Новое поколение анализаторов осадка мочи
advertisement
СОВРЕМЕННЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ТЕСТЫ: НОВЫЕ ТЕХНОЛОГИИ И КЛИНИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ Новое поколение анализаторов осадка мочи: преимущества для лаборатории и клиники Князева Е.С. (Москва) втоматизация анализа мочи до сих пор находится в стадии развития по сравнению с другими облас тями лабораторной диагностики, такими так ге матология или клиническая химия, хотя анализ мочи яв ляется одним из самых распространненых лабораторных методов исследования и используется при диагностике фактически любых заболеваний, а для нефрологии и уро логии имеет определяющее значение, т.к. либо подтверж дает, либо исключает соответствующую патологию. Так называемый «Общий анализ мочи», назначаемый практи чески при любом первичном посещении врача, фактичес ки состоит из нескольких видов анализа: визуального описания образца мочи, результатов его исследования тестполоской и результатов микроскопической оценки осадка. Если сегодня в России анализаторы мочи на тест полосках уже досточно широко распространены, то авто матизация анализа осадка до сих пор находится в зачаточ ной стадии. Традиционно анализ осадка мочи в России выполня ется ручным методом со всеми присущими этому методу недостатками, такими как плохая воспроизводимость, субъективность оценки, длительность и трудоёмкость вы полнения и пр. Изза отсутствия контрольных материа лов анализ оcадка мочи фактически остается вне сферы как внутрилабораторного, так и внешнего контроля ка чества. При рутинном ручном исследовании коэффици ент вариации при подсчете, например, таких клинически важных элементов осадка мочи как лейкоциты превыша ет 130%, что делает такой метод пригодным для клини ческого использования только в случаях выраженного от клонения от «нормальных» значений (HannemannPohl K et al, 1999). Кроме того, сама технология выполнения ручного микроскопического микроскопического исследования осадка мочи имеет серьезные подводные камни, зачас тую ведущие к спорной достоверности полученного ре зультата: частицы осадка не являются одинаковыми и осаждаются при центрифугировании по разному. Ско рость седиментации различных частиц мочи при центри фугировании описывается сложной формулой и зависит от относительной плотности и вязкости мочи, а также от относительной плотности и радиуса соответствующих А частиц. Разнообразие как частиц, так и химического со става мочи приводит к тому, что процент клеток, остаю щихся в супернатанте можеть сильно отличаться в раз ных образцах (T.Ishi et al, 2003). Центрифугирование может также приводить к разрушению таких диагностически важных элементов, как цилиндры (M.Takahashi). В то же самое время еще один широко используемый вид исследований, микробиологическое исследование мочи для определение бактериурии, является еще более длительным и требует для своего выполнения до двух дней, причем в зависимости от типа бактерий в некото рых случаях условия культивирования могут препятство вать полноценному росту. Все эти сложности учитывались при разработке пер вого в мире автоматического анализатора частиц осадка мочи UF100, выпущенного на мировой рынок компани ей Sysmex в 1995 году. За прошедшие годы использован ная технология значительно эволюционировала, и в 2006 г. Sysmex предложил лабораториям второе поко ление анализаторов мочи – приборы UF1000i и UF500i. Это новое поколение анализаторов было специально раз работано для наилучшей детекции наиболее частых нахо док при анализе мочи. Также как и их предшественники, системы UF1000i и UF500i являются проточными цитофлуориметрами, основанными на передовой технологии полупроводнико вого лазера. Без какойлибо предварительной подготовки пробирки с нативной мочой помещаются на борт анализа тора UF. После автоматического перемешивания образца для анализа аспирируется 1,2 мл мочи. В приборе аликво та мочи перемешивается в фиксированном соотношении со специальными реагентами – дилюентами и флуорес центными красителями. Задача дилюентов – растворение аморфных кристаллов за счет поддержания определенно го уровня рН, предобработка клеточных мембран для об легчения дальнейшего окрашивания, а также предотвра щение неспецифического окрашивания. Флуорохромы представляют собой полиметиновые красители, которые добавляются как в камеру для подсчета бактерий, так и в камеру для подсчета элементов осадка. Полиметин, как флуорохром, имеет множество анали тических преимуществ. Он синтезируется искусственно, 25 СОВРЕМЕННЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ТЕСТЫ: НОВЫЕ ТЕХНОЛОГИИ И КЛИНИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ от количества метиновых групп, длины и структуры цепи зависит диапазон световой адсорбции, который в случае UF точно соответствует длине волны лазера, равной 635 нм. Полиметин может обнаруживаться в крайне низ ких концентрациях, что особенно важно для анализа об разца с очень малым содержанием клеточных элементов. Но основным свойством полиметиновых флуорохромов явлется их тропность к нуклеиновым кислотам, содержа щимся в клетках – РНК и ДНК, причем интенсивность флуоресценции прямо пропорциональна концентрации РНК/ДНК в соответствующей частице. Окрашенные клетки проходят строго по одной через проточную каме ру, где под действием возбуждающего лазера флуоресци руют; длина волны испускаемого флуоресцентного сигнала составляет 660 нм. Помимо интенсивности флуоресцен того сигнала каждой частицы, регистрируется длитель ность его пульса, а также интенсивность фронтального и бокового светорассеяния. Совокупность регистрируе мых параметров подробно описывает размер частицы, ее форму и внутренную структуру, а также количество со держащихся нуклеиновых кислот. Для каждого образца анализируется до 65000 частиц и на основе суммы полученной оптической информации через 40 секунд – 1 минуту оператору выдаются данные о количественном содержании в моче эритроцитов, лей коцитов, эпителиальных клеток (с подразделением на клетки плоскоклеточного эпителия и клетки почечного и переходного эпителия), бактерий, грибков, кристаллов, цилиндров как гиалиновых, так и патологических, и спер матозоидов. Основной задачей лабораторного анализа осадка мочи является выявление патологических образцов, а среди диагностических находок наибольший интерес представ ляет обнаружение в образце эритроцитов (гематурия) и лейкоцитов (лейкоцитурия, подозрение на инфекцию мочевыводящих путей). 26 Анализаторы серии UF успешно справляются с зада чей отсортировки нормальных образцов с высокой чувст вительностью. Такая чувствительность обеспечивается классификацией огромного количества частиц, анализом из нативной мочи для исключения известных источников ошибок традиционного микроскопического анализа и окрашиванием при оптимальных условиях специально разработанными реагентами. Результатом является то, что «отрицательные» образцы, а их, как правило, боль шинcтво, могут быть немедленно автоматически подтвер ждены, результат передан в ЛИС и может быть сразу вы дан клиницисту. Реализация в лаборатории подхода совместного применения для анализа мочи ридера тест полосок и проточного цитометра UF ведет к очень замет ному сокращению количества образцов, требующих даль нейшей микроскопии. По данным разных авторов при использовании такого подхода процент микроскопичес ких исследований может быть снижен до 10–15% (Delanghe JR, et al, 2000; Roggeman S, et al, 2001) Среди «положительных» образцов одной из наиболее частых находок является подозрение на инфекцию моче выводящих путей. Естественно, что при скрининге такие образцы не должны быть пропущены: каждый образец, показанный как отрицательный, должен быть действи тельно отрицательным. Используемая в канале бакте рий анализатора UF реагентная система окрашивает ис ключительно бактерии, при этом наличе в образце клеточного дебриса не оказывает влияния на результат. Такая технология позволяет количественно подсчиты вать бактерии даже в диапазоне 103–104/мл. В комбина ции с одновременным подсчетом в моче лейкоцитов и грибков такой анализ дает клиницисту быструю инфор мацию о наличии или отсутствии инфекции мочевыводя щих путей, позволяя при отрицательном результате кли ницистам значительно сократить слепое назначение антибиотикотерапии, а лаборатории – уменьшить коли чество посевов мочи. По данным многочисленных иссле дований в зависимости от примененного cutoff для бак териурии UF демонстрирует чувствительность и специфичность до 0,97 и 0,93 соответственно, а отрица тельную и положительную прогностическая значи мость – до 0,995 и 0,83 (Gessoni G. et al, 2004; Wang J. et al, 2010). При использовании перед культурой мочи предва рительного скрининга на анализаторе UF на наличие инфекции мочевыводящих путей в зависимости от согла сованного в конкретном случае процента ложноотрица тельных образцов количество посевов удалось сократить на 75% (Evans R. et alб 2006; KimSY et al, 2007). Кроме это го, оценка рисунка скатерограммы бактерий позволяет СОВРЕМЕННЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ТЕСТЫ: НОВЫЕ ТЕХНОЛОГИИ И КЛИНИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ лаборатории сделать предварительный вывод о типе па тогена: грамотрицательные палочки или кокки. Помимо инфекции мочевыводящих путей другой кли нически значимой находкой является гематурия. Автома тическая детекция гематурии также требует высокой чув ствительности, так как в дальнейшем должен быть выявлен возможный источник кровотечения. По возмож ности, для оценки морфологии эритроцитов должна ис пользоваться фазовоконтрастная микроскопия, что по зволяет наилучшим способом выявить аномальную морфологию клеток. После прохождения через мембрану клубочков эритроциты испытыват типичные морфологи ческие изменения. Помимо круговых форм с гладкой или неровной структурой, акантоциты (известные также как клетки МиккиМауса) являются также особым видом дисморфных эритроцитов со проекцией специфической формы. Морфологическая оценка эритроцитов требует значительного практического опыта и хорошего знания микроскопии осадка мочи: • Эритроциты гломерулярного генеза как правило меньше эритроцитов из не гломерулярного источника; • Эритроциты гломерулярного генеза варьируют по форме и размеру, в то время как при негломеруляр ном источнике кровотечения они одинаковы; • Эритроциты гломерулярного генеза часто бывают «пустыми», т.е. в них почти отсутствует гемоглобин; • Иногда при гломерулярной геморрагии микроскпи чески могут выявляться также эритрофагоциты. Эритрофагоциты предствляют собой эпителиальные клетки, уже адсорбировавшие эритроциты. Напротив, при внепочечном кровотечении эритроци ты сохраняют свою форму (описываются как эуморф ные, изоморфные или не гломерулярные эритроциты). Помимо фазоконтрастной микроскопии в лабораториях используется также световая микроскопия предвари тельно окрашенного по Райту образца и световая микро скопия нативного образца. Минимальную чувствитель ность (66%) демонстрирует наиболее распространенный метод световой микроскопии нативного образца (Mehta K, et al 1994). Таким образом клинически значимая чув ствительность показана только для метода, доступного далеко не во всех лабораториях, а достоверность инфор мации о клеточной морфологии, полученной рутинным методом сомнительна. В 80е годы прошлого века были предприняты достаточно многообещающие попытки ис пользовать для определения источника кровотечения по казатель распределения эритроцитов мочи по размеру, полученный на гематологическом анализаторе. Однако, этот метод показал также серьезные ограничения, т.к. частицы, схожие по размеру с эритроцитами мочи, на пример, бактерии или кристаллы, ошибочно принима ются анализатором за эритроциты. В отличие от гемато логических анализаторов приборы серии UF лишены таких недостатков: на основе четкого выделения эритро цитов в образце, анализа их размера и распределения по размеру прибор в состоянии оценить морфологию эритроцитов и сообщить о своих находках оператору. В случае, если эритроциты нормальны по размеру и оди наковы по форме, генерируется сообщение «RBC iso morphic?», а если эритроциты дисморфны или имеются значительные вариации по размеру – сообщение «RBC dysmorphic?» или «RBC mixed?». Достоверность такой информации была также проверена в клинической прак тике и было показано, что данная классификация имеет чувствительность 100% и специфичность 92,54% для вы явления гломерулярного кровотечения, а для диагнос тики негломерулярных кровотечений – чувствитель ность 83% и специфичность 94%. (Hyodo T, et al 1995; Apelanld T, et al 2001) Информация «Изоморфные эритроциты», полученная на анализаторе Sysmex серии UF (правый нижний квад рант), по сравнению с оценкой эритроцитов методом ла зерной микроскопии Обнаружение в образце по преимуществу дисморф ных эритроцитов позволяет предположить почечный ис точник кровотечения (гломерулярная гематурия). Се мейная история и другие клинические признаки, совместно с лабораторными данными, играют важную роль при принятии решения о дальнейших диагностичес ких манипуляциях, особенно у детей, т.к. крайне жела тельно избегать инвазивных методов исследования. При повторном обнаружении дисморфной гематурии, как изолированной, так и в сочетании с протеинурией 27 СОВРЕМЕННЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ТЕСТЫ: НОВЫЕ ТЕХНОЛОГИИ И КЛИНИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ и патологическими цилиндрами, необходимо выяснить возможную семейную историю гематурии, также необхо димо исключить системные заболевания с вовлечением почек в патологический процесс; это может потребовать выполнения серологических и прочих клинических ис следований. В случае обнаружения гематурии без признаков дис морфии эритроцитов, что таким образом исключает вовлечение почечных клубочков в патологический про цесс, такое состяние можут быть вызвано воспалитель ными измененями мочевыводящих путей. Усиление перфузии и вазодилятация, возникающие при воспале нии, позволяют эритроцитам проникать через сосудис тую стенку в мочу. Для таких образцов при обнаруже нии в них лейкоцитов, бактерий или грибов, необходимо в дальнейшем выполнить посев мочи для идентификации патогена. В случае же отсутствия при знаков инфекции мочевыводящих путей должны быть рассмотрены другие возможные причины гематурии, такие как мочекаменная болезнь, при которой за счет механического повреждения возможно попадание эрит роцитов в мочу. 28 Анализ мочи, одна из древнейших медицинских тех ник, получил в 21 веке новые возможности, такие какие предоставляют новейшие автоматизированные анализато ры осадка мочи UF1000i/UF500i (Sysmex Corporation, Japan). Использование этих анализаторов позволяет зна чительно сократить время анализа, сделать его достовер ным, что дает дополнительные возможности для монито ринга терапии, исключить повальную микроскопию осадка, позволив квалифицированному персоналу лабо раторий сосредоточиться только на образцах, требующих внимания, а также предоставляет урологам и нефрологам дополнительную информацию об источнике кровотече ния, что исключительно важно для дифференциальной диагностики заболеваний. Использование UF1000i/UF500i как скринингового инструмента перед посевом мочи позволяет исключить слепое назначение антибиотиков, что ведет как к умень шению расходов лечебного учреждения, так и к сниже нию риска генерации резистентной флоры. Для лаборато рии же предварительный скриниг позволяет значительно снизить количество последующих посевов, что также да ет значительный экономический эффект.
