Остапчук Е.О

АННОТАЦИЯ
Диссертации на соискание ученой степени доктора философии (PhD)
по специальности 6D060700-Биология
Остапчук Екатерины Олеговны
«Функциональные и фенотипические особенности NK- и Трегуляторных клеток при раке молочной железы»
Общая характеристика работы
Работа посвящена изучению натуральных киллерных (NK) и Трегуляторных (Treg) клеток, их субпопуляционного состава, функциональной
активности, а также их сравнительному анализу в норме и при раке молочной
железы (РМЖ).
Актуальность темы исследования
По данным Всемирной Организации Здравоохранения РМЖ является
наиболее распространѐнным видом рака у женщин, занимающим к тому же
первое место по числу смертности от злокачественных новообразований среди
женского населения во всем мире, включая Казахстан. Не смотря на
многочисленные исследования и впечатляющий прогресс в диагностике и
лечение РМЖ, традиционная терапия (хирургическое вмешательство,
химиотерапия и/или лучевая терапия) не всегда оказывается эффективной для
значительной части больных, у которых наблюдаются рецидивы РМЖ,
приводящие в конечном итоге к смерти.
Противоопухолевый иммунный ответ выглядит достаточно сложным.
Сложность эта связана с тем, что иммунные клетки могут подавлять рост и
развитие опухоли, распознавая и убивая раковые клетки, но также могут
способствовать выживаемости и росту опухолевых клеток, стимулируя
ангиогенез и хроническое воспаление в опухолевой ткани. Лимфоциты, в том
числе NK-клетки и Treg-клетки, инфильтрируют опухоль, где находятся в
тесном взаимодействии с опухолевыми клетками, и вносят существенный вклад
в подавление противоопухолевого иммунитета. Если Treg-клетки признаны
одним из основных компонентов иммуносупрессорного пула иммуноцитов, то
существование регуляторной (супрессорной) субпопуляции среди NK-клеток
до сих пор только предполагалось, но еще не было показано.
Treg-клетки играют одну из ключевых ролей в подавлении
противоопухолевого иммунного ответа и развитии злокачественных опухолей.
Согласно результатам многих исследований, у пациентов со злокачественными
новообразованиями, в том числе и у больных раком молочной железы (РМЖ),
содержание Treg-клеток увеличено как в периферической крови, так и в
опухолевой ткани, что коррелирует со стадией рака и низкой выживаемостью
пациентов. Возрастание численности Treg-клеток рассматривается в качестве
одной из причин неэффективности иммунной защиты при опухолевом росте, а
при их элиминации, как было показано в экспериментах на мышах, происходит
отторжение или уменьшение размеров опухоли.
Несмотря на то, что негативный вклад Treg-клеток в развитие
онкологических заболеваний считается доказанным, до сих пор существует
много вопросов по поводу функциональной активности и фенотипических
характеристик их различных субпопуляций и их роли в развитии РМЖ.
Известно, что Treg-клетки как образованные в тимусе, названные
натуральными (nTreg), так и индуцированные на периферии (iTreg), обладают
значительной супрессорной активностью по отношению к функциям
эффекторных Т-лимфоцитов и других иммунокомпетентных клеток, вызывая
существенную иммуносупрессию в микроокружении опухоли. Однако, роль
некоторых субпопуляций Treg-клеток остается не изученной при
онкологических заболеваниях. В частности, представляет значительный
интерес вопрос о выявлении их субпопуляций, за счет которых повышается
общий пул Treg-клеток в опухоли. Этот вопрос важен для разработки
эффективных методов их удаления. Количественный состав и функциональная
активность основных субпопуляций Treg-клеток периферической крови
больных РМЖ до сих пор не изучены. Особую важность имеет изучение
механизмов активной миграции Treg-клеток в опухолевую ткань, значительную
роль
в
которых
отводят
способности
этих
клеток
связывать
высокомолекулярный гиалуронан, основной компонент межклеточного
матрикса. Таким образом, комплексный анализ основных субпопуляций Tregклеток, циркулирующих к периферической крови, при РМЖ крайне необходим
для раскрытия механизмов супрессии противоопухолевого иммунитета и
последующей разработки новых подходов к иммуноориентированной терапии
злокачественных заболеваний.
Натуральные киллерные клетки (NК) представляют собой один из
важнейших
компонентов
противоопухолевого
иммунитета.
Помимо
общеизвестной киллерной функции, у этих клеток к настоящему моменту
рядом исследований были обнаружены иммунорегуляторные свойства, что
привело к постановке вопроса о существовании особой регуляторной
субпопуляции NК-клеток. Иммунорегуляторную функцию клеток традиционно
связывают с продукцией цитокинов. Однако, такая NK-клеточная субпопуляция
пока не охарактеризована полностью и не изучена при онкологических
заболеваниях. Идентификация регуляторной субпопуляции NK позволит
расширить представления об иммунорегуляции при опухолевом процессе и
раскрыть механизмы подавления противоопухолевой активности эффекторных
NK и других иммунокомпетентных клеток.
Актуальность данной работы обусловлена важностью функции
иммунорегуляторных клеток в физиологии и патологии иммунной системы и
их ключевой ролью в патогенезе рака, а также принципиальной возможностью
их использования в качестве мишени для иммунотерапии этого заболевания,
нацеленной на коррекцию активности или количества иммуносупрессорных
клеток, что позволит обеспечить оптимальный терапевтический эффект
таргетной фармако- и иммунотерапии.
Цель исследования – изучить функциональные и фенотипические
характеристики субпопуляций NK- и T-регуляторных клеток здоровых доноров
и больных раком молочной железы
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
1. Изучить особенности субпопуляций nTreg- и iTreg-клеток
периферической крови здоровых доноров и больных РМЖ;
2. Провести анализ содержания и продукции супрессорных цитокинов
HLA-G-экспрессирующими Т-клетками в периферической крови здоровых
доноров и больных РМЖ;
3. Изучить функциональные и фенотипические характеристики
гиалуронан-связывающей субпопуляции Treg-клеток в периферической крови
здоровых доноров и больных РМЖ;
4. Провести сравнительный анализ содержания и фенотипа IL-10- и TGF-βпродуцирующих NK-клеток периферической крови здоровых доноров и
больных РМЖ;
5. Изучить функциональные и фенотипические характеристики HLA-Gэкспрессирующих NK-клеток периферической крови здоровых доноров и
больных РМЖ.
Объектами исследования являлись NK- и Т-регуляторные клетки
периферической крови здоровых и больных раком молочной железы людей.
Предметом исследования были функциональные и фенотипические
характеристики данных клеток.
Методы исследования: иммуномагнитная сепарация, проточная
цитофлуориметрия,
иммунофлуоресцентный
сортинг,
изопикническое
центрифугирование, микроскопия, культивирование клеток, полимеразная
цепная реакция, иммуноферментный пятенный анализ.
Научная новизна
В результате проведенных исследований получены новые данные о
содержании и функциональной активности субпопуляций nTreg-клеток при
РМЖ. Впервые изучена функциональная активность субпопуляций iTregклеток периферической крови в норме и при РМЖ. Выявленные супрессорные
молекулы, экспрессирующиеся клетками различных субпопуляций iTregклеток, расширяют представления о механизмах их супрессорной активности.
Впервые показано, что уровень HLA-G-экспрессирующих Т-клеток в
периферической крови при РМЖ повышен по сравнению со здоровыми
донорами.
В ходе выполнения работы разработан метод выделения и оценки Tregклеток, связывающих молекулу высокомолекулярного гиалуронана, главного
компонента внеклеточного матрикса. Впервые установлено, что способность
связывать гиалуронан дискриминирует Treg-клетки преимущественно с
фенотипом CD4+CD25+FoxP3+ и обладающих повышенной супрессорной
активностью. Впервые установлено, что у больных РМЖ в периферической
крови соотношение Treg-клеток, связывающих и не связывающих гиалуронан,
выше, чем у здоровых доноров. Причем при РМЖ в гиалуронан-связывающей
фракции Treg-клеток наблюдается увеличение доли клеток, несущих маркер
супрессорной активности CD39, что свидетельствует о повышенной тропности
Treg-клеток с высокой супрессорной активностью к ткани опухоли,
содержащей высокий уровень свободного высокомолекулярного гиалуронана.
Впервые показано, что уровень циркулирующих в крови NK-клеток,
экспрессирующих супрессорные цитокины (IL-10 и TGF-β), повышен у
больных РМЖ по сравнению со здоровыми донорами. Впервые обнаружена и
описана иммуносупрессорная субпопуляция NK-клеток, экспрессирующих
супрессорную молекулу HLA-G, уровень которых повышен у больных РМЖ.
Установлено
супрессорное
влияние
регуляторных
NK-клеток
на
функциональную активность важнейших факторов противоопухолевого
иммунного ответа.
Научная и практическая значимость диссертационной работы
Данная работа вносит вклад в развитие фундаментальных аспектов
клеточной
и
молекулярной
онкоиммунологии.
Так,
обнаружение
иммунорегуляторной субпопуляции NK-клеток человека позволяет по-новому
посмотреть на природу NK-клеточного иммунитета, в том числе при
онкологическом процессе. Полученные данные позволяют предположить, что
важной причиной неэффективности противоопухолевого иммунного ответа при
РМЖ является повышенное содержание и функциональная активность NK- и
Тreg-клеток.
Прикладной потенциал исследования заключается в возможности
использования результатов данного исследования в разработке новых подходов
к ранней диагностике и иммунотерапии РМЖ.
В ходе выполнения исследования был разработан и внедрен в лабораторию
молекулярной иммунологии и иммунобиотехнологии Института молекулярной
биологии и биохимии им.М.А.Айтхожина ряд новых методов, в том числе
метод физического разделения клеток периферической крови на фракции,
связывающие и не связывающие молекулу высокомолекулярного гиалуронана,
а также метод проточной цитофлуориметрии применительно к оценке
супрессорной активности Treg-клеток и цитотоксичности NK-клеток с
использованием флуоресцентного красителя CFSE.
Положения, выносимые на защиту:
1. Впервые выявлено, что циркулирующая в периферической крови
здоровых людей субпопуляция наивных nTreg-клеток отличается большей
экспрессией маркера функциональной активности LAP от субпопуляций
эффекторных nTreg-клеток и клеток памяти, в то время как nTreg
эффекторы/клетки памяти отличаются от наивных nTreg-клеток большей
экспрессией CTLA-4. РМЖ характеризуется увеличением доли всех
циркулирующих субпопуляций nTreg-клеток и повышенным уровнем
экспрессии маркеров функциональной активности (GITR, LAP, CD39, IL-35);
2. Впервые
IL-17-продуцирующие
iTreg-клетки
(iTreg-17),
экспрессирующие маркеры функциональной активности LAP и GITR
обнаружены в периферической крови здоровых людей. У больных РМЖ
содержание CD25+ iTreg-17-клеток повышено в два раза, причем данные клетки
дополнительно приобретают экспрессию CTLA-4, CD39 и IL-35.
3. Впервые показано, что в периферической крови здоровых людей
циркулируют Tr1-клетки, экспрессирующие CD25, FoxP3, GITR, CTLA-4, LAP,
CD39 и IL-35. При РМЖ повышена доля циркулирующих Tr1-клеток,
экспрессирующих CD25, FoxP3, CD39 и IL-35;
4. Впервые обнаружено повышение доли циркулирующих HLA-G+ Тклеток, продуцирующих IL-10 при РМЖ;
5. Впервые выявлено, что фракция Т-клеток периферической крови
здоровых людей, связывающих высокомолекулярный гиалуронан содержит
больше Treg-клеток с фенотипом CD4+CD25+FoxP3+ и обладает повышенной
супрессорной активностью, чем не связывающая гиалуронан фракция. Также
обнаружено, что РМЖ характеризуется повышенным содержанием гиалуронансвязывающих Treg-клеток, экспрессирующих маркер функциональной
активности CD39;
6. Впервые обнаружена экспрессия супрессорной молекулы HLA-G
минорной субпопуляцией NK-клеток периферической крови здоровых людей.
HLA-G+ NK-клетки обладают регуляторными свойствами, выражающимися в
подавление цитолитической активности NK. В периферической крови больных
РМЖ увеличено содержание регуляторных NK-клеток, экспрессирующих HLAG, IL-10 и TGF-β.
Личный вклад автора
Автор работы участвовал в выборе концепции и объекта исследования,
определении цели работы, постановке задач исследования, а также в дизайне и
выполнение всех экспериментов, сборе и анализе полученных данных и
написании диссертационной работы.
Публикации
Основные результаты диссертационной работы отражены в 13 научных
трудах, включающих 4 статьи в журналах, рекомендованных ККСОН МОН РК
и 3 статьи в зарубежных журналах, 1 из которых имеют ненулевой импактфактор по версии Scopus и в 1 журнале издательства РАМН Российской
Федерации. Одна статья, принятая в печать зарубежным журналом, имеющим
импакт фактор 1,98 по версии Thomson Reuters. Также, полученные в ходе
исследования данные были представлены и опубликованы в материалах 5
международных научных конференциях в дальнем зарубежье.
Объем и структура диссертации
PhD диссертация изложена на 149 страницах, состоит из введения, обзора
литературных данных, раздела с описанием материалов и методов
исследования, 6 параграфов с изложением результатов исследований и их
обсуждения, заключения и списка использованных источников, включающего
346 источников зарубежных и отечественных авторов. Для лучшей наглядности
и удобства сравнения результатов исследования, работа иллюстрирована 35
рисунками и 4 таблицами.