На правах рукописи Курицын Сергей Николаевич УЧАСТИЕ
advertisement
На правах рукописи Курицын Сергей Николаевич УЧАСТИЕ ЭНДОТЕЛИНА-1 В ПРОТЕКТИВНОМ ЭФФЕКТЕ ОПИОИДНЫХ ПЕПТИДОВ НА СТРЕССОБУСЛОВЛЕННУЮ ВАЗОКОНСТРИКЦИЮ 03.00.13 – Физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Архангельск – 2007 Работа выполнена на кафедре медицинской биологии с курсом медицинской генетики ГОУ ВПО «Северный государственный медицинский университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Бебякова Наталья Александровна Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Колмогоров Сергей Валентинович доктор медицинских наук, профессор Совершаева Светлана Леонидовна Ведущая организация: ГОУ ВПО « Московский государственный медико-стоматологический университет » Защита диссертации состоится «17» октября 2007 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 212.191.01 при Поморском государственном университете имени М. В. Ломоносова по адресу: 163045, г. Архангельск, ул. Бадигина, д.3. С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Поморского государственного университета имени М. В. Ломоносова. Автореферат разослан «______» ______________ 2007 г. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук, доцент 2 Н.В. Афанасенкова ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТ ИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. В конце ХХ века сформировалось направление фундаментальных исследований, связанное с изучением эндотелийзависимых факторов регуляции тонуса сосудов. Было выявлено, что эндотелий участвует в формировании системных гемодинамических реакций, регулирует местный сосудистый тонус, являясь конечным звеном его нейрогенной и гуморальной регуляции (Постнов Ю. В., Бойцов С.А., 2006, Wei C.M., 1987, Lerman A., Rodeheffer R.J., 1994). Функциональная перестройка эндотелия при воздействии стрессорных факторов заключается в изменении сбалансированной секреции веществ, регулирующих тонус сосудов (Соболева Г.Н., 1997, Затейщиков Д.А., 2000, Ольбинская Л.И., 2001, Шес такова М. В., 2001, Гельцер Б.И., 2004, Шляхто Е. В., 2004, Ющук Е.Н., 2005, Воробьева А. В., 2006). В настоящее время в механизмах внутриклеточной регуляции тонуса кровеносных сосудов установлена важная роль эндотелина-1 (Vanhoutte P. M., 1993), который является самым мощным из известных вазоактивных эндотелиальных факторов с констрикторными свойствами (Патарая С.А., 2000, Гомазков О.А., 2001, Омельянович Д.А., 2006, Yanagisawa M., 1988, La M., 1995, Schiffrin E.L., 1998). Ответ на стрессирующий фактор зависит от различных механизмов, которые формируют функционирующие в организме стресс-лимитирующие и стресс-реализующие системы (Меерсон Ф.З., 1989, Пшенникова М.Г., 2000). Одной из стресс-лимитирующих систем организма является система опиоидных пептидов. В исследованиях, посвященных изучению опиоидергической модуляции сосудистого тонуса, авторами в основном рассматривается влияние опиоидных пептидов на центральные механизмы регуляции этих изменений. Вопрос о влиянии опиоидов на периферический сосудистый тонус остается недос таточно исследованным. В литературе имеются лишь единичные данные, касающиеся модуляции опиоидами периферического сосудистого тонуса (Хромова А.В., 2002, Saunders W.S., 1985, Randich A., 1993, Robertson J.D., Willingham T., 1993). Учитывая, что в эндотелии кровеносных сосудов обнаружены различные типы опиатных рецепторов (Stefano G.B., 1998), можно предположить, что опиоидные пептиды могут реализовывать стресс-лимитирующие эффекты на сердечно-сосудистую систему через эндотелиальные факторы. В отечественной и зарубежной литературе работ, в которых исследовалось бы учас тие эндотелиальных вазоактивных систем в опиоидергической модуляции сосудистого тонуса, крайне мало (Командресова Т.М., 2006). Вмес те с тем, имеются данные о взаимосвязи как опиоидных пептидов, так и эндотелина-1 с биологически активными веществами, такими как катехоламины, ангиотенз ин и др., в регуляции сосудистого тонуса (Павленко В.С., 1984, Пшенникова М.Г., 1987, Маслов Л.Н., 2005, Fuder H., 1986, Rosen M.R., 1995). Эти факты свидетельствуют о возможном участии эндотелина-1, как эндотелиального фактора, в механизмах опиоидергической регуляции периферического сосудистого тонуса. Однако 3 вопрос о роли эндотелина-1 в механизмах опиоидергической регуляции периферического сосудистого тонуса в условиях острого стресса не исследован. Вмес те с тем, для введения опиоидных пептидов в практику профилактики и коррекции с трессорных изменений гемодинамики необходимо знание тонких механизмов опиоидергической модуляции периферического сосудистого тонуса в условиях острого стресса. Цель и задачи исследования. Цель исследования - изучить роль эндотелина-1 в механизмах влияния активации опиатных рецепторов на стрессобусловленные изменения тонуса периферических кровеносных сосудов. Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи: 1. Выявить участие опиоидергической системы в регуляции периферического сосудистого тонуса и элас тичности сосудов различного диаметра в условиях острого стресса. 2. Выявить участие эндотелина-1 в изменениях периферического сосудистого тонуса на фоне острого стресса. 3. Установить взаимосвязь опиоидергической системы и эндотелина-1 в регуляции периферического сосудистого тонуса на фоне острого стресса путем блокады и активации µ-, δ- и κ- опиатных рецепторов. Положения, выносимые на защиту. 1. Модуляция показателей периферического сосудистого тонуса на фоне блокады и активации опиатных рецепторов в условиях острого стресса свидетельс твует об участии опиоидергической системы в регуляции тонуса сосудов при стрессе. Наибольший протективный эффект на стрессобусловленную вазоконстрикцию, связанный преимущественно с изменением элас тичности крупных сосудов на протяжении всего периода эксперимента, наблюдался при активации µ- опиатных рецепторов и при сочетанной активации µ- и δ-опиатных рецепторов. При селективной активации δ-опиатных рецепторов был выявлен протективный эффект, начиная с 15-й мин стрессирования, в то время как при активации κ-опиатных рецепторов наблюдался кратковременный протективный эффект только на 15-й мин эксперимента. Данные протективные эффекты связаны с равнозначным изменением эластичности крупных и мелких кровеносных сосудов. 2. Неселективная блокада эндотелиновых рецепторов приводила к протективному эффекту на с трессобусловленную вазоконстрикцию, который связан преимущественно с изменением эластичнос ти крупных кровеносных сосудов. При этом гемодинамические изменения были менее выраженными по сравнению с контролем, что свидетельствует об участии эндотелина-1 в механизмах регуляции периферического сосудистого тонуса в условиях острого стресса. 3. Увеличение стрессобусловленного роста периферического сосудистого тонуса в условиях неселективной блокады опиатных рецепторов связано преимущественно со снижением эластичнос ти сосудов мелкого диаметра. Блокада опиатных рецепторов приводила к резкому увеличению уровня эндотелина-1. Активация всех типов опиатных рецепторов в условиях острого 4 стресса сопровождалась снижением уровня продукции эндотелина-1 в плазме крови экспериментальных животных. Наибольшее снижение уровня эндотелина-1 на 66,32% было выявлено на фоне селективной активации µ-опиатных рецепторов при помощи DAGO. При сочетанной активации µ- и δ-опиатных рецепторов даларгином уровень эндотелина-1 уменьшался на 28,50%. Селективная стимуляция δ-опиатных рецепторов при помощи DSLET приводила к незначительному уменьшению уровня эндотелина-1 (на 24,35%). Активация κ-опиатных рецепторов при помощи динорфина А1-13 не приводила к достоверным изменениям уровня эндотелина-1, концентрация которого уменьшалась лишь на 18,35%. Эти факты свидетельствуют о роли эндотелина-1 в механизме протективного дейс твия активации опиатных рецепторов на стрессобусловленный рост периферического сосудистого тонуса через изменение работы эндотелия кровеносных сосудов, направленное на уменьшение синтеза вазоконстрикторных факторов. 4. Наиболее тесная связь с эндотелином-1 выявлена у селективного агониста µ-опиатных рецепторов DAGO, т.к. при совместном действии DAGO и неселективного блокатора эндотелиновых рецепторов РD 145,065 наблюдался незначительный суммарный протективный эффект, в то время как при совместном действии даларгина и РD 145,065 наблюдался ярко выраженный суммарный протективный эффект, что свидетельс твует о том, что протективный эффект даларгина связан не только со снижением уровня эндотелина-1, но и с действием других эндотелиальных факторов. Научная новизна исследования. Впервые выявлено участие эндотелина-1 в стрессобусловленном увеличении периферического сосудистого тонуса, связанное с изменением эластичнос ти крупных кровеносных сосудов. Впервые ус тановлено участие эндотелина-1 в протективном эффекте активации µ-, δ- и κ-опиатных рецепторов на стрессобусловленную вазоконстрикцию. Установлено, что эндогенные опиоиды сдерживают выброс эндотелина-1 в условиях острого стресса. Выявлено, что наиболее тесно с эндотелином-1 связан протективный эффект селективной активации µ-опиатных рецепторов DAGO, который обусловлен изменением эластичности крупных сосудов. Результаты данного исследования будут способствовать расширению представлений о клеточных механизмах влияния стресс-лимитирующей системы опиоидных пептидов и стресс-реализующей системы эндотелина-1 на периферический сосудистый тонус. Научно-практическая значимость исследования. Результаты исследования расширят предс тавления об учас тии эндотелия в механизмах регуляции опиоидными пептидами периферического сосудистого тонуса и внесут определенный вклад в понимание сущности этих механизмов. Результаты исследования могут быть использованы в программе обучения студентов медицинских ВУЗов и биологических факультетов университетов в курсе физиологии сердечно-сосудистой системы. Полученные данные могут быть использованы для разработки фармакологических препаратов и методов коррекции стрессобусловленных изменений периферического сосудистого 5 тонуса, связанного с эндотелиальной дисфункцией кровеносных сосудов. Наиболее перспективным для разработки пептидных препаратов, регулирующих периферический сосудистый тонус в условиях острого стресса, является селективный агонис т µ- опиатных рецепторов DAGO. Материалы диссертационного исследования используются в преподавании курса физиологии сердечно-сосудистой системы Северного государственного медицинского университета на кафедре нормальной физиологии (акт внедрения от 08.02.2007), Поморского государственного университета имени М.В. Ломоносова на кафедре биологии и экологии человека (акт внедрения от 20.06.2007), Коми филиала Кировской государственной медицинской академии на кафедре нормальной физиологии (акт внедрения от 15.06.2007). Диссертационное исследование выполнено в ГОУ ВПО «Северный государственный медицинский университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию на кафедре медицинской биологии с курсом медицинской генетики при поддержке грантов РФФИ и администрации Архангельской области «Опиоидергическая модуляция стрессобусловленных изменений гемодинамики» № 03-04-96175, «Эндотелиальные механизмы опиоидергической модуляции стрессобусловленной вазоконстрикции» № 05-04-97530, гранта облас тного конкурса «Молодые ученые Поморья» «Роль эндотелина-1 в опиоидергической модуляции стрессобусловленной вазоконстрикции» № 03-26. Апробация результатов исследования. Основные результаты исследования представлены и обсуждены на совместном заседании кафедры медицинской биологии с курсом медицинской генетики и проблемной комиссии по физиологии и восстановительной медицине СГМУ (2005, 2006, 2007), IV и V молодежных научных конференциях «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике» (г. Сыктывкар, 2005, 2006), IX и X Международных школах - конференциях молодых ученых «Биология – наука ХХI века» (г. Пущино, 2005, 2006), I съезде физиологов СНГ (г. Сочи, 2005), научно-практической конференции «Новая технологическая платформа биомедицинских исследований (биология, здравоохранение, медицина)» (г. Ростов-на-Дону, 2006), II Российско-Китайской Международной научно-практической конференции «Фундаментальная фармакология и фармация – клинической практике» (г. Пермь, 2006), III Международной научно-практической школе-конференции «Актуальные вопросы инновационной деятельности в биологии и медицине» (г. Москва, 2006), Всероссийской конференции с международным участием «Академическая наука и ее роль в развитии производительных сил в северных регионах России» (г. Архангельск, 2006), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные аспекты жизнедеятельности человека на Севере» (г. Архангельск, 2006), XII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молодые ученые в медицине» (г. Казань, 2007), Молодежной научно-практической конференции студентов и молодых ученых Северного государственного медицинского университета с 6 международным участием (г. Архангельск, 2007), ХХ съезде физиологов России (г. Москва, 2007), молодежной научной конференции «Экология – 2007» (г. Архангельск, 2007). По теме диссертации опубликовано 22 печатные работы, в том числе 2 статьи в рецензируемых журналах. Структура и объем работы. Диссертация изложена на 142 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора научной литературы, раздела, посвященного материалам и методам исследования, глав, содержащих результаты собственных исследований и их обсуждение, заключения и выводов. Работа содержит 12 таблиц и 27 рисунков. Библиографический указатель содержит 339 наименований, из которых 173 публикация отечественных авторов и 166 иностранных. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В качес тве объекта исследования использовали половозрелых бодрствующих крыс–самцов генетической линии Wistar массой 200-250 г., характеризующихся вазоконстрикторными реакциями на острый стресс (Хромова А.В., 2002, Командресова Т.М., 2006). Проведено 11 экспериментальных серий (165 экспериментов). Количество животных в каждой экспериментальной серии составляло 15 особей. Все животные, используемые в эксперименте, содержались в стандартных условиях вивария СГМУ. Масса крыс соответствовала весовым показателям возрастных норм. Протокол эксперимента одобрен Комитетом по этике СГМУ (пр. № 05/05 от 15.06.05). В исследовании использовали иммобилизацию животных в камере без жесткой фиксации в течение одного часа (Судаков К.В., 1989). Оценку тонуса периферических сосудов осуществляли при помощи метода тетраполярной реографии (Виноградова Т.С., 1986, Ранкин М.А., 1997). Тонус сосудов оценивали с использованием реовазограммы хвостовой артерии крысы, для снятия которой использовали многофункциональный диагностический компьютерный комплекс «Диастом-01» (ГОСТ 15.013-94), разработанный в лаборатории функциональной диагностики ЦНИИС (зав. лаб. – проф. Логинова Н.К.). Реовазограммы записывали с 5-й по 60-ю мин стрессирования с интервалом 15 мин. Качественную оценку периферического сосудистого тонуса проводили по конфигурации реограммы (Логинова Н.К., 1994). Для количественного анализа сосудистого тонуса использовали индекс периферического сопротивления (ИПС) – интегральный показатель сосудистого тонуса, модуль упругости (МУ), характеризующий изменения эластичнос ти крупных сосудов, индекс быстрого кровенаполнения (ИБН), отражающий изменения эластичнос ти мелких сосудов (Соколова И.В., 2002). Для активации опиатных рецепторов использовали опиоидные пептиды производства лаборатории синтеза пептидов Кардиологического научнопроизводственного комплекса Росздрава (зав. лаб. - к.х.н. Беспалова Ж.Д.): неселектиный агонист µ-и δ-опиатных рецепторов даларгин (Tyr-D-Ala-Gly7 Phe-Leu-Arg) в дозе 0,1 мг/кг и селективные агонисты опиатных рецепторов : DAGO (H-Tyr-D-Ala-Gly-N-Me-Phe-Gly-ol) – агонис т µ-опиатных рецепторов в дозе 0,1 мг/кг; DSLET (H-Tyr-D-Ser-Gly-Phe-Leu-Thr) - лиганд δ-опиатных 2 5 6 рецепторов в дозе 0,1 мг/кг; динорфин А1-13 (D-Ala –Leu -Arg ) – агонист κ-опиатных рецепторов в дозе 0,2 мг/кг. Пептиды вводили в объеме 0,9 мл раствора Рингера внутрибрюшинно за 5 мин до начала эксперимента. Блокаду опиатных рецепторов проводили при помощи неселективного антагониста опиатных рецепторов налоксона (C19 H21 NO4 ) ((-)–17–Allyl-4,5-αepoxy-3,14-dihydroxymorphinan-6-one-hydrochloride) («Endo Laboratories», США) в дозе 0,7 мг/кг, который вводили за 15 мин до с трессирования внутрибрюшинно в объеме 0,9 мл раствора Рингера (Головко А. И. и соавт., 2003, Гейн С.В., 2006). Блокаду эндотелиновых рецепторов осуществляли при помощи неселективного антагониста PD145,065 (C52 H65 N7 O10) (N-Acetyl-α-[10,11Dihydro-5H-dibenzoacycloheptadien-5yl]-D-Gly-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp) («Sigma Aldrich», США), который вводили в дозе 0,3 мг/кг аналогичным способом (Пономарева Т.И., 2003, Куприна А. А., 2005). Животным контрольной серии вводили 0,9 мл раствора Рингера внутрибрюшинно за 5 мин до начала эксперимента. Концентрацию эндотелина-1 в плазме крови определяли иммуноферментным методом, используя наборы для количественного определения эндотелина-1 в биологических жидкостях производства компании «Biomedica» (Австрия) с использованием аналитического оборудования «Anthos 2020» производства компании «Anthos labtec instruments» (Австрия). Математический анализ полученных результатов проводили на персональном компьютере при помощи пакета прикладных программ статистической обработки «Microsoft Excel 7.0.». Обработка результатов предусматривала вычисление среднего значения (М), стандартной ошибки среднего (m) и стандартного отклонения (σ). Оценка достоверности различий проводилась с помощью t-критерия Стьюдента. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ У животных контрольной серии на протяжении всего срока иммобилизации наблюдался достоверный рост периферического сосудистого тонуса, который выражался в увеличении к 60-й мин стрессирования ИПС на 84,3% (р<0,001) и уменьшении МУ на 32,2% (р<0,001), а ИБН - на 18,4% (р<0,001) по сравнению с 5-й мин стрессирования (рис. 1). Полученные экспериментальные данные показывают, что в условиях острого стресса происходят изменения элас тичности как крупных сосудов, так и сосудов более мелкого диаметра, но крупные сосуды характеризуются более выраженными изменениями на острый стресс. 8 ИПС, удельн.ед. 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 *** *** *** *** 5 *** 15 30 45 60 время иммобилизации, мин контроль налоксон МУ, удельн. ед. 100 80 60 40 * ИБН, удельн. ед. * * ** 20 0 100 80 60 40 20 0 5 15 30 *** 5 15 45 60 время иммобилизации, мин *** 30 *** 45 *** 60 Рис. 1. Изменения ИПС, МУ и ИБН в условиях острого стресса в контроле и на фоне введения налоксона. Примечание: * - достоверные изменения по сравнению с контролем: * - р<0,05, ** - р<0,01, *** - р<0,001. Было установлено, что в условиях острого стресса концентрация эндотелина-1 повышалась на 14,2% по сравнению с базовым уровнем (р<0,1), что свидетельствует об участии эндотелина-1 в механизмах стрессобусловленных изменений периферического сосудистого тонуса (табл. 1). 9 Таблица 1 Уровень продукции эндотелина-1 на фоне активации и блокады опиатных рецепторов, предварительной блокады эндотелиновых рецепторов Экспериментальная серия Уровень эндотелина-1 (фмоль/мл) Базовый уровень (интактные животные) 1,69±0,23 Базовый уровень (в условиях блокады эндотелиновых рецепторов на фоне введения 2,50±0,23 PD 145,065) Стресс на фоне: введения раствора Рингера (контроль) 1,93±0,12 введения налоксона 4,68±0,90*** введения PD 145,065 3,43±0,30*** введения даларгина 1,38±0,16** введения DSLET 1,46±0,15* введения DAGO 0,65±0,11*** введения динорфина А1- 13 1,58±0,16 Стресс на фоне блокады эндотелиновых рецепторов PD 145,065: с последующим введением даларгина 3,07±0,28*** с последующим введением DAGO. 1,29±0,12* Примечание: * достоверные изменения по сравнению с контролем: * - р<0,05, ** - р<0,01, *** - р<0,001. Для установления участия опиоидергической системы в модуляции изменений периферического сосудистого тонуса и изучения особенностей влияния опиоидов на эластические свойства сосудов крупного и мелкого диаметра в условиях острого с тресса была проведена серия экспериментов с введением налоксона. На фоне неселективной блокады опиатных рецепторов наблюдалась ярко выраженная по сравнению с контролем вазоконстрикторная реакция на острый стресс, сопровождающаяся увеличением темпов стрессобусловленного роста ИПС и более выраженным снижением эластичнос ти мелких кровеносных сосудов по сравнению с крупными сосудами. ИПС на 5-й мин стрессирования был на 18,1% (р<0,001), а на 60-й мин – на 33,2% выше, чем в контроле (р<0,001), что доказывает учас тие опиатных рецепторов в регуляции сосудистого тонуса в условиях острого стресса. ИБН на 5-й мин стрессирования был ниже на 12,1% (р<0,001), а на 60-й мин - ниже на 38,3% (р<0,001), чем в контроле. МУ на 5-й мин был ниже на 9,6% (р<0,05), а на 60-й мин - на 14,9% (р<0,01) аналогичного показателя в контроле (рис. 1). В условиях ос трого стресса на фоне блокады опиатных рецепторов концентрация эндотелина-1 увеличивалась по сравнению с контрольной серией на 142,5% (р<0,001), и на 176,5% (р<0,001) по сравнению с интактными 10 животными, т.е. в данных условиях наблюдалась гиперпродукция эндотелина-1, что и приводило к ярко выраженной вазоконстрикторной реакции (табл. 1). Резкое увеличение уровня эндотелина-1 в условиях блокады опиатных рецепторов позволяет предположить, что эндогенные опиоиды сдерживают выброс эндотелина-1 в условиях острого стресса. Изменение уровня продукции эндотелина-1 на фоне блокады опиатных рецепторов указывает на его участие в механизме опиоидергической модуляции стрессобусловленных изменений периферического сосудистого тонуса и в формировании прессорных гемодинамических реакций на острый стресс. Для изучения участия эндотелина-1 в механизмах влияния активации различных типов опиатных рецепторов на изменения периферического сосудистого тонуса в условиях острого с тресса был оценен уровень продукции эндотелина-1 и изменения периферического сосудистого тонуса на фоне введения неселективных и селективных агонистов опиатных рецепторов. Было установлено, что активация всех типов опиатных рецепторов оказывала протективный эффект на стрессорную вазоконстрикцию с разной степенью выраженности (рис. 2). Активация κ-опиатных рецепторов приводила лишь к незначительному и кратковременному снижению роста периферического сосудистого тонуса только на 15-мин с трессирования. На протяжении остального времени эксперимента средние значения ИПС были ниже контрольных значений, но достоверно от них не отличались. Активация δ-опиатных рецепторов оказывала слабый протективный эффект, начиная с 15-й мин стрессирования, сохраняясь до конца эксперимента. ИПС на фоне введения DSLET на 15-й мин стрессирования был на 9,7% ниже, чем в контроле (р<0,001), а на 60-й мин – ниже на 7,3% (р<0,001). Протективный эффект сочетанной активации µ- и δ-опиатных рецепторов наблюдался, начиная с 5-й мин иммобилизации. На 5-й мин с трессирования ИПС на фоне введения даларгина был на 23,3% ниже, чем в контроле (р<0,001), а на 60-й мин иммобилизации - ниже на 14,6% (р<0,01). Самый выраженный протективный эффект на с трессобусловленный рос т периферического сосудистого тонуса был выявлен при селективной активации µ-опиатных рецепторов. На фоне введения DAGO на 5-й мин с трессирования ИПС был ниже соответствующего показателя в контроле на 35,7% (р<0,001), а к 60-й мин эксперимента эти отличия составили 22,0% (р<0,001). В данных условиях, изменялись эластические свойства периферических кровеносных сосудов. DAGO и даларгин приводили к более выраженному изменению эластичнос ти крупных сосудов, в то время как DSLET и динорфин А1-13 приводили к равнозначным и небольшим изменениям эластичности как крупных, так и мелких сосудов (рис. 2). Полученные данные свидетельс твуют об участии µ-, δ- и κ-опиатных рецепторов в регуляции периферического сосудистого тонуса в условиях острого стресса, среди которых µ-опиатным рецепторам принадлежит ведущая роль, т.к. их активация оказывает наибольший протективный эффект на стрессорную вазоконстрикцию. Менее выраженный протективный эффект на 11 стрессобусловленный рост ИПС был выявлен при сочетанной активации δ- опиатных рецепторов. µ- и ИПС, удельн.ед. 160 140 120 100 80 60 40 20 0 5 15 30 45 60 время иммобилизации, мин МУ, удельн.ед. ИБН, удельн.ед. 140 120 100 80 60 40 20 0 140 120 100 80 60 40 20 0 5 15 30 45 60 5 15 время иммобилизации, мин 30 45 60 Рис. 2. Стрессобусловленные изменения ИПС, МУ и ИБН на фоне активации различных типов опиатных рецепторов : ―◊― - раствор Рингера (контроль), ―х― - DSLET, ―▲― - DAGO, ―■ ― - даларгин, ―* ― - динорфин А1-13 . Протективный эффект активации различных типов опиатных рецепторов на стрессорную вазоконстрикцию сопровождался снижением уровня эндотелина-1, что свидетельствует об участии эндотелиального вазоконстриктора в опиоидергической регуляции тонуса сосудов при остром стрессе. Так селективная активация µ-опиатных рецепторов в условиях острого стресса приводила к снижению уровня эндотелина-1 на 66,32% (р<0,001), сочетанная активация µ- и δ-опиатных рецепторов - на 28,50% (р<0,01), селективная стимуляция δ-опиатных рецепторов - на 24,4% (р<0,01), а 12 активация κ-опиатных рецепторов - на 18,4% и достоверно не отличалась от значений в контроле (табл. 1). Для решения вопроса о степени участия эндотелина-1 в регуляции стрессобусловленных изменений периферического сосудистого тонуса была проведена экспериментальная серия с введением неселективного блокатора эндотелиновых рецепторов PD 145,065 (рис. 3). ИПС, удельн.ед. 160 140 120 *** 100 *** 80 ** 60 40 20 0 5 15 30 45 время иммобилизации, мин контроль ИБН, удельн.ед. 140 120 100 80 60 40 20 0 *** 120 100 80 60 40 20 0 *** 5 15 30 ** ** 45 60 60 PD 145,065 140 *** *** МУ, удельн.ед. *** 5 *** 15 *** 30 *** 45 *** 60 Рис. 3. Изменения ИПС, МУ и ИБН в условиях острого стресса на фоне введения раствора Рингера (контроль) и неселективной блокады эндотелиновых рецепторов. Примечание: * - достоверные изменения по сравнению с контролем: р<0,001. **-р<0,01, *** - Блокада эндотелиновых рецепторов приводила к протективному эффекту на стрессобусловленные изменения периферического тонуса, так как гемодинамические изменения на стресс были менее выраженными по сравнению с контролем. Это еще раз подтверждает факт участия эндотелина-1 в 13 механизмах регуляции периферического сосудистого тонуса при остром стрессе. Протективный эффект блокады эндотелиновых рецепторов наблюдался с 15-й мин стрессирорвания и сохранялся до конца эксперимента. На 15-й мин иммобилизации показатель ИПС был ниже показателей в контроле на этой же мин стрессирования на 10,5% (р<0,01), а на 60-й мин – на 15,0% (р<0,001). На фоне блокады эндотелиновых рецепторов увеличивалась эластичнос ть как крупных, так и мелких сосудов, но в большей степени изменялись эластические свойства сосудов крупного калибра. Так на 5-й мин стрессирования МУ был на 72,6% выше, чем в контроле на этой же мин эксперимента (р<0,001), а к 60-й мин стрессирования эта разница достигала 78,2% (р<0,001). В то время как на 5-й мин с трессирования ИБН был на 52,2% выше, чем в контрольной серии эксперимента (р<0,001), а к 60-й мин стрессирования это отличие составляло только 16,3% (р<0,001). В условиях блокады эндотелиновых рецепторов наблюдалось резкое увеличение уровня эндотелина-1 (табл. 1). Это, вероятно, связано с тем, что снижение концентрации активных эндотелиновых рецепторов в эндотелии кровеносных сосудов при их блокаде, приводит к увеличению концентрации соответс твующего агонис та (Yamada S., 1979). Причем введение блокатора эндотелиновых рецепторов интактным животным увеличивало уровень эндотелина-1 на 47,9%, (р<0,05), а блокада эндотелиновых рецепторов в условиях острого стресса повышала уровень эндотелина-1 на 77,7% (р<0,001). Эти данные подтверждают важную роль эндотелина-1 в формировании стрессорной вазоконстрикции. Так как из всех изученных лигандов опиатных рецепторов только даларгин и DAGO оказывали ярко выраженный протективный эффект на стрессобусловленную вазоконстрикцию, для оценки с тепени участия эндотелина-1 в их модулирующем эффекте были проведены серии экспериментов с предварительной блокадой эндотелиновых рецепторов и последующим введением даларгина и DAGO. На фоне сочетанного действия блокады эндотелиновых рецепторов и последующей активацией µ- и δ-опиатных рецепторов даларгином наблюдался суммарный протективный эффект на стрессобусловленную вазоконстрикцию, который был выше протективного эффекта как на фоне изолированного действия блокатора эндотелиновых рецепторов, так и изолированного действия даларгина (рис. 4). Так, на 5-й мин эксперимента ИПС в данной экспериментальной серии был на 37,2% ниже, чем на фоне введения PD 145,065 (р<0,001) и на 20,6% ниже, чем на фоне введения даларгина (р<0,01). К 60-й мин эксперимента ИПС увеличивался на 108,6% (р<0,001), что на 18,8% ниже, чем на фоне введения PD 145,065 (р<0,001) и на 19,2% ниже, чем на фоне введения даларгина (р<0,001) на этой же мин стрессирования. Полученные экспериментальные данные свидетельствует о том, что протективный эффект даларгина на стрессобусловленные изменения периферического сосудистого тонуса связан не только со снижением уровня 14 эндотелина-1, но и с изменением активнос ти других эндотелиальных вазоактивных факторов, например, оксида азота (Командресова Т.М., 2006). ИПС, удельн.ед. 160 140 120 100 *** 80 *** 60 *** *** 40 *** 20 0 5 15 30 45 60 контроль PD 145,065 даларгин PD 145,065+даларгин Рис. 4. Влияние сочетанной активации µ- и δ- опиатных рецепторов, блокады эндотелиновых рецепторов и введения даларгина на изменения ИПС в условиях острого иммобилизационного стресса. Примечание: * - достоверные изменения по сравнению с блокатором эндотелиновых рецепторов: *** - р<0,001. На фоне сочетанного дейс твия блокады эндотелиновых рецепторов и последующей активации µ-опиатных рецепторов DAGO наблюдался незначительный и кратковременный суммарный протективный эффект на стрессобусловленную вазоконстрикцию (рис. 5). ИПС на 5-й мин стрессирования хотя и был на 39,8% ниже, чем на фоне введения PD 145,065 (р<0,001) на этой же мин стрессирования, но дос товерно не отличался от показателя ИПС на фоне изолированного введения DAGO, снижая его лишь на 9,2%. Суммарный протективный эффект не наблюдался и к концу эксперимента: ИПС на 60-й мин стрессирования был лишь на 11,5% ниже, чем на фоне введения PD 145,065 на этой же мин с трессирования (р<0,001) и так же статистически достоверно не отличался от показателя ИПС на фоне изолированного введения DAGO, снижая его на 3,6%. Полученные данные свидетельствует о ведущей роли эндотелина-1 в протективном действии агониста µ-опиатных рецепторов DAGO. Стимулированный блокадой эндотелиновых рецепторов, уровень эндотелина-1 на фоне введения даларгина снижался лишь на 10,5%, в то время как на фоне введения DAGO происходило снижение уровня эндотелина-1 на 62,4% (р<0,001), что еще раз подтверждает факт ведущей роли эндотелина-1 в протективном действии DAGO (табл. 1). 15 ИПС, удельн.ед. 160 140 120 100 80 60 40 20 0 ** 5 15 ** 30 45 60 DAGO PD 145,065+DAGO контроль PD 145,065 Рис. 5. Влияние активации µ-опиатных рецепторов, блокады эндотелиновых рецепторов и введения DAGO на изменения ИПС в условиях острого иммобилизационного стресса. Примечание: * - достоверные изменения по сравнению с блокатором эндотелиновых рецепторов: ** - р<0,01. Проведенные исследования показали учас тие эндотелина-1 в механизмах протективного эффекта опиоидергической системы на стрессобусловленную вазоконстрикцию. Однако с тепень участия данного эндотелиального вазоконстрикторного фактора в протективных эффектах лигандов опиатных рецепторов, а также степень опиоид-индуцированного изменения уровня эндотелина-1 значительно различались при активации µ-, δ- и κ-опиатных рецепторов в условиях острого стресса. ВЫВОДЫ 1. Увеличение стрессобусловленного роста периферического сосудистого тонуса в условиях блокады опиатных рецепторов связано со снижением эластичности сосудов крупного и мелкого диаметра с преимущественным изменением эластичности сосудов мелкого диаметра. 2. При активации µ-, δ- и κ-опиатных рецепторов наблюдается протективный эффект на с трессобусловленную вазоконстрикцию с разной степенью выраженности. Наибольший протективный эффект, связанный преимущественно с изменением эластичности крупных кровеносных сосудов, наблюдается на фоне селективной активации µ-опиатных рецепторов и сочетанной активации µ- и δ-опиатных рецепторов. При селективной активации δ- и κ-опиатных рецепторов выявлен слабый и кратковременный протективный эффект, который связан с равнозначным изменением эластичности крупных и мелких кровеносных сосудов. 16 3. Увеличение уровня эндотелина-1 при остром с трессе и снижение стрессобусловленных изменений сосудистого тонуса на фоне блокады эндотелиновых рецепторов свидетельствует об участии эндотелина-1 в повышении периферического сосудистого тонуса на фоне острого стресса. Наибольшее влияние эндотелин-1 оказывает на изменения эластичности крупных сосудов. 4. Блокада опиатных рецепторов приводит к резкому увеличению уровня эндотелина-1, в то время как активация µ-, δ- и κ-опиатных рецепторов в условиях острого стресса снижает уровень эндотелина-1, что свидетельс твует о взаимосвязи опиоидергической системы и эндотелина-1 в регуляции периферического сосудистого тонуса на фоне острого стресса. 5. Наиболее тесно с эндотелином-1 связан протективный эффект на стрессобусловленную вазоконстрикцию селективной активации µ-опиатных рецепторов, т.к. наблюдается только небольшой суммарный эффект на стрессобусловленные изменения периферического сосудистого тонуса при совместном действии блокатора эндотелиновых рецепторов и селективной активации µ-опиатных рецепторов DAGO. 1. 2. 3. 4. 5. 6. СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТ АЦИИ Командресова Т.М. Роль активации и блокады µ- и δ- опиатных рецепторов в регуляции сосудистого тонуса /Т.М. Командресова, С.Н. Курицын, А. В. Хромова //Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике: материалы IV Молодежной науч. конф. – Сыктывкар, 2005. – С. 30-32. Командресова Т.М. Влияние блокады опиатных рецепторов на стрессобусловленные изменения периферического сосудистого тонуса /Т.М. Командресова, С.Н. Курицын, А. В. Хромова //Биология – наука XXI века: тез. докл. 9-й Междунар. Пущинской школы-конф. молодых ученых. – Пущино, 2005. – С. 150. Бебякова Н. А. Роль мю-, дельта- и каппа- опиатных рецепторов в модуляции стрессорной вазоконстрикции /Н.А. Бебякова., Т.М. Командресова, С.Н. Курицын, А. В. Хромова //Науч. тр. I съезда физиологов СНГ: тез. докл. – М., 2005. – Т. 1. – С.17. Курицын С. Н. Участие эндотелина-1 в гемодинамических изменениях при остром стрессе / С.Н. Курицын, Т.М. Командресова //Бюл. СГМУ. – 2005. – № 2. – С. 134-136. Курицын С.Н. Взаимосвязь эндотелиальных факторов в условиях активации и блокады опиатных рецепторов при остром с трессе /С.Н. Курицын, Т.М. Командресова //Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике: тез. докл. V Молодежн. науч. конф. – Сыктывкар, 2006. – С. 28-30. Курицын С.Н. Взаимодействие опиатных рецепторов с системой эндотелина-1 в условиях стрессорной вазоконстрикции /С.Н. Курицын, 17 Т.М. Командресова //Биология – наука XXI века: тез. докл. 10-й Пущинской школы-конф. молодых ученых. – Пущино, 2006. – С. 148. 7. Командресова Т.М. Участие NO в модулирующем влиянии DSLET на стрессобусловленные изменения периферического сосудистого тонуса /Т.М. Командресова, С.Н. Курицын //Бюл. СГМУ. – 2006. – № 1. – С. 77-80. 8. Курицын С.Н. Роль эндотелина-1 в изменениях эластичнос ти эндотелия сосудов в условиях острого стресса на фоне блокады опиатных рецепторов /С.Н. Курицын, Т.М. Командресова //Бюл. СГМУ. – 2006. – № 1. – С. 97-99. 9. Курицын С.Н. Участие эндотелина-1 в модулирующем влиянии DAGO на изменения элас тичности кровеносных сосудов /С.Н. Курицын //Новая технологическая платформа биомедицинских исследований (биология, здравоохранение, фармация): Материалы науч.-практ. конф. – Ростов-наДону, 2006. – С. 15. 10.Bebyakova N. A. Opioid-induced change of endothelin-1 concentration at sharp stress /N.A. Bebyakova, S.N. Kuritsin, T.M. Komandresova //Fundamental pharmacology and pharmacy – clinical practice: Materials of the 2-nd Russian – Chinese international scientific conferences on pharmacology. – Perm, 2006. – P. 21-22. 11.Бебякова Н.А. Учас тие опиоидных пептидов в регуляции уровня вазоактивных эндотелиальных факторов при остром стрессе /Н.А. Бебякова, С.Н. Курицын, Т.М. Командресова //Третья Международная научно - практ. конф. «Актуальные вопросы инновационной деятельности в биологии и медицине» (Медбиотек): Мат. конф. – М., 2006. – С. 12-13. 12.Bebyakova N. A. Participation opioid peptides in regulation of level vasoactive endothelial factors at sharp stress /N.A. Bebyakova, S.N. Kuritsin, T.M. Komandresova //The 3-rd International Scientific Conference “Modern issues of innovation activity in biology and medicine”: Proceedings of the conference. – Moscow, 2006. – P. 119-120. 13.Бебякова Н. А. Опиоидергическая коррекция вазоконстрикции при остром стрессе /Н.А. Бебякова, С.Н. Курицын, Т.М. Командресова //Академическая наука и ее роль в развитии производительных сил в северных регионах России. Всероссийская конф. с межд. участием [Электронный ресурс] Архангельск: ИЭПС УрО РАН, 2006а. 14.Гемодинамические реакции острого стресса на фоне введения даларгина /Н.А. Бебякова, А.В. Хромова, Т.М. Командресова, С.Н. Курицын // Вестник Поморского университета: Сер. «Физиологические и психологопедагогические науки». – 2006. – №2. – С. 18 – 24. 15.Роль опиоидергической системы в модуляции периферического сосудистого тонуса в условиях острого стресса /Н. А. Бебякова, Т.М. Командресова, С.Н. Курицын, А.В. Хромова, Ж.Д. Беспалова //Клиническая физиология кровообращения. – 2006.– № 3. – С. 45-49. 16.Бебякова Н. А. Роль оксида азота в модулирующем влиянии DAGO на стрессобусловленные изменения периферического сосудистого тонуса /Н. А. Бебякова., Т.М. Командресова, С.Н. Курицын //Вятский медицинский вестник. – 2006.– № 1. – С. 33-38. 18 17.Бебякова Н.А. Коррекция стрессорной вазоконстрикции даларгином /Н. А. Бебякова, С.Н. Курицын, Т.М. Командресова //Экология человека. – 2006. - № 4 (пр. 2). – С. 277-279. 18.Курицын С.Н. Учас тие вазоактивных систем эндотелия в протективном эффекте динорфина А1-13 на стрессобусловленную вазоконстрикцию /С.Н. Курицын, Т.М. Командресова //Бюл. СГМУ. – 2006. - № 2. – С. 64-66. 19.Курицын С. Н. Модуляция периферического сосудистого тонуса при остром стрессе путем блокады эндотелиновых рецепторов /С. Н. Курицын // Молодые ученые в медицине: Тезисы докладов XII Всероссийской науч. практ. конф. – Казань, 2007. – С. 258. 20.Курицын С. Н. Роль блокады эндотелиновых рецепторов в изменении периферического сосудистого тонуса при остром стрессе /С.Н. Курицын //Бюл. СГМУ. – 2007. - № 1. – С. 86-87. 21.Курицын С. Н. Опиоид-индуцированное изменение модуля упругости кровеносных сосудов при остром стрессе /С.Н. Курицын // ХХ съезд Физиологического общества им. И.П. Павлова. Тезисы докладов. – М.: – 2007. – С. 298. 22.Бебякова Н. А. Влияние селективной активации опиатных рецепторов на эластичность кровеносных сосудов в условиях острого стресса /Н. А. Бебякова, С.Н. Курицын, Т.М. Командресова //Экология – 2007: Мат. межд. конф. молодых ученых и специалистов. – Архангельск, 2007. – С. 305-307. 19
