, семейный анамнез и электрофизиологические аномалии подтверждают поставленный диагноз. Возможен генетический анализ, но
отсутствуют конкретные способы лечения. Могут быть полезны профессиональные консультации молодых пациентов для подготовки к дальнейшему развитию болезни. Фиксация помогает скорректировать
отвислую стопу; может быть полезна ортопедическая операция по обеспечению устойчивости стопы.
Нейродегенеративные заболевания включают также болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Гентингтона и боковой амиотрофический склероз (ALS).
Болезнь Альцгеймера представляет заболевание, характеризующееся ухудшением умственной деятельности в результате изменений, происходящих в тканях головного мозга. Указанные изменения
включают сокращение тканей головного мозга, не вызываемое нарушением кровеносных сосудов, сопровождающееся дегенеративным слабоумием и диффузной атрофией головного мозга. Болезнь Альцгеймера также называют старческим слабоумием типа болезни Альцгеймера (SDAT). Данное заболевание является наиболее распространенной причиной возрастного ухудшения умственной способности.
Болезнью Альцгеймера страдают примерно 9 из 10000 человек. Указанное заболевание поражает женщин несколько чаще, чем мужчин и возникает главным образом у пожилых людей.
Причина возникновения указанного заболевания неизвестна. Нейрохимические факторы, которые
могут способствовать возникновению данной болезни, включают отсутствие веществ, используемых
нервными клетками для передачи нервных импульсов (нейротрансмиттеры), включающих ацетилхолин,
соматостатин, вещество Р и норепинефрин. Окружающие факторы включают воздействие алюминия,
марганца и других веществ. Инфекционные факторы включают инфекции, вызываемые прионом (вирусоподобные микроорганизмы), которые поражают головной и спинной мозг (центральную нервную систему). В некоторых семьях (составляющих 5-10% всех случаев) существует наследственная предрасположенность к возникновению данного заболевания, но строгие (менделевские) законы не выполняются.
Диагноз обычно ставят, отклоняя другие причины слабоумия.
Исследователи установили, что в семьях, многие члены которых страдают болезнью Альцгеймера,
существует определенное изменение генов, характерное для всех лиц, страдающих данным заболеванием. Ген, продуцирующий вещество, именуемое аполипопротеином Е4, не считается фактором, вызывающим данное заболевание; присутствие указанного гена просто увеличивает вероятность возникновения такого заболевания. Существует много людей, имеющих ген Е4, и не подверженных болезни Альцгеймера.
Возникновение данной болезни характеризуется ухудшением памяти и прогрессирующей утратой
умственных способностей. Может наблюдаться смена настроения, ухудшение речи, изменение походки и
другие изменения по мере развития заболевания. Уменьшается размер тканей (атрофия) головного мозга,
происходит увеличение желудочков (свободных пространств в головном мозге) и образование отложений в тканях головного мозга.
Болезнь Паркинсона представляет заболевание головного мозга, характеризующееся дрожанием,
затруднением походки, движений и координации. Данное заболевание обусловлено поражением части
головного мозга, управляющей движением мышц. Указанное заболевание также называют дрожащим
параличом.
Указанное заболевание поражает примерно 2 из 1000 человек и наиболее часто возникает после 50
лет. Данное заболевание поражает как мужчин, так и женщин и является одним из наиболее распространенных неврологических заболеваний у пожилых людей. Термин "паркинсонизм" означает любое заболевание, которое характеризуется совокупностью изменений движения, наблюдаемых в случае болезни
Паркинсона, наиболее часто вызывающей указанную группу симптомов. Паркинсонизм может быть вызван другими нарушениями или внешними факторами (вторичный паркинсонизм).
Болезнь Паркинсона вызывает прогрессирующее разрушение нервных клеток части головного мозга, контролирующей движение мышц (базальное ядро и экстрапирамидальная область). В данной области обычно продуцируется допамин, который является одним из веществ, используемых клетками для
передачи импульсов (трансмиттеры). Разрушение указанной области головного мозга сокращает количество допамина в организме. Недостаточность допамина нарушает баланс между допамином и другими
трансмиттерам, такими как ацетилхолин. Без допамина нервные клетки не могут должным образом передавать сигналы, в результате чего утрачивается мышечная функция. Действительная причина разрушения клеток головного мозга неизвестна. Данное заболевание может поражать одну или обе стороны тела
с разной степенью утраты функциональности.
Помимо ухудшения управления мышцами некоторые субъекты, страдающие болезнью Паркинсона,
подвержены сильной депрессии. Хотя на ранней стадии заболевания умственные способности не ухудшаются, на более поздних стадиях заболевания болезнью Паркинсона у субъекта может наблюдаться
ухудшение умственных способностей (включая старческое слабоумие, галлюцинации и т.д.). Старческое
-5-
006655
слабоумие может быть вызвано побочным действием некоторых лекарственных средств, используемых
для лечения данного заболевания.
Болезнь Гентингтона является наследственным, основным аутосомным неврологическим заболеванием. Это заболевание встречается нечасто, поражая примерно 1 из 10000 человек (Breighton and Hayden,
1981). Данное заболевание обычно не имеет клинических проявлений до пятидесяти лет и вызывает психиатрическое расстройство, нарушение непроизвольных движений и ухудшение познавательной способности, что неизбежно ведет к смерти обычно через 17 лет после возникновения болезни.
Ген, ответственный за болезнь Гентингтона, получил название гентингтин. Указанный ген находится в хромосоме 4р, представляя эффективное средство для доклинической и внутриутробной диагностики. Генетическая аномалия заключается в избыточном числе последовательно расположенных нуклеотидных последовательностей CAG.
Увеличение размера повтора CAG у субъектов, страдающих болезнью Гентингтона, с высокой степенью точности указывает на возраст субъекта, у которого может возникнуть указанное заболевание.
Такая взаимосвязь особенно выражена у субъектов, заболевающих болезнью Гентингтона в юности, так
как у таких субъектов обычно имеется более 50 повторов. Длина повтора CAG в семьях, страдающих
болезнью Гентингтона, характеризуется некоторой изменчивостью, которая особенно заметна, когда дети наследуют ген гентингтин у страдающих данным заболеванием отцов.
В случае болезни Гентингтона неизвестно, каким образом указанный широко экспрессированный
ген вызывает избирательную гибель нейронов. Кроме того, анализ последовательности не позволяет обнаружить явной гомологии с другими известными генами, при этом не были идентифицированы структурные части или функциональные домены, которые позволили бы пролить свет на функцию вышеуказанного гена. В частности, по-прежнему остается без ответа вопрос, каким образом указанные широко
экспрессированные гены вызывают избирательную гибель нейронов.
Боковой амиотрофический склероз (ALS) представляет заболевание, вызывающее прогрессирующее ухудшение управления нервами произвольно сокращающимися мышцами вследствие разрушения
нервных клеток в головной и спинном мозге. Боковой амиотрофический склероз, именуемый также болезнью Лу Герига, является заболеванием, характеризующимся нарушением управления мышечной деятельностью. Нервы, управляющие указанными мышцами, сжимаются и исчезают, что вызывает уменьшение мышечной ткани из-за отсутствия нервной стимуляции. Уменьшается сила и координация мышц,
начиная с произвольно сокращающихся мышц (находящихся под контролем сознания, таких как мышцы
рук и ног). Управление мышцами все больше ухудшается, при этом болезнь поражает все новые группы
мышц. Может ухудшаться нервная стимуляция полупроизвольно сокращающихся мышц, таких как
мышцы, управляющие дыханием и глотанием. При этом данная болезнь не оказывает влияния на мыслительную способность.
Причина возникновения указанного заболевания неизвестна.
Боковой амиотрофический склероз поражает примерно 1 из 100000 человек. В некоторых случаях
он является наследственным заболеванием. Указанным заболеванием чаще болеют мужчины, чем женщины. Симптомы данного заболевания обычно проявляются в зрелом возрасте, часто после пятидесяти
лет.
Травматическое повреждение нервов может наблюдаться в центральной или периферической нервной системе. Травматическое повреждение головного мозга (TBI), также именуемое черепно-мозговой
травмой или закрытой черепно-мозговой травмой (CHI), означает повреждение головного мозга в результате удара по голове. Черепно-мозговая травма чаще всего возникает во время дорожнотранспортных происшествий, но может произойти в результате ныряния, сердечного приступа, инсульта
и инфекционных заболеваний. Травматическое повреждение головного мозга указанного типа обычно
препятствует поступлению кислорода или крови к головному мозгу и поэтому может именоваться "гипоксическим повреждением".
Черепно-мозговая травма или закрытая черепно-мозговая травма возникает в результате удара по
голове во время дорожно-транспортного происшествия или вследствие падения. В таком случае череп
ударяется о неподвижный предмет и головной мозг, находящийся внутри черепа, поворачивается и изгибается вдоль своей оси (ствола мозга), вызывая местное или обширное повреждение. Кроме того, головной мозг, представляющий мягкую массу, окруженную жидкостью, в которой он "плавает", может удариться о череп, что вызывает дальнейшее поражение головного мозга.
Сразу же после травмы человек может находиться в бессознательном состоянии, которое может
длиться несколько минут, недель или месяцев. В результате сгибания и удара травмированный головной
мозг повреждается или распадается на несколько частей. Такое поражение называется диффузным поражением или "бесснарядной травмой" головного мозга. Повреждения головного мозга, имеющие место
при бесснарядных травмах, можно классифицировать как первичные или вторичные.
Первичное повреждение головного мозга происходит во время травмирования, главным образом в
месте столкновения, в частности, при наличии перелома черепа. Сильные ушибы могут вызывать внутримозговое кровотечение или могут сопровождаться разрывами кортикальной ткани. Диффузные повреждения аксонов происходят в результате деформации сдвига и растяжения нейронов при поворачивании
-6-
006655
головного мозга внутри черепа. В данном случае могут наблюдаться небольшие геморрагические или
диффузные повреждения аксонов, которые можно обнаружить только под микроскопом.
Вторичное повреждение головного мозга возникает в результате осложнений, развивающихся после
травмы. Такие осложнения включают внутричерепное кровотечение, травматическое поражение внечерепных артерий, образование внутричерепной грыжи, гипоксическое поражение мозга или менингит.
Открытая черепно-мозговая травма представляет видимую рану головы и может возникать в результате выстрела, несчастного случая или попадания в череп предмета, травмирующего головной мозг
("снарядная травма головного мозга"). Черепно-мозговая травма подобного типа поражает конкретную
область головного мозга.
Так называемая легкая черепно-мозговая травма может не сопровождаться потерей сознания и вызывает лишь оцепенение или спутанность сознания в течение короткого периода времени. Хотя предоставляемая в данном случае медицинская помощь может быть минимальной, субъекты с черепномозговой травмой, не вызывающей коматозное состояние, могут испытывать симптомы, характерные для
субъектов, переживших посттравматическую кому.
Вследствие травмы в головном мозге возникают изменения, которые необходимо отслеживать во
избежание дальнейшего поражения мозга. Размер головного мозга часто увеличивается после тяжелой
черепно-мозговой травмы. Такое состояние называется набуханием мозга и происходит при увеличении
количества крови в головном мозге. Впоследствии в головном мозге может скапливаться вода, вызывая
отек головного мозга. Набухание и отек головного мозга вызывают повышение давления в головном
мозге, именуемого внутричерепным давлением ("ICP").
Травмы спинного мозга являются основными причинами параплегии и тетраплегии. Более 80% указанных заболеваний возникают в результате дорожно-транспортных происшествий. Клинически различают две основные группы травм: открытые травмы и закрытые травмы.
Открытые травмы вызывают прямое повреждение спинного мозга и нервных корешков. Перфорирующие повреждения могут вызвать обширные разрывы и кровотечение. Закрытые травмы составляют
большую часть повреждений спинного мозга и вызываются переломом/смещением позвонков и обычно
выявляются рентгеновскими методами. Повреждения спинного мозга зависят от степени костных повреждений и могут быть разделены на два типа: первичные повреждения, представляющие ушибы, рассечение нервного волокна и геморрагический некроз, и вторичные повреждения, представляющие экстрадуральные гематомы, инфаркты, инфекционные поражения и отеки.
Последствия повреждения спинного мозга включают восходящую и нисходящую дегенерацию поврежденных нервных волокон, посттравматическую сирингомиелию и системные последствия параплегии, такие как инфекционные поражения мочевых путей и грудной клетки, пролежни и мышечная слабость.
Неврологические заболевания могут возникать вследствие врожденных нарушений обмена веществ.
Миелиновые оболочки, покрывающие многие нервные волокна, состоят из липопротеидных слоев, образующихся на начальной стадии жизни. Миелин, образуемый олигодендроглией в центральной нервной
системе, в химическом и иммунологическом отношении отличается от миелина, образуемого периферическими шванновыми клетками, но миелин обоих типов выполняют одну и ту же функцию, а именно
способствуют передаче нервного импульса по аксону.
Многие наследственные заболевания обмена веществ (например, фенилкетонурия и другие аминоацидурии; болезни Тая-Саша, Ниманна-Пика и Гоше; синдром Гурлера; болезнь Краббе и другие лейкодистрофии) воздействуют на образующуюся миелиновую оболочку, главным образом в центральной
нервной системе. Если биохимический дефект нельзя устранить или компенсировать, возникает постоянный, часто широко распространенный неврологический дефицит.
Например, болезнь Краббе или глобоидно-клеточная лейкодистрофия представляет заболевание,
поражающее белое вещество периферической и центральной нервной системы. Мутации гена лизосомного фермента галакто-цереброзидазы (GALC) сокращают ферментативную активность и уменьшают
способность разрушать галактолипиды, обнаруживаемые исключительно в миелине. Для достижения
постоянной миелинизации и/или ремиелинизации у нуждающихся субъектов необходимы функциональные эндогенные олигодендроциты или трансплантация олигодендроцитов или стволовых клеток, способных дифференцировать с образованием олигодендроцитов для обеспечения достаточной экспрессии
GALC (Wenger et al., 2000).
Нейрофиброматоз 1 (NF1) является распространенным аутосомным заболеванием с широким спектром неврологических проявлений.
Множественная системная атрофия является спорадическим нейродегенеративным заболеванием
взрослых неизвестной этиологии. Непременным признаком всех нейродегенеративных заболеваний является участие клеток олигодендроглии в патогенных процессах. Главным отличием от болезни Паркинсона является то, что субъекты, страдающие множественной системной атрофией, не поддаются лечению
L-допамином.
Демиелинизация на последующих этапах жизни является признаком многих неврологических заболеваний; указанное явление может быть результатом повреждения нервов или миелина вследствие мест-7-
006655
ной травмы, ишемии, под действием токсических веществ или нарушений обмена веществ. Существуют
данные о том, что демиелинизация может вызывать шизофрению. Вслед за чрезмерным разрушением
миелина обычно происходит дегенерация аксонов и часто клеток тела, причем оба процесса могут быть
необратимыми. Однако во многих случаях происходит ремиелинизация, а также восстановление, регенерация и полное возобновление функции нервов. Демиелинизация в центральной нервной системе (то
есть спинном мозге, головном мозге или зрительных нервах) является важным открытием в основных
демиелинизирующих болезнях, этиология которых неизвестна. Наиболее известным заболеванием является рассеянный склероз.
Острые диссеминированные энцефаломиелиты и постинфекционные энцефаломиелиты характеризуются периваскулярной демиелинизацией центральной нервной системы, которая может происходить
спонтанно, но обычно возникает под воздействием вирусной инфекции или вирусной вакцинации (очень
редко после бактеральной вакцинации), что позволяет предположить наличие иммунологической причины. Острые воспалительные периферические невропатии, возникающие после вирусной вакцинации, или
синдром Гийена-Барре характеризуются такими же нарушениями демиелинизации, которые имеют место
в случае иммунопатогенеза, но они поражают только периферические структуры.
Метахроматическая лейкодистрофия является еще одним демиелинизирующим заболеванием. Адренолейкодистрофия и адреномиелоневропатия являются редкими Х-связанными рецессивными нарушениями обмена веществ, вызываемыми дисфункцией надпочечника и широкой демиелинизацией нервной системы. Адренолейкодистрофия возникает у маленьких мальчиков; адреномиелоневропатией страдают подростки. Следствием вышеуказанных заболеваний может быть ухудшение умственных способностей, мышечная спастичность и слепота. Адренолейкодистрофия является смертельным заболеванием.
В настоящее время исследуются возможности диетического и иммуномодуляторного лечения.
Наследственная атрофия зрительного нерва Лебера и родственные митохондриальные нарушения
характеризуются прежде всего билатеральной потерей центрального зрения, поражающей обычно молодых людей в возрасте около двадцати лет. Наследственная атрофия зрительного нерва Лебера может напоминать ретробульбарный неврит при рассеянном склерозе. В данном случае идентифицированы мутации наследуемой по материнской линии митохондриальной ДНК.
HTLV-обусловленная миелопатия является медленно прогрессирующим заболеванием спинного
мозга, вызываемым лимфотрофическим вирусом Т-клеток человека, и характеризуется спастической
слабостью обеих ног.
Другие неврологические заболевания включают невропатии с аномальной миелинизацией, обзор
которых приведен ниже.
Иммунные заболевания: острая форма болезни Гийена-Барре, хроническая иммунная демиелинизирующая полиневропатия (CIDP), множественная CIDP, множественная двигательная невропатия (MMN),
анти-MAG синдром, синдром GALOP, синдром антитела против сульфатида (с сывороточным Мбелком), синдром антитела против GM2, синдром POEMS, полиневропатия, органомегалия, эндокринопатия или отек, кожные изменения, вызываемые антигеном стрептококка М, периневрит, синдром антитела против GD1b IgM (редкое заболевание).
Токсины: дифтерия, крушина, гексахлорофен, цианат натрия, теллур.
Лекарственные средства, вызывающие в основном демиелинизацию: хлорокин, FK506 (Tacrolimus),
пергексилин, прокаинамид, зимельдин; лекарственные средства, вызывающие демиелинизацию и разрушение аксонов: амиодарон, синдром эозинофолии-миальгии, золото, сурамин, таксол.
Наследственные болезни: гликопротеид с дефицитом карбогидрата, катаракты и лицевой дисморфизм, синдром Коккейна, наследственная гипомиелинизация, наследственная мышечная дистрофия: дефицит мерозина, болезнь Фарбера (липогрануломатоз), HMSN и СМТ, доминанта: IA, IB, III, HNPP,
EGR2, термочувствительные, рецессивные болезни: III (синдром Дежерина-Сотта); 4А; 4В; 4В2; 4С; 4D
(LOM); 4Е; 4F; HMSN-R; X-связанное заболевание CNS: IX, болезнь Краббе, Маринеско-Сьегрена, метахроматическая лейкодистрофия, болезнь Ниманна-Пика, болезнь Пелицеуса-Мерцбахера (PLP), синдром
Рефсума, белок Приона (РrР27-30): мутация Glu200Lys, болезнь Крейтцфельда-Якоба, животная модель с
использованием мышей: избыточная экспрессия белка приона, болезнь Салла, SOX10, тенасцин-ХА, неравномерная упаковка периферических миелиновых оболочек, фенотип Элерса-Данлоса.
Болезни обмена веществ (редкие): диабет (вследствие одновременно развивающейся CIDP), гипотиреоз, гепатиты.
Митохондриальные болезни: синдром MNGIE, миопатия и наружная офтальмоплегия, невропатия,
желудочно-кишечная энцефалопатия, синдром NARP, невропатия, атаксия, ретинит, пигментоз.
Инфекционные болезни: болезнь Крейтцфельда-Якоба, дифтерия, ВИЧ: сопутствующая CIDP, лепра: лепроматоз; смешанная демиелинизация аксонов; колониеобразование клеток Швана, измененная
форма болезни Крейтцфельда-Якоба.
Более подробную информацию можно получить на указанном ниже сайте в Интернете:
http://www.neuro.wustl.edu/neuromuscular/nother/myelin.html.
Рассеянный склероз (MS) является воспалительным демиелинизирующим заболеванием центральной нервной системы (CNS), имеющим рецидивно-ремиттирующий или прогрессирующий характер.
-8-
006655
Рассеянный склероз является не единственным демиелинизирующим заболеванием. Другим подобным
заболеванием в периферической нервной системе является хроническая воспалительная демиелинизирующая полирадикулоневропатия (CIDP). Кроме того, существуют острые, однофазовые заболевания,
такие как воспалительная демиелинизирующая полирадикулоневропатия, именуемая синдромом ГийенаБарре (GBS), в периферической нервной системе и острый диссеминированный энцефаломиелит
(ADEM) в центральной нервной системе. Как рассеянный склероз, так и синдром Гийена-Барре представляют гетерогенные синдромы. В случае рассеянного склероза разные экзогенные воздействия наряду
с генетическими факторами могут вызывать развитие болезни, которая в конечном счете удовлетворяет
диагностическим критериям. В обоих заболеваниях разрушение аксонов может усиливать первичное демиелинизирующее поражение и вызывать постоянные неврологические расстройства.
Рассеянный склероз является наиболее распространенным из вышеуказанных демиелинизирующих
заболеваний. Данная болезнь считается аутоиммунным расстройством, при котором лейкоциты иммунной системы поражают белое вещество центральной нервной системы (CNS). Серое вещество может
быть также поражено. Хотя до сих пор неизвестна точная этиология рассеянного склероза, факторы, способствующие развитию данного заболевания, могут иметь генетическое, бактериальное и вирусное происхождение. В своем классическом проявлении (85% всех случаев) данное заболевание характеризуется
чередованием рецидивов и ремиссий, которые соответствуют нарушению неврологической функции,
продолжающемуся в течение нескольких недель с последующим значительным или полным восстановлением (Noseworthy, 1999). Периоды ремиссии с течением времени становятся все короче. Затем многие
субъекты испытывают последнюю стадию заболевания, характеризующуюся постепенной утратой неврологической функции с частичным восстановлением или без последующего восстановления. Такое состояние именуется вторичным прогрессирующим рассеянным склерозом. Небольшая часть больных людей (~15% всех субъектов, страдающих рассеянным склерозом) испытывает постепенное и непрерывное
ухудшение неврологической функции после возникновения указанного заболевания (первичный прогрессирующий рассеянный склероз). В настоящее время отсутствуют обоснованные методы лечения тяжелых форм рассеянного склероза, которые обычно являются смертельными.
Основным признаком рассеянного склероза является демиелинизированная бляшка с образовавшимся реактивным глиальным рубцом, обнаруживаемая в белом веществе головного и спинного мозга.
Демиелинизация связана с функциональным ухудшением или блокированием проводимости нервных
импульсов. У субъектов, страдающих рассеянным склерозом, также наблюдается разрушение и гибель
аксонов (Bjartmar et al., 1999). Исследования патологии показывают, что в большинстве случаев поражение ограничивается зрительными нервами, перивентрикулярным белым веществом, стволом головного
мозга и спинным мозгом (Storch et al., 1998). Указанные расстройства центральной нервной системы
включают острые симптомы диплопии, онемение и неустойчивую походку, а также хронические симптомы, такие как спастический парапарез и недержание мочи.
Молекулярные механизмы, определяющие патогенез рассеянного склероза, по-видимому, включают генетические и окружающие факторы, в том числе вирусные и бактериальные инфекции. Указанные
механизмы стимулируют усиленную миграцию Т-лимфоцитов и макрофагов через гематоэнцефалический барьер и в ткань центральной нервной системы.
Демиелинизация происходит при воздействии на миелин активированных макрофагов и микроглии,
а также в результате поражения миелинизирующих клеток вследствие передачи сигнала Fas-лигандом и
цитотоксичности, опосредуемой комплементом или антителом. Поэтому демиелинизация происходит
как в результате прямого воздействия на миелиновые оболочки, так и в результате уничтожения клеток,
продуцирующих и сохраняющих миелин.
Генетические и внешние факторы вызывают усиленный приток воспалительных клеток через гематоэнцефалический барьер. Это в свою очередь вызывает увеличение миграции аутореактивных Тлимфоцитов и макрофагов в ткань центральной нервной системы. Секреция цитокина Т-клетками активирует антигенпредставляющие клетки (АРС). Когда аутореактивные Т-клетки в молекулах МНС класса
II антигенпредставляющих клеток сталкиваются с мнимыми "антигенами MS", которые часто являются
белковыми составляющими миелиновой оболочки, они активируются. Несколько последующих механизмов могут вызывать разрушение олигодендроцитов и миелина. У некоторых субъектов большинство
поражений вызывает цитотоксичность, опосредуемая комплементом и антителом, в то время как у других субъектов на белое вещество воздействует передача сигнала Fas-лигандом и высвобождение провоспалительных цитокинов подобных TNF-α, выделяемых Т-клетками CD4+. Активированные макрофаги
также могут играть определенную роль в усилении фагоцитоза и секреции фактора. В результате этого
происходит обширная демиелинизация и последующее снижение эффективности проводимости аксонов
в центральной нервной системе. Однако последующие механизмы восстановления могут вызывать ремиелинизацию сразу же после прекращения воспалительного процесса. Ремиелинизированные аксоны у
субъектов, страдающих рассеянным склерозом, патологически распознаются благодаря появлению вокруг них тонких оболочек. Установлено, что дополнительные натриевые каналы часто проникают в мембрану демиелинизированного аксона, компенсируя таким образом ухудшение проводимости. Предшественники олигодендроглии могут усилить ремиелинизацию в местах поражения рассеянным склерозом.
-9-
006655
Олигодендроциты выполняют несколько функций, относящихся к продуцированию и сохранению
миелиновой оболочки. Указанные функции включают изоляцию, поддержку и усиление проводимости
для аксонов многочисленных нейронов. Один олигодендроцит может миелинизировать до 50 разных
аксонов. Миелинизация ограничена только некоторыми аксонами с большим диаметром; дендриты и
другие клетки, такие как астроциты, остаются немиелинизированными. Аксоны, по-видимому, осуществляют контроль за рядом миелинизирующих олигодендроцитов, так как трансфекция аксона в парадигму
зрительного нерва крысы подавляет восстановление миелина и продуцирование предшественников олигодендроцитов (Barres and Raff, 1999). Пролиферацию и миграцию олигодендроцитов могут стимулировать факторы, высвобождаемые аксонами в процессе развития. В этой связи число олигодендроцитов и
аксонов точно согласовано в центральной нервной системе.
Олигодендроциты, периневральные поддерживающие клетки центральной нервной системы, миелинизируют аксоны и усиливают трансдукцию импульсов. Они играют важную роль в сохранении жизнеспособности и функционировании аксонов. Следует отметить, что, как показано на приводимой схеме,
олигодендроцит выполняет только один процесс для каждого миелинизируемого аксона.
Многослойная миелиновая оболочка является специальным доменом плазматической мембраны
глиальных клеток с большим содержанием липидов и низким содержанием белка. Указанная оболочка
поддерживает аксоны и повышает эффективность проводимости электрических сигналов в центральной
нервной системе, препятствуя проникновению заряда в окружающую ткань. Узлы Ранвьера представляют участки в оболочке аксона, обеспечивающие скачкообразную проводимость.
В головном мозге взрослого человека олигодендроциты образуются из плохо изученных клетокпредшественников в субвентрикулярной области головного и спинного мозга (Nait-Oumesmar et al.,
1999). Указанные клетки-предшественники являются пролиферативными и экспрессируют миелиновые
транскрипты и белки, которые впервые появляются в вентральной области спинного мозга эмбриона за
несколько недель до начала миелинизации (Hajihosseini et al., 1996). Процесс миелинизации происходит
в головном мозге ребенка после его рождения. Во время послеродового развития указанные предшественники мигрируют в подлежащие миелинизации нервные пути.
Зрелые олигодендроциты высвобождаются из клеток-предшественников определенным и специфическим образом (см., например, публикацию Rogister et al., 1999). Олигодендроциты развиваются в заранее определенном направлении, каждая стадия которого разграничена несколькими клеткоспецифическими маркерами: адгезионная молекула эндотелиальной нервной клетки (E-NCAM), виментин, А2В5,
транскрипционный фактор POU Tst-l/Oct6/SCIP, антиген преолигодендробласта (РОА), галактоцереброзид (GalC), О1, О4 и миелинспецифические белки PLP, МВР и MOG. Стволовые нервные клетки образуют биполярные клетки пpe-GD3*, которые становятся предшественниками O2А. Указанные клетки образуют олигодендроциты или астроциты типа 2. Развитие продолжается до стадий преолигодендроглии и
пре-GalC*, прежде чем происходит фактическая дифференцировка с образованием олигодендроцитов.
Конечные стадии линии дифференцировки олигодендроглии определяются невозможностью дальнейшей
пролиферации указанных клеток. Зрелые олигодендроциты экспрессируют клеткоспецифические маркеры GalC и сульфатид (SUL) помимо экспрессии миелинспецифических белков.
Таким образом, дифференцировка олигодендроцитов происходит из митотически активных, способных мигрировать клеток-предшественников. Как только указанные клетки становятся постмитотическими, они транскрибируют и транслируют гены, кодирующие миелинспецифические белки. Образование миелиновой оболочки, охватывающей аксон, происходит при прямом взаимодействии процессов,
характерных для зрелого олигодендроцита и самого аксона. Формирование оболочки вокруг аксона в
центральной нервной системе заканчивается уплотнением миелиновой оболочки, которая в своей конечной форме напоминает жидкий кристалл, содержащий макромолекулы, образующие сложную структуру
(Scherer, 1997). Для стимуляции миелинизации необходимо учитывать точную стехиометрическую взаимосвязь между отдельными структурными белками миелиновой оболочки, так как увеличение или
уменьшение количества одного компонента вызывает изменение всей структуры оболочки.
Неспособность олигодендроцитов восстанавливать демиелинизированные аксоны свидетельствует
об общем неврологическом расстройстве, характерном для рассеянного склероза. Стимуляция ремиелинизация у субъектов, страдающих рассеянным склерозом, позволяет защитить аксоны и, таким образом,
ограничить развитие болезни, обусловленной гибелью аксонов в центральной нервной системе.
Демиелинизирующий фенотип рассеянного склероза стал объектом всестороннего исследования
природы активного поражения рассеянным склерозом. Оголенные аксоны и отсутствие миелинизирующих олигодендроцитов указывают на разрушение нормального миелина и аберрацию процесса ремиелинизации, обусловленные рассеянным склерозом. Известно, что при 40% поражении рассеянным склерозом происходит абортивная ремиелинизация, особенно на ранних стадиях заболевания (Prineas et al.,
1993). Данное явление создает реальную основу для разработки стратегий стимуляции восстановления
миелина, способных предотвратить необратимое повреждение нервной системы. Такая вероятность особенно высока для более молодых субъектов с поражениями центральной нервной системы, у которых
происходит ремиелинизация на ранних стадиях заболевания. Однако миелинизирующие или ремиелинизирующие олигодендроциты представляют клетки, испытывающие сильный метаболический стресс, при
- 10 -
006655
котором даже незначительные дополнительные поражения могут стать необратимыми (Scolding and
Lassmann, 1996). Такое положение уменьшает вероятность самопроизвольного восстановления в месте
активного поражения рассеянным склерозом, где воспалительный и другие процессы создают дополнительные преграды для ремиелинизации. Поэтому стратегии стимуляции восстановления миелина устраняют все неблагоприятные факторы, способствуя таким образом ремиелинизации и защите аксонов в
местах активного поражения рассеянным склерозом.
Известно, что в центральной нервной системе взрослого человека имеются клетки-предшественники олигодендроцитов, которые способны пролиферировать и созревать с образованием миелинизирующих олигодендроцитов. Кроме того, очевидно, что эндогенные популяции предшественников олигодендроцитов рядом с местами поражения рассеянным склерозом являются малочисленными на хронических стадиях заболевания вследствие ингибирования способности указанных предшественников пролиферировать и дифференцировать (Wolswijk, 1998). Такие клетки-предшественники обычно находятся в
состоянии покоя в местах хронического поражения рассеянным склерозом и не оказывают активного
воздействия на ремиелинизацию. Ситуация, характерная для хронических поражений рассеянным склерозом, включает факторы, препятствующие регенерации олигодендроглии, или не располагает факторами, необходимыми для стимуляции популяции клеток-предшественников олигодендроцитов (Wolswijk,
1998). Такое положение вещей позволило выдвинуть гипотезу о том, что эффективное лечение рассеянного склероза не должно ограничиваться подавлением воспалительного процесса, такое лечение должно
стимулировать ремиелинизацию. Ремиелинизирующие клетки могут быть получены из разных источников, включающих жизнеспособные нативные олигодендроциты в месте поражения, клетки, выделенные
из выживших клеток, или расположенные рядом клетки-предшественники. Установлено, что зрелые олигодендроциты можно заставить дифференцировать и пролиферировать при помощи таких факторов, как
основной фактор роста фибробластов (bFGF), создавая механизм для регенерации линии дифференцировки олигодендроглии после возникновения демиелинизирующей болезни (Grinspan et al., 1996;
Grinspan et al., 1993).
Дополнительные данные о благоприятном действии ремиелинизации в случае демиелинизирующих
заболеваний, таких как рассеянный склероз, получены в результате выполнения исследований с использованием факторов роста глиальных клеток при лечении данного заболевания в животных моделях. Известно, что фактор роста глиальных клеток 2 (нейрегулин/GGF-2), являющийся фактором роста центральной нервной системы, стимулирующим пролиферацию и выживание олигодендроцитов, способен
отсрочить возникновение болезни, сделать заболевание менее тяжелым и сократить частоту рецидивов в
модели рассеянного склероза ЕАЕ с использованием мышей (Marchionni et al., 1999). Установлено, что
нейрегулин оказывает благоприятное действие на выживание зрелых олигодендроцитов и продуцируется
аксонами (Fernandez et al., 2000).
Другие факторы роста, включая выделяемый тромбоцитами фактор роста (PDGF) и IGF-1, также
стимулируют ремиелинизацию и оказывают лечебное действие при использовании моделей ЕАЕ
(Dubois-Dalcq and Murray, 2000). Успех, достигнутый при стимуляции ремиелинизации благодаря усилению пролиферации и/или дифференцировке олигодендроцитов, свидетельствуют о благоприятных возможностях ремиелинизации в качестве метода лечения рассеянного склероза. Необходимо также идентифицировать молекулы, ингибирующие синтез миелина, так как указанные молекулы могут снизить
эффективность методов восстановления, таких как трансплантация клеток олигодендроглии клеток в
случае рассеянного склероза.
Процесс ремиелинизации можно осуществлять наряду с применением противовоспалительных
средств для восстановления повреждения и защиты аксонов от поражения и гибели.
Можно индуцировать олигодендроциты для ремиелинизации аксонов в центральной нервной системе, способствуя таким образом уменьшению интенсивности симптомов заболевания. Усиленная ремиелинизация может компенсировать разрушения, вызванные проникновением клеток иммунной системы в ткань центральной нервной системы и их воздействием на миелиновые оболочки.
Произведено несколько анализов дифференцировки клеток олигодендроглии и поражений, вызванных рассеянным склерозом, путем визуализации микроматрицы с дифференциальной экспрессией генов
(DGE, Scarlato et al., 2000; Whitney et al., 1999). При выполнении указанных анализов использованы разные матричные методы для оценки разных наборов генов. Анализ экспрессии генов в дифференцирующих олигодендроцитах и местах поражения рассеянным склерозом позволил выявить существенные изменения в экспрессии миелинспецифических генов. Кроме того, обнаружены нарушения в регуляции
других генов, многие из которых, как известно, участвуют в таких процессах, как управление циклом
развития клетки, реорганизация цитоскелета и направленная миграция через мембрану (Scarlato et al.,
2000).
Остеопонтин является сильно фосфорилированным сиалопротеином, который является основным
компонентом минерализованных внеклеточных матриксов костей и зубов. Остеопонтин (OPN) характеризуется наличием последовательности полиаспарагиновой кислоты и сайтов фосфорилирования Ser/Thr,
которые опосредуют связывание гидроксиапатита с очень консервативным фрагментом RGD, опосредующим связывание с клетками/передачу сигналов. Экспрессия остеопонтина в разных тканях свиде- 11 -
006655
тельствуют о множестве функций, в выполнении которых участвует один или несколько указанных консервативных фрагментов. Хотя отсутствие четко выраженного фенотипа у мышей с удаленным OPN не
позволяет определить конкретную роль остеопонтина в любой ткани, недавно выполненные исследования позволили получить новые данные о многостороннем участии указанного белка в разных биологических процессах, включая процессы развития, заживления ран, иммунологические реакции, онкогенность,
резорбцию костей и кальциноз. Способность остеопонтина стимулировать клеточную активность благодаря наличию многочисленных рецепторов, связанных с несколькими взаимодействующими путями передачи сигналов, можно объяснить его функциональным многообразием (Sodek et al.).
Кроме того, известно, что остеопонтин экспрессирован в главных сенсорных нейронах спинной и
тройничной нервной системы крысы как в теле нейронов, так и в аксонах (Ichikawa et al., 2000).
мРНК остеопонтина экспрессирована в головном мозге взрослого человека, о чем свидетельствуют
результаты гибридизации in situ. Экспрессия обнаружена в нейронах обонятельной луковицы и стволе
мозга, причем в стволе мозга указанная экспрессия обнаружена в функционально различных областях,
включая области, связанные с моторной функцией, сенсорную систему и нейроглию (Shin et al., 1999).
В другом исследовании изучена пространственная и временная экспрессия мРНК остеопонтина после ишемии переднего мозга у крыс. Временная индукция мРНК OPN после общей ишемии происходит
раньше в полосатом теле, чем в гиппокампе. Указанное явление четко выражено в дорсомедиальном полосатом теле рядом с боковым желудочком, в подобласти Са1 и подушковидном мицелии гиппокампа до
усиления активности микроглиальных клеток. Данное явление можно также обнаружить в зубчатых воротах и пограничной области СА3 (Lee MY, Shin SL, Choi YS, Kirn EJ, Cha JH, Chun MN, Lee SB, Kim
SY, Neurosci Lett, 1999 Aug 20, 271:2, 81-4).
Остеопонтин именуется также Eta-1. В заявке на патент WO 00/63241 описаны способы модуляции
иммунных реакций, в частности, способы модуляции иммунных реакций типа 1 при помощи модуляторов Eta-1 (активация ранних Т-лимфоцитов-1)/остеопонтина. Модуляторы остеопонтина считаются пригодными для лечения инфекционных заболеваний, иммунных нарушений и заболеваний, аутоиммунных
нарушений, включая рассеянный склероз, разные иммунодефициты и злокачественные опухоли. Все модуляторы остеопонтина, описанные в заявке на патент WO 00/63241, которые считаются полезными для
лечения аутоиммунных заболеваний, включая рассеянный склероз, являются ингибиторами
остеопонтина/Eta-l, что подробно рассмотрено в разделе V "Clinical Applications of the Modulatory Methods of the Invention", D "Autoimmune Diseases", на страницах 51-53 заявки на патент WO 00/63241.
Интерфероны представляют подкласс цитокинов, обладающих противовоспалительной, антивирусной и антипролиферативной активностью. С учетом биохимических и иммунологических свойств природные интерфероны человека сгруппированы в три класса: интерферон альфа (лейкоцит), интерферон
бета (фибробласт) и интерферон гамма (иммунный). Альфа-интерферон в настоящее время принят в
США и других странах для лечения волосато-клеточного лейкоза, остроконечных кондилом, саркомы
Капоши (злокачественной опухоли, обычно поражающей больных с синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД)) и хроническими гепатитами, не относящимися к типу А и В.
Кроме того, интерфероны (IFN) являются гликопротеидами, продуцируемыми организмом в ответ
на вирусную инфекцию. Интерфероны подавляют размножение вирусов в защищенных клетках. IFN,
включающие низкомолекулярный белок, не обладают специфическим действием, то есть IFN, индуцированный одним вирусом, не оказывает эффективного воздействия на другие вирусы. Однако интерфероны
являются видоспецифическими, то есть IFN, продуцированный одним видом, стимулирует антивирусную активность в клетках такого же или родственного вида. Интерфероны составляют первую группу
цитокинов, используемых благодаря наличию у них противоопухолевой и антивирусной активности.
Тремя главными интерферонами являются IFN-α, IFN-β и IFN-γ. Основные виды интерферонов
первоначально были классифицированы в зависимости от образующих их клеток (лейкоцит, фибробласт
или Т-клетка). Однако затем стало известно, что одна клетка может продуцировать интерфероны нескольких типов. Поэтому интерферон лейкоцита теперь именуется IFN-α, интерферон фибробласта именуется IFN-β и интерферон Т-клеток именуется IFN-γ. Кроме того, существует интерферон четверного
типа, IFN лимфобластоидов, продуцируемый в линии клеток "Namalwa" (выделенных из лимфомы Беркитта), которая, по-видимому, продуцирует смесь интерферонов лейкоцита и фибробласта.
Единица интерферона является мерой активности IFN (определяемой произвольно), представляющей количество, необходимое для защиты 50% клеток от поражения вирусом.
В каждом классе IFN имеется несколько отдельных типов.
IFN-β и IFN-γ являются продуктом одного гена. Разница между отдельными типами состоит, повидимому, в разном гликозилировании.
Интерфероны IFN-α образуют наиболее разнообразную группу, включающую примерно 15 типов.
Существует кластер генов IFN-α в хромосоме 9, включающий по крайней мере 23 члена, из которых 15
являются активными и транскрибированными. Зрелый интерферон IFN-α не гликозилирован.
Интерфероны IFN-α и IFN-β имеют одинаковую длину (165 или 166 аминокислот) и обладают аналогичной биологической активностью. Интерфероны IFN-γ имеют длину, равную 146 аминокислотам, и
- 12 -
006655
в меньшей степени схожи с интерферонами классов α и β. Только интерфероны IFN-γ могут активировать макрофаг или индуцировать созревание Т-клеток-киллеров. Фактически новые типы лечебных
средств могут быть названы модификаторами биологической реакции (BRM), так как они определяют
реакцию организма на опухоль, влияя на узнавание при помощи иммуномодуляции.
Интерферон фибробластов человека (IFN-β), в частности, обладает антивирусной активностью и
может стимулировать естественные клетки-киллеры против неопластических клеток. Данный интерферон представляет полипептид длиной около 20000 Да, индуцируемый вирусами и двухцепочечной РНК.
На основании нуклеотидной последовательности гена для интерферона фибробласта, клонированного
методом рекомбинантных ДНК, Derynk R. et а1., 1980 вывели полную аминокислотную последовательность белка. Данная последовательность имеет длину, равную 166 аминокислотам.
Shepard H.M. et аl., 1981 описали мутацию у основания 842 (Cys → Тyr в положении 141), которая
аннулирует антивирусную активность, и получили вариантный клон с делецией нуклеотидов 1119-1121.
Mark D.F. et al., 1984 внесли искусственную мутацию, заменив основание 469 (Т) основанием (А) ,
в результате чего происходит замена аминокислоты Cys → Ser в положении 17. Сообщалось, что полученный IFN-β обладает такой же активностью, что и нативный IFN-β и сохраняет стабильность при длительном хранении (-70°С).
Ребиф® (рекомбинантный интерферон-β человека) представляет последнюю разработку в области
лечения интерфероном рассеянного склероза и является важным достижением. Ребиф® является интерфероном (IFN)-бета 1a, продуцируемым линиями клеток млекопитающего, который фактически идентичен естественной молекуле человека.
Механизмы воздействия интерферонов полностью не изучены. Однако в большинстве случаев указанные интерфероны влияют на индукцию или транскрипцию определенных генов, воздействуя таким
образом на иммунную систему. Результаты исследований in vitro показывают, что интерфероны способны индуцировать или подавлять примерно 20 генных продуктов.
IFN-β может действовать в трех основных направлениях при лечении рассеянного склероза, таких
как:
регуляция функций Т-клеток, включающая активацию, пролиферацию и функцию супрессорных
клеток;
модуляция продуцирования цитокинов, включающая сокращение провоспалительных цитокинов и
увеличение ингибирующих, противовоспалительных цитокинов;
регуляция миграции и инфильтрации Т-клеток в центральную нервную систему через гематоэнцефалический барьер (ВВВ).
При выполнении исследования PRISMS установлена эффективность интерферона бета-1a при подкожном введении три раза в неделю для лечения рецидивно-ремиттирующего рассеянного склероза (RRMS). Результаты выполненного исследования показывают, что интерферон бета-1a может положительно
воздействовать на хроническую форму рассеянного склероза, уменьшая число и тяжесть рецидивов, делая болезнь менее обременительной и замедляя ее развитие, о чем свидетельствуют результаты измерения методом MRI. (Randomised, Double-Blind, Placebo-Controlled Study of interferon beta-1a in Relapsingremitting Multiple Sclerosis", The Lancet 1998; 352 (7 November, 1998): 1498-1504).
Ссылки на документы, приведенные в данном описании изобретения, не следует рассматривать как
признание того, что такой документ является прототипом или имеет отношение к патентоспособности
формулы изобретения настоящей заявки. Любое заявление относительно содержания или даты любого
документа основано на информации, известной заявителям в момент подачи заявки, и не содержит признания правильности такого заявления.
Краткое изложение существа изобретения
Объектом настоящего изобретения является новое средство для лечения и/или профилактики неврологического заболевания.
В основе данного изобретения лежит открытие того, что белок остеопонтин стимулирует пролиферацию и дифференцировку глиальных клеток, способствуя таким образом миелинизации и регенерации
нервов. В соответствии с настоящим изобретением установлено, что остеопонтин оказывает благоприятное действие на животные модели рассеянного склероза и периферических невропатий.
Таким образом, настоящее изобретение относится к применению остеопонтина или агониста активности остеопонтина для лечения неврологического заболевания, такого как травматическое повреждение
нерва, инсульт, демиелинизирующие заболевания центральной или периферической нервной системы,
невропатии и нейродегенеративные заболевания.
В соответствии с настоящим изобретением остеопонтин можно также использовать в комбинации с
интерфероном для лечения и/или профилактики неврологических заболеваний. В объем настоящего изобретения входит также применение молекул нуклеиновых кислот, экспрессирующих векторов, содержащих остеопонтин, и клеток, экспрессирующих остеопонтин, для лечения и/или профилактики неврологических заболеваний. Данное изобретение далее относится к фармацевтическим композициям, содер-
- 13 -
006655
жащим остеопонтин и интерферон необязательно вместе с одним или несколькими фармацевтически
приемлемыми наполнителями.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1А показана гистограмма, отображающая уровни экспрессии остеопонтина после введения
купризона в течение разных периодов времени, которые определяют при помощи анализа TaqMan®. 3/5
w. Cup означает введение купризона в течение трех или пяти недель, 5 w. cup + 1/3/6 w. означает введение купризона в течение пяти недель и восстановление в течение одной, трех или шести недель после
прекращения введения купризона.
На фиг. 1В показана регуляция остеопонтина, мРНК МBР и PLP по сравнению с контрольными
уровнями С1, которую измеряют при помощи анализа TaqMan® на разных стадиях развития мозжечка. С
1 to 20 означает послеродовое развитие мозжечка с 1-го по 20-ый день, СА означает мозжечок взрослого
человека.
На фиг. 2 схематически изображена структура остеопонтина и его известных изоформ, а также С- и
N-концевых конструкций.
На фиг. 3 схематически изображена плазмида Рас, содержащая кодирующую последовательность
остеопонтина.
На фиг. 4 показана гистограмма, иллюстрирующая увеличение мРНК остеопонтина в линии олигодендроцитных клеток oli-neu, подвергнутых воздействию сАМР в течение 6 часов (1), 2 дней (2), 6 дней
(3) или 10 дней (4) по сравнению с контрольным образцом. В столбцах 5 и 6 показаны уровни мРНК остеопонтина при выполнении эксперимента с использованием купризона. (5): обработка купризоном в
течение 3 недель, (6) обработка купризоном в течение 5 недель.
На фиг. 5 схематически изображена плазмида pDEST 12.2, содержащая кодирующую последовательность остеопонтина.
На фиг. 6 схематически изображена плазмида pDEST 12.2, содержащая кодирующую последовательность остеопонтина и кодирующую последовательность EGFP, флуоресцентного маркера.
На фиг. 7 схематически изображена плазмида pDEST 12.2, содержащая кодирующую последовательность остеопонтина с HIS-меткой.
На фиг. 8 показана пролиферация клеток oli-neu после культивирования в среде без инсулина и 24часовой обработки остеопонтином, экспрессированным в бакуловирусе (Baculo-OPN) , или остеопонтином, экспрессированным к клетках НЕК (HEK-OPN). Результаты анализа оценивают на основании флуоресценции алламарового синего, представляющего краситель, используемый для окрашивания живых
клеток.
На фиг. 9 показана кривая зависимости "доза-эффект" для пролиферации клеток oli-neu при отсутствии инсулина после 24-часовой обработки остеопонтином (BAC-OPN), экспрессированным в бакуловирусе, и остеопонтином (HEK-OPN), экспрессированным в клеткам НЕК.
На фиг. 10 показана пролиферация клеток oli-neu после культивирования в среде без инсулина и
обработки непроцессированным остеопонтином, экспрессрованным в бакуловирусе, (BacOPN) или Nконцевым фрагментом остеопонтина (N-концевой BacOPN).
На фиг. 11 показаны результаты иммуногистохимического анализа МBР в смешанных кортикальных культурах, обработанных 100 нМ рекомбинантного остеопонтина, экспрессированного в бакуловирусе. А = контрольный образец; В = образец, обработанный OPN; С =увеличение В; D = другое поле
смешанных кортикальных клеток, обработанных OPN, где не видно аксонов.
На фиг. 12 показано увеличение белка МBР при миелинизации смешанных кортикальных культур
после обработки фактором ингибирования лейкоза мышей (LIF) и остеопонтином, экспрессированным в
бакуловирусе, измеренное методом ELISA.
На фиг. 13 показана пролиферация клеток CG4 после обработки in vitro разными дозами (10 пМ, 10
нМ, 100 нМ) фосфорилированного остеопонтина, экспрессированного в клетках Е. coli, (OPN-E-coli), или
остеопонтина, экспрессированного в бакуловирусе (OPN Вас).
На фиг. 14 показаны периваскулярные воспалительные инфильтраты, присутствующие в спинном
мозге мышей, страдающих ЕАЕ, которым подкожно вводили носитель (PBS), носитель и 0,1% BSA, 1, 10
или 100 мкг/кг AS900011 (остеопонтин) или комбинацию из 100 мкг/кг AS900011 и 20000 единиц/мышь
мышиного интерферона бета (mlFNβ) или только 20000 единиц/мышь мышиного интерферона mlFNβ.
На фиг. 15 показано процентное значение демиелинизации в спинном мозге мышей, страдающих
ЕАЕ, которым подкожно вводили носитель (PBS), носитель и 0,1% BSA, 1, 10 или 100 мкг/кг AS900011
(остеопонтин) или комбинацию из 100 мкг/кг AS900011 и 20000 единиц/мышь мышиного интерферона
бета (mlFNβ) или только 20000 единиц/мышь мышиного интерферона mlFNβ.
На фиг. 16 показаны полученные в конце лечения клинические оценки воспалительной инфильтрации и демиелинизации у мышей, страдающих ЕАЕ, которым подкожно вводили носитель (PBS), носитель и 0,1% BSA, 1, 10 или 100 мкг/кг AS900011 (остеопонтин) или комбинацию из 100 мкг/кг AS900011
и 20000 единиц/мышь мышиного интерферона бета (mlFNβ) или только 20000 единиц/мышь мышиного
интерферона mlFNβ.
- 14 -
006655
На фиг. 17 показана масса тела мышей, страдающих невропатией, вызванной сдавливанием седалищного нерва, которым вводили носитель, 1, 10 или 100 мкг/кг остеопонтина (Ost), 10 мкг/кг положительного контрольного соединения (4-МС) или 100 мкг/кг денатурированного остеопонтина (Ost-D).
На фиг. 18 показана амплитуда мышечного потенциала действия соединения у мышей, страдающих
невропатией, которым вводили носитель, 1, 10 или 100 мкг/кг остеопонтина (Ost), 10 мкг/кг положительного контрольного соединения (4-МС) или 100 мкг/кг денатурированного остеопонтина (Ost-D).
На фиг. 19 показан скрытый период мышечного потенциала действия соединения у мышей, страдающих невропатией, которым вводили носитель, 1, 10 или 100 мкг/кг остеопонтина (Ost), 10 мкг/кг положительного контрольного соединения (4-МС) или 100 мкг/кг денатурированного остеопонтина (OstD).
На фиг. 20 показана продолжительность мышечного потенциала действия соединения у мышей,
страдающих невропатией, которым вводили носитель, 1, 10 или 100 мкг/кг остеопонтина (Ost), 10 мкг/кг
положительного контрольного соединения (4-МС) или 100 мкг/кг денатурированного остеопонтина (OstD).
На фиг. 21 показано процентное значение дегенерированных волокон у мышей, страдающих невропатией, которым вводили носитель, 1, 10 или 100 мкг/кг остеопонтина (Ost), 10 мкг/кг положительного
контрольного соединения (4-МС) или 100 мкг/кг денатурированного остеопонтина (Ost-D).
На фиг. 22 показано общее количество волокон в поле у мышей, страдающих невропатией, которым
вводили носитель, 1, 10 или 100 мкг/кг остеопонтина (Ost), 10 мкг/кг положительного контрольного соединения (4-МС) или 100 мкг/кг денатурированного остеопонтина (Ost-D).
Подробное описание изобретения
В основе настоящего изобретения лежит открытие того, что остеопонтин дифференциально экспрессируется в процессе дифференцировки олигодендроцитов и развития мозжечка. Кроме того, установлено, что экспрессия кДНК остеопонтина в олигодендроцитах вызывает образование дифференцированного фенотипа указанных клеток in vitro. При экспрессии остеопонтина олигодендроциты образуют
фенотип, подобный фенотипу дифференцирующей, миелинизирующей клетки. Помимо вышеуказанных
открытий, сделанных in vitro, установлено, что остеопонтин и, в частности, комбинация остеопонтина и
интерферона оказывает благоприятное воздействие на исследуемую модель рассеянного склероза. В экспериментальной модели периферической невропатии остеопонтин оказывает выраженное благоприятное
воздействие на активность нервов и значительно уменьшает дегенерацию в процентном выражении и
повышает степень миелинизации.
Экспериментальные данные, приведенные в данном описании изобретения, свидетельствуют о новой возможности лечения неврологических заболеваний, в частности, заболеваний, обусловленных
функцией нервных и глиальных клеток. Указанные открытия являются особенно удивительными с учетом того, что в заявке на патент WO 00/63241 сказано о необходимости ингибирования остеопонтина для
лечения рассеянного склероза.
Таким образом, данное изобретение относится к использованию остеопонтина или агониста активности остеопонтина и получению лекарственного средства для лечения и/или профилактики неврологических заболеваний.
Термин "остеопонтин" в используемом здесь значении означает непроцессированный остеопонтин
человека, имеющий аминокислотную последовательность, открытую в конце восьмидесятых годов (Oldberg et al., 1986; Kiefer et al., 1989). Последовательность остеопонтина человека определяется в прилагаемом списке последовательностей как SEQ ID No.l. Термин "остеопонтин" в используемом здесь значении
относится также к любому остеопонтину, выделенному из организма таких животных, как мыши, крупный рогатый скот или крысы, если указанный остеопонтин обладает достаточной идентичностью для
сохранения активности остеопонтина и если полученная молекула не является иммуногенной для человека.
Термин "остеопонтин" в используемом здесь значении далее относится к биологически активным
мутеинам и фрагментам, таким как естественные изоформы остеопонтина. Остеопонтин экспрессирован
в функционально различных формах, которые отличаются на уровне транскрипции (альтернативный
сплайсинг) и посттрансляционных модификаций (фосфорилирование, гликозилирование). Известны три
варианта сплайсинга OPN, определяемые как ОРN-а (далее именуемый также "непроцессированным"
остеопонтином), OPN-b и OPN-c (SEQ ID No. 1, 2 и 3, приведенные в прилагаемом списке последовательностей, также показаны на фиг. 2). Изоформы описаны Коn et al., 2000 и исследованы Saitoh et al.,
1995 и Коn et al., 2002.
Расщепление тромбина вызывает образование in vivo двух фрагментов протеолитического расщепления, включающих N- и С-концевые части белка. Фосфорилирование остеопонтина, в частности, Сконцевой части белков может иметь важное значение для функционирования остеопонтина. Поэтому
термин "остеопонтин" в используемом здесь значении включает также указанные протеолитическе
фрагменты и дифференциально фосфорилированные формы остеопонтина.
Термин "остеопонтин" в используемом здесь значении включает также изоформы, мутеины, слитые
белки, функциональные производные, активные фракции или фрагменты, производные с циклическими
- 15 -
006655
перестановками или их соли. Указанные изоформы, мутеины, слитые белки или функциональные производные, активные фракции или фрагменты, производные с циклическими перестановками сохраняют
биологическую активность остеопонтина. Они предпочтительно обладают лучшей биологической активностью по сравнению с остеопонтином дикого типа.
Термин "агонист активности остеопонтина" в используемом здесь значении означает молекулу,
стимулирующую или имитирующую активность остеопонтина, в частности, антитела-агонисты рецептора остеопонтина или низкомолекулярные агонисты, активирующие передачу сигналов через рецептор
остеопонтина. Функцию остеопонтина опосредуют по крайней мере две группы рецепторов. Во-первых,
он взаимодействует с αv-интегринами (рецепторы интегринов αvβ3 и αvβ5, действующие через фрагмент связывания с клеткой RGD (Arg-Gly-Asp)) при положительном влиянии марганца (Kunicki et а1.,
1997). Во-вторых, он взаимодействует с вариантной изоформой CD44 v6-v10. Считается, что С-концевая
часть остеопонтина взаимодействует с CD44 и N-концевая часть остеопонтина взаимодействует с рецепторами интегрина в процессе пролиферации, сохранения жизнеспособности и дифференцировки макрофагов. N-концевая часть остеопонтина также индуцирует высвобождение IL-12 и IL-10. Любой агонист,
стимулятор или энхансер любого из указанных рецепторов входит в определение термина "агонист активности OPN" в используемом здесь значении.
Термин "агонист активности остеопонтина" в используемом здесь значении далее относится к агентам, усиливающим опосредуемую остеопонтином активность, такую как стимуляция связывания клетки
с компонентами внеклеточного матрикса, морфогенез интомиелин-продуцирующих клеток линии дифференцировки олигодендроцитов, стимуляция рекрутинга, пролиферации, дифференцировки или созревания клеток линии дифференцировки олигодендроцитов (таких как недифференцированные или дифференцированные клетки-предшественники), стимуляция защиты клеток линии дифференцировки олигодендроцитов от апоптоза и повреждения клеток.
Термины "лечение" и "профилактика" в используемом здесь значении означают предупреждение,
подавление, ослабление, смягчение или устранение одного или нескольких симптомов или причин неврологического заболевания, а также симптомов, заболеваний или осложнений, сопутствующих неврологическому заболеванию. "Лечение" неврологического заболевания предполагает введение веществ по
настоящему изобретению после возникновения болезни, "профилактика" предполагает введение указанных веществ до появления признаков заболевания у нуждающегося субъекта.
Термин "неврологические заболевания" в используемом здесь значении означает все известные
неврологические болезни, расстройства или поражения центральной или периферической нервной системы, включая подробно описанные в разделе "Предпосылки изобретения".
Неврологические заболевания включают болезни, обусловленные нарушением функции центральной или периферической нервной системы, например, болезни, связанные с передачей нервных импульсов, головной болью, черепно-мозговой травмой, инфекционными поражениями центральной нервной
системы, нейроофтальмологическими расстройствами и поражениями черепного нерва, функцией и дисфункцией долей головного мозга, вызывающей нарушение подвижности, ступор и кому, демиелинизирующие заболевания, делеций и старческое слабоумие, нарушения в черепно-цервикальной области,
эпилептические припадки, поражения спинного мозга, расстройства сна, нарушения периферической
нервной системы, цереброваскулярные или мышечные заболевания. Для ознакомления с указанными
заболеваниями см., например, http:/www.merck.com/pubs/mmanual/sectionl4/secl4.htm.
Неврологические заболевания по данному изобретению предпочтительно выбирают из группы,
включающей травматическое повреждение нервов, инсульт, демиелинизирующие заболевания центральной или периферической нервной системы и нейродегенеративные заболевания.
Травматическое повреждение нервов может относиться к периферической или центральной нервной системе и представлять черепно-мозговую травму или травму позвоночника, включая параплегию,
описанные в разделе "Предпосылки изобретения".
Инсульт может быть вызван гипоксией или ишемией головного мозга. Указанное заболевание также называется цереброваскулярным заболеванием или сосудистым расстройством. Инсульт может вызывать утрату функций головного мозга (неврологические расстройства) в результате нарушения кровообращения в некоторых участках головного мозга. Нарушение кровообращения может быть вызвано сгустками крови, образующимися в головном мозге (тромбы) и частицами атеросклеротических бляшек или
других веществ, попавших в мозг из других частей тела (эмболия). Кровотечение (кровоизлияние) в головном мозге может вызвать симптомы, подобные инсульту. Наиболее распространенной причиной инсульта является вторичный инсульт вследствие атеросклероза (тромбоз головного мозга), поэтому данное изобретение относится также к лечению атеросклероза.
Периферическая невропатия может представлять синдром потери чувствительности, мышечной
слабости и атрофии, ухудшения глубоких сухожильных рефлексов и включать вазомоторные симптомы,
проявляющиеся отдельно или в любом сочетании. Невропатия может поражать отдельный нерв (мононевропатия), два или большее число нервов в разных частях тела (множественная мононевропатия) или
несколько нервов одновременно (полневропатия). Прежде всего могут быть поражены аксоны (например, в случае сахарного диабета, болезни Лайма, уремии или под воздействием токсических веществ),
- 16 -
006655
миелиновая оболочка или клетки Шванна (например, в случае острой или хронической воспалительной
полиневропатии, лейкодистрофии или синдрома Гийена-Барре). Другие невропатии, которые можно лечить способом по настоящему изобретению, могут возникать вследствие токсического воздействия
свинца, приема дапсона, укуса клеща, порфирии или синдрома Гийена-Барре и прежде всего поражают
двигательные нервные волокна. Другие невропатии, возникающие вследствие ганглионита заднего корешка, злокачественных опухолей, лепры, СПИД, сахарного диабета или хронической интоксикации
пиридоксином, прежде всего поражают ганглий заднего корешка или чувствительное нервное волокно,
вызывая ухудшение чувствительности. Могут быть также поражены черепно-мозговые нервы, например,
в случае синдрома Гийена-Барре, болезни Лайма, сахарного диабета и дифтерии.
Болезнь Альцгеймера представляет заболевание, характеризующееся ухудшением умственной деятельности в результате изменений, происходящих в тканях головного мозга. Указанные изменения могут
включать сокращение тканей головного мозга, дегенеративное слабоумие и диффузную атрофию головного мозга. Болезнь Альцгеймера также называют старческим слабоумием по типу болезни Альцгеймера
(SDAT).
Болезнь Паркинсона представляет заболевание головного мозга, характеризующееся дрожанием,
затруднением походки, движений и координации. Данное заболевание обусловлено поражением части
головного мозга, управляющей движением мышц, и называется также дрожащим параличом.
Болезнь Гентингтона является наследственным, основным аутосомным неврологическим заболеванием.
Боковой амиотрофический склероз (ALS) представляет заболевание, вызывающее прогрессирующее ухудшение управления нервами произвольно сокращающимися мышцами вследствие разрушения
нервных клеток в головном и спинном мозге. Боковой амиотрофический склероз, именуемый также болезнью Лу Герига, является заболеванием, характеризующимся нарушением управления мышечной деятельностью.
Рассеянный склероз (MS) является воспалительным демиелинизирующим заболеванием центральной нервной системы (CNS), которое имеет рецидивно-ремиттирующий или прогрессирующий характер.
Рассеянный склероз является не единственным демиелинизирующим заболеванием. Другим подобным
заболеванием в периферической нервной системе является хроническая воспалительная демиелинизирующая полирадикулоневропатия (CIDP). Кроме того, существуют острые, однофазовые заболевания,
такие как воспалительная демиелинизирующая полирадикулоневропатия, именуемая синдромом ГийенаБарре (GBS), в периферической нервной системе и острый диссеминирующий энцефаломиелит (ADEM)
в центральной нервной системе.
Другие неврологические заболевания включают невропатии с нарушением миелинизации, описанные в приведенном выше разделе "Предпосылки изобретения", а также запястный синдром. Травматическое повреждение нерва может сопровождаться ортопедическими осложнениями позвоночника, которые
также входят в объем настоящего изобретения.
Неврологические заболевания могут возникать вследствие врожденных нарушений обмена веществ.
Поэтому предпочтительный вариант осуществления данного изобретения относится также к неврологическому заболеванию, возникающему в результате врожденного нарушения обмена веществ.
Наследственные нарушения обмена веществ, входящие в объем настоящего изобретения, включают
фенилкетонурию и другие аминоацидурии, болезни Тая-Саша, Ниманна-Пика и Гоше, синдром Гурлера,
болезнь Краббе и другие лейкодистрофии. Указанные заболевания могут воздействовать на образующуюся миелиновую оболочку, главным образом в центральной нервной системе.
Неврологические заболевания, вызываемые наследственными нарушениями обмена веществ, также
подробно описаны в разделе "Предпосылки изобретения".
В объем настоящего изобретения входят также менее известные неврологические заболевания, такие как нейрофиброматоз или множественная системная атрофия (MSA). Другие нарушения, подлежащие лечению способом по настоящему изобретению, подробно описаны в приведенном выше разделе
"Предпосылки изобретения".
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения неврологическое заболевание
является периферической невропатией, наиболее предпочтительно диабетической невропатией. В объем
настоящего изобретения также входят невропатии, вызванные химиотерапией.
Термин "диабетическая невропатия" означает любую форму диабетической невропатии, один или
несколько симптомов или нарушений, сопровождающих диабетическую невропатию или вызываемых
указанным заболеванием, или поражающие нервы осложнения, вызываемые диабетом, подробно описанные в приведенном выше разделе "Предпосылки изобретения". Диабетическая невропатия может
представлять полиневропатию. В случае диабетической полиневропатии могут быть одновременно поражены многие нервы. Диабетическая невропатия может также представлять мононевропатию. В случае
местной мононевропатии болезнь, например, поражает один нерв, такой как глазодвигательный или отводящий черепной нерв. Указанное заболевание может также представлять множественную мононевропатию, при которой могут быть поражены два или большее число нервов в разных частях тела.
- 17 -
006655
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения неврологическое заболевание
является демиелинизирующим заболеванием. Демиелинизирующие заболевания предпочтительно включают демиелинизирующие нарушения центральной нервной системы, такие как острый диссеминированный энцефаломиелит (ADEM) и рассеянный склероз (MS), а также демиелинизирующие заболевания
периферической нервной системы (PNS). Указанные последними заболевания включают хроническую
воспалительную демиелинизирующую полирадикулоневропатию (CIDP) и острые монофазовые заболевания, такие как воспалительная демиелинизирующая полирадикулоневропатия, именуемая синдромом
Гийена-Барре (GBS).
Другой предпочтительный вариант осуществления изобретения относится к лечению и/или профилактике нейродегенеративного заболевания. Нейродегенеративное заболевание выбирают из группы,
включающей болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Гентингтона и ALS.
Остеопонтин предпочтительно представляет пептид, полипептид или белок, выбираемый из группы, состоящей из:
(а) полипептида, содержащего SEQ ID No. 1;
(b) полипептида, содержащего аминокислоты 1-168 или 170 SEQ ID No. 1;
(c) полипептида, содержащего аминокислоты 1-16 и 170-314 SEQ ID No. 1;
(d) полипептида, содержащего аминокислоты 170-314 SEQ ID No. 1;
(e) полипептида, содержащего SEQ ID No. 2;
(f) полипептида, содержащего SEQ ID No. 3;
(g) мутеина любого полипептида по пунктам (a)-(f), в котором аминокислотная последовательность
по крайней мере на 40, или 50, или 60, или 70, или 80, или 90% идентична по крайней мере одной из последовательностей (a)-(f);
(h) мутеина любого из полипептидов (a)-(f), кодируемого последовательностью ДНК, которая гибридизуется с комплементом последовательности нативной ДНК, кодирующей любой из полипептидов
(a)-(f), в умеренно жестких условиях или очень жестких условиях;
(i) мутеина любого полипептида по пунктам (a)-(f), в котором любые изменения аминокислотной
последовательности представляют консервативные аминокислотные замены в аминокислотных последовательностях (a)-(f);
(j) соли или изоформы, слитого белка, функционального производного, активной фракции или производного с циклическими перестановками любого из полипептидов (a)-(f).
Активные фракции или фрагменты могут включать любую часть или домен любой изоформы остеопонтина, такой как N-концевая часть или С-концевая часть, или любой OPN-a, -b или -с, показанный
на фиг. 2. Фрагмент GRGDS может присутствовать, отсутствовать или мутировать. Сайт связывания с
гепарином может быть мутированным, позволяя получить остеопонтин, не связывающийся с гепарином.
Непроцессированный остеопонтин или любой его активный фрагмент может быть фосфорилирован у
одного или нескольких нижеследующих остатков серина, например, у остатков серина, находящихся в
следующих положениях: 8, 10, 11, 33, 46, 47, 60, 62, 65, 83, 86, 89, 92, 101, 104, 107, 110, 113, 153, 155,
175, 179, 199, 203, 208, 212, 218, 223, 227, 238, 242, 247, 251, 254, 259, 264, 275, 287, 292, 294, 295. Кроме
того, сайты фосфорилирования серина могут быть мутированы с заменой остатков серина остатками глутамата, чтобы имитировать фосфорилирование.
Специалисту в данной области должно быть понятно, что для выполнения указанной функции достаточны даже меньшие части остеопонтина, представляющего, например, активный пептид, включающий остатки незаменимых аминокислот, необходимых для функционирования остеопонтина.
Специалисту в данной области должно быть также понятно, что мутеины, соли, изоформы, слитые
белки, функциональные производные остеопонтина, активные фракции или производные остеопонтина с
циклическими перестановками сохраняют подобную или даже лучшую биологическую активность остеопонтина. Биологическую активность остеопонтина и мутеинов, изоформ, слитых белков или функциональных производных, активных фракций или фрагментов, производных с циклическими перестановками или их солей можно измерить при помощи анализа методом совместного культивирования,
описанного ниже в примере 8. Смешанные кортикальные культуры содержат олигодендроциты, а также
другие клетки, выделенные из центральной нервной системы (такие как нейроны, астроциты,
микроглии), и индуцируют или увеличивают количество типичных генов, участвующих в миелинизации,
подобных РО, МBР или MAG, при инкубации с OPN или мутеином, изоформой, фрагментом, активной
фракцией, функциональным производным или солью. Экспрессию указанных генов можно измерить при
помощи количественного анализа RT-PCR, выполняемого в реальном времени (RT-PCR TaqMan®), который подробно описан в нижеследующих примерах. Другим простым анализом, используемым для измерения активности OPN, является анализ пролиферации олигодендроцитов, включающий инкубацию
соответствующей линии клеток олигодендроцитов, такой как клетки oli-neu или CG4, с OPN, мутеином,
изоформой, фрагментом, активной фракцией, функциональным производным или солью, который описан в приведенном ниже примере 7.
Предпочтительные активные фракции обладают активностью, которая равна или лучше активности
непроцессированного остеопонтина или характеризуется другими преимуществами, такими как лучшая
- 18 -
006655
устойчивость, более низкая токсичность или иммуногенность, либо указанные фракции легче получить в
больших количествах или очистить. Специалисту в данной области должно быть понятно, что мутеины,
активные фрагменты и функциональные производные можно получить, клонируя соответствующую
кДНК в приемлемых плазмидах и испытывая при помощи анализа методом совместного культивирования, как указывалось выше.
Белки по настоящему изобретению могут быть гликозилированными или негликозилированными,
они могут быть выделены из естественных источников, таких как жидкости организма, или они могут
быть предпочтительно получены рекомбинантными методами. Рекомбинант может быть экспрессирован
в прокариотических экспрессирующих системах, таких как Е. coli, или в эукариотических системах, таких как клетки насекомых, предпочтительно в экспрессирующих системах млекопитающего, таких как
клетки яичника китайского хомячка (СНО) или клетки НЕК.
В используемом здесь значении термин "мутеины" означает аналоги остеопонтина, в которых один
или несколько аминокислотных остатков естественного остеопонтина заменены другими аминокислотными остатками или удалены, либо один или несколько аминокислотных остатков добавлены в естественную последовательность остеопонтина без существенного изменения активности полученных продуктов по сравнению с остеопонтином дикого типа. Указанные мутеины получают известными методами
синтеза и/или сайтнаправленного мутагенеза или любыми другими известными методами, пригодными
для данной цели.
Мутеины остеопонтипа, которые могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением, или кодирующие их нуклеиновые кислоты включают конечную совокупность соответствующих
последовательностей в качестве заменяющих пептидов или полинуклеотидов, которые могут быть получены специалистом в данной области без ненужного экспериментирования на основании материалов и
способов, представленных в данном описании изобретения.
Мутеины по настоящему изобретению включают белки, кодированные нуклеиновой кислотой, такой как ДНК или РНК, которые гибридизируют с ДНК или РНК, кодирующими OPN по настоящему
изобретению, в умеренных или очень жестких условиях. Термин "жесткие условия" относится к условиям гибридизации и последующей промывки, которые обычно определяются специалистами в данной
области как "жесткие". См. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y.,
§§ 6.3 and 6.4 (1987, 1992), and Sambrook et al. (Sambrook, J. C., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
Примеры жестких условий включают без каких-либо ограничений условия промывки при температуре на 12-20°С ниже вычисленной Тm исследуемого гибрида, например, 2 х SSC и 0,5% SDS в течение 5
мин, 2 х SSC и 0,1% SDS в течение 15 мин; 0,1 х SSC и 0,5% SDS при 37°С в течение 30-60 мин и затем
0,1 х SSC и 0,5% SDS при 68°С в течение 30-60 мин. Специалистам в данной области должно быть понятно, что строгость условий зависит также от длины последовательностей ДНК, олигонуклеотидных
зондов (например, 10-40 оснований) или смешанных олигонуклеотидных зондов. При использовании
смешанных зондов вместо SSC желательно использовать хлорид тетраметиламмония (ТМАС). См. приведенную выше публикацию Ausubel.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения любой такой мутеин по крайней мере на
40% идентичен или гомологичен последовательностям SEQ ID No. 1, 2 или 3, приведенным в прилагаемом списке последовательностей. Более предпочтительно такой мутеин по крайней мере на 50, 60, 70,
80% или наиболее предпочтительно по крайней мере на 90% идентичен или гомологичен указанным последовательностям.
Идентичность отображает взаимосвязь между двумя или большим числом полипептидных последовательностей или двумя или большим числом полинуклеотидных последовательностей, определяемую
путем сравнения последовательностей. Как правило, идентичность представляет точное соответствие
между нуклеотидами или аминокислотами в двух полинуклеотидах или двух полипептидных последовательностях на протяжении всей длины сравниваемых последовательностей.
Для последовательностей, не имеющих точного соответствия, можно определить % идентичности.
Две сравниваемые последовательности обычно выравнивают для достижения максимального соответствия между последовательностями. Указанный процесс может включать заполнение "разрывов" в одной
или обеих последовательностях для увеличения степени выравнивания, % идентичности можно определить на протяжении всей длины обеих последовательностей, подвергаемых сравнению (так называемое
глобальное выравнивание), что особенно подходит для последовательностей, имеющих одинаковую или
очень близкую длину, либо на протяжении более короткой заранее определенной длины (так называемое
локальное выравнивание), что больше подходит для последовательностей, имеющих разную длину.
Методы сравнения идентичности и гомологии двух или большего числа последовательностей хорошо известны в данной области. Для определения % идентичности между двумя полинуклеотидами, %
идентичности и % гомологии между двумя полипептидными последовательностями можно использовать
программы, входящие в пакет программ для анализа последовательностей Висконсина, версия 9.1 (Devereux J et al., 1984), например, программы BESTFIT и GAP. Программа BESTFIT использует алгоритм
"локальной гомологии" Смита и Вотермена (1981) и находит лучшую отдельную область сходства между
- 19 -
006655
двумя последовательностями. В данной области также известны другие программы для определения
идентичности и/или сходства между последовательностями, например, семейство программ BLAST
(Altschul S.F. et al., 1990, Altschul S.F. et al., 1997, указанные программы можно получить на странице
фирмы NCBI по адресу www.ncbi.nim.nih.gov) и FASTA (Pearson W.R., 1990; Pearson, 1988).
Предпочтительными изменениями для мутеинов по настоящему изобретению являются изменения,
известные как замены "консервативных аминокислот". Замены консервативных аминокислот в полипептидах остеопонтина могут включать синонимичные аминокислоты в группе, обладающей настолько
близкими физико-химическими свойствами, что в результате замены одних членов группы другими сохраняется биологическая функция молекулы (Grantham, 1974). Совершенно очевидно, что в вышеуказанных последовательностях можно производить инсерции и делеции аминокислот без изменения их функции, особенно если указанные инсерции или делеции охватывают лишь несколько аминокислот, например, менее тридцати, предпочтительно менее десяти, и при этом не удаляются и не заменяются аминокислоты, имеющие важное значение для функциональной конформации, например, остатки цистеина.
Белки и мутеины, полученные в результате таких делеций и/или инсерций, входят в объем настоящего
изобретения.
Группы синонимичных аминокислот предпочтительно являются группами, приведенными в табл. I.
Более предпочтительно группы синонимичных аминокислот являются группами, приведенными в табл.
II; и наиболее предпочтительно группы синонимичных аминокислот являются группами, приведенными
в табл. III.
Таблица I. Предпочтительные группы синонимичных аминокислот
- 20 -
006655
Таблица II. Более предпочтительные группы синонимичных аминокислот
Таблица III. Наиболее предпочтительные группы синонимичных аминокислот
- 21 -
006655
Примеры выполнения замен аминокислот в белках, которые можно использовать для получения
мутеинов остеопонтина, полипептидов или белков, пригодных для использования при осуществлении
настоящего изобретения, включают любые известные способы, например, описанные в патентах США
№№ 4959314, 4588585 и 4737462, выданных Mark et al.; № 5116943, выданном Koths et al., № 4965195,
выданном Namen et al. № 4879111, выданном Chong et al.; и № 5017691, выданном Lee et al.; белки с заменой лизина, описанные в патенте США № 4904584 (Shaw et al.).
Термин "слитый белок" означает полипептид, содержащий остеопонтин, его мутеин или фрагмент,
слитый с другим белком, который характеризуется продолжительным временем существования в жидкостях организма. Так, остеопонтин может быть слит с другим белком, полипептидом или тому подобным,
например, с иммуноглобулином или его фрагментом.
"Функциональные производные" в используемом здесь значении означают производные остеопонтина, их мутеины и слитые белки, которые могут быть получены из функциональных групп, присутствующих в виде боковых цепей у остатков, или N- или С-концевых групп, способами, известными в данной области, и входят в объем данного изобретения, если они остаются фармацевтически приемлемыми,
то есть не ухудшают активность белка, которая, по существу, подобна активности остеопонтина, и не
сообщают токсических свойств содержащим их композициям.
Указанные производные могут, например, включать полиэтиленгликолевые боковые цепи, которые
могут маскировать антигенные сайты и продлевать время нахождения остеопонтина в жидкостях организма. Другие производные включают сложные алифатические эфиры карбоксильных групп, амиды карбоксильных групп, получаемые в результате взаимодействия с аммиаком, первичными или вторичными
аминами, N-ацильные производные свободных аминогрупп аминокислотных остатков, получаемые при
взаимодействии с ацильными частями (например, алканоильными или карбоциклическими ароильными
группами), или O-ацильные производные свободных гидроксильных групп (например, остатков серила
или треонила), получаемые при взаимодействии с ацильными частями.
Термин "активные фракции" остеопонтина, мутеинов и слитых белков по настоящему изобретению
означает любой фрагмент или предшественник полипептидной цепи белковой молекулы, рассматриваемый отдельно или вместе с ассоциированными молекулами или присоединенными остатками, например,
остатки сахара или фосфата, либо агрегаты белковой молекулы или остатков сахара при условии, что
указанная фракция обладает активностью, по существу схожей с активностью остеопонтина.
Термин "соли" в используемом здесь значении означает как соли карбоксильных групп, так и кислотно-аддитивные соли аминогрупп молекулы OPN или его аналогов. Соли карбоксильной группы, которые можно получить способами, известными в данной области, включают неорганические соли, например, соли натрия, кальция, аммония, железа или цинка и тому подобные, и соли с органическими основаниями, получаемые, например, при взаимодействии с аминами, такими как триэтаноламин, аргинин
или лизин, пиперидин, прокаин и тому подобные. Кислотно-аддитивные соли включают, например, соли
с минеральными кислотами, такими как хлористо-водородная или серная кислоты, и соли с органическими кислотами, такими как уксусная или щавелевая кислоты. Любые такие соли должны сохранять
биологическую активность OPN по настоящему изобретению, то есть оказывать пролиферативное действие на олигодендроциты.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения остеопонтин слит с молекулойносителем, пептидом или белком, которые способствуют проникновению через гематоэнцефалический
барьер ("ВВВ"). Такое слияние обеспечивает направленную доставку молекулы к месту действия в тех
случаях, когда заболевание поражает центральную нервную систему. Способы доставки лекарственного
средства через гематоэнцефалический барьер предполагают разрушение ВВВ осмотическими или биохимическими средствами при помощи вазоактивных веществ, таких как брадикинин. Другие способы
преодоления ВВВ могут включать использование эндогенных систем переноса, включающих опосредуемые носителем транспортеры, такие как глюкозные и аминокислотные носители; опосредуемый рецептором трансцитоз для инсулина или трансферрина; и активные отточные транспортеры, такие как пгликопротеид. Способ доставки лекарственного средства через ВВВ далее включает внутримозговую
имплантацию.
Функциональные производные остеопонтина могут быть конъюгированы с полимерами для улучшения таких свойств белка, как устойчивость, период полувыведения, биологическая доступность, переносимость организмом человека или иммуногенность. Для достижения указанной цели остеопонтин может быть связан с полиэтиленгликолем (PEG). Связывание с полиэтиленгликолем можно произвести известными способами, описанными, например, в заявке на патент WO 92/13095.
Поэтому в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения остеопонтин конъюгирован с полиэтиленгликолем.
В другом предпочтительном варианте осуществления данного изобретения белок слит с иммуноглобулином (Ig). Слияние может быть прямым или при помощи короткого линкерного пептида, имеющего длину, равную 1-3 аминокислотным остаткам или больше, например, 13 аминокислотным остаткам.
Указанный линкер может представлять трипептид с последовательностью E-F-M (Glu-Phe-Met) или линкерную последовательность длиной 13 аминокислот, включающую Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu- 22 -
006655
Gly-Gly-Gln-Phe-Met, которая вставлена, например, между последовательностью остеопонтина и последовательностью иммуноглобулина. Полученный слитый белок обладает улучшенными свойствами, такими как более продолжительное существование в жидкостях организма (период полувыведения), повышенная удельная активность или более высокий уровень экспрессии. Слияние с Ig может также облегчить очистку слитого белка.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения остеопонтин слит с константной областью молекулы Ig. Остеопонтин предпочтительно сливают с областями тяжелых цепей
подобных доменам СН2 и СН3 IgG1 человека. Другие изоформы молекул Ig также пригодны для получения слитых белков по настоящему изобретению и включают такие изоформы, как IgG2 или IgG4, либо
другие классы Ig, например, подобные IgM. Слитые белки могут быть мономерными или многомерными,
гетеро- или гомомногомерными. Иммуноглобулиновая часть слитого белка может быть далее модифицирована таким образом, чтобы не активировать связывание комплемента, путь активации комплемента
или связывание с рецепторами Fc.
Данное изобретение далее относится к использованию комбинации остеопонтина и иммуносупрессора для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения и/или профилактики неврологических заболеваний при одновременном, последовательном или раздельном введении. Иммуносупрессорами могут быть стероиды, метотрексат, циклофосфамид, антитела против лейкоцитов (такие как
САМРАТН-1) и тому подобные.
Данное изобретение далее относится к использованию комбинации остеопонтина и интерферона
для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения и/или профилактики неврологических заболеваний при одновременном, последовательном или раздельном введении.
Термин "интерферон" в значении, используемом в данной заявке на патент, означает любую молекулу, имеющую такое определение в научной литературе, и включает любые типы интерферона, указанные в приведенном выше разделе "Предпосылки изобретения". Интерферон предпочтительно является
человеческим, но может быть выделен из других видов, если его биологическая активность подобна интерферонам человека и если данная молекула не является иммуногенной для человека.
Приведенное выше определение, в частности, включает все типы интерферонов IFN-α, IFN-β и IFNγ. IFN-β является предпочтительным интерфероном по настоящему изобретению.
Термин "интерферон-бета (IFN-β)" в значении, используемом в настоящем изобретении, означает
интерферон фибробласта человека, выделяемый из биологических жидкостей или получаемый методами
рекомбинантных ДНК из прокариотических или эукариотических клеток-хозяев, а также его соли, функциональные производные, варианты, аналоги и фрагменты.
"Функциональные производные" в используемом здесь значении означают производные, которые
могут быть получены из функциональных групп, присутствующих в виде боковых цепей у остатков, или
N- или С-концевых групп, при помощи способов, известных в данной области, и входят в объем данного
изобретения, если они являются фармацевтически приемлемыми, то есть не ухудшают биологическую
активность вышеописанных белков, такую как способность связываться с соответствующим рецептором
и инициировать передачу сигналов рецептором, и не сообщают токсических свойств содержащим их
композициям. Производные могут иметь химические части, такие как карбогидратные или фосфатные
остатки при условии, что такое производное сохраняет биологическую активность белка и остается фармацевтически приемлемым.
Производные могут включать, например, сложные алифатические эфиры карбоксильных групп,
амиды карбоксильных групп, получаемые в результате взаимодействия с аммиаком, первичными или
вторичными аминами, N-ацильные производные свободных аминогрупп аминокислотных остатков, получаемые при взаимодействии с ацильными частями (например, алканоильными или карбоциклическими
ароильными группами), или O-ацильные производные свободных гидроксильных групп (например, остатков серила или треонила), получаемые при взаимодействии с ацильными частями. Такие производные
могут включать также полиэтиленгликолевые боковые цепи, которые могут маскировать антигенные
сайты и продлевать существование молекулы в жидкостях организма.
Особое значение имеет белок, полученный в виде производного или объединенный с комплексообразующим агентом для увеличения периода существования. Например, в соответствии с настоящим изобретением можно использовать вышеуказанные варианты, конъюгированные с полиэтиленголиколем,
или белки, полученные методами рекомбинантных ДНК, для достижения более продолжительного действия в организме.
Термин "производные" означает только такие производные, в которых ни одна из двадцати обычно
присутствующих естественных аминокислот не заменена другой аминокислотой.
Термин "соли" в используемом здесь значении означает как соли карбоксильных групп, так и кислотно-аддитивные соли аминогрупп вышеописанных белков или их аналогов. Соли карбоксильной
группы, которые можно получить способами, известными в данной области, включают неорганические
соли, например, соли натрия, кальция, аммония, железа или цинка и тому подобные, и соли с органическими основаниями, получаемые, например, при взаимодействии с аминами, такими как триэтаноламин,
- 23 -
006655
аргинин или лизин, пиперидин, прокаин и тому подобные. Кислотно-аддитивные соли включают, например, соли с минеральными кислотами, такими как хлористо-водородная или серная кислоты, и соли с
органическими кислотами, такими как уксусная или щавелевая кислоты. Любые такие соли должны сохранять биологическую активность белков по настоящему изобретению (соответственно, остеопонтина и
интерферона IFN-бета), то есть они должны обладать способностью связываться с соответствующим рецептором и инициировать передачу сигналов рецептором.
Интерфероны могут быть также конъюгированы с полимерами для улучшения устойчивости
белков. Конъюгат между интерфероном β и полиолполиэтиленгликолем (PEG) описан, например, в заявке на патент WO 99/55377.
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения интерферон представляет интерферон-β (IFN-β) и более предпочтительно IFN-β1α.
Остеопонтин предпочтительно используют одновременно, последовательно или раздельно с интерфероном.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения остеопонтин используют в
количестве от около 0,0001 до 100 мг/кг массы тела, от около 0,01 до 10 мг/кг массы тела, от около 1 до 5
мг/ кг массы тела или около 2 мг/кг массы тела.
Данное изобретение далее относится к использованию молекулы нуклеиновой кислоты для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения и/или профилактики неврологического заболевания, причем молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из:
(a) полипептида, содержащего SEQ ID No. 1;
(b) полипептида, содержащего аминокислоту 1-168 или 170 SEQ ID No. 1;
(c) полипептида, содержащего аминокислоту 1-16 и 170-314 SEQ ID No. 1;
(d) полипептида, содержащего аминокислоту 170-314 SEQ ID No. 1;
(e) полипептида, содержащего SEQ ID No. 2;
(f) полипептида, содержащего SEQ ID No. 3;
(g) мутеина любого из полипептидов по пунктам (a)-(f), в котором аминокислотная последовательность по крайней мере на 40, или 50, или 60, или 70, или 80, или 90% идентична по крайней мере одной
из последовательностей (a)-(f);
(h) мутеина любого из полипептидов (a)-(f), кодируемого последовательностью ДНК, которая гибридизуется с комплементом последовательности нативной ДНК, кодирующей любой из полипептидов
(a)-(f), в умеренно жестких условиях или очень жестких условиях;
(i) мутеина любого из полипептидов (a)-(f), в котором любые изменения аминокислотной последовательности представляют консервативные аминокислотные замены в аминокислотных последовательностях (a)-(f);
(j) изоформы, слитого белка, функционального производного, активной фракции или производного
с циклическими перестановками любого из полипептидов (a)-(f).
Нуклеиновую кислоту можно вводить в виде голой молекулы нуклеиновой кислоты при помощи
внутримышечной инъекции.
Указанная молекула далее может включать векторные последовательности, такие как вирусная последовательность, пригодная для экспрессии гена, кодированного молекулой нуклеиновой кислоты в
организме человека, предпочтительно в соответствующих клетках или тканях.
Поэтому в предпочтительном варианте осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты
далее включает последовательность экспрессирующего вектора. Последовательности экспрессирующих
векторов, хорошо известные в данной области, включают другие элементы, служащие для экспрессии
представляющего интерес гена. Они могут включать регуляторную последовательность, такую как промоторная и энхансерная последовательности, последовательности селектируемого маркера, ориджины
размножения и тому подобные. Таким образом, генотерапия применяется для лечения и/или профилактики заболевания. Экспрессия остеопонтина затем будет осуществляться in situ.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения экспрессирующий вектор является вектором, выделенным из лентивируса. Установлено, что лентивирусные векторы позволяют очень эффективно переносить гены, в частности, в центральной нервной системе. В соответствии с настоящим изобретением можно использовать другие хорошо известные вирусные векторы, например, векторы, выделенные из аденовируса.
Можно использовать вектор направленного действия для усиления прохождения остеопонтина через гематоэнцефалический барьер. Такие векторы могут направленно воздействовать на рецептор трансферрина или другие механизмы эндотелиального переноса.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения экспрессирующий вектор можно вводить при помощи внутримышечной инъекции.
- 24 -
006655
Применение вектора для индукции и/или усиления эндогенного продуцирования остеопонтина в
клетке, обычно не экспрессирующей остеопонтин или экспрессирующей остеопонтин в недостаточном
количестве, также входит в объем данного изобретения. Вектор может содержать регуляторные последовательности, функционирующие в клетках, предназначенных для экспрессии остеопонтина. Такие регуляторные последовательности могут быть промоторами или энхансерами. Затем регуляторную последовательность можно ввести в соответствующий участок генома путем гомологичной рекомбинации, благодаря чему регуляторная последовательность оперативно связывается с геном, экспрессию которого
необходимо индуцировать или усилить. Указанная методика, обычно именуемая "активацией эндогенного гена" (EGA), описана в заявке на патент WO 91/09955.
Данное изобретение далее относится к использованию клетки, которая генетически модифицирована для продуцирования остеопонтина при приготовлении лекарственного средства для лечения и/или
профилактики неврологических заболеваний.
Настоящее изобретение далее относится к клетке, которая генетически модифицирована для продуцирования остеопонтина с целью получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики
неврологических заболеваний. Таким образом, для доставки лекарственного средства в соответствующие
части тела человека можно использовать клеточную терапию.
Данное изобретение далее относится к фармацевтическим композициям, особенно применимым для
профилактики и/или лечения неврологических заболеваний, которые содержат терапевтически эффективное количество остеопонтина, терапевтически эффективное количество интерферона и необязательно
терапевтически эффективное количество иммуносупрессора.
Определение "фармацевтически приемлемый" означает любой носитель, который не влияет на эффективность биологической активности активного ингредиента и не является токсичным для хозяина,
которому его вводят. Например, активный белок, предназначенный для парентерального введения, может быть получен в виде дозированной лекарственной формы для инъекций в таких носителях, как физиологический раствор, раствор декстрозы, сывороточный альбумин и раствор Рингера.
Активные ингредиенты фармацевтической композиции по данному изобретению можно вводить
нуждающемуся субъекту разными способами. Способы введения включают внутрикожный, чрескожный
(например, в виде препаратов с медленным высвобождением), внутримышечный, внутрибрюшинный,
внутривенный, подкожный, пероральный, эпидуральный, местный, подоболочечный, ректальный и внутриназальный способы. Можно использовать любые другие терапевтически эффективные способы введения, например, поглощение через эпителиальные или эндотелиальные ткани или генотерапию, в соответствии с которой нуждающемуся субъекту вводят молекулу ДНК, кодирующую активное вещество (например, при помощи вектора), которая вызывает экспрессию активного вещества и его секрецию in vivo.
Кроме того, белок по данному изобретению можно вводить вместе с другими компонентами биологически активных веществ, таких как фармацевтически приемлемые поверхностно-активные вещества, наполнители, носители, разбавители и растворители.
Активные белки, предназначенные для парентерального введения (например, внутривенного, подкожного, внутримышечного), могут быть получены в виде раствора, суспензии, эмульсии или лиофилизованного порошка в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем для парентерального введения (таким как вода, физиологический раствор, раствор декстрозы) и добавками, которые сохраняют изотоничность раствора (например, маннит) или химическую стабильность (например, консерванты и буферы). Препарат стерилизуют обычными методами.
Биологическую доступность активного белка по данному изобретению можно улучшить при помощи методов конъюгирования, которые увеличивают период полувыведения молекулы из организма человека, например, связывая молекулу с полиэтиленгликолем, как описано в заявке на патент РСТ WO
92/13095.
Терапевтически эффективные количества активного белка зависят от многих переменных, включающих тип белка, сродство белка, остаточную цитотоксическую активность, вызываемую антагонистами, способ введения, клиническое состояние нуждающегося субъекта (включая способность сохранять
нетоксический уровень активности эндогенного остеопонтина).
"Терапевтически эффективное количество" означает такое количество вводимого остеопонтина, которое оказывает благоприятное воздействие на неврологическое заболевание. Доза, вводимая субъекту в
виде однократной или многократной дозы, может изменяться в зависимости от множества факторов,
включающих фармакокинетические свойства остеопонтина, способ введения, состояние субъекта и его
характеристики (пол, возраст, масса тела, состояние здоровья, размер тела), степень проявления симптомов, одновременно проводимое лечение, частоту лечения и требуемый эффект.
Как указывалось выше, остеопонтин можно предпочтительно использовать в количестве около
0,0001-10 мг/кг массы тела, около 0,001-5 мг/кг массы тела, около 0,01-5 мг/кг массы тела, около 0,1-3
мг/кг массы тела или около 1-2 мг/кг массы тела. Более предпочтительные количества остеопонтина составляют около 0,1-1000 мкг/кг массы тела, около 1-100 мкг/кг массы тела или около 10-50 мкг/кг массы
тела.
- 25 -
006655
Предпочтительным способом введения по данному изобретению является подкожный способ введения. Более предпочтительным способом введения по данному изобретению является внутримышечный
способ введения.
В других предпочтительных вариантах осуществления изобретения остеопонтин вводят ежедневно
или через день.
Суточные дозы обычно вводят в виде раздельных доз или в лекарственной форме пролонгированного действия, позволяющей получить требуемые результаты. Для второго или последующих введений
можно использовать такую же, меньшую или большую дозу по сравнению с первоначальной или предыдущей дозой, введенной нуждающемуся субъекту. Второе или последующее введение можно производить во время болезни или до ее возникновения.
В соответствии с настоящим изобретением остеопонтин можно вводить субъекту в профилактических или лечебных целях до, одновременно или после введения других лекарственных средств (например, схема введения нескольких лекарственных средств) в терапевтически эффективном количестве, в
частности, вместе с интерфероном. Активные вещества, вводимые одновременно с другими лечебными
средствами, можно вводить в одной или разных композициях.
Данное изобретение далее относится к способу лечения неврологического заболевания, который
включает введение нуждающемуся субъекту эффективного количества остеопонтина или агониста активности остеопонтина необязательно вместе с фармацевтически приемлемым носителем.
В объем настоящего изобретения входит также способ лечения неврологического заболевания,
включающий введение нуждающемуся субъекту эффективного количества остеопонтина или агониста
активности остеопонтина и интерферона необязательно вместе с фармацевтически приемлемым носителем.
Все приведенные материалы, включая журнальные статьи или рефераты, опубликованные или неопубликованные заявки на патент США или заявки на иностранные патенты, патенты, выданные в США
или иностранные патенты и любые другие публикации полностью включены в данное описание изобретения в качестве ссылки, в том числе все данные, таблицы, чертежи и тексты, представленные в указанных материалах. Кроме того, содержание всех ссылок, указанных в данном описании изобретения, также
полностью включено в описание изобретения в качестве ссылки.
Ссылка на стадии известных или стандартных способов, на известные или стандартные способы ни
в коем случае не является признанием того, что какие-то объекты, описания или варианты осуществления настоящего изобретения были ранее описаны или предложены в данной области техники.
Приведенное выше описание конкретных вариантов осуществления изобретения (включая содержание приведенных ссылок) полностью раскрывает общие особенности данного изобретения, на основании которых специалисты в данной области могут без ненужного экспериментирования легко модифицировать и/или адаптировать указанные конкретные варианты осуществления изобретения для разных
применений, не выходя за пределы общей концепции настоящего изобретения. Поэтому такие адаптации
и модификации представляют широкий спектр эквивалентов рассмотренных вариантов осуществления
изобретения с учетом указаний, приведенных в данном описании изобретения. Следует отметить, что
фразеология или терминология, использованная в данной заявке на патент, приведена с целью описания
и не содержит ограничений, поэтому специалисты в данной области должны интерпретировать терминологию или фразеологию с учетом приведенных указаний и на основании знаний специалиста в данной
области.
Для лучшего понимания изобретения, описанного в данной заявке на патент, приведены нижеследующие примеры, которые служат только для иллюстрации и не ограничивают объем настоящего изобретения.
Примеры
Пример 1. Дифференциальная экспрессия остеопонтина в моделях демиелинизирующих заболеваний in vivo и in vitro.
Способы
Модельные системы in vitro
Линия клеток oli-neu получена в результате иммортализации предшественников олигодендроглии
при помощи ретровируса с дефектом репликации, кодирующего онкоген t-neu, структурно активную тирозинкиназу; установлено, что указанная линия клеток дифференцирует в культуральной среде в присутствии 1 мМ дибутирил-сАМР (Jung et al., 1995). Это позволяет исследовать олигодендроциты в виде выделенных клеток.
Морфология и антигенные характеристики клеток в клеточной линии олигодендроцитов мыши olineu, выделенных из предшественников олигодендроцитов мыши А2В5, не подвергаемых обработке, и
после 6 дней обработки 1-5 мМ дибутирил-сАМР, стимулирующей продифференцировку, значительно
отличаются друг от друга. Если необработанные клетки oli-neu имеют круглую форму и являются в основном биполярными подобно клеткам-предшественникам олигодендроцитов, то клетки, обработанные
сАМР, инициируют многие процессы, имеют плоский фенотип и даже продуцируют плоские, вытянутые
"оболочкоподобные" структуры.
- 26 -
006655
Кроме того, можно использовать анализ миелинизации in vitro с использованием смешанных кортикальных культур для визуализации функционального миелина in vitro. Данная система позволяет изучить, каким образом олигодендроциты контактируют с аксонами и миелинизируют их в присутствии
клеток центральной нервной системы других типов (Lubetzki et al., 1993). В указанной системе можно
испытывать биологические факторы, которые могут воздействовать на пролиферацию предшественников олигодендроцитов или дифференцировку и сохранение жизнеспособности олигодендроцитов, например, влияя на образование сегментов настоящего миелина. Необходимость изучения процесса миелинизации in vitro привела к разработке анализов разных типов для исследования агрегации культур клеток
головного мозга (Matthieu et al., 1992), культур срезов мозжечка (Notterpek et al., 1993) и систем для совместного культивирования (Shaw et al., 1996; Barres et al., 1993). Преимуществом таких моделей является возможность исследования поведения олигодендроцитов в сочетании с клетками других типов и способов стимуляции указанных клеток для продуцирования миелина. В таких системах можно также вызвать демиелинизацию при помощи специальных повреждений и исследовать ответный процесс ремиелинизации.
Модельные системы in vivo
Существует целый ряд экспериментальных моделей in vivo и in vitro для рассеянного склероза.
Большинство моделей in vivo представляют классическую животную модель рассеянного склероза, экспериментального аллергического энцефаломиелита (ЕАЕ). Имеется много вариантов указанной модели,
которые адаптированы для использования в целом ряде организмов млекопитающих, включая мышей,
крыс и приматов (Petry et al., 2000). Кроме того, разработаны методики "имитации" предполагаемого вирусного компонента рассеянного склероза в животных моделях, таких как модель энцефалитогенного
вируса рассеянного склероза Тейлера у мышей (Dal Canto et al., 1995).
Животные модели для исследования миелинизации в центральной или периферической нервной
системе используются в меньшей степени. После появления гипотезы о рекапитуляции признано полезным исследование процесса миелинизации в развивающемся организме для изучения механизмов, лежащих в основе дифференцировки, миграции и пролиферации клеток олигодендроглии или клеток Шванна
(Franklin and Hinks, 1999). Однако для сравнения миелинизации в развивающемся организме, которая
происходит во время формирования центральной или периферической нервной системы, и ремиелинизации, которая происходит во взрослом состоянии, необходимо создать модели, специально предназначенные для исследования процесса ремиелинизации.
Модель с использованием купризона
Одной из наиболее известных и широко используемых моделей ремиелинизации является модель с
использованием купризона для индукции ремиелинизации у мышей. Данная модель включает пероральное введение органического соединения, купризона, являющегося медным хелатором, который, как известно, оказывает избирательное токсическое действие на олигодендроциты (Morell et al., 1998).
В большом мозге мышей, которым вводят купризон, происходит демиелинизация и ремиелинизация. Указанные патологические состояния можно наблюдать, производя окрашивание антителом против
CNPазы или антителом МВР. Миелин окрашивают луксолом быстрым голубым-периодной кислотой
Шиффа (LFB-PAS). Ремиелинизацию предшественников олигодендроцитов можно визуализировать при
помощи антител для рецептора PDGFα или NG2.
Введение мышам купризона в течение 3-5 недель вызывает обширную демиелинизацю большого
мозга. Одновременно с демиелинизацией после введения купризона в течение 3 недель увеличивается
синтез миелинспецифических генных транскриптов (Morell et al., 1998).
Последующее прекращение введения купризона создает условия для восстановления, так что через
6 недель после прекращения скармливания купризона у мышей наблюдается обширная ремиелинизация
большого мозга. Таким образом, модель с использованием купризона предоставляет полную парадигму
in vivo, позволяющую исследовать разные аспекты демиелинизации и ремиелинизации. Преимуществом
указанной модели является отсутствие инфильтрации Т-клеток в ткань центральной нервной системы,
что позволяет произвести более точное исследование процессов миелинизации, а также обеспечивает
воспроизводимость результатов (Hiremath et al., 1998).
Для введения купризона используют самок мышей линии C57BL/6 (в возрасте 8 недель с массой тела 20±3 г), которых делят на 6 групп по 6 животных в каждой группе.
Группа 1: контрольная группа, получающая обычный измельченный корм;
Группа 2: группа, в течение 3 недель получающая измельченный корм, содержащий 0,2% купризона (Cup3w);
Группа 3: группа, в течение 5 недель получающая измельченный корм, содержащий 0,2% купризона (Cup5w);
Группа 4: группа, в течение 5 недель получающая измельченный корм, содержащий 0,2% купризона, с последующим однонедельным периодом восстановления при кормлении обычным измельченным
кормом (1wR);
- 27 -
006655
Группа 5: группа, в течение 5 недель получающая измельченный корм, содержащий 0,2% купризона, с последующим трехнедельным периодом восстановления при кормлении обычным измельченным
кормом (3wR);
Группа 6: группа, в течение 5 недель получающая измельченный корм, содержащий 0,2% купризона, с последующим шестинедельным периодом восстановления при кормлении обычным измельченным
кормом (6wR).
У животных во всех группах удаляют головной мозг в конце каждого периода воздействия в точно
установленное время. Мышей сначала анестезируют и перфузируют через левый желудочек. Головной
мозг удаляют и делают несколько срезов по венечному шву на линии большого мозга-хвоста (полосатое
тело) и гиппокампа. Срезы ткани головного мозга помещают в парафин для иммунногистохимического
анализа и гибридизации in situ.
Подготовка ткани для гистологического анализа
Формалин получают, разбавляя 1 объем формальдегида (Fluka, 36%) и 1 объем стерильного PBS 8
объемами стерильной воды. Силиконовую трубку, приспособленную для присоединения перистальтического насоса и оснащенную иглой 1-1/5 20G, заполняют 10 мл PBS. Затем трубку непрерывно заполняют
40 мл формалина, соблюдая осторожность во избежание образования пузырьков воздуха.
Животных анестезируют пентобарбиталом натрия (Sanofi®), разведенным в отношении 1:1 стерильным PBS до концентрации 3 мг/100 мл до выполнения внутрисердечной перфузии фиксатором для
последующего гистологического анализа органов и тканей. Всем мышам внутрибрюшинно инъецируют
0,05 мл препарата (0,75 мг/кг). Как только мыши засыпают, их конечности фиксируют булавками (иглы
5/8 25G), прокалывая ими кожу на доске из стирольной пены. Брюшной отдел каждого животного дезинфецируют этанолом и стерильными ножницами надрезают кожу на уровне наружных половых органов. Затем живот рассекают вправо и влево. Наружные половые органы поднимают при помощи двух
пинцетов и открывают диафрагму по диагональному разрезу, затем делают двусторонний разрез перпендикулярно ранее сделанным разрезам, чтобы обнажить полость грудной клетки, в центральной части
которой находится бьющееся сердце. Удерживая сердце пинцетом, сразу же рассекают правое предсердие, чтобы спустить венозную кровь. В систему кровообращения каждой мыши вводят 10 мл PBS и 40
мл формалина. Головной и спинной мозг животного осторожно удаляют и помещают в 10 мл раствора
формалина в 50 мл пробирке Falcon® на 2 ч. Затем раствор формалина заменяют 10 мл стерильного PBS
и указанное вещество выдерживают в течение ночи при +4°С. Раствор PBS снова заменяют и выдерживают при +4°С в течение нескольких часов. Полусферы головного мозга и спинной мозг разрезают, получая срезы размером около 0,5 см, и помещают в пластиковые формы, соответствующие аппарату для
заливки. Головной и спинной мозг погружают в парафин при помощи автоматического вакуумного инфильтрационного процессора Tissue Tek E150/E300 (Miles Inc. Diagnostics) в соответствии с описанной
ниже программой:
30 мин в 50% этаноле;
60 мин в 70% этаноле;
60 мин в 70% этаноле;
60 мин в 80% этаноле;
90 мин в 80% этаноле;
30 мин в 96% этаноле;
90 мин в 96% этаноле;
120 мин в 96% этаноле;
30 мин в 100% ксилоле;
60 мин в 100% ксилоле.
Последней стадией заливки являются четыре 60-минутные инкубации в парафине (Histosec, Merck
11609).
Все растворы выдерживают при 40°С и температуре парафина 65°С. Подготовленные срезы головного и спинного мозга помещают в требуемой ориентации в пластиковые камеры для заливки парафиновым блоком. Выливают жидкий парафин и оставляют для быстрого охлаждения при 0°С на холодной
плите. Парафиновые блоки обрабатывают в микротоме для получения срезов (5-10 мкм). Затем срезы
помещают на обработанные физиологическим раствором предметные стекла (SuperFrost-Plus™, Menzel
cat. no. 041300). Предметные стекла со срезами хранят в помещениях без пыли.
Культура клеток
Oli-neu: Клетки (oli-neu) клеточной линии олигодендроцитов мыши обогащают центрифугированием и вновь суспендируют в среде Сато (Trotter et al., 1989). Клетки культивируют в 75 мл колбах при
37°С и в регулируемых условиях 5% СО2-инкубатора.
Дифференцировку выполняют при помощи 1 мМ dbcAMP, который добавляют непосредственно в
среду с культурой клеток. РНК экстрагируют методом Tri-ZOL (см. ниже).
Выделение РНК
Полную РНК выделяют из клеток oli-neu срезов головного мозга мышей, которым вводили купризон, и из цельного головного мозга новорожденных мышей на разных стадиях развития в соответствии с
- 28 -
006655
методом экстракции Tri-ZOL® (Life Technologies AG, Basel, Switzerland). Поли(А)* РНК получают из
образцов полной РНК в колонках OLIGOTEX™ (QIAGEN Inc., 28159 Stanford Avenue, Valencia, CA
91355, USA).
Анализ DGE с использованием микроматриц кДНК
Эксперименты с использованием микроматриц выполнены в компании Incyte Genomics (Incyte Genomics Inc., 3160 Porter Drive, Palo Alto, California 94304, USA). Анализ DGE выполняют, используя микроматрицу для экспрессии генов мыши GEM™ компании Incyte (http://www.incyte.com/reagents/gem/
products.shtml).
На чипы Incyte, используемые в указанных анализах, помещают молекулы кДНК, соответствующие
8734 известным и неизвестным генам (последовательности EST). Технология компании Incyte позволяют
на одной матрице окрашивать микрообразцы всех указанных генов. Все молекулы кДНК, соответствующие известному гену или EST, имеют длину, равную 500-5000 п. о. В спецификации компании Incyte
обнаруживаемый динамический диапазон определен в пределах от 2 до 2000 пг для отдельной мРНК в
образце. Количество РНК, необходимое для каждого эксперимента с использованием матрицы, равно 600
нг поли(А)* РНК. Указанные уровни обнаруживаемой дифференциальной экспрессии выражены в виде
отношений, превышающих 1,75.
Нормализация сигнала и определение уровня экспрессии
Отношения, вычисленные на основании 2 интенсивностей флуоресценции, позволяют произвести
количественное измерение относительного уровня экспрессии гена в 2 анализируемых образцах клеток.
Отношения, характерные для каждого гена, высчитывают на основании уровней нормализованной экспрессии. Коэффициент нормализации высчитывают путем деления общей экспрессии второго образца
(Р2) на общую экспрессию первого образца (P1). Указанный коэффициент затем используют для определения уровня экспрессии каждого гена в Р2. После выполнения стадии нормализации отношения генов
вычисляют на основании следующего правила:
Если предположить, что Е1 представляет уровень экспрессии данного гена в образце 1 и Е2 представляет уровень нормализованной экспрессии того же гена в образце 2, тогда, если Е2 > Е1, отношение =
Е2/Е1, в противном случае отношение = -Е1/Е2.
Так как гибридизацию образца выполняют одновременно в условиях конкуренции, технология с
использованием чипов Incyte является более точной для определения изменений относительной экспрессии и становится менее надежной для измерения уровней абсолютной экспрессии. Тем не менее можно
использовать указанные значения уровня экспрессии для сравнения пар в популяциях образцов РНК,
которые не подвергали физическому сравнению на чипе. Такие сравнения in silico являются менее надежными, но дают дополнительную информацию о механизмах, действующих в отношении анализируемых систем.
Результаты
Модели, используемые для анализа дифференциальной экспрессии остеопонтина
В табл. IV приведены описанные выше модели, используемые для экстракции мРНК и гибридизации на чипе (анализ DGE).
Таблица IV. Модели, используемые при выполнении анализа DGE
- 29 -
006655
Положительный контрольный параметр для анализа DGE: регуляция экспрессии миелинспецифических генов.
Указанный параметр служит в качестве положительного контрольного параметра при обнаружении
дифференциальной экспрессии миелинспецифических генов при помощи анализа DGE.
В табл. V показана регуляция экспрессии миелинспецифических генов, присутствующих на микроматрицах Incyte. Значения дифференциальной экспрессии для каждого гена получены при введении купризона в течение 3 и 5 недель. Указанные данные представляют положительный контрольный параметр
для проверки надежности чипа. Так как изменение экспрессии структурных генов миелина в экспериментальных условиях хорошо исследовано, экспрессию указанных генов, измеренную на чипах, можно
использовать для определения а) точности метода и b) воспроизводимости моделей.
Таблица V. Регуляция экспрессии миелинспецифических генов in vivo при выполнении анализов на микроматрицах в моделях миелинизации in vivo
В приведенной выше таблице показано изменение экспрессии некоторых миелинспецифических
генов при выполнении анализов на микроматрицах с использованием РНК из разных моделей in vivo,
служащих для исследования демиелинизации, ремиелинизации и миелинизации в процессе развития.
Изменения экспрессии указанных миелинспецифических генов показывают, каким образом процесс миелинизации можно исследовать на уровне транскрипционной регуляции с использованием микроматриц.
После введения купризона в течение 3 недель эффект демиелинизации можно визуализировать в
определенных областях головного мозга мыши. Ожидается, что через 3 недели можно обнаружить
уменьшение модуляции разных генов, относящихся к синтезу и/или сохранению миелина. Сокращение
экспрессии миелинспецифических генов, наблюдаемое при использовании микроматрицы, служит подтверждением точности и надежности экспериментальной системы. Данные, приведенные в таблице V,
показывают, что уровни мРНК для МBР снижаются в 13,6 раза и уровни циклонуклеотидфосфодиэстеразы 1 (CNPаза) снижаются в 2,9 раза при введении купризона в течение 3 недель по сравнению с контрольными экспериментами. Однако уровни РНК для обоих генов становятся в 1,3 и 1,1 раза ниже нормальных уровней соответственно после 5 недель введения купризона, свидетельствуя о том, что биологическая система предпринимает попытку ремиелинизации, увеличивая синтез структурных белков миелина.
Регуляция дифференциальной экспрессии остеопонтина
При анализе на чипе содержание остеопонтина увеличивается после введения купризона в течение
3-х недель (+2,2) и 5-и недель (+2,8).
Пример 2. Подтверждение дифференциальной экспрессии гена остеопонтина при помощи количественного анализа в реальном времени методом (RT)-PCR с использованием обратной транскриптазы
(TaqMan®)
Методы
Создание матрицы кДНК
Матрицы кДНК для анализа TaqMan® получают из образцов полной РНК при помощи обратной
транскрипции (RT), используя реагенты для обратной транскрипции TaqMan® (P/N N808-0234). Все реакции обратной транскрипции выполняют в среде объемом 100 мкл, содержащей 10 мкл буфера для RT
TaqMan, 22 мкл раствора 25 мМ МgCl2 (5,5 мМ), 20 мкл смеси дезоксиNТР (по 500 мкл каждого dNTP), 5
мкл произвольных гексамеров (2,5 мкМ), 2 мкл ингибитора RNазы (0,4 ед/мкл), 2,5 мкл обратной транскриптазы MultiScribe™ (1,25 ед/мкл) и 38,5 мкл образца РНК (1 мкг полной РНК) в Н2O без RNазы. Реакции выполняют в термоблоке Master-Cycler фирмы Eppendorf при 25°С в течение 10 мин (стадия инкубации), при 48°С в течение 30 мин (обратная транскрипция) и при 95°С в течение 5 мин (стадия инактивации). Все синтезированные кДНК хранят при -20°С в 20 мкл объемах.
Создание и проверка затравки
Верхние и нижние затравки для полимеразной реакции синтеза цепи (PCR) в реальном времени с
красителем SYBR Green для всех подтвержденных генов и GAPDH (контрольный образец) созданы при
помощи программного обеспечения Primer Express™ фирмы РЕ Biosystems в соответствии с опубликованными последовательностями и заказаны в концентрации 0,02 мкМ в фирме Interactiva (Interactiva: The
Virtual Laboratory, Sedanstrasse 10, D-89077 Ulm). Специфичность и оптимальные концентрации затравки
испытывают для каждого набора затравок. Возможное загрязнение геномной ДНК контролируют, вы- 30 -
006655
полняя реакции PCR с использованием отрицательных контрольных образцов кДНК, которые подвергают реакциям обратной транскрипции при отсутствии фермента RT. Отсутствие неспецифической амплификации подтверждают, анализируя продукты PCR при помощи электрофореза в агарозном геле на
3,5% гелях Metaphor или предварительно формованных 4% гелях NuSieve®.
В нижеследующей таблице приведены последовательности генспецифических затравок, созданных
для выполнения анализа TaqMan® для подтверждения дифференциальной экспрессии генов, которые поразному регулируются на микроматрицах. В таблице также указаны названия генов, соответствующих
каждой паре затравок, и номер доступа в банке генов GenBank последовательности, используемой для
создания каждой затравки при помощи программного обеспечения PrimerExpress™.
Таблица VI. Затравки, используемые для анализа методом RT-PCR
Реакции TaqMan
Полимеразную реакцию синтеза цепи (PCR) в реальном времени с красителем SYBR Green выполняют, используя 5 мкл/лунку продуктов RT (0,5 нг полной РНК), 25 мкл/лунку маточной смеси для PCR
с красителем SYBR Green (Applied Biosystems, CA, USA), урацил-N-гликозилазой (UNG) AmpErase (0,5
ед/лунку) и 20 мкл затравок (300 нМ). PCR выполняют при 50°С в течение 2 мин (для инкубации UNG
AmpErase с целью устранения любого возможного переноса путем удаления урацила, содержащегося в
продуктах PCR, полученных при выполнении предыдущей серии реакций TaqMan), при 95°С в течение
10 мин (для активации AmpliTaq Gold). Затем образцы обрабатывают на протяжении 40 циклов при 95°С
в течение 15 с, при 60°С в течение 1 мин в системе обнаружения последовательностей ABI PRISM®
7700. Образцы обратно транскрибированной кДНК амплифицируют и определяют их значения СТ (пороговое значение цикла). Все значения СТ нормализуют в соответствии с контрольным геном GAPDH. Образцы по возможности анализируют в двух или трех экземплярах для оценки воспроизводимости результата. При выполнении электрофорезного анализа наблюдается одна специфическая полоса ДНК для всех
подтвержденных генов и GAPDH.
Вычисление регуляции экспрессии гена при помощи порогового значения цикла (СТ)
Принцип обнаружения в реальном времени с использованием маточной смеси для PCR с красителем SYBR Green основан на прямом обнаружении продукта PCR путем измерения увеличения флуоресценции, возникающей при связывании красителя SYBR Green с двухцепочечной ДНК. Таким образом
выполняют количественное определение относительного увеличения продукта генспецифической амплификации на основании кривых роста PCR.
Измерение специфической кДНК в сравнении с контрольным образцом выполняют путем определения количества кДНК, превращенной из матричной РНК, которое соответствует специфическому гену,
в сравнении с калибровочным образцом, служащим в качестве физиологического эталона. Калибровку
производят при помощи образца, полученного из контрольного или необработанного продукта. Относительное количественное определение кДНК данного вида выполняют путем нормализации относительно
эндогенного контрольного образца (в данном случае GAPDH) для определения любого изменения начальной концентрации и качества полной РНК, используемой для создания матричных кДНК, и эффективности превращения при выполнении реакций обратной транскрипции. Для вычисления относительных количественных значений берут среднее значение СТ для повторно выполняемой серии реакций для
каждого образца, высчитывают разницу (∆СТ) средних значений СТ для исследуемых образцов и эндогенных контрольных образцов, вычитают среднее значение СТ калибровочного стандарта для исследуемого образца из ∆СТ данного исследуемого образца (∆∆СТ) и выражают относительное количественное
значение для исследуемого образца в виде 2-∆∆Сt, определяя таким образом степень увеличения или
уменьшения экспрессии гена.
Нормализация сигналов флуоресценции при выполнении реакций TaqMan®
Сигналы флуоресценции комплекса дцДНК-краситель SYBR Green нормализуют в отношении пассивного эталона или отрицательных контрольных реакционных смесей, не содержащих матричной ДНК.
Для выполнения нормализации интенсивность излучения комплекса дцДНК-краситель STBR Green в
экспериментальной реакционной смеси делят на интенсивность излучения пассивного эталона. В результате этого получают отношение Rn (нормализованный репортер) для реакционной смеси:
- Rn+ = значение Rn реакционной смеси, содержащей все компоненты, включая матричную ДНК;
- Rn- = значение Rn непрореагировавшего образца (отсутствие матричной ДНК);
- ∆Rn = (Rn+) - (Rn-), где
- 31 -
006655
Rn+ = (интенсивность излучения комплекса дцДНК-краситель SYBR Green)/PCR с матричной ДНК
(интенсивность излучения пассивного эталона);
Rn- = (интенсивность излучения комплекса дцДНК-краситель SYBR Green)/без матричной ДНК (интенсивность излучения пассивного эталона).
Вычисление регуляции экспрессии гена при помощи пороговых значений цикла (СT)
∆Rn представляет величину сигнала, образующегося в данной совокупности условий PCR для конкретной реакционной смеси. Пороговый параметр цикла представляет измерение относительного увеличения амплификации генспецифического продукта, которое соответствует относительному содержанию
специфического транскрипта в экспериментальной популяции кДНК. Данный параметр фиксируется в
виде точки цикла, в которой впервые обнаружено статистически значимое увеличение ∆Rn. Пороговое
значение определяют в виде среднего стандартного отклонения Rn для начальных циклов, умноженного
на поправочный коэффициент. Пороговый параметр цикла используется для количественного определения дифференцированной экспрессии гена. Конкретные значения вычисляют для каждой генспецифической кривой роста на основании установленной точки или цикла, когда была обнаружена интенсивность
флуоресценции, превышающая фоновое значение.
Для вычисления относительных количественных значений берут среднее значение СТ для повторно
выполняемой серии реакций для каждого образца, высчитывают разницу (∆СТ) средних значений СТ для
исследуемых образцов и эндогенных контрольных образцов и вычитают среднее значение СТ калибровочного стандарта для исследуемого образца из ∆СТ данного исследуемого образца (∆∆ СТ). И наконец,
относительное количественное значение для исследуемого образца выражают в виде 2-∆∆Ct, определяя
таким образом степень увеличения или уменьшения экспрессии гена.
Результаты
Выполнение количественного анализа методом (RT)-PCR с обратной транскриптазой (TaqMan) в
реальном времени представляет чувствительный и надежный способ выявления и подтверждения изменений в экспрессии гена. Детектор последовательностей TaqMan (ABI PRISM® 7700 Sequence Detection
System, Applied Biosystems, Foster City, CA) позволяет объединить анализ методом PCR с аппаратными
средствами/программным обеспечением, создавая таким образом систему для эффективного количественного определения последовательностей нуклеиновых кислот. Данная система сочетает циклическое
изменение температуры, обнаружение флуоресценции и прикладное программное обеспечение, позволяя
произвести циклическое обнаружение увеличения количества специфического продукта PCR.
Экспрессия нескольких контролируемых генов, обнаруженная при помощи микроматричного анализа, подтверждена с использованием платформы TaqMan®. Во всех случаях по возможности указан
период времени, в течение которого использована каждая модельная система. Это позволяет получить
большее число данных о поведении специфических генов на протяжении всего процесса.
Количественное определение изменения в экспрессии гена можно произвести при помощи устройства TaqMan®, позволяющего непосредственно обнаружить увеличение продукта PCR, измеряя флуоресценцию, вызываемую связыванием красителя SYBR Green с двухцепочечной ДНК, представленной
продуктами амплификации, специфичными для анализируемого гена. Измерение специфической кДНК в
сравнении с контрольным образцом выполняют путем определения количества кДНК, превращенной из
матричной РНК, которое соответствует специфическому гену, в сравнении с калибровочным образцом,
служащим в качестве физиологического эталона. Калибровку производят при помощи образца, полученного из контрольного или необработанного продукта. Относительное количественное определение кДНК
данного вида выполняют путем нормализации относительно GAPDH для определения любого изменения
начальной концентрации и качества полной РНК, используемой для создания матричных кДНК, и эффективности превращения при выполнении реакций обратной транскрипции.
Экспрессию гена секретированного фосфопротеина 1 (остеопонтина) анализируют с учетом продолжительности демиелинизации/ремиелинизации в модели с использованием купризона.
Результаты экспериментов TaqMan для экспрессии остеопонтина в модели ремиелинизации с использованием купризона показаны на фиг. 1(А). Установлено, что уровни мРНК остеопонтина увеличиваются в переднем мозге мышей в 18 раз после введения купризона в течение 3-х недель (3 w.Cup.) и в 25
раз после введения купризона в течение 5 недель (5 w.Cup).
Экспрессия остеопонтина снижается при восстановлении в течение 1, 3 и 6 недель после введения
купризона в течение 5 недель (5 w.cup. + 1 w., 3 w. и 6 w.). Полученные результаты свидетельствуют о
важной роли остеопонтина на стадии демиелинизации и ремиелинизации данной модели, так как ремиелинизация начинается при продолжающейся демиелинизации.
На фиг. 1 (В) показаны результаты экспрессии остеопонтина в развивающемся мозжечке. Содержание мРНК остеопонтина временно повышается сразу же после рождения в дни С4-С8, когда начинается
миелинизация мозжечка.
Результаты исследования при помощи микроматрицы свидетельствуют об увеличении остеопонтина в переднем мозге мышей во время введения купризона. Профиль экспрессии остеопонтина в данном
анализе включает стадии демиелинизации и ремиелинизации при введении купризона и показывает, что
- 32 -
006655
пики профиля экспрессии остеопонтина на стадии демиелинизации при введении купризона и в период
восстановления возвращаются почти к исходным уровням.
Результаты приведены в нижеследующей табл. VII.
Результаты анализа TaqMan® экспрессии остеопонтина подтверждают увеличение указанного вещества в головном мозге мышей, которым вводили купризон в течение 3 и 5 недель.
Таблица VII. Анализ TaqMan® регуляции экспрессии остеопонтина в модели с использованием
купризона
Пример 3. Подтверждение дифференциальной экспрессии остеопонтина методом нозерн-блоттинга.
Методы
Получение блотов
В случае специфических генов анализируют тканевую специфичность экспрессии, используя многотканевые нозерн-блоты мыши (Clontech Labs, 1020 East Meadow Circle, Palo Alto, CA). Указанные блоты содержат 2 мкг поли(А)* РНК из разных тканей взрослой мыши. Отдельные блоты получают для анализа дифференциальной экспрессии гена in vitro и in vivo. В одном наборе блотов используют РНК, выделенную из головного мозга мышей при введении купризона в течение 3 и 5 недель и после восстановления в течение 1, 3 и 6 недель (до 6 недель). Во втором наборе блотов используют РНК цельного мозга,
полученную на разных стадиях развития после рождения. И наконец, серию РНК получают из клеток
Oli-neu, выращиваемых в культуре и обрабатываемых дибутирил-сАМР в течение разных периодов времени. Указанную РНК используют для получения третьего набора блотов. Новые блоты гибридизируют
с каждым генспецифическим зондом для достижения максимальной эффективности обнаружения и сведения к минимуму расхождений результатов вследствие неравномерного стриппинга после гибридизации. Все блоты гибридизируют дважды, сначала с зондом против представляющего интерес гена и после
стриппинга с зондом против глицеральдегид-3-фосфата (mGAPDH) мыши для контроля изменений при
введении РНК.
- 33 -
006655
РНК (10 мкг/лунку) вводят в 1,2% денатурирующий агарозный гель, содержащий формальдегид и 5
х MOPS (209,27 г 3-(N-морфолино)пропансульфоновой кислоты, 20,5 г ацетата натрия, 50 мл 0,5 М
EDTA, рН 8,0, в 5 л стерильной Н2О доводят до рН 7,0, добавляя 12 М раствор NaOH). Все образцы РНК
смешивают с 2 мкл бромида этидия (0,01 мг/мл) , 2 мкл 5 х 3-(N-морфолино)пропансульфоновой кислоты (MOPS), 3,5 мкл 37% формальдегида и 10 мкл формамида. Затем образцы нагревают при 65°С в течение 10 мин и быстро охлаждают на льду. Сразу же после введения в гель к каждому образцу добавляют
два микролитра буфера для загрузки РНК (50% глицерина, 1 мМ EDTA, 0,4% бромфенолового синего и
0,4% ксилолцианолового красителя).
Все гели исследуют в течение ~3 ч в буфере для анализа 1 х MOPS (1 л=330 мл 37% формальдегида,
400 мл 5 х MOPS, 270 мл DEPC-обработанной Н2О) при 5 В см-1 (длина геля). Затем РНК в течение ночи
переносят на положительно заряженную найлоновую мембрану (Hybond™-N, Amersham Life Sciences,
Amersham Place., Little Chalfont Buckinghamshire, England HP7 9NA), используя описанный раствор SSC
(Terry Brown, Unit 4,9, Curret Protocols, 1993 [ed. F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G.
Seidman, J.A. Smith, and K. Struhl]). Эффективность переноса РНК проверяют, исследуя мембрану и уплощенный гель в ультрафиолетовом свете. РНК сшивают с мембраной при помощи линкера Strata
(Stratagene, USA). До гибридизации блоты хранят между листами фильтровальной бумаги Whatman толщиной 3 мм при комнатной температуре.
Получение зондов
Радиоактивные 32P-меченые зонды получают, используя очищенные гелем рестрикционные фрагменты клонов кДНК (длиной ~500 > 800 п.о.), соответствующих представляющим интерес генам.
Фрагменты ДНК произвольно метят 32P-dCTP до достижения удельной активности > 109 импульсов
в минуту мл-1, используя систему для мечения HighPrime™ (Roche Diagnostics AG, Industriestraβe 7,6343
Rotkreuz, Switzerland). Несвязанный 32P-dCTР удаляют путем самотечного элюирования смеси зонда в
колонке NAP™-5 Pharmacia, заполненной средой Sephadex® G-25 (степень чистоты для анализа ДНК в
дистиллированной воде, содержащей 0,15% Kathon® CG/ICP Biocide®).
Гибридизация и обнаружение сигнала
Гибридизацию с зондом осуществляют в устройстве ExpressHyb™ (Clontech Labs, 1020 East
Meadow Circle, Palo Alto, CA) в соответствии с инструкциями изготовителя. После гибридизации блоты
подвергают воздействию Hyperfilm™ MP (Amersham Pharmacia Biotech, England) при -80°С в кассетах
для ауторадиографии. Затем зонд экспонируют и стриппируют, инкубируя блот в течение 10 мин в растворе 0,5% SDS в стерильной Н2О при 90-100°С, после чего блот оставляют охлаждаться в течение 10
минут. Стриппированные мембраны упаковывают в пластик и хранят при -20°С до возникновения необходимости в повторном зондировании.
Результаты
Анализ методом нозерн-блоттинга ранее использовали в качестве вторичного метода подтверждения результатов в широкомасштабных исследованиях дифференциальной экспрессии генов (Chang et al.,
2000). Благодаря чувствительности и точности указанного анализа можно не только выявить тканевую
специфичность экспрессии для данного гена, но и определить величину дифференциальной экспрессии в
экспериментальных и контрольных условиях. Все это делает данный анализ надежным методом подтверждения результатов DGE, полученных при помощи анализа с использованием микроматрицы. Кроме
того, нозерн-блоты позволяют получить информацию о размерах транскриптов и возможных альтернативных сплайсированных изоформах, соответствующих представляющему интерес гену.
Обычные нозерн-блоты получают, используя РНК, выделенную из головного мозга мышей, которым вводили купризон, и контрольных мышей. Указанные образцы зондируют радиоактивно мечеными
фрагментами ДНК из клонов, предоставленных фирмой Incyte Geromics. Воспроизводимость нозернблотами результатов, полученных при помощи анализа экспрессии гена TaqMan®, проверяют, используя
радиоактивно меченый зонд против остеопонтина мыши, гибридизированный с блотом РНК, выделенной
из головного мозга мышей, которым вводили купризон. Таким образом можно сравнить результаты анализа методом нозерн-блоттинга с результатами анализа экспрессии остеопонтина методом TaqMan® в
модели с использованием купризона.
На фиг. 3 показана открытая рамка считывания для остеопонтина мыши, введенного в вектор
pT7T3D-Pac, предоставленный фирмой Incyte Genomics. Серая область соответствует кодирующей последовательности, и стрелка обозначает полную кДНК остеопонтина. Клональная вставка фланкирована
сайтами рестрикции EcoRI и Not1. Чтобы получить зонд, используемый в нозерн-блоттинге для анализа
тканевой экспрессии данного гена, фрагмент длиной 893 п.о. вырезают из клона, используя рестрикционные ферменты Hincll и Styl. Указанный фрагмент очищают гелем и метят для использования в качестве зонда.
Экспрессию остеопонтина мыши подтверждают при помощи анализа методом нозерн-блоттинга,
используя стандартный блот, полученный из РНК, выделенной из головного мозга мышей на каждой
стадии исследования в модели с использованием купризона, включая животных на стадии восстановления и контрольных животных, которым не вводили купризон. Полученный блот сначала зондируют радиоактивно меченым фрагментом кДНК остеопонтина мыши, который экспонируют и стриппируют, и
- 34 -
006655
затем повторно зондируют радиоактивно меченым фрагментом GAPDH мыши. Указанный образец используют в качестве положительного контрольного образца для определения различий в наблюдаемых
уровнях экспрессии на основании изменений общего количества РНК в каждой полосе блота.
Экспрессия остеопонтина в головном мозге мышей, получающих купризон, достигает максимума
после введения купризона в течение 3 и 5 недель, причем несколько более высокая экспрессия имеет место через 5 недель. На стадии восстановления уровни мРНК остеопонтина достаточно быстро снижаются, при этом значительное уменьшение экспрессии происходит через 1 неделю после прекращения введения купризона. Уровни мРНК остеопонтина возвращаются примерно к нормальным уровням после
восстановления в течение 6 недель. Полученные результаты сравнимы в количественном отношении с
результатами, полученными при помощи анализа экспрессии остеопонтина методом TaqMan® в модели
с использованием купризона (см. фиг. 1А).
Пример 4. Регуляция экспрессии остеопонтина в клетках oli-neu.
Экспрессию остеопонтина в олигодендроцитах (oli-neu), обработанных сАМР, измеряют при помощи анализа TaqMan. Результаты показаны на фиг. 4. В столбцах 1-4 показаны результаты, полученные в
олигодендроцитах. По сравнению с контрольным образцом (значение = 1) обработка сАМР (столбец 1) в
течение 6 ч увеличивает экспрессию мРНК остеопонтина. При воздействии сАМР в течение 2 дней
(столбец 2) экспрессия увеличивается в 12 раз. Более продолжительное воздействие в течение 6-10 дней
(столбцы 3, 4) вызывает снижение уровней мРНК остеопонтина. Сравнение с экспрессией мРНК остеопонтина в модели с использованием купризона (стобцы 5, 6) показывают, что увеличение содержания
остеопонтина в переднем мозге после введения купризона в течение 3 и 5 недель сравнимо с увеличением уровней в олигодендроцитах после обработки сАМР в течение 2 дней.
Пример 5. Экспрессия остеопонтина в олигодендроцитах.
Метод
Клетки oli-neu временно трансфецируют в соответствии с методом осаждения фосфатом кальция.
Клетки oli-neu, полученные на стадии экспоненционного роста, высевают (10е5/мл) в 6-луночный планшет за день до трансфекции. Раствор 100 мкл 250 мМ СаСl2 смешивают с 5 мкг плазмидной ДНК. К раствору Са/ДНК добавляют равный объем (100 мкл) раствора 2 х HEPES (140 мМ NaCl, 50 мМ HEPES, pH
7,05), содержащего фосфат из 300 мМ исходного раствора Na2HPO4 и NаН2РO4 при pH 7,05. Точно через
одну минуту смесь осторожно добавляют к содержимому культурального планшета и инкубируют в течение 4 ч при 37°С в СO2-инкубаторе. Затем среду заменяют свежей средой, и клетки инкубируют в течение 24-72 ч, после чего клетки собирают и анализируют методом вестерн-блоттинга.
Результаты
Клетки oli-neu трансфецируют разными конструкциями остеопонтина мыши в векторе pDEST12.2
(pDEST12.2-остеопонтин-EGFP, pDEST12.2-остеопонтин-Нis6, pDEST12.2-остеопонтин, см. фиг. 4-7, и
pCIE-EGFP в качестве контрольной плазмиды). Клетки продуцируют и секретируют белок, который обнаруживают специфические коммерческие антитела (R&D Systems, AF808). EGFP-меченая конструкция
облегчает контроль трансфекции, и через 24 ч после трансфекции можно обнаружить специфическое
изменение морфологии клетки (усиление процессов выработки олигодендроцитов) при сравнении с контрольной конструкцией pCIEGFP (не показана), которое свидетельствует о том, что остеопонтин стимулирует преобразование клеточной линии олигодендроцитов oli-neu мыши в более зрелый морфологический фенотип. Морфология клеток oli-neu, трансфецированных остеопонтином, очень схожа с морфологией миелинизирующего олигодендроцита.
Полученные результаты показывают, что экспрессия остеопонтина в олигодендроцитах полезна для
превращения указанных клеток в миелинизирующие клетки, и поэтому свидетельствует о благоприятном
воздействии остеопонтина на болезни, обусловленные нарушением функции олигодендроцитов.
Пример 6. Экспрессия белка остеопонтина в специфических областях головного мозга в модели с
использованием купризона.
Иммуногистохимическое исследование остеопонтина выполняют в разные периоды времени в процессе демиелинизации и ремиелинизации в модели с использованием купризона. Сильные сигналы обнаружены в пучках нервных волокон демиелинизированного большого мозга и полосатого тела после введения купризона в течение 5 недель, когда происходит рекрутинг микроглии в места демиелинизации.
Для визуализации активированных микроглиальных клеток последовательные срезы окрашивают CD68,
при этом аналогичные картины экспрессии свидетельствуют об экспрессии остеопонтина в микроглии.
Интересно отметить, что остеопонтин обнаружен также к клетках, выстилающих передние желудочки. Известно, что указанная область является субвентрикулярной зоной взрослого человека, содержащей сильные стволовые клетки, используемые для продуцирования нейронов, астроцитов и олигодендроцитов. Производят двойное окрашивание NG2, PSA-NCAM рецептора PDGFα, чтобы определить
клетки-предшественники олигодендроцитов, экспрессирующие остеопонтин.
Пример 7. Влияние белка остеопонтина на пролиферацию олигодендроцитов.
В данном эксперименте используют первичную клеточную линию олигодендроцитов (олигодендроглии) мышей, иммортализованную онкогеном t-neu (линия клеток "oli-neu"). Создание и свойства линии клеток oli-neu и условия культивирования описаны в публикации Jung et аl., 1995.
- 35 -
006655
Целью данного исследования является измерение воздействия OPN на пролиферацию олигодендроцитов при выполнении анализа пролиферации клеток oli-neu. Клетки высевают субконфлюэнтно. Затем клетки выдерживают в течение 24 ч в среде без инсулина и обрабатывают контрольным или рекомбинантным белком. Производят количественное определение числа клеток при помощи аламарового синего на основании показателей флуоресценции. Потенциирование вычисляют путем сравнения со стандартной кривой IGF1 (контрольный образец). Ингибирование пролиферации вычисляют путем сравнения
со стандартной кривой dbcAMP.
Материал
Аппаратура и программное обеспечение:
Счетчик излучений Wallac Victor 2
(возбуждение при 530-560 нм, излучение при 590 нм)
Программное обеспечение Graph Pad Prism
Реагенты:
Линия клеток oli-neu (Eur J Neuro 7:125-1265 (1995))
Аламаровый синий (BioSourcelntl Inc., Camarillo, CA93012)
Среда Сато включает нижеследующие компоненты:
Планшет с плоским основанием BioCoat, покрытый поли-D-лизином (356461 фирмы Becton Dickinson); R3-IGF1 (11146 фирмы Sigma); DbcAMP (D-06237 фирмы Sigma)
Метод
Культивирование клеток для биоанализа in vitro
Клетки oli-neu являются сросшимися клетками, растущими на субстрате из поли-L-лизина. Клетки
высевают на предварительно покрытые полилизином 96-луночные планшеты BioCoat™. Клетки отделяют 2-3 раза/неделю. Для этого клетки сначала промывают PBS и затем отделяют при помощи PBS и 1
мMEDTA. Клетки выращивают во влажном 10% СО2-инкубаторе.
В качестве замораживающей среды используют среду Сато с 20% FCS и 10% ДМСО. В данном эксперименте используют клетки oli-neu не более, чем 16-го пассажа. Клетки выдерживают в среде Сато без
инсулина в течение 24 ч и используют в конечной концентрации, равной 4000 клеткам/ лунку в 96луночном планшете.
Окрашивание аламаровым синим
После инкубации в СО2-инкубаторе в течение 48 ч в лунки добавляют 10 мкл аламарового синего и
инкубируют клетки еще 2,5 ч. Флуоресценцию контролируют при длине волны возбуждения 530-560 нм
и длине волны излучения 590 нм. Планшеты можно считывать в течение периода времени до 4 ч и при
интенсивности флуоресценции до 1 млн относительных единиц.
Методика выполнения эксперимента
В качестве контрольных образцов используют 100 нг/мл R3-IGF-1 (положительный контрольный
образец), 1 мМ dbcAMP (отрицательный контрольный образец), среду без инсулина или 100 нМ подвергнутого кипячению OPN. В качестве экспериментальных образцов используют 1 нМ, 10 пМ, 0,1 пМ,
0,01 пМ или 100 нМ рекомбинантного остеопонтина. Контрольные и экспериментальные образцы разводят до требуемых концентраций с конечным объемом 50 мкл в среде Сато без инсулина и вводят в лунки.
Клетки oli-neu выращивают в среде без инсулина в течение 24 ч и затем обрабатывают контрольными
- 36 -
006655
или экспериментальными образцами в течение 48 ч. Отделенные клетки oli-neu, которые выращивают в
свежей среде без инсулина в течение 24 ч, собирают из колбы для выращивания при помощи PBS с 1 мМ
EDTA. Клетки получают в количестве 300000 клеток/мл и добавляют по 50 мкл/лунку. Затем клетки инкубируют в течение 48 ч при 37°С во влажном СО2-инкубаторе. Добавляют 10 мкл аламарового синего и
клетки возвращают в инкубатор на 2,5 ч. Затем 70 мкл из каждой лунки переносят на черные 96луночные планшеты и сразу же измеряют флуоресценцию.
Через 24 ч измеряют пролиферацию недифференцированных клеток oli-neu в ответ на разные количества остеопонтина, который получают, используя клетки насекомых (BacOPN) или экспрессирующую
систему млекопитающего (HEK-OPN). Производят количественное определение скорости роста путем
измерения метаболической активности клеток при помощи флуорометрического/колориметрического
индикатора роста аламарового синего. Указанный агент содержит индикатор окисления-восстановления,
который показывает как флуоресценцию, так и изменение цвета в ответ на химическое восстановление
питательной среды в результате роста клеток. Указанный агент и анализ используют в соответствии с
описанием, приведенным в публикации Ahmed et al., 1994 и патенте США № 5501959.
Результаты
Результаты показаны на фиг. 8-10.
Эффект дозы определяют при использовании рекомбинантного остеопонтина, экспрессированного
в бакуловирусе и клетках НЕК. Дегенерация белка кипячением разрушает его биологическую активность. Добавление остеопонтина, экспрессированного в бакуловирусе (BacOPN), и OPN, экспрессированного в клетках НЕК (HEK-OPN), вызывает увеличение пролиферации клеток в зависимости от дозы
(фиг. 8), при этом IC50 равна 3,7 нМ BacOPN и 0,05 нМ HEK-OPN (фиг. 9). Кроме того, в клетках насекомых экспрессируют конструкцию N-концевого OPN, соответствующую аминокислотам 1-168 изоформы а OPN (см. фиг. 2, N-концевой OPN-а). Очищенный белок испытывают при помощи анализа пролиферации в сравнении с непроцессированным белком. Усеченный белок сохраняет активность (10 нМ, 100
нМ), см. фиг. 10.
Пример 8. Влияние остеопонтина на экспрессию маркеров миелинизации в смешанных кортикальных культурах.
Смешанные кортикальные культуры, выращенные на покровных стеклах, обрабатывают BacOPN
(100 нМ) в течение 12 дней после выращивания in vitro (DIV) в течение 5-17 дней. Через 17 дней выращивания in vitro культуры фиксируют и окрашивают антителом против МBР. Результаты показывают,
что на покровных стеклах с BacOPN образуется большее количество сильно разветвленных положительных олигодендроцитов МВР, чем на покровных стеклах с контрольными образцами (фиг. 11). Кроме того, в контрольных культурах (фиг. 11 А) отсутствуют миелинизирующие олигодендроциты, в то время
как культуры, обработанные OPN, (фиг. В, С и D) содержат большое количество олигодендроцитов, которые окружают аксоны и образуют сегменты миелина и нервное волокно (фиг. 11 B-D). Подсчет кластеров сегментов показывает наличие 16, 22 и 18 кластеров в трех разных образцах, обработанных OPN,
при полном отсутствии подобных сегментов в контрольных образцах. Полученные результаты показывают, что обработка смешанных кортикальных клеток остеопонтином вызывает образование дифференцированного фенотипа олигодендроцитов, который характерен для миелинизирующих олигодендроцитов.
Пример 9. Влияние остеопонтина на экспрессию МВР в смешанных кортикальных культурах при
измерении МВР методом ELISA.
Измерение МВР методом ELISA используют для определения увеличения белка МВР и миелинизации смешанных кортикальных культур, обработанных OPN и LIF.
Исходные культуры
Материал для исследования получают из ткани головного мозга эмбрионов мыши, удаленных у беременных самок мышей NMR1 на 16-ый день после коинтуса. Эмбрионы удаляют в соответствии с методикой, описанной Lubetzki et al., кору головного мозга расщепляют трипсином и отделенные клетки
(включая нейроны, астроциты, олигодендроциты, микроглии и предшественники нейронов) высевают в
количестве 1*105 клеток/лунку на предварительно покрытые поли-L-лизином 96-луночные культуральные планшеты (при начальном объеме, равном 50 мкл).
Обработка рекомбинантным белком
Клетки обрабатывают рекомбинантными белками (положительный контрольный образец, рекомбинантный фактор ингибирования лейкоза мышей (LIF), предоставленный фирмой AMRAD Laboratories, в
концентрациях 1 мкг/мл, 100 нг/мл и 10 нг/мл; непроцессированный остеопонтин, продуцированный бакуловирусом, в концентрациях 100 нМ, 10 нМ и 10 пМ). Все белки разводят в культуральной среде до
требуемой концентрации до добавления к клеткам in vitro. Культуры выращивают в течение 5 дней in
vitro и обрабатывают в течение последовательных 17 дней. Среду меняют через каждые 3 дня.
Методика обработки микропланшета для сбора образцов
Клетки лизируют и образцы собирают через 17 дней выращивания in vitro (DIV17). Для лизиса клеток используют буфер с тремя детергентами.
- 37 -
006655
Одну таблетку ингибитора протеазы (Roche № 1836170) добавляют к 10 мл раствора буфера с тремя
детергентами до его использования.
Из образцов смешанной кортикальной культуры, высеянной на 96-луночные планшеты с предварительно нанесенным покрытием, удаляют среду. Клетки осторожно промывают два раза 50 мкл 1 х PBS,
после чего в каждую лунку добавляют 50 мкл буфера с тремя детергентами. Все микропланшеты, содержащие лизированные образцы, хранят при -20°С до выполнения анализа.
Анализ белка методом ВСА
При выполнении анализа белка методом ВСА Pierce используют детергентсовместимый препарат
на основе бицинхониновой кислоты (ВСА) для колориметрического обнаружения и количественного
определения общего белка. Данный метод сочетает хорошо известное восстановление Сu+2 в Сu+1 под
действием белка в щелочной среде и высокочувствительное и избирательное колориметрическое обнаружение катиона меди (Сu+1) с использованием уникального реагента, содержащего бицинхониновую
кислоту.
Продукт реакции пурпурного цвета получают при выполнении данного анализа в результате образования хелата из двух молекул ВСА с одним ионом меди. Указанный водорастворимый комплекс обладает высокой оптической плотностью при 562 нм, которая изменяется линейно с увеличением концентрации белка в широком рабочем диапазоне от 20 мкг/мл до 2000 мкг/мл. Метод на основе ВСА является
методом, не имеющим конечной точки, так как конечный цвет продолжает изменяться, но после инкубации скорость изменения цвета существенно замедляется, позволяя исследовать большое количество образцов в одной серии экспериментов. Установлено, что на окрашивание ВСА влияет макромолекулярная
структура белка, количество пептидных связей и наличие четырех аминокислот (цистеин, цистин, триптофан и тирозин).
Методика определения общего содержания белка на микропланшете
25 мкл каждого эталона (концентрация BSA: 2000 мкг/мл, 1500 мкг/мл, 1000 мкг/мл, 750 мкг/мл,
500 мкг/мл, 250 мкг/мл, 125 мкг/мл, 25 мкг/мл) и образцов вводят в соответствующие лунки микропланшета. В контрольные лунки вводят 25 мкл разбавителя (буфер с тремя детергентами) (рабочий диапазон
20-2000 мкг/мл).
В каждую лунку добавляют 200 мкл рабочего реагента (смесь 50 частей реагента А на основе ВСА с
1 частью реагента В на основе ВСА). Планшет встряхивают в течение 30 с и инкубируют при 37°С в течение 30 мин. После инкубации измеряют значения оптической плотности при 570 нм.
Измерение МБР методом многослойного анализа ELISA
96-луночные стерильные микропланшеты с плоским основанием (Costar) инкубируют в течение ночи при +4°С с антителом против МBР (Chemicon, МАВ5274), разведенным в отношении 1:5000 в 1 х
PBS. В каждую лунку добавляют 50 мкл разведенного раствора антитела.
На следующий день раствор антитела удаляют из всех лунок планшета и производят блокировку,
используя 50 мкл 1% раствора BSA в 1 х PBS для каждой лунки. Блокировку выполняют в течение 1 ч
при комнатной температуре. После блокировки планшеты автоматически промывают 3 раза, используя
РВS/твин.
Инкубацию производят после последовательного добавления на микропланшеты разведенных растворов стандартного пептида МВР или образцов в 1% BSA/PBS. 100 нг/мл исходного раствора, содержащего пептид МВР, разводят в отношении 2:2. Степень разведения определяют после вычисления общего содержания белка с учетом результатов анализа белка ВСА. Получают нижеследующие значения:
100; 50; 25; 12,5, 6,2; 3,1 мкг.
После инкубации с эталоном и образцами белка МВР планшеты трижды промывают 1% BSA/PBS.
Вторую инкубацию выполняют, используя поликлональное антитело против МВР (Zymed 10-0038,
1:300), разведенное в 1% BSA/PBS. Планшеты инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре.
После инкубации планшеты снова трижды промывают аналогично приведенному выше описанию.
Культуры инкубируют с биотином козы против кролика (вектор ВА-1000, 1:10000), добавляя по 50
мкл во все лунки после разведения в 1% BSA/PBS, в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты
снова промывают после инкубации аналогично приведенному выше описанию.
Конечную инкубацию выполняют, добавляя в каждую лунку 50 мкл стрептавидинконъюгированной
пероксидазы из хрена (strep-HRP) (Amersham RPN 1051, 1:8000), разведенной в 1 х PBS. Планшеты инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре.
- 38 -
006655
После стадии промывки реакционную смесь проявляют, используя дигидрохлорид ортофенилендиамина (OPD) (Sigma, раствор, полученный в результате добавления 1 таблетки к 20 мл объему воды).
Реакционную смесь блокируют, добавляя 3 М раствор НСl или 30% H2SO4. Оптическую плотность измеряют при помощи многоканального спектрофотометра для прочтения планшетов (Labsystems Multiskan
EX) при 492 нм.
Результаты
Как показано на фиг. 12, уровни белка МBР увеличиваются в 3 раза в культурах, обработанных bacOPN (10 нМ), после выращивания in vitro (DIV) в течение 17 дней по сравнению с контрольными культурами. Данное наблюдение подтверждает ранее полученные результаты, свидетельствующие о положительном эффекте OPN, экспрессированного в бакуловирусе, на пролиферацию предшественника олигодендроцита и миелинизацию.
Пример 10. Влияние остеопонтина на пролиферацию CG4.
Линия клеток CG4 представляет иммортализованную клеточную линию олигодендроцитов, которая
спонтанно получена из первичных предшественников олигодендроцитов А2В5. Клетки CG4 является
линией клеток, обычно используемой для исследования дифференцировки или выживания олигодендроцитов. Линия клеток CG4 имеет такие преимущества, как
высокая скорость пролиферации, подобная предшественникам олигодендроцитов (O2А-подобные)
(GD3, А2В5-положительные клетки);
не требующее больших затрат сохранение в кондиционированной среде (при эффективных концентрациях фактора роста) из линии клеток нейробластомы В104 крыс (Louis J.C. et al., 1992), полученной из
АТСС;
возможность использования среды определенного состава (без FBS) (содержащей FGF2+PDGF)
вместо кондиционированной среды В104 для пролиферации в течение коротких периодов времени;
дифференцировка на олигодендроциты (О4,GalC-положительные) может быть начата при помощи
среды определенного состава;
дифференцировка на астроциты (GFAP-положительные) может быть начата в присутствии FBS.
Для испытания влияния на пролиферацию двух белков OPN (экспрессированных в клетках E-coli
или клетках насекомых) используют 35 пассажей клеток CG4. При выполнении данного анализа используют остеопонтин, продуцированный E-coli в системе R&D, (№ по каталогу 441-ОР), который фосфорилируют in vitro протеинкиназой 2 (GST-слитая) в 60 мкл объеме следующим образом:
Чтобы начать реакцию, добавляют смесь АТР и инкубируют клетки при 30°С в течение 1 ч. После
инкубации в течение 90 мин при 30°С (при перемешивании) к реакционной смеси, которую предварительно промывают в PBS для удаления протеин-киназы, добавляют 100 мкл гранул глутатионсефарозы
(Pharmacia). Затем смесь инкубируют, осторожно перемешивая, в течение одного часа при комнатной
температуре. Суспензию центрифугируют при ускорении 500 g в течение 5 мин для осаждения гранул.
Супернатант диализуют против PBS в течение ночи при 4°С. Затем производят количественное определение белка при помощи ВСА (Pierce).
Реакция с использованием киназы
10 мкл казеинкиназы при 0,05 мкг/мкл;
10 мкл OPN, экспрессированной в Е-coli при 0,5 мкг/мкл;
20 мкл 50 мM трис-HCl, pH 8;
10 мкл 6-кратного буфера для киназы;
10 мкл смеси АТР;
Анализ пролиферации
Bac-OPN и фосфорилированные in vitro белки OPN испытывают в концентрациях 10 пМ, 10 нМ и
100 нМ в отношении пролиферации клеток CG4. Анализ BrdU (Amersham) выполняют в соответствии с
- 39 -
006655
описанием, приведенным в публикации Avellana et al., 1996. Клетки культивируют в 70% среде определенного состава N1 (DMEM, содержащая 4,5 г глюкозы, 2 мМ глутамина, 100 ед/мл пенициллина, 100
мкг/мл стрептомицина и 1 мМ пуривата натрия, а также 5 мкг/мл трансферрина, 100 мМ путресцина, 30
нМ селенита натрия и 10 нг/мл биотина) и 30% кондиционированной среды В104 (N1 без биотина) (Louis
J.C. et al., 1992). Анализ выполняют на 24-луночных планшетах, обработанных полиорнитином (100
мкг/мл), которые засевают 3 х 104 клеток/лунку. Одновременно добавляют 10 нМ BrdU и клетки инкубируют в течение 18 ч. Клетки фиксируют и выполняют иммуноцитохимический анализ с использованием
антитела против BrdU для обнаружения деления клеток. Клетки также окрашивают красителем Hoechst
44432 (Sigma) для подсчета общего количества клеток. Получают изображения клеток, которые анализируют при помощи системы анализа изображений Leica QWin.
Результаты
Результаты показаны на фиг. 13.
Остеопонтин, экспрессированный в бакуловирусе, вызывает увеличение пролиферации клеток CG4.
Наиболее выраженный эффект можно наблюдать при концентрации 10 нМ OPN, хотя при концентрации
OPN, равной 100 нМ, также происходит пролиферация. Фосфорилированный in vitro OPN, экспрессированный в Е. coli, вызывает меньшую пролиферацию клеток CG4.
Анализ морфологии клеток CG4, подвергнутых воздействию OPN, по сравнению с клетками, не обработанными OPN, показывает, что в контрольных образцах дифференцировка отсутствует, OPNобработанные клетки CG4 дифференцируют в большинстве процессов развития клеток. Дифференцировка является более выраженной при экспрессии OPN в бакуловирусе и Е. coli, причем фосфорилированный in vitro OPN также вызывает дифференцировку клеток CG4 (не показана).
Пример 11. Влияние остеопонтина на MOG-индуцированный экспериментальный аутоммунный
энцефаломиелит (ЕАЕ) у мышей.
Цель исследования
Остеопонтин (OPN; AS900011) является цитокином, выполняющим плейотропные функции, включая адгезию, миграцию, дифференцировку, сохранение жизнеспособности и секрецию цитокина клетками разных типов. OPN идентифицирован методом дифференциальной экспрессии генов (DGE) с целью
обнаружения генов, способных регулировать ремиелинизацию и функцию олигодендроцитов (см. пример 1). Обработка предшественников олигодендроцитов рекомбинантным OPN, экспрессированным в
бакуловирусе (AS900011), увеличивает пролиферацию в зависимости от дозы (IC50 3,7 пМ, см. пример 7).
Кроме того, остеопонтин AS900011 влияет на дифференцировку линии клеток CG4 и первичных нейросфер (см. пример 8). OPN экспрессирован в демиелинизированной области большого мозга мышей, которым вводят купризон, причем наиболее сильная экспрессия имеет место в клетках микроглии (см.
пример 1). Экспрессия OPN наблюдается также в субвентрикулярной зоне (SVZ), где, как известно, продуцируются предшественники олигодендроцитов, участвующие в ремиелинизации (см. пример 4). Существует гипотеза, что OPN, цитокин с разными иммунорегуляторными свойствами может также быть модулятором функции нейронов и глии.
Целью данного исследования является испытание терапевтического действия OPN в модели MOGиндуцированного ЕАЕ у мышей.
Метод испытания
Метод индукции ЕАЕ, используемый в данном исследовании, является модификацией методики,
опубликованной Sahrbacher et al. (1998). Защита животных, используемых в данном эксперименте, осуществляется в соответствии с директивой 86/609/ЕЕС, утвержденной Министерством юстиции Италии за
№ 116 от 27 января 1992 г. Физические средства и оборудование для содержания и ухода за животными
находятся в соответствии с положениями директивы 86/609 EEC. Институт имеет полномочия, предоставленные компетентными ветеринарными службами. Все части данной методики, касающиеся ухода за
животными, одобрены официальным ветеринарным врачом. Данная методика утверждена Министерством здравоохранения Италии (Указ № 51/99-В).
Испытательная система
Вид, линия, сублиния и пол:
Самки мышей линии С57 BL/6JICO из колонии IFFA CREDO (Saint Germain sur 1'Arbresle, Ftance)
предоставлены фирмой Charles River Italia (Caico, Lecco, Italy).
Обоснование выбора испытательной системы:
В качестве экспериментальной модели выбраны мыши линии С57 BL/6JICO; документально подтверждена подверженность выбранной линии заболеванию ЕАЕ.
Поставщик:
Charles River Italia S.p.A.
Via Indipendenza, 11
23885-Calco (Lecco)
Акклиматизация:
В течение по крайней мере 5 дней до начала исследования. В указанный период животных ежедневно обследуют для подтверждения их пригодности к данному исследованию.
- 40 -
006655
Возраст и масса тела (методом слепого отбора):
Примерно 8 недель; 18-22 г.
Содержание:
По 10 животных в одной клетке в кондиционируемых помещениях.
Температура: 22°С±2.
Относительная влажность: 55%±10.
Замена воздуха: примерно 15-20/ч с фильтрацией в аппарате НЕРА до чистоты 99,99%.
Освещение: 12-часовой цикл чередования света и темноты (с 7:00 до 19:00).
Клетка: клетка Makrolon® размером 42,5х26,6х15, оснащенная подставкой для корма с крышкой из
нержавеющей стали. В основание клетки вставлена решетка. Отбросы, падающие через решетку на дно
клетки, периодически убирают.
Идентификация животных:
Ушная бирка. Табличка на клетке с указанием номера эксперимента, вводимой дозы и даты введения соединения.
Корм:
Гранулированный корм высшего качества GLP 4RF25, изготовленный фирмой Mucedola S.r.l., Settimo Milanese, лицензированной компанией Charles River Italia. Для облегчения кормления больных животных начиная с 7-го дня на основание клетки ежедневно кладут мокрые гранулы. Изготовитель корма
предоставляет сертификат анализа питательных веществ и примесей, уровень которых находится в пределах, установленных EPA-TSCA (44FR:44053-44093, 26 июля 1979 г.). RBM повторно анализирует животный корм по крайней мере два раза в год с целью выявления бактериального загрязнения. Животные
имеют свободный доступ к корму.
Вода:
Вода поступает из городской водопроводной сети. Воду фильтруют и предоставляют животным
свободный доступ к воде при помощи автоматической клапанной системы. Помимо автоматической системы для подачи воды использованы пластиковые бутылки. Питьевую воду периодически анализируют
на содержание микробов, тяжелых металлов, загрязняющих примесей (например, растворителей, пестицидов) и с целью определения других химических и физических свойств. Качество питьевой воды определяется на основании директивы 80/778 EEC.
В корме или питьевой воде не предполагается наличие примесей, которые могут препятствовать
достижению целей данного исследования.
Испытуемые вещества:
6 His-меченый остеопонтин мышей (AS900011) и mlFNβ
Процедура иммунизации:
Мышей иммунизируют (день=0) при помощи подкожной инъекции в левый бок 0,2 мл эмульсии,
содержащей 200 мкг пептида MOG35-55 (Neosystem, Strasbourg, France) в полном адъюванте Фрейнда
(CFA, Difco, Detroit, U.S.A.), содержащем 0,5 мг Mycobacterium tuberculosis. Сразу же после этого мышам
делают внутрибрюшинную инъекцию 500 нг токсина коклюша (List Biologocal Lab., Campbell, CA,
U.S.A.), растворенного в 400 мкл буфера (0,5 М NaCl, 0,017% тритона Х-100, 0,015 М трис-буфера,
рН=7,5). На 2-ой день животным делают вторую внутрибрюшинную инъекцию 500 нг токсина коклюша.
На 7-й день мышам вводят вторую дозу 200 мкг пептида MOG35-55 в CFA при помощи подкожной инъекции в правый бок. Начиная с 8-10 дня указанная процедура вызывает постепенно прогрессирующий паралич, начинающийся с хвоста и распространяющийся до передних лап.
Методика исследования:
В данном исследовании используют 7 групп по 15 животных в каждой. Все группы иммунизируют
пептидом MOG35-55 в CFA и токсином коклюша в соответствии с протоколом иммунизации и лечат следующим образом:
Группа 1: положительная контрольная группа, которой подкожно вводят только носитель OPN
(PBS + 0,1% BSA).
Группа 2: положительная контрольная группа, которой подкожно вводят только носитель mlFNβ
(PBS).
Группа 3: группа, которой подкожно вводят 1 мкг/кг остеопонтина (AS900011).
Группа 4: группа, которой подкожно вводят 10 мкг/кг остеопонтина (AS900011).
Группа 5: группа, которой подкожно вводят 100 мкг/кг остеопонтина (AS900011).
Группа 6: группа, которой подкожно вводят 100 мкг/кг остеопонтина (AS900011) и 20000 ед/мышь
mlFNβ.
Группа 7: группа, которой подкожно вводят 20000 ед/мышь mlFNβ.
Количество животных в группе является минимально необходимым для точной оценки наблюдаемого фармакологического действия.
Носитель:
PBS с 0,1% BSA используют для разведения остеопонтина до требуемой концентрации.
- 41 -
006655
PBS используют для разведения mlFNβ до требуемой концентрации.
Схема введения:
Остеопонтин (AS900011) в дозе 1, 10 и 100 мкг/кг вводят подкожно в объеме 10 мл/кг. mlFNβ в дозе
20000 ед/мышь вводят подкожно в объеме 200 мкл/мышь. Группе 1 подкожно вводят PBS с 0,1% BSA в
объеме 10 мл/кг и группе 2 подкожно вводят 200 мкл PBS/мышь.
Продолжительность лечения:
Лечение животных в группах по данному исследованию начинают с момента присвоения клинической оценки ≥1 и продолжают в течение 35 последовательных дней.
Форма введения:
Испытуемое соединение и mlFNβ вводят в виде растворов в соответствующем носителе. Требуемые
препараты получают в соответствии с инструкциями Спонсора.
Клинические наблюдения:
Начиная с 7-го дня после иммунизации животных обследуют на наличие паралича и присваивают
нижеследующие клинические оценки:
0 = отсутствие признаков заболевания;
0,5 = частичный паралич хвоста;
1 = паралич хвоста;
1,5 = паралич хвоста + частичный односторонний паралич задней конечности;
2 = паралич хвоста + слабость или частичный паралич задних конечностей;
2,5 = паралич хвоста + частичный паралич задних конечностей (опущенный таз);
3 = паралич хвоста + полный паралич задних конечностей
3,5 = паралич хвоста + полный паралич задних конечностей + недержание мочи;
4 = паралич хвоста + паралич задних конечностей + слабость или частичный паралич передних конечностей;
5 = агония или смерть.
Животных обследуют в тихом помещении. Клинические признаки в каждой группе ежедневно контролирует слепым методом технический работник, не знающий о типе воздействия.
Ежедневно контролируют массу тела животных.
Животных, испытывающих сильную боль или находящихся в состоянии агонии, обследует штатный ветеринар или уполномоченный служащий и при необходимости умерщвляют таких животных, чтобы избавить их от ненужной боли или страданий.
Взятие проб крови:
Через двадцать четыре часа после введения последней дозы у всех животных берут пробы крови
(при анестезии пентобарбиталом). Сыворотку отделяют обычным способом и образцы сыворотки хранят
при -20°С. Замороженную сыворотку затем отправляют в SPRI для определения концентрации испытуемого соединения в сыворотке.
Гистопатологические исследования:
В конце эксперимента животных, находящихся под наркозом, вызванным пентобарбиталом, фиксируют, перфузируя 4% формальдегид через левый желудочек сердца. Затем осторожно иссекают спинной
мозг и фиксируют его в формалине. Срезы спинного мозга помещают в парафиновые блоки. Блоки рассекают и окрашивают гематоксилином и эозином, вызывая воспалительную реакцию, а также красителем Kluver-PAS (окрашивание луксолом быстрым голубым и периодной кислотой Шиффа) для обнаружения демиелинизации.
Анализ данных:
Результаты клинических исследований выражены в виде средней оценки (± стандартная ошибка
средней) для каждой группы. Воздействие испытуемых веществ сравнивают с результатами, полученными для положительной контрольной группы животных, которым вводили носитель. Различия в клинических оценках между группами анализируют на основании критерия Крускала-Валлиса и в случае достижения статистической значимости полученные данные анализируют при помощи парного критерия Вилкоксона для каждого времени измерения. Данные, относящиеся к массе тела, оценивают при помощи
анализа ANOVA по одному признаку и в случае достижения статистической значимости для дальнейшей
оценки используют критерий Тукея. Для указанных целей применяют программное обеспечение S-Plus®.
Результаты:
Результаты данного исследования показаны на фиг. 14-16.
Результаты гистологического анализа периваскулярного воспалительного инфильтрата показывают,
что существует тенденция к уменьшению количества периваскулярных инфильтратов у животных, которым вводили OPN, особенно при введении наименьшего количества, равного 1 мкг/кг. Комбинация OPN
и IFNβ, которая, как известно, оказывает эффективное действие при лечении рассеянного склероза, позволяет получить лучшие результаты, чем при введении только OPN или только IFN (фиг. 14).
- 42 -
006655
Затем измеряют процентное значение демиелинизированных участков (фиг. 15). У животных, которым вводили OPN, обнаружено меньше демиелинизированных участков. Комбинация IFN и OPN в
большей степени уменьшает демиелинизацию, чем при введении только IFN (фиг. 15).
На фиг. 16 суммированы клинические оценки, присвоенные в конце эксперимента, результаты воспалительной инфильтрации и демиелинизации, полученные в данном исследовании. Хотя клинические
оценки, присвоенные при введении мышам OPN, были значительно ниже, чем у контрольных животных,
комбинация OPN и IFN оказывает четко выраженное влияние на клинические оценки, которые ниже, чем
в положительной контрольной группе животных, которым вводили интерферон-бета. Указанное наблюдение находится в соответствии с измерением воспалительных инфильтратов и степенью демиелинизации. Оба параметра существенно уменьшаются при введении OPN и IFNβ (фиг. 16).
В результате выполнения данного исследования получены нижеследующие результаты:
Остеопонтин (AS900011), испытанный отдельно в вводимых подкожно дозах 1, 10 и 100 мг/кг, не
уменьшает периваскулярную инфильтрацию и демиелинизацию на уровне статистической значимости.
Лечение mIFNβ (20000 ед/мышь при подкожном введении) уменьшает периваскулярную инфильтрацию
(55%) и демиелинизацию (53%). При объединении mIFNβ, используемого в той же дозе, с AS900011,
используемым в дозе 100 мг/кг, и подкожном введении указанной композиции происходит значительное
и заметное уменьшение воспалительных инфильтраций (71%) и демиелинизации (81%).
Данные гистологического анализа соотносят с клиническими оценками, полученными на 35-ый
день (конец эксперимента), когда животных умерщвляют и получают спинной мозг для гистологического анализа. Остеопонтин (AS900011), вводимый подкожно в дозах 1, 10 и 100 мг/кг, не вызывает существенного облегчения заболевания. Лечение mIFNβ (20000 ед/мышь подкожно) существенно облегчает
заболевание. При объединении mIFNβ, используемого в той же дозе, с AS900011, используемым в дозе
100 мг/кг, и подкожном введении полученной композиции достигается статистически значимое ослабление клинических симптомов заболевания.
Полученные данные позволяют предположить, что лечение композицией, включающей остеопонтин и mIFNβ, эффективно уменьшает как клинические, так и патологические воздействия в модели ЕАЕ
с использованием мышей, и поэтому данная композиция может быть эффективно использована для лечения рассеянного склероза.
Пример 12. Защитное действие, оказываемое остеопонтином на невропатию, вызванную сдавливанием седалищного нерва у мышей.
Аббревиатуры:
СМАР: мышечный потенциал действия соединения;
EMG: электромиография;
IGF-1: инсулиноподобный фактор роста;
SC: подкожное введение;
s.e.m.: стандартная ошибка средней;
vs: в сравнении;
Введение
Невропатии обычно избирательно воздействуют на тип поражаемых нейронов периферической
нервной системы (например, сенсорные и вегетативные), а также на подтип нейронов (маленькие и
большие). Аксотомия периферических нервов представляет наиболее часто используемую животную
модель для исследования нейрозащитных действий нейротрофических факторов. Травматическое повреждение нерва, повреждение нервного сплетения и нервных корешков являются серьезными осложнениями, возникающими вследствие несчастных случаев. Кроме того, в случае таких заболеваний, как запястный синдром, или ортопедические осложнения позвоночника, часто возникает давление на периферический нерв, которое может вызвать повреждение миелина. Аксотомия вызывает такие явления, как
гибель клеток, уменьшение скорости проводимости аксонов и изменение уровней нейротрансмиттеров в
пораженных нейронах. При сдавливании нервов возможна регенерация, представляющая интерес в связи
с невропатиями (McMahon S. and Priestley J.V., 1995).
Основополагающим вопросом в клеточной нейробиологии является регенерация нервов после
травмы или заболевания. Функциональная регенерация нервов требует не только проращивания и удлинения аксонов, но и синтеза нового миелина. Ремиелинизация необходима для восстановления нормальной проводимости нерва и для защиты аксонов от новых нейродегенеративных иммунологических воздействий. Главной целью исследования нейродегенеративных заболеваний является разработка способов
предотвращения гибели нейронов, сохранение фенотипа нейронов и восстановление пораженных нейронов и миелина. Многие исследования направлены на выявление молекулярных и клеточных механизмов,
ответственных за полную регенерацию пораженных спинно-мозговых двигательных нейронов (Fawcett et
al., 1990; Funakoshi et al., 1993). Вызванная травмой экспрессия нейротрофических факторов и соответствующих рецепторов может иметь важное значение для регенерации нервов. Результаты ранее выполненных исследований свидетельствуют о значительном улучшении регенерации нервов под воздействием
разных пептидов и непептидов, таких как инсулиноподобный фактор роста (IGF-1), АСТН (Lewis et al.,
- 43 -
006655
1993; Strand et al., 1980), тестостерон (Jones, 1993), SR57746A (Fournier et al., 1993) 4-метилкатехол
(Kaechi К. et al., 1993, 1995; Hanaoka Y. et al., 1992).
Целью настоящего исследования является оценка регенерации нервов у мышей, получавших остеопонтин в разных дозах. При использовании данной модели показан положительный эффект OPN на сохранение жизнеспособности и регенерацию нейронов и аксонов (сенсорные и двигательные нейроны),
миелинизацию и воспаление макрофагов, что может способствовать восстановлению двигательной
функции. Регенерацию можно измерить с учетом восстановления сенсомоторных функций и на основании морфологических исследований. Поэтому в данном исследовании параллельно выполняют электрофизиологические и гистоморфометрические анализы.
Вещества и методы
Животные
В данном исследовании использованы восемьдесят четыре самки мышей линии С571/6 RJ в возрасте 8 недель (Elevage Janvier, Le Genest-St-Isle, France). Всех животных делят на 7 групп (n=12): (а) мнимо
оперированная группа мышей, которым вводят носитель; (b) группа мышей со сдавливанием нерва, которым вводят носитель; (с) сдавливание нерва/остеопонтин (1 мкг/кг); (d) сдавливание нерва/остеопонтин (10 мкг/кг); (е) сдавливание нерва/остеопонтин (100 мкг/кг); (f) сдавливание нерва/4метилкатехол (10 мкг/кг); (g) сдавливание нерва/денатурированный остеопонтин (100 мкг/кг).
Мышей содержат в клетках группами (5 животных в одной клетке), помещают в инкубатор с регулируемой температурой (21-22°С), обратным циклом чередования света и темноты (12 ч/12 ч) и свободным доступом к корму и воде. Все эксперименты выполняют в соответствии с научными руководствами.
Поражение седалищного нерва
Животных анестезируют при помощи внутрибрюшинной инъекции 60 мг/кг хлоргидрата кетамина
(Imalgene 500®, Phone Merieux, Lyon, France). Правый седалищный нерв обнажают хирургическим путем
на уровне середины бедра и сдавливают на протяжении 5 мм в направлении разветвления седалищного
нерва. Нерв сдавливают дважды в течение 30 с при помощи гемостатического пинцета (ширина 1,5 мм;
Koenig; Strasbourg; France), поворачивая на 90° между каждым сдавливанием.
Планирование экспериментов и фармакологического лечения
Электромиографические (EMG) испытания выполняют один раз до дня хирургического вмешательства (базовое значение) и каждую неделю в течение 3 недель после операции.
День хирургического сдавливания нерва считается днем (D) 0. В течение 4 дней после сжатия нерва
не выполняют никаких испытаний.
Каждый день измеряют массу тела и определяют выживаемость.
Начиная со дня повреждения нерва и до конца исследования мышам ежедневно подкожно вводят
остеопонтин и денатурированный остеопонтин, в то время как 4-метилкатехол вводят ежедневно в виде
внутрибрюшинной инъекции.
На 4-ой неделе умерщвляют 4 животных в группе и иссекают седалищный нерв для выполнения
морфологического анализа.
Электрофизиологическое исследование.
Электрофизиологическое исследование выполняют, используя электромиограф (EMG) Neuromatic
2000M (Dantec, Les Ulis, France). Мышей анестезируют при помощи внутрибрюшинной инъекции 100
мг/кг хлоргидрата кетамина (Imalgene 500®, Rhone Merieux, Lyon, France). Нормальную температуру
тела поддерживают нагревательной лампой при 30°С и контролируют при помощи контактного термометра (Quick, Bioblock Scientific, Illkirch, France) в области хвоста.
Мышечный потенциал действия соединения (СМАР) измеряют в мышце gastrocnemius после однократной стимуляции седалищного нерва в течение 0,2 мс при сверхмаксимальной интенсивности (12,8
мА). Измеряют амплитуду (мВ), скрытый период (мс) и продолжительность (время, необходимое для
деполяризации и реполяризации) потенциала действия. Амплитуда является показателем числа активных
моторных единиц, в то время как скрытый период косвенно отображает проводимость двигательного
нерва и скорости нейромышечной передачи.
Морфометрический анализ.
Морфометрический анализ выполняют через 3 недели после сдавливания нерва. Для данного анализа используют четырех произвольно выбранных животных в группах. Мышей анестезируют при помощи внутрибрюшинной инъекции 100 мг/кг имальгена 500®. Сегмент седалищного нерва длиной 5 мм
иссекают для выполнения гистологического анализа. Ткань фиксируют в течение ночи 4% водным раствором глутаральдегида (Sigma, L'Isle d'Aeau-Chesnes, France) в растворе фосфатного буфера (рН=7,4) и
выдерживают в 30% сахарозе при +4°С до использования. Нерв фиксируют 2% тетроксидом осмия
(Sigma, L-Isle d'Abeau-Chesnes, France) в фосфатном буфере в течение 2 ч, дегидрируют в последовательных спиртовых растворах и заливают эпоном. Залитые ткани выдерживают при +70°С в течение 3 дней
для полимеризации. Микротомом делают поперечные срезы толщиной 1,5 мкм, окрашивают 1% толуидиновым синим (Sigma, L'Isle d'Abeau-Chesnes, France) в течение 2 мин, дегидрируют и помещают в эукитт. Двадцать срезов каждого образца исследуют оптическим микроскопом (Nikon, Tokyo, Japan) и выполняют морфометрический анализ 6 произвольно выбранных срезов одного образца нерва, используя
- 44 -
006655
программное обеспечение для полуавтоматического цифрового анализа изображений (Biocom, France).
Исследуют два поля в одном срезе. Определяют нижеследующие параметры: процентное содержание
дегенеративных волокон (в каждом поле) и общее количество волокон.
Анализ данных
Общий анализ данных выполняют, используя дисперсионный анализ (ANOVA) с одним показателем или повторным измерением, анализ ANOVA по одному признаку и непараметрические критерии
(критерий Манна-Витнея). Далее при необходимости используют критерий Даннетта. Уровень значимости соответствует р<0,05. Результаты выражают в виде среднего значения ± стандартная ошибка средней.
Результаты
Все животные выжили после сдавливания нерва. Одна мышь (сдавливание нерва/носитель, №2)
умерла на 7-ой день, и 2 мыши (мнимо оперированная группа мышей, получавших носитель, №3 и №6)
умерли на 14-ый день вследствие анестезии во время исследования EMG.
Масса животных.
Как показано на фиг. 17, в ходе эксперимента отмечено значительное изменение массы тела у животных в разных группах [F (6, 132)=1,93 и р<0,001; ANOVA с повторными измерениями].
В ходе исследования во всех группах наблюдалось увеличение массы тела животных.
Электрофизиологические измерения.
Амплитуда мышечного потенциала действия соединения (фиг. 18).
Между группами существует значительное различие в амплитуде СМАР на протяжении всего исследования [F(6, 18)=49,185 и р<0,001; ANOVA с повторным измерением] (фиг. 19).
После повреждения нерва у всех животных со сдавленным нервом наблюдается значительное
уменьшение амплитуды СМАР по сравнению с группой мнимо оперированных мышей (р<0,001; критерий Даннетта).
Кроме того, на 7-ой и 14-ый день амплитуда СМАР у мышей, которым вводили остеопонтин в количестве 100 мкг/кг или 4-метилкатехол в количестве 10 мкг/кг, была значительно выше, чем в группе со
сдавливанием нерва, получавшей носитель (р<0,05; критерий Даннетта).
Не наблюдается существенных различий между группой со сдавливанием нерва, получавшей носитель, и группой со сдавливанием нерва, получавшей D-остеопонтин в количестве 100 мкг/кг.
Скрытый период мышечного потенциала действия соединения (фиг. 19).
Как показано на фиг. 20, между группами наблюдается существенное различие в продолжительности скрытого периода СМАР [F (6, 18)=2,521 и р<0,001; ANOVA с повторными измерениями]. На 21-ый
день в группах со сдавливанием нерва наблюдается увеличение скрытого периода СМАР по сравнению с
мнимо оперированной группой (р<0,001; критерий Даннетта). Кроме того, лечение остеопонтином в количестве 10 и 100 мкг/кг оказывает значительное воздействие, поэтому скрытый период в указанных
группах существенно короче, чем в группе со сдавливанием нерва, получавшей носитель (р=0,017; критерий Даннетта).
Не существует значительного различия между группой со сдавливанием нерва, получавшей носитель, и группой со сдавливанием нерва, получавшей D-остеопонтин в количестве 100 мкг/кг.
Продолжительность мышечного потенциала действия соединения (фиг. 20).
На протяжении всего исследования между группами наблюдается существенное различие в продолжительности СМАР [F (6, 18)=25,15 и р<0,001; ANOVA с повторными измерениями] (фиг. 20).
Начиная с 7-го дня происходит значительное увеличение продолжительности СМАР в группах со
сдавливанием нерва (мнимо оперированная группа по сравнению с группами со сдавливанием нерва:
р<0,001; критерий Даннета). Кроме того, на 7-ой день в группе со сдавливанием нерва, получавшей остеопонтин в количестве 100 мкг/кг, наблюдается значительно более короткая продолжительность действия, чем в группе со сдавливанием нерва, получавшей носитель (р<0,001; критерий Даннетта).
На 14-ый и 21-ый день в трех группах значительно уменьшается продолжительность действия по
сравнению с группой со сдавливанием нерва, получавшей носитель: (а) сдавливание нерва/остеопонтин
10 мкг/кг; (b) сдавливание нерва/остеопонтин 100 мкг/кг; (с) сдавливание нерва/4-метил-катехол 10
мкг/кг.
Кроме того, не наблюдается существенного различия между группой со сдавливанием нерва, получавшей носитель, и группой со сдавливанием нерва, получавшей D-остеопонтин в количестве 100 мкг/кг.
Морфометрический анализ.
Процентное содержание дегенеративных волокон (фиг. 21).
Результаты статистического анализа свидетельствуют о значительном различии между группами в
процентном содержании дегенеративных волокон в поле (р<0,001; анализ ANOVA по одному признаку)
(фиг. 22). Во всех группах со сдавливанием нерва наблюдается существенное увеличение процентного
содержания дегенеративных волокон (р<0,001, критерий Даннетта). Кроме того, у мышей со сдавливанием нерва, прошедших курс лечения, процентное содержание дегенеративных волокон существенно
меньше, чем в группе мышей со сдавливанием нерва, которым вводили носитель (р<0,001; критерий
Даннетта). В группе мышей, которым вводил D-остеопонтин (100 мкг/кг), обнаружено большее процент- 45 -
006655
ное содержание дегенеративных волокон, чем в группах, получавших остеопонтин (р<0,001; критерий
Даннетта).
Общее количество волокон (фиг. 22).
Срезы исследуют при помощи оптического микроскопа с последующим выполнением морфометрического анализа с использованием программного обеспечения Visiolab 2000 (Biocom, Paris, France).
Анализируют пять срезов, полученных у одного животного, и 2 поля в одном срезе. Компьютер регистрирует только функциональные миелинизированные волокна (все дегенеративные волокна, то есть волокна с разрушенной миелиновой оболочкой не регистрируются).
Выводы
Модель сдавливания нерва представляет очень показательную модель периферической невропатии.
Сразу же после сдавливания нерва отмирает большая часть волокон большого диаметра вследствие механического повреждения, что ведет к сильному уменьшению амплитуды СМАР. Скрытый период
СМАР не изменяется сразу, но на 21-ый день скрытый период удлиняется в результате дополнительной
дегенерации волокон меньшего диаметра, вызываемой вторичной, иммуноопосредуемой дегенерацией
(макрофаги, гранулоциты). Продолжительность СМАР увеличивается на 7-ой день, достигает максимума
на 14 день и возвращается к уровню 21-го дня, который сравним с уровнем 7-го дня. Такое изменение
обусловлено тем, что на 21-ый день начинается регенерация сдавленного нерва, которая представляет
дополнительный интерес в связи с невропатическими заболеваниями. Через три недели в контрольных
группах также наблюдается прорастание/регенерация аксонов.
Остеопонтин оказывает защитное действие в модели сдавливания нерва у мышей. Сенсомоторные
функции в значительной степени восстанавливаются на 7-ой, 14-ый и 21-ый день после повреждения в
зависимости от дозы, и результаты морфологического исследования, выполненного на 21-ый день после
сдавливания нерва, указывают на существенное уменьшение процентного содержания дегенеративных
волокон и увеличение общего количества волокон. OPN является эффективной регуляторной молекулой
в данном исследовании, при этом 4-метилкатехол и инактивированный теплом, дегенеративный белок
OPN не оказывают существенного воздействия на функциональные или гистологические параметры.
Положительное действие, оказываемое на функциональное и гистологическое восстановление, может
быть обусловлено нижеследующими воздействиями OPN:
прямая защита волокон от вторичной, иммуноопосредуемой дегенерации;
ускоренная ремиелинизация и защита аксонов;
ускоренная регенерация/прорастание поврежденных аксонов;
увеличение количества миелинового дебриса, удаляемого макрофагами.
Ссылки
1. Abramsky, О. and Ovadia, H. (1997) Frontiers in Multiple Sclerosis, clinical research and therapy. Martin Dunitz publisher, London.
2. Altschul S F et al, J Mol Biol, 215, 403-410, 1990, Altschul S F et al, Nucleic Acids Res., 25:389-3402,
1997.
3. Barres, B.A., and Raff, M.C. Axonal control of oligodendrocyte development. Journal of Cell Biology
147(6): 1123-8, 1999.
4. Barres, B.A., Schmid, R., Sendnter, M., and Raff, M.C. Multiple extracellular signals are required for
long-term oligodendrocyte survival. Development 118(1): 283-95, 1993.
5. Bjartmar, C., Yin, X., and Trapp, B.D. Axonal pathology in myelin disorders. Journal of Neurocytology
28: 383-395, 1999.
6. Breighton, B and Hayden, MR: S Afr Med J. 1981 Feb 21; 59(8): 250.
7. Dal Canto, M.C., Melvold, R.W., Kim, B.S., and Miller, S.D. Two models of multiple sclerosis: experimental allergic encephalomyelitis (EAE) and Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV) infection. A
pathological and immunological comparison. Microsc. Res. Tech. 32(3): 215-29, 1995.
8. Derynk R. et al., Nature 285, 542-547, 1980.
9. Devereux J et al., Nucleic Acids Res, 12, 387-395, 1984.
10. Dubois-Dalcq, M., Feigenbaum, V., and Aubourg, P. The neurobiology of X-linked adrenoleukodystrophy, a demyelinating peroxisomal disorder. Trends in Neurosciences 22(1): 4-12, 1999.
11. Dubois-Dalcq, M., and Murray, K. Why are growth factors important in oligodendrocyte physiology?
Pathol Biol (Paris) 48(1): 80-6, 2000.
12. Fernandez, P.A., Tang, D.G., Cheng, L., Prochiantz, A., Mudge, A.W., and Raff, M.C. Evidence that
axon-derived neuregulin promotes oligodendrocyte survival in the developing rat optic nerve. Neuron 28(1): 8190, 2000.
13. Franklin, R.J. and Hinks, G.L. Understanding CNS remyelination: clues from developmental and regeneration biology. Journal of Neuroscience Research 58(2): 207-13, 1999.
14. Grantham, Science, Vol. 185, pp. 862-864 (1974).
15. Grinspan, J.B., Reeves, M.F., Coulaloglou, M.J., Nathanson, D., and Pleasure, D. Re-entry into the cell
cycle is required for bFGF-induced oligodendroglial dedifferentiation and survival. Journal of Neuroscience Research 46(4): 456-64, 1996.
- 46 -
006655
16. Grinspan, J.B., Reeves, M.F., Coulaloglou, M.J., Nathanson, D., and Pleasure, D. Re-entry into the cell
cycle is required for bFGF-induced oligodendroglial dedifferentiation and survival. Journal of Neuroscience Research 46(4): 456-64, 1996.
17. Grinspan, J.B., Stern, J.L., Franceschini, B., and Pleasure, D. Trophic effects of basic fibroblast growth
factor (bFGF) on differentiated oligodendroglia: a mechanism for regeneration of the oligodendroglial lineage.
Journal of Neuroscience Research 36(6): 672-80, 1993.
18. Hajihosseini, M., Tham, T.N., and Dubois-Dalcq, M. Origin of oligodendrocytes within the human spinal cord. Journal of Neuroscience 16(24): 7981-94, 1996.
19. Hartung, H.P., van der Meche, F.G., Pollard, J.D. (1998) Guillain-Barre syndrome, CIDP and other
chronic immune-mediated neuropathies. Curr. Opin. Neurol., 11, 497-513.
20. Hiremath, M.M., Saito, Y., Knapp, G.W., Ting, J.P., Suzuki, K., and Matsushima, G.K. Microglial/macrophage accumulation during Cuprizone-induced demyelination in C57BL/6 mice. Journal of Neuroimmunology 92(1-2): 38-49, 1998.
21. Ichikawa H, Itota T, Nishitani Y, Torii Y, Inoue K, Sugimoto T. Brain Res 2000 Apr 28;863(1-2):27681.
22. Jung, M., Kramer, E., Grzenkowski, M., Tang, K., Blakemore, W.F., Aguzzi, A., Khazaie, K., Chlichlia, K., von Blankenfeld, G., Kettenmann, H., and Trotter, J. Lines of murine oligodendroglial precursor cells
immortalized by an activated neu tyrosine kinase show distinct degrees of interaction with axons in vitro and in
vivo. European Journal of Neuroscience 7(6): 1245-65, 1995.
23. Kiefer et al. The cDNA and derived amino acid sequence for human osteopontin. Nucleic Acids Res.
1989 Apr 25;17(8):3306.
24. Kon S, Maeda M, Segawa T, Hagiwara Y, Horikoshi Y, Chikuma S, Tanaka K, Rashid MM, Inobe M,
Chambers AF, Uede T. (2000) Antibodies to different peptides in osteopontin reveal complexities in the various
secreted forms. Journal of Cellular Biochemistry 77(3): 487-98.
25. Kon S, Yokosaki Y, Maeda M, Segawa T, Horikoshi Y, Tsukagoshi H, Rashid MM, Morimoto J, Inobe
M, Shijubo N, Chambers AF, Uede T. (2002) Mapping of functional epitopes of osteopontin by monoclonal antibodies raised against defined internal sequences. Journal of Cellular Biochemistry 84(2): 420-32.
26. Kunicki, T.J., Annis, D.S., and Felding-Habermann, B. Molecular determinants of arg-gly-asp ligand
specificity for β3 integrins. Journal of Biological Chemistry 272(7): 4103-7, 1997.
27. Lee et al. Transient upregulation of osteopontin mRNA in hippocampus and striatum following global
forebrain ischemia in rats. Neurosci Lett. 1999 Aug 20;271(2):81-4.
28. Lipton, S. A., and Rosenberg, P. A. (1994). Excitatory amino acids as a final common pathway for neurologic disorders. N Engl J Med, 330, 613-22.
29. Loius J.C., Magal E., Muir D., Manthorpe M., Varon S. (1992) CG-4 A new bipontial glial cell line
from rat brain, is capable of differentiating in vitro into either mature oligodendrocytes or type-2 astrocytes. J
Neuroscience Research 31, 193-204.
30. Lubetzki, C., Demerens, C., Anglade, P., Villarroya, H., Frankfurter, A., Lee, M.Y., and Zalc, B. Even
in culture, oligodendrocytes myelinate solely axons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the
USA 90: 6820-6824, 1993.
31. Marchionni, M.A., Cannella, B., Hoban, C., Gao, Y.L., Garcia-Arenas, R., Lawson, D., Happel, E.,
Noel, F., Tofilon, P., Gwynne, D., and Raine, C.S. Neuregulin in neuron/glial interactions in the central nervous
system. GGF2 diminishes autoimmune demyelination, promotes oligodendrocyte progenitor expansion, and enhances remyelination. Advances in Experimental and Medical Biology 468: 283-95, 1999.
32. Mark et al. (Mark D.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81 (18) 5662-5666, 1984).
33. Matthieu, J.M., Comte, V., Tosic, M., and Honegger, P. Myelin gene expression during demyelination
and remyelination in aggregating brain cell cultures. Journal of Neuroimmunology 40(2-3): 231-4, 1992.
34. McDonald, J. W., Althomsons, S. P., Hyrc, K. L., Choi, D. W., and Goldberg, M. P. (1998). Oligodendrocytes from forebrain are highly vulnerable to AMPA/kainate receptor-mediated excitotoxicity. Nat Med, 4,
291-7.
35. Morell, P., Barrett, C.V., Mason, J.L., Toews, A.D., Hostettler, J.D., Knapp, G.W., and Matsushima,
G.K. Gene expression in brain during Cuprizone-induced demyelination and remyelination. Molecular and Cellular Neurosciences 12(4/5): 220-227, 1998.
36. Nait-Oumesmar, B., Decker, L., Lachapelle, F., Avellana-Adalid, V., Bachelin, C., and Van Evercooren, A.B. Progenitor cells of the adult mouse subventricular zone proliferate, migrate and differentiate into oligodendrocytes after demyelination. European Journal of Neuroscience 11(12): 4357-66, 1999.
37. Ng, W.P., Cartel, N., Roder, J., Roach, A., and Lozano, A. Human central nervous system myelin inhibits neurite outgrowth. Brain Research 720(1-2): 17-24, 1996.
38. Noseworthy, J.H. Progress in determining the causes and treatment of multiple sclerosis. Nature 399:
A40-A47, 1999.
39. Oldberg et al., Cloning and sequence analysis of rat bone sialoprotein (osteopontin) cDNA reveals an
Arg-Gly-Asp cell-binding sequence. Proc Natl Acad Sci USA. 1986 Dec;83(23):8819-23.
- 47 -
006655
40. Pantoni, L., Garcia, J. H., and Gutierrez, J. A. (1996). Cerebral white matter is highly vulnerable to ischemia. Stroke, 27, 1641-6.
41. Pearson W R, Methods in Enzymology, 183, 63-99, 1990.
42. Pearson W R and Lipman D J, Proc Nat Acad Sci USA, 85, 2444-2448,1988.
43. Petry, K.G., Boullerne, A.I., Pousset, F., Brochet, B., Caille, J.M., and Dousset, V. Experimental allergic encephalomyelitis animal models for analyzing features of multiple sclerosis. Pathol. Biol. (Paris) 48(1): 4753, 2000.
44. Pohlau, D., Aktas, O., Epplen, C. Hartung, H.P., Hoffmann, V. and Przuntek, H. (1998) Promoting remyelination as a future therapeutic principle in Multiple Sclerosis. Nervenarzt, 69, 841-850.
45. Prineas, J.W., Barnard, R.O., Kwon, E.E., Sharer, L.R., and Cho, E.S. Multiple sclerosis: remyelination
of nascent lesions. Annals of Neurology 33(2): 137-51, 1993.
46. Rodriguez-Pena, A. Oligodendrocyte development and thyroid hormone. Journal of Neurobiology
40(4): 497-512, 1999.
47. Rogister, B., Ben-Hur, T., and Dubois-Dalcq, M. From neural stem cells to myelinating oligodendrocytes. Molecular and Cellular Neurosciences 14(4-5): 287-300, 1999.
48. Sahrbacher, U.C., Lechner, F., Eugster, H.P., Frei, K., Lassmann, H., and Fontana, A. Mice with an inactivation of the inducible nitric oxide synthase gene are susceptible to experimental autoimmune encephalomyelitis. European Journal of Immunology 28 (4): 1332-8, 1998.
49. Saitoh Y, Kuratsu J, Takeshima H, Yamamoto S, Ushio Y. (1995) Expression of osteopontin in human
glioma, correlation with the malignancy. Laboratory Investigations. 72 (1): 55-63.
50. Scarlato, M., Beesley, J., and Pleasure, D. Analysis of oligodendroglial differentiation using cDNA arrays. Journal of Neuroscience Research 59(3): 430-5, 2000.
51. Scherer, S.S. Molecular genetics of demyelination: new wrinkles on an old membrane. Neuron 18: 1316, 1997.
52. Scolding, N., and Lassmann, H. Demyelination and remyelination. Trends in Neurosciences 19(1): 1-2,
1996.
53. Shaw, C.E., Milner, R., Compston, A.S., and ffrench-Constant, C. Analysis of integrin expression on
oligodendrocytes during axo-glial interaction by using ratmouse xenocultures. Journal of Neuroscience 16(3):
1163-72, 1996.
54. Shin et al., Expression of osteopontin mRNA in the adult rat brain. Neurosci Lett. 1999 Oct 1;
273(2):73-6.
55. Shepard H. M. et al., Nature, 294, 563-565, 1981.
56. Sodek J, Ganss B, McKee MD, Crit Rev Oral Biol Med 2000;11(3):279-303.
57. Smith, P.K., Krohn, R.I., Hermanson, G.T., Mallia, A.K., Gartner, F.H., Provenzano, MD., Fujimoto,
E.K., Goeke, N.M., Olson, B.J. and Klenk, D.C. (1985). Measurment of protein using bicinchoninic acid.
Anal.Biochem.l50, 76-85.
58. Smith and Waterman J Mol Biol, 147,195-197, 1981, Advances in Applied Mathematics, 2, 482-489,
1981.
59. Storch, M.K., Piddlesden, S., Haltia, M., Iivanainen, M., Morgan, P., and Lassmann, H. Multiple sclerosis: in situ evidence for antibody- and complement-mediated demyelination. Annals of Neurology 43(4): 46571, 1998.
60. Trojaborg W (1998) Acute and chronic neuropathies: new aspects of Guillain-Barre syndrome and
chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy, an overview and an update. Electroencephalogr Clin Neurophysiol., 107, 303-316.
61. Trotter, J. , Bitter-Suermann, D., and Schachner, M. Differentiation-regulated loss of the polysialylated
embryonic form and expression of the different polypeptides of the neural cell adhesion molecule by cultured
oligodendrocytes and myelin. Journal of Neuroscience Research 22(4): 369-83, 1989.
62. Wiechelman, K., Braun, R. and Fitzpatrick, J. (1988). Investigation of the bicinchoninic acid protein
assay: Identification of the groups responsible for color formation. Anal.Biochem. 175, 231-237. The degenerated fibers and the normal fibers were counted.
63. Whitney, L.W., Becker, K.G., Tresser, N.J., Caballero-Ramos, C.I., Munson, P.J., Prabhu, V.V., Trent,
J.M., McFarland, H.F., and Biddison, W.E. Analysis of gene expression in mutiple sclerosis lesions using cDNA
microarray. Annals of Neurology 46(3): 425-8, 1999.
- 48 -
006655
Список последовательностей
- 49 -
006655
- 50 -
006655
- 51 -
006655
- 52 -
006655
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Применение остеопонтина или агониста активности остеопонтина для получения лекарственного
средства для лечения и/или профилактики неврологического заболевания.
2. Применение по п.1, в котором неврологическое заболевание выбрано из группы, состоящей из
травматического повреждения нерва, инсульта, демиелинизирующих заболеваний центральной или периферической нервной системы, невропатий и нейродегенеративных заболеваний.
3. Применение по п.1 или 2, в котором неврологическое заболевание вызвано врожденным нарушением обмена веществ.
4. Применение по любому из предшествующих пунктов, в котором неврологическое заболевание
является периферической невропатией.
5. Применение по п.4, в котором неврологическое заболевание является диабетической невропатией.
6. Применение по п.2, в котором демиелинизирующее заболевание является рассеянным склерозом
(MS).
7. Применение по п.2, в котором нейродегенеративное заболевание выбрано из болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, болезни Гентингтона и бокового амиотрофического склероза (ALS).
8. Применение по любому из пп.1-7, в котором остеопонтин выбран из группы, состоящей из:
(a) полипептида, содержащего SEQ ID No. 1;
- 53 -
006655
(b) полипептида, содержащего аминокислоту 1-168 или 170 SEQ ID No. 1;
(c) полипептида, содержащего аминокислоту 1-16 и 170-314 SEQ ID No. 1;
(d) полипептида, содержащего аминокислоту 170-314 SEQ ID No. 1;
(e) полипептида, содержащего SEQ ID No. 2;
(f) полипептида, содержащего SEQ ID No. 3;
(g) мутеина любого полипептида (a)-(f), в котором аминокислотная последовательность по крайней
мере на 40, или 50, или 60, или 70, или 80, или 90% идентична по крайней мере одной из последовательностей (a)-(f);
(h) мутеина любого из полипептидов (a)-(f), кодируемого последовательностью ДНК, которая гибридизуется с комплементом последовательности нативной ДНК, кодирующей любой из полипептидов
(a)-(f), в умеренно жестких условиях или очень жестких условиях;
(i) мутеина любого полипептида по пунктам (a)-(f), в котором любые изменения аминокислотной
последовательности представляют консервативные аминокислотные замены в аминокислотных последовательностях (a)-(f);
(j) соли или изоформы, слитого белка, функционального производного, активной фракции или производного с циклическими перестановками любого из полипептидов (a)-(f).
9. Применение по любому из пп.1-8, в котором остеопонтин слит с несущей молекулой, пептидом
или белком, способствующим прохождению через гематоэнцефалический барьер.
10. Применение по любому из пп.8 или 9, в котором остеопонтин конъюгирован с полиэтиленгликолем.
11. Применение по любому из пп.8-10, в котором слитый белок содержит слитый белок иммуноглобулина (Ig).
12. Применение по любому из предшествующих пунктов, в котором лекарственное средство дополнительно содержит интерферон для одновременного, последовательного или раздельного введения.
13. Применение по п.12, в котором интерферон является интерфероном-β.
14. Применение по любому из предшествующих пунктов, в котором остеопонтин используют в количестве около 0,001-100 мкг/кг массы тела, около 1-10 мг/кг массы тела или около 5 мг/кг массы тела.
15. Применение молекулы нуклеиновой кислоты для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики неврологического заболевания, в котором молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
(a) полипептида, содержащего SEQ ID No. 1;
(b) полипептида, содержащего аминокислоту 1-168 или 170 SEQ ID No. 1;
(c) полипептида, содержащего аминокислоту 1-16 и 170-314 SEQ ID No. 1;
(d) полипептида, содержащего аминокислоту 170-314 SEQ ID No. 1;
(e) полипептида, содержащего SEQ ID No. 2;
(f) полипептида, содержащего SEQ ID No. 3;
(g) мутеина любого из полипептидов по пунктам (a)-(f), в котором аминокислотная последовательность по крайней мере на 40, или 50, или 60, или 70, или 80, или 90% идентична по крайней мере одной
из последовательностей (a)-(f);
(h) мутеина любого из полипептидов (a)-(f), кодируемого последовательностью ДНК, которая гибридизуется с комплементом последовательности нативной ДНК, кодирующей любой из полипептидов
(a)-(f), в умеренно жестких условиях или очень жестких условиях;
(i) мутеина любого из полипептидов (a)-(f), в котором любые изменения аминокислотной последовательности представляют консервативные аминокислотные замены в аминокислотных последовательностях (a)-(f);
(j) изоформы, слитого белка, функционального производного, активной фракции или производного
с циклическими перестановками любого из полипептидов (a)-(f).
16. Применение по п.15, в котором молекула нуклеиновой кислоты дополнительно содержит последовательность экспрессирующего вектора.
17. Применение вектора для индукции и/или усиления эндогенного продуцирования остеопонтина
или агониста активности остеопонтина в клетке при получении лекарственного средства для лечения
и/или профилактики неврологического заболевания.
18. Применение по любому из пп.15-17 в генотерапии.
19. Применение генетически модифицированной клетки для продуцирования остеопонтина или
агониста активности остеопонтина при получении лекарственного средства для лечения и/или профилактики неврологического заболевания.
20. Фармацевтическая композиция, содержащая остеопонтин или агонист активности остеопонтина
и интерферон необязательно вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями, которая предназначена для лечения и/или профилактики неврологического заболевания.
- 54 -
006655
21. Способ лечения неврологического заболевания, предусматривающий введение нуждающемуся в
этом пациенту эффективного количества остеопонтина или агониста активности остеопонтина необязательно вместе с фармацевтически приемлемым носителем.
22. Способ лечения неврологического заболевания, предусматривающий введение нуждающемуся в
этом пациенту эффективного количества остеопонтина или агониста активности остеопонтина и интерферона необязательно вместе с фармацевтически приемлемым носителем.
Фиг. 1А
Фиг. 1В
Фиг. 2
- 55 -
006655
Фиг. 3
Фиг. 4
Фиг. 5
- 56 -
006655
Фиг. 6
Фиг. 7
Фиг. 8
- 57 -
006655
Фиг. 9
Фиг. 10
Фиг. 11
- 58 -
006655
Фиг. 12
Фиг. 13
Фиг. 14
- 59 -
006655
Фиг. 15
Фиг. 16
Фиг. 17
- 60 -
006655
Фиг. 18
Фиг. 19
Фиг. 20
- 61 -
006655
Фиг. 21
Фиг. 22
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6
- 62 -