Постгеномная медицина. Инфраструктура
advertisement
212 ПОСТГЕНОМНАЯ МЕДИЦИНА инфраструктура инфраструктура ПОСТГЕНОМНАЯ МЕДИЦИНА 213 Постгеномная медицина. Инфраструктура Технологический кластер «Постгеномная медицина» Председатель наблюдательного совета акад. В.В. Власов Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН Руководитель проф. А.И. Шевела Центр новых медицинских технологий СО РАН Новосибирск, 630090, ул. Пирогова, 25/4 тел. (383) 333-15-94, факс (383) 333-15-94 e-mail: ashevela@mail.ru http:// www.cnmt.ru История создания Современная медицина базируется на использовании методов геномики, протеомики и клеточной биологии. Развитие персонализированной и регенеративной медицины возможно только на фундаменте, созданном современной биологией и приборостроением. Инициатором создания отдельной структуры, способной воплотить эти принципы в жизнь, Центра новых медицинских технологий (ЦНМТ), стал акад. В.В. Власов. Оценив необходимость развития в Сибирском отделении РАН биомедицинских исследований, Президиум СО РАН 9 ноября 2000 г. принял постановление о необходимости развертывания программы ЦНМТ, конечной целью которой явится создание института, занимающегося проблемами фундаментальной ме- дицины. На первом этапе была организована лаборатория генной диагностики, 5 мая 2004 г. был организован Центр новых медицинских технологий СО РАН в форме отдела ИХБФМ СО РАН. Целью деятельности технологического кластера «Постгеномная медицина» является обеспечение возможностей развития в СО РАН новых направлений медицины, опирающихся на методы геномики, протеомики и клеточной биологии. – выполнение фундаментальных научных и прикладных исследований в области медицинских наук; – разработка новых технологий и инновационных способов диагностики, профилактики и лечения заболеваний; – обеспечение условий для испытания приборов и методов для медицины, разработанных в институтах СО РАН. Основными задачами кластера являются: Основные направления научно-практической деятельности: – создание и поддержание инфраструктуры, обеспечивающей возможность проведения биомедицинских исследований на современном уровне, развитие постгеномных и клеточных технологий в интересах медицины; Аппарат для ударно-волновой терапии Modulith SLK (Storz Medical, Швейцария). – постгеномные технологии: генетическая паспортизация, протеомные исследования, персонализированная медицина; – регенеративная медицина: мини-инвазивная хирургия, клеточные технологии, хирургия сосудов, эндоваскулярные технологии; – репродуктивные технологии; – геронтология; – ультразвуковые технологии визуализации. Инфраструктура кластера: Устройство стереотаксическое для вакуумной дрель-биопсии маммотомии Mammotome (Ethicon Endo-Surgery, США). Ультразвуковой аппарат экспертного класса Hitachi EUB 8500, Япония. Основным подразделением кластера является Центр новых медицинских технологий СО РАН. В нем функционируют 6 лабораторий: • лаборатория генной диагностики; • лаборатория персонализированной медицины; • лаборатория восстановительной медицины; • лаборатория стволовой клетки; • лаборатория проблем репродукции; • лаборатория лучевой диагностики. В лабораториях проводятся экспериментальные и клинические исследования в области физиологии системы гемостаза, моделирования ангиогенеза, медицинского Аппарат InSIGHT G3 (Sandhill Scientific, США). 214 ПОСТГЕНОМНАЯ МЕДИЦИНА инфраструктура инфраструктура ПОСТГЕНОМНАЯ МЕДИЦИНА 215 Автоматический биохимический анализатор «ABX Pentra 400» (Horiba ABX Diagnostics, Франция). Иммунофлюоресцентный анализатор «AxSym» (Abbott, США). Оборудование операционной для выполнения миниинвазивных хирургических вмешательств. Эндовидеохирургическая стойка K. Storz, Германия. Плазмофракционатор Haemonetics MCS+ (Multi component system, США). применения стволовых клеток, сосудистой патологии. Выполняются молекулярно-генетические исследования для оценки риска развития заболеваний. Проводятся разработки новых методик лучевой диагностики; технологий реабилитации при нарушениях в центральной нервной системе, поражениях костномышечного аппарата; инновационных миниинвазивных способов доставки продуктов биотехнологий в организм. ЦНМТ СО РАН оснащен современным оборудованием для функциональных исследований органов желудочно-кишечного тракта, проведения лабораторной диагностики (иммуноферментный анализ, метод полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени»), лучевой диагностики (ультразвуковые исследования, тепловизионные исследования), миниинвазивных хирургических вмешательств, процедур экстракорпоральной гемокоррекции, экстракорпорального оплодотворения, репродуктивных технологий, экспериментальных работ со стволовой клеткой, гистологических и морфологических исследований. Деятельность ЦНМТ СО РАН Результатом научно-практической деятельности ЦНМТ СО РАН стали разработка и внедрение технологии «Молекулярно-генетическая методика оценки риска предрасположенности к тромбозу», генетическая паспортизация (определение 110 полиморфизмов генов системы гемостаза, предрасположенности к онкологическим, эндокринным, сердечно-сосудистым заболеваниям и др.). В центре проводятся экспериментальные работы по стимуляции ангиогенеза на основе клеточных технологий. Выполняются уникальные операции по технологиям SILS, NOTES (миниинвазивные хирургиче-ские вмешательства – доступ в брюшную полость через один порт или через естественные отверстия). Имеется самый большой в России опыт выполнения диагностических манипуляций и миниинвазивных оперативных методик лечения доброкачественных заболеваний молочной железы (тотальная вакуумная дрель-биопсия). Внедрены лазерные технологии оперативной коррекции заболеваний вен (эндовенозная лазерная коагуляция). Центр выполняет совместные научно-исследовательские работы с подразделениями СО РАН, СО РАМН, Минздравсоцразвития, Росмедтехнологий: • Новосибирский государственный университет; • ГОУ ВПО Новосибирский государственный медицинский университет Минздравсоцразвития России; • ФГУ Новосибирский научно-исследовательский институт патологии кровообращения им. акад. Е.Н. Мешалкина Росмедтехнологий; • • • • ФГУ Новосибирский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии Минздравсоцразвития России; Институт ядерной физики им. Г.И. Будкера СО РАН; Институт физики полупроводников им. А.В. Ржанова СО РАН; Научно-исследовательский институт клинической иммунологии СО РАМН. 216 ПОСТГЕНОМНАЯ МЕДИЦИНА научные результаты научные результаты а ПОСТГЕНОМНАЯ МЕДИЦИНА 217 б Постгеномная медицина. Научные результаты Разработка технологии управления процессами регенерации костных тканей с применением биодеградируемых полимеров 200 μm 20 μm в г д е И.В. Майбородин, А.И. Шевела, В.В. Морозов, Я.В. Новикова, В.Г. Куликов, К.С. Севостьянова Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск Целью данного проекта является изучение в эксперименте на лабораторных животных возможности применения полимеров на основе полигидроксиалканоатов (ПГА) в качестве носителей для стволовых клеток костномозгового происхождения (СК) и разработка основ технологий для ускорения процессов заживления костных дефектов. В эксперименте создан дефект костной ткани, в который были введены аутологичные СК различными способами: 1) непосредственно взвесь СК в культуральной среде (контроль); 2) СК на матрице из ПГА, созданного в Институте биофизики СО РАН (г. Красноярск) (опыт). После операции с последующим заполнением дефекта кости нижней челюсти суспензией СК в культуральной среде происходит ускорение репаративных процессов, приводящее к тому, что уже на 2-й неделе в костной мозоли присутствуют структуры красного костного мозга. Однако, согласно результатам денситометрии кости нижней челюсти крыс спустя 4 и 5 недель после операции, плотность тканей в дефекте на фоне применения СК меньше, чем при естественном ходе репаративного процесса, что обусловлено прогрессивным развитием полостей со структурами красного костного мозга. После применения матриксов из ПГА в течение всего эксперимента сохранялось неизменным от- верстие в кости, где находился сам полимер. Признаков консолидации ПГА с краем дефекта кости ни в одном случае не было. Во все сроки наблюдения происходит активное образование костной ткани между краем дефекта и матриксом, сам матрикс непосредственно инкапсулируется фиброзной тканью с большим числом клеточных элементов. Свидетельства деградации искусственного материала на все сроки эксперимента отсутствуют, также нет признаков формирования гигантских клеток инородных тел по краю матрикса. Плотность тканей в дефекте практически постоянна и меньше относительно состояния интактной кости, что связано с присутствием инородного тела. Полученные данные указывают на выраженную биоинертность используемого полимера. Прочность поврежденных тканей после применения ПГА остается сниженной за счет соединительнотканной капсулы между полимером и краем кости. Впервые в нашей стране проведено сравнительное исследование процессов регенерации в участке повреждения кости нижней челюсти на фоне введения суспензии СК и после имплантации ПГА. После операции с последующим заполнением дефекта суспензией СК в культуральной среде происходит резкое ускорение репаративных процессов и уже на второй неделе в костной мозоли присутствуют структуры красного костного мозга, но прочность кости при этом снижается (рис. в, г). 200 μm 100 μm Рис. Световая микроскопия поврежденного участка кости нижней челюсти крыс после различных методов влияния на репаративный процесс. Окраска гематоксилином и эозином. а – результаты применения СК спустя 2 недели после операции. Отверстие нижней челюсти полностью замещено слившимися островками молодой костной ткани со сформированными структурами красного костного мозга между ними; б – фрагмент рис. 1, а. Полость со структурами красного костного мозга, в котором на некоторых участках присутствуют большие многоядерные клетки – мегакариоциты (указано стрелкой); в и г – макропрепараты фрагментов нижней челюсти крысы через 3 недели после создания дефекта кости и заполнения его полимерным матриксом, матрикс без признаков деградации и консолидации, выпавший из дефекта при удалении жевательных мышц; д – искусственно созданное отверстие кости нижней челюсти с признаками регенерации костной ткани на периферии и фиброзной капсулой вокруг выпавшего матрикса из ПГА в центре через 1 неделю после операции; е – спустя 4 недели после операции и применения ПГА отверстие в кости нижней челюсти сохраняется. Между ним и неповрежденной костью расположены разные по размерам островки молодой кости с множеством крупных кровеносных сосудов. Консолидации этих островков в кость, структуры хряща или костной мозоли нет. 218 ПОСТГЕНОМНАЯ МЕДИЦИНА научные результаты научные результаты Фундаментальные основы клеточных технологий для регенеративной медицины ПОСТГЕНОМНАЯ МЕДИЦИНА Репрограммирование дифференцированных соматических клеток к плюрипотентному состоянию и перспективы заместительной клеточной терапии И.В. Майбородин, А.И. Шевела, В.В. Морозов, В.А. Матвеева, Я.В. Новикова, В.Г. Куликов, К.С. Севостьянова Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск С.П. Медведев, Е.В. Григорьева, А.А. Малахова, А.И. Шевченко, Е.В. Дементьева, С.М. Закиян Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск Целью данного проекта является изучение возможностей применения стволовых клеток для ускорения регенерации различных тканей организма, в частности костной ткани. В экспериментах на животных морфологическими и рентгенологическими методами исследованы результаты использования различных способов доставки аутологичных стволовых клеток костномозгового происхождения (непосредственно в культуральной среде, в фибриновом сгустке) в искусственно созданный дефект плоской и трубчатой костей, а также в повреждения суставного хряща. При проведении гистологического исследования образцов материала было найдено, что при использовании фибрина с СК для замещения дефекта кости были получены наилучшие результаты. Через 1 неделю отверстие в кости нижней челюсти было на большом протяжении заполнено сформированной костной тканью. Наиболее вероятно, что в данном случае суммируется или даже потенцируется влияние и фибрина, и клеточных технологий на репаративную регенерацию участка повреждения кости нижней челюсти, которая проходит значительно ин- а б тенсивнее, чем в условиях введения только фибрина или только СК. Видимо, образование кости в данных случаях начинается с середины дефекта, а не с краев. Стволовые клетки в фибриновом сгустке располагаются в объеме и равномерно выполняют весь дефект. В результате всего этого достигается максимально быстрое и успешное восстановление дефекта костной ткани. Впервые в нашей стране проведено сравнительное исследование процессов регенерации в участке и повреждения кости нижней челюсти крыс при естественном заживлении после применения фибринового сгустка на фоне введения суспензии СК и после применения фибрина с адсорбированными СК. Доказано, что при использовании фибринового сгустка с адсорбированными СК для замещения дефекта кости получены наилучшие результаты (рис.). Через 1 неделю отверстие в кости нижней челюсти было на большом протяжении, до 3/4 диаметра, заполнено сформированной костной тканью, так как образование кости в этих случаях начинается с середины дефекта, а не только с краев. По результатам денситометрии у животных этой группы отмечена максимальная плотность кости в участке повреждения. в Проведены эксперименты по получению индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) из фибробластов кожи и нейральных стволовых клеток плода человека (ФНСК) (рис.). Впервые удалось получить ИПСК с помощью сверхэкспрессии одного гена – Oct4– без интеграции плазмидного вектора в геном клетки. Полученные ИПСК обладают всеми свойствами плюрипотентных клеток и могут дифференцироваться в производные всех трех зародышевых листков (эктодермы, мезодермы и энтодермы), т. е. потенциально могут давать любые клетки, из которых состоит тело взрослого человека. Успешно проведены эксперименты по направленной дифференцировке полученных ИПСК в хондробласты (клетки хрящевой ткани), а также получены фрагменты хрящевой ткани in vitro. Поражения хрящевой ткани, связанные с возрастными изменениями и травмами, являются одними из наиболее распространенных болезней опорно-двигательного аппарата. Полученные клетки могут быть удобной моделью для исследования заболеваний на клеточном и молекулярном уровнях, а также потенциально могут быть источником материала для заместительной клеточной терапии. Рис. Получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) из фетальных нейральных стволовых клеток (ФНСК) и последующая дифференцировка ИПСК в производные трех зародышевых листков. β-III-тубулин г ФНСК Репрограммирование ИПСК Дифференцировка коллаген 1 нестин Рис. Данные радиовизиографического исследования участка повреждения кости нижней челюсти крыс через 5 недель после различных методов влияния на репаративный процесс (искусственно созданное отверстие указано стрелками). а – естественный ход регенерации, плотность тканей приближается к таковой на соседних участках; б – после применения фибринового сгустка плотность тканей в дефекте выше, чем при естественном заживлении; в – на фоне введения СК плотность тканей меньше, по сравнению с состоянием при естественной репарации и после применения клеток на предыдущий срок, само отверстие в кости шире; г – в результате использования фибринового сгустка с СК дефект тканей практически отсутствует. OCT 4 α-фетопротеин 219 220 ПОСТГЕНОМНАЯ МЕДИЦИНА научные результаты научные результаты Молекулярные механизмы перепрограммирования эпигенотипа дифференцированных клеток О.Л. Серов Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск Основным направлением работы лаборатории генетики развития ИЦиГ СО РАН является изучение молекулярных механизмов репрограммирования геномов дифференцированных клеток под влиянием генома эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) в гибридных клетках. Основные достижения в расшифровке механизмов репрограммирования геномов дифференцированных клеток следующие. • Впервые показано, что гибридные клетки типа «диплоидная ЭСК–диплоидный фибробласт», имеющие околотетраплоидный кариотип, способны генерировать химерных эмбрионов (рис. 1, а) и даже взрослых животных (рис. 1, б). Впервые установлено, что тетраплоидный кариотип – сумма хромосом ЭСК и фибробластов – сохраняется в процессе развития химер. Таким образом, выявлено полное доминирование генома ЭСК в гибридных клетках. Установлено, что репрограммирование начинается на стадии гетерокариона, когда ядра родительских клеток присутствуют раздельно в общей цитоплазме. • Впервые выявлено, что на стадии гетерокариона происходит альтернативное доминирование, т. е. присутствуют два типа гетерокарионов: 1 – с фенотипом ЭСК (позитивны по белкам «плюрипотентности» Oct4 и Nanog, негативны по коллагену, фибронектину и ламину А/С, свойственным фибробластам), и 2 – с фенотипом фибробласта (позитивны по коллагену, фибронектину, ламину А/С, негативны по Oct4 и Nanog). Оба типа гетерокарионов дают начало развитию двух типов гибридных клеток с альтернативными фенотипами – либо типа ЭСК, либо фибробласта. • Анализ метилирования CpG-сайтов в промоторе гена Oct4 показал, что в гибридных клетках с фенотипом ЭСК происходит деметилирование «фибробластного» аллеля, тогда как в гибридных клетках с фибробластным фенотипом происходит гиперметилирование аллеля ЭСК (рис. 2). Процесс метилирования/деметилирования завершается к 4-му дню после слияния ЭСК и фибробластов. Итогом исследований является расшифровка тайминга репрограммирования в гибридных клетках (рис. 3). Установлено, что репрограммирование начинается со стадии гетерокариона и завершается к 5–7-му дням после слияния ЭСК с соматическими клетками к моменту появления первичных колоний гибридных клеток. Таким образом, слияние ЭСК с соматическими является эффективным способом репрограммирования геномов дифференцированных клеток. В целом полученные данные важны в понимании процессов перепрограммирования геномов дифференцированных клеток и способствуют разработке прямого перепрограммирования соматических клеток для получения пациент-специфичных плюрипотентных клеток, перспективных для применения в регенеративной медицине. а в ЭСК клетки M. musculus (1 %) Фибробласты M. caroli (42 %) б Фибробластоподобные гибридные клетки г ЭСК-подобные гибридные клетки M. musculus M. caroli 1% 27 % M. musculus 2% M. caroli 53 % 47 % 57 % 60 % 64 % 48 hrs 1% 7% 48 hrs 48 days Рис. 2. Метилирование промотора гена Oct4 в ЭСК (а) и фибробластах M. caroli (б). В скобках – метилирование,%; в – метилирование родительских аллелей в гибридных клетках с фенотипом ЭСК через 48 и 96 ч после слияния и г – в гибридных клетках с фенотипом фибробласта. Светлые кружки – неметилированные CpG-сайты, темные – метилированные. ЭСК Фибробластоподобные гибридные клетки Фибробластоподобные гетерокарионы Гиперметилирование промоторов генов Oct4 и Nanog Слияние Конечный фенотип гибридных клеток Деметилирование промоторов генов Oct4 и Nanog б а ПОСТГЕНОМНАЯ МЕДИЦИНА Фибробласты 0 ЭСК-подобные гетерокарионы 1 2 ЭСК-подобные гибридные клетки 3 4 5 6 7 Дни Рис. 3. Схема тайминга образования гетерокарионов и гибридных клеток, формирования их альтернативных фенотипов и «закрепление» репрограммирования посредством эпигенетических механизмов (метилирование/деметилирование). 1000 μm Рис. 1. Химеры, полученные инъекцией гибридных клеток ЭСК-фибробласт (клон tef4) с околотетраплоидным набором хромосом. а – 11-дневный эмбрион с высоким содержанием потомков гибридных клеток, меченных GFP (зеленое свечение); б – взрослый самец tef4#7-48 с ярко выраженным химеризмом по окраске (Kruglova et al., 2008). 221 222 ПОСТГЕНОМНАЯ МЕДИЦИНА научные результаты научные результаты Метаболомные подходы в лечении тромбозов и персонализированной терапии А.А. Черноносов, Г.И. Лифшиц, Г.А. Цветовская, М.Л. Филипенко, О.С. Фёдорова Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск 10-OH OH 6-OH 7-OH O 1 8-OH литов в плазме крови (рис. 1), что позволяет не только проследить скорость метаболизма варфарина в целом, но и более подробно изучить пути его превращения в каждом конкретном случае. Это дает возможность выяснить, какие ферменты или каскады ферментов отвечают за переработку лекарства у данного пациента. Масс-спектрометрический анализ варфарина и его метаболитов, извлеченных из плазмы крови, проводится на приборе Agilent 6410 Triple Quard LC/MS. Фармакокинетика варфарина исследуется путем отбора у добровольцев проб крови объемом по 5 мл через 1, 2, 3, 8, и 24 часа после приема варфарина. В исследовании участвуют как здоровые добровольцы, не принимающие варфарин, так и пациенты, которые принимают варфарин постоянно по предписанию врача. На основе данных, полученных при обследовании 40 человек, установлено, что можно выделить как минимум три группы пациентов: с быстрым, средним и медленным типами метаболизма варфарина (рис. 2). Сопоставление с генотипами генов VKORC1 и CYP2С9 пациентов показывает, что в большей степени имеется корреляция с генотипом VKORC1. Таким образом, использование метаболомного подхода в сочетании с генотипированием позволяет создать комплексный метод персонализированного подбора дозы варфарина у пациентов с тромбоэмболическим синдромом. * Варфариновый спирт H 100 323 9 4’-OH 6 -OH 7 -OH 8 -OH 10-OH метаболиты 4’-OH O Варфарин 309 Варфариновый спирт Варфарин 304 3 06 308 310 31 2 150 314 200 31 6 3 18 m/z 32 0 32 2 3 24 250 326 300 Рис. 1. Строение варфарина (m/z 307) и его метаболитов: варфаринового спирта (m/z = 309), 4-, 6-, 7-, 8-, 10гидроксиварфаринов (m/z = 323) и масс-спектр их смеси. 220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 -20 -0,5 0 223 O 307 Варфарин, нг/мл Целью проекта является разработка способа персонализированного подбора дозы антикоагулянтного препарата варфарина на основе масс-спектрометрического анализа плазмы крови. Варфарин является антикоагулянтом непрямого действия, который назначается при терапии и профилактике различных тромбозов, инфарктов, при протезировании клапанов сердца. Данное исследование направлено на быструю характеризацию малых молекул-метаболитов, синтезируемых в организме человека или попадающих в качестве лекарств. Предлагаемый метаболомный подход призван решить проблему подбора дозы варфарина при нестабильном МНО (показатель, на основе которого в настоящее время производится подбор дозы препарата), наблюдаемом у значительной части пациентов. В проекте одновременно решаются две разноплановые задачи: первая – подбор эффективной дозы варфарина для конкретного больного, вторая, в сочетании с результатами генотипирования больных, – создание базы данных и поиск взаимосвязи между фармакокинетическими параметрами и генотипом пациента. Масс-спектрометрическим методом проводится определение концентрации варфарина его метабо- ПОСТГЕНОМНАЯ МЕДИЦИНА 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 Время, ч Рис. 2. Примеры фармакокинетики варфарина у пациентов с быстрым ( ), средним ( ) и медленным ( ) метаболизмом варфарина. 350 224 ПОСТГЕНОМНАЯ МЕДИЦИНА научные результаты научные результаты Геномный подход к персонализированной терапии непрямыми антикоагулянтами Г.И. Лифшиц, Я.В. Новикова, Н.В. Кох, Г.А. Цветовская, А.А. Слепухина, А.В. Белеванцева Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск Целью настоящей работы являются: – оценка вклада генетических маркеров в изменение терапевтической дозировки непрямого антикоагулянта варфарина для пациентов ЗападноСибирского региона России; – изучение частоты встречаемости полиморфизмов генов CYP2C9, VKORC, CYP4F2 в данной группе пациентов. Непрямые антикоагулянты (варфарин) применяются для профилактики тромбозов у возрастающего количества пациентов во всем мире. Режим дозирования варфарина устанавливается при помощи лабораторного контроля терапии – показателя международного нормализованного отношения (МНО). Основной побочный эффект передозировки – кровотечения различной степени тяжести. Средовые факторы объясняют 17 % вариабельности терапевтической дозы варфарина и около 50 % составляют генетические факторы, участвующие в метаболизме препарата. Показано, что предварительное генетическое тестирование для индивидуализации подбора дозы позволяет снизить частоту больших и малых кровотечений в период индукции (Gage, 2008; Wu, 2008). В России подбор дозы варфарина продолжает осуществляться эмпирически, без учета генетических особенностей метаболизма. В настоящее исследование вошли пациенты Западно-Сибирского региона, принимающие варфарин более 1 года. Эффективность подобранной дозы оценивалась на основании МНО. Носительство аллельных вариантов генов определялось с помощью полимеразной цепной реакции. При анализе полиморфных вариантов CYP2С9 суммарный процент медленных аллелей в нашей выборке оказался несколько ниже, чем в европейских популяциях. Нами не получено достоверных различий подобранной дозы варфарина в зависимости от генотипа CYP2C9. С учетом генотипа VKORC1 при носительстве медленных аллелей CYP2C9*2, *3 наблюдалась тенденция к уменьшению средней суточной дозы. При носительстве аллеля А гена CYP4F2 индивидуальная доза увеличивалась на 8 % (Caldwell, 2008). Не получено достоверных различий в ежедневной дозе варфарина у гетерозигот и гомозигот по аллелю G гена CYP4F2. Наиболее частым генотипом гена VKORC в нашем исследовании был гетерозиготный вариант С/Т. Получены достоверные отличия средних ежедневных доз варфарина в зависимости от генотипа VKORC (рис.): для пациентов с генотипом СС средняя доза составила 7,4 + 2,3 мг, с генотипом СТ – 5,0 + 2,0 мг, с генотипом ТТ – 3,1 + 0,9 мг (p(CC-CT) = 5*10–6, p(CT-TT) = 0,005, p(CC-TT) = 10–6). В результате исследования впервые в рамках геномного подхода к персонализированной медицине у пациентов Западно-Сибирского региона проанализированы частоты встречаемости полиморфизмов генов, участвующих в метаболизме непрямых антикоагулянтов. Показано, что наибольший вклад в подбор терапевтической дозировки варфарина в западносибирской популяции вносит генотип VKORC1. 16 Median 25%–75% Min-Max 14 12 10 8 6 4 2 0 CC CT TT Рис. Оптимальная суточная доза варфарина у пациентов Западно-Сибирского региона с различными генотипами С+1173T VKORC1. ПОСТГЕНОМНАЯ МЕДИЦИНА Диагностика тромбофилических состояний – артериальных и венозных тромбозов на стадии предболезни А.И. Шевела, Г.А. Цветовская, Я.В. Новикова, К.С. Севостьянова, В.Г. Куликов, С.В. Ненарочнов, А.А. Махотин, Е.Д. Чикова Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск Целью работы является изучение механизмов развития рецидивирующих тромбозов – выявление «генов риска», формирующих предрасположенность к мультифакториальным заболеваниям и тромботическим в том числе. Проводится комплексное исследование венозной крови больных, включающее оценку функционального состояния системы гемостаза и анализ генов-кандидатов, ассоциированных с тромбофилией у пациентов ЗападноСибирского региона. Уделяется внимание лабораторной оценке дисфункции эндотелия у больных с верифицированным диагнозом тромбозов различной локализации. Путем определения в крови эндотелиальных факторов системы фибринолиза – ингибитора активатора плазминогена (PAI1), а также уровня гомоцистеина в комбинации с генами риска развития тромбофилии оценивается состояние коагуляционного тромбоцитарнососудистого звена, активность системы фибринолиза – одного из важных звеньев системы гемостаза. В лаборатории обследуются пациенты, принимающие непрямой антикоагулянт варфарин. Разрабатывается алгоритм режима дозирования варфарина на основе определения международного нормализованного отношения (МНО), результатов генотипирования пациентов по CYP2C9 (*2 и *3), CYP4F2, VKORC1, кодирующих ферменты –«метаболизеры» варфарина. Впервые определены частоты встречаемости аллельных вариантов генов, определяющих метаболизм варфарина у пациентов – жителей Западной Сибири. Частоты аллелей и генотипов в данном регионе отличаются от таковых, полученных в других регионах России. Полученные данные используются в практической медицине с целью: • определения чувствительности пациентов к данному антикоагулянту; • выяснения причин резистентности или повышенной чувствительности при подборе доз антикоагулянта у проблемных пациентов. Индивидуальный режим дозирования варфарина способствует ускорению подбора дозы для достижения целевых значений МНО, снижению риска геморрагических осложнений и частоты развития чрезмерной гипокоагуляции (кровотечений). Данные, полученные с использованием молекулярно-биологических методов, позволяют определять факторы, оказывающие влияние на развитие патологического процесса, выявлять патологию на стадии предболезни, осуществлять поиск патогенетически обоснованных методов профилактики и лечения и, тем самым, снижать риск тромботических осложнений – повторных эпизодов тромбоза глубоких вен и ТЭЛА. Показано, что вопрос о приемлемости контрацепции и заместительной гормональной терапии не может решаться без генетического тестирования пациенток с целью выявления наследственной предрасположенности к тромбозам. Эти вопросы не могут быть решены и при тестировании ограниченного числа наиболее изученных генов, считающихся безусловными и строгими маркерами наследственной тромбофилии (F.V, F П, MTHFR- С677Т). Для выяснения механизмов развития наследственной тромбофилии доказана необходимость тестирования генов, кодирующих все звенья системы гемостаза и фолатного цикла. 225 226 ПОСТГЕНОМНАЯ МЕДИЦИНА научные результаты научные результаты Скрининг метаболических расстройств у детей 227 Противоопухолевый препарат на основе пептида молока человека – лактаптина И.В. Алексеева, А.А. Черноносов, О.С. Фёдорова Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск Метод тандемной масс-спектрометрии (ES-MS/MS) открывает новые возможности для идентификации анализа наследственных заболеваний, связанных с нарушением метаболизма амино-, органических и жирных кислот. С помощью данного метода путем анализа сухого пятна крови диаметром 5 мм можно определять более 40 заболеваний, затрачивая на каждый анализ в целом не более 3 часов. Определение состава метаболитов можно проводить уже на 2–3-и сутки с момента рождения (при традиционных методах анализ проводится на 5–7-е сутки) и в случае обнаружения отклонений от нормы назначать необходимое лечение в кратчайшие сроки. Проект направлен на использование современных методов масс-спектроскопии для диагностики метаболических расстройств у детей. Хотя каждый тип метаболических расстройств встречается редко и составляет 0,001–0,01 % от числа новорожденных, однако в сумме они дают очень заметную величину. Своевременное обнаружение этих расстройств даст существенный социальный и экономический эффект. В данной работе использовался-массспектрометр Agilent 6310 Triple Quard LC\MS (Agilent Technologies, USA). Исследуемые образцы крови, высушенные на химически инертной бумаге (Whatman 903, Whatman Inc., NJ, USA), экстрагировали метанолом, содержащим в качестве внутренних стандартов известные концентрации изотопномеченных аминокислот и ацилкарнитинов. Затем проводили дериватизацию проб смесью бутанол-HCl при нагревании для перевода анализируемых молекул в бутиловые эфиры. Исследованы образцы крови более 200 детей, в том числе новорожденных, проходящих лечение в ряде медицинских учреждений г. Новосибирска. Подтверждено наличие фенилкетонурии у 11 пациентов, у 20 обнаружена цитруллинурия, у 10 – гиперметионинемия, у 95 выявлены нарушения метаболизма органических кислот и другие заболевания. Часто метаболические нарушения носят комплексный характер, т. е. одновременно имеются нарушения метаболизма и аминокислот, и органических и/или жирных кислот. ПОСТГЕНОМНАЯ МЕДИЦИНА В.А. Рихтер Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск 2 Pro 1 Phe 1,8 1,6 1,4 Val 1,2 1 0,8 0,6 Leu+lle Met Met Ser 0,2 Phe Leu+lle Val 0,4 Tyr Tyr 0 2 Pro 2 Phe 1,8 1,6 1,4 1,2 1 Phe Val 0,8 0,6 Ala 0,4 Ala 0,2 Val Ser Leu+lle 0 2 Tyr Met 3 Tyr Phe 1,8 1,6 Phe 1,4 1,2 Pro 1 0,8 0,6 Val 0,4 Ala Ala 0,2 Val Leu+lle 0 Целью проекта является разработка принципиально нового противоопухолевого препарата на основе пептида человеческого молока лактаптина. Мы обнаружили, что в человеческом молоке содержится пептид, вызывающий апоптоз клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF-7. Этот пептид был очищен до гомогенного состояния, и его структура была установлена с использованием MALDI-TOF спектрометрии. Было установлено, что обнаруженный нами пептид является протеолитическим фрагментом каппа-казеина человека длиной 74 аминокислотных остатка и имеет молекулярную массу около 8,6 кДа (рис.). Учитывая происхождение пептида и его апоптотические свойства, мы его назвали лактаптином (Власов и др., 2008, Некипелая и др., 2008). Были созданы штаммы-суперпродуценты генно-инженерных аналогов лактаптина, получены рекомбинантные аналоги лактаптина и проведен сравнительный анализ их действия на культивируемые раковые клетки различного тканевого происхождения (Тикунова и др., 2010; Фомин и др., 2010; Semenov et al., 2010). Для дальнейших исследований был выбран обладающий большей цитотоксической активностью аналог лактаптина RL2. Структура RL2 была подтверждена методом ограниченного трипсинолиза с последующим анализом продуктов методом MALDI-TOF спектрометрии. Установлено, что RL2 подавляет жизнеспособность онкотрансформированных клеток и не влияет на жизнеспособность «здоровых» клеток организма человека. Для установления механизма действия лактаптина были определены клеточные белки, взаимодействующие с RL2. Для этого проводили аффинную хроматографию лизатов клеток MCF-7 на сорбенте с иммобилизованным RL2. Хроматографические фракции разделяли электрофорезом с последующей окраской геля Coomassie Brilliant Blue. Белки, связавшиеся с RL2, гидролизовали трипсином. Далее проводили масс-спектрометрический анализ фрагментов трипсинолиза белков из геля. Белки идентифицировали с использованием базы данных SwissProt при помощи интернет-ресурсов Mascot Peptide Mass Fingerprint и MS-Fit. Было установлено, что с RL2 взаимодействуют белки цитоскелета: α- и β-цепи тубулина (строительный компонент микротрубочек веретена деления) и α-актинин-1 (структурный белок актиновых филаментов). Таким образом, из молока человека выделен и охарактеризован лактаптин – пептид, обладающий апоптотической активностью. Получены рекомбинантные аналоги лактаптина, на основе которых разрабатывается принципиально новый противоопухолевый препарат. Рис. 1. Масс-спектры экстракта крови здорового ребенка (1), новорожденных с фенилкетонурией (2) и (3). Спектры записаны в режиме «нейтральных потерь» (NL 102 m/z), внутренние стандарты изотопномеченных аминокислот обозначены полужирным шрифтом с подчеркиванием. 1 1 C0 0,8 0,6 |--ɫɢɝɧɚɥɶɧɵɣ ɩɟɩɬɢɞ-| |------------------------------ɥɚɤɬɚɩɬɢɧ---------------------------------| MKSFLLVVNALALTLPFLAVEVQNQKQPACHENDERPFYQKTAPYVPMYYVPNSYPYYGTNLYQRRPAIAINNPYVPRTYYANPAVVRPHAQIPQRQYLPNSHPPTVVRRPNLHPSFIAIPPKKIQDKIIIPTINTIATVEPTPAPATEPTVDSVVTPEAFSESIITSTPETT TVAVTPPTA C8 C4 C2 C2 C 0,2 0 5 C16 C0 0,4 4 C14 C5 C3 /C4.0,3 3 C3 C C8 4 C0 C /C .0,3 3 4 2 C5 C12 C16 C14 C18:1 C16 C8 Рис. Лактаптин и его генно-инженерные аналоги. 3 2 1 0 C0 C4 C2 C 2 C C3 C 4 3 C8 |--------------ɮɪɚɝɦɟɧɬ I, ɤɥɨɧɢɪɭɟɦɵɣ ɜ ɤɥɟɬɤɚɯ ɦɥɟɤɨɩɢɬɚɸɳɢɯ------------| |---ɮɪɚɝɦɟɧɬ II, ɤɥɨɧɢɪɭɟɦɵɣ ɜ ɤɥɟɬɤɚɯ ɦɥɟɤɨɩɢɬɚɸɳɢɯ-----| |----------------ɮɪɚɝɦɟɧɬ III, ɤɥɨɧɢɪɭɟɦɵɣ ɜ ɤɥɟɬɤɚɯ ɦɥɟɤɨɩɢɬɚɸɳɢɯ------------| |----------------------------------ɮɪɚɝɦɟɧɬ IV, ɤɥɨɧɢɪɭɟɦɵɣ ɜ ɤɥɟɬɤɚɯ E.coli--------------------------------| |--------------ɮɪɚɝɦɟɧɬ V, ɤɥɨɧɢɪɭɟɦɵɣ ɜ ɤɥɟɬɤɚɯ E.coli-------------------| C14 C16 Рис. 2. Масс-спектры экстракта крови ребенка с диагнозом метилмалоновая ацедимия (1) и здорового ребенка (2). Спектры записаны в режиме «продукт ион» (Prod. Ion 85 m\z), внутренние стандарты изотопномеченных ацилкарнитинов обозначены полужирным шрифтом с подчеркиванием. 228 ПОСТГЕНОМНАЯ МЕДИЦИНА научные результаты Летучие соединения в выдыхаемом воздухе и слюне при разном морфофизиологическом состоянии людей А.Н. Бабко Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск М.П. Мошкин Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск 9 хроматографических пиков, а в слюне – 8. Шесть из них присутствовали в обоих субстратах и высоко достоверно коррелировали между собой. Содержание ацетона в выдохе находилось в обратной зависимости от возраста испытуемого (rs = –0,61, p < 0,001) и индекса массы тела (rs = –0,64, p < 0,001). Поскольку ацетон образуется при β-окислении липидов, то его снижение в выдохе более упитанных лиц старшего возраста свидетельствует о пониженном использовании липидов в энергетических циклах. Содержание легких углеводородов в слюне при операционном стрессе. У пациентов, назначенных на плановые операции, в первый день собирали образцы слюны утром натощак, за 1 час до операции (12–13 ч) и через 3–4 часа после операции. Во второй день пробы собирали утром натощак. Амплитуды ряда хроматографических пиков изменялись после хирургического вмешательства (см. рис.), в частности статистически значимо возрастало содержание ацетона в слюне. Полученные результаты позволяют сделать вывод об эффективности «искусственного носа» для оценки изменения метаболизма при разном морфофизиологическом состоянии людей. 250 200 Ацетон, у.е. Проведены исследования возможности выявления маркеров – летучих соединений, информативных при оценке физиологических и патологических состояний у человека, – эксперименты проводились с использованием прибора Bloodhound-214ST, позволяющего оценивать изменения метаболизма в условиях патологических процессов. Легкие углеводороды в выдыхаемом воздухе и факторы риска метаболических нарушений. В исследовании, проведенном на студентах Новосибирского государственного медицинского университета, выявлены половые различия в сопряженной с факторами риска изменчивости концентраций выдыхаемых углеводородов (С2–С3). Особый интерес представляют изменения уровня ацетона при разных факторах риска. У мужчин его содержание отрицательно коррелировало со склонностью к ожирению. У курящих женщин величина ацетонового пика была почти вдвое больше, чем у некурящих. Факторы риска возрастных нарушений обмена веществ отражаются на содержании легких углеводородов в выдыхаемом воздухе задолго до клинических проявлений метаболического синдрома. Корреляция содержания углеводородов в выдыхаемом воздухе и слюне. Состав выдыхаемого воздуха изменяется в течение нескольких часов даже при хранении в плотных тедларовых мешках. Проще хранить замороженные образцы слюны. Для оценки корреляций углеводородных профилей в этих средах было проведено исследование на условно здоровых добровольцах разного пола и возраста. Выдыхаемый воздух собирали в тедларовые мешки и анализировали сразу после сбора. Затем получали образцы слюны, которые хранили при –20 °С в течение 3 суток. В выдыхаемом воздухе было выделено 150 100 50 0 Утро (день 1) Перед операцией После операции Утро (день 2) Рис. Содержание ацетона в слюне пациентов до и после хирургической операции. Различия между средними значениями до операции достоверно отличаются от таковых после операции (p < 0,05, LSD тест).
