Фенотипические и функциональные характеристики лейкоцитов

на правах рукописи
МИХАЙЛОВА
Валентина Анатольевна
Фенотипические и функциональные характеристики лейкоцитов
периферической крови и их микрочастиц при преэклампсии
14.03.03 - патологическая физиология
14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург
2015
2
Работа выполнена в лаборатории иммунологии с группой по диагностике СПИД
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О.
Отта».
Научные руководители:
Доктор медицинских наук, профессор
Сельков Сергей Алексеевич
Заведующий лабораторией иммунологии с группой по диагностике СПИД Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О.
Отта».
Доктор биологических наук
Соколов Дмитрий Игоревич
Ведущий научный сотрудник лаборатории иммунологии с группой по диагностике СПИД Федерального государственного бюджетного научного учреждения
«Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О. Отта».
Официальные оппоненты:
Доктор биологических наук
Розанова Ольга Егоровна
Старший научный сотрудник Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального научно-биологического агентства»
Доктор биологических наук
Самойлович Марина Платоновна
Ведущий научный сотрудник лаборатории гибридомной технологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский научный центр радиологии и хирургических технологий» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение
науки «Институт цитологии Российской академии наук».
Защита диссертации состоится «___» ___________ 2015 года в _______ часов на
заседании диссертационного совета Д 001.022.02 при Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Институт экспериментальной медицины» по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д.12. С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Институт экспериментальной медицины» по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д.12, или
на сайте http://www.iemrams.spb.ru/russian/dissov02.htm.
Автореферат разослан «____» _____________ 2015 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
Доктор медицинских наук
Дыбан П.А.
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы исследования. Одним из распространенных осложнений беременности является преэклампсия, патогенез которой во многом связан с нарушением перфузии маточно-плацентарного ложа. Эта патология развивается после 20 недели беременности и для неё характерно развитие полиорганной недостаточности [Айламазян Э.К., 2008]. Развитие патофизиологического
процесса при преэклампсии сопровождается изменением основных популяций
лейкоцитов в периферической крови [Соколов Д.И., 2012] и децидуальной оболочке [Wilczynski J.R., 2003]. Изменение состава и функциональных характеристик лейкоцитов децидуальной оболочки приводит к развитию воспалительной
реакции в зоне маточно-плацентарного контакта, которая может приобретать системный характер и приводить к манифестации клинических проявлений преэклампсии [Соколов Д.И., 2012]. При беременности, осложненной преэклампсией,
для эндотелиальных клеток в зоне маточно-плацентарного контакта характерна
экспрессия адгезионных молекул ICAM-1, VCAM-1, PECAM-1 [Tziotis J., 2002],
что, наряду с изменением секреции хемокинов клетками децидуальной оболочки и плаценты, может способствовать хемотаксису, адгезии и трансэндотелиальной миграции лейкоцитов из периферической крови в маточно-плацентарный комплекс. В литературе имеются разрозненные данные о фенотипических
характеристиках лейкоцитов периферической крови матери при преэклампсии,
тогда как их функциональные свойства остаются практически неисследованными, что определяет актуальность определения паттернов экспрессии адгезионных молекул и хемокиновых рецепторов лейкоцитами периферической крови
и проведения функциональных тестов адгезии и трансэндотелиальной миграции
лейкоцитов. Одной из популяций лейкоцитов, присутствующих в децидуальной
оболочке на протяжении всей беременности, являются NK-клетки. При преэклампсии NK-клетки могут вносить вклад в развитие воспаления в зоне маточноплацентарного контакта за счет секретируемых цитокинов и цитотоксической
активности [Goldman-Wohl, 2008]. В настоящее время в литературе представлены противоречивые данные о функциональной активности NK-клеток при
преэклампсии, с чем связана актуальность изучения данной популяции лейкоцитов.
В настоящее время одним из новых направлений исследований становится
изучение феномена образования микровезикул (микрочастиц) эукариотическими клетками и их участие в межклеточных взаимодействиях. Как физиологическая беременность, так и беременность, осложненная преэклампсией, сопровождается повышением количества микрочастиц в плазме крови [Biro E.,
2007]. При развитии воспаления в децидуальной оболочке возможно образование лейкоцитами микрочастиц, однако их фенотип, а также их влияние на свойства лейкоцитов при преэклампсии не изучены. Изменение функционального
состояния лейкоцитов при преэклампсии может быть связано с различием в характеристиках микрочастиц клеток, присутствующих в периферической крови,
поэтому исследование состава микрочастиц и эффектов, оказываемых ими на
клетки, представляется актуальным.
4
Целью работы явилось изучение характеристик лейкоцитов и их микрочастиц, выделенных из периферической крови женщин с беременностью, осложненной преэклампсией.
Задачи исследования:
1. Оценить in vitro особенности адгезии и трансэндотелиальной миграции
мононуклеаров периферической крови женщин с физиологической беременностью и беременностью, осложненной преэклампсией.
2. Охарактеризовать экспрессию поверхностных рецепторов лейкоцитами
периферической крови у женщин с физиологической беременностью и беременностью, осложненной преэклампсией.
3. Изучить активность NK-клеток периферической крови женщин с физиологической беременностью и беременностью, осложненной преэклампсией.
4. Оценить характеристики микрочастиц плазмы периферической крови
женщин с физиологической беременностью и беременностью, осложненной
преэклампсией.
5. Изучить in vitro влияние микрочастиц плазмы крови женщин с физиологической беременностью и беременностью, осложненной преэклампсией, на
функциональные свойства моноцитоподобных клеток линии THP-1.
Научная новизна. Впервые проведено комплексное изучение функциональных характеристик, связанных со способностью лимфоцитов и моноцитов
к адгезии и трансмиграции in vitro, у женщин с физиологической беременностью
и с преэклампсией. Показано, что интенсификация функции адгезии к эндотелиальным клеткам мононуклеаров беременных женщин с преэклампсией не ведет
к усилению функции транэндотелиальной миграции in vitro. Впервые проведенный комплексный сравнительный анализ экспрессии адгезионных молекул и рецепторов для цитокинов лейкоцитами периферической крови женщин с физиологической беременностью и беременностью, осложненной преэклампсией, выявил повышение экспрессии адгезионных молекул CD18 CD8+ Т-лимфоцитами,
CD11с NK-клетками, рецептора к IFNγ (CD119) моноцитами. Проведенный анализ функциональной активности NK-клеток периферической крови in vitro выявил снижение экспрессии гликопротеина CD107a, ассоциированного с лизосомальными мембранами. Выявлена повышенная экспрессия TRAIL NK-клетками
периферической крови при преэклампсии. Впервые проведена комплексная
оценка поверхностных рецепторов, представленных на мембранах микрочастиц
плазмы периферической крови женщин с физиологической беременностью и беременностью, осложненной преэклампсией. Впервые проведено изучение влияния микрочастиц плазмы периферической крови женщин с физиологической беременностью и беременностью, осложненной преэклампсией, на моноцитоподобные клетки линии THP-1.
Теоретическая и практическая значимость. Выявленная при преэклампсии по сравнению с физиологической беременностью повышенная экспрессия
адгезионных молекул CD8+ Т-лимфоцитами, моноцитами и повышенное количество CD11c+ NK-клеток в периферической крови свидетельствует об изменении функциональной активности этих клеток. Повышенная при преэклампсии
5
экспрессия рецепторов к IFNγ моноцитами и нейтрофилами отражает активированное состояние этих лейкоцитов. Следствием активированного состояния моноцитов и повышенной экспрессии адгезионных молекул лимфоцитами может
являться установленная нами повышенная адгезия лимфоцитов и моноцитов к
активированному эндотелию. Впервые на основании оценки экспрессии NKклетками CD107a и TRAIL, установлено, что преэклампсия сопровождается изменением функционального состояния NK-клеток периферической крови, при
котором основным механизмом индукции апоптоза клеток-мишеней становится
TRAIL-зависимый путь.
Впервые проведенная комплексная оценка фенотипических характеристик
микрочастиц плазмы крови позволила установить, что преэклампсия сопровождается повышением содержания в периферической крови микрочастиц с фенотипом CD45+CD16+CD56-. Впервые установлено, что микрочастицы плазмы
крови женщин с преэклампсией в отличие от микрочастиц плазмы крови женщин с физиологической беременностью снижают экспрессию молекул CD18 и
CD54 моноцитоподобными клетками линии THP-1, что отражает наличие регуляторной функции у микрочастиц.
Обнаруженные различия экспрессии поверхностных молекул популяциями
лейкоцитов, а также различия в содержании в периферической крови микрочастиц с определенным фенотипом у женщин с физиологической беременностью
и женщин с преэклампсией в дальнейшем могут лечь в основу разработки методов выявления пациентов группы риска по развитию преэклампсии.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Преэклампсия сопровождается повышенной экспрессией CD18 CD8+ Тлимфоцитами, CD11с NK-клетками и CD119 моноцитами периферической
крови и повышенной функцией адгезии лимфоцитов и моноцитов in vitro как к
интактному, так и к активированному эндотелию. Данные фенотипические и
функциональные характеристики лимфоцитов и моноцитов при преэклампсии
могут определять их миграцию в децидуальную оболочку и их участие в развитии воспаления.
2. При преэклампсии происходит смена стратегии цитотоксических эффектов NK-клеток, отражающаяся в снижении способности реализовывать цитотоксический ответ с образованием гранзимов и перфорина, что характеризуется
сниженной по сравнению с физиологической беременностью экспрессией
CD107a NK-клетками после активации. Преэклампсия по сравнению с физиологической беременностью характеризуется присутствием в периферической
крови повышенного количества TRAIL+ NK-клеток, что указывает на предрасположенность NK-клеток индуцировать TRAIL-опосредованный апоптоз клеток-мишеней.
3. Повышенное у женщин с физиологической беременностью по сравнению
с небеременными женщинами количество микрочастиц с фенотипом
CD45+CD16+CD56+ может отражать гибель цитотоксических NK-клеток. Развивающаяся при преэклампсии воспалительная реакция отражается в присутствии в кровеносном русле повышенного количества микрочастиц, образованных нейтрофилами и моноцитами. Преэклампсия сопровождается сниженным
6
количеством микрочастиц, образованных NK-клетками, что может быть связано
с нарушением механизмов развития иммунологической толерантности, а
именно дефектом в индукции гибели активированных NK-клеток, что определяет цитотоксические эффекты в зоне маточно-плацентарного контакта.
4. Микрочастицы плазмы периферической крови женщин с физиологической беременностью и с преэклампсией в условиях in vitro по-разному изменяют
активность моноцитоподобных клеток линии THP-1, проявляя регуляторные
свойства. Микрочастицы женщин с физиологической беременностью снижают
экспрессию рецептора для IL-8 и повышают экспрессию адгезионных молекул
CD18 и CD54 клетками линии THP-1. Микрочастицы женщин с преэклампсией
по сравнению с микрочастицами женщин с физиологической беременностью повышают экспрессию CD181 клетками линии THP-1.
Реализация работы. По материалам диссертации опубликовано 29 научных
работ, в том числе 9 статей в журналах, включенных в Перечень ВАК Минобрнауки РФ для публикации материалов диссертационных исследований.
Личное участие автора заключалось в проведении экспериментальных исследований, статистической обработке, обобщении и анализе полученных результатов, и подготовке статей. Методическая помощь была оказана с.н.с. отдела иммунологии ФГБНУ «ИЭМ» Стариковой Э.А. при освоении метода трансэндотелиальной миграции. Атомно-силовая микроскопия препаратов микрочастиц, выделенных из плазмы периферической крови, была выполнена совместно с сотрудниками биологического факультета Санкт-Петербургского Государственного
Университета Бенкеным К.А. и Онохиным К.В., за что автор выражает им благодарность.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы представлены на X
юбилейном Всероссийском научном форуме «Мать и дитя» (Москва, 2009), XIII
Всероссийском форуме с международным участием «Дни иммунологии в СанктПетербурге» (Санкт-Петербург, 2009), II Европейском Конгрессе по иммунологии
(Берлин, Германия, 2009), на 14-ом Международном конгрессе по Иммунологии
(Кобе, Япония, 2010), I Ежегодной научной конференции молодых ученых и специалистов «Репродуктивная медицина: взгляд молодых 2010» (Санкт-Петербург,
2010), XVI Межгородской конференции молодых ученых «Актуальный проблемы
патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2010), на XI Всероссийском научном форуме «Мать и дитя» (Москва, 2010), 4-ой Всероссийской конференции «Иммунология репродукции» (Пермь, 2010), Всероссийской конференции молодых
ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 2010), на XVII Межвузовской конференции молодых ученых «Актуальный проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2011), XIV Всероссийском
научном форуме с международным участием имени академика В.И.Иоффе «Дни
иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2011), 17-ом Международном студенческом медицинском конгрессе (ISCOM 2011) (Гронинген, Голландия,
2011), на XII Всероссийском научном форуме «Мать и дитя» (Москва, 2011), II
Ежегодной научной конференции молодых ученых и специалистов «Репродуктивная медицина: взгляд молодых 2011» (Санкт-Петербург, 2011), Международной конференции «Programmed Cell Death in Biology and Medicine» (Москва,
7
2012), XIII Всероссийском научном форуме «Мать и дитя» (Москва, 2012), XVIII
Международной медико-биологической конференции молодых исследователей,
посвященной двадцатилетию факультета СПбГУ «Фундаментальная наука и
клиническая медицина – человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2015).
Объем и структура диссертации. Материалы диссертации включают введение,
обзор литературы, описание материалов и методов, полученные результаты, обсуждение, общее заключение, выводы, список сокращений и список литературы.
Текст диссертации изложен на 190 страницах, содержит 10 таблиц, 46 рисунков
и 11 приложений. Список литературы состоит из 367 работ.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования. Получено разрешение Этического Комитета ФГБУ «НИИ АГ им.Д.О.Отта» СЗО РАМН на проведение исследований.
Обследовано 422 женщины во время и вне беременности: здоровые небеременные женщины, в анамнезе у которых были одни и более родов (I группа), соматически здоровые женщины с физиологически протекающей беременностью
(ФБ) (38-39 недель, группа II) и беременные женщины с преэклампсией (ПР) (3839 недель, группа III). Критериями включения для I группы являлись отсутствие
беременности на момент исследования, согласие на проведение исследования.
Критериями исключения для I группы являлись острая или обострение хронической инфекционной патологии, сахарный диабет I и II типов, аллергические реакции, аутоиммунные заболевания, заболевания сердечно-сосудистой системы,
отказ от проведения обследования. Возраст женщин II и III групп находился в
интервале от 17 до 48 лет и в среднем составил 30,8±5,9 лет. Критериями включения для II группы являлись срок беременности 38-39 недель, одноплодная беременность, отсутствие осложнений беременности, согласие на участие в исследовании. Критериями включения для III группы являлись срок беременности 3839 недель, наличие клинических проявлений преэклампсии, одноплодная беременность, согласие на участие в исследовании. Критериями исключения для II и
III групп являлись сахарный диабет I и II типов, сахарный диабет беременных на
инсулинотерапии, многоводие, маловодие, урогенитальная инфекция, острая
или обострение хронической инфекционной патологии, аутоиммунные заболевания, аллергические реакции, гипертоническая болезнь и другие заболевания системы кровообращения, отказ от проведения исследования. Все беременные
женщины наблюдались врачами в акушерских отделениях ФГБНУ «НИИ АГиР
им. Д.О. Отта». Диагноз преэклампсии у женщин третьей группы установлен в
отделении физиологии и патологии беременности ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О.
Отта» в соответствии с Международной классификацией болезней X пересмотра
на основании клинических симптомов различной степени выраженности. Получено информированное согласие пациенток на обследование. Объектом исследования явилась периферическая кровь.
Культуры клеток: эндотелиальные клетки (ЭК) линии Ea.Hy 926 культивировали в среде DMEM/F12 с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 50
мкг/мл сульфата гентамицина, 2 мМ L-глютамина, HAT. Моноцитоподобные
8
клетки линии ТНР-1 культивировали в среде RPMI-1640, 10% ЭТС, 2 мМ Lглютамина, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (Sigma, США).
Адгезия к эндотелиальным клеткам и трансэндотелиальная миграция мононуклеаров периферической крови. ЭК культивировали в 24-луночном планшете, затем в часть лунок с ЭК вносили 100 ЕД/мл TNFα (препарат «Рефнолин»,
Латвия) и инкубировали 22 часа. Затем все лунки отмывали трижды раствором
Хенкса. Выделенные методом центрифугирования в градиенте плотности мононуклеары периферической крови вносили в лунки (1×106 клеток в 500 мкл культуральной среды) и культивировали 30 минут (5% СО2, 37ºС). Затем трижды отмывали монослой ЭК от неадгезировавших клеток раствором Хенкса. Адгезировавшие клетки вместе с монослоем ЭК переводили в суспензию путем 5-минутной экспозиции в растворе версена. Анализ адгезировавших к ЭК мононуклеаров
проводили на цитофлюориметре FACScan с использованием антител к CD3,
CD16, CD56, CD4, CD8, CD14.
При оценке трансэндотелиальной миграции 45000 ЭК вносили во вставки с поликарбонатным фильтром (размер пор 8 мкм, BDFalkon, США) в среде
DMEM/F12, 10% ЭТС и инкубировали 24 часа (37˚С, 5% СО2). В верхнюю камеру вставки вносили мононуклеары периферической крови(1×106 клеток в 200
мкл среды DMEM/F12, 10% ЭТС). В нижнюю камеру вносили 700 мкл той же
среды. В часть нижних камер вносили 50 Ед/мл TNFα и инкубировали 24 часа
(37˚С, 5% СО2). После инкубации собирали клетки, мигрировавшие в нижнюю
камеру, окрашивали антителами к CD45, CD3, CD4, CD8, CD16, CD56, CD14 (BD, США)
и оценивали количество лимфоцитов и моноцитов периферической крови с помощью цитофлюориметра FACSCantoII.
Экспрессию лейкоцитами периферической крови адгезионных молекул, рецепторов к хемокинам и ростовым факторам оценивали с помощью метода
проточной цитофлюориметрии с помощью FACSCantoII. Обрабатывали клетки
цельной периферической крови антителами CD3, CD4, CD8, CD14, CD16, CD56,
CD11a, CD11b, CD11c, СD18, CD29, CD49d, CD31, CD44, CD47, CD51/CD61, CD36, CD54,
CD58, CD62L, CD62E, CD62P, CD138, CD106, интегрину β7,CD192, CD134, CD 196,
CXCR5, CD197, CD119, CD184,CD114, CD116, CD140b, CD140a (BD, США).
Для оценки функциональной активности NK-клеток периферической
крови мононуклеары периферической крови выделяли на градиенте плотности
фиколл-верографин, инкубировали 4 часа 1 млн клеток в 1мл среды RPMI-1640,
10% ЭТС (37°С, 5% CO2). Часть клеток инкубировали в присутствии антител к
CD107a и 8 мкг\мл монензина. Вторую часть клеток от тех же пациенток инкубировали в присутствии антител к CD107a, 8 мкг\мл монензина, и стандартного
реагента для активации лейкоцитов (активатора), содержащего 2,5 мкг\мл РМА
и 0,5 мкг\мл иономицина. После инкубации клетки обрабатывали антителами к
CD3, CD16, CD56, CD54. При анализе экспрессии TRAIL клетки периферической крови обрабатывали антителами к CD3, CD16, CD56, TRAIL. Экспрессию
анализировали на цитофлюориметре FACSCantoII.
Атомно-силовая микроскопия микрочастиц периферической крови. Все
растворы и среды для выделения микрочастиц были предварительно профиль-
9
трованы через фильтр с диаметром пор 0,1 мкм. Периферическую кровь центрифугировали 15 минут (2600g, +10ºС) и 10 минут (9900g, +10ºС) для осаждения
тромбоцитов. Затем центрифугировали надосадок 20 минут (19800g, +10ºС) для
осаждения микрочастиц, после обработки холодным раствором Хенкса без CaCl2
центрифугировали 20 минут (19800g, +10ºС). Полученные микрочастицы разводили в растворе Хенкса без CaCl2 и наносили на покровные стекла, покрытые
полилизином с добавлением 10% формалина, и высушивали при 37оС. После
фиксации препараты промывали в дистиллированной воде и высушивали.
Атомно-силовая микроскопия препаратов микрочастиц выполнена на сканирующем зондовом микроскопе Интегра Аура (NT-MDT, Россия) сотрудниками биологического факультета Санкт-Петербургского Государственного Университета
Бенкеным К.А. и Онохиным К.В., за что автор выражает им благодарность.
Для анализа микрочастиц периферическую кровь последовательно центрифугировали при 2600g, 9900g, 19800g. Микрочастицы разводили в растворе Хенкса
с 0,35% бычьего сывороточного альбумина, обрабатывали антителами к CD45,
CD3, CD4, CD8, CD14, CD16, CD56, CD62L, CD62P, CD54, CD41a и оценивали
на цитофлюориметре FACSCantoII.
Оценка влияния микрочастиц плазмы крови на функциональные свойства
клеток линии THP-1. Микрочастицы плазмы периферической крови выделяли
путем последовательных центрифугирований (2600g, 9900g, 19800g). За 22 часа
до стимуляции микрочастицами клетки линии ТНР-1 рассевали в 24-луночный
планшет (1х106 клеток/мл) и инкубировали (37°С, 5% CO2). В часть лунок вносили 50 ЕД/мл TNFα. На следующий день клетки отмывали раствором Хенкса.
Выделенные из периферической крови микрочастицы разводили RPMI-1640,
10% ЭТС пропорционально исходному объему образца плазмы крови и вносили
в лунки с клетками THP-1, культивировали 24 часа. Затем клетки THP-1 отмывали раствором Хенкса, обрабатывали реагентом FcBlock, антителами к CD11a,
CD11b, CD11c, СD18, CD29, CD49d, CD31, CD47, CD54, интегрину β7, HLA-DR,
CD119, CD181, CD182, CD120a, VEGFR1, VEGFR2 и анализировали на цитофлюориметре FACSCantoII.
Статистический анализ проводили в программе STATISTICA 7.0 с использованием непараметрического U-критерия Манна-Уитни.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Адгезия и миграция мононуклеаров через эндотелий. Применяли два варианта модельных систем in vitro: интактный эндотелий и активированный TNFα
эндотелий. Установлена сниженная адгезия лимфоцитов к интактному эндотелию в группе II по сравнению с группой I (рисунок 1). Количество лимфоцитов,
адгезировавших к активированному эндотелию, было выше, чем лимфоцитов,
адгезировавших к интактному эндотелию. Указанные различия могут определять миграцию лимфоцитов беременных женщин в децидуальную оболочку, так
как эндотелий в зоне маточно-плацентарного контакта находится в активированном состоянии и экспрессирует адгезионные молекулы ICAM-1, ICAM-2,
VCAM-1, PECAM-1. Выявленное при ФБ повышенное количество моноцитов,
10
адгезировавших к интактному эндотелию, может являться следствием изменения экспрессии адгезионных молекул на моноцитах. В группе III по сравнению
с группой II количество лимфоцитов, адгезировавших к активированному эндотелию, было выше, что обусловлено повышенной экспрессией адгезионных молекул на активированном эндотелии и может быть следствием изменения экспрессии адгезионных молекул отдельными популяциями лимфоцитов при ПР.
100
80
60
40
20
0
%
**
◙◙
◙◙ #
◙ ◙#
*
лимфоциты (адгезия лимфоциты (адгезия моноциты (адгезия к моноциты (адгезия к
к интактному
к активированному
интактному
активированному
эндотелию)
TNFα эндотелию)
эндотелию)
TNFα эндотелию)
Рисунок 1. Адгезия мононуклеаров к эндотелию. * - p<0,05, **- p<0,01 по сравнению с группой I; # - p<0,05 по сравнению с группой II. ◙ - p<0,05; ◙◙ - p<0,01
- различия внутри группы.
Адгезия моноцитов к активированному эндотелию при ПР была выше, чем при
ФБ, что связано с локальным воздействием цитокинов и хемокинов на моноциты
в зоне маточно-плацентарного кровотока. Как спонтанная, так и индуцированная
TNFα, трансэндотелиальная миграция моноцитов in vitro в группе II была выше,
чем в группе I, в то время как миграция лимфоцитов была снижена (рисунок 2).
Рисунок 2. Трансэндотелиальная миграция мононуклеаров.*- p<0,05 по
сравнению с группой I; # - p<0,05 по сравнению с группой II.
11
Сниженная трансмиграция обусловлена сниженной адгезией лимфоцитов к
интактному эндотелию и связана со снижением способности лимфоцитов
мигрировать в ткани в отсутствие активационных сигналов от эндотелия. В
присутствии TNFα в группе II относительное количество мигрировавших
лимфоцитов снижено, а моноцитов – повышено по сравнению с группой I. В
группе III по сравнению с группой II снижено относительное количество
лимфоцитов, спонтанно мигрировавших в нижнюю камеру (рисунок 2), что
указывает на недостаточность повышенной при ПР адгезии к активированному
эндотелию лимфоцитов для завершения трансмиграции в отсутствии
дополнительных хемокинов и цитокинов, секретируемых в условиях воспаления
в зоне маточно-плацентарного контакта.
Экспрессия поверхностных маркеров лейкоцитами периферической крови.
В группе II по сравнению с группой I увеличено количество CD3+CD8+ Т-лимфоцитов, CD3+CD4+ Т-лимфоцитов, NK-клеток, экспрессирующих интегрин β7,
CD29, CD49d, увеличена интенсивность экспрессии моноцитами CD11c, CD11b,
CD54, CD62P, CD47, CD29, CD31 (таблица 1).
Выявленные изменения экспрессии адгезионных молекул популяциями лимфоцитов и моноцитами могут определять выявленную in vitro повышенную адгезию к эндотелию при физиологической беременности. В группе III по сравнению
с группой II интенсивность экспрессии CD18 CD3+CD8+ Т-лимфоцитами в 6,5
раз выше. В группе III по сравнению с группой II снижено количество CD3+CD4+
Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD47, CD44, CD49d, а количество CD11c+ NKклеток повышено.
В группе III по сравнению с группой II интенсивность экспрессии моноцитами
CD11c, CD54, CD47, CD49d снижена, но повышено количество CD119+
моноцитов и интенсивность экспрессии ими CD119 (таблица 1). Повышенная
при ФБ экспрессия адгезионных молекул CD8+ Т-лимфоцитами, CD4+ Тлимфоцитами, NK-клетками и моноцитами указывает на возможность этих
клеток мигрировать в децидуальную оболочку и регионарные лимфатические
узлы. При ПР повышенная экспрессия CD18 CD8+ Т-лимфоцитами, CD11с NKклетками свидетельствует о возможности миграции этих клеток в децидуальную
оболочку, что вместе с нарушениями механизмов индукции толерантности
может определять развитие воспаления в децидуальной оболочке. Экспрессия
CD119 моноцитами при ПР определяет их готовность к участию в развитии
воспалительной реакции.
Функциональная активность NK-клеток периферической крови.
Количество CD107a+ NK-клеток повышалось в присутствии активатора по
сравнению с их начальным количеством во всех группах пациентов (таблица 2),
что указывает на способность NK-клеток отвечать на стимуляцию. В группе III
по сравнению с группой II количество CD107a+ NK-клеток было ниже после
инкубации в присутствии активатора (таблица 2), что свидетельствует о
сниженной гранзим-опосредованной цитотоксической активности NK-клеток
при ПР. Количество TRAIL+ NK-клеток повышено в группе III (25,9% {11,9%;
43,9%}) по сравнению с группой II (12,8 % {5,3%; 20,4%}, # - p<0,05).
12
Таблица 1. Экспрессия лейкоцитами поверхностных маркеров (медианы).
Группа I (n=27) Группа II (n=22)
ОтноОтноИнтенсивИнтенсивсительсительПопуляция лейкоцитов
ность эксность эксное коное копрессии,
прессии,
личеличеMFI
MFI
ство, %
ство, %
CD3+CD8+Integrin β7+
36,2
817
48,1 ** 1070 **
CD3+CD8+CD29+
18,9
662
26,6 *
874 *
CD3+CD8+CD49d+
78,6
2056
91,9 *
2345
CD3+CD8+CD18+
19,4
486
30,1
576
CD3+CD4+ Integrin β7+
18,4
486
28,0 *** 665 **
CD3+CD4+ CD29+
25,0
961
31,1 *
1104 *
CD3+CD4+CD49d+
53,1
1699 71,5 *** 2054 *
CD3+CD4+CD47+
97,4
5369
99,2
6034 *
CD3+CD4+CD44+
26,8
729
25,8
602
CD3-CD16+CD56+ Integrinβ7+
3,4
144
8,9 **
233
CD3-CD16+CD56+CD29+
22,1
865
32,9 *
1076
CD3-CD16+CD56+CD49d+
83,1
1572
93,2 ** 2067 ***
CD3-CD16+CD56+CD11c+
42,9
1831
51,8
2226
CD14+CD11c+
98,9
4351
98,9 11047 ***
CD14+CD11b+
83,0
279
91,2 ** 4130 ***
CD14+CD54+
98,9
3669
99,3 6845 ***
CD14+CD62P+
82,9
266
80,7 3164 ***
CD14+CD47+
68,7
2856
86,9 * 3817 ***
CD14+CD29+
72,5
2210
85,3
3133**
CD14+CD31+
99,4
1170
99,0 16765 ***
CD14+CD119+
46,5
3
65,6 1971 ***
CD14+CD49d+
91,3
16313
86,8 3575 ***
Группа III (n=24)
Относи- Интенсивтельное ность эксколиче- прессии,
ство, %
MFI
38,8 ## 764 ###
21,8
584 ##
78,4 ### 1783 ###
17,4 #
3890 #
24,6
519 #
30,4
779 ###
56,6 # 1306 ###
95,7 ### 3923 ###
14,7 ## 336 ###
11,6
229
27,5
698 ##
89,9
1632 ##
60,2 #
2286
98,9
9071 #
92,8
4239
99,0
5587 ##
84,4
2726
79,8
2985 #
91,5
2639
99,1
15422
80,7 #
2090 #
87,9
2226 ##
*- p<0,05, ** - p<0,01, *** - p<0,001 по сравнению с группой I; # - p<0,05, ## p<0,01, ### - p<0,001 по сравнению с группой II. MFI - относительные единицы
флуоресценции.
Таблица 2. Экспрессия CD107a NK-клетками периферической крови.
Группа I
Группа II
ОтносиОтносиУсловия
ИнтенсивИнтенсивтельное
тельное
инкубации
ность эксность экспресколичеколичепрессии, MFI
сии, MFI
ство, %
ство, %
Инкубация без
0,5
1754
1,1
1744
активатора
{0,2; 2,4} {1240; 2172} {0,4; 2,7} {649; 1873}
10,8
2957
7,4
3447
Инкубация с
{5,6; 18,2} {2282; 3417} {4,0; 11,0} {2550; 4621}
активатором
◙◙◙
◙◙
◙◙◙
◙◙◙
Группа III
ОтносиИнтенсивность
тельное
экспрессии,
количеMFI
ство, %
1,1
1170
{0,6; 1,7} {824; 1604}
4,5
3292
{2,6; 6,0} {2056; 3618}
◙◙◙#
◙◙◙
◙◙ - p<0,01, ◙◙◙ - p<0,001 (различия внутри группы); # - p<0,05 по сравнению с
группой II. MFI - относительные единицы флуоресценции.
Содержание
и
фенотипические
характеристики
микрочастиц
периферической крови. При помощи атомно-силовой микроскопии поля
зрения 20х20 мкм определили популяцию сферических объектов плазмы
13
периферической крови в диапазоне высот 50-900 нм с максимумом 230 нм.
Мажорная популяция микрочастиц находилась в диапазоне высот 100-300 нм.
Гранулометрический анализ поля зрения 5х5 мкм показал средний диаметр
микрочастиц плазмы крови составил 330 нм. В группе II общее содержание
микрочастиц превышает их количество в группе I (p<0,001), что отражает
активно протекающие процессы межклеточных взаимодействий в фетоплацентарном комплексе. В группе II по сравнению с группой I повышено
количество микрочастиц с фенотипом NK-клеток (CD45+CD16+CD56+, CD45–
CD16+CD56+) и Т-хелперных лимфоцитов (СD3+CD4+) (таблица 3), что может
быть следствием гибели цитотоксических NK-клеток и активации CD4+ Тлимфоцитов при индукции толерантности.
При ПР не происходит гибели цитотксических NK-клеток, что отражается в
выявленном сниженном количестве микрочастиц CD45+CD16+CD56+ по
сравнению с ФБ. Количество микрочастиц NK-клеток с фенотипом
CD45+CD16–CD56+ было вдвое выше при ПР, что может отражать гибель NKклеток с фенотипом CD16dimCD56bright в децидуальной оболочке, обладающих
регуляторными функциями. Источником микрочастиц с фенотипом
CD45+CD16+CD56– могут быть NK-клетки, моноциты и нейтрофилы. Так как
количество специфичных для NK-клеток микрочастиц снижено при ПР,
возможно преимущественное происхождение микрочастиц CD45+CD16+CD56–
из моноцитов и нейтрофилов при их активации в зоне маточно-плацентарного
контакта.
Таблица 3. Количество микрочастиц, экспрессирующих поверхностные маркеры.
Группа I (n=21)
Комбинации поверхАбсолютное колиностных маркеров
чество, в 1 мл
CD45+ CD16+ CD56+
298 {188; 600}
CD45+ CD16+ CD56–
1610 {834; 600}
CD45+CD16– CD56+
765 {418;, 1234}
CD45–CD16+ CD56+
3832 {1359; 5824}
CD3+ CD4+
563 {330; 1065}
Группа II (n=20)
Группа III (n=24)
Абсолютное количе- Абсолютное количество, в 1мл
ство, в 1мл
9389{4974; 17894}**
840 {465; 1372} ##
541 {292; 1225}*
9923{4032;17433}##
520 {161; 888}*
981 {784; 1658} #
5989 {2170; 18934}*
8274 {3443; 18439}
1707 {686; 3302}*
970 {802; 1639}
*- p<0,05, ** - p<0,001 по сравнению с группой I; # - p<0,05, ##- p<0,001по
сравнению с группой II.
Влияние микрочастиц плазмы крови на клетки линии THP-1. При
воздействии микрочастиц группы II по сравнению с группой I in vitro снижается
экспрессия CD181 интактными и предварительно активированными TNFα
клетками линии THP-1 (рисунок 3). Можно предположить, что при аналогичном
влиянии микрочастиц на клетки в условиях in vivo сниженная экспрессия
рецептора к IL-8 может влиять на миграцию клеток в ткани и в том числе в
децидуальную оболочку, учитывая, что IL-8 секретируется клетками
децидуальной оболочки и плаценты [Соколов, 2012].
Экспрессия CD18 и CD54 клетками THP-1 повышена при влиянии микрочастиц
плазмы женщин группы II по сравнению с группой I, что указывает на существование контроля миграции клеток в ткани со стороны присутствующих в плазме
14
крови микрочастиц. Экспрессия CD181 интактными и предварительно активированными клетками ТНР-1 подавлялась после введения микрочастиц группы III,
но в меньшей степени, чем при действии микрочастиц группы II. Возможно, что
в условиях in vivo аналогичное увеличение экспрессии CD181 на моноцитах под
влиянием микрочастиц, присутствующих в плазме крови при ПР, может способствовать миграции моноцитов в зону воспаления. Экспрессия рецепторов CD18
и CD54 активированными клетками THP-1 снижалась при воздействии микрочастиц группы III. Вероятно, аналогичное влияние микрочастиц, присутствующих
в плазме при ПР, в ситуации in vivo на моноциты периферической крови может
компенсировать повышенную активность моноцитов при ПР.
Рисунок 3. Влияние микрочастиц плазмы на экспрессию поверхностных молекул
моноцитоподобными клетками линии ТНР-1. * - p< 0,05 по сравнению с группой I; # - p<0,05 по сравнению с группой II.
Таким образом, наблюдающаяся на фоне повышенной экспрессии адгезионных
молекул лейкоцитами при ФБ сниженная функция адгезии и трансэндотелиальной миграции лимфоцитов через эндотелий указывают на определяющую роль
хемокинов в привлечении лейкоцитов в децидуальную оболочку. Повышенная
адгезия и трансэндотелиальная миграция моноцитов через эндотелий при ФБ может быть вызвана повышенной экспрессией моноцитами CD11b, CD11c,CD29,
CD31, CD47, CD62P. ФБ сопровождается появлением в периферической крови
15
микрочастиц лейкоцитов, вызывающих изменение экспрессии адгезионных молекул и рецептора к цитокину IL-8 моноцитоподобными клетками линии THP-1.
ПР сопровождается развитием воспалительной реакции в децидуальной оболочке и в плаценте, секрецией провоспалительных цитокинов и повышением
экспрессии адгезионных молекул эндотелиальными клетками в зоне маточноплацентарного контакта. Выявленная повышенная экспрессия адгезионных молекул CD8+ Т-лимфоцитами, моноцитами, NK-клетками определяет возможность миграции этих клеток в децидуальную оболочку. При ПР лейкоциты находятся в активированном состоянии, что подтверждается данными о повышенной
экспрессии CD119 моноцитами, и определяет их готовность к адгезии к эндотелию при наличии хемоаттрактанта. Выявленная in vitro повышенная адгезия лимфоцитов к активированному эндотелию при ПР отражает повышенный адгезионный потенциал лимфоцитов. Учитывая то, что эндотелиальные клетки в зоне
маточно-плацентарного контакта находятся в активированном состоянии [Dye
J.F, 2001], лимфоциты при ПР могут адгезировать к эндотелию и мигрировать в
зону воспаления в децидуальной оболочке. При ПР изменяется функциональное
состояние NK-клеток периферической крови: основным механизмом индукции
апоптоза клеток-мишеней становится TRAIL-зависимый путь, а в периферической крови появляется повышенное количество микрочастиц, образованных
нейтрофилами и моноцитами, что может являться следствием развивающегося в
маточно-плацентарном комплексе воспаления. При ПР микрочастицы плазмы
подавляют экспрессию CD18 и CD54 моноцитоподобными клетками THP-1, что
делает сходным фенотип этих клеток с фенотипом клеток THP-1 при воздействии микрочастиц небеременных женщин, что может отражать нарушение системы контроля межклеточных взаимодействий при ПР на системном уровне.
ВЫВОДЫ
1.
Физиологическая беременность сопровождается сниженной трансэндотелиальной миграцией лимфоцитов и повышенной трансэндотелиальной миграцией моноцитов in vitro. Преэклампсия по сравнению с физиологической беременностью
характеризуется повышенной адгезионной способностью лимфоцитов и моноцитов периферической крови к активированным эндотелиальным клеткам линии
Ea.Hy926. Функция трансэндотелиальной миграции лимфоцитов периферической
крови in vitro снижена при преэклампсии по сравнению с физиологической беременностью.
2.
У женщин с физиологической беременностью по сравнению с небеременными женщинами повышена экспрессия CD8+ Т-лимфоцитами, CD4+ Т-лимфоцитами, NK-клетками адгезионных молекул CD29, CD49d, интегрин β7, а также
CD62P, CD11b, CD11c, CD29, CD31, CD47, CD54 моноцитами периферической
крови. При преэклампсии по сравнению с физиологической беременностью повышена экспрессия CD18 CD8+ Т-лимфоцитами, CD11с NK-клетками, а экспрессия
адгезионных молекул CD4+ Т-лимфоцитами снижена.
16
3.
У женщин при физиологической беременности по сравнению с небеременными женщинами для нейтрофилов и моноцитов периферической крови характерна повышенная экспрессия рецептора к IFNγ (CD119). При развитии преэклампсии экспрессия рецептора к IFNγ на моноцитах периферической крови возрастает.
4.
Преэклампсия сопровождается повышением количества NK-клеток периферической крови, экспрессирующих TRAIL, при отсутствии изменений количества
CD107a+ NK-клеток. При стимуляции NK-клеток in vitro количество активированных CD107a+ NK-клеток снижено при преэклампсии по сравнению с физиологической беременностью.
5.
Физиологическая беременность сопровождается присутствием в плазме периферической крови повышенного количества микрочастиц преимущественно образованных NK-клетками (CD45+ CD16+ CD56+ и CD45- CD16+ CD56+). При преэклампсии по сравнению с физиологической беременностью в периферической
крови повышено содержание микрочастиц преимущественно нейтрофильного и
моноцитарного происхождения (CD45+CD16+CD56-).
6.
Микрочастицы плазмы крови женщин с физиологической беременностью и
с преэклампсией in vitro обладают разнонаправленными эффектами на экспрессию
активированными моноцитоподобными клетками линии THP-1 адгезионных молекул CD18 и CD54 и на экспрессию рецептора к IL-8 (CD181) клетками линии THP1 независимо от наличия предшествовавшей активации.
Список работ, опубликованных по теме диссертации:
Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК России:
1. Соколов Д.И. Оценка функции адгезии к эндотелиальным клеткам различных субпопуляций мононуклеаров периферической крови беременных женщин в норме и при
гестозе / Соколов Д.И., Лесничия М.В., Селютин А.В. и др. // Регионарное кровообращение и микроциркуляция. –2008. –Т.7, №4. –С.34-41.
2. Михайлова В.А. Экспрессия адгезионных молекул моноцитами периферической
крови при беременности / Михайлова В.А., Климовская Я.С., Аманова Н.В. и др. //
Медицинская иммунология – 2010.- Т.12, №4-5. –C.337-342.
3. Михайлова В.А. Экспрессия адгезионных молекул и хемокиновых рецепторов NKклетками периферической крови при беременности / Михайлова В.А., Онохина Я.С.,
Сельков С.А., Соколов Д.И. // Иммунология. – 2011. - №2. – С.78-81.
4. Михайлова В.А. Цитотоксические Т-лимфоциты периферической крови матери при
гестозе: экспрессия адгезионных молекул, хемокиновых рецепторов, активационных
маркеров / Михайлова В.А., Овчинникова О.М., Еремеева Д.Р. и др. // Иммунология.
– 2011. –Т.5, №32. – С.256-260.
5. Михайлова В.А. Экспрессия поверхностных маркеров на нейтрофилах при физиологической беременности и при гестозе / Михайлова В.А., Овчинникова О.М., Онохина
Я.С. и др. // Журнал акушерства и женских болезней. – 2011. – Т.LX, №6. – С.40-44.
6. Михайлова В.А. Фенотипическая характеристика CD4+ Т-лимфоцитов периферической крови при физиологической беременности и при гестозе / Михайлова В.А., Онохина Я.С., Овчинникова Я.С. и др. // Медицинская иммунология. – 2012. – Т.14, №3.
– С.195-200.
17
7. Михайлова В.А. Фенотипическая характеристика моноцитов периферической крови
при физиологической беременности и гестозе / Михайлова В.А., Онохина Я.С., Овчинникова О.М. и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2012.
– Том 154, № 10. – С.466-471.
8. Михайлова В.А. Особенности трансэндотелиальной миграции мононуклеаров периферической крови при физиологической беременности и гестозе / Михайлова В.А.,
Овчинникова О.М., Сельков С.А., Соколов Д.И. // Иммунология. – 2012. – Т.33, №5.
– С. 236-240.
9. Михайлова В.А. Выявление микрочастиц лейкоцитарного происхождения в периферической крови при физиологической беременности и при преэклампсии / Михайлова В.А., Овчинникова О.М., Зайнулина М.С. и др. // Бюллетень экспериментальной
биологии и медицины. – 2014. – Т.157, №6. – С.721-727.
Тезисы докладов:
1. Михайлова В.А. Изменение адгезивных свойств мононуклеаров крови при патологии беременности – гестозе / Михайлова В.А., Сельков С.А., Соколов Д.И. // Медицинская иммунология. –2009. –Т.11, №4-5. –С.412.
2. Михайлова В.А. Секреция цитокинов и хемокинов тканью плаценты и адгезия мононуклеаров периферической крови при гестозе // Михайлова В.А., Соколов Д.И., Сельков С.А. / Материалы X юбилейного Всероссийского научного форума «Мать и
дитя». – 2009. –С.132-133.
3. Mikhailova V.A. Assessment of adhesion function of mononuclear leukocytes at normal
pregnancy and at eclampsia / Mikhailova V.A., Selkov S.A., Sokolov D.I. // European Journal of Immunology. –2009. –Vol.39, №S1. –P.S 708-S 709.
4. Климовская Я.С. Сравнение экспрессии адгезионных молекул моноцитами периферической крови здоровых небеременных женщин и женщин с физиологическим течением беременности / Климовская Я.С., Михайлова В.А.// Материалы XVI конференции «Актуальные проблемы патофизиологии». – 2010. –С.75-76.
5. Михайлова В.А. Экспрессия адгезионных молекул NK-клетками периферической
крови во время и вне беременности / Михайлова В.А., Климовская Я.С. // Материалы
XVI конференции «Актуальные проблемы патофизиологии». – 2010. –С.7128-130.
6. Михайлова В.А. Функциональное состояние моноцитов периферической крови при
беременности / Михайлова В.А., Климовская Я.С. // Материалы I-ой конференции
«Репродуктивная медицина: взгляд молодых». – 2010. –С.28-29.
7. Mikhaylova V.A. What adhesion molecules do monocytes express at uncomplicated pregnancy? / Mikhaylova V.A., Klimovskaya Y.S., Sokolov D.I. // 17th International Student
Congress of Medical Sciences. Abstact Book. – 2010. –P.243.
8. Mikhaylova V.A. Adhesion molecules of peripheral blood NK cells at pregnancy / Mikhaylova V.A., Klimovskaya Y.S., Sokolov D.I. // International Immunology Meeting Abstract
– 2010. – Vol. 22, supplement №1. –P.i182.
9. Михайлова В.А. Экспрессия рецепторов NK-клетками при беременности в норме и
при гестозе / Михайлова В.А., Климовская Я.С., Соколов Д.И., Сельков С.А. // Материалы XI Всероссийского научного форума «Мать и дитя». –2010. –С.149.
10. Михайлова В.А. Характеристика NK-клеток у беременных с гестозом / Михайлова
В.А., Соколов Д.И. // Российский иммунологический журнал. –2010. – Т. 4 (13), №4.
–С.406-407.
18
11. Михайлова В.А. Адгезионные молекулы NK-клеток при беременности в норме и
при гестозе / Михайлова В.А., Климовская Я.С., Соколов Д.И. // Медицинский академический журнал. – 2010. –T.10, №5. –С.214.
12. Михайлова В.А. Экспрессия хемокиновых рецепторов цитотоксическими Т-лимфоцитами периферической крови при гестозе / Михайлова В.А., Овчинникова О.М.,
Соколов Д.И. // Материалы XVII конференции «Актуальные проблемы патофизиологии». – 2011. – С.109-110.
13. Михайлова В.А. Адгезионные молекулы и хемокиновые рецепторы моноцитов периферической крови при беременности, осложненной гестозом / Михайлова В.А.,
Овчинникова О.М., Максимова И.М. и др. // Медицинская иммунология. – 2011. –
Т.13, №4-5. – С.432.
14. Онохина Я.С. Особенности экспрессии адгезионных молекул хелперными Т-лимфоцитами периферической крови при физиологической беременности / Онохина
Я.С., Михайлова В.А., Соколов Д.И., Сельков С.А. // Медицинская иммунология. –
2011.- Т.13, №4-5. – С.433.
15. Михайлова В.А. Поверхностные маркеры хелперных Т-лимфоцитов периферической крови при гестозе / Михайлова В.А., Овчинникова О.М., Онохина Я.С. и др. //
Материалы XII Всероссийского научного форума «Мать и дитя». – 2011. – С.148.
16. Михайлова В.А. Экспрессия адгезионных молекул цитотоксическими Т-лимфоцитами периферической крови при гестозе / Михайлова В.А., Овчинникова О.М.,
Сафронова Н.Ю. // Журнал акушерства и женских болезней. – 2011. –Т.LX, №4. –
С.140-141.
17. Mikhaylova V.A. Microparticles of peripheral blood leukocytes in case of healthy pregnancy and preeclampsia / Mikhaylova V.A., Ovchinnikova O.M., Sokolov D.I., Selkov S.A.
// Abstract book «Programmed cell death in biology and medicine». – 2012. – P.38-39.
18. Михайлова В.А. Способы реализации NK-клетками функциональной активности
при физиологической беременности и при гестозе / Михайлова В.А., Овчинникова
О.М., Онохина Я.С. и др.// Материалы XIII Всероссийского научного форума «Мать
и дитя». – 2012. – С.111-112.
19. Михайлова В.А. Оценка трансэндотелиальной миграции мононуклеаров периферической крови при беременности в норме и при гестозе / Михайлова В.А., Овчинникова О.М., Макулова М.В. и др. // Материалы XIII Всероссийского научного форума
«Мать и дитя». – 2012. – С.112-113.
20. Михайлова В.А. Изменение фенотипа моноцитов под влиянием микрочастиц периферической крови беременных женщин / Михайлова В.А., Овчинникова О.М. // Материалы XVIII конференции «Фундаментальная наука и клиническая медицина – человек и его здоровье». – 2015. – С.342-343.
Список сокращений:
ПР – преэклампсия
ФБ – физиологическая беременность
ЭТС – эмбриональная телячья сыворотка
FcBlock - реагент, блокирующий неспецифическое связывание Fc-фрагментов антител
HLA –человеческий лейкоцитарный антиген
IFNγ – интерферонγ
IL – интерлейкин
MCP – моноцитарный хемотактический
протеин
PMA – форбол – миристат- ацетата
19
TNFα–фактор некроза опухоли α
TRAIL – TNF-подобный лиганд, инициирующий апоптоз
VEGF-R – рецептора фактора роста эндотелия сосудов