Клеточно-опосредованная генная терапия для сдерживания
advertisement
ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «КАЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ На правах рукописи Сафиуллов Зуфар Зуфарович НЕЙРОНАЛЬНАЯ МОЛЕКУЛА АДГЕЗИИ NCAM В СОЧЕТАНИИ С НЕЙРОТРОФИЧЕСКИМИ ФАКТОРАМИ ДЛЯ КЛЕТОЧНООПОСРЕДОВАННОЙ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ МЫШЕЙ С МОДЕЛЬЮ БОКОВОГО АМИОТРОФИЧЕСКОГО СКЛЕРОЗА 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель доктор медицинских наук профессор Исламов Р.Р. Научный консультант доктор биологических наук доцент Ризванов А.А. Казань – 2015 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ .............................................................................................................. 4 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ...................................................................... 12 1.1 Нейродегенеративные заболевания ............................................................... 12 1.2 Моделирование бокового амиотрофического склероза .............................. 16 1.3 Генная терапия нейродегенеративных заболеваний ................................... 18 1.4 Клеточная терапия нейродегенеративных заболеваний ............................. 22 1.5. Стратегии генно-клеточной терапии нейродегенеративных заболеваний31 1.5.1. Терапевтические гены ................................................................................ 31 1.5.2 Генно-клеточная терапия ............................................................................ 35 1.5.3 Генетически модифицированные мононуклеарные клетки крови пуповины человека для терапии бокового амиотрофического склероза .......................... 36 1.6 Перспективы внедрения генно-клеточных препаратов для терапии нейродегенеративных заболеваний ..................................................................... 38 ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования.................................................. 40 2.1 Получение генно-клеточного препарата....................................................... 40 2.1.1 Забор крови пуповины человека ................................................................. 40 2.1.2 Выделение мононуклеарных клеток крови пуповины человека ............. 42 2.1.3 Трансдукция мононуклеарных клеток крови пуповины человека ......... 42 2.1.4 Анализ эффективности трансдукции мононуклеарных клеток крови пуповины человека in vitro ................................................................................... 43 2.2 Ксенотрансплантация мононуклеарной фракции крови пуповины человека трансгенным SOD1 G93A мышам ....................................................................... 46 2.3 Оценка эффективности генно-клеточной терапии ...................................... 47 2.3.1 Клиническая оценка развития заболевания и продолжительности жизни животных ................................................................................................................ 47 2.3.2 Тест силы хватки .......................................................................................... 47 2.3.3 Открытое поле .............................................................................................. 48 2.4 Гистологические методы исследования ....................................................... 49 2.4.1 Иммунофлуоресцентное окрашивание ...................................................... 50 3 2.4.2 Морфометрический анализ ......................................................................... 52 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ........... 53 3.1 Экспрессия рекомбинантных генов генетически модифицированными клеткми крови пуповины человека..................................................................................... 53 3.1.1 Жизнеспособность мононуклеарных клеток крови пуповины in vitro трансдуцированных рекомбинантным аденовирусом....................................... 53 3.1.2 Экспрессия рекомбинантных терапевтических генов в мононуклеарных клетках крови пуповины in vitro .......................................................................... 54 3.2 Морфологическое исследование спинного мозга подопытных трансгенных мышей ..................................................................................................................... 56 3.2.1 Фенотипирование генетически модифицированных мононуклеарных клеток пуповины человека в спинном мозге трансгенных SOD1 G93A мышей ........ 56 3.2.2 Иммуноэкспрессия рекомбинантных генов в мононуклеарных клетках крови пуповины после трансплантации в спинной мозг SOD1 G93A мышей .......... 61 3.2.3 Адресная миграция и выживание генетически модифицированных мононуклеарных клеток крови пуповины человека после трансплантации трансгенным SOD1 G93A мышам ....................................................................... 64 3.3 Поведенческие тесты и анализ продолжительности жизни подопытных животных ................................................................................................................ 67 3.3.1 Иммунотолерантность ................................................................................. 67 3.3.2. Поведенческие тесты .................................................................................. 67 3.3.3 Продолжительность жизни экспериментальных трансгенных мышей .. 73 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ..................................................................................................... 75 ВЫВОДЫ ............................................................................................................... 79 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ................................................................................... 81 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................................... 84 СПИСОК ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА ......................................... 106 4 ВВЕДЕНИЕ Актуальность Проблема терапии нейродегенеративных заболеваний, ишемических инсультов и нейротравм остаётся одной из актуальных и недостаточно разработанных в фундаментальной и практической медицине, что обуславливает низкую эффективность современных методов лечения [1, 33]. Эти состояния сопровождаются гибелью нейронов, дегенерацией аксонов, а следовательно, неизбежным нарушением функционирования иннервируемой ткани-мишени, при этом возможности регенерации нервной ткани в этих условиях изучены не достаточно [3]. Ввиду этого такие больные получают только симптоматическое лечение, которое существенно не повышает качество жизни и, как правило, не увеличивает ее продолжительность. Результаты преодоления последствий нейродегенерации и стимулирование регенерации нервной ткани в ходе лечения неврологических больных требуют разработки и внедрения принципиально новых методов терапии, например с использованием генных и клеточных технологий [156], вместе с тем такой подход к лечению затруднителен ввиду малой изученности процессов протекающих в организме в этих условиях. Для поддержания жизни и препятствия вторичной дегенерации нейронов, а также для стимулирования роста регенерирующих нервных волокон представляется одним из обеспечение перспективных нейронов терапевтических специфическими подходов ростовыми и трофическими факторами [82], вместе с тем такой подход к лечению нейродегенеративных заболеваний требует детальной разработки. Интенсивные научные поиски выявили наиболее значимые нейротрофические факторы, которые могут быть применены в качестве лекарственных препаратов, но их использование ограничено экспериментами, или клиническими испытаниями [28]. К ним относятся, в первую очередь, мозговой нейротрофический фактор (BDNF), глиальный нейротрофический фактор (GDNF) [42], инсулиноподобный фактор роста (IGF) и сосудистый эндотелиальный 5 фактор роста (VEGF) [108]. Нейропротекторное действие этих факторов доказано в эксперименте in vitro и in vivo [60, 1]. При этом установлено, что комбинации нескольких нейротрофических факторов могут иметь более выраженный положительный эффект на выживание мотонейронов при нейродегенеративных заболеваниях [82], однако экспериментальные исследования и клинические испытания, проводимые с данными факторами, на сегодняшний день пока не позволили создать лекарственный препарат для стимулирования нейрорегенерации. Одна из главных причин отсутствия эффективной терапии нейродегенеративных заболеваний заключается в затруднениях с доставкой лекарственных средств в зону поражения нервной ткани. В настоящее время исследуют разные способы доставки биологически активных молекул в организм больного, например путём инъекции рекомбинантного белка, с помощью экспрессионного генетического вектора (плазмидного или вирусного), или на клеточных носителях, однако создать наиболее эффективный способ доставки терапевтических молекул в зону нейродегенрации пока не удалось. В рамках стратегии применения терапевтических трансгенов в последние годы активно разрабатывается технология их доставки в область повреждения при помощи разнообразных клеток (генно-клеточная, или клеточно- опосредованная генная терапия), вместе с тем строгих научных обоснований использования конкретных клеток в качестве доноров генов на сегодняшний день не существует [133]. Данная стратегия предполагает применение ряда клеток в качестве носителей терапевтических генов. По сравнению с прямой генной терапией, предполагающей непосредственное введение рекомбинантных ДНК или РНК в организм, клеточно-опосредованная доставка терапевтических генов имеет очевидные преимущества. Главное из них, основанное на феномене адресной миграции клеток (хоминг), состоит в потенциальной возможности обеспечить доставку генов к множественным очагам нейродегенерации. Другое преимущество генно-клеточной терапии связано с эффективностью продукции в области любых повреждений молекул стимуляторов регенерации в оптимальных 6 дозах. Наконец, сами трансплантируемые клетки могут служить источником молекул-стимуляторов регенерации и молекул внеклеточного матрикса, этом являются поддерживающих рост нервных проводников [47]. Одними из наиболее перспективных в смысле мононуклеарные клетки крови пуповины человека, активно изучаемые в настоящее время [55]. Основанием для применения этих клеток с целью лечения нейродегенеративных заболеваний является их пригодность как для алло-, так и для аутотрансплантации у человека, их низкая иммуногенность, доступность, простота получения и хранения. Немаловажным фактором, облегчающим использование такого подхода в клинической практике, является и отсутствие законодательных, этических и религиозных запретов для трансплантации выделенных из пуповины клеток. Кроме того, в пуповинной крови присутствуют стволовые клетки, способные дифференцироваться в разных направлениях, а также клетки, являющиеся источником многочисленных ростовых и трофических факторов [82]. Генетическая модификация мононуклеарных клеток крови пуповины открывает дополнительные возможности генной терапии [36]. Это не только адресная доставка специфических ростовых и трофических факторов, оказывающих нейропротекторный эффект, в область поражения при дегенерации нервной ткани дифференцировки различной этиологии, трансплантированных но и возможность мононуклеарных направленной клеток крови пуповины в некоторые паренхиматозные клетки, например в эндотелиальные клетки и клетки нейроглии [96]. Однако многие разработки в области генно-клеточной терапии нейродегенеративных заболеваний остаются пока на уровне экспериментов в лабораториях или (в лучшем случае) только еще начаты клинические испытания [173]. Поэтому исследования, направленные на создание генно-клеточного препарата, сдерживающего нейродегенерацию, имеет не только фундаментальное, но и прикладное значение. 7 Цель и задачи исследования Целью данной работы является исследование эффективности генноклеточной терапии трансгенных SOD1 G93A мышей с моделью бокового амиотрофического мононуклеарных одновременно склероза клеток с помощью крови рекомбинантные генетически пуповины гены человека, модифицированных экспрессирующих нейротрофических факторов и нейрональной молекулы адгезии NCAM. В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи: 1. Получить генетически модифицированные мононуклеарные клетки крови пуповины (МККП) человека, трансдуцированные аденовирусным вектором (Ad5), кодирующим ген усиленного зелёного флуоресцентного белка (Ad5-EGFP), сосудистого эндотелиального фактора роста (Ad5-VEGF), глиального нейротрофического фактора (Ad5-GDNF) и нейрональной молекулы адгезии (Ad5-NCAM1), или в различных комбинациях, а именно: Ad5-VEGF+Ad5-GDNF; Ad5-VEGF+Ad5-NCAM1; или Ad5-GDNF+Ad5-NCAM1. 2. Оценить экспрессию рекомбинантных генов в мононуклеарных клетках крови пуповины человека in vitro с помощью иммунофлуоресцентного и ПЦР-РВ методов. 3. Выявить влияние ксенотрансплантации полученных генно-клеточных препаратов на двигательную активность трансгенных SOD1 G93A мышей с моделью бокового амиотрофического склероза при помощи поведенческих тестов («открытое поле» и «тест силы хватки»). 4. Охарактеризовать способность к миграции и выживание генетически модифицированных мононуклеарных клеток крови пуповины человека в спинном мозге трансгенных SOD1 G93A мышей с моделью бокового амиотрофического склероза. 5. Изучить иммунофлуоресцентным методом экспрессию терапевтических генов (VEGF, GDNF и NCAM1) в трансплантированных мононуклеарных клетках крови пуповины человека в спинном мозге трансгенных SOD1 G93A мышей с моделью бокового амиотрофического склероза. 8 Оценить терапевтическую эффективность генно-клеточной терапии 6. трансгенных SOD1 G93A мышей с помощью генетически модифицированных мононуклеарных клеток крови пуповины человека, экспрессирующих рекомбинантные нейротрофические факторы (VEGF или GDNF) и нейрональную молекулу адгезии NCAM1 в различных сочетаниях. Научная новизна работы Впервые на основе мононуклеарных клеток крови пуповины человека и аденовирусных векторов были получены генно-клеточные конструкции, несущие: ген глиального нейротрофического фактора и нейрональной молекулой адгезии; ген сосудистого эндотелиального фактора роста и нейрональной молекулой адгезии; ген глиального нейротрофического фактора и сосудистого эндотелиального фактора роста, которые можно использовать в экспериментах с исследованием терапии бокового амиотрофического склероза. Новыми следует признать данные о том, что после ксенотрансплантации трансгенным SOD1 G93A мышам с моделью модифицированные бокового амиотрофического мононуклеарные клетки склероза крови пуповины генетически человека, экспрессирующие гены сосудистого эндотелиального фактора роста, глиального нейротрофического фактора и нейрональной молекулой адгезии выявлены в поясничном отделе спинного мозга трансгенных мышей через 5 месяцев после трансплантации. Приоритетными являются данные о положительной связи между продолжительностью жизни трансгенных SOD1 G93A мышей, количеством жизнеспособных мононуклеарных клеток крови пуповины человека в спинном мозге мышей и комбинацией терапевтических генов в генетически модифицированных клетках. Несомненной новизной обладают результаты, свидетельствующие о более высокой двигательной активности и наибольшей продолжительности жизни у трансгенных мышей с моделью бокового амиотрофического склероза, которым трансплантировали мононуклеарные трансдуцированные рекомбинантными клетки крови аденовирусами, пуповины человека, кодирующими ген 9 глиального нейротрофического фактора и ген нейрональной молекулы адгезии, или клетки, трансдуцированные рекомбинантными аденовирусами, кодирующими ген сосудистого эндотелиального фактора роста и ген нейрональной молекулы адгезии. Впервые показано, что трансплантация генетически модифицированных мононуклеарных клеток крови пуповины человека, экспрессирующих нейротрофический фактор в сочетании с нейрональной молекулой адгезии, повышает миграционный потенциал и жизнеспособность трансплантированных клеток и, как следствие, имеет более выраженный терапевтический эффект у трансгенных мышей с моделью бокового амиотрофического склероза. Научно-практическая значимость работы Результаты исследования имеют важное значение, как для практической медицины, так и для фундаментальной науки. Полученные данные могут служить основой для разработки нового класса лекарственных средств на основе мононуклеарных клеток крови пуповины человека и рекомбинантных аденовирусов, кодирующих терапевтические гены, предназначенных для лечения ряда нейродегенеративных заболеваний, а также терапии ишемических инсультов и нейротравм. Тот факт, что экспрессия генов ростовых факторов в сочетании с нейрональной молекулой адгезии в мононуклеарных клетках крови пуповины человека имеет более продолжительное действие на клетки-мишени в зоне нейродегенерации и, что такой подход позволяет не только контролировать продукцию терапевтических генов, но и саму аденовирусную инфекцию, делает возможным надеяться на внедрение генно-клеточного препарата в практическую медицину для терапии нейродегенеративных заболеваний. Предлагаемый метод лечения нейродегенеративных заболеваний при помощи генетически пуповины человека модифицированных мононуклеарных клеток крови может быть использован в центрах неврологии и нейрохирургии. Разработанные в ходе выполнения диссертационной работы методические подходы для генно-клеточной терапии нейродегенративных заболеваний могут быть внедрены в учебный процесс в высших медицинских 10 учебных заведениях, как на теоретических (биология, гистология, физиология), так и на практических кафедрах (неврология, хирургические болезни). Положение, выносимое на защиту: Доставка в спинной мозг гена нейрональной молекулой адгезии NCAM1 с помощью мононуклеарных клеток крови пуповины человека повышает эффективность клеточно-опосредованной терапии мышей с моделью бокового амиотрофического склероза рекомбинантными генами нейротрофических факторов VEGF и GDNF. Степень достоверности и апробация работы Выбранные методы и технические способы их решения современны, адекватны поставленным задачам и соответствуют мировому уровню. Достоверность полученных данных подтверждается молекулярно-генетическими, иммунофлуоресцентными, морфометрическими, физиологическими и статистическими методами исследования. Результаты исследования, вошедшие в диссертационную работу, были доложены на 89–й Всероссийской научнопрактической конференции студентов и молодых ученых, посвященной 70-летию победы в Великой Отечественной войне (Казань, 2015); Всероссийской школеконференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Материалы и технологии 21-го века» (Казань, 2014); 3-й международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Казань, 2013), V международном симпозиум «Актуальные вопросы генных и клеточных технологий» (Москва, 2012), 87-й всероссийской научно практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2012), II международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2008). 11 Личный вклад автора Автор диссертационного исследования в соответствии с поставленными задачами исследования лично планировал и проводил научные эксперименты. Все полученные результаты, выраженные в выводах и положениях выносимых на защиту, выполнены при личном участии соискателя. Автор лично занимался подготовкой к печати тезисов и статей по теме диссертации, а диссертационная работа написана автором самостоятельно. Публикации По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ, из них 3 статьи в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК. Структура и объем диссертационной работы Диссертация представлена на 108 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, списка сокращений, списка литературы и списка иллюстративного материала. Работа содержит 4 таблицы, 22 рисунка, которые включают микрофотографии флуоресцентной и конфокальной микроскопии, схемы. Список литературы содержит 187 источников, из которых 183 иностранных. 12 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Нейродегенеративные заболевания Нейродегенеративные заболевания характеризуются прогрессирующей гибелью нервных клеток головного и спинного мозга. Начиная с работ Сантъяго Рамон-и-Кахаля (Cajal, 1909-1911), проблема регенерации нейронов остаётся одной из важнейших в нейробиологии. До сих пор в научной литературе резонирует пророческое высказывание Кахаля: «…в конце развития родники роста и регенерации аксонов и дендритов высыхают безвозвратно. Посередине взрослости нервные пути — нечто фиксированное, законченное и неизменное. Всё может погибнуть, ничто не может регенерировать. Науке будущего предписано изменить, если возможно, это суровое правило». Сегодня процесс регенерации в центральной нервной системе (ЦНС) не считается заврещённым [33]. Вместе с открытием стволовой нейрональной клетки, опровергнувшим догму о нереальности регенерации в ЦНС, в настоящее время рушится и представление о невозможности синтеза белка в аксоне [6]. Функциональная значимость нервных клеток для организма предусматривает их потенциальную возможность к регенерации за счёт стволовых клеток, а значительная протяжённость аксонов в составе периферических нервов предполагает существование в аксоплазме локальных биохимических процессов жизнеобеспечения [155]. Очевидно, что подобные открытия в нейробиологии вместе с прогрессом молекулярных и клеточных технологий открывают широкие перспективы разработки новых способов лечения неврологических болезней [3]. При нейродегенеративных заболеваниях страдают различные участки ЦНС и мнжество типов нервных клеток. Необратимым изменениям подвергаются холинергические нейроны спинного мозга при боковом амиотрофическом склерозе и ствола головного мозга при спинальной мышечной атрофии [122], дофаминергические нейроны в чёрном веществе (substantia nigra) при болезни Паркинсона [63], GABA-ергические нейроны базальных ганглиев при хорее 13 Хантингтона [113], нервные клетки зубчатой извилины гиппокампа при болезни Альцхаймера [86]. Разработка препаратов поддерживающих жизнь нейронов, которые начинают вступать в процесс апоптоза, и формирование новых межклеточных связей в нервной ткани, в замен утраченных, могут значительно улучшить качество и увеличить продолжительность жизни таких больных [145]. Перспективными подходами для разработки способов лечения больных, страдающих нейродегенеративными заболеваниями, можно считать коррекцию экспрессии генов, ответственных за развитие заболевания, трансплантацию подходящих стволовых клеток, а также сочетание клеточной терапии и генной инженерии — трансплантация генетически модифицированных стволовых клеток [82]. Боковой амиотрофический склероз (БАС) представляет собой нейродегенеративное заболевание с прогрессирующей гибелью двигательных, холинергических нейронов спинного и ствола головного мозга ЦНС. Необратимой дегенерации подвергаются мотонейроны находящиеся в передних рогах спинного мозга в шейном и поясничном утолщениях, а также в двигательной зоне коры головного мозга и двигательных ядрах ствола мозга. Впервые был описан французским врачом психиатром Жан-Мартеном Шарко в 1874 году. Однако большую известность заболевание приобрело после смерти легендарного американского бейсболиста Генри Луи Геринга в 1939 году. С тех пор БАС стали называть болезнью Луи Геринга [123]. И хотя поиск возможных методов предотвратить или замедлить их гибель ведется уже второе столетие, до сих пор не было найдено эффективных нейропротекторных препаратов [3]. Заболевание неизлечимо, летальность составляет 100%. Боковой амиотрофический склероз представляет особый интерес ввиду своей редкости, крайне тяжелого течения заболевания и неминуемого летального исхода. В настоящее время в мире насчитывается около 60 – 70 тысяч больных. Заболевание встречается с частотой 1,8 на 100000 населения. Возрастной пик заболевания приурочен к 40 - 65 годам. В последние годы отмечается тенденция к росту заболеваемости во всех возрастных группах. Продолжительность жизни 14 составляет около пяти лет, однако 50% больных умирают через три года после постановки диагноза [2]. Клинические симптомы начинают проявляться когда уже потеряно более 80% двигательных нейронов. Сначала больные жалуются на слабость, далее появляется гиперрефлексия, клонические судороги, повышение мышечного тонуса, фасцикуляции (подергивание мышц), затем развивается атрофия скелетных мышц, появляется дисфагия (нарушения глотания) и респираторные нарушения. В терминальной стадии развивается тетраплегия [68]. Смерть больных наступает из-за прогрессирующей дыхательной недостаточности и прогнозируется достоверно. Вероятность возникновения увеличивается с возрастом. Преобладающий пол — мужской (2:1) [3]. Термин «амиотрофический» отражает атрофию и слабость скелетной мускулатуры, возникающих в результате гибели двигательных нейронов [68]. Тогда как термин «латеральный склероз» указывает на изменения спинного мозга, обнаруженные при вскрытии больных. В результате глиоза, сопровождающего распад нисходящих двигательных путей, при пальпации обнаруживается уплотнение боковых канатиков [19]. Механизмы избирательной гибели мотонейронов при БАС до настоящего времени остаются невыясненными, но последние два десятилетия отмечаются большим прогрессом в молекулярной генетике и раскрытии причин возникновения заболевания и приближении к пониманию механизмов смерти мотонейронов. Вдвинуто множество теорий патогенетического мехаизма развития заболевания среди которых выделяют: глютаматная эксайтотоксичность [20], митохондриальные нарушения [97, 175], окислительный стресс [9], нарушения аксонного транспорта, аутоиммунные механизмы, дисфункция цитоскелета и образование неправильных белковых комплексов, аутоиммунные нарушения, ухудшение трофики мотонейронов [184], вирусное поражение, нарушение гематэнцефалического барьера [61]. Различают семейную (10%) и спорадическую (90%) форму заболевания. Причем при семейной форме заболевания 10% оказываются генетически детерминированы, а 20% обусловлены миссенсмутацией в гене Cu/Zn-супероксиддисмутазы [3]. Ген SOD1 расположен в 21 15 хромосоме (21q22.1-q22.2) кодирует Cu/Zn- супероксиддисмутазу – фермент антиоксидантной защиты клетки, находящийся в ядре, митохондриях, цитозоле, который катализирует превращение токсического супероксида (О2-) в кислород (О2) и перекись водорода (Н2О2) пероксидных радикалов и препятствует образованию перекиси водорода [142]. Фермент представляет собой гомодимер, каждый мономер которого связывает атом меди и цинка. Цинк связывающий домен и медь связывающий домен соединены дисульфидным мостиком. Молекулярная масса 32,5 кДа. Считается, что мутация гена SOD1 приводит к экнарушению метаболизма, и как следствие повреждению продуктами окисления с последующим воспалением. Существует более 100 мутаций харатеризующихся заменой одной из 153 аминокислот, кодируемых геном SOD1. Такие мутации вызывают нарушение процесса формирования пространственной структуры белка, а также аномальную внутриклеточную агрегацию фермента связанную с цитотоксичностью и последующей нейрональной дисфункцией [181]. Цитотоксичность продуктов мутантного гена обусловлена олигомеризацией белков в высокомолекулярные структуры с повышенной оксидазной активностью фермента с дальнейшей продукцией токсического пероксититрита (ONOO-) [27]. Воздействие мутантного белка на митохондрии приводит не только к их дисфункции, но и запускает митохондриальный путь апоптоза мотонейронов [175]. Наследуются мутации по аутосомно-доминантному типу, за исключением мутации Asp90Ala, наследование которой также осуществляется по аутосомнорецессивному типу. Мутации характеризуются различной пенетрантностью, поэтому фенотипически гетерогенны [174]. С того времени как Шарко описал боковой амиотрофический склероз, произошел незначительный прогресс в понимании патогенетических механизмов гибели мотонейронов и, соответственно, в патогенетической терапии заболевания [164]. «Не смотря ни на что, давайте хранить верность и продолжать исследования. Это лучший способ найти решение и благодаря нашим усилиям вердикт, внесенный больным завтра, будет отличаться от того, который мы должны объявить сегодня» [34]. 16 На сегодняшний день доступно лишь поддерживающее симптоматическое лечение. С этой целью для терапии БАС применяют разные фармацевтические препараты с антиапоптозным, антиглютаматным, антивоспалительным, антиокислительным действием [111]. Зарегистрированный препарат для антиглютаматный агент, ингибирующий лечения БАС Riluzole — пресинаптическое высвобождение глютамата, — увеличивает среднюю продолжительность жизни больного на 2-3 месяца [121]. Поэтому в настоящее время на фоне интенсивного развития фундаментальной биологической науки ведутся активные исследования по созданию и испытанию новых лекарственных средств для сдерживания гибели нервных клеток и стимулирования нейрорегенерации [83]. Значительный успех в разработке препаратов для лечения БАС связывают с созданием моделей БАС на животных. 1.2 Моделирование бокового амиотрофического склероза Наиболее использование удобной стратегией экспериментальных поиска животных. методов Мыши лечения является являются наиболее изученной разновидностью млекопитающих и просты в содержании. Геном мыши полностью расшифрован и на 80% сходен с человеческим. Для этих целей в лаборатории Mark E. Gurney при Северозападном университете США (Northwestern University, USA) создана специальная линия трансгенных B6SJLTg(SOD1-SOD1-G93A)dl1Gur/J мышей, в геном которых встроены мутантные гены. G93A означает, что глицин в позиции 93 замещен на аланин. У таких животных происходит необратимая дегенерация мотонейронов и развитие параличей поперечнополосатой скелетной мускулатуры [9], схожая с таковой при боковом амиотрофическом склерозе у человека [69]. 50% мышей погибают в возрасте 5 месяцев [142]. Описаны 4 стадии развития заболевания у трансгенных SOD1 G93A мышей, экспрессирующих мутантный ген SOD1: 1) стадия, предшествующая развитию мышечной слабости; 2) стадия быстрого 17 прогрессирования, во время которой наблюдается быстрое развитие мышечной слабости (обычно более, чем на 50% за 2 недели); 3) стадия медленного прогрессирования, продолжающаяся 4-11 недель; 4) стадия паралича [97]. Трансгенные мыши становятся парализованными на одну или более конечностей в возрасте 5-6 месяцев. Большинство мотонейронов не погибает вплоть до терминальной стадии заболевания, которая наблюдается в среднем через 9 недель от начала болезни. На сегодняшний день создано несколько линий трансгенных мышей, отличающихся темпами развития и тяжестью заболевания. Эти параметры коррелируют с количеством копий мутантного гена, экспрессирующихся у разных линий животных [99]. Наши исследования проводятся на трансгенных мышах, развитие заболевания у которых запаздывает по сравнению с оригинальными животными приблизительно на 2-3 месяца. Это связано с тем, что количество копий мутантного гена в данном случае приблизительно на 30% меньше (18 копий) по сравнению с животными с высоким числом копий (25 копий) [69]. Выбранная нами линия имеет преимущество перед оригинальной более простым воспроизводством и уходом за животными. В питомник лабораторных животных «Пущино» при филиале института биоорганической химии им. академика М.М. Шемякина и академика Ю.А. Овчинникова РАН (филиал ИБХ РАН) линия B6SJL-Tg(SOD1-SOD1- G93A)dl1Gur/J поступила в 2006 году из питомника The Jackson Laboratory (USA) на средства по государственному контракту № 02.442.11.7319 (2006-РИ19.0/001/320). По договору с Казанским государственным медицинским университетом питомник «Пущино» отвечает за поддержание линии и производство трансгенных мышей B6SJL-Tg(SOD1-SOD1-G93A)dl1Gur/J. Ветеринарное свидетельство, выданное питомником лабораторных животных «Пущино», гарантирует качество воспроизводимых мышей и их пригодность для осуществления экспериментальных исследований. Протоколы генотипирования (полимеразная цепная реакция с использованием специфических праймеров) опубликованы на сайте The Jackson Laboratory. 18 1.3 Генная терапия нейродегенеративных заболеваний Лечение нейродегенеративных заболеваний, причинами которых являются мутации конкретных генов, безусловно требует вмешательство в организм больного на генном уровне. Использование определенных геном позволяет как подавить, так и усилить экспрессию гена-мишени. На сегодняшний день с целью коррекции экспрессии генов-мишеней разработаны ряд подходов, некоторые из которых пока находятся на стадии эксперимента, в то время как другие уже проходят клинические испытания [3]. Антисмысловые олигонуклеотиды – одноцепочные ДНК и РНК избирательно блокируют гены мишени, отвечающими за развитие заболевания. Антисмысловая РНК комплементарно связывается с мРНК, транслирующей ген, тем самым препятствуя дальнейшему синтезу белка. Использование антисмысловой ДНК приводит к образованию ДНК/РНК гибриду, который разрушает РНКаза Н [7]. Изначально создание антисмысловых олигонуклеотидов применялось для блокирования мРНК теломеразы, ответственной за трансформацию опухолевых клеток. После чего технологию антисмысловых олигонуклеотидов стали применять при лечении заболеваний, вызванных мутацией известных генов. После введения трансгенным мышам с моделью бокового амиотрофического склероза антисмысловых олигонуклеотидов, комплементарных мРНК мутантного гена SOD1, было зафиксировано снижение количества мРНК SOD1 и белка SOD1 в паренхиме головного и спинного мозга. У таких животных отмечалось замедление развития симптомов заболевания [157]. РНК-интерференция является эволюционно консервативным механизмом посттранскрипционной блокады синтеза белка. Короткая интерферирующая РНК (siRNA) комплементарно взаимодействует с мРНК-мишенью, что приводит к деградации мРНК и как следствие, невозможности синтеза белка. siRNA способна инициировать посттранскрипционное «молчание» генов, вызывающих развитие конкретного заболевания, как в культуре клеток, так и у животных с моделью заболеваний человека. Разработка методов адресной доставки siRNA в клетки 19 мишени и возможность синтеза в лаборатории siRNA, которая будет комплементарна любой изученной мРНК, открывает широкие перспективы использования этого метода для лечения инфекционных, онкологических и нейродегенеративных заболеваний таких как: болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз [3]. Трансгенным мышам SCA1 со спиномозжечковой атаксией приизели внутримозжечковую инъекцию вирусного вектора, который экспрессирует siRNA, комплементарную мутантному гену АТХ1 (атаксин 1), в результате цитоархитектоника мозжечка восстановилась, что повлекло значительное улучшение координации движений [176]. Скрещивание трансгенных мышей обладающих мутантным геном SOD1 с мышами экспрессирующими siRNA, комплементарную мутантному гену, показало, что у потомства активно транскрибируется анти-SOD1 siRNA препятствуя гибели мотонейронов [149]. Трансгенным G93A мышам с фенотипом БАС внутримышечно [139] или интраспинально [140] была проведена инъекция вирусного вектора содержащего siRNA, комплементарную мутантному гену SOD1, что отодвинуло начало заболевания и продлило жизнь больным мышам. Сейчас ведется активная подготовка к клиническим испытаниям у пожилых людей введения модифицированной siRNA для сдерживания дегенерации желтого пятна сетчатки [91]. Вирусная трансфекция является перспективным методом доставки необходимых генов в клетки – мишени, используя вирусные векторы. Суть метода заключается в том, что в генетический материал вируса интегрируют один или несколько рекомбинантных генов. Такая конструкция состоит из промотора, рекомбинантного гена и сигнала для полиаденилирования мРНК. Для этой цели могут быть использованы различные вирусы [159]. К общепринятым вирусным векторам в исследованиях по генной терапии относятся вирус лейкемии мышей Молони — MoMLV, аденовирус серотипа 5 — Ad5, адено-ассоциированный вирус — AAV и лентивирусы (HIV-1). По своей эффективности вирусные векторы превосходят плазмидные, но для некоторых из них обнаружены проблемы безопасности применения, связанные, во-первых, с 20 риском инсерционного мутагенеза, вызываемого итеграцией ретровирусного генома в геном реципиента и, во-вторых, индуцированием иммунного ответа к векторным вирусным антигенам [151]. Аденовирусные векторы являются безоболочечными вирионами, несущими двухцепочечный вирусный геном [159], обладают способностью к инфицированию широкого спектра делящихся и неделящихся клеток. Вирусный геном способен принять трансгенные вставки до 8 тыс. пар нуклеотидов. Однако, такая конструкция имеет существенный недостаток: взаимодействуя с иммунной и гуморальной системами организма, может повлечь осложнения как при первоначальном использовании препарата, так и при повторных введениях [151]. Поскольку аденовирусная система не способна интегрироваться в геном хозяина и экспрессия трансгенов будет лимитирована по времени, эффект от применения данного метода будет носить непродолжительный характер. Однако этот недостаток компенсируется способностью аденовирусов к аксонному транспорту [24]. Аденовирусные конструкции способные экспрессировать нейротрофические факторы подтвердили свою эффективность при лечении животных с моделью заболевания человека [110, 120]. При внутримышечном введении больным БАС аденовирусных векторов, экспрессирующих терапевтические гены, отмечена хорошая переносимость препаратов, увеличение продолжительности жизни и снижение уровня дыхательной недостаточности [2]. Рекомбинантный адено-ассоциированный вирус (recombinant AdenoAssosiated Virus, rAAV) непатогенный для человека парвовирус, для репликации которого необходима коинфекция хелперным вирусом [126]. rAAV преимущественно инфицирует нейроны, что обуславливает его эффективность в нервной системе [29]. AAV дикого тапа может интегрироваться в хромосому человека, в то время как рекомбинантный AAV такой способностью не обладает, и в клетке хозяина присутствует в виде эписомы. Эписома – генетический элемент, способный существовать в клетке независимо от хромосомы и не встраивается в неё. Недостатком rAAV является небольшой размер вставки трансгенной конструкции – менее 5 тыс. пар нуклеотидов. Экспрессия трансгенов 21 rAAV продолжается в течение длительного времени: до 19 месяцев в мозгу крыс и более 8 лет в мозгу приматов [126]. Вирусные векторы, созданные на основе герпесвирусов (Herpes Simplex Viruses, HSV) проявляют высокую инфекционную активность по отношению к нервным клеткам, что обусловлено природным тропизмом герпесвирусов к нервной ткани. Эти вирусы способны к эффективному ретро- и антероградному транспорту в нервной системе. Модифицированные герпесвирусы способны нести продолжительные трансгенные вставки до 50 тыс. пар нуклеотидов и проявляют репликационную активность в виде эписомы [64]. Недостатком герпесвирусной системы является мощная иммунная реакция организма на вирусные белки и, как следствие, непродолжительная экспрессия трансгенов [100]. Ретровирусы также могу быть использованы для доставки терапевтических генов при лечении нейродегенеративных заболеваний. Удаление значительной части генетической информации при создании рекомбинантных вирусных систем, повышает их безопасность при клиническом применении. Замена гликопротеинов вирусной оболочки ретровирусов на гликопротеины других вирусов (Vesicular Stomatitis Virus, VSV-G) открывает возможность рекомбинантным ретровирусам инфицирования широкого спектра клеток [127]. Особенностью ретровирусов является способность кодировать до 10 тыс. пар нуклеотидов трансгенной информации и длительной экспрессии этих генов. При терапии нейродегенеративных заболеваний применяют рекомбинантные ретровирусы для доставки в ЦНС различных нейротрофических факторов [138]. Любое нейродегенеративное заболевание связано со сниженной экспрессией нейротрофических молекул, поэтому перспективным направлением в терапии болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, хореи Хантингтона и БАС будет использование вирусных векторов для доставки нейротрофинов. Инфицирование вирусным вектором, экспрессирующим VEGF или IGF-1 трансгенных мышей с моделью БАС отодвигало начало развития заболевания и увеличивало продолжительность их жизни [14, 92]. Однако, последующие 22 клинические испытания введения вирусных терапевтических препаратов не показали выраженного терапевтического эффекта [48]. Более контролируемым по сравнению с прямой генной терапией является доставка терапевтических генов на клеточных носителях. Она основана на трансплантации генетически модифицированных клеток, сверхэкспрессирующих рекомбинантные гены. Данный подход позволяет проследить место окончательной локализации мигрирующих трансплантированных клеток и (при необходимости или нежелательных последствиях) остановить дальнейшую терапию генно-клеточным препаратом [3]. 1.4 Клеточная терапия нейродегенеративных заболеваний При нейродегенеративных заболеваниях, ишемических инсультах, травмах спинного и головного мозга происходит как гибель нейронов, так и дегенерация аксонов с последующими нарушениями в структуре коммуникаций нейрональных сетей, что влечет нарушение контролируемых ими функций. С целью препятствия вторичной дегенерации, а также стимулирования регенерации нервных клеток и их аксонов технологий перспективным - подходом трансплантация считается применение эмбриональных стволовых клеточных клеток, предифференцированных в нейральном направлении, прогениторных клеток и нейральных стволовых клеток [71]. В настоящее время в клинической практике широко применяется аллотрансплантация костной ткани, хряща, сердца, почек, печени, в то время как трансплантация эмбриональной ткани и стволовых клеток пока остается на уровне экспериментов в лабораториях, или в лучшем случае только находится на стадии клинических испытаний. Для преодоления постишемических и посттравматических изменений в нервной ткани, а также для коррекции нейродегенеративных заболеваний интенсивно исследуются возможности клеточной трансплантации [8]. Наряду с этим существуют этические проблемы, связанные с возможностью использования клеток ткани плода, и медицинские 23 характеризующиеся высокой вероятностью опухолевой трансформации трансплантированных клеток [134]. Трансплантируемые стволовые клетки должны обладать предсказуемыми и воспроизводимыми свойствами, такими как: сохранять жизнеспособность в тканях реципиента; активно размножаться с получением достаточного количества клеток, чтобы восстановить утраченные ткани; интегрироваться в ткани органа-реципиента; дифференцироваться в нужные клеточные типы; восстанавливать тканевый матрикс и формировать направляющие пути для роста аксонов; принимать участие в процессе миелинизации; оказывать трофическое и нейропротекторное воздействие; стимулировать рост аксонов. Однако не стоит рассчитывать, что трансплантированные клетки заместят погибшие нейроны, не стоит. Результаты клеточной терапии при нейродегенерации указывают на восстановление чувствительной и (в меньшей мере) двигательной функции, но в большинстве случаев положительный эффект выражен незначительно [79]. Для трансплантации в спинной и головной мозг применяют: стволовые мезенхимные клетки костного мозга и жировой ткани; эмбриональные стволовые клетки; стволовые клетки пуповинной крови. Стволовая мезенхимная клетка красного костного мозга с фенотипом CD29, CD34, CD44, CD90, CD106, CD105/SH2, CD73/SH3, Sca-1, Thy-1, BMPR принадлежит к самообновляющейся популяции клеток, которые дают начало стромальным клеткам Stro-1, экспрессирующим маркёры стволовых клеток (CD34, Sca-1 и др.). Сама стволовая мезенхимная клетка, а также её дочерние стромальные клетки способны дифференцироваться в жировые, костные, хрящевые клетки [87]. Результаты дальнейших исследований говорят о 24 возможной трансдифференцировки стволовой мезенхимной клетки в клетки других зародышевых листков. В экспериментах in vitro [87] и in vivo [119] установлена возможность дифференцировки стволовой мезенхимной клетки в нейральном и миогенном направлениях. При трансплантации в головной мозг крысы стволовые мезенхимные клетки человека давали начало астроцитам [13]. В культуре клеток из стволовых мезенхимных клеток были получены нейроны, экспрессирующие фенотипы дофаминергических, глутаматергических и холинергических нейронов [50]. Доступность клеточного материала, возможность трансплантации аутологичных клеток, пригодность с этической точки зрения, а также отсутствие признаков образования тератомы открывают широкие перспективы в использовании собственных стволовых мезенхимных клеток костного мозга для лечения нейродегенеративных заболеваний. Дифференцированные из стволовых мезенхимных клеток дофаминергические нейроны были трансплантированы животным с моделью болезни Паркинсона, что дало значительный терапевтический эффект, и этот факт послужил отправной точкой для начала клинических испытаний лечения паркинсонизма [153]. Одним из наиболее важных свойств является способность мезенхимных стволовых клеток к миграции. Доказано, что стволовые мезенхимные клетки после внутривенной инъекции спосодны заселяться не только в органы гемопоэза, но и мигрировать в зону ишемии головного мозга в эксперименте моделирования инсульта у крыс [106]. Таким образом, стволовые мезенхимные клетки красного косного мозга, трансплантированные внутривенно, способны целенаправленно мигрировать в области нейродегенерации и дифференцироваться там в нейроны и клетки глии. Использьзуя 20–100 мл аспирата красного костного мозга за две недели экспансии из культуры клеток было получено 10х106 стволовых мезенхимных клеток, что достаточно для нейротрансплантации человеку [50]. Эмбриональные стволовые клетки можно получить как из внутренней клеточной массы бластоцисты, так и из примордиальных половых клеток. На 4–5 сутки развития бластоцисты методом иммунохирургии (при помощи антител, повреждающих клетки трофобласта) внутреннюю клеточную массу отделяют от 25 трофэктодермы. Полученные клетки культивируют in vitro и выделяют чистые клеточные линии, которые способны формировать скопления шарообразной формы — эмбриоидные тела. Характерными маркёрами эмбриональных стволовых клеток являются: SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, Oct-4. Используя специфические факторы роста можно направлять дифференцировку диссоциированных клеток эмбриоидных тел. Ретиноевая кислота, фактор роста эпидермиса (EGF), морфогенетический белок кости 4 (BMP4) и щелочный фактор роста фибробластов (FGF) индуцируют дифференцировку клеток, образующихся из эктодермы. Трансформирующий фактор роста β1 (TGF β 1) и активин-А стимулируют дифференцировку клеток в производные мезодермы. Производные всех трёх зародышевых листков можно получить путём воздействия на стволовые клетки фактором роста гепатоцитов (HGF) и фактором роста нервов (NGF) [51]. Эмбриональные половые клетки получают из эмбриоидных тел, которые образуются при культивировании примордиальных половых клеток, полученных из половых валиков на 5–9-й неделе развития эмбриона. Для подтверждения принадлежности к эмбриональным половым клеткам используют следующие маркёры: SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81. Воздействуя различными факторами роста на эмбриональные половые клетки, были получены специализированные клетки — производные всех трёх зародышевых листков [109]. При нейродегенеративных заболеваниях используют клетки, полученные из эмбриоидных сфер, предифференцированные нейральные клетки, дифференцированные нервные клетки, а также генетически модифицированные клетки, экспрессирующие нейротрофические факторы или нейральные молекулы адгезии [104]. В эксперименте, полученные из зародышевых клеток человека, эмбриональные стволовые клетки были однократно трансплантированы в цереброспинальную жидкость крысам, инфицированным вирусом Sindbis, после чего наблюдалось восстановление двигательной активности у парализованных животных [93]. Однако трансплантация эмбриональных стволовых клеток мыши в головной мозг крыс, в 20% случаев вызывала образование тератомы из 26 трансплантированных клеток Риск [22]. опухолевой трансформации эмбриональных стволовых клеток снижается, если клетки in vitro предварительно подвергнуть дифференцировке нейротравмах и в нейральные нейродегенеративных предшественники. заболеваниях травмах При можно трансплантировать эмбриональные стволовые клетки, предифференцированные в нервные клетки, экспрессирующие фенотип холинергических нейронов [77] и экспрессирующие фенотип дофаминергических нейронов для лечения болезни Паркинсона [105, 183]. Поскольку существует высокая вероятность трансформации эмбриональных стволовых клеток в опухолевые, а также контаминации неизвестными инфекционными агентами из нечеловеческого материала, который используется при культивировании клеток, применение эмбриональных стволовых клеток человека в клеточной терапии было ограничено лишь экспериментальными исследованиями [45]. Однако 9 августа 2001 года в США был принят закон о финансировании лабораторных исследований эмбриональных стволовых клеток человека известных чистых линий и строго отвечающих специфическим критериям. Мононуклеарные клетки крови пуповины человека Экспериментальное обоснование выбора клеток является актуальной задачей для улучшения результатов регенерационной медицины. Наиболее перспективными в этом аспекте являются стволовые клетки, выделенные из крови пуповины. Основанием для использования стволовых клеток крови пуповины для стимулирования процессов регенерации в нервной ткани является их пригодность при алло-, и аутотрансплантации у человека, а также их доступность, низкая иммуногенность, простота в получении и хранении [65]. Немаловажным фактором служит отсутствие этических и религиозных противоречий, связанных с использованием стволовых клеток крови пуповины человека. Получив подтверждение о способности трансдифференцировки стволовой мезенхимной клетки и стволовой кроветворной клетки в нейральном 27 направлении [26, 72, 114, 118, 119], началось активное изучение эффектов при нейротрансплантации этих клеток в эксперименте. Общепризнанной экспериментальной моделью нейродегенерации является модель бокового амиотрофического склероза у трансгенных мышей. Было показано, что трансплантированные пуповинные клетки крови человека продлевали жизнь трансгенным G93A мышам, а терапевтический эффект напрямую зависел от количества трансплантированных клеток [40, 55]. Попав в кровяное русло, клетки крови пуповины преимущественно мигрировали в очаги дегенерации нервной ткани, однако также были обнаружены в других органах [62]. Морфологическое исследование трансплантированных клеток крови пуповины человека выявило экспрессию нейрональных маркёров, таких как глиальный фибриллярный кислый белок GFAP, нестин, нейрональная форма βтубулина TuJ1. На модели ишемического инсульта у крыс трансплантация клеток крови пуповины снижала клинические проявления ишемии мозга [38]. Поэтому учитывая трансплантации успех клеток экспериментов крови доказывающих пуповинной эффективность животным с моделью нейродегенеративных заболеваний человека, и наряду с этим отсутствие положительных результатов клинических испытаний по аутотрансплантации CD34 позитивных амиотрофическим клеток склерозом, периферической становится крови очевидным, больным что боковым использование стволовых клеток крови пуповины является перспективным направлением в клеточной терапии нейродегенеративных заболеваний [44]. Пуповинная кровь является богатым и доступным источником гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток [16, 65]. Выявлено присутствие в пуповинной крови стволовых клеток, способных давать начало специализированным клеткам разных тканей [101]. В настоящее временя охарактеризованы выделенные из крови пуповины стволовая кроветворная клетка (CD34, CD31, CD59, Sca-1, Thy1, Oct-4, Nanog, SOX2, FGF-4), прогениторная эндотелиальная клетка (CD34, GATA2, Flk-1), стволовая мезенхимная клетка, эмбриональная стволовая клетка крови пуповины (CD133, 28 CD164, Oct-4, SSEA-3, SSEA-4), SP (side population) клетка, которая способна дифференцироваться как в миогенном, так и в кроветворном направлениях, а также клетки, экспрессирующие специфические CD–маркёры и способные давать начало различным клеточным популяциям. Например, стволовая кроветворная клетка способна выходить из общего кровотока и заселять такие органы как печень, сердце, головной мозг или скелетные мышцы. Затем, учитывая микроокружение, стволовая кроветворная клетка может дифференцироваться в гепатоциты, эндотелиальные клетки сосудов, нейроны, олигодендроциты, астроциты, миобласты скелетной и сердечной мышечной ткани [107]. Первая успешная трансплантация клеток крови пуповины была выполнена у пациента с анемией Фанкони (англ. Fanconi’s anemia) [66]. В настоящее время получены убедительные данные о целесообразности трансплантации мононуклеарной фракции крови пуповины для терапии разных нозологических форм и в т.ч. нейродегенеративных заболеваний [178]. В многочисленных работах было установлено, что клетки крови пуповины при культивировании в среде с нейрональными ростовыми факторами, γ-интерфероном [10, 11, 12] или ретиноевой кислотой [85, 103] способны к дифференцировке в нейрогенном направлении [32, 70, 103, 116, 141, 161]. При блокировании гемопоэтической популяции клеток крови пуповины была получена клеточная линия со свойствами нейрональных стволовых клеток (англ. human umbilical cord blood-neural stem cells), которые при стимулировании фактором роста эпидермиса (англ. epidermal growth factor, EGF) способны к спонтанной агрегации и дифференцировке в клетки, по своим свойствам сходные с нейронами, астроцитами и олигодендроцитами [32]. При культивировании in vitro на биодеградируемом материале в течение трёх недель МККП формировали клеточные комплексы, содержащие стволовые клетки и пролиферирующие нейробласты. Мультиэлектродные чипы, на которые были высажены полученные комплексы, выявили способность МККП дифференцироваться в нейроны, 29 образующие функциональные сети и генерирующие спонтанные потенциалы действия [90]. Эффективность трансплантации МККП для стимулирования процессов нейрорегенерации интенсивно исследуют в экспериментах на животных [73]. Трансплантация МККП оказывает выраженный положительный эффект на выживание нейронов ЦНС. На модели болезни Альцгеймера у трансгенных мышей со сверхэкспрессией предшественника β-амилоида (англ. Amyloid Precursor Protein, APP) экспериментальных введения МККП трансплантация животных таким продлевала После многократного произошло уменьшение [54]. мышам МККП жизнь внутривенного астроцитоза и образования β-амилоидных бляшек [130]. Данное улучшение было ассоциировано с активацией фагоцитарной активности клеток микроглии по отношению к βамилоиду и активацией астроцитов, экспрессирующих глиальный фибриллярный кислый белок (англ. glial fibrillary acidic protein, GFAP) [130]. При трансплантации трансгенным мышам с моделью болезни Альцгеймера стволовых мезенхимных клеток, полученных из пуповинной крови, было продемонстрировано восстановление когнитивных функций (памяти и обучения) [102]. На модели ишемического инсульта у грызунов показано, что после внутривенного введения МККП у животных уменьшается объём инфаркта головного мозга и улучшается неврологический статус. Внутрибрюшинное введение человеческих МККП новорождённым крысятам с гипоксической ишемией головного мозга также приводит к облегчению симптомов центрального паралича [117]. В зоне ишемии МККП активизируют неоангиогенез, вызывают анти-апоптозный и противовоспатительный эффект [38, 128, 171, 177]. Клетки CD34+, полученные из крови пуповины человека, участвуют в образовании новых сосудов в зоне ишемии, обеспечивая тем самым благоприятные условия для нейрорегенерации [165]. Положительный эффект МККП на восстановление двигательных функций установлен на моделе травмы спинного мозга у мышей и крыс [132, 150, 160]. Введение клеток крови пуповины человека в кровоток в условиях травмы 30 спинного мозга угнетает развитие воспалительной реакции, нейротрофическое влияние, стимулирует неоваскуляризацию, оказывает способствует снижению экспрессии проапоптозных генов и обеспечивает выживание нейронов [35, 46]. Другим возможным механизмом положительного эффекта МККП на нейрорегенерацию может служить их способность дифференцироваться в нейроны, астроциты и олигодендроциты [133]. Так, в условиях культивирования в среде, содержащей фактор роста фибробластов 8 (англ., fibroblast growth factor, FGF8), МККП могут дифференцироваться в дофаминергические нейроны [59]. При трансплантации таких клеток в полосатое тело мозга крыс (модель болезни Паркинсона) установлено частичное восстановление симптоматического поведения, вызванного амфетамином [59, 173]. Биологически активные молекулы, секретируемые МККП, также участвуют в стимулировании нейрорегенерации [129], так как МККП продуцируют антиоксидантные, ангиогенные и нейротрофические факторы [2, 12, 15, 47, 152, 177]. В экспериментах in vitro при кокультивировании МККП и нейронов гиппокампа показано, что МККП экспрессируют молекулы адгезии (V-CAM-1, ICAM-1, L-selectin, E-selectin) и ростовые факторы (колониестимулирующие факторы гранулоцитов G-CSF и гранулоцитов/макрофагов GM-CSF, VEGF, GDNF и BDNF) [39]. В связи с этими наблюдениями значительное количество исследователей сфокусировали внимание на способах доставки клетками крови пуповины ростовых и нейротрофических факторов, таких как сосудистый эндотелиальный фактор роста (англ. vascular endothelial growth factor, VEGF), мозговой нейротрофический фактор (англ. brain-derived neurotrophic factor, BDNF) из ткани мозга и происходящий из нейроглии нейротрофический фактор (англ. glial cellderived neurotrophic factor, GDNF). Так, при трансплантации МККП в условиях травмы спинного мозга восстановление функциональных нарушений связывают с усилением экспрессии VEGF [47], а на модели ишемического инсульта — с нейропротекторным действием BDNF [96, 179]. Уровень экспрессии GDNF 31 возрастает после трансплантации МККП крысам с моделью ишемического инсульта [23, 179]. Противовоспалительное действие МККП может быть обусловлено лимфоцитами, которые вырабатывают значительное количество интерлейкина 10 (IL10) [187]. Многочисленные эффективность доказательные трансплантации эксперименты клеток крови пуповины демонстрируют животным с экспериментальной ишемией разных органов и систем, поэтому применение стволовых клеток крови пуповины считается одним из перспективных направлений в клеточной терапии ишемических и дегенеративных заболеваний [38]. Кроме того, Wan-Zhang Yang с соавторами было доказал, что аллотрансплантация клеток крови пуповины безопасна при терапии различных заболеваний [178]. 1.5. Стратегии генно-клеточной терапии нейродегенеративных заболеваний 1.5.1. Терапевтические гены К перспективным методам лечения больных нейродегенеративными заболеваниями можно отнести коррекцию экспрессии гена, который отвечает за развитие заболевания, трансплантацию стволовых клеток, а также совместное применение генной терапии в сочетании с клеточной — трансплантацию генетически модифицированных клеток, сверхэкспрессирующих факторы, стимулирующие выживание нейронов. Исследования в этой области выявили наиболее подходящие в данной ситуации нейротрофические факторы, которые можно применить для стимулирования нейрорегенерации [28]. К ним относятся глиальный нейротрофический фактор (GDNF), мозговой нейротрофический фактор (BDNF) [5], сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) и инсулиноподобный фактор роста (IGF) [108]. Нейропротекторный эффект этих факторов подтвержден в эксперименте in vitro и in vivo. Отмечено, что использование комбинаций нескольких нейротрофических факторов может 32 оказать более выраженное положительное воздействие на поврежденные нервные клетки. Несмотя на это проведенные экспериментальные исследования, а также клинические испытания, с данными факторами, не смогли выявить конкретный эффективный препарат для стимулирования нейрорегенерации [180]. Не решенным остается вопрос о способе доставки терапевтических веществ в нервную ткань. В настоящее время разрабатываются методы доставки биологически активных молекул в ткани – мишени организма больного, такие как инъекция рекомбинантного белка, использование экспрессионных векторов (плазмидного или вирусного), а также трансплантация генетически модифицированных клеток, сверхэкспрессирующих ростовые и трофические факторы [60]. Список генов, кодирующих синтез потенциальных стимуляторов нейрорегенерации достаточно велик. Из них нам представляются наиболее перспективными сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), глиальный нейротрофический фактор (GDNF) и молекула адгезии нервных клеток (NCAM). Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) был первоначально описан как сосудистый фактор проницаемости (vascular permeability factor, VPF) [52], который, как было показано впоследствии, проявляет специфическую митогенную активность в отношении эндотелиальных клеток [56]. Семейство VEGF включает VEGF-A (ранее просто VEGF), VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E и плацентарный фактор роста (PlGF) [57]. В результате альтернативного сплайсинга гена, кодирующего VEGF-А, синтезируются молекулы, состоящие из 121, 145, 165, 189, или 206 аминокислот. В зависимости от присутствия в зрелой мРНК 6 или 7 экзона происходит синтез растворимых (VEGF121 и VEGF165), или мембрано-(матрикс) связанных изоформ (VEGF189, VEGF206) [167]. Преимущественно синтезируются VEGF121 и VEGF165 и находятся в фокусе интенсивных исследований. Кроме ангиогенного действия VEGF проявляет свойства типичного нейротрофического фактора. Он поддерживает выживание чувствительных [158] 33 и двигательных [3] нейронов. VEGF стимулирует пролиферацию астроцитов [143], нейральных стволовых [88] и шванновских [158] клеток. Введение аденовирусного вектора с геном VEGF при травме спинного мозга сдерживает вступление нервных клеток в апоптоз [137]. Доставка в область травмы спинного мозга VEGF при помощи трансфицированных нейральных стволовых клеток усиливает пролиферацию глиальных предшественников и неоваскуляризацию [94]. Стимулирующее влияние VEGF на процесс неоваскуляризации важно для устранения эффекта посттравматической ишемии ткани. Глиальный нейротрофический фактор (GDNF) принадлежит к семейству трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), секретируют клетки глии (астроциты, шванновские клетки), имеет выраженное нейропротекторное действие на дофаминэргические нейроны головного мозга и холинэргические мотонейроны спинного мозга [42], стимулирует рост нервных отростков [80]. Уровень мРНК GDNF быстро возрастает в нервной ткани после повреждения [78] и имеет выраженный эффект сдерживания посттравматической гибели нейронов [17]. GDNF быстро деградирует в организме и не может эффективно проникать через гематоэнцефалический барьер [49], что следует учитывать при доствке GDNF в ЦНС. В эксперименте при травме спинного мозга инъекция в область повреждения GDNF оказала нейропротекторный эффект [42]. Кроме того GDNF стимулирует увеличение количества и длинны регенерирующих аксонов, а также способствует росту аксонов в культуре нервных клеток спинального ганглия [182]. После трансплантации генетически модифицированных мезенхимных стволовых клеток, экспрессирующих GDNF, крысам с моделью бокового амиотрофического склероза увеличивается выживаемость мотонейронов [162]. На модели травмы лицевого нерва показано, что применение биодеградируемого материала в комбинации с нейральными стволовыми клетками, генетически модифицированными для поврежденного нерва [154]. экспрессии GDNF, повышает регенерацию 34 Молекула адгезии нервных клеток NCAM (CD56) — гомофильно связывающийся гликопротеин; экспрессируется на поверхности нейронов и клеток нейроглии. Межклеточные взаимодействия, опосредуемые NCAM, в нейроонтогенезе и посттравматической регенерации обеспечивают выживание и миграцию нейронов, направленный рост нейритов, синаптогенез. Кинетика взаимодействия молекул NCAM зависит от количества молекул и степени их гликозилирования (связывания с полисиаловой кислотой). Полисиаловая кислота удерживает воду и таким образом модулирует дистанцию между клетками. Высокий уровень полисиалированной формы NCAM выявлен в ходе нейрогенеза; в постнатальном периоде — при ишемии и травме мозга [148]. Полисиалированная форма NCAM выступает в роли нейропротектора и способствует нейрорегенерации. Через цитозольный домен NCAM участвует в разных внутриклеточных сигнальных каскадах (протеин киназа А, протенин киназа С, кальций/кальмодулин зависимая киназа, спектрин, GAP43, PI3, цГМФ каскады) [30, 31, 136, 172]. Ранее для генетичекой модификации клеток был использован ген нейральной молекулы адгезии L1 (L1CAM). Трансфекция эмбриональных стволовых клеток мыши плазмидными векторами, которые экспрессируют клонированный ген L1CAM, способствовала как встраиванию молекулы адгезии в мембрану стволовых клеток, так и секреции её растворимой формы [37]. После трансплантации таких клеток животным, с моделью нейротравмы спинного мозга, они обнаруживались в ткани реципиента через месяц после трансплантации и формировали отростки, в то время как такие же клетки, но нетрансфецированные, выживали лишь в течение 7 суток. В следующей работе [21] было установлено, что экспрессия L1 способствует дифференцировке эмбриональных стволовых клеток по нейрональному пути. Особый интерес представляет трансдукция клеточных носителей двумя и более экспрессионными векторами [3, 82]. Такой подход позволяет получить одновременную сверхэкспрессию нескольких молекул стимуляторов регенерации. Недавно, было показано, что генетически модифицированные мезенхимные 35 стволовые клетки человека, одновременно сверхэкспрессирующих гены GDNF и VEGF, при их внутримышечной инъекции крысам с моделью бокового амиотрофического склероза поддерживают структуру нервно-мышечного синапса и продлевают жизнь животных [98]. В наших исследованиях в мононуклеарные клетки крови человека, кроме гена стимулятора регенерации, был введён ген молекулы адгезии нервных клеток, которая согласно полученным данным способствовала адресной миграции трансплантированных клеток и поддерживала их выживание в тканях реципиента [82]. Таким образом, комбинация нескольких нейротрофических факторов могут иметь более выраженный эффект на сдерживание гибели и выживание нервных клеток. 1.5.2 Генно-клеточная терапия Накопленный опыт в области биотехнологии позволяет применять разработанную генно-клеточную терапию для стимулирования процессов регенерации в разных отделах ЦНС при инсультах, травмах головного и спинного мозга и нейродегенеративных заболеваниях [169]. Прямая геная терапия подразумевает инъекцию плазмидных или вирусных векторов, экспрессирующих терапевтические гены, в организм. Попадая в разные клетки и ткани реципиента плазмиды и вирусы начинают продуцию целевых молекул, однако их эффект оказался непродолжительным, ввиду быстрого расщепления протеазами. При Генно-клеточная терапия основана на введении в организм больного клеток, предварительно генетически модифицированных с помощью экспрессионных векторов вирусного или плазмидного [185]. В настоящее время стратегиями терапии нейродегенеративных заболеваний различной природы являются трансплантация клеток или доставка терапевтических генов, продукты которых в одоих случаях препятствуют развитию патологических реакций и способствуют нейрорегенерации. Комбинация этих подходов лежит в основе генно-клеточной терапии, с применением которой связывают большие надежды не только в области 36 стимулирования нейрорегенерации при нейродегенеративных заболеваниях, но и в регенеративной медицине в целом [41]. Немаловажным фактором при применении генной и генно-клеточной терапии с целью регенерации ткани является увеличение уровня экспрессии генов, кодирующих факторы роста, трофические факторы и молекулы адгезии, которые поддерживают выживание клеток паренхимы поражённого органа и стимулируют его регенерацию [74]. Трансплантируемые стволовые клетки также являются продуцентами биологически активных молекул, поэтому могут служить альтернативой Инновационное внутривенному направление, введению сочетающее рекомбинантных результат белков. клеточной терапии, дополненный эффектом от продуктов экспрессии терапевтических генов, имеет широкие перспективы для дальнейшего клинического использования. Возможности терапии нейродегенеративных заболеваний с применением генноклеточных технологий активно разрабатываются во многих лабораториях мира [147]. Существуют препятствия внедрению генно-клеточных технологий связаннве с этическими проблемами когда применяют клетки эмбриона или плода, существует высокая вероятность опухолевой трансформации трансплантированных эмбриональных стволовых клеток, в ряде случаев происходит инфицирование реципиента возбудителями неизвестных заболеваний при использовании сыворотки и клеток животных, развивается иммунологическая реакция в ответ на аллогенные клетки, всегда естьриск неконтролируемой продукции рекомбинантного белка [166]. Для предотвращения развития дегенерации и активирования процессов нейрорегенерации в настоящее время ведутся активные поиски как новых терапевтических генов, так и новых клеточных носителей [95]. 1.5.3 Генетически модифицированные мононуклеарные клетки крови пуповины человека для терапии бокового амиотрофического склероза 37 С целью повышения эффективности терапии клетками крови пуповинны разрабатываются новые подходы, заключающиеся в применении генетически модифицированных МККП, как способа доставки трофических факторов и молекул адгезии, которые поддерживают выживание клеток паренхимы, стимулируют пролиферацию клеток, восстановают межклеточные контакты и способствуют формированию утраченных тканевых структур [3]. Кроме удовлетворения общим критериям клеточных векторов доставки молекулстимуляторов нейрорегенерации, трансплантируемые в ЦНС клетки должны проявлять повышенную выживаемость и обладать способностью миграции через гемато-энцефалический барьер. На сегодняшний день существуют единичные работы по экспериментальной трансплантации генетически модифицированных клеток крови пуповины для стимулирования регенерации кардиоиооцитов и сосудов. Особый интерес представляет трансплантация генетически модифицированных клеток крови пуповины, несущих ген сосудистого эндотелиального фактора роста VEGF. Трансплантация клеток крови пуповины, трансфецированных геном VEGF, способствует активации ангиогенеза в пораженной ткани при моделировании хронической ишемии конечностей у крыс [81] и инфаркта миокарда у мышей [36]. К тому же эффект генно-клеточной терапии может быть усилен за счет трансфекции клеток двухкассетным плазмидным вектором, который экспрессирует два терапевтических гена. Для предотвращения последствий связанных с дегенеративными изменениями в нервной ткани, и стимулирования процессов нейрорегенерации в ЦНС получение и испытание генетически модифицированных МКПК крови пуповины будет являться перспективным подходом применения генно- клеточной терапии для лечения нейродегенеративных заболеваний. Здесь возможно тестирование множества различных подходов, например: использование различных клеточных типов крови пуповины, возможность нагрузки трансплантируемых клеток разными терапевтическими генами, варианты по количеству трансплантируемых клеток, срокам трансплантации, и 38 способу введения клеток непосредственно в область травмы, внутривенно, в биоматрикс [3]. 1.6 Перспективы внедрения генно-клеточных препаратов для терапии нейродегенеративных заболеваний В России аналога заявленному лекарственному препарату не существует. Первое российское генно-инженерное лекарство "Неоваскулоген" создано в ОАО "Институт стволовых клеток человека" (ИСКЧ) на основе плазмидного вектора (pCMV) и рекомбинантного гена сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF165). Препарат предназначен для лечения ишемических состояний различной локализации, продаётся в России 2012 года [131]. В настоящее время ООО «НТфарма» предлагает геннотерапевтический препарат АдеВаск™ для генной терапии бокового амиотрофического склероза. Препарат создан на основе двух аденовирусных векторов, экспрессирующих гены сосудистого эндотелиального фактора роста и ангиогенина. Зарубежными конкурентами на данном этапе создания генно-клеточного препарата на основе мононуклеарной фракции крови пуповины являются иностранные научные коллективы, завершившие доклинические исследования и приступившие к клиническим испытаниям клеточных препаратов для терапии БАС и других нозологических форм нерйродегенративных заболеваний (Таблица 1). 39 Таблица 1 - Клинические испытания клеточных препаратов для терапии нейродегенеративных состояний Нозология Травма спинного мозга Ишемическй инсульт у детей БАС БАС БАС БАС БАС Клеточный материал и способ введения Фаза клинических испытаний Мононуклеарные клетки крови пуповины; интраспинальная инъекция Фаза 2 Аутологичные стволовые клетки крови пуповины; внутривенная инъекция Фаза 1 Мезенхимные стволовые клетки из крови пуповины; интратекальная инъекция Фаза 2 Аутологичные мезенхимные стволовые клетки из красного костного мозга; интратекальная инъекция Мезенхимные стволовые клетки из красного костного мозга; внутрижелудочкавая инъекция Аутологичные мезенхимные стволовые клетки из красного костного мозга; внутривенная инъекция Мезенхимные стволовые клетки из красного костного мозга; множественные внутримышечные инъекции в сочетании с однократной интратекальной инъекцией Фаза 1 Фаза 1 Фаза 1 Фаза 2 БАС CD34+ клетки из периферической крови; интраспинальная инъекция Фаза 1 БАС Нейрональная стволова клетка человека, интраспинальная инъекция Фаза 1 40 ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования Эксперименты выполнены на 73 трансгенных мышах B6SJL-Tg(SOD1G93A)dl1Gur/J, экспрессирующих мутантный ген человека — Cu/Zn– супероксиддисмутазу sod1 (Gly93 Ala; глицин замещён на аланин в позиции 93), далее трансгенные SOD1 G93A мыши. Животные приобретены в питомнике лабораторных животных «Пущино». Половозрелых трансгенных SOD1 мышей содержали в стандартных условиях питомника (вивария) Казанского государственного медицинского университета со свободным доступом к воде и корму, тщательным уходом, контролируемой температурой, регулируемой влажностью и гуманным отношением в течение всей жизни животного в соответствии с требованиями приказа Министерства здравоохранения Российской Федерации от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении Правил лабораторной практики». Проведение диссертационного исследования одобрено локальным этическим комитетом Казанского государственного медицинского университета. 2.1 Получение генно-клеточного препарата 2.1.1 Забор крови пуповины человека Заготовку пуповинной крови производили после получения информированного согласия у беременной женщины, которая проходила тщательный дородовый скрининг на наличие противопоказаний к донорству пуповинных клеток (тяжелые соматические заболевания, отягощенный семейный анамнез, акушерская патология). Донором не могла быть беременная женщина при положительных результатах тестирования на наличие следующих инфекций: ВИЧ 1 и 2, сифилис, гепатиты В и С, острую стадию инфекций, вызванных вирусом простого герпеса 1 и 2, цитомегаловирусом, токсоплазмой (в соответствии с Приказом Минздрава РФ от 14.09.2001 №364 об утверждении порядка медицинского обследования доноров крови и ее компонентов). 41 Пуповинную кровь забирали специально обученные сотрудники роддома по инструкции Банка стволовых клеток Казанского медицинского университета. Сразу после рождения ребенка и отсечения пуповины кровь собирали в стандартную систему для взятия донорской крови (контейнеры пластиковые одинарные CPDA-1 250 GG, Thermo). Забор пуповинной крови осуществляли как в ходе родов через естественные родовые пути, так и в случае оперативного родоразрешения путем кесарева сечения. Отработанная техника забора позволяла медицинскому персоналу контролировать качество получаемой пуповинной крови. После забора в течение 12 часов пуповинную кровь в изотермическом контейнере доставляли в Банк стволовых клеток, где из неё выделяли мононуклеарную фракцию (Рисунок 1). Рисунок 1 - Дизайн эксперимента. [Исламов и др., 2007] с изменениями 42 2.1.2 Выделение мононуклеарных клеток крови пуповины человека Выделение мононуклеарных клеток крови пуповины (МККП) проводили в градиенте плотности фиколла в пробирках объемом 50 мл, согласно опубликованной ранее методике [76]. В каждую пробирку вносили по 25 мл раствора фиколла плотностью 1,077 г/мл (ПанЭко), на который аккуратно при помощи автоматического дозатора наслаивали равный объём пуповинной крови с антикоагулянтом (соотношение крови и антикоагулянта колебалось в пределах 1:1-3:1). Проводили центрифугирование при 720 ×g в течение 20 мин и получали чёткое разделение крови на 4 фракции: эритроциты, фиколл, лейкоциты и плазму. МККП собирали в отдельную пробирку, ресуспендировали в растворе фосфатносолевого буфера, модифицированного Дульбекко (DPBS, ПанЭко) в соотношении 1:2 и центрифугировали при 305 ×g в течение 15 мин. Полученный клеточный осадок ресуспендировали в 10 мл раствора DPBS и повторно центрифугировали при 305 ×g в течение 15 мин. Для удаления эритроцитов клетки ресуспендировали в гипотоническом лизирующем буфере (0,168 M NH4Cl, 0,1 M KHCO3, 1,27 мМ EDTA, pH 7,3), на заключительном этапе клетки отмывали раствором DPBS. После выделения МККП поддерживали в среде RPMI-1640 (Sigma) с добавлением 1мМ L-глутамина, 10% сыворотки крови плодов коровы (Sigma) и 1х смеси антибиотиков пенициллина и стрептомицина (100 ЕД/мл; 100 мкг/мл) (Sigma). 2.1.3 Трансдукция мононуклеарных клеток крови пуповины человека Рекомбинантные экспрессионные конструкции на основе аденовирусов пятого серотипа, кодирующие гены vegf, gdnf, ncam1 и egfp, были созданы ранее с помощью технологии Gateway-клонирования (Invitrogen, США) (Черенкова и др., 2012). Готовые для использования стоки аденовирусов Ad5-VEGF, Ad5-GDNF, Ad5-NCAM1 и Ad5-EGFP были любезно предоставлены отделом поисковых исследований НОЦ фармацевтики Казанского (Приволжского) федерального университет (заведующий отделом Ризванов А.А.). 43 МККП трансдуцировали рекомбинантными аденовирусами Ad5-VEGF, Ad5-GDNF, Ad5-NCAM, Ad5-EGFP в отдельности и их комбинациями. МККП ресуспендировали в среде RPMI 1640 содержащей 10% FBS, 2 мМ L-глутамина и смесь пенициллина и стрептомицина (100 ЕД/мл;100 мкг/мл) (Sigma), рассевали в шести луночных планшетах (9,5 см2) с низкой адгезией и добавляли аденовирусы в соотношении 10 инфекционных вирусных частиц на клетку (multiplicity of infection, MOI 10). Клетки культивировали в инкубаторе при 37°С, во влажной атмосфере, содержащей 5% СО2. Для ксенотрансплантации трансдуцированные МККП собирали через 16 часов культивирования центрифугированием при 500×g в течение 5 мин. Клеточный осадок трижды промывали в растворе DPBS, растворяли в стерильном растворе 0,9% хлорида натрия из расчета 1×10 6 клеток в 100 мкл инъекции. Все работы с клетками проводились в асептических условиях в ламинарном шкафу Faster SafeFAST Elite Microbiological Safety Cabinets (Италия) второго уровня защиты с соблюдением общепринятых правил работы с эукариотическими клетками. 2.1.4 Анализ эффективности трансдукции мононуклеарных клеток крови пуповины человека in vitro Через 96 часов после трансдукции МККП соскребали с планшета и анализировали экспрессию рекомбинантных генов (vegf, gdnf, ncam, egfp) методом ПЦР-РВ. Выделение PНК из модифицированных и нативных МККП осуществляли с использованием набора Yellow solve (Силекс), согласно инструкции фирмы производителя. Количество и степень очистки РНК определяли спектрофотометрически и в ходе электрофореза в агарозном геле. РНК до использования хранили при -20°С. Для синтеза кДНК использовали 100 нг РНК-матрицы. Реакцию oбpатнoй тpанскpипции пpoвoдили с испoльзoванием шестинуклеотидных рандом ((agct)(agct)(agct)(agct)(agct)(agct)) праймеров-гексамеров (Литех) на приборе С1000 (Random6) (BioRad). Реакционная смесь общим объемом 20 мкл содержала 150 нг РНК-матрицы, 1 мкл 44 50 нM гексануклеотидного рандом-праймера и 8,5 мкл деионизированной воды. Сначала проводили предварительный нагрев смеси в течение 5 мин при 65°С. Далее в каждый исследуемый образец добавляли 4 мкл буфера 5Х RT buffer (Thermo Scientific) для обратной транскриптазы, 20 U ингибитора РНКаз Ribolock RNAse inhibitor (Thermo Scientific), 1 мкл, 10 мМ дНТФ, 200 U обратной транскриптазы Maxima Reverse Transcriptase (Thermo Scientific). Синтез кДНК проводили при следующих параметрах реакции: 25°С-10 мин, 42°С-60 мин, 70°С10 мин. Синтезированный препарат кДНК применяли непосредственно для ПЦРРВ или хранили при -20°С. Количественный анализ транскрипции мРНК генов vegf165, gdnf и ncam1 проводили с помощью метода полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) на приборе CFX96 Real-Time System (BioRad) c использованием программного обеспечения BioRad CFX Manager. ПЦР-РВ проводили по методике гидролизуемых проб (TaqMan) c использованием геноспецифичных ДНК-зондов и прафмеров. Нуклеотидные последовательности праймеров и зондов представлены в таблице 2. Таблица 2 - Нуклеотидная последовательность праймеров и зондов, использованная для количественного анализа в ПЦР-РВ Название праймера или Нуклеотидная последовательность праймеров или зонда зондов VEGF-TM-Forward ATCACCATGCAGATTATGCG VEGF-TM-Reverse TGCATTCACATTTGTTGTGC VEGF-TM-Probe* [FAM]TCAAACCTCACCAAGGCCAGCA[BHQ1] GDNF-TM-Forward CGCTGAGCAGTGACTCAAAT GDNF-TM-Reverse CGATTCCGCTCTCTTCTAGG GDNF-TM-Probe* [FAM]TCCATGACATCATCGAACTGATCAGG[BHQ1] NCAM1-TM-Forward AGATGAGGGCACTTATCGCT NCAM1-TM-Reverse GATGGTAGGTGGCACATTCA NCAM1-TM-Probe* [FAM]CCGTGCCAGGATTCTGCCCT[BHQ1] 45 Продолжение таблицы 2 Название праймера или Нуклеотидная последовательность праймеров или зонда зондов 18S-TM-Forward GCCGCTAGAGGTGAAATTCTTG 18S-TM-Reverse CATTCTTGGCAAATGCTTTCG 18S-TM-Probe* [HEX]ACCGCGCAAGACGGACCAG[BHQ2] *TaqMan пробы, содержащие 5' FAM (или HEX) флюоресцентную метку и 3' BHQ1 (или BHQ2) гаситель. BHQ – Black Hole Quenchers, FAM – 6carboxyfluorescein, HEX – Hexachloro-Fluorescein Для проведения ПЦР-РВ в объеме 15 мкл использовали: 2,5Х реакционную смесь Б (Синтол), 200 нМ прямого и обратного праймеров, 100 нМ флуоресцентного зонда, воду (Синтол) и 0,5 мкл ДНК матрицы (кДНК). В качестве эндогенного контроля использовали набор праймеров и зонд для анализа уровня экспрессии гена домашнего хозяйства 18S рРНК. Готовую реакционную смесь раскапывали в 96-луночные планшеты, в каждую лунку вносили кДНК, закрывали оптически прозрачной пленкой и проводили ПЦР-амплификацию в режиме: 95°C-3 мин, 39 циклов: 95°C-10 сек, 55°C-15 сек, включая сканирование планшета. Для каждого гена-мишени результаты были получены в ходе двух независимых экспериментов в трех повторностях. Количество мРНК было нормализовано по гену домашнего хозяйства 18S рРНК. Для построения стандартных кривых и оценки относительной экспрессии рекомбинатных генов, кодирующих NCAM1, VEGF и GDNF, использовали серийные разведения плазмидной ДНК со вставками целевых генов. Уровень экспрессии генов в нетрансдуцированных МККП принимали за 100%. Статистическую обработку проводили с использованием пакета программ MS Excel 2007. Для оценки достоверности полученных результатов использовали t-критерий Стьюдента с уровнем значимости менее 1% (P<0,01). Эффективность трансдукции МККП Ad5-EGFP оценивали по количеству EGFP позитивных клеток с помощью инвертированного флуоресцентного 46 микроскопа исследовательского класса Axio Observer Z1 (Carl Zeiss, Германия) с использованием программного обеспечения Axio Vision 40V4.8.2.0. 2.2 Ксенотрансплантация мононуклеарной фракции крови пуповины человека трансгенным SOD1 G93A мышам На 27-й недели жизни до появления клинических симптомов трансгенных мышей наркотизировали путем внутрибрюшинной инъекции хлоралгидрата (Sigma, США) (80 мг/мл, 0,4 мл на 100 г). После наступления медикаментозного сна производили инъекцию 2 млн МККП в 100 мкл DPBS (БиолоТ) в ретроорбитальный синус. В зависимости от препарата, который был введен в венозную кровь, животные были разделены на следующие группы (Таблица 3). Таблица 3 - Экспериментальные группы животных Группа Контроль МККП МККП+Ad5EGFP МККП+Ad5VEGF МККП+ Ad5GDNF Материал для инъекции в ретроорбитальный синус Количество животных Физиологический раствор 10 Нативные МККП 13 МККП, трансдуцированные аденовирусом Ad5EGFP МККП, трансдуцированные аденовирусом Ad5VEGF МККП, трансдуцированные аденовирусом Ad5GDNF МККП+Ad5- МККП, трансдуцированные аденовирусами Ad5- VEGF-NCAM VEGF и Ad5-NCAM МККП+Ad5- МККП, трансдуцированные аденовирусами Ad5- GDNF-NCAM GDNF и Ad5-NCAM МККП+Ad5- МККП, трансдуцированные аденовирусами Ad5- GDNF-VEGF GDNF и Ad5-VEGF 15 7 6 8 8 6 47 2.3 Оценка эффективности генно-клеточной терапии 2.3.1 Клиническая оценка развития заболевания и продолжительности жизни животных Клиническое состояние животных оценивали по описанной методике [174]. Шкала оценки клинического состояния подразумевает следующую градацию: 4 балла – отсутствие признаков двигательных нарушений; 3 балла – тремор задних лапок при подвешивании мыши за хвост; 2 балла – нарушение походки; 1 балл – мыши цепляются хотя бы одной задней лапкой; 0 баллов – неспособность самостоятельно поддерживать горизонтальное положение тела в течение 30 сек. К моменту генно-клеточной терапии все животные (как экспериментальной, так и контрольной группы) находились на начальной стадии заболевания. Клиническое состояние оценивалось в 4 балла (признаки двигательных нарушений отсутствуют). Для оценки двигательной активности с 25-й недели жизни с подопытными животными проводили поведенческие тесты. По мере прогрессирования заболевания, при достижении терминальной стадии, примерно за 2 дня до предполагаемой гибели, животных выводили из эксперимента путем погружения в глубокий наркоз с помощью внутрибрюшинной инъекции хлоралгидрата. 2.3.2 Тест силы хватки Мышам, удерживая их за хвост, позволяют вцепиться всеми лапками в горизонтально расположенную металлическую решётку. После этого решетка медленно переворачивается таким образом, что мыши оказываются перевернутыми вниз головой (Рисинок 2). Фиксируется период времени до тех пор, пока животное не отцепится от решётки, тест состоит из трёх попыток, где выбирается наибольший результат (Weydt 2003). Каждая мышь тестируется 2 раза в неделю с момента трансплантации до окончания эксперимента. Перед тестированием животные обучались проведению теста в течение двух недель. 48 Рисунок 2- Демонстрация проведения поведенческого теста «Сила хватки» у трансгенных SOD1 G93A мышей 2.3.3 Открытое поле Этот тест применяется для оценки общей и исследовательской активности. Классическая установка представляет собой арену Холла – хорошо освещенная круглая арена диаметром 1.2 м, стенкой 45 см, пол которой размечен радиальными и круговыми линиями, поделенную на одинаковые квадраты (приблизительно 13 кв.см.) (Рисунок 3). Время проведения теста – 3 минуты. В центр помещается животное и регистрируется число пересеченных линий – горизонтальная активность. Вертикальная двигательная активность животных представлена двумя видами стоек: задние лапы животного остаются на полу арены, а передние упираются в стенку поля (Climbing) или остаются на весу (Rearing). Подсчитывается количество стоек животного. Подсчет количества заглядываний в отверстия – исследовательская активность. Основным критерием 49 для идентификации данной формы поведения является участие в перемещении животного всех четырех лап. Если животное находилось в пределах одного сектора (всеми четырьмя лапами), а затем перешло в смежный с ним (задние лапы пересекли разделяющую их линию), то считается, что пересечен один сектор. Рисунок 3 - Демонстрация проведения поведенческого теста «Открытое поле» у трансгенных SOD1 G93A мышей 2.4 Гистологические методы исследования Под глубоким наркозом производили транскардиальную перфузию сначала холодным PBS, затем 4% раствором параформальдегида (4ºС). Из позвоночного столба извлекали спинной мозг в области поясничного утолщения с запасом ткани 2 мм в ростральном и каудальном направлениях. Фрагмент спинного мозга помещали в 4% раствор параформальдегида на 12 часов, после чего пропитывали 30% раствором сахарозы содержащим 0,1% азида натрия. Выведение животных из эксперимента проводили в соответствии с «Правилами работы с 50 использованием экспериментальных животных» (Приказ Минвуза от 13.01.1984 года №724). 2.4.1 Иммунофлуоресцентное окрашивание Для приготовления криостатных срезов поясничный отдел спинного мозга помещали в заливочную среду TBS (Triangle Biomedical Science, Durham, NC) и замораживали в криостате Microm HM 560 (Carl Zeiss). Свободно плавающие поперечные срезы толщиной 20 мкм инкубировали с первичными антителами против ядерного антигена человека (HNA), терапевтических генов (VEGF, GDNF, NCAM), маркёров клеток спинного мозга (нейроны — нейрональная форма β IIIтубулина, астроциты — S-100, олигодендроциты — OSP, клетки микроглии — Iba1, эндотелиальные клетки — CD34), цитозольного белка, инициирующего апоптоз (Caspase-3) и репортёрного зелёного флуоресцирующего белка (GFP) в течение суток при 4ºС (Таблица 4). Далее срезы промывали при помощи PBS и инкубировали со вторичными антителами, конъюгированными с флуоресцентными красителями в течении 2 часов при комнатной температуре в темноте. Для визуализации ядер клеток срезы дополнительно окрашивали в растворе 4’,6-диамино-2-фенилиндола (DAPI) в течении 10 минут при комнатной температуре в темноте. Для всех иммунных реакций выполняли отрицательные контроли с исключением из инкубационной среды первичных или вторичных антител путем их замены на 5% сыворотку осла. Окрашенные срезы помещали в среду поддерживающую флуоресценцию и изучали с помощью конфокального микроскопа LSM 780 Meta (Carl Zeiss). Иммунофенотипирование МККП выполнено совместно с к.б.н. Гусевой Д.С. 51 Таблица 4 - Характеристика антитела, использованных для иммунофлуоресцентного окрашивания Антиген *HNA (ядерный антиген человека *VEGF (сосудистый эндотелиальный фактор роста *GDNF (глиальный нейротрофический фактор) *NCAM (CD56-PE) (нейрональная молекула адгезии) Антитела Разведение Производитель Мышь, Chemicon, 1:100 моноклональные США Кролик, Santa Cruze, 1:150 поликлональные США Кролик, Santa Cruze, 1:150 поликлональные США Мышь, Сорбент, моноклональные 1:100 Россия Мышь, моноклональные *GFP (зелёный Кролик, флуоресцирующий белок) поликлональные Кролик, *CD34 поликлональные *Нейрональная форма β IIIКролик, тубулина поликлональные Кролик, *Iba1 поликлональные *Специфический белок Кролик, олигодендроцитов (OSP) поликлональные Кролик, *S-100 поликлональные **Alexa Fluor 488 (анти-кролик) Осел, поликлональные **Alexa Fluor 488(анти-мышь) Осел, поликлональные **Alexa Fluor 647 (анти-мышь) Осел, поликлональные * первичные антитела *Caspase-3 ** вторичные антитела 1:1000 1:100 1:100 1:2,000 1:600 Sigma-Aldrich, США Santa Cruz, США Abcam Covance Biocare Medical 1:2,000 Abcam 1:2,000 DakoCytomation 1:200 Thermo scientific, США Thermo scientific, США Thermo scientific, США 1:200 1:200 52 2.4.2 Морфометрический анализ Количество HNA+ клеток (МККП человека, экспрессирующие ядерный антиген человека) подсчитывали на 100 поперечных срезах спинного мозга каждой трансгенной мыши в нескольких повторностях. Исследование проводили на всей площади среза. Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы Origin7 Pro. Полученные результаты представлены в виде среднего значения и стандартной ошибки, статистическая достоверность различий оценивалась при помощи t-критерия Стьюдента, при этом отличия считались достоверными при р<0.05. 53 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1 Экспрессия рекомбинантных генов генетически модифицированными клеткми крови пуповины человека 3.1.1 Жизнеспособность мононуклеарных клеток крови пуповины in vitro трансдуцированных рекомбинантным аденовирусом Установлено, что около 70-80% клеток синтезировали белковый продукт гена еgfp. Экспрессия гена еgfp in vitro наблюдали в течение 30 дней после трансдукции МККП (Рисунок 4). Рисунок 4 - Мононуклеарные клетки пуповинной крови человека трансдуцированных рекомбинантным аденовирусом, экспрессирующим ген зеленого флуоресцирующего белка – egfp (МOI 10), 96 часов после внесения Ad5EGFP в культуру МККП. А и С – флуоресцентная микроскопия, B и D – фазовоконтрастная микроскопия, А и B – модифицированные МККП, С и В – не модифицированные (нативные) МККП. Измерительная линейка, 100 m 54 Полученные результаты свидетельствуют в пользу того факта, что аденовирус пятого серотипа, является эффективным для генетической модификации МККП. После трансдукции клетки сохраняют жизнеспособность и синтезируют белок внесенного гена. 3.1.2 Экспрессия рекомбинантных терапевтических генов в мононуклеарных клетках крови пуповины in vitro Было установлено, что при трансдукции МККП одним терапевтическим геном (vegf165 или gdnf) содержание мРНК этих генов в МККП увеличилось в 2000 (VEGF) и в 1700 (GDNF) раз, по сравнению с контролем — немодифицированные мононуклеарные клетки человека (Рисунок 5). При одновременной генетической модификации МККП аденовирусными векторами Ad5-GDNF и Ad5-VEGF содержание мРНК увеличилось в 4900 (GDNF) и 2500 (VEGF) раз, соответственно. В случае ко-трансдукции клеток двумя рекомбинантными аденовирусами Ad5-VEGF165 и Ad5-NCAM1 уровень мРНК этих генов увеличивался в 6200 (VEGF) и 3000 (NCAM1) раз. Аналогичная динамика прослеживалась нами при оценке экспрессии генов gdnf и ncam1 в МККП одновременно трансдуцированных Ad5-GDNF и Ad5-NCAM1. Уровень мРНК увеличился в 130 (VEGF) и 150 (NCAM1) раз, по сравнению с контролем (Рисунок 6). Таким образом, показано, что трансдукция МККП аденовирусными векторами является эффективной, а генетически модифицированные МККП сверхэкспрессируют рекомбинантные гены. 55 Рисунок 5 - Экспрессия мРНК генов vegf165, ncam1 и gdnf в мононуклеарных клетках пуповинной крови человека через 96 часов после трансдукции аденовирусами Ad5-GDNF Ad5-NCAM1 и Ad5-VEGF165 Пояснение: VEGF – трансдукция МККП Ad5-VEGF165, GDNF – трансдукция МККП Ad5-GDNF, VEGF+GDNF – трансдукция МККП Ad5VEGF165 и Ad5-GDNF, VEGF+NCAM – трансдукция МККП Ad5-VEGF и Ad5NCAM, NTC – контроль, уровень экспрессии мРНК исследуемых генов в нетрансдуцированных клетках. Количество РНК нормализовано по гену 18S рРНК. Данные получены в ходе трех независимых экспериментах и представлены как среднее значение ± статистической обработки Планки погрешностей представляют собой величины стандартных отклонений, р<0,01. 56 Рисунок 6 - Экспрессия мРНК генов vegf165, ncam1 и gdnf в мононуклеарных клетках пуповинной крови человека через 96 часов после трансдукции аденовирусами Ad5-GDNF и Ad5-NCAM1 Пояснение: NTC – контроль, уровень экспрессии мРНК исследуемых генов в нетрансдуцированных клетках. Количество РНК нормализовано по гену 18S рРНК. Данные получены в ходе трех независимых экспериментах и представлены как среднее значение ± статистической обработки Планки погрешностей представляют собой величины стандартных отклонений, р<0,01. 3.2 Морфологическое исследование спинного мозга подопытных трансгенных мышей 3.2.1 Фенотипирование генетически модифицированных мононуклеарных клеток пуповины человека в спинном мозге трансгенных SOD1 G93A мышей Для идентификации МККП человека в организме мыши было проведено иммунофлуоресцентное окрашивание срезов спинного мозга мышей с помощью АТ против ядерного АГ человека (HNA). Исследование препаратов с помощью 57 люминисцентного микроскопа выявило HNA-позитивные (HNA+) клетки во всех экспериментальных группах животных, которым трансплантировали МККП. HNA+ клетки были обнаружены в белом и сером веществе спинного мозга, как на ранних сроках исследования (2 недели после трансплантации), так и на терминальной стадии заболевания (через 5 месяцев после трансплантации). Иммунофенотипирование МККП с применением маркёров нервных клеток (нейрональная форма β-III тубулина), астроцитов (S100), или олигодендроцитов (OSP) не обнаружило признаков принадлежности клеток ни к одному из клеточных типов ЦНС (Рисунок 7). Рисунок 7 - МККП в спинном мозге трансгенных SOD1 G93A мышей через 2 недели после трансплантации 58 Пояснение: А —иммунофлуоресцентное окрашивание АТ против HNA (красный). Б — двойное иммунофлуоресцентное окрашивание АТ против HNA (красный) и маркёра нервных клеток (нейрональная форма β-III тубулина — (зелёный). В — двойное иммунофлуоресцентное окрашивание АТ против HNA (красный) и маркёра астроцитов (S-100 — зелёный). Г — двойное иммунофлуоресцентное окрашивание АТ против HNA (красный) и маркёра олигодендроцитов (OSP — зелёный). На всех панелях ядра клеток окрашены бисбензимид раствором (синий). Измерительная линейка: 20 мкм. Однако через две недели после трансплантации среди МККП были обнаружены HNA+-клетки, которые реагировали с АТ против маркёра эндотелиальных клеток CD34 (HNA+CD34+-клетки) (Рисунок 8), что демонстрирует дифференцировку прогениторных клеток в клетки эндотелия сосудов. Рисунок 8- CD34-позитивные МККП человека в сером веществе спинного мозга трансгенной SOD1 G93A мыши Пояснение: А-D — двойное иммунофлуоресцентное окрашивание с АТ против ядерного АГ человека (HNA) и маркёра эндотелиальных клеток (CD34). A — ядра, окрашенные бис-бензимид раствором (синий); B — ядерный АГ человека (красный); С — маркёр эндотелиальных клеток CD34 (зелёный); D — объединение панелей A-C — демонстрируют HNA+CD34+-клетку. Измерительная линейка: 50 мкм. Экспрессия человеческими клетками маркёра клеток микроглии Iba1 (HNA+Iba1+-клетки) указывает на то, что трансплантированные моноциты дифференцировались в клетки микроглии. HNA+Iba1+-клетки по своим 59 морфологическим признакам напоминали клетки микроглии. Они имели небольшое тело овальной формы с короткими отростками (Рисунок 9). Рисунок 9 - Iba1- позитивные МККП человека в сером веществе спинного мозга трансгенной SOD1 G93A мыши Пояснение: А-D — двойное иммунофлуоресцентное окрашивание с АТ против ядерного АГ человека (HNA) и маркёра клеток микроглии (Iba1). A — ядра, окрашенные бис-бензимид раствором (синий); B — ядерный АГ человека (красный); С — маркёр микроглии Iba1 (зелёный); D — объединение панелей A-C — демонстрируют HNA+Iba1+-клетку. Измерительная линейка: 10 мкм. Кроме того, на этом сроке были выявлены HNA+-клетки, локализующиеся в сосудах спинного мозга (Рисунок 10). Рисунок 10 - HNA+-клетки, локализующиеся в сосудах спинного мозга Пояснение: А-D — двойное иммунофлуоресцентное окрашивание с АТ против ядерного АГ человека (HNA) и маркёра эндотелиальных клеток (CD34). A — ядра, окрашенные бис-бензимид раствором (синий); B — ядерный АГ человека (красный); С — маркёр эндотелиальных клеток CD34 (зелёный); D — объединение панелей A-C — демонстрируют HNA+-клетку в кровеносном сосуде. Измерительная линейка: 10 мкм. 60 Иммунопозитивная реакция мотонейронов на антитела к каспазе-3 выявила вступившие в процесс апоптоза двигательные нейроны передних рогов спинного мозга трансгенных мышей с моделью бокового амиотрофического склероза. Поскольку животных были выведены из эксперимента на терминальной стадии заболевания и клинически у трансгенных мышей наблюдали стойкий паралич задних конечностей, в паренхиме спинного мозга встречаются в основном каспаза-3 позитивные мотонейроны. При двойном иммунофлуоресцентом окрашивании с использованием антител к каспазе-3 и ядерному антигену человека, среди каспаза-3 позитивных нейронов обнаруживаются HNА- позитивные клетки (Рисунок 11). Рисунок 11- Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание поперечного среза спинного мозга трансгенной SOD1 G93A мыши на 42 неделе после трансплантации генетически модифицированных клеток пуповинной крови человека с помощью антител к ядерному антигену человека (HNА) и каспазы-3 61 Пояснение: Среди каспаза-3 позитивных мотонейронов присутствуют каспаза-3 негативные HNА-позитивные мононуклеарные клетки человека. А — ядра, окрашенные раствором 4',6-диамидино-2-фенилиндола (синий); Б — окраска антителами против каспаза-3 (жёлтый), В — ядерный антиген человека (красный); Г — объединение панелей A-В. Измерительная линейка: 20 мкм. Этот факт подтверждает наше предположение, что мононуклеарные клетки крови пуповины способны проникать через гематоэнцефалический барьер, мигрировать в очаги нейродегенерации, создавать микроокружение нейронам вступающим в апоптоз, секретировать терапевтические молекулы по паракринному механизму и поддерживать выживание нервных клеток. 3.2.2 Иммуноэкспрессия рекомбинантных генов в мононуклеарных клетках крови пуповины после трансплантации в спинной мозг SOD1 G93A мышей Иммунофлуоресцентное окрашивание при помощи антител к ЕGFP позволило установить характер миграции трансплантированных клеток, продолжительность их жизни и эффективность экспрессии репортёрного гена. ЕGFP - позитивные клетки были обнаружены как в белом веществе спинного мозга (передних, задних и боковых канатиках), так и в сером веществе (преимущественно в передних рогах) через 14 недель после трансплантации (Рисунок 12). Экспрессия репортерного гена выполняет функцию контроля, и позволяет оценить влияние трансфекции на жизнеспособность клеток. Также характеризует способность клеток синтезировать продукты встроенных генов в необходимом объеме. 62 Рисунок 12- EGFP-позитивные клетки в сером веществе поясничного отдела спинного мозга трансгенной SOD1 G93A мыши через 14 недель после трансплантации Пояснение: А — ядра, окрашенные раствором 4',6-диамидино-2- фенилиндола (синий); Б — окраска антителами против EGFP (жёлтый), В — объединение панелей А-Б. Измерительная линейка: 20 мкм. Изучение иммуноэкспрессии терапевтических генов мононуклеарными клетками человека после трансплантации трансгенным SOD1 G93A мышам позволило установить, что МККП способны синтезировать рекомбинантные белки пока остаются жизнеспосбными. Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание позволило обнаружить экспрессию генов vegf и gdnf в МККП трансдуцированных одним вектором Ad5-VEGF или Ad5-GDNF (Рисунок 13) и (Рисунок 14). Рисунок 13 - Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание. HNA+VEGF+клетки в поясничного отдела спинного мозга трансгенной SOD1 G93A мыши через 7 недель после трансплантации Пояснение: PI — ядра, окрашенные раствором иодида пропидиума (фиолетовый); HNu — окраска антителами против ядерного антигена человека 63 (красный); VEGF — окраска антителами против сосудистого эндотелиального фактора роста (зелёный), ув.40х. Измерительная линейка: 10 мкм. Рисунок 14 - Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание. HNA+GDNF+клетки в поясничном отделе спинного мозга трансгенной SOD1 G93A мыши через 7 недель после трансплантации Пояснение: PI — ядра, окрашенные раствором иодида пропидиума (фиолетовый); HNu — окраска антителами против ядерного антигена человека (красный); GDNF — окраска антителами против глиального нейротрофического фактора (зелёный), ув.40х. Измерительная линейка: 10 мкм. Способность трансплантированных клеток успешно мигрировать в нервную ткань и синтезировать нейротрофические молекулы указывает на то, что разработанная стратегия является успешной. Полученный результат подтолкнул на создание более сложной генно-клеточной конструкции, которая в свою очередь должна усилить эффект предыдущей. Решением данного вопроса послужило создание генно-клеточной конструкции содержащей помимо гена нейротрофического фактора, ген нейрональной молекулы адгезии. При тройном иммунофлуоресцентном окрашивании МККП, трансдуцированных двумя вирусными векторами, выявлены клетки, синтезирующие два рекомбинантных белка VEGF и NCAM или GDNF и NCAM (Рисунок 15). Экспрессия нейрональной молекулы адгезии трансплантированными клетками способствует их миграции преимущественно в очаги нейродегенерации, а экспрессия терапевтического гена способствует нейропртекции (GDNF) или улучшает трофику путем неоваскуляризации (VEGF). 64 Рисунок 15 - Иммуноэкспрессия терапевтических генов в МККП после трансплантации в спинном мозге трансгенных SOD1 G93A мышей Пояснение: А — HNА+NCAM+GDNF+-клетки в сером веществе поясничного отдела спинного мозга через 9 недель после трансплантации. B — HNА+NCAM+VEGF+-клетки в сером веществе поясничного отдела спинного мозга через 7 недель после трансплантации. С — HNА+NCAM+GDNF+-клетки в сером веществе поясничного отдела спинного мозга через 17 недель после трансплантации. Ядра окрашены раствором иодида пропидиума (фиолетовый); ядерный антиген человека (красный); сосудистый эндотелиальный фактор роста VEGF (зелёный); глиальный нейротрофичнеский фактор GDNF (зелёный). Измерительная линейка: 20 мкм. 3.2.3 Адресная миграция и выживание генетически модифицированных мононуклеарных клеток крови пуповины человека после трансплантации трансгенным SOD1 G93A мышам После трансплантации МККП в спинном мозге трансгенных мышей во всех экспериментальных группах обнаружены HNA позитивные клетки, экспрессирующие ядерный антиген человека. Достоверных различий в количестве 65 прижившихся клеток на сроках до 8 недель после трансплантации не выявлено. При этом на более поздних сроках в паренхиме спинного мозга трансгенных мышей, для лечения которых был использован один терапевтический ген, встречаются лишь единичные трансплантированные клетки, а на том же сроке после трансплантации, в спинном мозге трансгенных мышей, получивших клетки содержащие комбинацию терапевтического гена с нейрональной молекулой адгезии, были обнаружены многочисленные скопления трансплантированных клеток (Рисунок 16). Рисунок 16 - Мононуклеарные клетки крови пуповины человека в спинном мозге трансгенной G93A мыши через 9 недель после трансплантации Пояснение: Иммуннофлуоресцентное окрашивание: синий — ядра клеток, окрашены DAPI; зелёный — ядра клеток окрашены с помощью АТ против ядерного антигена человека (HNA); merge — совмещение двух изображений. А — клетки HNA+ и клетки трансдуцированные Ad-GDNF, B — HNA+ клетки трансдуцированые Ad-GDNF и Ad-NCAM. Измерительная линейка — 20μм. На гистограмме представлено соотношение количества выявленных в паренхиме спинного мозга клеток, экспрессирующих ядерный антиген человека в период с 5 по 17 неделю после трансплантации (Рисунок 17). 66 Рисунок 17 - Гистограмма количества HNA+ клеток в 100 поперечных срезах спинного мозга трансгенных G93A мышей после трансплантации мононуклеарных клеток крови пуповины человека на разных сроках эксперимента Пояснение: Свободная от значений колонка в серии GDNF-NCAM на сроке 6 недель обусловлена отсутствием гибели животных этой серии на этом сроке. Свободная от значений колонка в серии VEGF на сроке 9 недель свидетельствует о гибели всех животных этой серии до данного срока. На сроке 17 недель HNA+ клетки выявлены только в сериях GDNF-NCAM. n – количество животных, в скобках указано количество повторностей исследования. Одной из целей эксперимента являлось установить макимальную продолжительность выживания трансгенных мышей на фоне лечения с помощью генетически модифицированных клеток. По этой причине животных выводили из эксперимента по мере вступления в терминальную стадию заболевания и в этой связи некоторые экспериментальные группы представлены одним животным. Кроме того, учитывая, что сроки вывода из эксперимента разнятся у всех 67 трансгенных мышей, то для получения более наглядной демонстрации различий групп, было решено объединить две недели эксперимента в одну точку на шкале абсцисс. Вместе с тем нами получены данные в пользу того, что нейрональная молекула клеточной адгезии — NCAM поддерживает жизнеспособность трансплантированных клеток. В экспериментальной серии МККП+GDNF-NCAM количество клеток было больше, чем в серии МККП+GDNF на сроке 9-10 недель, а на сроке 17 недель HNA+ клетки были обнаружены только в серии МККП+GDNF-NCAM. При этом единичные HNA+ клетки были выявлены и на более поздних сроках в сериях МККП+GDNF-NCAM и МККП+VEGF-NCAM. 3.3 Поведенческие тесты и анализ продолжительности жизни подопытных животных 3.3.1 Иммунотолерантность Предварительные эксперименты по ксенотрансплантации (трансплантации человеческих клеток трансгенным мышам) были выполнены с целью оценки иммунологической толерантности трансгенных мышей. После трансплантации МККП в течение недели трансгенные мыши находились под клиническим наблюдением. Результаты наблюдения не обнаружили, ни у контрольных, ни у трансгенных SOD1 G93A мышей симптомы иммунологической несовместимости. Через 7 дней после трансплантации макро- и микроскопическое исследование головного и спинного мозга, печени, селезёнки, почек, лёгких и сердца у подопытных животных не выявило признаков воспаления вызванных трансплантацией МККП человека. 3.3.2. Поведенческие тесты Эффективность генно-клеточной терапии у трансгенных SOD1 G93A мышей c фенотипом бокового амиотрофического склероза оценивали по двум 68 поведенческим тестам: (1) тест «Открытое поле» и (2) тест «Сила хватки». На первой неделе исследования подопытные трансгенные мыши из контрольной группы показали следующие результаты: горизонтальная активность — 70.9±2.7, вертикальная активность — 10.2±2.1, исследовательская активность — 6.3±1.4, тест «Сила хватки» — 56.6±4.2 секунд. По сравнению с результатами трансгенных мышей из других подопытных групп, достоверных различий не обнаружено (P>0.05). К 3-й неделе эксперимента в тесте «Открытое поле» происходил постепенный спад горизонтальной активности во всех подопытных группах, кроме группы МККП+VEGF-GDNF, в которой отмечена двухфазная динамика — первоначальное увеличение активности до 3 недели с последующим снижением до завершения эксперимента. В целом, постепенное снижение горизонтальной активности наблюдалось до 9-й недели во всех группах, однако темп снижения двигательной активности в контрольной группе был выше. К 12-й неделе активность контрольной группы, а также групп МККП+VEGF-NCAM и МККП+VEGF-GDNF снизилась до минимальных значений. Напротив в группах МККП+GDNF и МККП+GDNF-NCAM горизонтальная активность не изменилась по сравнению с результатами 9-й недели, кроме того появляются достоверные различия между показателями группой горизонтальной МККП+GDNF-NCAM, МККП+EGFP, активности, снижение с и неуклонно группами горизонтальной приостановилось. (р< 0,05) (Рисунок 18). снижающимися МККП+GDNF активности в и которых 69 Рисунок 18 - Гистограмма изменения уровня горизонтальной активности трансгенных SOD1 G93A мышей при выполнении теста двигательной активности «Открытое поле» Пояснение: Ось абсцисс показывает время прошедшее после трансплантации трансгенным мышам генетически модифицированных МККП, в неделях. Ось ординат характеризует уровень горизонтальной активности – количество пересеченных линий, в %. За 100% был принят уровень горизонтальной активности трансгенных мышей до трансплантации МККП. Вертикальная активность в тесте «Открытое поле» постепенно снижалась на протяжении эксперимента, однако опять стоит обратить внимание общую динамику снижения вертикальной активности в контрольной группе, где темп снижения активности наиболее высокий. Здесь стоит отметить группу МККП+GDNF-NCAM, результаты вертикальной активности которой, на 6-й неделе эксперимента достоверно выше таковых по сравнению с группами МККП+GDNF, МККП+VEGF-NCAM и контрольной группой (р< 0,05) (Рисунок 70 19). Интересен тот факт, что вертикальная активность почти всех групп на 12-й неделе близка к нулю, в то время как показатели группы МККП+GDNF достаточно высокие. Обращая внимание на вертикальную активность этой группы на протяжении всего эксперимента, видно, что показатель незначительно изменился за все время. Рисунок 19 - Гистограмма изменения уровня вертикальной активности трансгенных SOD1 G93A мышей при выполнении теста двигательной активности «Открытое поле» Пояснение: Ось абсцисс показывает время прошедшее после трансплантации трансгенным мышам генетически модифицированных МККП, в неделях. Ось ординат характеризует уровень вертикальной активности – количество стоек на задних лапах, в %. За 100% был принят уровень вертикальной активности трансгенных мышей до трансплантации МККП. 71 Исследовательская активность животных в тесте «Открытое поле» значительно колебалась в течение эксперимента, поэтому оценка этого параметра была затруднена и не учитывалась в анализе двигательной активности (Рисунок 20). Рисунок 20 - Гистограмма изменения уровня исследовательской активности трансгенных SOD1 G93A мышей при выполнении теста двигательной активности «Открытое поле» Пояснение: Ось абсцисс показывает время прошедшее после трансплантации трансгенным мышам генетически модифицированных МККП, в неделях. Ось ординат характеризует уровень исследовательской активности – количество заглядываний, в %. За 100% был принят уровень исследовательской активности трансгенных мышей до трансплантации МККП. В тесте «Сила хватки» на 3-й неделе мышечная сила в группах МККП+ GDNF и МККП+GDNF-NCAM была достоверно выше по сравнению с контролем (р< 0,05). К 6-й неделе происходит резкое снижение силы хватки во всех группах, 72 при этом достоверных различий между группами не установлено. Далее с 6-й по 12-й неделю наоборот происходит медленное снижение силы хватки. На 12-й неделе к тестированию были способны только мыши из групп: МККП+EGFP, МККП+VEGF, МККП+GDNF и МККП+GDNF-NCAM. После этого срока трансгенные мыши всех групп данный тест выполнять не могли (Рисунок 21). Рисунок 21 - Гистограмма изменения уровня силы хватки трансгенных SOD1 G93A мышей при выполнении теста двигательной активности «Сила хватки» Пояснение: Ось абсцисс показывает время прошедшее после трансплантации трансгенным мышам генетически модифицированных МККП, в неделях. Ось ординат характеризует уровень силы хватки – время, в течении которого перевернутая трансгенная мышь способна удерживать тело, в %. За 100% был принят уровень силы хватки трансгенных мышей до трансплантации МККП. 73 3.3.3 Продолжительность жизни экспериментальных трансгенных мышей Выживаемость у трансгенных мышей различалась между экспериментальными группами. На 11 неделе после трансплантации количество живых трансгенных мышей составило: 27,3% — в контрольной группе, 41,7% — МККП+EGFP, 60% — МККП+VEGF, 50% — МККП+GDNF, 20% — МККП+VEGF-GDNF, 42,8% — МККП+VEGF-NCAM и 87,5% в группе МККП+GDNF-NCAM, которая достоверно отличалась от контрольной группы. При этом выживаемость трансгенных мышей из группы МККП+GDNF-NCAM была выше, по сравнению с другими группами. Учитывая, что животные из контрольной группы вышли из эксперимента на 14-й неделе и группы МККП+EGFP на 15-й, можно сделать педположение, что дальнейшее продолжение жизни трансгенных SOD1 G93A мышей обусловлено экспрессией трансплантированными клетками нейротрофических факторов. На 15 неделе после трансплантации в живых осталось 16,7% животных в группе МККП+GDNF, 28.6% в группе МККП+VEGF-NCAM и 50% в группе МККП+GDNF-NCAM. При этом, к этому сроку были выведены из эксперимента все животные из контрольной группы, а также из групп МККП+EGFP, МККП+VEGF и МККП+VEGF-GDNF. Максимальная продолжительность жизни установлена для групп МККП+GDNF-NCAM и МККП+VEGF-NCAM, которая составила 5 месяцев после лечения (Рисунок 22). Эти группы отличаются от остальных тем, что животным трансплантировали клетки, содержащие помимо терапевтического гена, нейрональную молекулу адгезии. В результате чего эффективность генноклеточного препарата оказалась выше. 74 Рисунок 22 - График продолжительности жизни трансгенных SOD1 G93A мышей Пояснение: Ось абсцисс показывает время прошедшее после трансплантации мышам генетически модифицированных МККП, в неделях. Ось ординат характеризует количество оставшихся в живых животных, в %. За 100% было принято количество трансгенных мышей в день трансплантации МККП. 75 ЗАКЛЮЧЕНИЕ До настоящего времени эффективные способы преодоления последствий нейродегенерации при боковом амиотрофическом склерозе в клинической практике отсутствовали, в связи с чем одним из перспективных подходов для решения этой проблемы является создание нового класса лекарственных средств, содержащих терапевтические гены. Генно-клеточная технология открывает новые возможности терапии различных заболеваний человека, которые до сих пор считаются неизлечимыми. В рамках этой проблемы особый интерес представляют перспективы продления жизни пациентам Экспериментальные исследования позволяют модифицированные клетки, имея огромный с такими надеяться, заболеваниями. что потенциал генетически для доставки терапевтических генов в ЦНС с целью структурного и функционального восстановления мозга после нейротравм, ишемических инсультов и при различных нейродегенеративных заболеваниях, могут быть полезны при решении таких проблем. Мононуклеарные клетки крови пуповины человека представляют собой один из наиболее доступных источников стволовых клеток с минимальной иммуногенной реакцией реципиента. Мононуклеарные клетки крови пуповины человека легко плазмидными поддаются и культивированию, вирусными векторами и генетической способны модификации экспрессировать рекомбинантные гены с высокой эффективностью. Полученные на сегодняшний день результаты по трансплантации генетически модифицированных МККП экспериментальным животным с моделью бокового амиотрофического склероза указывают на целесообразность их применения не только как носителей терапевтических генов, но и как источника эндотелиальных и глиальных клеток. В настоящем исследовании на трансгенных SOD1 G93A мышах с моделью бокового амиотрофического склероза изучен терапевтический эффект генноклеточного препарата на основе мононуклеарных клеток крови пуповины и аденовирусных векторов, несущих терапевтические гены (сосудистый 76 эндотелиальный фактор роста, глиальный нейротрофический фактор и нейрональную молекулу адгезии). Эффективность генно-клеточной терапии трансгенных SOD1 G93A мышей с моделью бокового амиотрофического склероза оценивали при помощи поведенческих тестов, продолжительности жизни и морфологического анализа спинного мозга. Экспрессию терапевтических генов в генетически модифицированных мононуклеарных клеток крови пуповины человека изучали с помощью молекулярно-генетического и иммунофлуоресцентного методов исследования. Ранее нами была выдвинута гипотеза, что генетически модифицированные мононуклеарные клетки крови пуповины человека, одновременно экспрессирующие рекомбинвнтные нейротрофический фактор и нейрональную молекулу адгезии, могут быть эффективным лекарственным препаратом для сдерживания гибели нейронов при нейродегенеративных заболеваниях [3]. Такой подход позволяет получить сверхэкспрессию молекулы стимулятора регенерации и молекулы, способствующей адресной миграции и выживанию генетически модифицированной клетки. Недавно было показано, что генетически модифицированные мезенхимные стволовые клетки человека, одновременно сверхэкспрессирующих гены GDNF и VEGF, при их внутримышечной инъекции крысам с моделью бокового амиотрофического склероза поддерживают структуру нервно-мышечного синапса и продлевают жизнь животных [98]. Наш выбор именно этих факторов также обусловлен их выраженным стимулирующим влиянием на процессы нейрорегенрации и ангиогенеза. В наших исследованиях в мононуклеарные клетки крови человека, кроме гена стимулятора регенерации, был введён ген нейрональной молекулы адгезии, которая согласно полученным данным способствовала адресной миграции трансплантированных клеток и поддерживала их выживание в тканях реципиента [82]. Ранее было показано, что трансфекция эмбриональных стволовых клеток мыши плазмидными векторами, экспрессирующими клонированный ген L1CAM, обеспечивает как встраивание этой молекулы адгезии в мембрану стволовых клеток, так и секрецию её растворимой формы [37]. После трансплантации таких клеток в травмированный 77 спинной мозг они начинали формировать отростки и обнаруживались в тканях реципиента через месяц после трансплантации, в то время как аналогичные, но нетрансфецированные клетки выживали только в течение 7 суток. Важно заметить, что МККП способны проникать через тканевые барьеры, в том числе через гематоэнцефалический барьер, что является немаловажным фактором при выборе этих клеток. Терапевтические молекулы, которые транзиторно сверхэкспрессируются генетически модифицированными клетками, могут воздействовать на клетки-мишени по аутокринному, паракринному или эндокринному механизму. С помощью терапевтических генов по аутокринному механизму в отношении трансплантированных клеток можно повысить их жизнеспособность, контролировать адресный хоминг, миграцию и направленную дифференцировку. По паракринному и эндокринному механизму терапевтические молекулы, которые секретируют трансплантированные клетками, способны оказывать трофический и нейропротекторный эффект на клетки-мишени в очагах нейродегенерации. Полученные в данном исследовании результаты могут быть использованы в качестве основы для создания нового класса лекарственных препаратов, состоящих из рекомбинантных аденовирусов, кодирующих терапевтические гены, и мононуклеарных клеток крови пуповины человека. Решение поставленных задач на уровне эксперимента позволит начать клинические испытания, что ускорит внедрение и использование в клинической практике трансплантации генетически модифицированных мононуклеарных клеток крови пуповины больным, страдающим нейродегенеративными заболеваниями, а также пациентам после ишемических инсультов и нейротравм. Результаты первых клинических испытаний лечения бокового амиотрофического склероза стволовыми клетками, выделенными из периферической крови, показали безопасность этого подхода и толерантность больного к трансплантированным клеткам [114]. Однако клиническое применение стволовых клеток крови пуповины для трансплантации требует проведения дополнительных экспериментальных исследований учитывая возможность их трансдифференцировки в разные клеточные типы [156]. 78 Таким образом, мононуклеарных целесообразность клеток крови генетической пуповины модификации человека для лечения нейродегенративных заболеваний обусловлена: 1. высоким уровнем трансдукции мононуклеарных клеток и подтвержденной экспрессией терапевтических генов; 2. миграцией через гемато-энцефалический барьер и повышением жизнеспособности трансплантированных клеток в ЦНС реципиента; 3. адресной доставкой специфических ростовых и трофических факторов в область дегенерации; 4. секрецией мононуклеарными клетками крови пуповины собственных биологически активных молекул, способствующих регенерации; 5. действием терапевтических молекул на клетки-мишени по аутокринному, паракринному или эндокринному механизму; 6. направленной дифференцировкой трансплантированных клеток в разные паренхиматозные клетки (макрофаги, эндотелиальные клетки, астроциты и др.); 7. трансплантацией клеток без учета гистосовместимости по HLA; 8. возможностью контролировать вирусную инфекцию. 79 ВЫВОДЫ 1. Мононуклеарные клетки крови пуповины человека способны к трансдукции одним или одновременно двумя генными векторами но основе рекомбинантного аденовируса 5 серотипа (Ad5), кодирующего гены человека: сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), глиальный нейротрофический фактор роста (GDNF) и нейрональную молекулу адгезии NCAM1. 2. Мононуклеарные трансдуцированные одним клетки крови пуповины (МККП) аденовирусным вектором, или в человека, различных комбинациях, а именно: МККП+Ad5-VEGF, МККП+Ad5-GDNF, МККП+Ad5VEGF+Ad5-GDNF, МККП+Ad5-VEGF+Ad5-NCAM1, МККП+Ad5-GDNF+Ad5NCAM1, способны к синтезу терапевтических молекул (VEGF, GDNF, NCAM1) in vivo после трансплантации трансгенным SOD1 G93A мышам. 3. Мононуклеарные клетки крови пуповины человека, экспрессирующие сосудистый эндотелиальный фактор роста в сочетании с нейрональной молекулой адгезии в одном случае, и глиальный нейротрофический фактор вместе с нейрональной молекулой адгезии в другом, выявлены в спинном мозге мышей через 5 месяцев после их трансплантации. 4. Максимальное количество МККП в спинном мозге трансгенных SOD1 G93A мышей на всех сроках трансплантации (3, 6, 9, 12, 18, 21 неделя) обнаружено после трансдукции МККП рекомбинантными генами VEGF и GDNF в сочетании с геном нейрональной молекулы адгезии NCAM1. 5. Наилучшие показатели двигательной активности и продолжительности жизни имели группы трансгенных SOD1 G93A мышей, которым трансплантировали МККП+Ad5-VEGF+NCAM1 и МККП+Ad5- GDNF+Ad5-NCAM1. 6. Установлена трансгенных SOD1 прямая G93A зависимость мышей от продолжительности количества в спинном жизни мозге трансплантированных генетически модифицированных МККП и комбинации терапевтических генов. 80 7. молекулы Экспрессия в генетически модифицированных МККП нейрональной адгезии NCAM1 повышает миграционный потенциал и жизнеспособность трансплантированных клеток в спинном мозге трансгенных SOD1 G93A мышей с моделью бокового амиотрофического склероза. 81 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ μm (мкм) – микрометр AAV (Adeno-Associated Virus) – аденоассоциированный вирус Ad5 (Adenovirus serotype 5) – аденовирус серотипа 5 ATX1 (Ataxin 1) – атаксин BDNF (Brain Derived Neurotrophic Factor) – мозговой нейротрофический фактор BMP4 (Bone Morphogenic Protein 4) – морфогенетический белок кости BMPR (Bone Morphogenetic Protein Receptor) – рецептор белка морфогенеза кости CMV (Cytomegalovirus) – цитомегаловирус DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) – 4,6-диамидино-2-фенилиндол DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline) – фосфатно-солевой буфер Дульбекко EGF (Epidermal Growth Factor) – фактор роста эпидермиса EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) – усиленный зеленый флюоресцирующий белок FGF (Fibroblast Growth Factor) – фактор роста фибробластов G93A – глицин замещён на аланин в позиции 93 GABA (Gamma-Aminobutyric Acid) – гамма-аминомасляная кислота GAP43 (Growth Associated Protein 43) – белок связанный с ростом клеток GDNF (Glial cell Derived Neurotrophic Factor) – нейротрофический фактор полученный из глиальных клеток GFAP (Glial Fibrillary Acidic Protein) – глиальный фибриллярный кислый белок HGF (Hepatocyte Growth Factor) – фактор роста гепатоцитов HIV-1 (Human Immunodeficiency Virus 1) – вирус иммунодефицита человека1 HNA (Human Nuclei Antigen) – ядерный антиген человека HSV (Herpes Simplex Virus) – вирус простого герпеса Iba1 (Ionized calcium-binding adapter molecule 1) – молекула связывающая ион кальция IGF (Insulin-like Growth Factor) – инсулиноподобный фактор роста MoMLV (Moloney Murine Leukemia Virus) – вирус лейкемии мышей Молони 82 NCAM (Neural Cell Adhesion Molecule 1) – молекула адгезии нейрональных клеток 1 NGF (Nerve Growth Factor) – фактор роста нервов Oct-4 (Octamer-binding transcription factor 4) – октамер связывающий транскрипционный фактор 4 OSP (Oligodendrocyte Specific Protein) – специфический белок олигодендроцитов PBS (Phosphate Buffered Saline) – натрий-фосфатный буфер PlGF (Placenta Growth Factor) – фактор роста плаценты rAAV (recombinant Adeno-Associated Virus) – рекомбинантный аденоассоциированный вирус RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute Medium 1640) – среда для культивирования клеток №1640, разработанная в Институте раковых исследований Розвелла Парка S-100 (S100 protein) – белок S100 SCA1 (Spinocerebellar ataxia 1) – спиномозжечковая атаксия Sca-1 (Stem Cell Antigen) – антиген стволовых клеток siRNA ( small interfering RNA) – малые интерфирирующие РНК SOD1 (Superoxide Dismutase 1) – супероксиддисмутаза 1 SSEA (Stage Specific Embryonic Antigen) – стадия специфический антиген эмбриона Stro-1 – стромальные клетки TGF-β1 (Transforming Growth Factor beta 1) – трансформирующий фактор роста Thy-1 (Thymus cell antigen) – антиген клеток тимуса TRA (Teratocarcinoma mucin-like Antigen) – антиген устойчивый к тератокарциноме TUJ1 (Neuron-specific class III beta-tubulin) – нейрональный β III-тубулин VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) – сосудистый эндотелиальный фактор роста VSV-G (Vesicular Stomatitis Virus G) – вирус везикулярного стоматита G АГ - антиген 83 АТ – антитела БАС – боковой амиотрофический склероз ВИЧ – вирус иммунодефицита человека ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота ИВЛ – искусственная вентиляция легких кДНК – комплементарная ДНК МККП – мононуклеарные клетки крови пуповины мРНК – матричная рибонуклеиновая кислота НТФ – нейротрофические факторы ПЦР – полимеразная цепная реакция ПЦР – полимеразная цепная реакция ПЦР-РВ – полимеразная цепная реакция в реальном времени РНК – рибонуклеиновая кислота т.п.н. – тысяч пар нуклеотидов цГМФ – циклический гуанозинмонофосфат ЦНС – центральная нервная система 84 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Гусева Д.С. Генетически модифицированные мононуклеары пуповинной крови – стимляторы нейрорегенерации при дегенеративных заболеваниях центральной нервной системы / Д.С. Гусева, А.А. Ризванов, А.П. Киясов, Р.Р. Исламов // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. – 2013. – Т.8, №3. – С.1-7. 2. Завалишин И.А. Генная терапия бокового амиотрофического склероза: двухлетнее рандомизированное плацебо-контролируемое исследование / И.А. Завалишин, Н.П. Бочков, З.А. Суетна и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2008. - Т.145, №4. – С.467–70. 3. Исламов Р.Р. Генная и клеточная терапия нейродегенеративных заболеваний / Р.Р. Исламов, А.А. Ризванов, Д.С. Гусева, А.П. Киясов // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. – 2007. - Т.2, №3. – С. 21-37. 4. Черенкова Е. Е. Создание рекомбинантных аденовирусов и лентивирусов, экспрессирующих ангиогенные и нейропротекторные факторы, с помощью технологии клонирования Gateway / Е.Е Черенкова, В.Ю. Федотова, М.А. Борисов, Р.Р. Исламов, А.А. Ризванов // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. – 2012. – Т.7, №3. – С.164-168. 5. Anderson W.F. The ADA human gene therapy clinical protocol: Points to Consider response with clinical protocol / W.F. Anderson, R.M. Blaese, K. Culver // Human Gene Therapy. – 1990. – V1, №3. – P.331-62. 6. Abeysinghe C. S. Pre-differentiation of human neural stem cells into GABAergic neurons prior to transplant results in greater repopulation of the damaged brain and accelerates functional recovery after transient ischemic stroke / C. S. Abeysinghe, L. Bokhari, A. Quigley et al. / Stem Cell Research and Therapy. – 2015. – V.6. – P.186. 7. Agrawal S. Antisense oligonucleotides: towards clinical trials / S. Agrawal // Trends in Biotechnology. – 1996. – V.14, №10. – P.376-87. 85 8. Aleksandrova M.A. Stem Cells in the Brain of Mammals and Human: Fundamental and Applied Aspects / M.A. Aleksandrova, M.V. Marey // Zhurnal Vysshei Nervnoi Deiatelnosti Imeni I P Pavlova. – 2015. – V.65, №3. – P.271-305. 9. Andrus P.K. Protein oxidative damage in a transgenic mouse model of familial amyotrophic lateral sclerosis / P.K. Andrus, T.J. Fleck, M.E. Gurney, E.D. Hall // J Neurochemistry. – 1998. – V.71, №5. – P.2041-8. 10. Arien–Zakay H. Interferongamma-induced neuronal differentiation of human umbilical cord bloodderived progenitors / H. Arien–Zakay, S. Lecht, M.M. Bercu et al. // Leukemia. – 2009. – V.23. – P.1790–800. 11. Arien-Zakay H. Neuronal conditioning medium and nerve growth factor induce neuronal differentiation of collagen-adherent progenitors derived from human umbilical cord blood / H. Arien-Zakay, A. Nagler, H. Galski et al. // Journal of Molecular Neuroscience. – 2007. – V.32. – P.179–91. 12. Arien-Zakay H. Neuroprotection by cord blood neural progenitors involves antioxidants, neurotrophic and angiogenic factors / H. Arien-Zakay, S. Lecht, M.M. Bercu et al. // Experimental Neurology. – 2009. – V.216. – P.83–94. 13. Azizi S.A. Engraftment and migration of human bone marrow stromal cells implanted in the brains of albino rats--similarities to astrocyte grafts / S.A. Azizi, D. Stokes, B.J. Augelli et al. // Proceeding of the National Academy Science. – 1998. – V.95, №7. – P.3908-13. 14. Azzouz M. VEGF delivery with retrogradely transported lentivector prolongs survival in a mouse ALS model / M. Azzouz, G.S. Ralph, E. Storkebaum, L.E. Walmsley et al. // Nature. – 2004. – V.429, №6990. – P.413-7. 15. Bachstetter A.D. Peripheral injection of human umbilical cord blood stimulates neurogenesis in the aged rat brain / A.D. Bachstetter, M.M. Pabon, M.J. Cole et al. // BMC Neuroscience. - 2008. – V.9. – P.22. 16. Ballen K., Current status of cord blood banking and transplantation in the United States and Europe / K. Ballen, H.E. Broxmeyer, J. McCullough et al. // Biology of Blood and Marrow Transplantation. – 2001. – V.7, №12. – P.635-45. 86 17. Barati S. GDNF gene delivery via the p75(NTR) receptor rescues injured motor neurons / S. Barati, P.R. Hurtado, S.H. Zhang et al // Experimental Neurology. 2006. – V.202, №1. – P.179-88. 18. Baumgartner B.J. Targeted transduction of CNS neurons with adenoviral vectors carrying neurotrophic factor genes confers neuroprotection that exceeds the transduced population / B.J. Baumgartner, H.J. Shine // Neuroscience. – 1997. – V.17, №17. – P.6504-11. 19. Bede P. Multiparametric MRI study of ALS stratified for the C9orf72 genotype / P. Bede, L.W. Bokde, M.B. Byrne et al. // Neurology. – 2013. – V.81, №4. – P.361-369 20. Bendotti C. Transgenic SOD1 G93A mice develop reduced GLT-1 in spinal cord without alterations in cerebrospinal fluid glutamate levels / C. Bendotti, M. Tortarolo, S.K. Suchak, et al. // Neurochemistry. – 2001. –V.79, №4. – P.737-46. 21. Bernreuther C. Neural cell adhesion molecule L1-transfected embryonic stem cells promote functional recovery after excitotoxic lesion of the mouse striatum / C. Bernreuther, M. Dihne, V. Johann, Schiefer J. et al. // Neuroscience. – 2006. – V.26, №45. – P.11532-9. 22. Bjorklund L.M. Embryonic stem cells develop into functional dopaminergic neurons after transplantation in a Parkinson rat model / L.M. Bjorklund, R. Sanchez-Pernaute, S. Chung, et al. // Proceeding of the National Academy Science. – 2002. – V.99, №4. – P.2344-9. 23. Borlongan C.V. Central nervous system entry of peripherally injected umbilical cord blood cells is not required for neuroprotection in stroke / C.V. Borlongan, M. Hadman, C.D. Sanberg, P.R. Sanberg // Stroke. – 2004. – V.35, №10. – P.2385–9. 24. Boulis M.N. Characterization of adenoviral gene expression in spinal cord after remote vector delivery / M.N. Boulis, D.E. Turner, J.A. Dice et al. // Neurosurgery. – 1999. – V.45, №1. – P.131-7. 87 25. Boulis N.M. Neuronal survival following remote adenovirus gene delivery / N.M. Boulis, D.E. Turner, M.J. Imperiale, E.L. Feldman // Neurosurgery. – 2002. – V.96, №2. – P.212-9. 26. Brazelton T.R. From marrow to brain: expression of neuronal phenotypes in adult mice / T.R. Brazelton, F.M. Rossi, G.I. Keshet, H.M. Blau // Science. – 2000. – V.290, №5497. – P.1775-9. 27. Bruns C.K. Impaired post-translational folding of familial ALS-linked Cu, Zn superoxide dismutase mutants / C.K. Bruns, R.R. Kopito // EMBO. – 2007. –V.26, №3. – P.855-66. 28. Budni J. The involvement of BDNF, NGF and GDNF in aging and Alzheimer's disease / J. Budni, T. Bellettini-Santos, F. Mina et al. // Aging and Disease. – 2015. – V.6, №5. – P.331-41. 29. Burger C. Recombinant adeno-associated viral vectors in the nervous system / C. Burger, K. Nash, R.J. Mandel // Human Gene Therapy. – 2005. – V.16, №7. – P. 781-91. 30. Büttner B. Novel cytosolic binding partners of the neural cell adhesion molecule: mapping the binding domains of PLC gamma, LANP, TOAD-64, syndapin, PP1, and PP2A / B. Büttner, C. Kannicht, W. Reutter, R. Horstkorte // Biochemistry. – 2005. – V.44, №18. – P.6938-47. 31. Büttner B. The neural cell adhesion molecule is associated with major components of the cytoskeleton / B. Büttner, C. Kannicht, W. Reutter, R. Horstkorte // Biochemistry Biophysical Research Commune. – 2003. –V.310, №3. – P.967-71. 32. Buzanska L. Neural stem-like cell line derived from a nonhematopoietic population of human umbilical cord blood / L. Buzanska, M. Jurga, E.K. Stachowiak et al. // Stem Cells and Development. – 2006. – V.15. – P.391–406. 33. Carvalho I.M. Current Neurogenic and Neuroprotective Strategies to Prevent and Treat Neurodegenerative and Neuropsychiatric Disorders / I.M. Carvalho, P.B. Coelho, P.C. Costa et al. // Neuromolecular Medicine. – 2015. – V.17. – P.91-93. 88 34. Charcot J.M. Lectures on the diseases of the nervous system / J.M. Charcot // The New Sydenham Society. - 1889. – 438p. 35. Chen C.T. Infusion of human umbilical cord blood cells ameliorates hind limb dysfunction in experimental spinal cord injury through anti-inflammatory, vasculogenic and neurotrophic mechanisms / C.T. Chen, N.H. Foo, W.S. Liu et al. // Pediatrics and Neonatology. – 2008. – V.49, №3. – P.77–83. 36. Chen H.K. Combined cord blood stem cells and gene therapy enhances angiogenesis and improves cardiac performance in mouse after acute myocardial infarction / H.K. Chen, H.F. Hung, K.G. Shyu et al. // European Journal of Clinical Investigation. – 2005. – V.11, №35. – P.677-86. 37. Chen J. Cell adhesion molecule L1-transfected embryonic stem cells with enhanced survival support regrowth of corticospinal tract axons in mice after spinal cord injury / J. Chen, C. Bernreuther, M. Dihne, M. Schachner // Neurotrauma. – 2005. – V.22, №8. – P.896-906. 38. Chen J. Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats / J. Chen, P.R. Sanberg, Y. Li et al. // Stroke. – 2001. – V. 32, №11. – P.2682-8. 39. Chen N. Human umbilical cord blood cells have trophic effects on young and aging hippocampal neurons in vitro / N. Chen, J. Newcomb, S. Garbuzova–Davis et al. // Aging and Disease. – 2010. – V.1. – P.173–90. 40. Chen R. The potential for the use of mononuclear cells from human umbilical cord blood in the treatment of amyotrophic lateral sclerosis in SOD1 mice / R. Chen, N. Ende // Medicine. – 2000. – V.31, №1-2. – P.21-30. 41. Chen Y.B. Mesenchymal stem cell-based HSP70 promoter-driven VEGF A induction by resveratrol alleviates elastase-induced emphysema in a mouse model / Y.B. Chen, Y.W. Lan, L.G. Chen et al. // Cell Stress Chaperones. – 2015. – V.20, №6. – P.979-89. 42. Cheng H. Neuroprotection of glial cell line-derived neurotrophic factor in damaged spinal cords following contusive injury / H. Cheng, J.P. Wu, S.F. Tzeng // Neurosciense Research. – 2002. – V.69, №3. – P.397–405. 89 43. Coatti G.C. Stem cells for amyotrophic lateral sclerosis modeling and therapy: myth or fact? / G.C. Coatti, M.S. Beccari, T.R. Olávio // Cytometry. – 2015. – V.87, №3. – P.197-211. 44. Cordes A.L. Intramedullary spinal cord implantation of human CD34+ umbilical cord-derived cells in ALS / A.L. Cordes, K. Jahn, R. Hass et al. // Amyotrophic Lateral Sclerosis. – 2011. – V.12, №5. – P.325-30. 45. Correia A.S. Stem cell-based therapy for Parkinson’s disease / A.S. Correia, S.V. Anisimov, J.Y. Li, P. Brundin // Annals of Medicine. – 2005. – V.37, №7. – P.487-98. 46. Dasari V.R. Neuronal apoptosis is inhibited by cord blood stem cells after spinal cord injury / V.R. Dasari, K.K. Veeravalli, A.J. Tsung et al. // Neurotrauma. – 2009. – V.26, №11. – P.2057–69. 47. Dasari V.R. Umbilical cord blood stem cell mediated downregulation of fas improves functional recovery of rats after spinal cord injury / V.R. Dasari, D.G. Spomar, L. Li et al. // Neurochemical Research. – 2008. – V.33, №1. – P.134–49. 48. Dawbarn D. Neurotrophins and neurodegeneration / D. Dawbarn, S.J. Allen // Neuropathology Applied Neurobiology. – 2003. – V.29, №3. – P.211-30. 49. Deierborg T. Emerging restorative treatments for Parkinson's disease / T.Deierborg, D. Soulet, L. Roybon et al. // Progress in Neurobiology. – 2008. – V.85, №4. – P.407-32. 50. Dezawa M. Insights into autotransplantation: the unexpected discovery of specific induction systems in bone marrow stromal cells / M. Dezawa // Cellular and Molecular Life Science. – 2006. – V.63, №.23. – P.2764-72. 51. Drissi H. Derivation and Chondrogenic Commitment of Human Embryonic Stem Cell-Derived Mesenchymal Progenitors / H. Drissi, J.D. Gibson, R.M. Guzzo, R.H. Xu // Methods in Molecular Biology. – 2015. – V.1340. – P.65-78. 52. Dvorak H.F. Fibrin gel investment associated with line 1 and line 10 solid tumor growth, angiogenesis, and fibroplasia in guinea pigs. Role of cellular immunity, myofibroblasts, microvascular damage, and infarction in line 1 tumor regression / H.F. 90 Dvorak, A.M. Dvorak, E.J. Manseau et al. // National Cancer Institute. – 1979. –V.62, №6. – P.1459-72. 53. El Maarouf AUse of polysialic acid in repair of the central nervous system / A. El Maarouf, A.K. Petridis, U. Rutishauser // Proceedings of the National Academy of Science. – 2006. – V.103, №45. – P16989-94. 54. Ende N. Human umbilical cord blood cells ameliorate Alzheimer’s disease in transgenic mice / N. Ende, R. Chen, D.J. Ende–Harris // Medicine. – 2001. – V.32. №.3–4, - P.241–7. 55. Ende N. Human umbilical cord blood effect on sod mice (amyotrophic lateral sclerosis) / N. Ende, F. Weinstein, R. Chen, M. Ende // Life Science. – 2000. – V.67, №1. – P.53-9. 56. Ferrara N. Molecular and biological properties of the vascular endothelial growth factor family of proteins / N. Ferrara, K. Houck, L. Jakeman, D.W. Leung, // Endocrine Reviews. – 1992. – V.13, №1. – P.18-32. 57. Ferrara N. The biology of VEGF and its receptors / N. Ferrara, H.P. Gerber, J. LeCouter // Nature Medicine. – 2003. – V.9, №6. – P.669-76. 58. Frahm H.D. Comparison of brain structure volumes in Insectivora and Primates. I. Neocortex / H.D. Frahm, H. Stephan, M. Stephan // Hirnforsch. - 1982. – V.23, №4. – P.375-389. 59. Fu Y.S. Conversion of human umbilical cord mesenchymal stem cells in Wharton’s jelly to dopaminergic neurons in vitro: potential therapeutic application for Parkinsonism / Y.S. Fu, Y.C. Cheng, M.Y. Lin et al. // Stem Cells. – 2006. – V.24. – P.115–24. 60. Garanima E.E. Construction of recombinant adenovirus containing picorna- viral 2A-peptide sequence for the co-expression of neuro-protective growth factor in human umbilical cord blood cells / E.E. Garanina, Y.O. Mukhamedshina, I.I. Salafutdinov et al. // Spinal Cord. – 2015. – V.6. – P.162. 61. Garbuzova-Davis S. Feasibility of cell therapy for amyotrophic lateral sclerosis / S. Garbuzova-Davis, P.R. Sanberg // Experimental Neurolology. – 2009. – V. 216, №1. – P.3-6. 91 62. Garbuzova-Davis S. Intravenous administration of human umbilical cord blood cells in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis: distribution, migration, and differentiation / S. Garbuzova-Davis, A.E. Willing, T. Zigova et al. // Hematotherapy and Stem Cell Research. – 2003. – V.12, №3. – P.255-70. 63. Giasson B.I. Neuronal alpha-synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein / B.I. Giasson, J.E. Duda, S.M. Quinn, B. Zhang, et al.// Neuron. – 2002. – V.34, №4. – P.521-33. 64. Glorioso J.C. Herpes vector-mediated gene transfer in treatment of diseases of the nervous system / J.C. Glorioso, D.J. Fink // Annual Review Microbiology. – 2004 – V.58. – P.253-71. 65. Gluckman E. Current status of umbilical cord blood hematopoietic stem cell transplantation / E. Gluckman // Experimental Hematology. – 2000. – V.28, №11 – P.1197-205. 66. Gluckman E. Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi's anemia by means of umbilical-cord blood from an HLA-identical sibling / E. Gluckman, H.A. Broxmeyer, A.D. Auerbach et al. // New England Journal of Medicine. – 1989. – V.321, №17. – P.1174-8. 67. Gluckman E. Umbilical cord blood transplants / E.Gluckman, F. Locatelli // Current Opinion in Hematology. – 2000. – V.7, №6. – P.353-7. 68. Goldstein L.N. Altered patterns of cortical activation in ALS patients during attention and cognitive response inhibition tasks / L. H. Goldstein, I. C. Newsom-Davis, V. Bryant et al. // Neurology. – 2011. – V.258, №12. – P.2186-2198. 69. Gurney M.E. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation // M.E. Gurney, H. Pu, A.Y. Chiu et al. // Science. – 1994. – V.264, №5166. – Р.1772-5. 70. Habich A. Early appearance of stem/progenitor cells with neural-like characteristics in human cord blood mononuclear fraction cultured in vitro / A. Habich, M Jurga, I. Markiewicz et al. // Experimental Hematology. – 2006. – V.34. – P.914–25. 92 71. Han F. Development of stem cell-based therapy for Parkinson's disease / F. Han, D. Baremberg, J. Gao et al. // Translational Neurodegener. – 2015. – V.3, №4. – P.16. 72. Hao H.N. Fetal human hematopoietic stem cells can differentiate sequentially into neural stem cells and then astrocytes in vitro / H.N. Hao, J. Zhao, R.L. Thomas et al. // Hematotherapy Stem Cell Research. – 2003. – V12, №1. – P.23-32. 73. Harris D.T. Cord blood stem cells: a review of potential neurological applications / D.T. Harris // Stem Cell Reviews. – 2008. – V.4. – P.269–74. 74. Hatzistergos K.E. Cell Therapy: Targeting Endogenous Repair Versus Remuscularization / K.E. Hatzistergos, J.M. Hare // Circulation Research. – 2015. – V.117, №8. – P.659-61. 75. Hawley T.S. Flow Cytometry Protocols / T.S. Hawley, R.G. Hawley, Totowa N.J. // Humana Press. - 2004. – V.263. – P.219-38 76. Hawley T.S. Multiparameter flow cytometry of fluorescent protein reporters / T.S. Hawley, D.J. Herbert, S.S. Eaker, R.G. Hawley // Methods of Molecular Biology. – 2004. – V.263. – P.219-238. 77. Hendricks W.A., Pak E.S., Owensby J.P., Menta K.J., et al. Predifferentiated embryonic stem cells prevent chronic pain behaviors and restore sensory function following spinal cord injury in mice / W.A. Hendricks, E.S. Pak, J.P. Owensby, K.J. Menta, et al. // Molecular Medicine. – 2006. – V.12, №1-3. – Р.34-46. 78. Höke A. Expression of glial cell line-derived neurotrophic factor family of growth factors in peripheral nerve injury in rats / A. Höke, C. Cheng, D.W. Zochodne // Neuroreport. – 2000. – V.11, №8. – P.1651-4. 79. How C.K. Induced pluripotent stem cells alleviate lung injury from mesenteric ischemia-reperfusion / C.K. How, S.K. Hou, L.K. Chen // Journal of Trauma and Acute Care Surgery. – 2015. – V.79, №4. – P.592-601. 80. Iannotti C. Glial cell line-derived neurotrophic factor-enriched bridging transplants promote propriospinal axonal regeneration and enhance myelination after spinal cord injury / C. Iannotti, H. Li, P. Yan et al // Experimental Neurology. – 2003. V.183, №2. – P.379-93. 93 81. Ikeda Y. Development of angiogenic cell and gene therapy by transplantation of umbilical cord blood with vascular endothelial growth factor gene / Y. Ikeda, N. Fukuda, M. Wada et al. // Hypertension Research. – 2004. – V.27, №2. – P. 119-28. 82. Islamov R.R. Symptomatic improvement, increased life-span and sustained cell homing in amyotrophic lateral sclerosis after transplantation of human umbilical cord blood cells genetically modified with adeno-viral vectors expressing a neuroprotective factor and a neural cell adhesion molecule / R.R. Islamov, A.A. Rizvanov, M.A. Mukhamedyarov et al. // Current Gene Therapy. – 2015. – V.15, №3. – P.266-76. 83. Jackrel M.E. Engineering enhanced protein disaggregases for neurodegenerative disease / M.E. Jackrel, J. Shorter // Prion. – 2015. –V.9, №9. – P.90109. 84. Jaiswal M. K. Calcium, mitochondria and the pathogenesis of ALS: the good, the bad and the ugly / M.K. Jaiswal // Frontiers in Cellular Neuroscience. - 2013 – V.7. – P.199. 85. Jang Y.K. Retinoic acid mediated induction of neurons and glial cells from human umbilical cord derived hematopoietic stem cells / Y.K. Jang, J.J. Park, M.C. Lee et al. // Neuroscience Research. – 2004. –V.75. – P.573–84. 86. Jankowsky J.L. Persistent amyloidosis following suppression of Abeta production in a transgenic model of Alzheimer disease / J.L. Jankowsky, H.H. Slunt, V. Gonzales, et al. // PLoS Medicine. – 2005. – V.2, №12. – Р.e355. 87. Jiang Y. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow / Y. Jiang, B.N. Jahagirdar, R.L. Reinhardt et al. // Nature. – 2002. – V.418, №6893. – P.41-9. 88. Jin K.L. Vascular endothelial growth factor: direct neuroprotective effect in vitro ischemia / K.L. Jin, X.O. Mao, D.A. Greenberg // Proceedings of the National Academy of Science. – 2000. – V.97. – P.10242 – 10247. 89. Motoneuron Jones K.J. Injury CD4 + T and Disease Cells / and Neuroprotection: K.J. Jones, A.E. Relevance to Lovett-Racke, C.L. Walker, V.M.Sanders // Neuroimmune Pharmacology. – 2015. - V.7. – P.1-8. 94 90. Jurga M. Generation of functional neural artificial tissue from human umbilical cord blood stem cells / M. Jurga, A.W. Lipkowski, B. Lukomska et al. // Tissue Engineering. – 2009. – V.15. – P.365–72. 91. Karagiannis T.C. RNA interference and potential therapeutic applications of short interfering RNAs / T.C. Karagiannis, A. El-Osta // Cancer Gene Therapy. – 2005. – V.12, №10. – Р.787-95. 92. Kaspar B.K. Retrograde viral delivery of IGF-1 prolongs survival in a mouse ALS model / B.K. Kaspar, J. Llado, N. Sherkat et al. // Science. – 2003. – V.301, №5634. – P.839-42. 93. Kerr D.A. Human embryonic germ cell derivatives facilitate motor recovery of rats with diffuse motor neuron injury. D.A. Kerr, J. Llado, M.J. Shamblott et al. // Neuroscience. – 2003. – V.23, №12. – P.5131-40. 94. Kim H.M. Ex vivo VEGF delivery by neural stem cells enhances proliferation of glial progenitors, angiogenesis, and tissue sparing after spinal cord injury / H.M. Kim, D.H. Hwang, J.E. Lee et al // PLoS One. – 2009. – V.4, №3. – P.4987. 95. Kimbrel E.A. Current status of pluripotent stem cells: moving the first therapies to the clinic / E.A. Kimbrel, R. Lanza // Nature Reviews Drug Discovery. – 2015. – V.14, №10. – P.681-92. 96. Koh S.H. Implantation of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells as a neuroprotective therapy for ischemic stroke in rats / S.H. Koh, K.S. Kim, M.R. Choi et al. // Brain Research. – 2008. – V.1229. – P.233–48. 97. Kong J. Massive mitochondrial degeneration in motor neurons triggers the onset of amyotrophic lateral sclerosis in mice expressing a mutant SOD1 / J. Kong, Z. Xu // Neuroscience. – 1998. – V.18, №9. – P.3241-50. 98. Krakova D. Synergistic effects of GDNF and VEGF on lifespan and disease progression in a familial ALS rat model / D. Krakora, P. Mulcrone, M. Meyer et al. // Molecular Therapy. – 2013. – V.21, №8. – P.1602–10. 95 99. Kunst C.B. Genetic mapping of a mouse modifier gene that can prevent ALS onset / C.B. Kunst, L. Messer, J. Gordon et al. // Genomics. – 2000. – V.70, №2. – P.181-9. 100. Latchman D.S. Herpes simplex virus-based vectors for the treatment of cancer and neurodegenerative disease / D.S. Latchman // Current Opinion in Molecular Theraputics. – 2005. – V.7, №5. – P.415-8. 101. Laughlin M.J. Umbilical cord blood for allogeneic transplantation in children and adults / M.J. Laughlin // Bone Marrow Transplantation. – 2001. – V.27, №1. – P.1-6. 102. Lee H.J. The therapeutic potential of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells in Alzheimer’s disease / H.J. Lee, J.K. Lee, H. Lee et al. // Neuroscience Letters. – 2010. – V.481, №1. – P.30–5. 103. Li X. Human cord blood-derived multipotent stem cells (CB-SCs) treated with alltrans-retinoic acid (ATRA) give rise to dopamine neurons / X. Li, H. Li, J. Bi et al. // Biochemical Biophysical Research Communications. – 2012. –V.419, №1. – P.110–6. 104. Liew C.G. Transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells / C.G. Liew, J.S. Draper, J. Walsh et al. // Stem Cells. – 2007. – V.25, № 6. – P.1521-8. 105. Lindvall O. Evidence for long-term survival and function of dopaminergic grafts in progressive Parkinson's disease / O. Lindvall, G. Sawle, H. Widner et al. // Annals of Neurology. – 1994. – V.35, №2. – P.172-80. 106. Lu L. Therapeutic benefit of TH-engineered mesenchymal stem cells for Parkinson's disease / L. Lu, C. Zhao, Y. Liu et al. // Brain Research Protocol. – 2005. – V.15, №1. – P.46-51. 107. Lu T. Effect of pulsed electromagnetic field therapy on the osteogenic and adipogenicdifferentiation of bone marrow mesenchymal stem cells / T. Lu, Y.X. Huang, C. Zhang et al. // Genetics and Molecular Research. – 2015. – V.14, №3. – P.11535-42. 96 108. Lunn J.S. Vascular endothelial growth factor prevents G93A-SOD1induced motor neuron degeneration / J.S. Lunn, S.A. Sakowski, B. Kim et al // Developmental Neurobiology. – 2009. – V.69, №13. – P.871-84. 109. Magnusdottir E. Human Primordial Germ Cell Specification - Breakthrough In Culture and Hopes for Therapeutic Utilization / E. Magnusdottir // Laeknabladid. – 2015. – V.101, №10. – P.461-468. 110. Manabe Y. Adenovirus-mediated gene transfer of glial cell line-derived neurotrophic factor prevents motor neuron loss of transgenic model mice for amyotrophic lateral sclerosis / Y. Manabe, I. Nagano, M.S. Gazi et al. // Apoptosis. – 2002. – V.7, №4. – P.329-34. 111. Mancuso R. Amyotrophic lateral sclerosis: Current perspectives from basic research to the clinic / R. Mancuso, X. Navarro // Progress in Neurobiology. – 2015. – V.15. – P.78-7. 112. Mandel. R.J. Recombinant adeno-assosiated viral vectors as therapeutic agents to threat neurological disorders / R.J. Mandel, F.P. Manfredsson, K.D. Foust et al. // Molecular Therapy. – 2006. – V.13, №3. – P.463-83. 113. Mangiarini L. Exon 1 of the HD gene with an expanded CAG repeat is sufficient to cause a progressive neurological phenotype in transgenic mice / L. Mangiarini, K. Sathasivam, M. Seller et al. // Cell. – 1996. – V.87, №3. – P.493-506. 114. Mazzini L. Stem cell therapy in amyotrophic lateral sclerosis: a methodological approach in humans / L. Mazzini, F. Fagioli, R. Boccaletti et al. // Amyotrophic Lateral Sclerosis Other Motor Neuron Disorder. – 2003. – V.4, №3. – P.158-61. 115. McCown T.J. Adeno-assosiated virus (AAV) vectors in the CNS / T.J. McCown // Current Gene Therapy. – 2005. – V.5, №3. – P.333-8. 116. McGuckin C.P. Umbilical cord blood stem cells can expand hematopoietic and neuroglial progenitors in vitro / C.P. McGuckin, N. Forraz, Q. Allouard et al. // Experimental Cell Research. – 2004. – V.295. – P.350–9. 97 117. Meier C. Spastic paresis after perinatal brain damage in rats is reduced by human cord blood mononuclear cells / C. Meier, J. Middelanis, B. Wasielewski et al. // Pediatric Research. – 2006. – V.59. – P.244–9. 118. Mezey E. Bone marrow: a possible alternative source of cells in the adult nervous system / E. Mezey, K.J. Chandross // European Journal of Pharmacology. – 2000. – V.405, №1-3. – P.297-302. 119. Mezey E. Turning blood into brain: cells bearing neuronal antigens generated in vivo from bone marrow / E. Mezey, K.J. Chandross, G. Harta et al. // Science. – 2000. – V.290, №5497. – P.1779-82. 120. Miagkov A. Gene transfer of baculoviral p35 by adenoviral vector protects human cerebral neurons from apoptosis / A. Miagkov, J. Turchan, A. Nath, D.B. Drachman // DNA Cell Biology. – 2004. – V.23, №8. – P.496-501. 121. Miller R.G. Riluzole for amyotrophic lateral sclerosis (ALS)/motor neuron disease (MND) / R.G. Miller, J.D. Mitchell, M. Lyon, D.H. Moore // Amyotrophic Lateral Sclerosis and Other Motor Neuron Disorders. – 2003. – V.4,№3. – P.191-206. 122. Monani U.R. The human centromeric survival motor neuron gene (SMN2) rescues embryonic lethality in Smn(-/-) mice and results in a mouse with spinal muscular atrophy / U.R. Monani, M. Sendtner, D.D. Coovert et al. // Human Molecular Genetics. – 2000. – V.9, №3. – P.333-9. 123. Mukhamedyarov M.A. Analysis of the efficiency of gene-cell therapy in transgenic mice with amyotrophic lateral sclerosis phenotype / M.A. Mukhamedyarov, A.A. Rizvanov, Z.Z. Safiullov et al. // Cell Technologies in Biology and Medicine. – 2013. - №4. – P.215-19 124. Munoz-Elias G. Marrow stromal cells, mitosis, and neuronal differentiation: stem cell and precursor functions / G. Munoz-Elias, D. Woodbury, I.B. Black // Stem Cells. – 2003. –V.21 №4. – P.437-48. 125. Murashov A.K. RNAi pathway is functional in peripheral nerve axons / A.K. Murashov, V. Chintalgattu, R.R. Islamov et al. // FASEB – 2007. – V.21, №3. – P.656-70. 98 126. Muzyczka N. Parvoviridae: the viruses and their replication. Fields Virology / N. Muzyczka, K.I. Berns. – New York: Lippincott, Williams & Wilkins, 2001. - P.2327-2360. 127. Naldini L. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector / L. Naldini, U. Blomer, P. Gallay et al. // Science. - 1996. – V.272, №5259. – P.263-7. 128. Newcomb J.D. Timing of cord blood treatment after experimental stroke determines therapeutic efficacy / J.D. Newcomb, C.T. Ajrno, C.D. Sanberg et al. // Cell Transplantation. – 2006. – V.15. – P.213–23. 129. Newman M.B. Cytokines produced by cultured human umbilical cord blood (HUCB) cells: implications for brain repair / M.B. Newman, A.E. Willing, J.J. Manressa et al. // Experimental Neurology. – 2006. – V.199. – P.201–8. 130. Nikolic W.V. Peripherally administered human umbilical cord blood cells reduce parenchymal and vascular beta-amyloid deposits in Alzheimer mice / W.V. Nikolic, H. Hou, T. Town et al. // Stem Cells and Development. – 2008. –V.17. – P.1– 17. 131. Nikulnikov P.I. Experience of application of the gene inductor of vascular rndothelium growth factor in treatment of patients, suffering atherosclerotic ischemia of the lower extremities tissues / P.I. Nikulnikov // Klinicheskaya Khirurgia. – 2015. – V.5. – P.41-3. 132. Nishio Y. The use of hemopoietic stem cells derived from human umbilical cord blood to promote restoration of spinal cord tissue and recovery of hindlimb function in adult rats / Y. Nishio, M. Koda, T. Kamada et al. // Journal of Neurosurgery Spine. – 2006. – V.5. – P.424–33. 133. Park D.H. Transplantation of umbilical cord blood stem cells for treating spinal cord injury / D.H. Park, J.H. Lee, C.V. Borlongan et al. // Stem Cell Reviews and Reports. – 2011. - V.7, №1. – P.181–94. 134. Pera M.F. What if stem cells turn into embryos in a dish? / M.F. Pera, G. de Wert, W. Dondorp et al. // Nature Methods. – 2015. – V.12, №10. – P.917-9. 99 135. Perreau M. The conundrum between immunological memory to adenovirus and their use as a vector in clinical gene therapy / M. Perreau, E.J. Kremer // Molecular Biotechnology. – 2006. – V.34, №2. – P.247-56. 136. Povlsen G.K. Intracellular signaling by the neural cell adhesion molecule / G.K. Povlsen, D.K. Ditlevsen, V. Berezin, E. Bock // Neurochemistry Research. – 2003. – V.28, №1. – P.127-41. 137. Qiang H. Neuroprotective effects of recombinant adeno-associated virus expressing vascular endothelial growth factor on rat traumatic spinal cord injury and its mechanism / H. Qiang, C. Zhang, Z. Shi, M. Ling // Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi. – 2012. – V.26, №6. - 724-30. 138. Ralph G.S. Gene therapy for neurodegenerative and ocular diseases using lentiviral vectors / G.S. Ralph, K. Binley, L.F. Wong et al. // Clinical Science. – 2006. – V.110, №1. – P.37-46. 139. Ralph G.S. Silencing mutant SOD1 using RNAi protects against neurodegeneration and extends survival in an ALS model / G.S. Ralph, P.A. Radcliffe, D.M. Day et al. // Nature Medicine. – 2005. – V.11, №4. – P.429-33. 140. Raoul C. Lentiviral-mediated silencing of SOD1 through RNA interference retards disease onset and progression in a mouse model of ALS / C. Raoul, T. AbbasTerki, J.C. Bensadoun et al. // Nature Medicine. – 2005. – V.11, №4. – P.423-8. 141. Rogers I. Identification and analysis of in vitro cultured CD45-positive cells capable of multilineage differentiation / I. Rogers, N. Yamanaka, R. Bielecki et al. // Experimental Cell Research. – 2007. –V.313. – P.1839–52. 142. Rosen D.R. Mutations in Cu/Zn superoxide dismutase gene are assotiated with familial amyotrophic lateral sclerosis / D.R. Roren, T. Siddique, D. Patterson // Nature. – 1993. – V.362, №6415. – P.59-62. 143. Rosenstein J.M. Patterns of brain angiogenesis after vascular endothelial growth factor administration in vitro and in vivo / J.M. Rosenstein, N. Mani, W.F. Silverman, J.M. Krum // Proceedings of the National Academy of Science. – 1998. – V.95, №12. – P.7086-91. 100 144. Rüb U. Intraneuronal Transport and Defense Mechanisms with Possible Pathogenetic Relevance in Huntington's Disease (HD) / U. Rüb, J.P. Vonsattel, H. Heinsen, H.W. Korf // Advances in Anatomy, Embryology and Cell Biology. – 2015. – V.217. – P.91-100. 145. Rüb U. Widespread Brainstem Neurodegeneration in Huntington's Disease (HD) / U. Rüb, J.P. Vonsattel, H. Heinsen, H.W. Korf // Advances in Anatomy, Embryology and Cell Biology. – 2015. – V.217. – P.83-90. 146. Ruban A. Combined Treatment of an Amyotrophic Lateral Sclerosis Rat Model with Recombinant GOT1 and OxaloaceticAcid: A Novel Neuroprotective Treatment / A. Ruban, K. Cohen-Kashi Malina, I. Cooper et al. // Neurodegenerative Disease. – 2015. – V.15, №4. – P. 233-42. 147. Rushkevich Y.N. The Use of Autologous Mesenchymal StemCells for Cell Therapy of Patients with Amyotrophic Lateral Sclerosis in Belarus / Y.N. Rushkevich, S.M. Kosmacheva, G.V. Zabrodets et al. // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. – 2015. – V.159, №4. – P.576-81. 148. Rutishauser U. Polysialic acid in the plasticity of the developing and adult vertebrate nervous system / U. Rutishauser // Nature Revievs Neuroscience. – 2008. – V.9, №1. – P.26-35. 149. Saito Y. Transgenic small interfering RNA halts amyotrophic lateral sclerosis in a mouse model / Y. Saito, T. Yokota, T. Mitani et al. // Biological Chemistry. – 2005. – V.280, №52. – P.42826-30. 150. Saporta S. Human umbilical cord blood stem cells infusion in spinal cord injury: engraftment and beneficial influence on behavior / S. Saporta, J.J. Kim, A.E. Willing et al. // Journal of Hematotherapy and Stem Cell Research. – 2003. – V.12. – P.271–8. 151. Schagen F.H. Immune responses against adenoviral vectors and their transgene products: a review of strategies for evasion / F.H. Schagen, M. Ossevoort, R.E. Toes, R.C. Hoeben // Critical Revievs in Oncology/Hematology. – 2004. – V.50, №1. – P.51-70. 101 152. Schira J. Significant clinical, neuropathological and behavioural recovery from acute spinal cord trauma by transplantation of a well-defined somatic stem cell from human umbilical cord blood / J. Schira, M. Gasis, V. Estrada et al. // Brain. – 2012. – V.135, №2. – P.431–46. 153. Schwarz E.J. Multipotential marrow stromal cells transduced to produce LDOPA: engraftment in a rat model of Parkinson disease / E.J. Schwarz, G.M. Alexander, D.J. Prockop, S.A. Azizi // Human Gene Therapy. – 1999. – V.10, №15. – P.2539-49. 154. Shi H. Glial cell line-derived neurotrophic growth factor increases motility and survival of cultured mesenchymal stem cells and ameliorates acute kidney injury / H. Shi, D. Patschan, G.P. Dietz et al. // Renal Physiology. – 2008. – P.229-35. 155. Shirian S. Comparison of Capability of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells and Endometrial Stem Cells to Differentiate into Motor Neurons on Electrospun Poly(ε-caprolactone) Scaffold / S. Shirian, S. EbrahimiBarough, H. Saberi et al. // Molecular Neurobiology. – 2015. – V.17. – P.29. 156. Silani V. Stem therapy for ALS: hope and reality / V. Silani, N. Leigh // Amyotrophic Lateral Sclerosis and Other Motor Neuron Disorders. – 2003. – V.4, №1. – P.8-10. 157. Smith R.A. Antisense oligonucleotide therapy for neurodegenerative disease / R.A. Smith, T.M. Miller, K. Yamanaka et al. // Journal of Clinical Investigation. – 2006. – V.116, №8. – P.2290-6. 158. Sondell M. Vascular endothelial growth factor has neurotrophic activity and stimulates axonal outgrowth, enhancing cell survival and Schwann cell proliferation in the peripheral nervous system / M. Sondell, G. Lundborg, M. // Neuroscience. – 1999. - V.19, №14. – P.5731-40. 159. St George J.A. Gene therapy progress and prospects: adenoviral vectors / J.A. St George // Gene Therapy. - 2003. – V.10, №14. – P.1135-41. 160. Sun T. Repairing neural injuries using human umbilical cord blood / T. Sun, Q.H. Ma // Molecular Neurobiology. – 2013. – V.47, №3. – P.938–45. 102 161. Sun W. Voltagesensitive and ligand-gated channels in differentiating neural stem-like cells derived from the nonhematopoietic fraction of human umbilical cord blood / W. Sun, L. Buzanska, K. Domanska-Janik et al. // Stem Cells. – 2005. –V.23. – P.931–45. 162. Suzuki M. Direct muscle delivery of GDNF with human mesenchymal stem cells improves motor neuron survival and function in a rat model of familial ALS / M. Suzuki, J. McHugh, C. Tork et al. // Molecular Therapy. – 2008. –V.16, №12. – P.2002-10. 163. Tadesse T. Analysis of graft survival in a trial of stem cell transplant in ALS / T. Tadesse, M. Gearing, D. Senitzer et al. // Annals of Clinical Translational Neurology. – 2014. - V.1, №11. – P.900-8. 164. Tafuri F. SOD1 misplacing and mitochondrial dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis pathogenesis // F. Tafuri, D. Ronchi, F. Magri et al. // Frontiers in Cell Neuroscience. – 2015. – V.25, №9. – P.336. 165. Taguchi A. Administration of CD34 cells after stroke enhances neurogenesis via angiogenesis in a mouse model / A. Taguchi, T. Soma, H. Tanaka et al. // Journal of Clinical Investigation. – 2004. – V.114. – P.330–8. 166. Thies R.S. The advancement of human pluripotent stem cell-derived therapies into the clinic / R.S. Thies, C.E. Murry // Development. – 2015. – V.142, №18. – P.3077-84. 167. Tischer E. The human gene for vascular endothelial growth factor. Multiple protein forms are encoded through alternative exon splicing / E. Tischer, R. Mitchell, T. Hartman et al. // Journal of Biological Chemistry. – 1991. – V.266, №18. – P.11947-54. 168. Tolentino M.J. Intravitreal injection of vascular endothelial growth factor small interfering RNA inhibits growth and leakage in a nonhuman primate, laserinduced model of choroidal neovascularization / M.J. Tolentino, A.J. Brucker, J. Fosnot et al. // Retina. – 2004. – V.24, №4. – Р.660. 169. Tracy C.J. Intravitreal Implantation of Genetically Modified Autologous Bone Marrow-Derived Stem Cells for Treating Retinal Disorders / C.J.Tracy, D.N. 103 Sanders, J.N. et al. // Advances in Experimental Biology and Medicine. – 2015. – V.854. – P.571-7. 170. Valentine J.S. Misfolded CuZnSOD and amyotrophic lateral sclerosis / J.S. Valentine, P.J. Hart // Proc Natl Acad Sci USA. - 2003. – V.100, №7. – P.3617-22. 171. Vendrame M. Infusion of human umbilical cord blood cells in a rat model of stroke dose dependently rescues behavioral deficits and reduces infarct volume / M. Vendrame, J. Cassady, J. Newcomb et al. // Stroke. – 2004. –V.35. – P.2390–5. 172. Walmod P.S. Zippers make signals: NCAM-mediated molecular interactions and signal transduction / P.S. Walmod, K. Kolkova, V. Berezin, E. Bock // Neurochemistry Research. – 2004. – V.29, №11. – P.2015-35. 173. Weiss M.L. Human umbilical cord matrix stem cells: preliminary characterization and effect of transplantation in a rodent model of Parkinson’s disease / M.L. Weiss, S. Medicetty, A.R. Bledsoe et al. // Stem Cells. – 2006. – V.24. – P.781– 92. 174. Weydt P. Assessing disease onset and progression in the SOD1 mouse model of ALS / P. Weydt, S.Y. Hong, M. Kliot, T. Moller // Neuroreport. – 2003. – V.14, №7. – P.1051-4. 175. Wong P.C. An adverse property of a familial ALS-linked SOD1 mutation causes motor neuron disease characterized by vacuolar degeneration of mitochondria / P.C. Wong, C.A. Pardo, D.R. Borchelt et al. // Neuron. – 1995. – V.14, №6. – P.110516. 176. Xia H. RNAi suppresses polyglutamine-induced neurodegeneration in a model of spinocerebellar ataxia / H. Xia, Q. Mao, S.L. Eliason, et al. // Nature Medicine. – 2004. – V.10, №8. – P.816-20. 177. Xiao J. Transplantation of a novel cell line population of umbilical cord blood stem cells ameliorates neurological deficits associated with ischemic brain injury / J. Xiao, Z. Nan, Y. Motooka et al. // Stem Cells and Development. – 2005. – V.14. – P.722–33. 104 178. Yang W.Z. Safety evaluation of allogeneic umbilical cord blood mononuclear cell therapy for degenerative conditions / W.Z. Yang, Y. Zhang, F. Wu et al. // Journal of Translation Medicine. – 2010 – V.8. – P.75. 179. Yasuhara T. Mannitol facilitates neurotrophic factor up-regulation and behavioural recovery in neonatal hypoxic-ischaemic rats with human umbilical cord blood grafts / T. Yasuhara, K. Hara, M. Maki et al. // Journal of Cellular and Molecular Medicine. – 2010. – V.14, №4. – P.914–21. 180. Zeng X. Integration of donor mesenchymal stem cell-derived neuronlike cells into host neural network after rat spinal cord transaction / X. Zeng, X.C. Qiu, Y.H. Ma et al. // Biomaterials. – 2015. – V.53. – P.184-201. 181. Zetterstrom P. Soluble misfolded subfractions of mutant superoxide dismutase-1s are enriched in spinal cords throughout life in murine ALS models / P. Zetterstrom, H.G. Stewart, D. Bergemalm et al. // Proceeding of the National Academy of Science . – 2007. – V.104, №35. – P.14157-62. 182. Zhang H.T. Umbilical cord blood cell-derived neurospheres differentiate into Schwann-like cells / H.T. Zhang, H.Y. Cheng, L. Zhang et al // Neuroreport. – 2009. – V.20, № 4. – P.354–359. 183. Zhang S.C. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells / S.C. Zhang, M. Wernig, I.D. Duncan et al. // Nature Biotechnology. – 2001. – V.19, №12. – P.1129-33. 184. Zhong Z. ALS-causing SOD1 mutants generate vascular changes prior to motor neuron degeneration / Z. Zhong, R. Deane, Z. Ali et al. // Nature Neuroscience. – 2008. – V.11, №4. – P.420-2. 185. Zhou C.B. Treating congenital megacolon by transplanting GDNF and GFRα-1 doublegenetically modified rat bone marrow mesenchymal stem cells / C.D. Zhou, C.H. Peng, W.B. Pang et al. // Genetics and Molecular Research. – 2015. – V.14, №3. – P.9441-51. 186. Zhu W. ALFF Value in Right Parahippocampal Gyrus Acts as a Potential Marker Monitoring Amyotrophic Lateral Sclerosis Progression: a Neuropsychological, 105 Voxel-Based Morphometry, and Resting-State Functional MRI Study / W.Zhu, X. Fu, F. Cui et al. // Molecular Neuroscience. – 2015. – V.57, №1. – P.106-13. 187. Zola H. Expression of cytokine receptors by human cord blood lymphocytes: comparison with adult blood lymphocytes / H. Zola, M. Fusco, P.J. Macardle et al. // Pediatric Research. – 1995. – V.38. – P.397–403. 188. Zuccato C. Loss of huntingtin-mediated BDNF gene transcription in Huntington's disease / C. Zuccato, A. Ciammola, D. Rigamonti et al. // Science. – 2001. – V.293, №5529. – P.493-8. 106 СПИСОК ИЛЛЮСТРАТИВНОГОНОГО МАТЕРИАЛА Таблица 1 - Клинические испытания клеточных препаратов для терапии нейродегенеративных состояний ................................................................................. 39 Рисунок 1 - Дизайн эксперимента. [Исламов и др., 2007] с изменениями. .. 41 Таблица 2 - Нуклеотидная последовательность праймеров и зондов, использованная для количественного анализа в ПЦР-РВ. ....................................... 44 Таблица 3 - Экспериментальные группы животных. ...................................... 46 Рисунок 2 - Демонстрация проведения поведенческого теста «Сила хватки» у трансгенных SOD1 G93A мышей. ............................................................................ 48 Рисунок 3 - Демонстрация проведения поведенческого теста «Открытое поле» у трансгенных SOD1 G93A мышей. ................................................................. 49 Таблица 4 - Характеристика антитела, использованных для иммунофлуоресцентного окрашивания. ..................................................................... 51 Рисунок 4 - Мононуклеарные клетки пуповинной крови человека трансдуцированных рекомбинантным аденовирусом, экспрессирующим ген зеленого флуоресцирующего белка – egfp (МOI 10), 96 часов после внесения Ad5EGFP в культуру МККП. А и С – флуоресцентная микроскопия, B и D – фазовоконтрастная микроскопия, А и B – модифицированные МККП, С и В – не модифицированные (нативные) МККП. Измерительная линейка, 100 m. .......... 53 Рисунок 5 - Экспрессия мРНК генов vegf165, ncam1 и gdnf в мононуклеарных клетках пуповинной крови человека через 96 часов после трансдукции аденовирусами Ad5-GDNF Ad5-NCAM1 и Ad5-VEGF165.. ............. 55 Рисунок 6 - Экспрессия мРНК генов vegf165, ncam1 и gdnf в мононуклеарных клетках пуповинной крови человека через 96 часов после трансдукции аденовирусами Ad5-GDNF и Ad5-NCAM1.. ....................................... 56 Рисунок 7 - МККП в спинном мозге трансгенных SOD1 G93A мышей через 2 недели после трансплантации. .................................................................................. 57 Рисунок 8- CD34-позитивные МККП человека в сером веществе спинного мозга трансгенной SOD1 G93A мыши.. ...................................................................... 58 107 Рисунок 9 - Iba1- позитивные МККП человека в сером веществе спинного мозга трансгенной SOD1 G93A мыши. ....................................................................... 59 Рисунок 10 - HNA+-клетки, локализующиеся в сосудах спинного мозга. ... 59 Рисунок 11- Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание поперечного среза спинного мозга трансгенной SOD1 G93A мыши на 42 неделе после трансплантации генетически модифицированных клеток пуповинной крови человека с помощью антител к ядерному антигену человека (HNА) и каспазы-3. 61 Рисунок 12- EGFP-позитивные клетки в сером веществе поясничного отдела спинного мозга трансгенной SOD1 G93A мыши через 14 недель после трансплантации.............................................................................................................. 62 Рисунок 13 - Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание. HNA+VEGF+клетки в поясничного отдела спинного мозга трансгенной SOD1 G93A мыши через 7 недель после трансплантации. ........................................................................ 62 Рисунок 14 - Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание. HNA+GDNF+клетки в поясничном отделе спинного мозга трансгенной SOD1 G93A мыши через 7 недель после трансплантации.. ................................................................................. 63 Рисунок 15 - Иммуноэкспрессия терапевтических генов в МККП после трансплантации в спинном мозге трансгенных SOD1 G93A мышей. ..................... 64 Рисунок 16 - Мононуклеарные клетки крови пуповины человека в спинном мозге трансгенной G93A мыши через 9 недель после трансплантации. ................. 65 Рисунок 17 - Гистограмма количества HNA+ клеток в 100 поперечных срезах спинного мозга трансгенных G93A мышей после трансплантации мононуклеарных клеток крови пуповины человека на разных сроках эксперимента.................................................................................................................. 66 Рисунок 18 - Гистограмма изменения уровня горизонтальной активности трансгенных SOD1 G93A мышей при выполнении теста двигательной активности «Открытое поле». .......................................................................................................... 69 Рисунок 19 - Гистограмма изменения уровня вертикальной активности трансгенных SOD1 G93A мышей при выполнении теста двигательной активности «Открытое поле». .......................................................................................................... 70 108 Рисунок 20 - Гистограмма изменения уровня исследовательской активности трансгенных SOD1 G93A мышей при выполнении теста двигательной активности «Открытое поле». .......................................................................................................... 71 Рисунок 21 - Гистограмма изменения уровня силы хватки трансгенных SOD1 G93A мышей при выполнении теста двигательной активности «Сила хватки»............................................................................................................................ 72 Рисунок 22 - График продолжительности жизни трансгенных SOD1 G93A мышей. ............................................................................................................................ 74
